CN108309940B - β-榄香烯与铂类药物共载脂质体及其制备方法 - Google Patents

β-榄香烯与铂类药物共载脂质体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种β‑榄香烯与铂类药物共载脂质体，每毫升该β‑榄香烯与铂类药物共载脂质体溶液包括β‑榄香烯0.03～0.6mg，铂类药物0.025～0.5mg，磷脂1～2mg，高纯胆固醇0.05～0.1mg，聚乙二醇化磷脂0.03～0.06mg，其余为缓冲溶液。通过薄膜水化法制备共载脂质体，将β‑榄香烯与铂类药物分别包裹于脂质体的亲脂性双分子层中和亲水性脂质体空腔中，按各自特定的药物代动力学特点释放出药物，起到稳定的协同作用，能够提高药物对肺癌的治疗效果，降低药物毒性。

Description

β-榄香烯与铂类药物共载脂质体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种β-榄香烯与铂类药物共载脂质体及其制备方法，属于脂质体药剂技术领域。
背景技术
肺癌是全球范围内因癌症致死的首要因素，每年接近140万人死于肺癌，并且每年仍有160万新增加的肺癌病人确诊。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一，根据全国肿瘤登记中心发布的数据表明，2010年，我国新发肺癌病例居各类恶性肿瘤的首位，肺癌发病率为35.23/10万。
传统化疗药物治疗仍然是人肺腺癌的重要治疗手段，但是单一的化疗药物因为耐药性等毒副作用限制着治疗效果的发挥，因此基于两种药物的联合治疗已经日渐成为人肺腺癌等癌症治疗的主要研究方向。目前，已有多种脂质体药物上市，如β-榄香烯脂质体，铂类药物脂质体已经进入临床二期。游离β-榄香烯与游离顺铂的两药联合治疗肺癌的研究文献已有发表如：β-榄香烯联合顺铂和热疗对A549细胞中MDR1等基因表达的影响的研究。因此，β-榄香烯与铂类药物共载脂质体的发明有研究基础支撑和临床意义。
尽管，β-榄香烯具体作用机制尚未阐明，但是其在肺癌、乳腺癌等肿瘤的治疗效果的研究已经明确了其作用机制：引起细胞G2/M期阻滞，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。铂类药物是一种应用较早的抗肿瘤药物，作用机理是：药物通过细胞膜，进入细胞后，铂原子与DNA结合后，阻断DNA的修复和复制，因而诱导细胞凋亡。已有许多研究报道β-榄香烯与其他抗肿瘤药物的联合应用，可以逆转癌细胞对该抗肿瘤药物的耐药性，提高药物抗肿瘤效果，如β-榄香烯联合紫杉醇治疗胃癌、β-榄香烯联合三苯氧胺治疗乳腺癌等。
但是，作为已经有多年应用的抗肿瘤药物β-榄香烯和铂类药物单独用药过程中依然存在一些问题：多药耐药性、对正常组织的毒副作用等。因此，本设计发明的目的在于：逆转多药耐药性、提高治疗作用和降低毒副作用。
此外，两药联合应用中，两药的恰当比例决定药物能否发挥最大药效。两种药物联合应用的比例不同，对疾病的治疗效果不同如协同、增强和拮抗作用。先前两种游离药物的应用中，由于两种药物的药代动力学不同，对疾病的治疗效果就具有了不确定性。因此，通过制备共载脂质体，将两种药可以按固定比例包载后，控制药物在治疗部位的比例，从而发挥药物较好的治疗效果。
传统的抗肿瘤药物在治疗的同时会对非病变组织产生一定的毒副作用。基于纳米颗粒的载药体系可以将药物选择性输运到肿瘤靶组织甚至靶细胞内，从而提高病变组织的药物浓度，降低药物用量和对正常组织的毒副作用，提高药物的利用度。靶向是抗肿瘤纳米载药体系研究中重要的方向，理想的载药体系是药物定向地到达靶组织后释放出来，在肿瘤部位达到较高的药物浓度。研究表明肿瘤或炎症附近组织的渗透性比正常组织大，大分子物质较易进入并积聚到肿瘤细胞附近，实现肿瘤的被动靶向这种作用被称为高通透性和滞留效应，即EPR效应。EPR效应的发现在药学研究领域具有重要意义。近年来，国内外学者对高治疗效果且低毒性的靶向给药系统的研究渐渐广泛深入，抗肿瘤药物脂质体更是其中研究和开发的热点。作为应用度较高的一种纳米药物载体，脂质体包载的抗肿瘤药物比游离的抗癌药物对肿瘤细胞有更好的治疗效果，化疗药物被脂质体包载后其细胞摄取率会增加，且在体内持续释放从而增强其对细胞的杀伤作用。脂质体因具有组织相容性、细胞亲和性、靶向性和缓释性等性质，被广泛地用于抗肿瘤药物的研发中。
另据文献报道，脂质体因其自身优点，通过增加药物在肿瘤组织和肿瘤细胞的浓度从而逆转肿瘤的多药耐药性，并且不增加药物的毒副作用,因此脂质体与游离药物相比较，脂质体有一定的逆转肿瘤耐药性的效果。目前，已有多种脂质体药物上市，如阿霉素脂质体、紫杉醇脂质体、及β-榄香烯脂质体等，顺铂脂质体已经进入临床二期。
中国专利200410082866.8公开了一种以β-榄香烯为主含有其它倍半萜烯混合榄香烯的脂质体的几种制备方法。本文制备的榄香烯脂质体粒径只说明小于500nm，这样的粒径是否可以发挥较好的药物代谢动力学的效果，没有实验依据；且该脂质体的榄香烯是混合物，不能指出该脂质体是否能达到确切的肺癌治疗效果。
中国专利200910058074.X公开了β-榄香烯脂质体的一种制备方法，以及它的冻干粉针的制备，在粒径的控制上达到230nm，但是该文只说明的是对肝癌的治疗，对其它类型的癌症治疗未作说明。
中国专利201410240399.0公开了一种顺铂脂质体的制备方法，并有对肺癌细胞A549的细胞实验和实体瘤大鼠实验的支撑。但是，没有引入共载药的思路。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种铂类药物与β-榄香烯共载脂质体，该脂质体能够共传递两种药物，控制两种药物在体内释放，提高药物对肺癌的治疗效果，降低药物的毒副作用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种β-榄香烯与铂类药物共载脂质体，其特征在于，每毫升所述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体溶液由以下物质制成：
β-榄香烯0.03～0.6mg，优选0.5mg；
铂类药物0.025～0.5mg，优选0.4mg；
磷脂1～2mg，优选1.7mg
高纯胆固醇0.05～0.1mg，优选0.08mg；
聚乙二醇化磷脂0.03～0.06mg，优选0.05mg；
其余为缓冲溶液。
其中，所述铂类药物为顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂中的一种或两种以上。
所述磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂，天然磷脂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化大豆磷脂中的一种或两种以上，合成磷脂选自二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油酯、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种或两种以上。
所述聚乙二醇化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或两种以上。
所述高纯胆固醇的纯度不低于99％。
所述β-榄香烯为β-榄香烯纯品。
所述缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0～7.6，配方为柠檬酸3.27g/L、柠檬酸钠26.3g/L)、磷酸盐缓冲液(pH 6～8，配方为NaCl8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.44g/L、KH2PO40.24g/L)或碳酸盐缓冲液(pH 9.2～10.7，配方为Na2CO31.59g/L、NaHCO32.94g/L)。
本发明还提供上述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将β-榄香烯、磷脂、高纯胆固醇、聚乙二醇化磷脂加入到有机溶剂中，混匀，将混合液体旋转蒸发，蒸干有机溶剂直到混合物形成均匀的薄膜；
步骤二：在步骤一得到的薄膜中继续加入铂类药物的水溶液和缓冲溶液，室温下水浴超声4～6min，然后冰水浴超声2～4min得到均一的脂质体溶液；
步骤三：采用过滤柱纯化步骤二得到的脂质体溶液即得。
步骤一中，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、甲醇和丙酮中一种或两种以上的混合物。
步骤二中，铂类药物的水溶液的质量浓度为优选为1mg/mL。
步骤三中，所述水浴超声的频率为30～50KHZ，优选40KHZ；所述冰水浴超声的频率为300～500HZ，优选400HZ。
上述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体在制备治疗癌症药物上的应用也在本发明的保护范围中，尤其是制备治疗肺癌药物上的应用。
本发明服了传统方法只是简单地将两种联合使用的缺点，将β-榄香烯与顺铂制备成共载脂质体，分别将β-榄香烯与铂类药物分别包裹与脂质体的亲脂性双分子层中和亲水性脂质体空腔中，按各自特定的药物代动力学特点释放出药物，起到稳定的协同作用。本申请脂质体中β-榄香烯药物包封率可达45％，铂类药物包封率可达43％。所述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体水合粒径范围：110～130nm，电位：-6mv～-10mv。体外释放实验中，药物在中性介质(pH7.4)中的释放略慢于酸性介质(pH5.5)；MTT、台酚蓝和Hoechst/PI双染结果均表明单载脂质体药物组的细胞活力均小于其对应的游离药物处理组，且共载脂质体药物组显示出最强的细胞毒性；相比于游离药物组，载药脂质体组中的药物半衰期较长、清除速率较慢，药物组织分布图中可以看出，肝、脾和肾中药物的含量高于其他几个组织，且各组织中载药脂质体中的药物含量高于游离药物组；相比于游离药物组和单载脂质体药物组，共载脂质体能够更有效地抑制肿瘤的生长以及延长小鼠生存周期；H&E染色和肝、肾功能指标表明共载脂质体p是安全有效的药物载药体系。总之，经过动物体内和体外实验证实本发明的聚乙二醇修饰的β-榄香烯和顺铂共载脂质体能够提高药物对肺癌的治疗效果，降低药物毒性。
有益效果：
1、本申请将β-榄香烯与顺铂制备成共载脂质体，将β-榄香烯与铂类药物分别包裹于脂质体的亲脂性双分子层中和亲水性脂质体空腔中，按各自特定的药物代动力学特点释放出药物，起到稳定的协同作用；
2、本申请中β-榄香烯作为一种毒副作用相对较小的抗肿瘤药物，它的与铂类药物的联合应用减少了铂类药物的量，从而减少了药物对正常机体的毒副作用；
3、本申请脂质体能够可控地将两种药物包裹在脂质体中，利用EPR效应的被动靶向作用，在肿瘤部位聚集，提高肿瘤部位的脂质体浓度，提高药物的治疗效果。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为共载脂质体的透射电镜图片；
图2为共载脂质体的包封率和载药率测定；
图3为MTT法检测不同药物对A549细胞活力的影响.；
图4为台酚蓝染色法检测A549细胞死亡情况；
图5为Hoechst和PI双染法检测A549细胞晚凋和死亡情况；
图6为不同药物对药代动力学和组织分布的影响；.
图7为β-ELE-DDP-Lip显著抑制C57BL/6小鼠皮下实体瘤的生长照片(A)；不同处理组的小鼠肿瘤体积变化(B)；不同处理组小鼠生存时间(C)；不同处理组小鼠的体重变化(D)；不同处理组肿瘤切片的H&E染色(E)和TUNEL染色(F)；
图8为H&E染色考察药物对小鼠的安全性影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
实施例1
将β-榄香烯(β-ELE)、大豆磷脂(PC)、高纯胆固醇(HP-Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG)按质量比6:20:1:0.6(总共13.8mg)加入到4ml氯仿溶液中，混匀。将混合液体旋转蒸发，蒸干氯仿溶液直到混合物形成均匀的薄膜。取1mL顺铂水溶液(2.4mg/mL)与5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，pH7.2，配方:NaCl8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO41.44g/L、KH2PO4 0.24g/L，)一同加入上一步装薄膜的圆底反应瓶中，按特定条件超声：室温下水浴超声5min，频率40KHZ，然后转冰水浴超声3min，频率400HZ，至脂质体溶液均一稳定。采用G-50葡聚糖凝胶过滤柱，纯化上步制备得到的脂质体溶液。该脂质体溶液制剂可制备为注射液或冻干品，并于4℃避光保存。脂质体材料Lip的比例：PC:HP-Chol:DSPE-mPEG＝20:1:0.6，质量为10.8mg；两种药物与脂质体材料Lip的质量比：β-ELE:DDP:Lip＝3:2.4:10.8。
实施例2
将β-榄香烯(β-ELE)、大豆磷脂(PC)、高纯胆固醇(HP-Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG)按质量比6:20:1:0.6(总共13.8mg)加入到4ml氯仿溶液中，混匀。将混合液体旋转蒸发，蒸干氯仿溶液直到混合物形成均匀的薄膜。取1ml顺铂水溶液(3mg/mL)与5ml磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液pH7.2，配方:NaCl8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO41.44g/L、KH2PO4 0.24g/L)一同加入上一步装薄膜的圆底反应瓶中，按特定条件超声：室温下水浴超声5min，频率40KHZ，然后转冰水浴超声3min，频率400HZ，至脂质体溶液均一稳定。采用G-50葡聚糖凝胶过滤柱，纯化上步制备得到的脂质体溶液。该脂质体溶液制剂可制备为注射液或冻干品，并于4℃避光保存。脂质体材料Lip的比例：PC:HP-Chol:DSPE-mPEG＝20:1:0.6，质量为10.8mg；两种药物与脂质体材料Lip的质量比：β-ELE:DDP:Lip＝3:3:10.8。
实施例3
将β-榄香烯(β-ELE)、二油酰磷脂酰胆碱合成磷脂(DOPC)、高纯胆固醇(HP-Chol)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DMPE-mPEG)按质量比6:20:1:0.6(总共13.8mg)加入到4ml氯仿溶液中，混匀。将混合液体旋转蒸发，蒸干氯仿溶液直到混合物形成均匀的薄膜。取1ml奈达铂水溶液(2.4mg/ml)与5ml磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，pH6，配方:NaCl8g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO4 1.44g/L、KH2PO40.24g/L)一同加入上一步装薄膜的圆底反应瓶中，按特定条件超声：室温下水浴超声4min，频率50KHz，然后转冰水浴超声2min，频率500Hz，至脂质体溶液均一稳定。采用G-50葡聚糖凝胶过滤柱，纯化上步制备得到的脂质体溶液。该脂质体溶液制剂可制备为注射液或冻干品，并于4℃避光保存。脂质体材料Lip的比例：PC:HP-Chol:DSPE-mPEG＝20:1:0.6，质量为10.8mg；两种药物与脂质体材料Lip的质量比：β-ELE:DDP:Lip＝3:2.4:10.8。
实施例4
将β-榄香烯(β-ELE)、二油酰磷脂酰胆碱合成磷脂(DOPC)、高纯胆固醇(HP-Chol)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DMPE-mPEG)按质量比0.6:20:1:0.6(总共6.66mg)加入到4ml氯仿溶液中，混匀。将混合液体旋转蒸发，蒸干氯仿溶液直到混合物形成均匀的薄膜。取1ml奈达铂水溶液(0.15mg/mL)与5ml柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0～7.6，配方:柠檬酸3.27g/L、柠檬酸钠26.3g/L)一同加入上一步装薄膜的圆底反应瓶中，按特定条件超声：室温下水浴超声6min，频率30KHz，然后转冰水浴超声4min，频率300Hz，至脂质体溶液均一稳定。采用G-50葡聚糖凝胶过滤柱，纯化上步制备得到的脂质体溶液。该脂质体溶液制剂可制备为注射液或冻干品，并于4℃避光保存。脂质体材料Lip的比例：PC:HP-Chol:DSPE-mPEG＝20:1:0.6，质量为6.48mg；两种药物与脂质体材料Lip的质量比：β-ELE:DDP:Lip＝0.18:0.15:6.48。
实施例5
将β-榄香烯(β-ELE)、二油酰磷脂酰胆碱合成磷脂(DOPC)、高纯胆固醇(HP-Chol)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DMPE-mPEG)按质量比6:20:1:0.6(总共16.56mg)加入到4ml氯仿溶液中，混匀。将混合液体旋转蒸发，蒸干氯仿溶液直到混合物形成均匀的薄膜。取1ml奈达铂水溶液(2.4mg/mL)与5ml碳酸盐缓冲液(pH 9.2～10.7，配方：Na2CO31.59g/L、NaHCO32.94g/L)一同加入上一步装薄膜的圆底反应瓶中，按特定条件超声：室温下水浴超声5min，频率40KHz，然后转冰水浴超声3min，频率400Hz，至脂质体溶液均一稳定。采用G-50葡聚糖凝胶过滤柱，纯化上步制备得到的脂质体溶液。该脂质体溶液制剂可制备为注射液或冻干品，并于4℃避光保存。脂质体材料Lip的比例：PC:HP-Chol:DSPE-mPEG＝20:1:0.6，质量为12.96mg；两种药物与脂质体材料Lip的质量比：β-ELE:DDP:Lip＝3.6:2.4:12.96。
实施例6
将实施例1～4制备的脂质体进行透射电镜扫描成像，其中，图1a为实施例1空载脂质体Lip，图1b和图1c分别为实施例1和2制备的载药脂质体，可以发现，两种载药比例的β-ELE-DDP-Lip均为大小均一，结构稳定的球体，粒径为80nm到100nm。
实施例7
测定实施例1和2制备的两种载药比例的载药脂质体的水合粒径Size以及分散系数PDI和zeta电位，结果见表1。
表1
Figure BDA0001618837200000081
a：β-ELE:DDP:Lip＝3:0.125:10.8；
b：β-ELE:DDP:Lip＝3:2.5:10.8；
表中数值为平均值±SD(n＝3)。
实施例8
共载脂质体包封率(EE％)和载药率(LE％)的测定：
采用离心法测定，载药脂质体通过G-50葡聚糖凝胶过滤柱纯化后，取纯化后的脂质体溶液加入氯仿破坏脂质双份子层，释放出药物。再转移至离心机10000rpm离心10min，液体分层取上清，加入相应体积的DDTC溶液，处理方法同顺铂的定量分析曲线由HPLC测定包封的顺铂浓度；离心后的下层氯仿层，过0.45μm滤膜后由HPLC测定包封的β-榄香烯浓度。EE％和LE％的计算方法如下列公式(1)和公式(2)：
Figure BDA0001618837200000082
Figure BDA0001618837200000083
结果如图2A：β-ELE:DDP:Lip＝3:0.125:10.8；
图2B：β-ELE:DDP:Lip＝3:2.5:10.8。
根据图2A、2B可以看出，两种不同药脂比的脂质体中：因β-榄香烯(β-ELE)加入的量一样，所以两种载药脂质体中β-榄香烯(β-ELE)的EE％和LE％比较接近，图2A中EE％和LE％分别为45.74+2.32％和8.41+0.42％，图2B中EE％和LE％分别为44.02+2.89％和9.75.63+0.69％；而顺铂(DDP)的EE％和LE％随着加入的顺铂量的增加，载药脂质体中顺铂的LE％增加而EE％降低，图2A中EE％和LE％分别为43.03+3.62％和0.49+0.04％，图2B中EE％和LE％分别为35.23+2.32％和6.63+0.44％。
实施例9
MTT法检测共载脂质体对肺癌细胞活力的影响：
(1)将处于对数生长期的肺癌细胞消化，重悬并计数。每种细胞分两块96孔板即分别用于24h处理和48h处理。按每个孔3000个细胞的数目接种于96孔板，每块96孔板分别有8-9个药物处理组，每个处理组6个复孔。每个孔细胞培养液体积为100μL。接种细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)细胞培养24h后观察其生长状态，分别向各处理组加入对应的药物。A549细胞进行9种不同药物的处理：PBS、Lip、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip、β-ELE-DDP-Lip即依次为不加药物的空白组、不加药物的空白脂质体组、游离β-榄香烯组、β-榄香烯单载脂质体组、游离顺铂组、顺铂单载脂质体组、游离β-榄香烯与游离顺铂组、β-榄香烯单载脂质体与顺铂单载脂质体混合组、β-榄香烯与顺铂共载脂质体组，PBS处理作为Control组。A549/DDP细胞和LLC细胞进行8种不同药物的处理：PBS、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip。各组如含有药物，则各组所含的药物浓度均为：β-ELE 20μg/ml,DDP2.5μg/mL；
(3)MTT的配制：称量适量质量的MTT粉末，溶解于适量PBS得到浓度为5mg/mL的MTT溶液，经0.45μm滤膜过滤后，用适量DMEM基本培养基将MTT溶液稀释至0.5mg/mL；
(4)分别在药物处理24h和48h后，吸取孔内液体，并用PBS润洗一次，之后每孔各加入MTT溶液100μL，用铝箔纸包好避光于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4h；
(5)每孔各加入100μL15％的SDS裂解液，放回于37℃细胞培养箱中继续避光孵育12h；
(6)取出96孔板置于酶标仪中检测波长在570nm处的OD值。
结果如图3A、3B所示：与Control组相比blank-Lip组的细胞活力没有下降，表明空白脂质体对细胞没有毒性，这是因为脂质体具有生物相容性、细胞亲和性和低毒性的优点。游离药物处理组的细胞活力均大于其对应的脂质体载药组，即β-ELE、DDP、β-ELE+DDP组分别比对应的β-ELE-Lip、DDP-Lip、β-ELE-Lip+DDP-Lip组的细胞活力强。β-榄香烯与顺铂共载脂质体组β-ELE-DDP-Lip的细胞活力比β-榄香烯单载脂质体与顺铂单载脂质体混合组β-ELE-Lip+DDP-Lip要低。对3种细胞的实验结果表明相对于其它几组药物处理β-ELE-DDP-Lip显示出最强的细胞毒性。
实施例10
台酚蓝染色法检测肺癌细胞死亡情况：
(1)将处于对数生长期的A549细胞、A549/DDP细胞和LLC细胞消化，重悬并计数。每种细胞分两块24孔板，每块孔板接种4个处理组，每组3个复孔。按每个孔6000个细胞的数目接种于24孔板，每个孔细胞培养液体积为500μL；接种细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；
(2)细胞培养24h后观察其生长状态，分别向各处理组加入对应的药物处理24h；三种细胞进行8种不同药物的处理：PBS、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip、β-ELE-DDP-Lip，PBS处理作为Control组；各组如含有药物，则各组所含的药物浓度均为：β-ELE 20μg/ml,DDP 2.5μg/mL；
(3)轻轻吸取原培养液，每孔加入500μL0.4％台酚蓝溶液处理细胞1min，吸去台酚蓝溶液，加入500μLPBS轻轻润洗一遍，再加入500μL PBS，于倒置显微镜下观察，并拍照，作计数统计；
结果如图4所示：游离药物处理组的蓝色细胞均少于其对应的脂质体载药组，即β-ELE、DDP、β-ELE+DDP组分别比对应的β-ELE-Lip、DDP-Lip、β-ELE-Lip+DDP-Lip组的细胞毒性小。β-ELE和β-ELE-Lip组由于β-榄香烯的细胞毒性很小，半数致死量大，而且我们使用的是低浓度，故两组蓝色的细胞也极少。DDP、DDP-Lip和β-ELE+DDP组的蓝色细胞较多，则是顺铂有较大的细胞毒性所致。由台酚蓝照片对应的统计图表明β-ELE-DDP-Lip处理组死细胞比例略微高，β-ELE-Lip+DDP-Lip组这也与MMT实验结果相符合，表明了β-ELE-DDP-Lip有较强的细胞毒性。
实施例11
Hoechst和PI双染法检测肺癌细胞晚凋和坏死情况：
(1)将处于对数生长期的A549细胞、A549/DDP细胞和LLC细胞细胞消化，重悬并计数。每种细胞分两块24孔板，每块孔板接种4个处理组，每组3个复孔；按每个孔6000个细胞的数目接种于24孔板，每个孔细胞培养液体积为500μL；接种细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；
(2)细胞培养24h后观察其生长状态，分别向各处理组加入对应的药物处理24h；三种细胞进行8种不同药物的处理：PBS、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip、β-ELE-DDP-Lip，PBS处理作为Control组；各组如含有药物，则各组所含的药物浓度均为：β-ELE 20μg/mL，DDP 2.5μg/mL；
(3)轻轻吸取原培养液，加入500μLPBS后各加入Hoechst和PI染液，轻轻摇匀，于37℃孵箱中继续避光孵育20min,于荧光倒置显微镜下观察，绿色荧光激发PI染料，紫外光激发Hoechst染料，拍照作计数统计。
体内抗肿瘤效果评估。
依据图5结果表明：β-ELE-DDP-Lip组的晚期凋亡细胞比例和坏死细胞的比例均高于其它几组，表明β-ELE-DDP-Lip有更大的细胞毒性。每组药物的脂质体组的相比较其游离药物组Hoechst蓝色染色的皱缩，亮蓝细胞和PI红色染色的细胞比例均较高，这也吻合了MTT和台酚蓝染色实验的结果，表明了脂质体载体提高药物毒性的优点。
实施例12
药代动力学和组织分布：
(1)药代动力学实验：
β-榄香烯组：将C57BL/6小鼠(16-20g)随机分成3组每组3只，以4mgβ-榄香烯/kg体重的药物与小鼠体重比例分别尾静脉注射β-ELE、β-ELE-Lip和β-ELE-DDP-Lip。在注射药物6个时间点：0.25h，0.5h，1h，2h，4h和12h后，分别摘眼球，眼静脉取血，处理血液样品后，通过HPLC来测定血液中β-榄香烯的含量。由所测定的各个时间点的药物浓度，绘制药物的浓度-时间曲线，并使用PK Solver2.0软件分析出β-ELE、β-ELE-Lip和β-ELE-DDP-Lip的药代动力学参数。
顺铂组：血液样品处理步骤同上，再经过顺铂与DDTC的处理步骤处理后，通过HPLC来测定血液中顺铂的含量。由所测定的各个时间点的药物浓度，绘制药物的浓度-时间曲线，并使用PK Solver2.0软件分析出DDP、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip的药代动力学参数。
(2)组织分布实验：
β-榄香烯组：将C57BL/6小鼠(18-22g)随机分成3组每组3只，以4mgβ-榄香烯/kg体重的药物与小鼠体重比例分别尾静脉注射β-ELE、β-ELE-Lip和β-ELE-DDP-Lip。药物注射后分别于2h和12h解剖小鼠取出组织样品：脑、心、肺、肾、肝、脾，组织经过进一步处理后，经HPLC测定，换算组织中β-榄香烯的含量。
顺铂组：组织破碎步骤同上，再经过顺铂与DDTC的处理步骤处理后，加氯仿定容至1mL，经HPLC测定，换算出组织中顺铂的含量。
绘制出血浆中顺铂和β-榄香烯的浓度-时间曲线如图6A，6B。这5种药物的药代动力学曲线符合静脉注射给药的双室模型，表2和表3是根据PK Solver2.0软件分析计算出的药代动力学参数。
表2
Figure BDA0001618837200000121
表3
Figure BDA0001618837200000131
由浓度-时间曲线图6A、6B可见，游离顺铂和游离β-榄香烯的血药浓度随时间变化下降较快，对应时间点的浓度均低于载药脂质体β-ELE-Lip、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip。结合表2，顺铂(DDP)的分布相半衰期(t1/2α)，清除相半衰期(t1/2β)以及清除率(CL)分别为0.07h、0.92h和1.19mL/g·h。DDP-Lip的t1/2α(0.21h)、t1/2β(3.49h)和CL(0.66mL/g·h)分别是DDP的3倍、3.79倍和5/9。并且β-ELE-DDP-Lip的t1/2α(0.18h)、t1/2β(3.52h)和CL(0.65mL/g·h)分别是DDP的2.57倍、3.82倍和近5/9。DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip曲线下面积(AUC0→∞)和保留时间(MRT)也有同样的变化趋势。游离药物的半衰期短、清除速率快以及血液中保留时间短的原因：药物由血液输入体内后会迅速血浆蛋白结合，之后被内皮网状吞噬系统(RES)识别并摄取，这也使得游离药物毒副作用较大、生物利用度低以及药物治疗效果不佳。
由上述结果显示：相比于游离药物组载药脂质体组β-ELE-Lip、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip的半衰期较长、清除速率较慢以及血液中保留时间也较长，原因是聚乙二醇(PEG)对脂质体的隐形作用。
以5mg顺铂/kg体重和4mgβ-榄香烯/kg体重的药物与小鼠体重比例分别尾静脉注射β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip，分别于2h和12h处理组织样品：脑、心、肺、肾、肝、脾，并检测绘制出顺铂和β-榄香烯的组织分布图6C、6D。从图中可以看出，肝、脾和肾中药物的含量高于其他几个组织，由于相较于体内其它器官肝和脾中单核—吞噬细胞系统分布较多，药物被单核—吞噬细胞系统捕获的含量因而在肝和脾中较多，肾脏是药物代谢和排泄的重要器官，因而其中药物含量也较多。图中还可以看出，各个组织中载药脂质体β-ELE-Lip、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip的药物含量高于游离药物组β-ELE和DDP，这也是由于聚乙二醇(PEG)对脂质体的隐形作用。
实施例13
体内抗肿瘤效果评估：
小鼠皮下肿瘤造模完成后，每日观察肿瘤生长情况，并测量肿瘤的最大直径，记为a,最小直径记为b,则肿瘤体积按照V＝ab2/2计算，直到肿瘤体积接近50mm3时将小鼠随机分为8个组，每组6只。分别给予8种药物处理：以4mgβ-榄香烯/kg体重和5mg顺铂/kg体重的药物与小鼠体重比例分别尾静脉注射PBS、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip、β-ELE-DDP-Lip，PBS处理作为Control组。从给药起第一天记为0天，每隔4天测量并记录每组小鼠的体重和肿瘤体积，持续记录到24天。在第24天每组随机取出一只小鼠，经过灌注处理后取出肿瘤组织，制作为石蜡切片，分别进行H&E染色(按2.2.10组织化学染色步骤)和TUNEL染色(按试剂盒说明书上步骤)，以考察不同药物处理组的肿瘤切片的组织形态和肿瘤细胞的凋亡信号。每组的另外5只，每日观察直至死亡，记录其生存的时间。
图7A给出了第24天各加药组小鼠肿瘤的照片。在第24天，观察到PBS处理组肿瘤体积达到了6000m3(见7B)；而β-ELE和β-ELE-Lip处理组，因为β-ELE的药物毒性小，且使用量小，对肿瘤的抑制作用小，肿瘤体积增长也较快，接近6000m3；DDP和β-ELE+DDP药物处理组由于DDP的药物毒性大，肿瘤生长较慢，肿瘤体积达到4000m3左右DDP-Lip处理组由于脂质体载体的作用，对肿瘤生长的抑制表现出比DDP和β-ELE+DDP药物处理组更强的抑制效果；β-ELE-Lip+DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip处理组的肿瘤生长明显低于其它组，而共载脂质体组β-ELE-DDP-Lip处理组的肿瘤生长最缓慢，体现出其显著提高体内实体瘤的治疗效果。
对荷瘤小鼠生存时间的记录统计如图7C，β-ELE-DDP-Lip处理组的小鼠的平均生存时间最长达到44天，可见其抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间的显著效果，作为含有顺铂脂质体组的DDP-Lip和β-ELE-Lip+DDP-Lip处理组的平均生存时间分别为35天和36天，比DDP组的30天要长，表现出脂质体载药体系较好的治疗效果。
对荷瘤小鼠体重的变化趋势的记录如图7D所示，PBS处理组，小鼠体重随着肿瘤的快速增大，持续性的增加；β-ELE和β-ELE-Lip处理组也接近PBS组的趋势；对于含顺铂脂质体的处理组DDP-Lip、β-ELE-Lip+DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip组小鼠体重持续增长，略低于PBS组；含游离DDP的DDP和β-ELE+DDP药物处理组，由于给药初期对正常生理表现出系统毒性，小鼠体重经历一个下降的过程，之后又缓慢增长；β-ELE-DDP-Lip组小鼠体重持续较为缓慢地增长，表明了其作为低毒，有效的载药体系的优越性。
从组织学上考察不同药物处理组对小鼠肿瘤的影响，取给药第24天后小鼠肿瘤，做石蜡切片，H&E染色。如图7E和7F，PBS、β-ELE和β-ELE-Lip组肿瘤组织的细胞排列紧密，细胞质饱满，细胞核数量所占比例多，表明增殖状态。而DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip处理组的肿瘤切片都不同程度地体现出：细胞排列疏松，细胞质萎缩，细胞核数量占比例减小；β-ELE-DDP-Lip药物处理组细胞间隙最大，细胞萎缩最严重，细胞核数目比例也最少，体现出其对肿瘤细胞最显著的抑制效果。
实施例14
组织化学染色：
为了评价载药脂质体的系统毒性，将C57BL/6小鼠(16-20g)随机分成8组，对小鼠分别给予尾静脉注射8种不同药物的处理：PBS、β-ELE、β-ELE-Lip、DDP、DDP-Lip、β-ELE+DDP、β-ELE-Lip+DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip，其中含药物组分别以5mgDDP/kg体重和4mg/kg体重的药物与小鼠体重比例注射，每组5只。注射第21天后解剖小鼠，经过灌注麻醉处理，解剖取出小鼠的肝脏和肾脏，于4％多聚甲醇浸泡过夜。再由脱水，透明，包埋，切片，贴片等步骤处理后进行H&E染色。
实验结果如图8A和图8B分别为肾和肝H&E染色的照片。图8A中，β-ELE、β-ELE-Lip、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip与对照组PBS组形态接近，肾小球和肾小管形态正常，细胞浆及细胞核染色清晰，没有观察到病变部位。而药物性损伤一般是间质性肾炎，表现出肾间质水肿。DDP组和β-ELE+DDP组肾切片，可以观察到水肿的细胞间质。图8B中，β-ELE、β-ELE-Lip、DDP-Lip和β-ELE-DDP-Lip与对照组PBS组肝细胞形态接近，肝细胞排列紧密，肝小板和细胞核清晰，胞浆均匀染色。相比于其他几组，DDP组和β-ELE+DDP组的肝切片细胞形态变化不明显，可能是肝脏具有代偿功能，使得肝细胞得到恢复。
本发明提供了一种β-榄香烯与铂类药物共载脂质体及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (4)

1.一种β-榄香烯与铂类药物共载脂质体，其特征在于，每毫升所述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体由以下物质制成：
β-榄香烯0.03~0.6 mg，
铂类药物0.025~0.5 mg，
磷脂1~2 mg，
高纯胆固醇 0.05~0.1 mg，
聚乙二醇化磷脂0.03~0.06 mg，
其余为缓冲溶液；
所述铂类药物为顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂中的一种或两种以上；
所述磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂，天然磷脂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化大豆磷脂中的一种或两种以上，合成磷脂选自二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油酯、( 2 ,3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种或两种以上；
所述聚乙二醇化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一种或两种以上；
该β-榄香烯与铂类药物共载脂质体通过如下步骤制备：
步骤一：将β-榄香烯、磷脂、高纯胆固醇、聚乙二醇化磷脂加入到有机溶剂中，混匀，将混合液体旋转蒸发，蒸干有机溶剂直到混合物形成均匀的薄膜；
步骤二：在步骤一得到的薄膜中继续加入铂类药物的水溶液和缓冲溶液，室温下水浴超声4~6min，然后冰水浴超声2~4min得到均一的脂质体溶液；
步骤三：采用过滤柱纯化步骤二得到的脂质体溶液即得；
步骤二中，所述水浴超声的频率为30~50KHZ；所述冰水浴超声的频率为300~500HZ；
所述高纯胆固醇的纯度不低于99%。
2.根据权利要求1所述的一种β-榄香烯与铂类药物共载脂质体，其特征在于，所述缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
3.权利要求1或2中任意一项所述β-榄香烯与铂类药物共载脂质体在制备治疗癌症药物上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌症为肺癌。
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