DE69732308T2

DE69732308T2 - Arzneistoffverabreichungssystem mit hyaluronsäure

Info

Publication number: DE69732308T2
Application number: DE69732308T
Authority: DE
Inventors: Christopher Lewes MARRIOTT; Gary Peter Martin; Mark Barry Watford BROWN
Original assignee: Jagotec AG
Current assignee: Jagotec AG
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: CA2266622A1; WO1998013024A2; EP0963196A2; AU4468197A; AU740111B2; WO1998013024A3; EP0963196B1; US20010005501A1; CA2266622C; DE69732308D1; US6890901B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen zum Transport von Cyclosporin A.
Liposomen und Hyaluronsäure sind jeweils als Arzneimittelräger im topischen Transportsystemen für Arzneimittel verwendet worden.
Für eine Übersicht der Literatur zur Verwendung von Liposomen als Transporter für dermale Arzneimittel verweisen wir auf Gary P. Martin „Phospholipids as Skin Penetration Enhancers", King's College University of London, London, United Kingdom, S. 57–84, 1993.
Liposomen sind Vesikel, in denen ein wässriges Kompartiment oder Volumen vollständig von einer Membran aus Lipidmolekülen umschlossen ist, bei denen es sich gewöhnlich um Phospholipide handelt. Liposomen können sich spontan bilden, wenn Lipide in wässrigen Medien dispergiert werden, was eine Population von Liposomen-Vesikeln erzeugt, die durchschnittliche maximale Durchmesser im Nanometer- bis Mikrometer-Bereich aufweisen. Liposomen können so gebildet werden, dass sie Moleküle einschließen, und zwar entweder in dem wässrigen Kompartiment oder in der Membran oder in beiden dieser Orte. Liposomen können aus natürlichen Bestandteilen derart gebildet werden, dass ihre Membran oder Membranen eine Doppelschicht ausbildet/ausbilden, die ähnlich der Lipidanordnung in natürlichen Zellmembranen ist. Es ist möglich, diese Ähnlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo für die zielgerichtete Zufuhr von Arzneimitteln oder für die Immunmodulation zu nutzen, wobei die Fähigkeit der Liposomen, das Verhalten natürlicher Membranen zu imitieren und daher durch dieselben Stoffwechselvorgänge abgebaut zu werden, sie zu einem außerordentlich sicheren und effektiven Arzneimittel-Transporter für die medizinische Anwendung macht.
Abgesehen von den chemischen Bausteinen der Liposomen, die deren Fluidität, Ladungsdichte und Permeabilität bestimmen, können Liposomen durch die Größe und Form charakterisiert werden. Liposomen besitzen durchschnittliche maximale Durchmesser im Bereich von 25 Nanometern bis über 1.000 Nanometern, was mit den durchschnittlichen maximalen Durchmessern lebender Zellen übereinstimmt. Wie oben angegeben, können Liposomen eine einzelne Doppelschicht-Membran aufweisen. Sie können jedoch auch mehrfache, konzentrische Membranschichten besitzen, die einander aufeinanderfolgend umgeben. Es ist daher möglich, Liposomen aufgrund der Anzahl ihrer Membranschichten und relativen durchschnittlichen Durchmesser in eine der folgenden Kategorien einzuteilen: multilamellare Vesikel (MLV)-Liposomen, kleine unilamellare Vesikel (SUV)-Liposomen, große unilamellare Vesikel (LUV)-Liposomen und intermediäre unilamellare Vesikel (IUV)-Liposomen (siehe New, R. C., „Liposomes – A Practical Approach", Oxford University Press, Oxford, S. 1–33, 1990).
Es ist für verschiedene Faktoren, wie etwa die Lamellarität (d. h. die Anzahl der Lamellen bzw. Doppelmembranschichten), die Lipidzusammensetzung, die Ladung auf der Liposomenoberfläche und die Gesamtlipidkonzentration gezeigt worden, dass diese die Arzneimittelverteilung in den tieferen Hautschichten beeinflussen (siehe z. B. Weiner et al. „Topical Delivery of Liposomally Encapsulated Interferon in a Herpes Guinea Pig Model", Antimicrob. Agents Chemother., 33: 1217–1221, 1989). Ebenso gab es zahlreiche Diskussionen über den Mechanismus der Liposomen-Diffusion in die Haut. Ursprünglich ging man davon aus, dass Liposomen intakt durch die Dermis diffundieren, wo sie dann räumlich verteilt werden, wie dargestellt in Mezei, M. und Gulasekharam, V., „Liposomes – A Selective Drug Delivery System for the Topical Route of Administration" Life Sci., 26: 1473–1477, 1980. Später wurde diese Theorie kritisiert in Ganesan et al. „Influence of Liposomal Drug Entrapment on Percutaneous Absorption", Int. J. Pharm., 20: 139–154, 1984; und Ho et al. "Mechanism of Topical Delivery of Liposomally Entrapped Drugs", J. Controlled Rel., 2: 61–65, 1985, da man davon ausging, dass das dicht gepackte Stratum corneum den Durchtritt von Liposomen durch die Epidermis und Dermis nicht erlauben würde. Egbaria, K. und Weiner, N., „Topical Application of Liposomal Preparations", Cosmet. Toilet, 106: 79–93, 1991 postulierten, dass eine molekulare Vermischung der Doppelschichten des Liposoms und des Stratum corneum stattfindet. Es gab ebenfalls Hinweise darauf, dass der follikuläre Penetrationsweg zu dem liposomalen Arzneimittel-Transport in die Haut beiträgt, wie etwa diskutiert in Du Plessis et al. „Topical Delivery of Liposomally Encapsulated Gamma-Interferon", Antiviral Res., 18: 259–265, 1992; und ebenso Hinweise darauf, dass die Größe des Liposoms wichtig ist, wie beschrieben in Du Plessis et al. „The Influence of Particle Size of Liposomes on the Deposition of Drug into Skin", 103: 277–282, 1994.
Liposomen sind auch für die nicht-topische oder parenteralen Arzneimittel verwendet worden. Bei die Bewertung der Effektivität der Arzneimittelzufuhr über Liposomen haben Forscher (1) die Auswirkung von Bestandteilen biologischer Flüssigkeiten auf die strukturelle Integrität von Liposomen untersucht, und ebenso (2) die Geschwindigkeiten, mit denen Liposomen an der Verabreichungsstelle eliminiert und in die Gewebe verteilt werden. Bei beiden Parametern wird das Verhalten der Liposomen durch deren strukturelle Eigenschaften bestimmt. Insbesondere nimmt z. B. die Geschwindigkeit der Clearance an der Verabreichungsstelle ab, wenn die Stabilität der Liposomen zunimmt. Ihre Zirkulationszeit kann dagegen durch die Verwendung kleinerer Liposomen oder die Änderung der Lipidzusammensetzung kontrolliert werden, oder indem die Liposomen hydrophil gemacht werden (siehe Gregoriadis, G., „Liposomes in Drug Delivery: Present and Future", 346–352).
Trotz dieses umfangreichen Wissens und Schrifttums sind Liposomen alleine auf Grund ihrer Instabilität und/oder ihrer unzureichenden Penetrationseigenschaften in bestimmten Systemen gelegentlich als Arzneimittel-Transporter unzulänglich.
Wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. 93/16732 diskutiert und beansprucht wird, ist auch Hyaluronsäure als Vehikel für die topische Zufuhr von Arzneimitteln bekannt. Hyaluronsäure ist jedoch extrem hydrophil und ist daher mit hydrophoben Arzneimitteln wie etwa Cyclosporin nicht erfolgreich kombiniert worden.
Es ist gefunden worden, dass es zahlreiche Proteine gibt, die HA binden, einschließlich diverser, verschiedener Zellrezeptoren mit einer Vielzahl von Funktionen, einschließlich solcher Rezeptoren, die mit Tumorzellen in Zusammenhang stehen. Es wurde daher vorgeschlagen, dass HA angesichts der Vielzahl ihrer Möglichkeiten, mit Zellen zu interagieren, verschiedene regulatorische Funktionen besitzen muss.
WO 96/14083 beschreibt die Formulierung von Superoxid-Dismutase in Liposomen, gegebenenfalls vermischt mit Hyaluronsäure, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, die gegen erhöhte Konzentrationen von Superoxid-Radikalen nützlich sind. FR-A-2622104 beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem aktiven Wirkstoff, die in Gegenwart von Atelocollagen formuliert wurden und in denen Hyaluronsäure vorhanden sein kann. FR-A-2614787 beschreibt kosmetische Zusammensetzungen enthaltend Liposomen und ein Natriumsalz der Hyaluronsäure. EP-A-0446931 beschreibt die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen enthaltend Hyaluronsäure in der Gentherapie. Ebenso beschreibt WO 97/15330 die Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen aus Liposomen und Hyaluronsäure in der Gentherapie. Hermann et al., Skin. Pharmacol., 1: 246–249 (1988), beschreibt eine Studie über die Probleme bei der Verwendung topischen Cyclosporins für die Behandlung von Psoriasis.
Viele Arzneimittel, beispielsweise Cyclosporin A (Molekularformel: C₆₂H₁₁₁N₁₁O₆₂; gelegentlich im folgenden als CsA bezeichnet), sind schwierig zu verabreichen. Cyclosporin A ist ein zyklisches Undekapeptid-Antibiotikum, das von dem Pilz Tolypocladium inflatum produziert wird, und hochgradig lipophil ist. Cyclosporin A ist außerdem praktisch unlöslich in Wasser und, wie oben angegeben, hydrophob. Cyclosporin A ist ein wirkungsvolles, für T-Lymphozyten zellspezifisches Immunsuppressionsmittel, das primär für die Prophylaxe und Behandlung der Organabstoßung bei Nieren-, Leber-, Herz- und Pankreas-Transplantationen verwendet wird. Es ist außerdem oral oder intramuskulär bei der Behandlung von Psoriasis verabreicht worden, wie dies in Ellis et al. „Cyclosporin Improves Psoriasis in a Double Blind Study", JAMA, 256: 3110–3116; Griffiths et al. (1987) "Cyclosporine and Psoriasis", Lancet, i: 806, 1986, diskutiert wird.
Wenn es oral verabreicht wird, wird Cyclosporin A gewöhnlich als eine mit Getränken gemischte Olivenöl-basierte Mikroemulsionslösung verabreicht. Cyclosporin A kann auch als intravenöse Injektion verabreicht werden. Der Arzneistoff wird unter Verwendung des Solubilisierungsmittels Chremophor EL, einem Gemisch aus Olivenöl und polyethoxyliertem Rizinusöl (auch bekannt unter dem Handelsnamen Neoral) solubilisiert. Die systemische Applikation einer solchen Cyclosporin A-Formulierung führt jedoch zu verschiedenen Nebenwirkungen wie etwa anaphylaktischen Reaktionen, das Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Nephrotoxizität, gastrointestinalen Problemen, Hepatotoxizität, angioneurotischem Ödem und leichtem Zittern, wie dies in Thomson, A. W., „Immunobiology of Cyclosporin: A Review", Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 61: 147–172, 1983, beschrieben wird. Es wird vermutet, dass eine Reihe dieser Nebenwirkungen von dem Arzneimittel-Transporter selbst verursacht wird, wie dies in Williams et al. „Intravenous Cyclosporin and Kidney Function: The Johns Hopkins Experience" Transplant. Proc., 18: 66–73, 1986; und Luke et al. "Effects of Cyclosporin on the Isolated Perfused Rat Kidney" Transplantation, 43: 795–799, 1987, diskutiert wird.
Die Häufigkeit systemischer Nebenwirkungen kann merklich vermindert werden, wenn Cyclosporin A topisch verabreicht wird, obgleich frühere Studien über die transdermale Zufuhr von Cyclosporin A zur Behandlung von Psoriasis unter Verwendung von Öl-in-Wasser-Emulsionen zeigten, daß diese Verabreichungsform ineffektiv ist (siehe z. B. Gilhar et al. „Topical Cyclosporin in Psoriasis" J. Am. Acad. Dermatol., 18: 378–379, 1988; und Hermann et al. „Topical Cyclosporin for Psoriasis", Skin Pharmacol., 1: 246–249, 1988). Zusätzlich können die Nebenwirkungen vermindert werden, indem ein weniger antagonistischer Träger verwendet wird. Es besteht somit ein Bedarf an einer nicht-toxischen Dosierungsform von Cyclosporin A und einen sicheren Weg der Verabreichung.
Eine Kombination von CsA und Liposomen ist aufgrund der physikalischen Instabilität der Kombination nicht zufriedenstellend. Das bedeutet, dass die Liposomen in der Liposomen/CsA-Kombination zerfallen können, sodass eine Trennung des CsA von den Liposomen bewirkt wird. Allerdings kann diese Trennung zwischen CsA und den Liposomen sogar erfolgen, wenn die Liposomen nicht zerfallen. Eine geeignete Kombination musste daher noch entwickelt werden. Hyaluronsäure alleine versagt ebenfalls als Träger für CsA aufgrund der lipophilen, hydrophoben Natur von CsA.
HA und Liposomen sind jeweils für sich ebenfalls nicht in der Lage, als gute Träger für andere lipophile und hydrophobe Arzneimittel zu fungieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend ein Gemisch aus Hyaluronsäure und Liposomen und mit in diesen Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A, für die topische Verabreichung. Die Liposomen können multilamellar sein. Geeigneter Weise besitzt die Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10.000 bis 1.000.000 Dalton. Die Liposomen der Erfindung können negativ geladen sein und können einen durchschnittlichen maximalen Durchmesser im Bereich von 80 bis 1040 Nanometern, vorzugsweise 200 bis 900 Nanometern, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung 13,2 Gewichts-% Liposomen, 2,5% Hyaluronsäure und 13,5 Milligramm Cyclosporin A pro Gramm Liposomen enthalten.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die Hyaluronsäure und Liposomen aufweist, wobei dieses Verfahren die Herstellung von Liposomen aus Phospholipiden in Gegenwart von Cyclosporin A und das Mischen dieser Liposomen mit der Hyaluronsäure umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung 13,2 Gewichts-% Liposomen, 2,5 Gewichts-% Hyaluronsäure und 13,5 Milligramm Cyclosporin A pro Gramm Liposomen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Mischung aus Hyaluronsäure und Liposomen mit in diesen Liposomen eingeschlossen Cyclosporin A zur Verwendung bei der Behandlung der Psoriasis bereitgestellt. Dieser Aspekt umfaßt daher die Verwendung von Cyclosporin A und Phospholipiden bei der Herstellung von Liposomen, und anschließend die Beimischung dieser Cyclosporin A einschließenden Liposomen mit Hyaluronsäure bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Psoriasis.
Der Einschluss des Cyclosporin A innerhalb der Liposomen zur Ausbildung einer Liposom/Cyclosporin A-Zusammensetzung erlaubt es Cyclosporin A, mit Hyaluronsäure (hier im folgenden gelegentlich als HA bezeichnet) kombiniert zu werden, um eine wirkungsvolle pharmazeutische Zusammensetzung auszubilden, die die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die negativ geladene Liposomen bei einer 13.000-fachen Vergrößerung zeigt;
1B ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die negativ geladene Liposomen bei einer 9.800-fachen Vergrößerung zeigt;
2 ist ein Diagramm, das die Partikelgrößenverteilung von negativ geladenen Liposomen in HEPES-Puffer mit 0,1 M und einem pH von 7,4 zeigt;
3 ist ein Diagramm, das einen Indikator für die Elastizität, gemessen als Speichermodul (G'), und einen Indikator für die Viskosität, gemessen als Verlustmodul (G''), für Hyaluronsäure zeigt, und zwar mit und ohne negativ geladene Liposomen in Abhängigkeit von der Frequenz;
4 ist eine Kurve, die das Verhältnis der Peakfläche zur Konzentration bei der Verwendung von Fluoranthen als temporärer interner Standard zeigt, wobei diese Kurve verwendet wurde, um die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Einheit zu kalibrieren, die zur Bestimmung der Menge an in den Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A eingesetzt wurde;
5A ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs bei einer 4.300-fachen Vergrößerung, die Cyclosporin A zeigt, das in negativ geladenen Liposomen enthalten ist;
5B ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs bei einer 18.000-fachen Vergrößerung, die Cyclosporin A zeigt, das in negativ geladenen Liposomen enthalten ist;
6 ist ein Diagramm, das einen Indikator für die Elastizität, gemessen als Speichermodul (G'), und einen Indikator für die Viskosität, gemessen als Verlustmodul (G''), für HA zeigt, und zwar mit und ohne negativ geladene, Cyclosporin A enthaltende Liposomen in Abhängigkeit von der Frequenz;
7 ist ein Diagramm, das einen Indikator für die Elastizität, gemessen als Speichermodul (G'), in Abhängigkeit von der Frequenz für in Hyaluronsäure suspendierte negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen zeigt, sowie für Hyaluronsäure alleine, bei einer null Stunden entsprechenden Zeit;
8 ist ein Diagramm, das einen Indikator für die Elastizität, gemessen als Speichermodul (G'), in Abhängigkeit von der Frequenz für die in Hyaluronsäure suspendierte negativ geladen, positiv geladene und neutrale Liposomen nach 72 Stunden zeigt;
9 ist ein Diagramm, das die vergleichende Oxidation von Formulierungen zeigt, die Liposomen alleine, Liposomen mit HA und Liposomen mit α-Tocopherylacetat enthalten;
10 ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die in Liposomen enthaltenes Cyclosporin A und HA vor der Gefriertrocknung bei einer 8.650-fachen Vergrößerung zeigt;
11 ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die in Liposomen enthaltenes Cyclosporin A und HA vor der Gefriertrocknung bei einer 14.400-fachen Vergrößerung zeigt;
12 ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die in Liposomen enthaltenes Cyclosporin A und HA nach der Gefriertrocknung bei einer 15.350-fachen Vergrößerung zeigt;
13 ist eine photographische Aufnahme eines Gefrierbruchs, die in Liposomen enthaltenes Cyclosporin A und HA nach der Gefriertrocknung bei einer 9.230-fachen Vergrößerung zeigt; und
14 ist ein Diagramm, das die relative radioaktive Anwesenheit von Cyclosporin A in der Epidermis und der Dermis der Haut für Formulierungen zeigt, die HA und Liposomen, bzw. nur Liposomen enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie allgemein hier verwendet bezieht sich HA auf eine Hyaluronsäureverbindung, die beim Lösen Hyaluronsäure ergibt. Die wirksamen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung umfassen ein Gemisch aus Liposomen mit einer ausreichenden Menge an HA, damit die Liposomen, mit denen HA gemischt wird, als effektiver Cyclosporin A-Arzneimittelträger wirken. Die Menge an für diesen Zweck benötigter HA ist abhängig von dem Molekulargewichts-Anteil von HA. Wenn z. B. das Molekulargewicht relativ niedrig ist, kann die Konzentration relativ hoch sein, und umgekehrt. HA kann ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 10.000 bis 1.000.000 Dalton besitzen, wobei der größte Anteil vorzugsweise 400.000 bis 800.000 Dalton beträgt. Hyaluronsäure wird üblicher Weise in Form einer wässrigen Lösung von HA-Salzen bereitgestellt, wie etwa Natrium- oder Kalium-Hyaluronat, mit einer HA-Konzentration im Bereich von 0,3 bis 2,5 Gewichts-%. Zusammensetzungen mit HA innerhalb dieser Konzentrationsbereiche und mit diesen durchschnittlichen Molekulargewichten werden üblicherweise als topische oder nicht-topische Arzneimittelträger für eine große Bandbreite von Liposomen effektiv sein.
Wie nachfolgend diskutiert wird, werden Liposomen üblicherweise unter Verwendung zweier Techniken hergestellt, einer Gefrier-Auftau-Zyklus-Technik und einer konventionellen Filmtechnik. Beide Techniken erzeugen hauptsächlich multilamellare Vesikel (MLV)-Liposomen (MLVs umfassen typischerweise fünf oder mehr konzentrische Lamellen und besitzen durchschnittliche maximale Durchmesser im Bereich von 100 bis 1.000 Nanometern). Andere Techniken der Liposomenherstellung können ebenfalls genutzt werden. Unabhängig von dem Herstellungsverfahren für solche Liposomen werden sie durch die Kombination mit HA, in einem einfachen Gemisch, stabiler und brauchbarer.
Darüber hinaus scheinen Liposomen die viskoelastische Natur von HA nicht zu beeinträchtigen. Tatsächlich wird die Stärke des HA-Gels offenbar erhöht. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass Liposomen hydrophobe Bindungen unterstützen. Es ist auch möglich, dass HA dabei hilft, die Liposomen zu stabilisieren und vor einem Zerfall zu schützen, wodurch somit ein typisches, mit dem Liposomentransport verbundenes Problem überwunden wird.
Es ist gezeigt worden, dass es möglich ist, eine gelatinöse pharmazeutische Zusammensetzung mit Cyclosporin A und Hyaluronsäure unter Verwendung von Liposomen herzustellen. Durch das Mischen von HA mit einer Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung zur Herstellung eines Gemisches hiervon, kann Cyclosporin A effektiv und mit minimaler systemischer Zufuhr zur Epidermis, Dermis, Subdermis und den dazwischen befindlichen Zonen verbracht und dort verteilt werden.
Außerdem kann die HA-Liposomen-Zusammensetzung, die Cyclosporin A enthält, bei oraler, parenteraler oder intrarektaler Verabreichung bestimmte Stellen im Körper zielgerichtet ansteuern. Dies wird der Befähigung beider Komponenten zum zielgerichteten Transport zugeschrieben. Genauer gesagt macht die Interaktion von HA mit verschiedenen Zellrezeptoren diese zu einem geeigneten Kandidaten für einen zielgerichteten Arzneimittelträger für die nicht-topische Verabreichung eines Arzneimittels.
Ursprünglich dachte man, dass Liposomen als Verstärker der Penetration wirken könnten. Man nahm also an, dass Liposomen die Gewebepenetration erleichtern können, um den Transport eines Arzneimittels zu erlauben. Inzwischen wird jedoch vermutet, dass Liposomen einen ähnlichen Mechanismus haben könnten, wie er für Hyaluronsäure vorgeschlagen wird. Das heißt, Liposomen können den lokalen Transport eines Arzneimittels innerhalb der Epidermis und/oder der Dermis verstärken und dadurch die Menge des Arzneimitels vermindern, das in den systemischen Kreislauf gelangt. Ein solcher Effekt ist von ersichtlichem Vorteil, wenn die gewünschte Zufuhrstelle innerhalb der Hautschichten liegt. Ebenso kann eine lokal begrenzte Zufuhr vorteilhaft bei einem Arzneimittel sein, das über einen längeren Zeitraum oder an ausgedehnte Bereiche des Körpers verabreicht werden muss, oder auch dann, wenn die systemische Toxizität ein Problem darstellen könnte.
Um zu zeigen, dass praktisch jedes Liposom mit HA kombiniert werden kann, ohne die Wirksamkeit von HA als Träger und Transportvehikel zu vermindern, wurde die Wirkung von negativ geladenen, positiv geladenen und neutralen Liposomen auf die Viskoelastizitätseigenschaften eines HA-Gels in Abwesenheit eines jedweden Arzneimittels untersucht. Die Viskoelastizitätseigenschaften wurden durch Beobachtung des Speichermoduls (G') und des Verlustmoduls (G'') auf die Liposomen- und HA-Gelzusammensetzung untersucht, und zwar bei einem HA-Anteil von 2,5 Gewichts-% der Zusammensetzung und bei verschiedenen Frequenzen und bei konstanter Verformung oder Verdrängung. Der Speichermodul (G') ist ein Indikator für die Elastizität einer Substanz und daher ein Kennzeichen für die Stärke der HA-Gelzusammensetzung und ein Maßstab für die Stabilität der dreidimensionalen Struktur des Gels. Die Stabilität der dreidimensionalen Struktur bezieht sich auf die Fähigkeit der HA-Gelzusammensetzung, eine dreidimensionale Form aufrechtzuerhalten. Je höher der Wert für G' bei einer gegebenen Frequenz ist, umso elastischer ist die HA-Gelzusammensetzung, und ist daher mit einer umso größeren Stärke der HA-Gelzusammensetzung verbunden. Der Verlustmodul (G'') ist ein Indikator für die Viskosität einer Substanz. Je höher der Wert für G'' bei einer gegebenen Frequenz ist, umso viskoser ist die HA-Gelzusammensetzung.
Die Frequenz, bei der der Speichermodul (G') den Verlustmodul (G'') schneidet, ist als Überschneidungsfrequenz bekannt. Da der Verlustmodul (G'') ein Indikator für die Viskosität einer Substanz, und der Speichermodul (G') ein Indikator für die Elastizität einer Substanz ist, stellt die Überschneidungsfrequenz einen Weg zur Bestimmung der Viskoelastizitätseigenschaften einer Substanz dar. Wenn die untersuchte Substanz z. B. ein Gel ist, ist dieses Gel umso viskoelastischer, je niedriger die Überschneidungsfrequenz ist. Ein viskoelastisches Material ist ein viskoses Material, das auch bestimmte elastische Eigenschaften, wie etwa die Fähigkeit zur Speicherung von Deformationsenergie, besitzt. Im Zusammenhang von Gelen ist das Gel umso stabiler, je viskoelastischer dieses ist.
Die Stabilität von Liposomenformulierungen ist bestimmt worden, indem die rheologischen Profile diverser Liposomen/HA-Gelzusammensetzungen untersucht und diese Profile zum Zeitpunkt Null und nach zweiundsiebzig (72) Stunden miteinander verglichen wurden. Diese Tests wurden nach der Zeitspanne von 72 Stunden fortgesetzt, wobei die Ergebnisse für 7 Tage übereinstimmend blieben. Andere Tests zeigten eine vergleichbare Stabilität für bis zu 30 Tage.
Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden anhand der folgenden Tests, Arbeitsabläufe und Ergebnisse gezeigt.
Materialien
Phosphatidylcholin (Lecithin; Reinheitsgrad 1, mit einer Reinheit von über 99%) und Phosphatidyl-Serin und -Glycerin (mit einer Reinheit von über 99%) wurden von Lipid Products (Redhill, Surrey, UK) bezogen. Cholesterin, 0,05 M HEPES-Puffer (ein zwitterionischer Puffer) mit einem pH von 7,4, und Stearylamin (98%, Gaschromatographie) wurden bei Sigma Chemical Co. (Poole, Dorset, UK) erworben. Alle Lösungsmittel besaßen Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Reinheitsgrad und wurden von Fisher Scientific (Loughborough, Leics, UK) geliefert. Natrium-Hyaluronsäure (Produktnummern HG4003 und HG4001) mit durchschnittlichen Molekulargewichten im Bereich von 10.000 bis 1.000.000 Dalton wurden von der Hyal Pharmaceutical Corporation geliefert. Cyclosporin A, entsprechend dem pharmazeutischen US-Reinheitsgrad, wurde von der Atlantic Chemical Co. (Ontario, Kanada) bezogen.
Liposomenproduktion, Techniken der Arzneimittel-Beladung und Zugabe von HA
Es wurden zwei Techniken zur Herstellung von Liposomen eingesetzt. Beide Techniken erzeugten MLV-Liposomen, die den Einbau der maximalen Menge eines Arzneimittels in die Liposomen erlaubten. Die beiden eingesetzten Techniken waren eine Gefrier-Auftau-Zyklus-Technik, entworfen von Mayer et al. „Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles", Biochim. Biophys. Acta, 817: 193–196, 1985, und die viel einfachere konventionelle Filmtechnik, beschrieben durch New in „Liposomes – A Practical Approach", Oxford University Press, Oxford, S. 1–33, 1990. Die konventionelle Filmtechnik umfaßt weniger Produktionsstufen als die Gefrier-Auftau-Zyklus-Technik.
Bei beiden Techniken wurde Cyclosporin A zum Zeitpunkt der Liposomenherstellung in den Liposomen eingeschlossen.
Bei der Verwendung der konventionellen Filmtechnik wurde Cyclosporin A zunächst zu Lipiden hinzugegeben, die Phosphatidylcholin (PC), Cholesterin (C) und Rinder-Phosphatidylserin (PS) oder Phosphatidylglycerin (PG) in einem molaren Verhältnis von 1,0 PC : 0,5 C : 0,1 PG oder PS umfassen. Andere Lipide und molare Verhältnisse können ebenfalls verwendet werden. Die Lipide und Cyclosporin A wurden dann in einem 2 : 1-Verhältnis von Chloroform und Methanol in einem Rundbodenkolben gelöst. Die Lösungsmittel wurden dann durch Rotationsverdampfung unter einem Strom von Stickstoffgas entfernt, gefolgt von einer Trocknung der Lipid- und Cyclosporin A-Kombination unter Vakuum über Nacht, um einen Lipid- und CsA-Film zu bilden. Der Lipid- und CsA-Film wurde dann mit HEPES-Puffer (0,05 M, pH 7,4) hydratisiert, wodurch sich Liposomen bildeten, die CsA einschließen. Die CsA/Liposomen-Zusammensetzung umfasste 10 Gewichts-% Phosphatidylcholin, 2,5 Gewichts-% Cholesterin, 1,0 Gewichts-% Phosphatidyl-Serin oder -Glycerin und 1,35 Gewichts-% CsA. Es wurde anschließend reines, trockenes Natrium-Hyaluronsäure-Pulver (Produkt Nr. HG4003) derart zu der CsA/Liposomen-Kombination hinzu gegeben, dass die Konzentration an HA 2,5 Gewichts-% betrug. Die Zugabe von HA zu der CsA/Liposomen-Kombination reduzierte die Endkonzentration der Liposomen auf 13,165% (9,75 Gewichts-% Phosphatidylcholin, 2,44 Gewichts-% Cholesterin, 0,975 Gewichts-% Phosphatidyl-Serin oder -Glycerin) und die Endkonzentration von CsA auf 1,32 Gewichts-% der Zusammensetzung.
Beispielsweise wurde ein Film, der 1,0 Gramm Phosphatidylcholin, 0,25 Gramm Cholesterin, 0,10 Gramm Phosphatidyl-Serin oder -Glycerin, sowie 0,135 Gramm CsA enthielt, mit 8,515 Gramm HEPES-Puffer hydratisiert, um 10 Gramm an Liposomen zu erhalten, die 0,135 Gramm darin eingeschlossenes CsA enthalten, bzw. 13,5 Milligramm CsA pro Gramm Liposomen. Reines, trockenes Natrium- Hyaluronsäure-Pulver wurde dann hinzu gegeben und mit der CsA/Liposomen-Kombination hydratisiert, um eine HA-Endkonzentration von 2,5 Gewichts-% bereitzustellen. Vor seiner Verwendung wurde der HEPES-Puffer filtriert und entgast, um Sauerstoff zu entfernen und die Oxidation und den Abbau der ungesättigten Lipide zu minimieren.
Cyclosporin-Test
Die Menge an in den Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A wurde unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit einer 15-Zentimeter C18 Hichrom-Säule mit einer 5-Zentimeter Schutzvorrichtung (bezogen von Reading, Berks, UK) analysiert. Die Flussrate betrug 1,5 Milliliter pro Minute und die Säulentemperatur war 50°C. Die mobile Phase war ein Gemisch von 75 Gewichts-% Acetonitril und 25 Gewichts-% Wasser, und das Elutionsmittel wurde bei 207 Nanometern unter Verwendung von Fluoranthen als temporärer interner Standard überwacht.
Rheologische Studien
Die rheologischen Profile der Liposomen/HA-Gel-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurden unter Verwendung eines CarriMed UK CSL Rheometers (TA Instruments, Leatherhead, Surrey, UK.) untersucht. Das Rheometer war mit einer parallelen Acrylplatte von 4 Zentimeter Durchmesser ausgestattet, und alle Tests wurden bei 25°C ohne eine Lösungsmittelfalle durchgeführt. Die untersuchten rheologischen Profile waren der Speichermodul (G'; ein Indikator für die Elastizität des Gels) und der Verlustmodul (G''; ein Indikator für die Viskosität des Gels) in Abhängigkeit von der Frequenz bei konstanter Verformung oder Verdrängung.
Gefrierbruch
Es wurden Photos von Gefrierbrüchen für die erfindungsgemäßen Liposomen/HA-Gel-Zusammensetzungen aufgenommen. Die Gefrierbruch-Photos wurden erzeugt, indem die Liposomen/HA-Gelzusammensetzung zwischen zwei Kupferplatten gebracht wurde. Daraus schloss sich das Kryofixieren, das Brechen und Ätzen des Gels unter Hochvakuum und bei niedriger Temperatur an. Die Proben der Liposomen/HA-Gelzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurden dann mit Platin (Pt) und Kohlenstoff (C) dampfbeschichtet, um Replikabilder zu erzeugen. Mit „Replikabild" ist ein negatives photographisches Abbild der Liposomen/HA-Gelzusammensetzung gemeint. Nach der Reinigung wurden die Replikabilder auf einer Philips EM301G mode Transmissionselektronenmikroskopie-Einheit (aus Eindhoven, Niederlande) ausgewertet.
Bestimmung der Partikelgröße
Die meisten kommerziellen Partikelgrößenmesstechniken verwenden Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS). PCS nutzt die Zeitabhängigkeit von Intensitätsveränderungen bei gestreutem Laserlicht, die auf der Brownschen Partikelbewegung in Lösung/Suspension beruhen, um die Partikelgröße zu messen. Da kleine Partikel in Lösung schneller als große Partikel diffundieren, variiert die Geschwindigkeit von Veränderungen von gestreutem Licht dem entsprechend. Die Analyse der Intensitätsveränderungen erlaubt es, den Diffusionskoeffizienten (D) zu bestimmen, und, unter Verwendung der Stokes-Einstein-Gleichung (1), den äquivalenten hydrodynamischen Radius der Partikel (R_b) für Partikel zu berechnen, die von 3 Nanometern bis 3 Mikrometern reichen. Die Stokes-Einstein-Gleichung definiert den Diffusionskoeffizienten als: D = kT/6πη Rb (1)wobei k die Boltzmann-Konstante, T die absolute Temperatur und η die Viskosität des Lösungsmittels ist. Die durchschnittlichen maximalen Durchmesser bei den Liposomen/HA-Gelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wurden unter Verwendung eines Malvern Autosizer Model 700 (von Malvern, Worcs., UK.) bestimmt. Eine 1/200-Verdünnung der Liposomensuspension wurde in eine sauberen Küvette eingebracht und bei einer Thermostat-kontrollierten Temperatur von 25°C überwacht.
Versuchsergebnisse und Diskussion
Die Arten von Liposomen-Vesikel, die zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Liposomen/HA-Gelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden unter Verwendung der Gefrierbruch-Technik bestimmt.
Die unter Verwendung der Gefrierbruch-Technik, erzeugten 1A und 1B sind photographische Abbildungen negativ geladener Liposomen (hergestellt unter Verwendung einer Gefrier-Auftau-Zyklus-Technik) bei 13.000-facher bzw. 9.800-facher Vergrößerung. Die Gefrierbruchbilder zeigen, dass hauptsächlich multilamellare Vesikel (MLV)-Liposomen gebildet wurden. Bei der Bestimmung des Typs der vorliegenden Liposomen-Vesikel muss bei Verwendung der Gefrierbruchtechnik Acht gegeben werden, da die Wahrscheinlichkeit des Bruches bei großen Vesikeln höher ist als bei kleinen Vesikeln. Dies resultiert oft in einer Fehlidentifikation der Bruchverläufe in einer Membran und führt dazu, dass MLV-Liposomen fälschlicherweise für große unilamellare Vesikel (LUV)-Liposomen gehalten werden.
2 ist ein Diagramm, das die Verteilung der durchschnittlichen maximalen Durchmesser für negativ geladene Liposomen (wie gezeigt und beschrieben im Hinblick auf die 1A und 1B) in HEPES-Puffer von 0,05 M und mit pH 7,4 zeigt. Die durchschnittlichen maximalen Liposomendurchmesser lagen im Bereich von 80 bis 1040 Nanometern, wobei die Mehrheit im Bereich von etwa 200–900 Nanometern lag. Solche Liposomen erlauben den Einschluss maximaler Mengen an Cyclosporin A in die Liposomen. Die Liposomen wurden dann mit Hyaluronsäure (Produkt Nr. HG4001; durchschnittliches Molekulargewicht 630.000 Dalton) gemischt. Anschließend wurden die Fließeigenschaften überprüft, um den Effekt zu bestimmen, den die Liposomen auf die Viskoelastizitätseigenschaften von HA ausübten.
3 ist ein Diagramm, das den Speichermodul (G') und den Verlustmodul (G'') für Natrium-Hyaluronat (Produktnr. HG4001; durchschnittliches Molekulargewicht 630.000 Dalton) mit und ohne negativ geladene Liposomen (wie gezeigt und beschrieben im Hinblick auf 1A und 1B) in Abhängigkeit von der Frequenz zeigt. Bei etwa 13 Gewichts-% Liposomen und 2,5 Gewichts-% HA liegt keine Störung in der HA-Gelstruktur vor. Tatsächlich waren der Speichermodul (G', offener Kreis) und der Verlustmodul (G'', offenes Dreieck) für die Kombination von HA und negativ geladenen Liposomen geringfügig höher als der G'-Wert (offenes Quadrat) und der G''-Wert (offene Raute) für die HA-Gelzusammensetzung alleine. Es ist zu beachten, dass das Gel umso elastischer ist, je höher G' liegt, und umso viskoser, je höher G'' ist. Ebenso ist die Substanz umso viskoelastischer, je niedriger die Frequenz ist, bei der G' und G'' einander schneiden. Die Frequenz, bei der sich G' und G'' schneiden, beträgt etwa 4 Hertz für die HA/Liposomen-Zusammensetzung, während die Frequenz, bei der sich G' und G'' schneiden, für HA alleine bei etwa 5 Hertz liegt. Dies zeigt, dass die HA/Liposomen-Zusammensetzungen geringfügig viskoelastischer sind als HA alleine. Diese gesteigerte Viskoelastizität zeigt, dass eine stabile HA/Liposomen-Formulierung erreicht werden kann.
Wie oben diskutiert, wurde Cyclosporin A bei Verwendung einer konventionellen Filmtechnik auch in negativ geladene Liposomen eingeschlossen. Bei Verwendung einer konventionellen Filmtechnik wurden negativ geladene Liposomen (wie im Hinblick auf 1 gezeigt und beschrieben) mit 13,5 Milligramm Cyclosporin A pro Gramm Liposomen beladen. Der Einschluss von Cyclosporin A in die Liposomen wurde unter Verwendung von Protamin-Aggregation und Zentrifugation, mit anschließendem Aufbrechen der Vesikel mit Triton X100 bestimmt, wie diskutiert in Rosier et al. „A Rapid Method for Separating Small Vesicles from Suspension", Anal. Biochem. 96: 384–390, 1979, gefolgt von HPLC-Analyse. Die Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung wurde dann im Gemisch mit HA kombiniert.
4 ist eine Eichkurve, die das Verhältnis der Peakfläche zur Konzentration zeigt, wobei Fluoranthen als temporärer interner Standard verwendet wird. Diese Eichkurve wurde verwendet, um die Geräte der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) vor der Analyse der HA/Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung zu kalibrieren, um die Menge an in den Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A zu bestimmen. Der Test zeigte, dass das gesamte Cyclosporin A innerhalb der Liposomen in HA eingeschlossen war. Dieses Ergebnis wurde durch Beobachtungen mittels Elektronenmikroskopie bei negativer Färbung weiter bestätigt, die zeigten, dass keine freien Cyclosporin A-Partikel in kristalliner Form vorhanden waren, nachdem Cyclosporin A in die Liposomen eingeschlossen worden war.
Die unter Verwendung der Gefrierbruch-Technik hergestellten 5A und 5B sind photographische Abbildungen negativ geladener Liposomen (wie gezeigt und beschrieben im Hinblick auf die 1A und 1B), die Cyclosporin A enthalten, bei 4.300-facher bzw. 18.000-facher Vergrößerung. Nachdem Cyclosporin A in die negativ geladenen Liposomen eingeschlossen worden war, wie oben im Hinblick auf 3 dargestellt, wurde die Cyclosporin A/Liposomen-Kombination mit HA gemischt. Es wurden dann Gefrierbruch-Abbildungen der Zusammensetzung aufgenommen. Die Bilder zeigen, dass multilamellare Vesikel (MLV)-Liposomen vorherrschend waren. Das bedeutet, dass der Einschluss von Cyclosporin A in die Liposomen und das dann erfolgte Mischen der Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung mit HA die Struktur der liposomalen Vesikel nicht veränderte.
6 ist ein Diagramm, das den Speichermodul (G') und den Verlustmodul (G'') für Hyaluronsäure (Produktnr. HG4003; Molekulargewicht 630.000 Dalton) mit und ohne negativ geladene Liposomen (hergestellt unter Verwendung einer konventionellen Filmtechnik) enthaltend Cyclosporin A im Bezug auf die Frequenz zeigt. Cyclosporin A wurde, wie oben diskutiert, mit einer Beladung von 13,5 Milligramm CsA pro Gramm Liposom in den Liposomen eingeschlossen. Reines, trockenes HA-Pulver wurde dann mit der Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung (ebenfalls wie oben diskutiert) gemischt, sodass die Konzentrationen der Liposomen und der HA 13,165 Gewichts-% bzw. 2,5 Gewichts-% betrugen. Durch Auftragen von G' und G'' gegen die Frequenz und Bestimmung der Frequenz, bei der G' und G'' einander schneiden, wurde die viskoelastische Natur der HA/Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung, wie oben diskutiert, bestimmt.
Es wurde ein Unterschied hinsichtlich der Rheologie zwischen den zwei Chargen von HA (Produktnummern HG4003 und HG4001) beobachtet. Wie in 6 gezeigt, war die Viskoelastizität für die HG4003 Hyaluronsäure viel geringer als für die HG4001 Hyaluronsäure, wie durch die Frequenz angezeigt, bei der G' (offene Quadrate) und G'' (offene Rauten) einander schneiden. Insbesondere für die HG4003-Hyaluronsäure alleine betrug die Überschneidungsfrequenz etwa 10 Hertz (siehe 6), im Vergleich mit einer Überschneidungsfrequenz von etwa 5 Hertz für die HG4001-Hyaluronsäure (siehe 3). Der Grund für den Unterschied der viskoelastischen Eigenschaften dieser zwei Hyaluronsäuren könnte auf Verunreinigungen der HG4003-HA-Probe beruhen.
Die viskoelastischen Eigenschaften der HA wurden durch das Mischen der Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung mit HA nicht nachteilig beeinflusst. Tatsächlich waren der Speichermodul (G'; offener Kreis) und der Verlustmodul (G''; offenes Dreieck) für die Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung in HA signifikant höher als der Speichermodul (G'; offenes Quadrat) und der Verlustmodul (G''; offene Raute) für HA alleine (siehe 6). Die Überschneidungsfrequenz (die Frequenz, bei der sich G' und G'' schneiden) ist für die Liposomen/Cyclosporin A-Kombination in HA geringer als 1 Hertz, während die Überschneidungsfrequenz für HA alleine etwa 10 Hertz beträgt, was anzeigt, dass die HA/Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzungen signifikant viskoelastischer sind als HA alleine (siehe 6). Eine Erklärung für den erhöhten Speichermodul (G') und Verlustmodul (G'') besteht darin, dass die Liposomen die Stärke und Stabilität der HA-Gelzusammensetzung erhöhen.
Als nächstes wurde gezeigt, dass negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit HA verwendet werden können. Die in den Liposomen/HA-Gelzusammensetzungen verwendeten Liposomen, gezeigt und beschrieben im Hinblick auf die 7 und 8, wurden unter Verwendung einer konventionellen Filmtechnik hergestellt in HEPES-Puffer (mit 0,05 M und pH 7,4) suspendierte. Negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen, wurden, wie oben beschrieben, mit Natrium-Hyaluronsäure (Produktnr. HG4003) gemischt. Die Liposomen/HA-Gelzusammensetzungen wurden so hergestellt, dass die Gesamtlipidkonzentration, gemessen in Mol, konstant blieb. Der HEPES-Puffer wurde filtriert und entgast, um Sauerstoff zu entfernen und die Oxidation zu minimieren, wodurch der Abbau ungesättigter Lipide vermindert wird. Die Kontroll-HA-Gelzusammensetzung wies 2,5 Gewichts-% HA in HEPES-Puffer auf.
Die 7 und 8 sind Diagramme, die die Elastizität, gemessen als Speichermodul (G') gegen die Frequenz, für negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen in HA und für HA alleine, ebenfalls gegen die Frequenz, zeigen. 7 zeigt den anfänglichen Speichermodul (G') in Abhängigkeit mit der Frequenz für diese Liposomen/HA-Zusammensetzungen, und 8 zeigt den Speichermodul (G') für diese Liposomen/HA-Zusammensetzungen nach 72 Stunden. Die in den 7 und 8 dargestellten Zusammensetzungen waren vollständig hydratisiert. Für jede Liposomen/HA-Zusammensetzung lag der Speichermodul (G') 100–200% höher als der Speichermodul (G') für HA alleine. Wie in 7 und Tabelle 1 gezeigt, besaßen die positiv geladenen Liposomen in HA (offener Kreis) die höchsten Werte für den Speichermodul (G'), gefolgt von den negativ geladenen Liposomen (offenes Quadrat) und den neutralen Liposomen (offene Raute) in HA. Alle drei Liposomen/HA-Zusammensetzungen besaßen Speichermodule, die signifikant höher lagen als die Speichermodule für HA alleine (offenes Dreieck).
Tabelle 1 Auswirkung der Polarität und der Anwesenheit von Liposomen auf die Speichermodule (G') von HA
Wie in 8 und Tabelle 2 gezeigt, wurden nach 72 Stunden ähnliche Ergebnisse gefunden, mit der Ausnahme, dass der Speichermodul (G') für negativ geladene Liposomen (offenes Quadrat) in HA etwa dasselbe war wie der Speichermodul für positive Liposomen (offener Kreis) in HA. Der Speichermodul (G') für neutrale Liposomen (offene Raute) in HA war wiederum geringer als die Speichermodule (G') für die negativ und positiv geladenen Liposomen in HA. Nach 72 Stunden war das Niveau der Speichermodule (G') wie folgt:
Tabelle 2 Auswirkung der Polarität und der Anwesenheit von Liposomen auf die Speichermodule (G') von HA nach 72 Stunden
Es wurde außerdem gezeigt, dass negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen die Viskoelastizitätseigenschaften von Gelzusammensetzungen mit 2,5 Gewichts-% HA (Produktnr. HG4003) in Abwesenheit eines jeden medizinischen Stoffes nicht nachteilig beeinflussten. Die negativ geladenen, positiv geladenen und neutralen Liposomen/HA-Zusammensetzungen wurden einer dynamischer oszillatorischer Versuchung unterzogen, und die rheologischen Profile wurden mit denjenigen verglichen, die für eine Kontroll-Gelzusammensetzung mit 2,5 Gewichts-% HA in HEPES-Puffer erhalten wurden.
Tabelle 3 zeigt den mittleren Speichermodul (G') für positiv geladene, negativ geladene und neutrale Liposomen in HA und für HA alleine. Wie oben angezeigt, ist das Gel umso weniger stabil, je großer die Verminderung des mittleren Speichermoduls (G') ist. Die Speichermodule (G') wurden bei Frequenzen von 5–10 Hertz über einen Zeitraum von 72 Stunden beobachtet. Nach 72 Stunden waren die Veränderungen des mittleren Speichermoduls (G') für die positiv geladenen Liposomen (Änderung des mittleren G' = –13,0%) und die neutralen Liposomen (Änderung von G' = –8,9%) in HA großer als die Veränderungen des mittleren Speichermoduls (G') für negativ geladene Liposomen (Änderung des mittleren G' = –2,3%) in 2,5 Gewichts-% HA und für HA alleine (Änderung des mittleren G' = –1%). Diese Ergebnisse zeigen, dass die positiv geladenen und neutralen Liposomen in HA weniger stabil sind als die negativ geladenen Liposomen in HA und HA alleine waren. Die geringere Veränderung des mittleren Speichermoduls (G') für negativ geladene Liposomen in HA mag dafür verantwortlich sein, dass der Speichermodul (G') für negativ geladene Liposomen nach 72 Stunden höher ist als der Speichermodul (G') für positiv geladene Liposomen, wie es in 8 gezeigt ist.
Tabelle 3 sechs Proben pro Datenpunkt
Tabelle 4 zeigt die Überschneidungsfrequenzen für positiv geladene, negativ geladene und neutrale Liposomen im Gemisch mit HA und für HA alleine, zu Beginn und nach 72 Stunden. Wie oben angemerkt, ist eine Substanz umso viskoelastischer, je niedriger die Überschneidungsfrequenz der Substanz ist. Die Werte der Überschneidungsfrequenz für positiv geladene, negativ geladene und neutrale Liposomen in Gemischen mit HA waren signifikant niedriger als die Überschneidungsfrequenzen für HA alleine. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass die Gegenwart von Liposomen die Stärke und Stabilität der HA-Gelzusammensetzungen steigert. Negativ geladene Liposomen in HA zeigten jedoch die niedrigste Überschneidungsfrequenz aller untersuchten Liposomen.
Tabelle 4 sechs Proben pro Datenpunkt
Im alllgemeinen scheint es so zu sein, dass negativ geladene und positiv geladene Liposomen in HA die Stärke und Stabilität der HA-Gelzusammensetzung stärker erhöhen als neutrale Liposomen. Jedoch steigern im Vergleich zu HA alleine alle Arten von Liposomen die Elastizität von HA. Die Stabilität der HA-Gelzusammensetzung im Gemisch mit positiv geladenen und neutralen Liposomen stieg jedoch nach 72 Stunden geringfügig an, wie es durch die geringeren Überschneidungsfrequenzen angezeigt wird, wogegen die Stabilität negativ geladener Liposomen im Gemisch mit HA und von HA alleine nicht anstieg. Tabelle 4 zeigt, dass die Überschneidungsfrequenzen der negativ geladenen, positiv geladenen und neutralen Liposomen in HA signifikant niedriger waren als die Überschneidungsfrequenzen von HA alleine, sowohl zu Anfang als auch nach 72 Stunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass negativ geladene, positiv geladene und neutrale Liposomen in HA-Gelzusammensetzungen signifikant viskoelastischer und daher stabiler waren als HA-Gelzusammensetzungen alleine.
Antioxidantien-Aktivität von Hyaluronan (HA)
Liposomen bestehen aus Phospholipiden, die leicht oxidiert werden. Dieser Oxidationsprozess resultiert in einer Verminderung der Haltbarkeit der Liposomen-Zubereitungen. Es wird angenommen, dass HA die Oxidationsrate von Phospholipiden vermindern kann, da HA auch als Fänger freier Radikale beschrieben wurde (Presti, D. & Scott, J. E., Cell Biochem. Function, 12 281–288 (1994)). Der Oxidationsprozess umfaßt eine anfängliche Konjugation von Doppelbindungen, wonach sich dann zyklische Peroxide und Hydroperoxide bilden können. Diese Peroxide können dann weiter in Aldehyde und Fettsäuren zerfallen.
Kein einzelner Test ermöglicht die absolute Quantifizierung der Oxidation von Phospholipiden, jedoch wird die Messung des Mengenniveaus zyklischer Peroxide in der Formulierung einen Anhaltspunkt für den oxidativen Zustand der Phospholipide geben. Dieser Test kann verwendet werden, um einen Vergleich zwischen der Wirksamkeit verschiedener Antioxidantien zu erlauben. Die Bildung des Phospholipid-Oxidationsprodukts, zyklischem Peroxid, in der CYCLOPS-Formulierung (Liposomen und HA), über eine Zeitspanne von 28 Tagen, wurde mit der Menge verglichen, die in Liposomen alleine oder in Liposomen enthaltend das Antioxidans α-Tocopherylacetat, gefunden wurde. Die Ergebnisse dieser vergleichenden Tests sind in 9 dargestellt.
Liposomen enthaltend Ei-Phosphatidylcholin wurden durch Rotationsverdampfung hergestellt und mit HEPES-Puffer (pH 7,4) hydratisiert. Die Liposomen-Formulierung enthielt entweder kein Antioxidans oder α-Tocopherylacetat mit 1 Gewichts-% des Gesamtlipids, oder HA mit 2,5 Gewichts-% der gesamten Formulierung. Die Bildung des Lipid-Oxidationsprodukts, zyklischem Peroxid, wurde untersucht, indem Proben der Formulierung in Gegenwart von Thiobarbitursäure für 15 Minuten auf 100°C erhitzt wurden. Der Test wurde einen Tag nach der Herstellung der Liposomen und über einen Zeitraum von 28 Tagen durchgeführt, und die Formulierungen wurden unter Stickstoff bei 4°C gelagert.
Diese Versuche zeigten, dass die mit α-Tocopherylacetat formulierten Liposomen nach einem Tag signifikant weniger zyklisches Peroxid enthielten als die CYCLOPS-Formulierung und die Liposomen-Formulierung, die kein Antioxidans enthielt (9). Wenn jedoch nach 7 Tagen getestet wurde, war die Menge an zyklischem Peroxid sowohl bei CYCLOPS als auch bei den Liposomen, die α-Tocopherylacetat enthielten, im Vergleich zu den Liposomen alleine signifikant vermindert. Nach 7, 11, 14 und 28 Tagen gab es keinen signifikanten, erkennbaren Unterschied zwischen der Menge an zyklischen Peroxiden in der Formulierung mit α-Tocopherylacetat und in der CYCLOPS-Formulierung.
HA führte im Vergleich zu Liposomen, die kein HA oder kein bekanntes Antioxidans enthielten zu einer signifikanten (p < 0,05) Verminderung der Menge an gebildetem zyklischem Peroxid. Die Antioxidantien-Aktivität von HA zeigte keinen statistischen Unterschied (p > 0,05) zu dem unbekannten Antioxidans α-Tocopherylacetat.
Kryokonseivierende Eigenschaften von HA
Ein Verfahren zur Verlängerung der Haltbarkeit von Liposomenformulierungen kann darin bestehen, den Formulierungen durch Gefriertrocknung Wasser zu entziehen.
Kryokonservierungsstoffe, wie etwa das Polysaccharid Trehalose, können in die Formulierung einbezogen werden, um die Liposomen vor einer Beschädigung während des Gefriertrocknungsprozesses zu schützen. Man nimmt an, dass HA als Kryokonservierungsstoff wirken kann und die Stabilität der gefriergetrockneten Liposomen erhöht.
Liposomen wurden durch das konventionelle Filmverfahren hergestellt und dazu verwendet, HA zu hydratisieren, um ein Gel mit 2,5 Gewichts-% zu erhalten. Vor der Gefriertrocknung wurden elektronenmikroskopische Gefrierbruchaufnahmen der Formulierungen unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (EM301 G, Philips electron optics, Cambridge, UK) aufgenommen. Eine Probe der Formulierung wurde dann über Nacht gefriergetrocknet und im nachfolgend für eine Woche bei 4°C unter Stickstoff gelagert. Die Probe wurde dann mit der erforderlichen Menge an Wasser rehydratisiert, wonach elektronenmikroskopische Gefrierbruchbilder aufgenommen wurden. Zusätzlich wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) der rehydratisierten Formulierung durchgeführt. Eine 500 mg Probe der Formulierung wurde unter Argon getrocknet und in 100 μl einer 2 : 1 (v/v) Chloroform : Methanol-Lösung wiederhergestellt, um eine Konzentration von 55 mg/ml an Phospholipid zu erhalten. Ein Aliquot von 10 μl wurde auf eine TLC-Platte getupft, wobei Aliquots (10 μl) von Lysophosphatidylcholin (LPC)-Standards einbezogen wurden. Man ließ die Platte mit einer mobilen Phase aus 65 : 35 : 2,5 : 2,5 (v/v) Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid : Wasser laufen, wonach die Platte mit einer 50 : 50 (v/v)-Lösung von Molybdänblau-Spray (Sigma, Dorset, UK) : 4,2 M Schwefelsäure besprüht wurde, um die Lipide sichtbar zu machen.
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen, abgebildet in den 10 & 11, aufgenommen bei einer 8.650-fachen bzw. 14.400-fachen Vergrößerung, zeigen, dass vor der Gefriertrocknung Liposomen in der Formulierung vorlagen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen der rehydratisierten Formulierung, abgebildet in den 12 & 13 und aufgenommen bei 15.350-facher, bzw. 9.230-facher Vergrößerung, zeigen, dass nach Durchlaufen des Gefriertrocknungsprozesses und einer Woche Lagerung als gefriergetrocknetes Pulver die Liposomen noch immer vorlagen. LPC ist ein Produkt der spontanen Hydrolyse von Phosphatidylcholin und kann als Maß der Integrität des Phospholipids verwendet werden. Es wurden keine Spots, die LPC entsprachen, beobachtet, wenn für die mittels elektronenmikroskopischer Bilder untersuchten Formulierungen eine Prüfung mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) vor und nach der Gefriertrocknung durchgeführt wurde (Nachweisgrenze der LPC-Detektion ist 0,05 mg/ml).
Es wird angenommen, dass HA in der Formulierung als Kryokonservierungsstoff wirkt, da Liposomen schnell gebildet wurden, wenn die CYCLOPS-Formulierung nach einer Woche der Lagerung als Pulver rehydratisiert wurde. Bei dem Gefriertrocknungsprozess wurden weniger als 0,1% der Phospholipide zu LPC hydrolysiert. Nichtsdestoweniger mag es sein, dass die Auswirkungen der HA auf die Langzeitstabilität der gefriergetrockneten Formulierung nur durch die Überprüfung über einen längeren Zeitraum bestimmt werden können.
Verteilung von Cyclosporin A in der Haut
In früherer Zeit waren klinische Studien zu topischen Cyclosporin A-Formulierungen therapeutisch nicht erfolgreich (Bousema et al., J. Am. Acad. Dermatol., 22, 126–27 Brief Communication (1990)). Dennoch ist für die Formulierungen von Arzneimitteln in Liposomen gezeigt worden, dass diese die Verteilung der Arzneimittel innerhalb der Epidermis verstärken (Egbaria et al., Skin Pharmacol., 4, 21–28 (1991)). Es ist außerdem für HA gezeigt worden, dass diese die Arzneimittelverteilung in der Haut verstärkt, sodass z. B. erhöhte Mengen an Diclofenac in der Haut gefunden wurden, wenn HA in diese Formulierungen einbezogen wurde (Brown et al., Int. J. Tissue React., XVII, 133–140 (1995)). Daher gehen wir davon aus, dass die Kombination von Liposomen und HA zusammen die Menge an in der Haut gefundenem Cyclosporin A erhöht.
Ausgeschnittene humane Haut wurde in Franz-Zellen befestigt, und 250 μl entweder von Liposomen von oder der CYCLOPS-Formulierung enthaltend radioaktives Cyclosporin A wurden auf die Oberfläche der Haut appliziert. Nach einer Inkubationsphase von 48 Stunden wurde die Formulierung von der Haut gewaschen und der Pfropfen der CYCLOPS-Formulierung, der sich auf der Hautoberfläche gebildet hatte, wurde unter Verwendung eines Scotch Magic Tape (810, 3 M) entfernt.
Die Epidermis und die Dermis wurden anschließend getrennt, indem der Hautabschnitt in ein Plastiksäckchen eingebracht und dort für 60 Sekunden bei 70°C in Wasser eingetaucht wurde. Nach der Trennung wurden die Epidermis und die Dermis über Nacht in Soluen solubilisiert, und ein Aliquot wurde entnommen und zu einem Szintillationsgemisch (Ultima Gold, Beckmann) hinzugegeben. Die radioaktiven Impulse wurden als Prozentanteil der eingesetzten Impulse berechnet.
Sowohl die Liposomen als auch die CYCLOPS-Formulierung führten zu einer Einlagerung von Cyclosporin A innerhalb der Epidermis in Höhe von etwa 3% der gesamten, auf die Hautoberfläche applizierten Radioaktivität. Diese Ergebnisse sind in 14 dargestellt, in der die vergleichenden, prozentualen Radioaktivitäten für die CYCLOPS-Formulierung (mit 2,5 Gewichts-% Hyaluronan) und die Liposomen-Formulierung (ohne Hyaluronan) in der Epidermis und der Dermis der Haut nach 48 Stunden gezeigt werden. Bei der Verwendung der CYCLOPS-Formulierung wurde eine höhere Menge an Cyclosporin A in der Haut abgelagert als mit der Liposomen-Formulierung alleine, jedoch war dieser Anstieg bei der Anzahl der untersuchten Hautabschnitte (n = 3) nicht signifikant (p > 0,05). Die Menge an Cyclosporin A in der Dermis war gering, und es wurde kein Cyclosporin A in der Aufnahmekammer der Franz-Zelle detektiert.
Der Prozentsatz an Cyclosporin A in der Epidermis lag auf einem Niveau, das bei der Behandlung der Erkrankung Psoriasis einen therapeutischen Effekt haben würde. Daher gehen wir davon aus, dass die CYCLOPS-Formulierung ein Potential als neue topische Formulierung von Cyclosporin A besitzt.
Die obigen Beispiele und Versuche zeigen auch, dass Cyclosporin A erfolgreich mit HA-Gelzusammensetzungen gemischt werden kann, indem Cyclosporin A zuerst in Liposomen eingeschlossen, und die Liposomen/Cyclosporin A-Zusammensetzung anschließend mit HA gemischt wird. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Anwesenheit von Liposomen in HA die viskoelastische Natur von HA nicht beeinträchtigt. Die Ergebnisse zeigen sogar, dass die Liposomen die Viskoelastizität von HA-Gelen verstärken. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass Liposomen die hydrophoben Bindungen der HA-Gelzusammensetzung zwischen den Ketten und innerhalb der Ketten des HA-Gels erhöhen. Hyaluronsäure wiederum stabilisiert die Liposomen und schützt sie vor dem Zerfall, wodurch eines der Hauptprobleme im Zusammenhang mit der Arzneimittelzufuhr über Liposomen überwunden wird. Somit sind die HA/Liposomen-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung ideal geeignet für die topische und nicht-topische Zufuhr von CsA.
Pharmazeutische Hyaluronsäure/Liposomen-Zusammensetzungen enthaltend therapeutisch wirksame Mengen von Cyclosporin A gemäß der vorliegenden Erfindung können auch bei Tieren sicher und effektiv appliziert werden. So kann z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung mit 2,5 Gewichts-% Hyaluronsäure, 13,2 Gewichts-% Liposomen mit 13,5 Milligramm darin eingeschlossenem Cyclosporin A pro Gramm Liposomen auf die Oberfäche eines inneren oder äußeren Organs oder Gewebes einschließlich der Haut eines Tieres in einer therapeutisch wirksamen Menge topisch appliziert werden, um einen beliebigen Krankheitszustand an oder nahe dieser Oberfläche zu behandeln, bei dem nicht-systemisch zugeführtes Cyclosporin A pharmakologisch wirksam ist.
Pharmazeutische HA/Liposomen-Zusammensetzungen, die therapeutisch wirksame Mengen an Arzneimitteln enthalten, sind jedoch nicht auf topische Anwendungen beschränkt. Vielmehr können sie tierischen Organismen einschließlich des Menschen oral, parenteral oder intrarektal in Dosismengen verabreicht werden, die im wesentlichen vollständig durch die wirksame Dosis des pharmazeutischen Bestandteils bestimmt werden, mit dem das Liposomen/HA-Trägersystem kombiniert wird, da das Trägersystem selbst nicht toxisch ist. Die Menge an verwendetem Liposomen/HA-Träger kann leicht durch Fachleute bestimmt werden, wobei andere zielgerichtete Transport-Systeme als Modell verwendet werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend: ein Gemisch von Hyaluronsäure und Liposomen mit in den Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A, das für die topische Anwendung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Liposom multilamellar ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10.000 bis 1.000.000 Dalton besitzt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen negativ geladen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen einen durchschnittlichen maximalen Durchmesser im Bereich von 80 bis 1040 Nanometern aufweisen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen einen durchschnittlichen maximalen Durchmesser im Bereich von 200 bis 900 Nanometern besitzen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung 13,2 Gewichts-% an Liposomen, 2,5% Hyaluronsäure und 13,5 Milligramm Cyclosporin A pro Gramm Liposomen enthält.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Hyaluronsäure und Liposomen, wobei dieses Verfahren umfasst: Herstellen von Liposomen aus Phospholipiden in Anwesenheit von Cyclosporin A; Mischen dieser Liposomen mit Hyaluronsäure.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung 13,2 Gewichts-% Liposomen, 2,5 Gewichts-% Hyaluronsäure und 13,5 Milligramm Cyclosporin A pro Gramm Liposomen enthält.
Gemisch aus Hyaluronsäure und Liposomen mit in den Liposomen eingeschlossenem Cyclosporin A zur Verwendung bei der Behandlung der Psoriasis.
Verwendung von Cyclosporin A und Phospholipiden bei der Herstellung von Liposomen und anschließendem Mischen der Cyclosporin A einschließenden Liposomen, die mit Hyaluronsäure, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Psoriasis.