DE69531701T2

DE69531701T2 - Sphingosome mit verbesserter arzneistoffabgage

Info

Publication number: DE69531701T2
Application number: DE69531701T
Authority: DE
Inventors: S. Murray WEBB; B. Marcel BALLY; D. Lawrence MAYER; M. James MILLER; G. Paul TARDI
Original assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Arbutus Biopharma Corp
Priority date: 1994-06-20
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2015-06-20
Also published as: ES2206510T3; DE69531701D1; JPH10501534A; CA2193502A1; ATE248586T1; CA2193502C; JP3270478B2; EP0804159A1; PT804159E; WO1995035094A1; US5543152A; AU2709495A; EP0804159B1

Description

Liposomale Formulierungen für therapeutisch aktive Medikamente weisen signifikante Vorteile gegenüber Medikamenten auf, die in freier Form injiziert werden. Weinstein, Liposomes: From Biophysics to Therapeutics, (Ostro, M. J., ed.), Marcel Dekker, Inc., NY, Seiten 277–338, (1987). Zum Beispiel weisen liposomale Formulierungen des Anti-Krebs-Alkaloides Vincristin eine grössere Wirksamkeit gegen L1210 Leukämiezellen auf als freies Vincristin, und sie weisen eine geringere begleitende Toxizität auf. Mayer et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 33: 17–24 (1993) und Mayer et al., Cancer Res. 50: 575–579 (1990). Die Entwicklung liposomaler Formulierungen von therapeutischen Wirkstoffen mit klinischen und/oder pharmazeutischem Potential hängt von der Liposom/Medikament-Kombination, die sowohl biologische Wirksamkeit als auch langfristige chemische Stabilität besitzt, ab. Im allgemeinen kann die Wirksamkeit eines liposomalen Wirkstoffes durch Erhöhung sowohl der Lebensdauer des Liposoms im Kreislauf als auch der Fähigkeit des Liposoms, das eingeschlossene Medikament zurückzuhalten, verbessert werden. Mayer, ebenda und- Boman et al., Cancer Res. 54: 2830–2833 (1994). Deshalb wurden viele Anstrengungen auf die Entwicklung liposomaler Formulierungen von therapeutischen Verbindungen konzentriert, die sowohl verlängerte Kreislaufszeiten als auch eine verbesserte Medikamentenretention aufweisen.
Eine grosse Vielfalt therapeutischer Wirkstoffe können in Liposome unter Verwendung eines transmembranösen pH-Gradienten mit Verkapselungseffizienzen von ca. 100% geladen werden. Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 1025: 143–151 (1990) und Madden et al., Chem. Phys. Lipids 53: 37–46 (1990). Die chemische Stabilität dieser Formulierungen, das heisst die effektive Retention der geladenen Medikamente in den Liposomen während der Zirkulation in vivo, verlangt häufig, dass der intraliposomale pH in dem Bereich zwischen pH 2,0 und 4,0 liegt. Innerhalb dieses pH-Bereiches kann jedoch eine saure Hydrolyse des Acyl-Bestandteiles der Liposome die liposomalen Membranen destabilisieren und in einem vorzeitigen Verlust des Medikamentes resultieren.
Vincristin kann zum Beispiel effizient durch ein pH-Gradient-abhängiges Verkapselungsverfahren, welches einen intraliposomalen pH von 4,0 verwendet, in Liposome geladen werden. Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 1025: 143–151 (1990) und Mayer et al., Cancer Res. 50: 575–579 (1990). Die Arbeit mit liposomalem Vincristin basiert auf Vesikeln, die Phosphatidylcholin (PC), normalerweise Ei-PC oder Distearoyl-PC und Cholesterin enthalten. Mayer et al., 1993, siehe oben. Verstärkte Anti-Tumor-Wirksamkeit von liposomalem Vincristin tritt auf, wenn die in vivo-Retention von Vincristin in den Liposomen unter Verwendung eines 100fach grösseren (das heisst intraliposomaler pH = 2,0), transmembranösen pH-Gradienten vergrössert wird. Boman et al., siehe oben. Bei diesem pH tritt die Säurehydrolyse des PC-Bestandteiles des Liposoms jedoch in einem signifikanten Maße auf und beschränkt die chemische Stabilität der Liposome deutlich. Insbesondere sind die Fettsäurecarboxylester an den Positionen sn-1 und sn-2 besonders anfällig für Säurehydrolyse, welche lyso-PC und freie Fettsäuren ergibt. Grit et al., Chem. Phys. Lipids 64: 3–18 (1993). Liposome, die signifikante Anteile an lyso-PC enthalten, sind durchlässiger für gelöste Stoffe und wären demnach als Träger für die Medikamentenabgabe ungeeignet.
Es ist berichtet worden, dass Sphingomyelin eine Zunahme der Lebensdauer von Liposomen im Kreislauf verleiht. Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 981: 27–35 (1989) und Allen et al., FEBS Lett. 223: 42–46 (1987). Diese Studien verwendeten jedoch einen eingeschlossenen, wässerigen, gelösten Stoff (¹²⁵I-Tyraminylinulin) als einen Marker der Liposomverteilung, und die augenscheinliche Zunahme der Lebensdauer des Liposoms in der Gegenwart von Sphingomyelin könnte zumindest zum Teil aus der vermehrten Retention des gelösten Stoffes durch Sphingomyelin resultiert haben. Es gab auch verschiedene Berichte, dass Sphingomyelinenthaltende Liposome toxischer seien als PC-enthaltende Liposome. Weereratne et al., Brit. J. Exp. Pathol. 64: 670–676 (1983), Allen et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 229: 267–275 (1984) und Allen et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 50: 281–290 (1985). Obwohl aufschlussreichere Studien nicht erhältlich sind, besteht die Annahme, dass Sphingomyelin-enthaltende Liposome mit einem höherem Toxizitätsrisiko verbunden sind.
WO 88/04924 (Liposome Technology Inc.) offenbart ein Liposom, das mit ¹²⁵I-Tyraminylinulin geladen ist. Das Liposom umfasst Sphingomyelin und Cholesterin im Verhältnis 2 : 1. Im Vergleich mit einem äquivalenten Phosphatidylcholin : Cholesterin-Liposom, gibt es einen signifikant niedrigeren Anteil an radiomarkierter Verbindung, die 2 Stunden nach Injektion in vivo verbleibt.
WO 88/06442 (The Liposome Company Inc.) offenbart liposomale Zusammensetzungen von antineoplastischen Wirkstoffen. Die Liposome umfassen Phospholipide und Cholesterin. Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Ladung der Liposome mit antineoplastischen Wirkstoffen mit Hilfe eines pH-Gradienten.
WO 90/14105 (The Liposome Company Inc.) offenbart Liposome, die Phosphatidylcholin und Cholesterin umfassen. Die Ladung von phannazeutischen Wirkstoffen in die Liposome wird durch Anwendung von Puffern, die die Löslichkeit der Wirkstoffe, wenn sie in den Liposomen eingeschlossen sind, erhöhen, verbessert.
Liposomale Formulierungen von therapeutischen Verbindungen, die eine erhöhte biologische und chemische Stabilität aufweisen, werden in dem Fachgebiet gebraucht. Da die Wirksamkeit von liposomalen Wirkstoffen durch Zunahme der Kreislaufzeit des Liposoms und der Fähigkeit des Liposoms, das eingekapselte Medikament zurückzuhalten, verbessert werden kann, wäre die Entwicklung von liposomalen Formulierungen, die diese Eigenschaften aufweisen, eine wertvolle Ergänzung für die klinischen Behandlungsregime. Ziemlich überraschend, erfüllt die vorliegende Erfindung diese und andere, ähnliche Bedürfnisse.
Die vorliegende Erfindung stellt eine liposomale Zusammensetzung, welche ein Liposom, das eine oder mehr Membranen, welche Sphingomyelin und Cholesterin umfassen, aufweist, ein liposomales Inneres, das einen sauren pH, der geringer ist als der des liposomalen Äusseren aufweist, und eine therapeutische Verbindung, die in dem Liposom zur Verabreichung an den Empfänger enthalten ist; umfasst, für die Abgabe einer therapeutischen Verbindung an einen Säugetierempfänger bereit.
Sphingomyelin und Cholesterin liegen typischerweise in einem molaren Verhältnis von 75/25 mol%/mol% beziehungsweise von 30/50 mol%/mol% und in einem vorzuziehenden Beispiel in einem Verhältnis von ungefähr 55/45 mol%/mol% vor.
Die therapeutische Verbindung kann ein Alkaloid wie Vincristin, Vinblastin, Swainsonin oder Etoposid oder eine Vorstufe davon sein.
Das Medikament, wie zum Beispiel Vincristin, kann in einem Medikament-zu-Lipid-Verhältnis von ca. 0,01/1,0 bis 0,2/1,0 (Gew./Gew.) vorliegen. Swainsonin kann in einem Medikament zu Lipid-Verhältnis von 0,01 : 1,1 bis 0,5 : 1,0 (mol : mol) vorliegen.
Zielführende Liganden und andere Lipide können ebenfalls als Bestandteile der Liposome vorliegen, solange sie nicht die Stabilität des Medikamentes oder des Liposoms nachteilig beeinflussen.
Die Liposome können unilaminar oder multilaminar sein und weisen normalerweise durchschnittliche Durchmesser von ungefähr 0,05 μm (micron) bis 0,45 μm (micron) und mehr vorzuziehen von ungefähr 0,05 μm (micron) bis 0,2 μm (micron) auf. Das Innere des Liposoms weist typischerweise einen pH von ca. pH 2 bis pH 6 auf, zum Beispiel umfassend einen Zitratpuffer bei ungefähr pH 4.
Die Erfindung stellt ebenfalls Liposome für die Verabreichung einer therapeutischen Verbindung bereit, welche aus einer Mischung, welche Sphingomyelin und Cholesterin in einer ersten gepufferten wässerigen Lösung, die einen sauren pH grösser als pH 2 aufweist, umfasst, hergestellt werden. Das Liposom wird dann in einer zweiten gepufferten Lösung, die einen pH aufweist, der grösser ist als der der ersten gepufferten wässerigen Lösung, suspendiert, wodurch ein transmembranöser pH-Gradient gebildet wird, der den Transfer der therapeutischen Verbindung zu dem Liposom erleichtert. In einigen Ausführungsarten können in dem Verfahren auch andere passive Mittel des Medikamenteneinschlusses bei einem niedrigen intraliposomalen pH verwendet werden. Diese alternativen Verfahren gehen normalerweise mit einem weniger effizienten Medikamenteneinschluss einher, und es kann daher ein zusätzlicher Schritt zur Trennung des Liposoms von dem zweiten Puffer, der freies Medikament enthält, notwendig sein.
Die Erfindung erlaubt Verfahren für die verbesserte Abgabe einer lipophilen therapeutischen Verbindung wie eines Alkaloides an einen Empfänger zur Behandlung. Dem Empfänger, der die Behandlung benötigt, wie zum Beispiel einem Patientem, der an einem Tumor leidet, wird die liposomale Zusammensetzung, welche ein Liposom, das eine oder mehr Membranen, welche Sphingomyelin und Cholesterin umfassen, aufweist, ein liposomales Inneres, das einen sauren pH, der geringer ist als der des liposomalen Äusseren aufweist, und eine therapeutische Verbindung, die in dem Liposom zur Verabreichung an den Empfänger enthalten ist oder ein akzeptables Salz davon, umfasst, verabreicht. Der pH-Gradient kann durch einen Methylammonium- oder Ethanolammonium-Konzentrationsgradienten hervorgerufen werden. Typischerweise liegt das Cholesterin in der liposomalen Verbindung in einem molaren Gesamtverhältnis von 30% bis 50% vor und mehr vorzuziehen liegen das Sphingomyelin und das Cholesterin in einem Verhältnis von ungefähr 75/25 mol%/mol%, beziehungsweise von 30/50 mol%/mol% vor. Die Abgabe einer Alkaloid-Verbindung wie zum Beispiel Vincristin oder Swainsonin ist für diese Verfahren besonders geeignet. Vincristin und Swainsonin können in einem Medikament-zu-Lipid-Verhältnis von ca. 0,01/1,0 bis 0,2/1,0 (Gew./Gew.) beziehungsweise von 0,01/1,0 bis 0,5/1,0 (mol/mol) vorliegen. In jedem Fall kann die liposomale Zusammensetzung, die das Medikament enthält, wiederholt an den Empfänger verabreicht werden, um eine zur Verhinderung oder Behandlung der Krankheit, zum Beispiel eines Tumors, ausreichende Konzentration des Medikamentes zu erhalten, aber weniger als eine Menge, die eine inakzeptable Toxizität für den Empfänger hervorruft. Die Verabreichung kann auf einer Vielzahl von Wegen geschehen, aber die Alkaloide werden bevorzugt intravenös oder parenteral gegeben. Swainsonin wird bequemerweise oral verabreicht. Die Liposome, die dem Empfänger verabreicht werden, können unilaminar sein und einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,05 μm bis 0,45 μm (micron), mehr vorzuziehen von 0,05 μm bis 0,2 μm (micron) aufweisen.
Die Erfindung erlaubt auch Verfahren für die Abgabe einer immunmodelierenden Alkaloidverbindung in einer liposomalen Zusammensetzung an einen Empfänger. Der Empfänger kann an einer durch Chemotherapie hervorgerufenen Immunsuppression leiden und zum Beispiel mit einer liposomalen Zusammensetzung von Swainsonin behandelt werden. Die liposomale Zusammensetzung umfasst ein Liposom, welches eine oder mehr Membranen, welche Sphingomyelin und Cholesterin umfassen, aufweist, ein liposomales Inneres, das einen sauren pH, der geringer ist als der des liposomalen Äusseren aufweist, und eine therapeutische Verbindung, die in dem Liposom zur Verabreichung an den Empfänger enthalten ist oder ein akzeptables Salz davon. Vorzugsweise wird Swainsonin oral, intravenös oder parenteral gegeben.
1 veranschaulicht die Hydrolyse von grossen, unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (O) SM/Chol (55/45, mol/mol) (•) bei 37°C in 0,3 M Zitrat, pH 2,0.
2A und 2B veranschaulichen die Menge an Lipid, die in dem Kreislauf von BDF1-Mäusen verbleibt, denen grosse, unilaminare Liposome aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (O), SM/Chol (55/45, mol/mol) (•) oder SM/ChoVPEG-PE (55/40/5, mol/mol/mol) (
) injiziert wurden. Die injizierten Liposome waren entweder leer (2A) oder mit Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von ca. 0,1 (2B) geladen. Die injizierte Dosis an Lipid betrug 20 mg/kg, entsprechend einer Gesamtinjektion von ca. 430 μg Lipid.
3 beschreibt das Vincristin/Lipid-Verhältnis im Plasma von BDF1-Mäusen zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion von grossen, unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (O), SM/Chol (55/45, mol/mol) (•) oder SM/Chol/PEG-PE (55/40/5, mol/mol/mol) (
). Die Mäuse wurden mit Liposomen in einem Vincristin/Lipid-Verhältnis von ca. 0,1 injiziert, entsprechend einer Lipiddosis von 20 mg/kg und einer Vincristindosis von 2,0 mg/kg. Die injizierten Gesamtmengen betrugen ca. 430 μg Lipid und 43 μg Vincristin.
4 zeigt das gesamte Vincristin, das im Plasma von BDF1 Mäusen zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion von grossen unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (O), SM/Chol (55/45, mol/mol) (•) oder SM/Chol/PEG-55/40/5, mol/mol/mol (
) verblieb. Die Mäuse wurden mit Liposomen in einem Vincristin/Lipid-Verhältnis von ca. 0,1 injiziert, entsprechend einer Lipiddosis von 20 mg/kg und einer Vincristindosis von 2,0 mg/kg. Die injizierten Gesamtmengen betrugen ca. 430 μg Lipid und 43 μg Vincristin.
5 zeigt die Aufnahme von grossen, unilaminaren Liposomen aus SM/Chol (55/45, mol/mol) und DSPC/Chol (55/45, mol/mol) durch peritoneale Makrophagen.
Liposome, die nicht-austauschbare und nicht-metabolisierte, radiomarkierte ¹⁴CCHDE enthalten, wurden mit 100 mg/kg parenteral injiziert. Nach 4 Stunden wurden Makrophagen durch Lavage gewonnen und die Zellen und das Lipid durch Hämocytometrie beziehungsweise Flüssig-Szintillationszählung bestimmt.
6 beschreibt die Ladung von Vincristin in P388-Tumore. Abgabe von Vincristin an peritoneale P388-Tumore in BDF1 Mäuse nach i.v.-Injektion von grossen, unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (O), SM/Chol (55/45, mol/mol (•) oder SM/Chol PEG–PE (55/40/5, mol/mol/mol) (
), die Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von 0,1 (Gew./Gew.) enthielten. Vincristin wurde in einer Dosis von 20 mg/kg injiziert, entsprechend einer Lipiddosis von 20 mg/kg.
Die 7A-7C zeigen zusammen die Anti-Tumor-Wirksamkeit liposomaler Formulierungen von Vincristin. BDF1-Mäuse, die P388-Tumore enthielten, wurden mit grossen, unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) (∇), SM/Chol (55/45, mol/mol) (❐) oder SM/Chol/PEG-PE (55/40/5, mol/moVmol) (Δ), die Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von 0,1 (Gew./Gew.) enthielten, injiziert. Kontrollmäuse erhielten keine Injektion (•). Die Liposomkonzentrationen vor der Injektion wurden so angepasst, dass Vincristindosierungen von 1,0 (7A), 2,0 (7B) und 4,0 (7C) mg/kg erreicht wurden.
8 zeigt Blutspiegel von radiomarkiertem Swainsonin in Balb/c-Mäusen, das entweder als liposomale Formulierung (L-Im) oder als eine wässerige Lösung des freien Medikamentes (F-Im) verabreicht wurde. Die Formulierungen wurden oral über Sonde (p.o.), intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) verabreicht. Blut wurde 1 Std., 3 Std., 6 Std. und 24 Std. nach der Dosis abgenommen.
9 zeigt die Wirkungen von GM-CSF und Swainsonin auf das Knochenmarkszellvorkommen 14 Tage nach der chemotherapeutischen Verabreichung an C57BU6-Mäuse.
10A beziehungsweise 10B veranschaulichen die TNF-Produktion aus LPSstimulierten Splenozyten und IL-2-Produktion aus ConA-stimulierten Splenozyten, gesammelt aus C57BU6-Mäusen 14 Tage nach chemotherapeutischer Behandlung.
11A und 11B zeigen Vincristinspiegel im (A) Plasma und (B) Tumoren nach Verabreichung von freiem und liposomalem Vincristin an SCID-Mäuse, die A431-Tumore tragen. SCID-Mäuse, die zwei A431-Tumore trugen, wurden mit freiem Vincristin (?) oder mit grossen, unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (O) oder SM/Chol (•), die Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von 0,1 (Gew./Gew.) enthielten, i.v. injiziert. Vincristin wurde in einer Dosis von 2,0 mg/kg injiziert, entsprechend einer Lipiddosis von 20 mg/kg. Die Daten stellen die Mittelwerte (+/– Standard-abweichung) von drei Mäusen (6 Tumore) dar; wo keine Standardabweichungsbalken sichtbar sind, sind sie kleiner als die Grösse des Symbols.
12 zeigt die Anti-Tumor-Wirksamkeit von freiem und liposomalem Vincristin in SCID-Mäusen, die A431-Tumore tragen. SCID-Mäuse, die zwei A431-Tumore tru en, erhielten keine Behandlung (
), oder wurden mit freiem Vincristin (?) oder mit grossen unilaminaren Liposomen aus DSPC/Chol (O) oder SM/Chol (•), die Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von 0,1 (Gew./Gew.) enthielten, i.v. injiziert. Vincristin wurde in einer Dosis von 2,0 mg/kg injiziert, entsprechend einer Lipiddosis von 20 mg/kg. Die Daten stellen das Gewicht der A431-Tumore dar (ausgedrückt als Prozent des Tumorgewichtes direkt vor der Behandlung) und sind die Mittelwerte (+/– Standardabweichung) von 8–10 Tumoren in 4–5 Mäusen.
13 zeigt die prozentuale Retention von Swainsonin in Liposomen, die bei 37°C bei pH 2 inkubiert wurden, über die Zeit. Swainsonin wurde in einem Medikament zu Lipid-Verhältnis von 0,2/1,0 (mol/mol), unter Verwendung von 0,3 M Zitrat pH 4 (ausgenommen SM/Chol bei pH 2), in Liposome geladen. EPC, Ei- Phosphotidylcholin; EPC/Chol, Ei-Phosphotidylcholin/Cholesterin (55%/45%) (mol/mol); SM/Chol, Sphingomyelin/ Cholesterin (55%/45%) (mol/mol).
14 zeigt die prozentuale Retention von Swainsonin in Liposomen, die bei 37°C in HEPES-gepufferter Salzlösung (HPS) pH 7,5 inkubiert wurden, über die Zeit.
15 zeigt die prozentuale Retention von Swainsonin in Liposomen, die bei 37°C in normalem Mäuseserum inkubiert wurden, über die Zeit.
Die Zusammensetzungen der Erfindung bieten eine verbesserte Abgabe von therapeutischen Verbindungen an einen Empfänger. Die liposomalen Formulierungen der Erfindung weisen verlängerte Lebensdauern im Kreislauf und/oder verbesserte Medikamentenretention auf. Die Liposome, auch als "Sphingosome" bezeichnet, bestehen aus Sphingomyelin und Cholesterin und weisen einen sauren intraliposomalen pH auf. Die liposomalen Formulierungen, basierend auf Sphingomyelin und Cholesterin weisen im Vergleich mit anderen Formulierungen einige Vorteile auf. Die Sphingomyelin/Cholesterin-Kombination ergibt Liposome, die sehr viel stabiler gegenüber Säurehydrolyse sind, signifikant bessere Medikamentenretentionseigenschaften aufweisen, bessere Ladungseigenschaften in Tumore und dergleichen aufweisen und signifikant bessere Anti-Tumor-Wirksamkeit zeigen, als andere liposomale Formulierungen, die getestet wurden.
"Liposome", "Vesikel" und "liposomale Vesikel" sollen so verstanden werden, dass sie Strukturen anzeigen, die lipidhaltige Membranen, die ein wässeriges Inneres umschliessen, aufweisen. Die Strukturen können eine oder mehrere Lipidmembranen aufweisen, ausser wenn anders angegeben, obwohl die Liposome im allgemeinen nur eine Membran aufweisen werden. Solche einschichtigen Liposome werden hier als "unilaminar" bezeichnet. Vielschichtige Liposome werden hier als "multilaminar" bezeichnet.
Die Liposomzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus Sphingomyelin und Cholesterin. Das Verhältnis von Sphingomyelin zu Cholesterin, das in dem Liposom vorliegt, kann unterschiedlich sein, liegt aber in allgemeinen in dem Bereich von 75/25 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin bis 30/50 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin, mehr vorzuziehen bei ungefähr 70/30 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin bis 40/45 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin, und am besten ist ungefähr 55/45 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin. Andere Lipide können, wenn es nötig ist in den Formulierungen vorliegen, wie zum Beispiel um Lipidoxidation zu verhindern oder um Liganden an die Liposomoberfläche zu binden. Im allgemeinen wird der Einschluss von anderen Lipiden zu einer Abnahme in dem Sphingomyelin/Choles-terin-Verhältnis führen.
Eine grosse Vielzahl therapeutischer Verbindungen können durch die Liposome und Verfahren der vorliegenden Erfindung abgegeben werden. "Therapeutische Verbindung" soll zum Beispiel Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Onkolytica, Antünfektiva, Anxiolytika, Psychotropika, Immunmodulatoren, Ionotropika, Toxine wie Gelonin und Inhibitoren der eukaryonten Proteinsynthese und dergleichen einschliessen. Unter den therapeutischen Verbindungen werden für den Einschluss in den Liposomen der vorliegenden Erfindung diejenigen vorgezogen, die lipophile Kationen sind. Unter diesen befinden sich therapeutische Wirkstoffe der Klasse der lipophilen Moleküle, die in der Lage sind, sich in der zweischichtigen Lipidphase des Liposoms zu verteilen und die daher in der Lage sind, sich mit den Liposomen in einer Membranform zu verbinden.
Typische Medikamente schliessen Prostaglandine, Amphotericin B, Methotrexat, Cisplatin und Derivate, Vincristin, Vinblastin, Progesteron, Testosteron, Östradiol, Doxorubicin, Epirubicin, Beclomethason und Ester, Vitamin E, Cortison, Dexamethason und Ester, Betamethasonvalerat und andere Steroide, etc. ein.
Besonders vorzuziehende therapeutische Verbindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die Alkaloid-Verbindungen und ihre Derivate. Unter diesen sind Swainsonin und Mitglieder der Vinca-Alkaloide und ihre semisynthetischen Derivate, wie zum Beispiel Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Etoposid, Etoposidphosphat und Teniposid. Innerhalb dieser Gruppe sind Vinblastin, Vincristin und Swainsonin besonders vorzuziehen. Swainsonin (Creaven and Mihich, Semin. Oncol. 4: 147 (1977)) besitzt die Fähigkeit, die Knochenmarksproliferation zu stimulieren (White and Olden, Cancer Commun. 3: 83 (1991)). Swainsonin stimuliert auch die Produktion multipler Zytokine, einschliesslich IL-1, IL-2, TNF, GM-CSF und Interferone (Newton, Cancer Commun. 1: 373 (1989); Olden, K., J. Natl. Cancer Inst., 83: 1149 (1991)). Berichten zufolge induziert es auch B- und T-Zellimmunität, durch natürliche Killer-T-Zellen und Makrophagen induzierte Zerstörung von Tumorzellen in vitro und weist, wenn mit Interferon kombiniert, direkte Anti-Tumor-Aktivität gegen Colonkrebs und Melanomkrebse in vivo auf (Dennis, J., Cancer Res., 50: 1867 (1990); Olden, K., Pharm. Ther., 44: 85 (1989), White and Olden, Anticancer Res., 10: 1515 (1990)). Andere Alkaloide, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schliessen Paclitaxel (Taxol) und synthetische Derivate davon ein.
Ein typisches Verfahren für die Herstellung der Liposome der Erfindung wird nun beschrieben, obwohl verstanden werden soll, dass die Vorgehensweise in verschiedener Hinsicht Modifikationen unterworfen werden kann ohne das Ergebnis zu beeinflussen. Wie unten in dem experimentellen Abschnitt ausführlicher beschrieben wird, werden Liposome hergestellt, die in der Lage sind lipophile, kationische Medikamente als Antwort auf einen transmembranösen pH-Gradienten einzuschliessen, wobei diese Liposome jedoch resistent gegenüber Medikamentenverlust im Kreislauf sind. Zu Beginn werden Liposome, die Sphingomyelin und Cholesterin enthalten, entsprechend dem erwünschten molaren Verhältnis von Sphingomyelin und Cholesterin, zum Beispiel 55/45 mol./mol.hergestellt. Ein geeigneter Puffer für die Bildung des Liposoms und damit für die Bildung des liposomalen Inneren, ist einer, der physiologisch akzeptabel ist und einen sauren pH aufweist, typischerweise von ungefähr pH 2 bis ungefähr pH 6, mehr vorzuziehen von ungefähr pH 3 bis pH 5 und am besten von ungefähr pH 4. Ein Beispiel für einen geeigneten Einschluss-Puffer ist Zitratpuffer, eingestellt auf ca. pH 4.
Andere Lipide können ebenfalls in die Herstellung des Liposoms einbezogen werden. Diese Lipide schliessen Phospholipide wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure, Cardiolipin und Phosphatidylinositol mit verschiedenen Fettacylzusammensetzungen und natürlichem und/oder (halb)synthetischem Ursprung und Dicetylphosphat ein. Ceramid und verschiedene Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglioside können ebenfalls zugefügt werden. Kationische Lipide können ebenfalls zugefügt werden. Zusätzliche Lipide, die geeignet für die Verwendung in den Liposomen der vorliegenden Erfindung sein könnten, sind den Fachleuten gut bekannt.
Sobald die Liposome mit dem eingeschlossenen sauren Puffer hergestellt sind, können die Liposome in einen gewünschten Grössenbereich klassifiziert werden. Die Liposome sollten im allgemeinen weniger als ungefähr 1,0 μm (micron) Grösse aufweisen, vorzugsweise ca. 0,05 μm bis 0,45 μm (micron), mehr vorzuziehen ungefähr 0,05 μm bis 0,2 μm (micron), was der Liposomsuspension erlaubt, durch Filtration sterilisiert zu werden.
Für die Klassierung der Liposome kann eine Liposomsuspension entweder durch Bad oder Sonde in kleine Vesikel von weniger als ungefähr 0,05 μm (micron) Grösse beschallt werden. Homogenisierung kann ebenfalls verwendet werden, um grössere Liposome in kleinere zu fragmentieren. Bei beiden Verfahren kann die Teilchengrössenverteilung durch konventionelle Laser-Teilchengrössendiskrimination oder dergleichen überwacht werden.
Die Extrusion von Liposomen durch eine kleinporige Polycarbonat-Membran oder eine asymmetrische keramische Membran ist ein effektives Verfahren zur Reduzierung der Liposomgrössen auf eine relativ gut definierte Grössenverteilung. Typischerweise lässt man die Suspension ein oder mehrere Male durch die Membran zirkulieren bis die gewünschte Liposomgrössenverteilung erreicht ist. Die Liposome können durch aufeinanderfolgend kleinporigere Membranen extrudiert werden, um eine allmähliche Reduktion der Liposomgrösse zu erreichen.
Vor oder nach der Klassierung wird der externe pH der Liposomherstellung auf ungefähr 7,0 bis 7,5 durch Zugabe eines geeigneten Puffers, zum Beispiel 0,5 M NaHP₂O₄, erhöht. Das Medikament oder die Medikamente der Wahl werden dann mit den Liposomen in der geeigneten Konzentration, zum Beispiel bei einem Vincristin/Lipid-Verhältnis von 0,01/1,0 bis 0,2/1,0 (Gew./Gew.), für einige Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um eine transmembranöse Aufnahme des/der Medikamentes) zu erlauben, gemischt, zum Beispiel für ungefähr 5 bis 30 Min. oder mehr und bei ungefähr 45–65°C (zum Beispiel 10 Min. bei 60°C im Falle der liposomalen Vincristinzubereitungen, die in den Beispielen unten beschrieben werden), obwohl jemand mit üblichem Geschick auf dem Fachgebiet verstehen wird, dass die Bedingungen angepasst werden können und die Aufnahme entsprechend überwacht werden kann. Die Formulierung der Liposome und therapeutischen Verbindungen) sollte im allgemeinen aus einer relativ gleichförmigen Population von Vesikeln in Hinblick auf Grösse und Medikament-Lipid-Verhältnis bestehen.
Andere Verfahren für die passive Einschliessung von Medikamenten als die direkte Bildung von transmembranösen pH-Gradienten können verwendet werden. In einer Ausführungsart werden innere/äussere Konzentrationsgradienten unter Verwendung von geladenen Aminen: Methylammonium oder Ethanolammonium, gebildet. Liposome werden in der Gegenwart einer wässerigen Lösung des geladenen Amins gebildet. Jede Anzahl an pharmazeutisch akzeptablen Salzen des geladenen Amins kann vennrendet werden, um die Lösung herzustellen, wie zum Beispiel Fluorid, Chlorid, Citrat, Sulfat, Phosphat, Bromid, Iodid oder Acetat, aber nicht darauf begrenzt. Nach der Bildung des. Liposoms, werden die äusseren geladenen Amine verdünnt oder entfernt, zum Beispiel durch Verdünnung, Filtration, Dialyse oder Gelausschluss. Wenn die ungeladenen Amine das liposomale Innere verlassen und ein Proton zurücklassen, wird dadurch ein innerer/äusserer pH-Gradient gebildet. Die Grösse des pH-Gradienten wird proportional zu der Grösse des gebildeten Konzentrationsgradienten sein. Der pH-Gradient wird verwendet, um das Liposom durch Verfahren, die hier offenbart werden, mit einem Medikament wie Swainsonin zu laden.
Zusätzliche Bestandteile können zu den Liposomen gefügt werden, um sie auf bestimmte Zelltypen zielzuführen. Die Liposome können zum Beispiel mit monoklonalen Antikörpern oder Bindungsfragmenten davon, die an Epitope, die nur auf bestimmten Zelltypen wie krebsverwandten Antigenen vorliegen, binden, konjugiert werden, und damit wird ein Mittel zur Zielführung der Liposome nach der systemischen Verabreichung bereitgestellt. Alternativ können Liganden, die an die Oberflächenrezeptoren der Zielzelltypen binden, ebenfalls an die Liposome gebunden werden. Andere Mittel für die Zielführung der Liposome können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden.
Nach einem Schritt zur Trennung, der nötig sein kann, um freies Medikament aus dem Medium, das das Liposom enthält, zu entfernen, wird die Liposomsuspension für die Verabreichung an den Patienten oder die Empfängerzellen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger auf die gewünschte Konzentration gebracht. Viele pharmazeutisch akzeptable Träger können in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. Eine Vielzahl wässeriger Träger kann verwendet werden, zum Beispiel Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen und auch Glykoproteine können für eine verbesserte Stabilität eingeschlossen sein, wie Albumin, Lipoprotein, Globulin etc.. Im allgemeinen wird normale gepufferte Kochsalzlösung (135–150 mM NaCl) als der pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet, aber andere geeignete Träger können ausreichen. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle, liposomale Sterilisationstechniken wie Filtration sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, wie sie notwendig sind, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, enthalten, wie Wirkstoffe zur pH-Einstellung und Pufferung, Tonizitäts-einstellende Wirkstoffe und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid etc.. Diese Zusammensetzungen können durch oben beschriebene Verfahren sterilisiert oder unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die resultierenden wässerigen Lösungen können für den Gebrauch verpackt oder unter aseptischen Bedingungen gefiltert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässerigen Lösung verbunden wird.
Die Konzentration der Liposome in dem Träger kann unterschiedlich sein. Im allgemeinen wird die Konzentration bei ungefähr 20–200 mg/ml liegen, gewöhnlich bei ungefähr 50–150 mg/ml und am häufigsten bei ungefähr 75–125 mg/ml, zum Beispiel bei ungefähr 100 mg/ml. Fachleute können diese Konzentrationen variieren, um die Behandlung mit verschiedenen Liposombestandteilen oder für bestimmte Patienten zu optimieren. Die Konzentrationen können zum Beispiel angehoben werden, um die Flüssigkeitsbelastung, die mit der Behandlung einher geht, zu senken.
Die vorliegende Erfindung erlaubt Verfahren für die Einbringung therapeutischer Verbindungen in die Zellen eines Empfängers. Die Verfahren umfassen im allgemeinen die Verabreichung eines Liposoms, das die therapeutische Verbindung enthält, an einen Empfänger, worin das Liposom eine Membran, die aus Sphingomyelin und Cholesterin und wahlweise anderen Lipiden besteht, und ein wässeriges Inneres mit einem pH wesentlich unter dem physiologischem pH, zum Beispiel pH 3 bis ungefähr pH 5, und die therapeutische Verbindung von Interesse aufweist. Der Empfänger kann aus einer Vielfalt von Lebewesen stammen, einschliesslich Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Vogelartigen, Pferdeartigen, Kuhartigen, Schweinen, Lagomorpha, Nagetiern und dergleichen.
Die Zellen des Empfängers werden den liposomalen Präparaten der Erfindung gewöhnlich durch in vivo-Verabreichung der Formulierungen ausgesetzt, aber ex vivo-Aussetzung der Zellen gegenüber den Liposomen ist ebenfalls möglich. In vivo-Aussetzung erhält man durch Verabreichung der Liposome an den Empfänger. Die Liposome können auf vielen Wegen verabreicht werden. Diese schliessen parenterale Wege der Verabreichung, wie intravenös, intramuskulär, subkutan und intraarteriell ein. Im allgemeinen werden die Liposome intravenös oder in einigen Fällen per Inhalation verabreicht. Oft werden die Liposome in eine grosse zentrale Vene wie die Vena cava superior oder Vena cava inferior verabreicht, um den hochkonzentrierten Lösungen die Verabreichung in Gefässe mit grossem Volumen und Fluss zu ermöglichen. Die Liposome können nach vaskulären Eingriffen intraarteriell verabreicht werden, um eine hohe Konzentration direkt an ein betroffenes Gefäss abzugeben. In einigen Fällen können die Liposome oral oder transdermal verabreicht werden, obwohl die Vorteile der vorliegenden Erfindung am besten bei parenteraler Verabreichung realisiert werden. Swainsonin kann zum Beispiel bequem oral verabreicht werden, kann aber parenteral oder intravenös verabreicht werden. Die Liposome können auch für eine langanhaltende Freisetzung nach der Anlage in implantierbare Vorrichtungen eingeschlossen werden.
Wie oben beschrieben werden Liposome bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung im allgemeinen intravenös oder per Inhalation verabreicht. Oft erhält der Patient mehrfache Behandlungen. Der Dosierungszeitplan der Behandlungen wird durch die Krankheit und den Zustand des Patienten bestimmt. Standardbehandlungen mit therapeutischen Verbindungen, die im Fachgebiet gut bekannt sind, können als Anleitung für die Behandlung mit Liposomen, die therapeutische Verbindungen enthalten, dienen. Die Dauer und der Zeitplan der Behandlungen kann durch Verfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind, variiert werden, aber die verlängerte Kreislaufszeit und die Abnahme an Liposomverlust wird im allgemeinen eine Anpassung der Dosierungen von den vorher verwendeten nach unten erlauben. Die Dosierung von Liposomen der vorliegenden Erfindung kann abhängig von dem klinischen Zustand und der Grösse des Tieres oder Patienten, der die Behandlung erhält, variieren. Die Standarddosis der therapeutischen Verbindung, wenn sie nicht eingeschlossen ist, kann als Anleitung für die Dosierung der im Liposom verkapselten Verbindung dienen. Die Dosierung bleibt typischerweise über die Dauer der Behandlung konstant, obwohl in einigen Fällen die Dosierung variieren kann. Physiologische Standardparameter, die verwendet werden können, um die Dosierung der Liposome der Erfindung zu verändern, können während der Behandlung bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung und nicht als Begrenzung angeboten.
BEISPIEL I
Säurestabilität von DSPC/Chol- gegenüber SM/Chol-Liposomen
Dieses Beispiel zeigt die Stabilität von Liposomen, die mit Sphingomyelin und Cholesterin hergestellt wurden, gegenüber Säurehydrolyse, verglichen mit Liposomen, die mit Distearoylphosphatidylcholin und Cholesterin hergestellt wurden.
Für die Liposomherstellung wurden Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Ei-Sphingomyelin (SM) von Avanti Polar Lipids erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Cholesterin wurde von Sigma Chemical Company erworben und PEG PE wurde entsprechend Parr et al., eingereicht, Biochim. Biophys. Acta (1994) synthetisiert. Die Lipide wurden in CHCl₃ oder CHCl₃ mit Spuren von CN₃OH aufgelöst, dann in wie unten angegebenen molaren Verhältnissen gemischt und überschüssiges Lösungsmittel unter einem Strom von Stickstoffgas entfernt. Restliches Lösungsmittel wurde unter hohem Vakuum für 3 bis 16 Std. von dem Lipidfilm entfernt. Die Lipide wurden durch die Zugabe von 0,3 M Zitratpuffer (pH 4,0 oder 2,0) dispergiert, um eine endgültige Lipidkonzentration von entweder 50 oder 100 mg/ml zu erhalten. Die Hydratation des Lipides wurde durch Vortexieren und Erhitzung auf 65°C erleichtert. Die Equilibrierung des gelösten Stoffes zwischen dem Inneren und Äusseren der Liposome wurde durch fünf Gefrier/Auftau-Zyklen zwischen –196° und 60° erreicht, wie allgemein in Mayer et al., Biochim. Bioph res. Acta 817: 193–196 (1985) beschrieben wird. Grosse unilaminare Vesikel wurden durch wiederholte Extrusion von multilaminaren Liposomen durch zwei oder dreifach geschichtete, 0,1 μm Filter (Poretics, Livermore CA), die bei 60–65°C in einem Themobarrel Extruder (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) gehalten wurden, hergestellt. Die Liposomgrössenverteilungen wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung unter Verwendung eines Nicomp Modell 270 Submicron Teilchengrössenklassierers bestätigt. Diese Präparate wiesen typischerweise durchschnittliche Durchmesser von 130 bis 150 nm auf.
Grosse, unilaminare Liposome aus DSPC/Chol oder SM/Chol wurden wie oben beschrieben in 0,3 M Zitratpuffer bei pH 2,0 hergestellt und dannn auf 3,2 mg/ml Lipid verdünnt. Die Liposome wurden für verschiedene Zeiten bei 37°C inkubiert und dann vor der Bestimmung der Lipidhydrolyse eingefroren. Die Lipiddispersionen wurden aufgetaut und dann das Lipid in CHCl₃/CH₃OH extrahiert und unter einem Strom von Stickstoffgas konzentriert. Bekannte Mengen an Lipid wurden auf K6F-Dünnschicht-Chromatographie-Platten getüpfelt und in CHCl₃/CH₃/OH/H₂O/NH₄OH (65/25/4/0,3, per Volumen) entwickelt. Die Lipide wurden in Joddampf sichtbar gemacht und dann die entsprechenden Bereiche der Platten zurückgewonnen und auf Phosphor entsprechend Bartlett, J. Biol. Chem. 234: 466–468 (1959) analysiert. Die Gesamthydrolyse von DSPC wurde aus der Menge an in den Proben vorliegendem MSPC bestimmt und dann zur Gesamthydrolyse korregiert; die Hydrolyse von Sphingomyelin wurde aus der Differenz zwischen der Menge des chromatographierten und des in Form nicht-hydrolysierten Sphingomyelins zurückgewonnenen Lipids errechnet. Kalibrierungskurven wurden jeweils für DSPC, MSPC und Sphingomyelin bestimmt.
Wie in 1 gezeigt wird, waren Liposome, die aus SM/Chol (55/45, mol/mol) bestanden, signifikant weniger anfällig gegenüber Säurehydrolyse als dies Liposome waren, die aus DSPC/Chol (55/45, mol/mol) bestanden. Das heisst, die Hydrolyserate bei 37°C und pH 2,0 war in SM/Chol-Liposomen 100fach langsamer als in DSPC/Chol-Liposomen. Ähnliche Ergebnisse wurden während der Inkubation von Liposomen bei pH 4,0 und bei verschiedenen Temperaturen zwischen 4°C und 37°C beobachtet.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Liposome, die aus SM/Chol bestanden, signifikant stabiler gegenüber Säurehydrolyse waren als identische Liposome, die aus DSPC/Chol bestanden (1). Da das hauptsächliche Abbauprodukt in DSPC/Chol-Liposomen das lyso-PC (MSPC) ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SM/Chol-Liposome stabiler sind als jede Fonnulierung, die auf Lipiden basiert, die carboxyl-veresterte Fettsäuren enthält (sprich jede auf Phospholipid basierende Formulierung).
BEISPIEL II
Lipid- und Medikamenten-Pharmakokinetik
Die Aufnahme von Vincristin in grosse unilaminare Liposome wurde unter Verwendung eines pH-Gradienten-abhängigen Verfahrens erreicht, wie bei Mayer et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 33: 17–24 (1993) beschrieben. Kurzgefasst wird eine Lösung von Vincristinsulfat (Oncovin® Eli Lilly, Indianapolis, IN) zu den Liposomen in einem Medikamenten/Lipid-Verhältnis von 0,1/1 (Gew./Gew.) gegeben und bei 60°C für 5 bis 10 Minuten equilibriert. Die Vincristinaufnahme als Antwort auf einen transmembranösen pH-Gradienten wurde durch die Zugabe von 0,5 M NaHP₂O₄ gestartet, um den externen pH auf 7,2–7,6 einzustellen. Die Aufnahme durfte für 10 Minuten bei 60°C vorangehen und wies typischerweise eine Einschlusseffizienz von ca. 95% auf (Mayer et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 33: 17–24 (1993)).
Liposome aus DSPC/Chol (55/45), SM/Chol (55/45) oder SM/Chol/PEG-PE (55/40/5), die den nicht-austauschbaren und nicht-metabolisierten radioaktiven Marken ¹⁴C-CHDE (Cholesteryl-4-hexadecylether, wie angegeben mit ³N oder ¹⁴C radioaktiv markiert, erworben von New England Nuclear) enthielten, wurden hergestellt. Leere Liposome oder Liposome, die mit ³H-Vincristin (Amersham) geladen waren, wurden auf die angegebene Konzentration mit HBS verdünnt und dann intravenös in BDF1-Mäuse (8–10 Wochen alt; Charles River) in einer Vicristindosierung von 2 mg/kg (Lipiddosierung von 20 mg/kg) injiziert. Zu verschiedenen Zeiten nach der Liposominjektion wurde Blut durch Herzpunktion abgenommen und Leber, Milz und Muskel gewonnen. In allen Fällen wurden die Lipid- und Vincristin-Verteilungen durch Flüssig-Szintillationzählung von bekannten Plasmavolumina und 10% Homogenaten der Gewebe bestimmt.
Die Clearance der leeren Liposome aus DSPC/Chol und SM/Chol wird in 2A gezeigt. Liposome, die aus SM/Chol bestanden, wurden aus dem Kreislauf in einer leicht langsameren Rate entfernt als die DSPC/Chol-Liposome. Dieser Unterschied in den Clearanceraten zwischen DSPC/Chol-Liposomen und SM/Chol-Liposomen wurde auch in Formulierungen, die Vincristin enthielten, beobachtet, wie in 2B gezeigt wird, obwohl die Gesamt-Clearanceraten in der Gegenwart von Vincristin langsamer waren, verursacht durch die Wirkung des Medikamentes auf die RES-Aktivität. Die Menge an SM/Chol, das im Kreislauf verblieb, lag typischerweise 30-50% höher als für DSPC/Chol-Liposome. Ein weiterer Anstieg der Menge des Lipides im Kreislauf wurde durch die Zugabe von 5 mol% PEG-PE zu den SM/Chol-Mischungen erreicht.; 24 Stunden nach der i.v.-Injektion verblieben 200 μg Lipid/ml Plasma für SM/Chol/PEG-PE-Liposome im Kreislauf, verglichen mit 100 μg/ml Plasma für SM/Chol-Liposome und 65 μg/ml Plasma für DSPC/Chol-Liposome (2B).
Die Charakteristika der Medikamentenretention der Liposome wurden durch Änderungen in der Lipidzusammensetzung der Vesikel signifikant verändert. Der Vincristinverlust aus DSPC/Chol-Liposomen war sehr rasch, mit einem Verbleib von nur 50% des ursprünglich eingekapselten Vincristins, das nach 4 Stunden im Kreislauf eingeschlossen blieb, wie in 3 gezeigt wird. Im Gegensatz dazu war der Vincristinverlust aus SM/Chol-Liposomen viel langsamer, mit einem Verbleib von mehr als 60% des eingeschlossenen Medikamentes in den Liposomen 24 Stunden nach der Injektion (3). Darüberhinaus wurden zusätzliche Zunahmen in der Vincristinretention in SM/Chol-Liposomen in der Gegenwart eines zweifach grösseren transmembranösen pN-Gradienten nicht beobachtet (sprich pH_i = 2,0). Die Gegenwart von 5 mol% PEG-PE in den SM/Chol-Liposomen bewirkte eine signifikante Zunahme der Permeabilität von Vincristin; ca. 30% des eingeschlossenen Vincristin verblieb nach 24 Stunden im Kreislauf in den Liposomen, wie in 3 gezeigt wird.
Die Anti-Tumor-Wirksamkeit von liposomalem Vincristin ist eine Funktion der Menge des Medikamentes, das im Kreislauf verbleibt und ist demnach eine Konsequenz sowohl aus der Liposomenlebensdauer in dem Kreislauf wie auch der Medikamentenretention innerhalb der Liposome. Die Gesamtmenge des im Kreislauf verbleibenden Vincristins war in den liposomalen DSPC/Chol-Formulierungen signifikant niedriger als entweder in den liposomalen SM/Chol- oder SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen, wie in 4 gezeigt wird. Beide auf Sphingomyelin basierende Liposom-Formulierungen wiesen identische Mengen an im Kreislauf verbleibendem Vincristin auf. Dies war eine Konsequenz aus dem höheren Vincristin/Lipid-Verhältnis im SM/Chol als im SM/Chol/PEG-PE (3) und der geringeren Menge an in dem Kreislauf verbleibendem Lipid im SM/Chol als im SM/Chol/PEG-PE (2B).
Um zu bestimmen, ob die verlängerte Lebensdauer der SM/Chol-Liposome im Kreislauf eine Konsequenz aus der geringeren Aufnahme der SM/Chol-Liposome durch Makrophagen war, wurde die Aufnahme der Liposome durch peritoneale Makrophagen gemessen. Leere DSPC/Chol- und SM/Chol-Liposome, die ¹⁴CCHDE enthielten, wurden wie oben beschrieben hergestellt und der externe pH mit 0,5 M NaHP₂O₄ auf 7,2 bis 7,6 eingeteilt. Liposome wurden mit 100 mg Lipid/kg in einem Volumen von 0,5 ml in CD1-Mäuse (8–10 Wochen alt) (Charles River) i.p. injiziert. Nach 4 Stunden wurden peritoneale Makrophagen durch Lavage gewonnen, durch wiederholte Zentrifugation gereinigt und dann wurden die Makrophagen mit einem Hämocytometer gezählt und die Menge des durch die Makrophagen aufgenommenen Lipids durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt.
Für die Serumprotein-Bindungsassays wurden 10 mg von entweder DSPC/Chol- oder SM/Chol-Liposomen, die mit ¹⁴C-CHDE markiert waren, auf einen externen pH von 7,2–7,6 eingestellt und dann mit HBS auf 20 mg/ml verdünnt. Die Liposome wurden mit 500 μl fötalem Rinderserum (ICN Biomedicals) (vorgefiltert durch einen 0,22 μm Filter) für 30 min. bei 37°C inkubiert. Serumprotein, das nicht an die Liposome gebunden war, wurde durch Führen der Probe über eine 1 cm (innerer Durchmesser) × 18 cm Biogel A-15m Säule (Bio-Rad Laboratories) (in HBS) mit 35 ml/Std. entfernt. Bruchteile (1 ml) wurden auf Protein (Sigma bicinchoninische Säure-Proteinassay-Kit) und Lipid (LSC) untersucht und das absorbierte Protein wurde nach Korrektur für parallel eluiertes Serumprotein berechnet.
Die Aufnahme von i.p.-injizierten SM/Chol-Liposomen in Makrophagen war 50% niedriger als die Aufnahme von DSPC/Chol-Liposomen, wie in 5 gezeigt wird. Es ist wahrscheinlich, dass die verminderte Aufnahme von SM/Chol-Liposomen durch Makrophagen und ihre verlängerte Lebendauer im Kreislauf eine Konsequenz aus einer geringeren Proteinopsonierung an der Oberfläche der SM/Chol-Liposomen als an den DSPC/Chol-Liposomen ist. Die Messung der Adsorption der fötalen Rinderserumproteine an SM/Chol- und DSPC/Chol-Liposomen zeigt an, dass die DSPC/Chol-Liposome 13,7 μg Protein/mg Lipid adsorbierten. Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Adsorption von fötalen Rinderserumproteinen an SM/Chol-Liposome nicht festgestellt.
Somit kann man aus diesem Beispiel ersehen, dass Liposome, die aus SM/Chol bestehen, eine etwas längere Lebensdauer im Kreislauf hatten als ähnliche DSPC/Chol-Liposome, jeweils sowohl in der Gegenwart wie auch in der Abwesenheit von eingeschlossenem Viricristin (2). SM/Chol-Liposome waren dramatisch besser als DSPC/Chol-Liposome bei der Retention von Vincristin, das unter Verwendung des transmembranösen pH-Gradienten-Verfahrens verkapselt worden war (4). Die Zugabe von PEG-PE zu SM/Chol-Liposomen erhöhte signifikant die Lebensdauer der Liposome im Kreislauf, PEG-PE verursachte aber auch eine signifikante Zunahme an Verlust von Vincristin aus den Liposomen. Die erhöhten Spiegel von Vincristin, das in SM/Chol- und SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen im Kreislauf verblieb (4), waren eine Konsequenz sowohl aus der verbesserten Medikamentenretention in SM-enthaltenden Liposomen (3) wie auch der verlängerten Lebensdauer der SM/Chol/PEG-PE-Liposome im Kreislauf (2b). Die verlängerte Lebensdauer von SM/Chol/PEG-PE-Liposomen im Kreislauf wurde jedoch durch die geringere Medikamentenretention durch die Liposome, die PEG-PE enthielten, aufgewogen. Demnach gab es bei den auf SM basierenden liposomalen Formulierungen von Vincristin keine Verbesserung bei der Lebensdauer von Vincristin im Kreislauf durch die Zugabe des Lipides PEG-DSPE (4). Desweiteren, da es keine Verbesserung der Vincristinretention in vivo durch die Verwendung eines pH_i = 2,0 gab, wurde die optimale Vincristinretention im Kreislauf mit einer relativ schlichten liposomalen Formulierung, die nur Sphingomyelin, Cholesterin und Zitratpuffer umfasste (pH 4,0), erreicht.
BEISPIEL III
Tumorladung mit liposomalem Vincristin
Um zu bestimmen, ob die verlängerte Lebensdauer von Vincristin im Kreislauf, wie in 4 gezeigt, in einer erhöhten Medikamentenabgabe an die Tumore resultierte, wurde die Ladung von liposomalem Vincristin in P388-Tumore untersucht. Für die Experimente der Tumorladung wurden BDF1-Mäuse mit 10⁶ P388-Zellen ( erworben vom National Cancer Insitute, Bethesda, MD) (wöchentliche Passage durch BDF1-Mäuse) 24 Std. vor der Liposom-Injektion i.p. injiziert. Zu verschiedenen Zeiten nach der Liposom-Injektion wurde der Tumor durch peritoneale Lavage zurückgewonnen. In allen Fällen wurden die Lipid- und Vincristin-Verteilungen durch Flüssig-Szintillationzählung bekannter Volumina der Lavage bestimmt.
Wie in 6 gezeigt wird, hatte die Akkumulation von Vincristin aus DSPC/Chol-Liposomen in P388-Tumoren einen frühen Spitzenwert 4 Stunden nach der Liposominjektion und war zu späteren Zeiten signifikant niedriger. Im Gegensatz dazu zeigt Vincristin aus Formulierungen sowohl von SM/Chol wie auch SM/Chol/PEG-PE eine fortgesetzte Abgabe von Vincristin für bis zu 24 bis 48 Stunden nach der Liposom-Injektion. Das bedeutet, dass SM/Chol- und SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen von Vincristin wenigstens 30% mehr Vincristin an P388-Tumore abgab als dies DSPC/Chol-Liposome taten.
Die erhöhten Spiegel von Vincristin, das unter Verwendung von auf SM-basierenden liposomalen Formulierungen (4) in dem Plasma in Zirkulation verblieb, wurden in den grösseren Mengen an Vincristin, das in P388-Tumore geladen wurde, wiedergespiegelt (6). Dieser Zusammenhang lässt für P388-Tumore in BDF1-Mäusen darauf schliessen, dass Liposome, die DSPC, SM und/oder PEG-PE enthalten, sich nicht signifikant in ihrer Fähigkeit unterscheiden, aus dem Gefässkreislauf zu dem peritonealen Tumor auszutreten.
BEISPIEL IV
In vivo-Wirksamkeit von liposomalem Vincristin gegen P388-Tumore
Um zu bestimmen, ob die erhöhte Vincristin-Abgabe an P388-Tumore durch SM/Chol- und SM/Chol/PEG-PE-Liposome, wie in Beispiel III gezeigt, in einer verstärkten Anti-Tumor-Aktivität resultiert, wurde die Wirksamkeit von liposomalen Formulierungen von Vincristin bestimmt.
BDF1-Mäuse, die P388-Tumore trugen, wurden mit liposomalen Formulierungen von DSPC/Chol (55/45, mol/mol), SM/Chol (55/45, mol/mol) oder SM/Chol/PEG-PE (55/40/5, mol/mol/mol), die Vincristin in einem Medikament/Lipid-Verhältnis von 0,1 (Gew./Gew.) enthielten, behandelt.
Grosse, unilaminare Liposome aus DSPC/Chol (55/45), SM/Chol (55/45) oder SM/Chol/PEG-PE (55/40/5) wurden wie oben beschrieben hergestellt und mit Vincristin in einem Vincristin/Lipid-Verhältnis von 0,1/1 (Gew./Gew.) geladen. Liposomales Vincristin wurde in BDF1-Mäuse i.v. injiziert, die 24 Stunden früher eine i.p.-Injektion von 10⁶ P388-Zellen verabreicht bekommen hatten. Die Liposomkonzentration wurde so eingestellt, dass Vincristindosen von 1,0, 2,0 und 4,0 mg/kg erreicht wurden, dann wurden die Gewichte und das Überleben der Tiere für die folgenden 60 Tage verfolgt. Tiere, die 60 Tage überlebten, wurden erneut mit 10⁶ P388-Zellen injiziert, um den Immunbestandteil des Langzeitüberlebens zu beurteilen.
Wie in 7 gezeigt wird, überlebten Mäuse, die keine Injektion des liposomalen Vincristin erhielten, 10–11 Tage nach der Verabreichung des P388-Tumors. Die Behandlung mit entweder DSPC/Chol- oder SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen mit einer Vincristindosis von 1 mg/kg verlängerte die Überlebenszeit auf 17 beziehungsweise 19 Tage. Behandlung mit SM/Chol-Formulierungen bei gleicher Vincristindosis ergab eine leichte Verbesserung im Überleben, 23 Tage.
Bei Vincristindosen von 2 mg/kg, verlängerten sowohl DSPC/Chol-wie auch SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen das Überleben auf 30–31 Tage. Im Gegensatz dazu war die SM/Chol-Formulierung bei dieser Vincristindosis signifikant wirksamer; 60% der Mäuse überlebten bis 60 Tage nach der Gabe des P388-Tumors (7). Bei einer Vincristindosis von 4 mg/kg, ergaben sowohl die DSPC/Chol-wie auch die SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen 60 Tage nach der P388-Tumor-Injektion ein Überleben von 40% der Mäuse. Formulierungen aus SM/Chol waren signifikant wirksamer; abgesehen von einem einzigen Todesfall wegen Vincristintoxizität, betrug das Überleben der übrigen Mäuse nach 60 Tagen 100% (7).
Demnach war die Anti-Tumor-Wirksamkeit von SM/Chol-Liposomen signifikant besser als die von SM/Chol/PEG-PE-Liposomen (7), obwohl die Beobachtung der Ladung von Vincristin in P388-Tumoren bei diesen zwei liposomalen Formulierungen identisch war (6). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die besseren Vincristinretentions-Eigenschaften von SM/Chol-Liposomen im Kreislauf verglichen mit SM/Chol/PEG-PE-Liposomen (3) , ebenfalls in der Peritonealhöhle auftreten können und in einer verbesserten Vincristinaufnahme in die P388-Zellen resultiert. Formulierungen aus SM/Chol waren ca. zweimal wirksamer als die Formulierungen, die entweder auf DSPC/Chol oder SM/Chol/PEG-PE basierten. Das heisst, das Überleben, das durch DSPC/Chol- und SM/Chol/PEG-PE-Formulierungen bei Vincristindosen von 2,0 mg/kg erreicht wurde, erhielt man bei SM/Chol bei einer Dosis von 1,0 mg/kg. Ähnlich war das Überleben, das man durch DSPC/Chol und SM/Chol/PEG-PE bei einer Dosis von 4,0 mg/kg Vincristin erhielt, sehr ähnlich dem, das durch SM/Chol-Formulierungen bei 2,0 mg/kg erreicht wurde.
BEISPIEL V
Bioverfügbarkeit von liposomalem Swainsonin
Weibliche Balb/c-Mäuse, 5–6 Wochen alt, wurden unter Standardbedingungen untergebracht. Nach einer einwöchigen Eingewöhnungszeit vor dem experimentellen Verfahren erhielten die Tiere während des Experimentes freien Zugang sowohl zu Futter wie auch Wasser. Swainsonin (Toronto Res. Chem.) wurde mit Tritium radioaktiv markiert. Mit Tritium versehenes Swainsonin wurde als eine auf Lipid basierende Formulierung (L-Im) und als eine wässerige Formulierung , die freies Medikament enthielt (F-Im), verabreicht. Mit Tritium versehenes Swainsonin wurde in Sphingomyelin/Cholesterin-(Avanti Polar Labs) Sphingosome unter Verwendung eines Zitratpuffer-pH 2-Gradienten in einem Medikament-zu-Lipid-Verhältnis von 0,2 : 1 (mol : mol) und mit einer Beladungseffizienz von 80% geladen. Zweihundert Mikroliter der Lipid- und der wässerigen Swainsonin-Formulierungen wurden oral per Sonde (p.o.), intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.p.) gegeben. Nach 1, 3, 6 und 24 Stunden wurden 50 Mikroliter-Blutproben durch retroorbitale Blutungen abgenommen. Die Blutproben wurden gebleicht und dann in einem Szintillationszähler gezählt. Die Ergebnisse wurden als Prozent der verabreichten Dosis im Blut zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung ausgedrückt.
Wie in 8 gesehen wird, weist die liposomale Formulierung (L-Im) von Swainsonin eine höhere Bioverfügbarkeit auf und erreicht höhere Blutspiegel im Vergleich mit der freien wässerigen Formulierung (F-Im). Die orale Bioverfügbarkeit von Swainsonin liegt bei ungefähr 60–65%, wenn man sie mit intravenös verabreichtem Swainsonin vergleicht.
BEISPIEL VI
Wirksamkeit von Swainsonin und GM-CSF
Weibliche C57BU6-Mäuse (durchschnittliches Gewicht 15,03 g), wurden verwendet und unter Standardbedingungen untergebracht. Nach einer einwöchigen Eingewöhnungszeit vor dem experimentellen Verfahren erhielten die Tiere während des Experimentes freien Zugang sowohl zu Futter wie auch Wasser. Die Mäuse waren zu Beginn des Experimentes 6 Wochen alt und wurden zufällig in 12 Gruppen zu je 5 Mäusen pro Gruppe eingeteilt. 40 Mäusen wurde eine einzelne Bolus-Injektion (i.p.) von entweder Methotrexat (Mtx, 410 mg/kg) (Sigma Chemical Co.) oder Doxorubicin (Dox, 14,9 mg/kg) (Adria Laboratories) gegeben. Zwei Tage nach der Chemotherapie, wurde für die Verabreichung von Swainsonin (2 mg/kg i.p. oder p.o.), rekombinantem murinen GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor) (1 μg/Maus/Tag i.p., 5 × 10⁴ U/ μg Aktivität) (R & D Systems) oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (200 μl i.p.) für 10 aufeinanderfolgende Tage (einmal pro Tag) gesorgt. Die Anzahl der Todesfälle wurde über einen Beobachtungszeitraum von 14 Tagen für jede Behandlungsgruppe aufgezeichnet.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 (unten) zeigen, dass wenn Swainsonin für 10 Tage nach einer LD₅₀-Dosis eines Chemotherapeutikums (Mtx oder Dox) verabreicht wird, alle Tiere, denen Swainsonin intravenös oder i.p. verabreicht wurde, mit der cytotoxischen Belastung fertig wurden und über 2 Wochen nach der Chemotherapie überlebten. Die Hälfte der Tiere, die mit Mtx behandelt wurden und die Hälfte derer, die mit Dox behandelt wurde, starb innerhalb weniger Tage nach der Chemotherapie. Tieren, die mit einer i.p.-Verabreichung von rekombinantem murinen GM-CSF über 10 Tage behandelt wurden, ging es nicht so gut wie mit Swainsonin; ungefähr die Hälfte der mit Mtx behandelten Tiere starb innerhalb weniger Tage nach Beginn des 10-Tages-Dosierungszeitraumes. Tiere, die mit Dox und 10 Tage mit GM-CSF dosiert wurden, überlebten den zweiwöchigen Erholungszeitraum. Swainsonin wurde über 10 Tage oral an die chemotherapeutisch behandelten Tiere verabreicht und abgesehen von einem Tier (in der mit Mtx behandelten Gruppe) überlebten alle die cytotoxische Behandlung.
TABELLE 1
BEISPIEL VII
Erholung von chemotherapeutisch hervorgerufener Leukopenie
Am 15. Tag nach der anfänglichen chemotherapeutischen Dosis wurden 4 Mäuse aus jeder Gruppe der Immunmodulationstudie (Beispiel 6) willkürlich geopfert und bis zu 1 ml Blut durch Herzpunktion gewonnen. Zirkulierende periphere weisse Blutkörperchen wurden gezählt, Blutausstriche (für die Neutrophilenzählung) angefertigt und Blutproben genommen und auf Zytokinproduktion (IL-1,IL-2, TNF) getestet. Die Zytokin-Blutspiegel (TNF, IL-1 und IL-2) wurden durch käuflich erwerbliche Assay-Kits untersucht. Die Milz, der Thymus und das Knochenmark wurden entfernt und Einzelzell-Suspensionen hergestellt. Das Zellvorkommen dieser Lymphorgane wurde durch den Trypan-Blau-Exklusionstest bestimmt. 9 zeigt die Auswirkungen von GM-CSF und Swainsonin auf das Knochenmarkszellvorkommen 14 Tage nach der chemotherapeutischen Medikamentenverabreichung. Wie gezeigt wird, zeigt sich Swainsonin oral oder i.p. gegeben, genauso wirksam wie GM-CSF, i.p. gegeben über 10 aufeinanderfolgende Tage.
Zellen aus der Milz, dem Thymus und dem Knochenmark wurden auf ihre Fähigkeit getestet, auf Stimulation mit verschiedenen Mitogenen zu reagieren: ConA (1, 2,5 und 5 μg/ml) (Sigma), Phytohämagglutinin (PHA) (1 und 2,5 μg/ml) (Sigma) und LPS (2,5 und 5 μg/ml) (Difco). Nach 72 Stunden Stimulation wurde die proliferative Antwort unter Verwendung von CeIITiter 96 (Promega) gemessen. Gleichzeitig wurden mitogen-stimulierte Splenocyten für die Zytokinproduktion nach ConA-(2,5 μg/ml) und Lipopolysaccharid-(LPS) (2,5 μg/ml) Stimulation etabliert. Die Überstände wurden nach 24 Std. und 48 Std. gesammelt und auf Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Interleukin-2-(IL-2) Produktion unter Verwendung des direkten ELISA-Verfahrens getestet. Überstände von nicht stimulierten Zellen dienten als Kontrollen. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als pg/ml von TNF-α, (die Empfindlichkeit des Assays liegt < 25 pg/ml) oder von IL-2 (die Empfindlichkeit des Assays liegt < 3 pg/ml). Wie in den 10A beziehungsweise 10B gezeigt wird, waren die TNF- und IL-2-Spiegel von ConA- und LPS-stimulierten Splenozyten in mit Swainsonin behandelten Tieren signifikant höher im Vergleich mit den mit Chemotherapie behandelten und den PBS- (keine Behandlung) Kontrollen.
Um einen Vorteil für den oralen Weg der Verabreichung nachzuweisen, wurde Swainsonin in simuliertem Mageninhalt für verschiedene Zeiträume (1, 2, 4, 24, 48 und 72 Std.) in vitro inkubiert und die "orale Stabilität" von Swainsonin bestimmt. Swainsonin wurde ebenfalls in Salzsäure (pH 2), die das wichtigste gastrale Verdauungsenzym, Pepsin, enthielt, inkubiert. Die in vitro Stabilitätstests haben gezeigt, dass Swainsonin unter diesen harten Bedingungen bis zu 72 Stunden stabil ist.
Beispiel VIII
Pharmakokinetik, Tumorladung und Therapie von SCID-Mäusen, die A431-Tumore tragen
Die Tumorladung und Anti-Tumor-Wirksamkeitseigenschaften von DSPC/Chol- und SM/Chol-liposomalen Formulierungen von Vincristin wurden in Mäusen, die solide menschliche, squamöszellige A431-Tumore von Fremdspendern trugen, bestimmt. Diese Experimente wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die positiven Ergebnisse, die in dem murinen aszitischen P388-Tumor-Modell beobachtet wurden, repräsentativ für andere Tumortypen waren. SCID-Mäusen, die 100–200 mg solide menschliche A431-Tumore trugen, wurden mit freiem Vincristin oder mit Liposomen aus entweder DSPC/Chol oder SM/Chol, die Vincristin enthielten, i.v. injiziert. Vincristin einschliessende DSPC/Chol- oder SM/Chol-Liposome wurden wie in Beispiel II hergestellt. Die Verkapselung von Vincristin in DSPC/Chol- und SM/Chol-Liposome erhöhte die Menge an nach 24 Stunden nach der Verabreichung im Kreislauf verbleibendem Vincristin 28-beziehungsweise 87fach, verglichen mit freiem Vincristin (11A). Wie in BDF1-Mäusen, die P388-Tumore trugen, beobachtet, war die Menge des im Kreislauf verbleibenden Vincristins in SM/Chol-Liposomen 24 Stunden nach der Injektion ca. 3 mal so gross wie von Vincristin, das in DSPC/Chol-Liposome eingekapselt war (11A).
Verbesserte Lebensdauer von Vincristin im Kreislauf korrelierte mit einer Zunahme der Beladung von Vincristin in die A431-Tumore (11A). Genauer waren die freien Vincristinspiegel in den A431-Tumoren 0,5 Stunden nach der Injektion am höchsten (0,856 mg/g Tumor) und nahmen auf 0,32 mg/g Tumor nach 24 Stunden ab (11B). Die Verkapselung von Vincristin in DSPC/Chol-Liposome erhöhte die Menge von Vincristin in A431-Tumoren 4 bis 48 Stunden nach der Verabreichung auf 1,3 beziehungsweise bis 1,55 mg/g Tumor (11B). Die Verkapselung von Vincristin in SM/Chol-Liposome resultierte in einer weiteren Zunahme der Vincristinabgabe an A431-Tumore 24 bis 48 Stunden nach der Injektion auf 2,8–3,2 mg/g Tumor, was eine zweifache Zunahme in der Abgabe, die man mit DSPC/Chol-Liposomen erhält, bedeutet. Wie in dem murinen aszitischen Tumormodell beobachtet, war das Vincristin/Lipid, das in den soliden menschlichen A431-Tumoren beobachtet wurde, sehr ähnlich dem, das im Plasma beobachtet wurde.
Das heisst, für Vincristin, das in DSPC/Chol-Liposomen eingekapselt war, betrugen die Vincristin/Lipid-Verhältnisse (Gew./Gew.) 24 Stunden nach der Injektion 0,022 im Plasma und 0,029 im Tumor, während für Vincristin, das in SM/Chol-Liposomen eingeschlossen war, die Vincristin/Lipid-Verhältnisse 0,055 im Plasma und 0,050 im Tumor betrugen.
Die Anti-Tumor-Wirksamkeit von freiem und liposomalem Vincristin gegen A431 war eng mit der Vincristinakkumulation im Tumorgebiet korreliert (12). SCID-Mäuse, die A431-Tumoren trugen, die keine Behandlung erhielten, zeigten innerhalb von 4-5 Tagen nachdem die Behandlung begonnen wurde, eine 100%ige Zunahme des Tumorgewichtes und mussten innerhalb von 10 Tagen getötet werden, als der Tumor 10% des gesamten Körpergewichtes übertraf. Tumortragenden SCID-Mäuse, die mit freiem Vincristin mit 2 mg/kg behandelt wurden, wiesen eine kurze Verzögerung des Tumorwachstums auf (100%ige Zunahme des Tumorgewichtes innerhalb von 6–8 Tagen erreicht), aber mussten nach 10–12 Tagen getötet werden. Im Gegensatz dazu, resultierte die Behandlung mit in DSPC/Chol-Liposomen eingeschlossenem Vincristin in einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums (100% Zunahme des Tumorgewichtes nach 15–20 Tagen, Tötung 21 Tage nach der Behandlung). Diese Therapie wurde durch eine einzelne Behandlung mit in SM/Chol-Liposomen eingeschlossenem Vincristin weiter verbessert. In dieser Behandlungsgruppe wurde eine kleine aber beständige Abnahme der Tumorgrösse beobachtet. 15 Tage nach der Injektion, waren einige Tumore tastbar aber nicht messbar, und 33 Tage nach der Behandlung waren einige Tumore nicht mehr tastbar. Von den 5 Mäusen (10 Tumore gesamt), die mit SM/Chol-liposomalem Vincristin behandelt wurden, wurde ein Tier früh auf Grund einer Tumorulzeration getötet, nicht auf Grund von Tumorwachstum. Von den acht Tumoren, die 40 Tage nach der Liposom-Injektion verblieben, zeigte die histologische Untersuchung, dass alle acht Tumore sich aktiv teilende, squamöszellige Carcinome einer Masse, die durch körperliche Untersuchung nicht feststellbar war, waren. Demnach bewirkte die Behandlung mit SM/Chol-liposomalem Vincristin eine signifikante Abnahme im Tumorwachstum, obwohl keiner der ursprünglichen Tumoren geheilt war.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Erfindung, dass liposomale Formulierungen von Vincristin und anderen Alkaloiden, basierend auf Sphingomyelin/Cholesterin-Vesikeln, einige signifikante Vorteile gegenüber Formulierungen, die auf DSPC/Chol-Vesikeln basieren aufweisen. Genauer sind Formulierungen, basierend auf Sphingomyelin/Cholesterin: (1) viel stabiler gegen Säurehydrolyse, weisen (2) signifikant bessere Medikamentenretentionseigenschaften auf, weisen (3) bessere Tumorbeladungseigenschaften auf und zeigen (4) eine signifikant bessere Anti-Tumor-Wirksamkeit als dies vergleichbare Liposome tun, die aus DSPC/Chol oder SM/Chol/ PEG-PE bestehen.

Claims

Eine liposomale Zusammensetzung für die Zufuhr einer therapeutischen Verbindung zu einem Säugetierwirt, welche ein Liposom umfasst, das eine oder mehr Membranen aufweist, welche Sphingomyelin und Cholesterin umfassen, ein liposomales Inneres, das einen sauren pH aufweist, der geringer ist als derjenige des liposomalen Äusseren, und eine therapeutische Verbindung, die in dem Liposom enthalten ist, für die Zufuhr zu dem Wirt.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Sphingomyelin und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 75/25 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin bis 30/50 mol %/mol % Sphingomyelin/Cholesterin vorliegen.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 2, worin das Sphingomyelin und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 70/30 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin bis 40/45 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin vorliegen.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, worin das Sphingomyelin und Cholesterin in einem Verhältnis von ungefähr 55/45 mol%/mol% Sphingomyelin/Cholesterin vorliegen.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin die lipophile therapeutische Verbindung ein Alkaloid ist.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, worin das Alkaloid aus Vincristin, Vinblastin, Swainsonin oder Etoposid oder Vorstufen davon ausgewählt wird.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, worin das Alkaloid Vincristin ist.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin Vincristin in einem Medikament zu Lipid-Verhältnis von ungefähr 0,01/1,0 bis 0,2/1,0 (Gew./Gew.) vorliegt.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, desweiteren wenigstens ein Lipid umfassend, das aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure, Cardiolipin, Phosphatidylinosit, Ceramid, Cerebrosid und Gangliosid ausgewählt wird.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Liposome unilaminar sind.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Liposome durchschnittliche Durchmesser von ungefähr 0,05 μm (Mikron) bis 0,45 μm (Mikron) aufweisen.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Liposome durchschnittliche Durchmesser von ungefähr 0,05 μm (Mikron) bis 0,2 μm (Mikron) aufweisen.
Die liposomale Zusammensetzung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Innere einen Citratpuffer bei ungefähr pH 4,0 umfasst.
Ein Liposom für die Zufuhr einer therapeutischen Verbindung, hergestellt durch das Verfahren der Bildung eines Liposoms aus einer Mischung, die Sphingomyelin und Cholesterin umfasst, in einer ersten gepufferten wässrigen Lösung, die einen sauren pH grösser als pH 2 aufweist; und Suspension der Liposome in einer zweiten gepufferten Lösung, die einen pH aufweist, der grösser ist als der der ersten gepufferten wässrigen Lösung, wobei ein Transmembran-pH-Gradient gebildet wird, der die Überführung der therapeutischen Verbindung zu dem Liposom erleichtert, worin das Innere des Liposoms, das die therapeutische Verbindung enthält, bei pH 2 bis pH 6 liegt.
Das Liposom, das durch das Verfahren gemäss Anspruch 14 hergestellt wird, worin das Verfahren desweiteren den Schritt der Trennung des Liposoms, das die therapeutische Verbindung enthält, von dem zweiten Puffer, der therapeutische Verbindung enthält, welche nicht durch das Liposom eingefangen worden ist, umfasst.