DE60127140T2

DE60127140T2 - Amphotericin b enthaltende strukturierte emulsion

Info

Publication number: DE60127140T2
Application number: DE60127140T
Authority: DE
Inventors: Srikanth A. Bharat Serum PAI; Shilpa S. A/204 Kopri KOCHAREKAR; Sangeeta H. Bharat Serum RIVANKAR
Original assignee: Bharat Serums and Vaccines Ltd
Current assignee: Bharat Serums and Vaccines Ltd
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2021-06-20
Also published as: EP1313449B1; WO2001097778A2; ZA200300330B; AU8008401A; US20030206929A1; IN188843B; DE60127140D1; US7053061B2; EP1313449A2; AU2001280084B2; WO2001097778A3; CN1447682A; ES2283423T3; JP4804702B2; ATE355825T1; KR20030039331A; RU2275899C2; WO2001097778A8; KR100812764B1; CN100502834C

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand dieser Erfindung ist eine Amphotericin-B-Zusammensetzung mit geringer Toxizität. Gegenstand dieser Erfindung ist insbesondere eine Amphotericin-B-Zusammensetzung mit geringer Toxizität in einer strukturierten Emulsion von Öl-in-Wasser-Art zur parenteralen Verabreichung.
Hintergrund der Erfindung:
Amphotericin B ist ein makrocyclisches, Polyen-Antibiotikum, das von Streptomycetes nodosus produziert wird. Es ist gegen eine große Vielfalt von Pilzen, Hefen und einigen Protozoen wirksam.
Amphotericin B zur intravenösen Verabreichung war ursprünglich in einer konventionellen kolloiden Form erhältlich. Selbst heute, etwa 35 Jahre nach seiner Entwicklung, ist es aufgrund seiner zuverlässigen therapeutischen Wirksamkeit als ein bedeutendes Antimykotikum weit verbreitet. Die Verträglichkeit des Arzneimittels ist angesichts etlicher negativer Auswirkungen, von denen bei klinischer Anwendung berichtet wurde, gering. Nephrotoxizität tritt in fast allen Patienten auf, die konventionelles Amphotericin B intravenös erhalten. Die anderen negativen Auswirkungen schließen Hypertonie, Hypotonie, Herzrhythmusstörung, einschließlich Kammerflimmern, Herzstillstand, Leberstörungen ein. Es tritt sowohl ein tubulärer als auch ein glomerulärer Schaden auf und es besteht ein Risiko eines dauerhaften Schadens der Nierenfunktion. Lösungen von Amphotericin B reizen das venöse Endothel und können aufgrund des synthetischen oberflächenaktiven Stoffs Natriumdeoxycholat, das in der Zubereitung zur Solubilisierung von Amphotericin B verwendet wird, Schmerz und Thrombophlebitis an der Injektionsstelle verursachen.
Um die toxischen Wirkungen zu verringern, wurde Amphotericin B in verschiedenen Arzneimittelabgabesystemen formuliert, wie zum Beispiel Lipidkomplex, Liposomen und Emulsion. Diese Zusammensetzungen haben eine größere Wirksamkeit, weisen sogar eine geringere Toxizität im Vergleich zum Arzneimittel, wenn es in freier Form verwendet wird, auf. Sowohl der Lipidkomplex als auch liposomale Formulierungen von Amphotericin B sind nun auf dem Markt erhältlich und sind in verschiedenen Ländern weltweit zugelassen.
Der Hauptnachteil von Lipidformulierungen, die auf Lipidkomplex und Liposomen basieren, sind die hohen Therapiekosten. Amphotericin B ist ein lipophiles Arzneimittel, das zu Sterinen bindet und sich in Lipiddoppelschichten einschiebt und daher ist Amphotericin B besonders zur Verwendung mit den lipidbasierten Abgabesystemen geeignet.
Es wurde in diesem Labor ein Versuch zur Formulierung von Amphotericin B in Form einer lipidbasierten Emulsion unternommen, die den Vorteil von geringer Toxizität bei niedrigeren Therapiekosten haben.
Volker Heinemann et al. haben postuliert [Antimicrobial agents and chemotherapy 1997, 41(4); 728-732], dass die Lipidemulsionen die Menge von oligomerem Amphotericin B herabsetzen und dadurch die Wechselwirkung von Amphotericin B mit Cholesterin von menschlichen Zellmembranen verringern. Das verbleibende monomere Amphotericin B behält jedoch sein Potenzial zur Bindung zu Ergosterin von fungalen Zellmembranen bei.
Kirsh R., Goldstein R., Tarloff J. und et al. haben berichtet (J. Infect. Dis. 1988, 158; 1065-1070), dass die Lipidemulsionszusammensetzung von Amphotericin B, die durch Mischen mit Fettemulsion hergestellt wurde, geringe Toxizität ohne Verlust von antifungaler Aktivität aufweist. Jedoch wurde gefunden, dass die physikalische Stabilität einer derartigen Lipidemulsion, die Amphotericin B enthält, schlecht ist.
Moreau P. et al. haben berichtet (J. Antimicro. Chemother. 1992, 30; 535-541), dass Patienten, die mit Fettemulsionsinjektion, die mit Amphotericin B gemischt war, behandelt wurden, eine bedeutende Verringerung von infusionsbezogener Toxizität und Nierenfunktionsstörung zu zeigen schienen.
Die Verwendung von Amphotericin B, das mit Fettemulsion von parenteraler Ernährung gemischt ist, nimmt sowohl in Europa als auch in den Vereinigten Staaten zu.
Die Verfahren des Stands der Technik zur Herstellung von Amphotericin-B-Emulsion werden nachstehend diskutiert:
US-Patent 5364632 (1994)/Japanisches Patent JP 2290809 (1990)
Das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Emulsion wird in einem typischen Beispiel folgendermaßen beschrieben:
Amphotericin B wurde in Methanol (0,8 mg/ml) im Ultraschallbad (15 min) gelöst. Phospholipide E-80 (enthalten hauptsächlich 80% Phosphatidylcholin und 8% Phosphatidylethanolamin) wurden in Chloroform gelöst. Beide Lösungen wurden gemischt und durch ein kombiniertes Filtersystem, das einen Glasfaser-Vorfilter und einen regenerierten Cellulose-Membranfilter von 0,45 μ (RC 5) (GF92) umfasst, zur Entfernung von Pyrogenen und Aggregaten gefiltert. Die entstehende klare Lipidlösung wurde als dünner Film an den Wänden eines Rundkolbens durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck bei 40°C abgeschieden. Die wässrige Phase, die das Poloxamer, Natriumdeoxycholat und Glycerin umfasst, wurde durch einen Millipore-Filter von 0,22 μ gefiltert, in das Gefäß gegossen und die Dispersion wurde mit Ultraschall behandelt, bis eine homogene liposomale Mischung erhalten wurde.
MCT (mittelkettige Triglyceride)-Öl, das durch einen Millipore-Filter von 0,22 μ gefiltert war und α-Tocopherol enthielt, wurde auf 70°C erhitzt und dann in der liposomalen Mischung, die auf 45°C erhitzt war, vermischt und darin durch einen Magnetrührer dispergiert.
Während die Emulgierung ausgeführt wurde, wurde die gleiche Temperatur unter Verwendung eines Mischers mit hoher Scherung, Polytron, aufrechterhalten. Die entstehende grobe Emulsion wurde rasch abgekühlt. Eine feine monodispergierte Emulsion wurde unter Verwendung eines zweistufigen Homogenisators erhalten.
Schließlich wurde der pH der Emulsion eingestellt und es wurde durch einen Millipore-Filter von 0,45 μ gefiltert, um grobe Tröpfchen und Ablagerungen, die während des Emulgierungs- und Homogenisierungsverfahrens erzeugt wurden, zu entfernen.
Alle Verfahrensvorgänge wurden unter sterilen Bedingungen ausgeführt.
Die relativen Mengen der verschiedenen Bestandteile in den endgültigen Emulsionen in dem Beispiel und der Bereich, der in der Beschreibung angegeben ist, sind folgendermaßen:
Amphotericin B 0,075% (0,015-0,15%), MCT-Öl 20% (3-50%), Phospholipid E80 0,5% (0,5-20%), Poloxamer 2% (0,3-10%), Natriumdeoxycholat 1% (0,5-5%), Glycerin 2,25%, α-Tocopherol 0,02% und bidestilliertes Wasser 200%.
Die Nachteile des Verfahrens vom US-Patent 5364632 (1994)/Japanischen Patent JP 2290809 (1990) sind:

i. Da die Löslichkeit von Amphotericin B in Methanol niedrig ist, ist eine große Menge von Methanol erforderlich, um die erforderliche Menge von Amphotericin B zu lösen. Dies beschränkt die Höhe des Arzneimittels in der endgültigen Zusammensetzung.
ii. In diesem Verfahren ist es notwendig, zuerst einen dünnen Film des Arzneimittels, Amphotericin 8 und Phospholipide, zu bilden und dann diesen Film unter Verwendung der wässrigen Phase zu hydratisieren. Die wässrige Phase enthält nichtionisches Emulgierungsmittel Polaxamer, oberflächenaktiven Stoff Natriumdeoxycholat und Glycerin.
iii. Die verwendete Ölphase ist MCT-Öl mit zugesetztem α-Tocopherol. Die Emulsion wird durch Zugabe der öligen Phase, die bei 70°C gehalten wurde, zur wässrigen Phase, die bei 45°C gehalten wurde, hergestellt. Dies gewährleistet nicht, dass das Amphotericin B in der Ölphase gehalten wird. Dieses Verfahren schöpft nicht das volle Potenzial zur Verringerung der Toxizität von Amphotericin B aus, wenn es in der öligen Phase vorliegen würde.
iv. Das Produkt des Verfahrens von US-Patent 5364632 (1994) wird unter sterilen Bedingungen hergestellt, um es steril zu erhalten. Das bevorzugte Verfahren der Sterilisation, das in Arzneibüchern beschrieben ist, ist Autoklavieren des Produkts im Endbehälter. Weiterhin ist terminale Sterilisation die einzige bevorzugte Alternative, die höheres Vertrauen zur Sterilitätseinhaltung bietet, da Amphotericin B gewöhnlich auf intravenösem Weg verabreicht wird.
v. Obgleich das Emulsionsprodukt gegenüber mechanischer Beanspruchung stabil ist, wurde die Toxizität nicht untersucht. Daher ist die Toxizität des Produkts unbekannt. Jedoch wurden in-vivo-Vergleichsstudien in Balb/c-Mäusen zum Vergleich mit Fungizon, das eine kommerzielle Amphotericin-B-Formulierung ist, die Natriumdeoxycholat enthält, unternommen. Diese Studie zeigte, dass das Produkt weniger toxisch als Fungizon ist. Die Verwendung von MCT-Öl und des Poloxamers erhöht die Plasmakonzentration des Arzneimittels durch Verringerung der Aufnahme des Arzneimittels durch das retikuloendotheliale System (RES). Im Fall von Pilzinfektionen ist es erforderlich, dass Amphotericin B im retikuloendothelialen System, die die Infektionsstelle darstellt, verteilt wird.

Japanisches Patent 11-60491 (1989)
In diesem japanischen Patent wurde eine medizinische Formulierung, die Amphotericin B in der Emulsionsform enthält, beschrieben. Die Emulsion enthält

i) Amphotericin B (1 bis 10 mg/ml der endgültigen Emulsion).
ii) die ölige Phase – Die ölige Phase besteht aus Pflanzenölen, Fischöl oder Triglyceriden (1-50%, bevorzugt 5-30%). Das bevorzugte verwendete Öl ist Sojaöl oder Sesamöl.
iii) Emulgatoren – Der verwendete Emulgator sind Phospholipide. Zusätzlich werden auch nicht-toxische Emulgatoren eingesetzt. Verwendete Phospholipide sind zum Beispiel Eigelbphospholipide, Sojabohnenphospholipide oder hydriertes Produkt, das aus diesen Stoffen erhalten wird. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylglycerol wurden auch verwendet. Die empfohlene Menge ist 1-50 Gewichts-% der Ölkomponente, bevorzugt 10-30 Gewichts-% der Ölkomponente oder 1-10% w/v, bevorzugt 4-6% w/v der Emulsion. Nichtionische Emulgatoren, wie zum Beispiel Polyalkylenglycol (Mol.-gew. 1000-10000, bevorzugt 4000-6000) oder Polyoxyethylen- oder Polyoxypropylenpolymer (Mol.-gew. 1000-20000, bevorzugt 2000-10000), hydrierte Castoröl-Polyoxyalkylen-Derivate, wie zum Beispiel hydrierte Castoröl-Polyoxyethylen-20-ether, -40-ether, 100-ether, mit weniger als 5% w/v, bevorzugt weniger als 1% w/v, werden eingesetzt. Eine Kombination der zwei nichtionischen Emulgatoren kann auch verwendet werden.
iv) Fettsäuren und ihre Salze (pharmazeutisch verträglich) – bis zu 1%, bevorzugt 0,5% w/v.
v) Stabilisierungsmittel – weniger als 5% w/v, bevorzugt weniger als 1% w/v, die Folgende einschließen: a) Polymersubstanzen mit hohem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Albumin menschlichen Ursprungs; Vinylcopolymer, z.B. Polyvinylpyrolidon, Polyvinylalkohol; aliphatische Amine. b) Gelatine, Hydroxyethylstärke; Cholesterin-Varianten;
vi) Isotonische Stoffe – weniger als 5% w/v, bevorzugt weniger als 1% w/v.
vii) Glycerin oder seine Monoester, wie Monoolein-, Monopalmitin-;
viii) Saccharide, wie zum Beispiel Mono- und Disaccharide, Sorbitol, Xylitol, mit weniger als 5% w/v, bevorzugt weniger als 1% w/v.
ix) Antioxidationsmittel, wie zum Beispiel Tocopherol, mit weniger als 5% w/v, bevorzugt weniger als 1% w/v;
x) pH-regulierende Mittel, wie zum Beispiel Säuren, Alkalien und Puffer.

Das Herstellungsverfahren, dem gefolgt wurde, entsprach dem in der Vergangenheit Berichteten. Dieses Verfahren schließt zuerst die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion (w/o) und dann die Umwandlung dieser in eine Öl-in-Wasser-Emulsion (o/w) durch Verdünnung mit Wasser ein. In diesem Verfahren werden Sojaöl, Phospholipid, Amphotericin B und etwas Wasser sowie andere Additive (wann immer verwendet) alle zusammengemischt und erhitzt, falls erforderlich. Die Mischung wird dann in einem Hochdruckhomogenisator homogenisiert. Es wird mehr Wasser in der erforderlichen Menge zugegeben, um die w/o-Emulsion in eine o/w-Emulsion umzuwandeln, die wieder homogenisiert wird.
In einem typischen Beispiel werden 200 g Sojaöl, 50 g Phospholipid und 2,5 g Amphotericin B und 750 ml Wasser wie vorstehend verarbeitet.
In einem weiteren Beispiel wurde Glycerin 2,2% w/v der Zusammensetzung in die vorstehende Zusammensetzung eingeschlossen.
Die durchschnittliche Tröpfchengröße der Emulsion beträgt von 0,1-0,2 μ. Die Emulsion und ihre Tröpfchengröße ist bis zu 10 Tagen unter Kühlungsbedingungen stabil.
Nachteile dieses Verfahrens vom Japanischen Patent 11-60491 (1989) sind:
Es ist bekannt, dass Amphotericin B in Emulsionsformulierung weniger toxisch ist als die konventionelle Amphotericin-B-Formulierung. Jedoch schöpfen die Formulierungen dieses Japanischen Patents 11-60491 (1989) nicht das volle Potenzial zur Verringerung der Toxizität, das diesem Emulsionskonzept verfügbar ist, aufgrund des Herstellungsverfahrens der Emulsion, dem in diesem Patent gefolgt wurde, aus.

i. Da die mittlere Partikelgröße der in dem Japanischen Patent 11-60491 (1989) erhaltenen Emulsion von 0,1 bis 0,2 μ beträgt, ist es nicht in der Lage, den bekannten Vorteil der bevorzugten Aufnahme von Partikeln, die eine größere Größe aufweisen, durch das retikuloendotheliale System auszunutzen. Die bevorzugte Aufnahme von Amphotericin B durch das retikuloendotheliale System ist erforderlich, da dies die Stelle für die meisten der Pilzinfektionen ist.
ii. Die Stabilität der Emulsion wird bis zu 10 Tage im Kühlschrank untersucht.
iii. Eine große Anzahl von Additiven, die die Emulgierung unterstützenden Mittel, wie zum Beispiel aliphatische Amine, Polymere mit großem Molekulargewicht, nichtionische natürliche oberflächenaktive Stoffe, Cholesterin-Varianten, Saccharide, wie zum Beispiel Mono- und Disaccharide, Antioxidationsmittel, einschließen, werden zur Zugabe in der Emulsionsformulierung vorgeschlagen.
iv. Der Verfahrensschritt der Sterilisation des Produkts wurde nicht beschrieben.

Im Japanischen Patent 4-173736 (1992) wurde ein Produkt beschrieben, das 0,005% bis 5% Amphotericin B, 0,5% bis 25% Phospholipid, bevorzugt Eilecithin, enthält. Die Zusammensetzung hat einen durchschnittlichen Partikelgrößendurchmesser von 100 nm. Dies ist keine Emulsion und enthält keine ölige Phase.
Im US-Patent 5389373 (1995) ist ein Herstellungsverfahren einer Öl-in-Wasser (o/w)-Emulsion von schlecht löslichen Arzneimitteln beschrieben. Das Verfahren schließt das Auflösen von Amphotericin B in wässriger Lösung von hohem oder niedrigem pH, die Zugabe der entstehenden Lösung von einer Stärke von nicht mehr als 100 μg/ml zu einer vorgebildeten Emulsion, die Zugabe einer Menge von Säure, Base oder Puffer, die zur Neutralisation und Einstellung des pH des Produkts auf einen gewünschten Wert geeignet ist, zur Emulsion ein.
Nachteile dieses Verfahrens vom US-Patent 5389373 (1995) sind:
Die Hauptschwäche dieses Verfahrens ist die Begrenzung der niedrigen Stärke von Amphotericin B in der Emulsion. In diesem Verfahren liegt die Konzentration von Amphotericin B in der Größenordnung von 100 μg/ml. Daher ist ein größeres Volumen der Zusammensetzung zur Injektion erforderlich, was therapeutisch nicht vorteilhaft ist.
Im US-Patent 5534502 (1996) wird Amphotericin B unter Verwendung einer Säure und von Ethanol dekristallisiert und dann homogen in einem Lipid dispergiert, wonach es emulgiert wird. In diesem Verfahren ist es notwendig, Amphotericin B in Ethanol zu lösen, die bevorzugteste Menge von Ethanol ist 400 bis 600 ml/Gramm Amphotericin B. Die Hauptschwäche dieses Verfahren ist, dass Amphatericin B in saurem pH nicht stabil ist.
Das Europäische Patent EP 0700678 (1996) beschreibt eine Lipidemulsion, die im Wesentlichen Citronensäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und mindestens ein Mitglied, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methionin, Phenylalanin, Serin, Histidin und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon besteht, enthält, vorausgesetzt, dass sie nicht gleichzeitig Methionin und Phenylalanin enthält.
Es ist ein wesentliches Erfordernis, gleichzeitig Citronensäure und mindestens eine der vorstehenden Aminosäuren zu verwenden. Das Herstellungsverfahren einer erfindungsgemäßen Emulsion wird folgendermaßen beschrieben:
Phospholipide und Hilfsmittel zur Emulgierung, wie zum Beispiel Ölsäure, werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Hexan, gelöst und dann wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abdestilliert, um einen Lipidfilm zu erhalten. Zum entstehenden Lipidfilm die Ölkomponente und Wasser [lacuna] und die Mischung wird vorübergehend durch heftiges Rühren durch Schütteln emulgiert. Die entstehende Flüssigkeit wird unter Verwendung des gegenwärtig verwendeten Emulgators emulgiert. Nach vollständiger Emulgierung wird der pH-Wert der entstehenden Emulsion durch Zugabe von Salzsäure oder Natriumhydroxid auf eine vorbestimmte Höhe eingestellt. Dann werden Citronensäure und Aminosäure zur Emulsion gegeben, um eine Lipidemulsion zu erhalten. Alternativ kann die Lipidemulsion gleichermaßen durch Zugabe einer Ölkomponente und einer wässrigen Lösung von Citronensäure und Aminosäuren zum Lipidfilm, der durch die vorangehenden Methoden hergestellt wurde, und dann Unterziehen der entstehenden Mischung den Emulgierungsmethoden hergestellt werden.
Nachteile dieses Verfahrens vom Europäischen Patent EP 0700678 (1996) sind:
Das Herstellungsverfahren von Amphotericin-B-Emulsion wurde nicht speziell beschrieben. Amphotericin B ist eines der Arzneimittel von einer Liste von etwa 70 Arzneimitteln, die als „kann in Lipidemulsion formuliert werden" ausgeführt ist.

i) Das Herstellungsverfahren von Lipidemulsionen schließt die Auflösung von Phospholipiden in geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Hexan, ein.
ii) In den Beispielen dieses Patents werden Aminosäuren und Citronensäure zu den vorgebildeten Lipidemulsionen gegeben und die Stabilität bei 60°C hinsichtlich Verfärbung untersucht. Es ist erforderlich, dass intravenöse Emulsionen gegenüber Sterilisationstemperaturen vom Autoklavieren stabil sind.
iii) Das Verfahren der Sterilisation, das in einem der Beispiele beschrieben ist, ist Erhitzen bei 60°C für 1 Stunde und die dreimalige Wiederholung dieses Sterilisationsverfahrens alle 24 Stunden. Dieses Verfahren ist nicht zur Herstellung von intravenösen Injektionen geeignet.

Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens für Amphotericin-B-Emulsion, die für parenterale Verabreichung verwendbar ist, sehr geringe Toxizität aufweist, und die Überwindung der Nachteile und Schwächen der einzeln benannten, vorstehenden Verfahren des Stands der Technik.
Somit ist der Hauptteil des Hauptziels die Entwicklung eines Verfahrens zum Beschichten von festem Pulver von Amphotericin B mit Öl und Einbringen des ölbeschichteten festen Amphotericin-B-Pulvers in die ölige Phase der Öl-in-Wasser-Emulsion, mit dem Vorbehalt, dass Amphotericins B im gesamten Herstellungsverfahren, einschließlich des Autoklavierungsverfahrens der Sterilisation, und danach, bis zu seiner Haltbarkeitsdauer oder Verwendung, in der öligen Phase der Emulsion eingeschlossen bleibt.
Ein weiterer Teil des Hauptziels ist die Entwicklung eines Herstellungsverfahrens einer derartigen strukturierten Öl-in-Wasser-Emulsion mit durchschnittlichem Öltröpfchen in der Emulsion, das im optimalen Bereich geregelt ist, sodass es bevorzugt im retikuloendothelialen System verteilt ist, was zu einer niedrigen Plasmakonzentration führt. Für einen injizierbaren Zweck wirkt es somit wie eine Emulsion von wässriger äußerer Phase, die Ölkügelchen mitführt, die ölbeschichtetes Amphotericin B enthalten.
Ein weiterer Teil des Hauptziels ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung einer derartigen strukturierten Amphotericin-B-Emulsion, die nur ein Minimum von Additiven benötigt, die zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion wesentlich sind.
Zusammenfassung der Erfindung:
Entsprechend ist eine im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform mit einem LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die Folgendes umfasst:

a) ölige Phase (bis zu 30% w/v der Zusammensetzung), die aus einer Gruppe von pflanzlichen Ölen, wie zum Beispiel Sojaöl, Sesamöl, Saflordistelöl ausgewählt ist;
b) Amphotericin B (0,05% bis 1% w/v der Zusammensetzung), das in der öligen Phase dispergiert ist;
c) wässriges Phasenwasser;
d) die Tonizität modifizierende Mittel, wie zum Beispiel Glycerin, Mannitol, Dextrose, die in der wässrigen Phase gelöst sind; und
e) natürlichen Phosphatid-Emulgator (bis zu 3% w/v der Zusammensetzung), der in der wässrigen Phase dispergiert ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung einer derartigen parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform mit einem LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen Gegenstand der Erfindung, das Folgendes umfasst: Dispergieren von Amphotericin B in öliger Phase; Herstellen der wässrigen Phase durch Auflösen des die Tonizität modifizierenden Mittels in Wasser; Dispergieren des Emulgierungsmittels in der wässrigen Phase; Einstellen des pH der wässrigen Phase auf etwa 8-11; Zugeben der öligen Phase zur wässrigen Phase unter Rühren, um eine grob strukturierte Emulsion zu erhalten; Homogenisieren der grob strukturierten Emulsion auf eine durchschnittliche Partikelgröße von unter 2 Mikron; Filtrieren, Füllen der homogenisierten, strukturierten Emulsion unter Stickstoff in Glasgefäße, Schließen der Glasgefäße, Abdichten der geschlossenen Glasgefäße und Sterilisieren der abgedichteten, gefüllten Gefäße durch Autoklavieren. Die Reihenfolge dieser Verfahrensschritte ist wichtig. Abändern der Reihenfolge dieser Verfahrensschritte verändert die Struktur der Emulsion, wie durch Toxizitätsstudien wiedergegeben wurde.
Es ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung kennzeichnend, dass das Eiphosphatid in wässriger Phase dispergiert wird, während das Amphotericin-B-Pulver in der öligen Phase dispergiert wird, und daher wird das Produkt als ölbeschichtetes Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform bezeichnet.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform, wie durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt, Gegenstand dieser Erfindung.
Das Formulieren von Amphotericin B als strukturierte Emulsionsform von Öl-in-Wasser-Art durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung führte beträchtlich zur Verringerung seiner Toxizität und gewährleistete Sterilität der Zusammensetzung, ohne seine antifungale Aktivität zu verändern. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die weniger toxisch ist, stellt einen Rahmen zur Anhebung der Dosishöhen bei der Behandlung von bestimmten Infektionen bereit.
Die parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform der vorliegenden Erfindung ist weniger toxisch und ist durch Folgendes gekennzeichnet:

a) hat einen LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg Körpergewicht in der Einzeldosis-Toxizitätsstudie und von mindestens 40 mg/kg Körpergewicht in der Toxizitätsstudie mit wiederholter Dosis in Mäusen;
b) hat einen LD₅₀ von mindestens 150 mg/kg Körpergewicht in Ratten in der Einzeldosis-Toxizitätsstudie;
c) zeigt mindestens eine 20-mal geringere hämolytische Wirkung auf menschliche rote Blutkörperchen, im Vergleich zur konventionellen Formulierung, die Natriumdeoxycholat enthält;
d) zeigt eine bevorzugte Gewebeverteilung im retikulären endothelialen System und hat mindestens eine zweifache t_1/2 in Organen vom retikuloendothelialen System, im Vergleich zur konventionellen Formulierung, die Natriumdeoxycholat enthält, in der Einzeldosisstudie in Mäusen;
e) zeigt keine toxischen Symptome von Herztoxizität nach Injektion in Mäusen, wie zum Beispiel schwere Atemnot, lokale Reizung, Bauchschmerz und Ruhelosigkeit.

Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung:
Der Amphotericin-B-Gehalt in der parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform der Erfindung liegt weitgehend im Bereich von 0,05% bis 1% w/v der Zusammensetzung. Bevorzugt beträgt er von 0,1 bis 0,5% w/v und speziell beträgt er entweder etwa 0,5% oder etwa 0,25% w/v der Zusammensetzung.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Amphotericin B vor der Emulgierung in der öligen Phase dispergiert. Amphotericin B wird als solches verwendet oder wird vor dem Dispergieren in der öligen Phase mikronisiert. Die ölige Phase liegt in einer Menge vor, die weitgehend bis zu 30% w/v der Zusammensetzung, bevorzugt von 5 bis 25% w/v, beträgt, und bevorzugter beträgt sie 10-20% w/v, speziell beträgt sie entweder etwa 10% w/v oder etwa 20% w/v. Die verwendete ölige Phase ist üblicherweise ein pflanzliches Öl und kann eins der pflanzlichen Öle, wie zum Beispiel Sojaöl, Sesamöl, Baumwollsamenöl, Saflordistelöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl, Maisöl, Castoröl oder Olivenöl, sein. Das bevorzugte pflanzliche Öl ist Sojaöl.
In dieser Erfindung wird der Emulgator in der wässrigen Phase gelöst. Geeignete Emulgatoren schließen natürlich vorkommende Phosphatide und modifizierte Phosphatide ein. Der bevorzugte Emulgator ist natürlich vorkommende Phosphatide, wie zum Beispiel Eiphosphatid und Sojaphosphatide. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Emulgator kann eine Mischung von zwei oder mehr der vorstehend erwähnten Emulgatoren umfassen. Das bevorzugte natürliche Phosphatid ist gereinigtes Eiphosphatid.
Die parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform der vorliegenden Erfindung wird für den pH-Bereich 6,0-8,5 formuliert. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der pH der wässrigen Phase zwischen 8 & 11 mit einem Alkali, wie zum Beispiel Natriumhydroxid- oder Kaliumhydroxidlösung in Wasser, eingestellt, sodass der pH der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nach dem Autoklavieren im Bereich von 6-8,5 bleibt.
Die parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform der vorliegenden Erfindung wird durch Einschluss eines die Tonizität modifizierenden Mittels, wie zum Beispiel Glycerin, Mannitol, Dextrose oder einer Kombination davon, isotonisch mit Blut eingestellt. Das bevorzugte, die Tonizität modifizierende Mittel ist Glycerin. Glycerin liegt in einer Menge von 2-3% w/v der Zusammensetzung vor. Bevorzugt beträgt die verwendete Menge von Glycerin etwa 2,25% w/v der Zusammensetzung.
Die parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotencin B in strukturierter Emulsionsform der vorliegenden Erfindung sind besonders sterile Öl-in-Wasser-Emulsionen, die gemäß den Herstellungsmethoden unter kontrollierten Bedingungen hergestellt wurden, und werden abschließend durch Autoklavieren sterilisiert. Wenn die Emulgierung bei einer höheren Temperatur ausgeführt wird, werden entweder die wässrige Phase oder die ölige Phase oder beide Phasen bei einer Temperatur bis zu 75°C gehalten.
Die durchschnittliche Partikelgröße der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird absichtlich bei bis zu 2 μ gehalten, sodass Amphotericin B bevorzugt im retikuloendothelialen System verteilt wird, wodurch eine niedrige Plasmakonzentration erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung ist durch ein typisches Beispiel beschrieben, worin die strukturierte Emulsion Folgendes umfasst: Amphotericin B (0,5% w/v); ölige Phase – Sojaöl (20% w/v); Emulgator – gereinigtes Eiphosphatid (1,2% w/v); die Tonizität modifizierendes Mittel – Glycerin (2,25% w/v) und Wasser (q.s. bis 100 Volumen-%); die durch das Verfahren hergestellt wird, das Folgendes umfasst: Dispergieren von Amphotericin B in Sojaöl; Herstellen der wässrigen Phase durch Zugabe von Glycerin zu Wasser; gefolgt vom Dispergieren des gereinigten Eiphosphatids in der wässrigen Phase; Einstellen des pH der wässrigen Phase auf 10,8; Zugeben des Sojaöls, das Amphotericin B enthält, zur wässrigen Phase unter Rühren, um eine grobe Emulsion zu erhalten; Homogenisieren der groben Emulsion auf eine Partikelgröße von unter 2 Mikron; Filtrieren durch 2 Mikron-Filter, Füllen unter Stickstoff in Glasgefäße, Schließen der Glasgefäße, Abdichten der geschlossenen Glasgefäße und Sterilisieren der abgedichteten gefüllten Gefäße durch Autoklavieren.
Die strukturierte Emulsion der parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B, das in Öl-in-Wasser-artiger Emulsion strukturiert ist, der vorliegenden Erfindung hat geringe Toxizität und sie hat eine geringe Partikelgröße und sie ist zur parenteralen Verwendung geeignet. Die Sterilität der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist gewährleistet, da das Produkt durch abschließendes Autoklavieren ohne bedeutenden Verlust von Amphotericin-B-Aktivität und ohne Destabilisierung der Emulsion sterilisiert wird. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist leicht zu verwenden, da das Produkt mit Dextrose-Injektion 5% oder Kochsalzlösung verdünnt werden könnte, um die zur parenteralen Verabreichung erforderliche Konzentration zu erhalten. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat auch eine verlängerte Haltbarkeitadauer und ist daher als ein fertig marktfähiges Produkt geeignet.
Wir haben das Toxizitätsprofil der Emulsionen, die durch Verfahren, in denen Variationen in der Form von Zugabe von Amphotericin B und gereinigtem Eiphosphatid unternommen wurden, untersucht. Diese sind in den Beispielen, wie sie in der folgenden Tabelle dargestellt sind, beschrieben.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung, wenn Amphotericin B in einer wässrigen Phase suspendiert, wird beobachtet, [sic] dass es zu einem Produkt führt, das bei Injektion in Mäusen Symptome von Herztoxizität verursacht, wie zum Beispiel schwere Atemnot, lokale Reizung, Bauchschmerz und Ruhelosigkeit. Jedoch wurden diese toxischen Symptome nicht beobachtet, wenn Amphotericin B in einer öligen Phase suspendiert wird. Dies könnte durch den Reservoir-Effekt aufgrund von sowohl der öligen Tröpfchen der Emulsion als auch der Kuppfer-Zellen verursacht sein. Diese langsame Freisetzung könnte zur Gegenwart von monomerem Amphotericin B im Plasma nach der Injektion von Emulsionsformulierung führen, wodurch die Toxizität verringert wird [Lit. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1997; Vol. (Bd.) 41(4): S. 728-732].
Wir beobachteten, dass die Zusammensetzung, die durch Zugabe des Emulgators Eilecithin in die ölige Phase hergestellt wird, auch Symptome von Herztoxizität, wie vorstehend erwähnt, verursachte. Nach umfangreichem Experimentieren wurde dieses Problem durch Zugabe von Eilecithin zur wässrigen Phase bewältigt. Diese Verfahrensstudien sind in Beispiel I bis Beispiel VI beschrieben. Beispiel II und Beispiel III, die die Variationen von Beispiel I sind, sind alle von der vorliegenden Erfindung, während Beispiele IV, V und VI nicht von der Erfindung sind. Beispiel VII beschreibt die in-vitro-Toxizitätsstudien mit menschlichen roten Blutkörperchen. Beispiel VIII und Beispiel XI beschreiben die Toxizitätsstudien in Mäusen, Ratten und Hunden. Beispiel IX beschreibt eine pharmakokinetische Studie in Kaninchen und Beispiel X beschreibt Organverteilungsstudien in Mäusen.
Die Beobachtung, dass in Öl dispergiertes Amphotericin B und in Wasser dispergiertes Eilecithin eine Emulsion mit einer sehr geringen Toxizität ergeben, deutet eine starke Wechselwirkung zwischen Öltröpfchen und Amphotericin B an. Daher kann Amphotericin-B-Emulsion als ein Reservoir von monomerer Form von Amphotericin B betrachtet werden und aufgrund der hohen Stabilität der Formulierung würden nur begrenzte Mengen von freiem Amphotericin zunehmend freigesetzt werden. Die monomere Form von Amphotericin B ist fähig, zu dem Ergosterin von Pilzzellen zu binden, doch ist mit dem Cholesterin von Wirtszellen von Säugetieren inaktiv und verursacht daher weniger Toxizität. Im Fall von konventioneller Amphotericin-B-Formulierung führt die Freisetzung von großen Mengen von freiem Amphotericin B im Plasma zur Gegenwart von selbstassoziierten Oligomeren im Kreislauf. Diese oligomeren Formen wechselwirken mit Cholesterin-enthaltenden Wirtszellmembranen und verursachen daher mehr Toxizität. Dies erklärt den Mechanismus von geringer Toxizität der Amphotericin-B-Emulsion der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur konventionellen Formulierung. Geringere maximale Konzentration und AUC-Werte im Serum (Beispiel IX) und entsprechend schnellere Absetzung von Amphotericin B in Geweben (Beispiel X-A) erklären auch den Grund für die geringere Toxizität der Amphotericin-B-Emulsion der vorliegenden Erfindung. Die geringe Toxizität wird durch unsere Ergebnisse, wie sie in den Beispielen VIII-A, VIII-B und VIII-C angegeben sind, bestätigt.
Diese Toxizitätsstudien zeigen, dass, obgleich die parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform des Produkts unserer vorliegenden Erfindung der im Japanischen Patent 11-60491 (1989) Beschriebenen zu ähneln scheint, das Produkt der vorliegenden Erfindung aufgrund des Herstellungsverfahrens eine charakteristische geringe biologische Toxizität aufweist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert ein Emulsionsprodukt, das aufgrund der langsamen Freisetzung von Amphotericin B in Plasma, wenn es injiziert wird, die Bildung von Monomeren begünstigt, was bei dem Produkt, das durch das im Japanischen Patent 11-60491 (1989) beschriebene Verfahren hergestellt wird, nicht der Fall ist. Somit ist die Emulsionsstruktur der vorliegenden Erfindung von der, die durch das japanische Patent erhalten wird, verschieden, wie durch die Toxizitätsstudien gezeigt wurde. Daher bezeichnen wir die Emulsion der vorliegenden Erfindung als strukturierte Emulsion.
In der Hauptausführungsform der Erfindung wird Amphotericin B in öliger Phase dispergiert, sodass Amphotericin-B-Pulver ölbeschichtet wird. Als Emulgator verwendetes Eilecithin wird in wässriger Phase dispergiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Homogenisierung in Wiederholungsdurchläufen durchgeführt, um eine Partikelgrößenverteilung von unter 2 μ zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die endgültige parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform am Ende durch abschließendes Autoklavieren abschließend sterilisiert.
Unterschiede zum Stand der Technik:
Es wird von dem Folgenden ersichtlich werden, dass sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung von den Patenten unterscheidet.

a) Das Verfahren der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem US-Patent 5364632 (1994) darin, dass es keinerlei Lösungsmittel für Amphotericin B verwendet; dass es nicht über den Herstellungsprozess eines Films von Amphotericin B und Phospholipid und anschließende Hydratisierung verläuft, dass es nicht MCT-Öl mit zugesetztem α-Tocopherol verwendet; dass es den pH der wässrigen Phase, die Eiphosphatid enthält, auf 8-11 einstellt; dass es einen abschließenden Sterilisationsschritt enthält – und im Produkt, das geringe Toxizität und gute Verteilung im retikuloendothelialen System (RES) aufweist. Die Verwendung derartiger großer Mengen von Lösungsmittel erschwert es, das Verfahren kommerziell anzuwenden. Es wurde beobachtet, dass die Partikelgröße in verschiedenen Beispielen kleiner als 100 nm ist, jedoch wurde nicht über die Toxizität der Zusammensetzung berichtet. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die geringe Toxizität selbst bei 5 mg/ml aufrechterhalten, was therapeutisch vorteilhaft ist, da das erforderliche, zu injizierende Volumen gering ist.
b) Das Verfahren der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem Japanischen Patent 11-60491 (1989) darin, dass die Emulsionskügelchen-/-partikelgröße in dem japanischen Patent 0,1-0,2 μ beträgt und die in der vorliegenden Erfindung bis zu 2 μ beträgt. In dem Verfahren unserer Erfindung wird Eiphosphatid zur wässrigen Phase gegeben und der pH der wässrigen Phase wird auf 8-11 eingestellt. Die Haltbarkeitsdauer des Produkts der vorliegenden Erfindung beträgt über 2 Jahre, während die des japanischen Patents in der Größenordnung von 10 Tagen oder wenigen Wochen liegt. Eine große Anzahl von die Emulsion unterstützenden Mittel sind in dem Verfahren der japanischen Patente erforderlich, die in der vorliegenden Arzneimittelemulsion nicht erforderlich sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein steriles Produkt bereit, das abschließend durch Autoklavieren sterilisiert wird, das des Stands der Technik des japanischen Patents ist nicht sterilisiert.
c) Das Produkt, das durch das Verfahren vom Japanischen Patent 4-173736 (1992) hergestellt wird, enthält keine Partikel mit Durchmessern von mehr als 1 μm und dieses Produkt enthält keine Ölkomponente und unterscheidet sich daher von der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
d) Im US-Patent 5389373 (1995) wird Amphotericin B zu einer vorgebildeten Emulsion gegeben, während Amphotericin B im Verfahren unserer vorliegenden Erfindung in öliger Phase dispergiert wird.
e) Im Europäischen Patent EP 0700678 (1996) wurde Amphotericin-B-Emulsion als solche nicht beschrieben. Es ist eines der Arzneimittel von etwa 70 Arzneimitteln, die im Patent als „kann als Lipidemulsion formuliert werden" beschrieben sind. Die in diesem Patent beschriebenen Emulsionen sollten im Wesentlichen Aminosäuren und Citronensäure oder ihre Salze enthalten, die im Verfahren unserer Erfindung überhaupt nicht erforderlich sind. Das Herstellungsverfahren von Emulsion in diesem Patent beginnt im Wesentlichen mit der Herstellung eines Phospholipidfilms mit oder ohne einem Arzneimittel. Dieser Methode wird im Verfahren unserer Erfindung überhaupt nicht gefolgt. Im Herstellungsverfahren von Emulsion beschreibt die Methode verschiedene Weisen der Zugabe von Emulgator, während das Verfahren unserer Erfindung die Methode der Zugabe von Emulgator nur zur wässrigen Phase beschreibt. Das im Europäischen Patent EP 0700678 (1996) erwähnte Ziel der Erfindung ist im Wesentlichen die Bewältigung des Problems der Verfärbung von Lipidemulsion unter Verwendung von Citronensäure und Aminosäuren, während das Ziel der vorliegenden Erfindung die Entwicklung von einem ölbeschichteten Amphotericin B strukturiert in einem Öl-in-Wasser-artigen Emulsion mit geringer Toxizität ist, die durch LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen gekennzeichnet ist.

Beispiele:
Die Erfindung wird nun durch Beispiele erläutert werden.
Alle der in diesem Beispiel verwendeten Ausgangsstoffe waren von parenteraler Qualität. Verwendete Gerätschaften waren von konventioneller Art. Die gesamte Verarbeitung wurde in einem Bereich mit einem kontrollierten Umfeld durchgeführt. Während der Verarbeitung des Ansatzes wurde Stickstoffabdeckung bereitgestellt.
In diesen Beispielen verwendetes Amphotericin B war von parenteraler Qualität, das von Alpharma erhalten wurde und die USP-Vorgaben erfüllt.
In diesen Beispielen verwendetes gereinigtes Eiphosphatid war von parenteraler Qualität und wurde von Lipoids bezogen.
Gewerblich erhältliche Amphotericin-B-Injektion, die Natriumdeoxycholat enthält, wird in den gesamten pharmakokinetischen Studien, Organverteilungsstudien und Toxizitätsstudien als konventionelle Amphotericin-B-Injektion bezeichnet. Es wird in allen Studien lediglich ein Fabrikat von konventioneller Zusammensetzung verwendet.
Beispiel I
Die ölige Phase wurde durch Dispergieren von 1 g Amphotericin B in 40 g Sojaöl hergestellt.
Die wässrige Phase wurde durch Zugeben von 4,5 g Glycerin zu 150 ml Wasser und dann Dispergieren von 2,4 g Eiphosphatid darin hergestellt. Der pH wurde unter Verwendung von wässriger Natriumhydroxidlösung auf 10,6 eingestellt.
Die vorstehend hergestellte ölige Phase wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zur wässrigen Phase gegeben. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die gebildete Emulsion wurde durch den Hochdruckhomogenisator gegeben. Die Homogenisierung wurde wiederholt, bis die Kügelchen-/Partikelgröße unter 2 μm lag. Das Produkt wurde sofort nach jedem Homogenisierungsdurchlauf auf etwa 20°C abgekühlt.
Die homogenisierte Emulsion wurde durch einen 2 μ-Filter gefiltert und unter Stickstoff in Gefäße gefüllt, abgedichtet und durch Autoklavieren sterilisiert.

Das durch dieses Verfahren hergestellte Produkt hat die folgende Zusammensetzung:

a) Amphotericin B –	1,0 g
b) Sojaöl –	40,0 g
c) gereinigtes Eiphosphatid –	2,4 g
d) Glycerin –	4,5 g
e) Natriumhydroxid –	q.s. zur Einstellung des pH
f) Wasser –	q.s. auf 200 ml

Das erhaltene sterilisierte Produkt wurde Toxizitätsstudien in Mäusen, Ratten und Hunden (Beispiel VIR-A, VIII-B, VIII-C, VIII-D), pharmakokinetischen Studien (Beispiel IX), Organverteilungsstudien (Beispiel X-A, X-B) unterzogen.
Stabilitätsstudien wurden durch Aufbewahrung des Produkts in den Fläschen bei 2°C-8°C durchgeführt und die Ergebnisse sind nachstehend angegeben.
STABILITÄTSWERTE VOM PRODUKT VON BEISPIEL I
Die Toxizitätsstudien zeigen deutlich, dass die durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Emulsion eine synergistische Zusammensetzung ist.
Beispiel II
Amphotericin-B-Pulver wurde unter Verwendung einer Luftstrahlmühle auf eine Partikelgröße im Bereich von weniger als 10 Mikron mikronisiert.
Die ölige Phase wurde durch Dispergieren von 1 g Amphotericin B (mikronisiert) in 40 g Sojaöl hergestellt.
Die wässrige Phase wurde durch Zugeben von 4,5 g Glycerin zu 150 ml Wasser und dann Dispergieren von 2,4 g Eiphosphatid darin hergestellt. Der pH wurde unter Verwendung von wässriger Natriumhydroxidlösung auf 10,8 eingestellt.
Die vorstehend hergestellte ölige Phase wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zur wässrigen Phase gegeben. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die gebildete Emulsion wurde durch den Hochdruckhomogenisator gegeben. Die Homogenisierung wurde wiederholt, bis die Kügelchen-/Partikelgröße unter 2 μm lag.
Die homogenisierte Emulsion wurde durch einen 2 μ-Filter gefiltert und unter Stickstoff in Gefäße gefüllt, abgedichtet und autoklaviert.

a) Amphotericin B (mikronisiert) –	1,0 g
b) Sojaöl –	40,0 g
c) gereinigtes Eiphosphatid –	2,4 g
d) Glycerin –	4,5 g
e) Natriumhydroxid –	q.s. zur Einstellung des pH
f) Wasser –	q.s. auf 200 ml

Dieses Beispiel belegt, dass Abkühlen während der Homogenisierung nicht erforderlich ist, wenn mikronisiertes Amphotericin B verwendet wird.
Beispiel III
Die ölige Phase wurde durch Dispergieren von 1 g Amphotericin B in 40 g Sojaöl, das zuvor auf 70 erhitzt wurde, hergestellt.
Die wässrige Phase wurde durch Zugeben von 4,5 g Glycerin zu 150 ml Wasser, das zuvor auf 65°C erhitzt wurde, und dann Dispergieren von 2,4 g Eiphosphatid darin hergestellt. Der pH wurde unter Verwendung von wässriger Natriumhydroxidlösung auf 10,8 eingestellt.
Die ölige Phase bei 70°C wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zur wässrigen Phase bei 65°C gegeben. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die gebildete Emulsion wurde durch den Hochdruckhomogenisator gegeben. Die Homogenisierung wurde wiederholt, bis die Kügelchen-/Partikelgröße unter 2 μm lag. Das Produkt wurde sofort nach jedem Homogenisierungsdurchlauf auf etwa 20°C abgekühlt.
Die homogenisierte Emulsion wurde durch einen 2 μ-Filter gefiltert und unter Stickstoff in Gefäße gefüllt, abgedichtet und durch Autoklavieren bei 110°C für 40 Minuten sterilisiert.

Der Gehalt von Amphotericin B im erhaltenen Produkt wurde analysiert und es wurde ermittelt, dass er ausreichend ist, was zeigt, dass Emulgierung bei höherer Temperatur durchgeführt werden könnte.
Beispiel IV (nicht von der Erfindung)

Ölige Phase – 40 g Sojaöl

Die wässrige Phase wurde durch Zugeben von 4,5 g Glycerin zu 150 ml Wasser und dann Dispergieren von 2,4 g Eiphosphatid darin hergestellt. Es wurde 1 g Amphotericin B in dieser Eiphosphatidlösung dispergiert und der pH wurde unter Verwendung von wässriger Natriumhydroxidlösung auf 10,8 eingestellt.
Die ölige Phase wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zur wässrigen Phase gegeben. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die gebildete Emulsion wurde durch den Hochdruckhomogenisator gegeben. Die Homogenisierung wurde wiederholt, bis die Kügelchen-/Partikelgöße unter 2 μm lag.
Das Produkt wurde sofort nach jedem Homogenisierungsdurchlauf auf etwa 20°C abgekühlt.
Die homogenisierte Emulsion wurde durch einen 2 μ-Filter gefiltert und unter Stickstoff in Gefäße gefüllt, abgedichtet und durch Autoklavieren sterilisiert.

Das sterilisierte Produkt wurde Toxizitätsstudien unterzogen, gemäß den Details, die in Beispiel XI angegeben sind, und es wurde ermittelt, dass es toxische Symptome von Herztoxizität verursacht. Daher wird die Zugabe von Amphotericin B zur wässrigen Phase nicht empfohlen.
Beispiel V (nicht von der Erfindung)
Die ölige Phase wurde durch Lösen von 2,4 g gereinigtem Eiphosphatid unter Rühren in 40 g Sojaöl, das zuvor auf 70°C erhitzt wurde, hergestellt.
Die wässrige Phase wurde durch Zugeben von 4,5 g Glycerin zu 150 ml Wasser, das zuvor auf 65°C erhitzt wurde, und dann Dispergieren von 1 g Amphotericin B darin hergestellt. Der pH wurde unter Verwendung von wässriger Natriumhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt.
Die ölige Phase bei 70°C wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zur wässrigen Phase bei 65°C gegeben. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die gebildete Emulsion wurde durch den Hochdruckhomogenisator gegeben. Die Homogenisierung wurde wiederholt, bis die Kügelchen-/Partikelgröße unter 2 μm lag. Das Produkt wurde sofort nach jedem Homogenisierungsdurchlauf auf etwa 20°C abgekühlt.
Die homogenisierte Emulsion wurde durch einen 2 μ-Filter gefiltert und unter Stickstoff in Gefäße gefüllt, abgedichtet und durch Autoklavieren sterilisiert.

Das sterilisierte Produkt wurde Toxizitätsstudien unterzogen, gemäß den Details, die in Beispiel XI angegeben sind, und es wurde ermittelt, dass es toxische Symptome von Herztoxizität verursacht. Daher wird die Zugabe von gereinigtem Eiphosphatid zur öligen Phase und die Zugabe von Amphotericin B zur wässrigen Phase nicht empfohlen.
Beispiel VI (nicht von der Erfindung)
Es wurden 40 g Sojaöl auf 75°C erhitzt und 2,4 g Eilecithin wurden unter Rühren darin gelöst. Es wurde 1 g Amphotericin B unter Rühren in der öligen Phase dispergiert, um eine gleichmäßige Dispersion von Amphotericin B in öliger Phase zu erhalten. Für 15 Minuten wurde die ölige Phase mit Stickstoff durchgespült.
Es wurden 150 ml Wasser auf 65°C erhitzt. Es wurden 4,5 g Glycerin unter Rühren dazu gegeben. Der pH wurde unter Verwendung von verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 10,65 eingestellt. Die ölige Dispersion von Amphotericin B wurde unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit zu dieser wässrigen Phase gegeben, um eine grobe Emulsion zu erhalten. Das Volumen wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Diese grobe Emulsion wurde dann unter Verwendung eines APV-Hochdruckhomogenisator homogenisiert, bis das homogenisierte Produkt durch einen Glasfaserfilter von 2 μ gefiltert werden konnte. Das Produkt wurde sofort nach jedem Homogenisierungsdurchlauf auf etwa 20°C abgekühlt. Das gefilterte Produkt wurde unter Stickstoff in Glasgefäße gefüllt, abgedichtet und durch Autoklavieren sterilisiert.

Das sterilisierte Produkt wurde Toxizitätsstudien unterzogen, gemäß den Details, die in Beispiel XI angegeben sind, und es wurde ermittelt, dass es toxische Symptome von Herztoxizität verursacht. Daher wird die Zugabe von gereinigtem Eiphosphatid zur öligen Phase nicht empfohlen.
Parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B strukturiert in einer Öl-in-Wasser-artigen Emulsion in den folgenden Beispielen wird als Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml) bezeichnet.
Beispiel VII
Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde einem in-vitro-Toxizitätstest mit menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs) zusammen mit konventioneller Amphotericin-B-Formulierung, die Natriumdeoxycholat enthält, unterzogen.
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: RBCs von normalen menschlichen männlichen Spendern.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde.
Vergleichsstoff: konventionelle Injektion von Amphotericin B (5 mg/ml).
Studiendesign: Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. RBCs wurden durch Zentrifugieren bei 450 g für 10 min bei 4°C isoliert. Das Plasma und „Buffy Coat" wurden entfernt und die RBCs wurden 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) bei 4°C gewaschen, bevor sie in PBS dispergiert wurden. Dies wurde dann mit einem Sysmex KX-21 Zellzählgerät gezählt und am Tag der Ernte verwendet. Für die Bestimmung von RBC-Empfindlichkeit gegen Amphotericin B wurden 2 ml Zellsuspension (5 × 10⁷ Zellen/ml) in PBS für 1 h bei 37°C mit Amphotericin-B-Emulsion oder konventioneller Amphotericin-B-Injektion inkubiert. Die RBCs wurden dann für 5 min bei 1500 g zentrifugiert und 3-mal mit PBS gewaschen. Das Pellet von RBCs wurde durch 2 ml Wasser lysiert, gerührt und zentrifugiert (1500 g für 5 min), um Membrane zu entfernen. Hämoglobin wurde mit dem Zellzählgerät gemessen. Die Freisetzung wurde als die Differenz zwischen Kontrolle und behandelten Zellen berechnet und als Prozentanteil des gesamten Hämoglobingehalts ausgedrückt.
TABELLE 1. DOSEN VON AMPHOTERICIN-B-FORMULIERUNGEN, DIE AUF IN-VITRO-TOXIZITÄT MIT MENSCHLICHEN RBCs UNTERSUCHT WURDEN
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden durch Vergleich der behandelten Gruppen mit der negativen Kontrollgruppe unter Verwendung des Student-t-Tests analysiert.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 2: HÄMOGLOBINGEHALT IN g/dl FÜR DIE AMPHOTERICIN-B-FORMULIERUNGEN
Es wird ein ansteigendes Austreten von Hämoglobin mit ansteigenden Konzentrationen von Amphotericin B in konventioneller Amphotericin-B-Injektion und der Emulsion beobachtet (Verweis auf 1). Die konventionelle Amphotericin-B-Injektion zeigte ein durchschnittliches Austreten von 77,55% für 5 mg/l und 100% für 50 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l. Die Emulsion zeigte einen Durchschnitt von 2,04% für 5 mg/l, 4,08% für 50 mg/l, 4,18% für 100 mg/l und 9,49% für 200 mg/l. Die Amphotericin-B-Emulsion war bedeutend weniger toxisch als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion bei den untersuchten Dosen (P < 0,05).
SCHLUSSFOLGERUNG
Somit zeigten die in-vitro-Toxizitätsdaten deutlich, dass die Amphotericin-B-Emulsion, die in Beispiel I hergestellt wurde, weniger toxisch ist als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion, wenn die Zielzellen menschliche RBCs sind.
Beispiel VIII
Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde in-vitro-Toxizitätsstudien in Mäusen zusammen mit konventionellem Amphotericin B, das Natriumdeoxycholat enthält, unterzogen.
Die Studie wurde mit den folgenden Zielen durchgeführt:

– die LD₅₀-Werte für beide vorstehenden Formulierungen aus Einzeldosisstudien einzuschätzen
– Auswirkungen auf die Toxizität für die vorstehenden 2 Formulierungen aus Studien mit wiederholter Dosis zu bestimmen

VIII-A) EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIE IN MÄUSEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Weibliche Schweizer Albinomäuse im Gewichtsbereich von 20-22 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign: Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 8 Tieren, und zwar GRUPPE 1 und GRUPPE 2, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt verschiedene Dosen von konventioneller Amphotericin-B-Injektion, GRUPPE 2 erhielt verschiedene Dosen von Amphotericin-B-Emulsion.
TABELLE 3. DOSEN VON AMPHOTERICIN-B-FORMULIERUNGEN, DIE FÜR EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIEN IN MÄUSEN UNTERSUCHT WURDEN
Alle Gruppen erhielten die Injektionen auf intravenösem Weg. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 72 Stunden bezüglich irgendwelcher Anzeichen von klinischer Toxizität und bezüglich Mortalität beobachtet. Die prozentuale Mortalität wurde für alle Dosen berechnet.
Statistische Analyse: Probit-Analysenmethode wurde zur Bestimmung der LD₅₀-Werte für alle Formulierungen durchgeführt.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 4. PROZENTUALE MORTALITÄT FÜR DIE VERSCHIEDENEN DOSEN DER 2 FORMULIERUNGEN
Die vorstehende Tabelle zeigt, dass die konventionelle Zubereitung konventionelle Amphotericin-B-Injektion toxischer ist als Amphotericin-B-Emulsion. Die prozentuale Mortalität für die Formulierungen stieg in einer dosisabhängigen Weise an. Die LD₅₀-Werte für die 2 Formulierungen wurden durch die Probit-Analysenmethode bestimmt. 2 zeigt ein Diagramm von prozentualer Mortalität versus Dosis für die 2 Formulierungen.
SCHLUSSFOLGERUNG: Die Amphotericin-B-Emulsion, die in Beispiel I hergestellt wurde, hat einen hohen LD₅₀-Wert und ist weniger toxisch als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion.
VIII-B) TOXIZITÄTSSTUDIE MIT WIEDERHOLTER DOSIS IN MÄUSEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Weibliche Schweizer Albinomäuse im Gewichtsbereich von 20-22 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign: Die Tiere wurden in 3 Gruppen von jeweils 6 Tieren, und zwar GRUPPE 1, GRUPPE 2 und GRUPPE 3, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt das Blindproben-Emulsionsvehikel (Kontrolle), GRUPPE 2 erhielt verschiedene Dosen von konventioneller Amphotericin-B-Injektion und GRUPPE 3 erhielt verschiedene Dosen von Amphotericin-B-Emulsion.
TABELLE 5. DOSEN VON KONVENTIONELLEM AMPHOTERICIN B UND AMPHOTERICIN-B-EMULSION, DIE FÜR TOXIZITÄTSSTUDIEN MIT WIEDERHOLTER DOSIS IN MÄUSEN UNTERSUCHT WURDEN
Alle Gruppen erhielten die Injektionen, wie sie in Tabelle 5 angegeben sind, täglich auf intravenösem Weg. Die Kontrollgruppen erhielten das maximale Volumen des Vehikels. Alle Tiere wurden bezüglich irgendwelcher Anzeichen von klinischer Toxizität beobachtet. Ihre Körpergewichte wurden für 14 Tage jeden zweiten Tag erfasst. Die Tiere wurden für eine Dauer von 14 Tagen auch bezüglich Mortalität beobachtet. Die prozentuale Mortalität wurde für alle Dosen berechnet.
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden zum Vergleich der Veränderung der Körpergewichte während der Studie analysiert. Derartige Veränderungen wurden zwischen den behandelten Gruppen verglichen.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 6. PROZENTUALE MORTALITÄT FÜR DIE VERSCHIEDENEN DOSEN DER 2 FORMULIERUNGEN
Die vorstehende Tabelle (Verweis auch auf 3) zeigt, dass die konventionelle Amphotericin-B-Injektion toxischer ist als die Amphotericin-B-Emulsion. Die prozentuale Mortalität für die Formulierungen stieg in einer dosisabhängigen Weise an. Für die mit Vehikel behandelte Gruppe wurde für 14 Tage keine Mortalität beobachtet. Amphotericin-B-Emulsion zeigte, selbst bei höheren Dosen, eine geringere Toxizität als konventionelle Amphotericin-B-Injektion.
TABELLE 7. MITTLERE KÖRPERGEWICHTE BEI VERSCHIEDENEN DOSEN FÜR DIE TOXIZITÄTSSTUDIE MIT WIEDERHOLTER DOSIS IN MÄUSEN
Die Gruppe, die mit konventioneller Amphotericin-B-Injektion behandelt wurde, zeigte eine Abnahme des Körpergewichts der Tiere bei 1,5 mg/kg und 2,5 mg/kg, während Amphotericin-B-Emulsion eine Abnahme des Körpergewichts der Tiere von 20 mg/kg und 40 mg/kg zeigte (Verweis auf 4). An den Tagen 6 und 8 waren die Körpergewichte von Mäusen, die mit Amphotericin-B-Emulsion von 20 mg/kg und 40 mg/kg behandelt wurden, wesentlich geringer als die von Mäusen, die mit Amphotericin-B-Emulsion bei 10 mg/kg behandelt wurden.
Die histopathologische Untersuchung zeigte einige degenerative Veränderungen in den Parenchymzellen von Leber und Nieren, die aufgrund des allgemeinen Metabolismus in Mäusen aufgetreten sein könnten. Die serösen Myofibrillen waren vermutlich das Ergebnis von Hypoxie während der Opferung. Die Veränderungen waren im Allgemeinen von reversibler Art. Die Wirkung von Amphotericin B zeigte sich mehr an der Leber und den Nieren und teilweise im Herzen, wobei sehr akute Läsionen verursacht wurden. Die Intensität war im Allgemeinen dosisabhängig. Bei konventioneller Amphotericin-B-Injektion wurden die Läsionen bei niedrigen Dosishöhen beobachtet.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die Amphotericin-B-Emulsion zeigte eine geringere Toxizität als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion.
VIII-C) EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIE IN RATTEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Wistar-Albinoratten beiden Geschlechts im Gewichtsbereich von 140-160 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign: Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 6 Tieren, und zwar GRUPPE 1 und GRUPPE 2, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt verschiedene Dosen von konventioneller Amphotericin-B-Injektion. GRUPPE 2 erhielt die Dosen von Amphotericin-B-Emulsion.
TABELLE 8. DOSEN VON KONVENTIONELLER AMPHOTERICIN-B-INJEKTION UND AMPHOTERICIN-B-EMULSION, DIE FÜR EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIEN IN RATTEN UNTERSUCHT WURDEN
Alle Gruppen erhielten die Injektionen, wie sie in Tabelle 8 angegeben sind, auf intravenösem Weg. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 72 Stunden bezüglich irgendwelcher Anzeichen von klinischer Toxizität und bezüglich Mortalität beobachtet. Die prozentuale Mortalität wurde für alle Dosen berechnet.
Statistische Analyse:
Probit-Analysenmethode wurde zur Bestimmung der LD₅₀-Werte für alle Formulierungen durchgeführt.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 9. PROZENTUALE MORTALITÄT FÜR DIE VERSCHIEDENEN DOSEN DER 2 FORMULIERUNGEN
Die vorstehende Tabelle (Verweis auch auf 5) zeigt, dass die konventionelle Amphotericin-B-Injektion toxischer ist als Amphotericin-B-Emulsion. Die prozentuale Mortalität für die Formulierungen stieg in einer dosisabhängigen Weise an. Die LD₅₀-Werte für die 2 Formulierungen wurden durch die Probit-Analysenmethode bestimmt. Die 50%-Mortalität wurde für Amphotericin-B-Emulsion nach 72 Stunden beobachtet. Es trat keine Veränderung der Körpergewichte über 72 Stunden auf.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die Amphotericin-B-Emulsion ist weniger toxisch als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion.
VIII-D) EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIE IN HUNDEN
Die vorliegende Studie wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Toxizität und Sicherheit von Amphotericin-B-Emulsion in Hunden zu bewerten.
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Zwölf gesunde Hunde beiden Geschlechts, die im Durchschnitt 10-15 kg wogen, wurden für diese Studie verwendet. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen im Hundezwinger mit Zugriff für Futter und Wasser, ad libitum, untergebracht.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign: Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 6 Tieren, und zwar GRUPPE 1 und GRUPPE 2, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt konventionelle Amphotericin-B-Injektion. GRUPPE 2 erhielt Amphotericin-B-Emulsion, die in Beispiel I hergestellt wurde.
TABELLE 10. DETAILS VON DOSEN VON KONVENTIONELLER AMPHOTERICIN-B-INJEKTION UND AMPHOTERICIN-B-EMULSION, DIE FÜR EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIEN IN HUNDEN UNTERSUCHT WURDEN

Alle Gruppen erhielten die Injektionen, wie sie in Tabelle 10 angegeben sind, gelöst in 6-20 ml 5% Dextrose, auf intravenösem Weg. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 21 Tagen nach Injektion bezüglich irgendwelcher Anzeichen von klinischer Toxizität beobachtet. Die Tiere wurden bei Kontrolle V0, V2, V4, V6 und V8 gewogen. Für hämatologische und biochemische Studien (Nierenfunktions- und Leberfunktionstest) bei V0, V4 und V8 wurde Blut abgenommen. Kontrollplan:

V0 Kontrollbeginn	VS nach 12 Tagen von V0
V1 innerhalb von 2 Tagen des Kontrollbeginns	V6 nach 15 Tagen von V0
V2 nach 3 Tagen von V0	V7 nach 18 Tagen von V0
V3 nach 6 Tagen von V0	V8 nach 21 Tagen von V0
V4 nach 9 Tagen von V0

Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden zum Vergleich der Veränderung der Parameter von den Ausgangswerten während der Studie analysiert. Derartige Veränderungen wurden zwischen den behandelten Gruppen verglichen.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Es wurde ermittelt, dass alle hämatologischen Parameter in beiden Gruppen eine Abweichung von den Ausgangswerten zeigen. Der prozentuale Abfall der Leukozytenzahl für die Emulsion war wesentlich höher als gewöhnlich, doch lag innerhalb des normalen Bereichs und war daher nicht von klinischer Bedeutung.
TABELLE 12. MITTLERE PROZENTUALE VERÄNDERUNG VON BIOCHEMISCHEN PARAMETERN IN HUNDEN ÜBER DEN AUSGANGSWERTEN BEI VERSCHIEDENEN KONTROLLEN
Der Leberfunktionsparameter (Verweis auf 6) AST zeigte bis V8 einen Anstieg von 334,38% für die Gruppe der konventionellen Amphotericin-B-Injektion, während er für die Gruppe der Amphotericin-B-Emulsion nur auf 108,86% begrenzt blieb. Ähnliche Ergebnisse wurden für ALT und gesamtes Bilirubin beobachtet. Der Anstieg für die konventionelle Gruppe war im Vergleich zur Emulsion statistisch signifikant.
Die Nierenfunktionsparameter (Verweis auf 7) waren in der Gruppe der konventionellen Amphotericin-B-Injektion wesentlich gestört. Die Abweichung für die Amphotericin-B-Emulsion war wesentlich geringer als die für die Gruppe der konventionellen Amphotericin-B-Injektion.
Nephrotoxizität, die hauptsächliche Toxizität von Amphotericin B, resultiert aus der nichtselektiven zytotoxischen Wechselwirkung zwischen Amphotericin B der konventionellen Amphotericin-B-Injektion (enthält Natriumdeoxycholat) und Cholesterin von Säugetierzellen. Die Zytotoxizität für Säugetiere wird durch Einschließen von Amphotericin B in lipidbasierter Emulsionsformulierung abgemildert. Dies verändert die Affinität von Amphotericin B und verringert seinen selektiven Transfer zu Cholesterin-enthaltenden Säugetierzellen.
TABELLE 13. MITTLERE KÖRPERGEWICHTE BEI VERSCHIEDENEN DOSEN FÜR DIE EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIE IN HUNDEN
Die mit konventioneller Amphotericin-B-Injektion behandelte Gruppe zeigte eine größere Abnahme der Körpergewichte der Tiere im Vergleich zur Amphotericin-B-Emulsion (Verweis auf 8).
SCHLUSSFOLGERUNG
Amphotericin-B-Emulsion bietet einen wesentlichen Schutz gegen Hepatotoxizität und Nephrotoxizität im Vergleich zu konventioneller Amphotericin-B-Injektion.
Beispiel IX
Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde zur Bewertung der pharmakokinetischen Parameter in Kaninchen im Vergleich zur konventionellen Amphotericin-B-Injektion verwendet.
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Männliche Weiße Neuseeland-Kaninchen im Gewichtsbereich von 1,5-2,0 kg wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardnahrungsgemüse und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign: Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 3 Tieren, und zwar GRUPPE 1 und GRUPPE 2, eingeteilt. Die GRUPPEN 1 und 2 erhielten konventionelle Amphotericin-B-Injektion bzw. Amphotericin-B-Emulsion. Es wurden bei 5, 15, 30, 45 und 60 min und nach 1, 2, 3, 4, 5, 24 und 48 Stunden nach einzelner intravenöser Bolusdosis Blutproben entnommen. Die Proben wurden bei 3000-4000 rpm zur Abtrennung des Plasmas zentrifugiert. Das Plasma wurde bei -20°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Verabreichungsweg: über die Marginalvene des Ohrs von Kaninchen.
TABELLE 14. DOSEN VON AMPHOTERICIN-B-FORMULIERUNGEN FÜR PHARMAKOKINETISCHE STUDIEN IN KANINCHEN
Analyse des Amphotericin-B-Gehalts
Der Amphotericin-B-Gehalt im Plasma wurde durch Phasen-HPLC-Methode unter Verwendung einer C-18-Säule analysiert. Das Amphotericin B im Plasma wurde unter Verwendung von Dimethylsulfoxid und Acetonitril von HPLC-Qualität in einem Verhältnis von 1 : 3 : 1 extrahiert. Die Proben wurden dann bei 3000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde auf die Säule injiziert.
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden zum Vergleich der behandelten Gruppen durch den Student-t-Test analysiert.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 15: GIBT DIE PHARMAKOKINETISCHEN PARAMETER FÜR DIE 2 FORMULIERUNGEN AN.
Es besteht kein wesentlicher Unterschied bei C_max, T_max, T_1/2, Vd zwischen den zwei Formulierungen. Hinsichtlich Clearance wird die Emulsion aus dem Plasma mit einer wesentlich schnelleren Rate entfernt als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion (P < 0,05). Dies zeigt, dass die Verteilung der Emulsion in den Geweben schneller stattfindet als die der konventionellen Amphotericin-B-Injektion (Verweis auf 9).
Beispiel X
Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde für Organverteilungsstudien in Mäusen im Vergleich zur konventionellen Amphotericin-B-Injektion verwendet.
Die vorliegende Studie wurde mit den folgenden Zielen durchgeführt:

– das Muster von Organverteilung in Mäusen für die zwei Formulierungen aus Einzeldosisstudien einzuschätzen.
– das Muster von Organverteilung in Mäusen für die zwei Formulierungen aus Studien mit wiederholter Dosis zu bestimmen.

X-A) EINZELDOSISSTUDIE ZUR ORGANVERTEILUNG IN MÄUSEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Weibliche Schweizer Albinomäuse im Gewichtsbereich von 20-22 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Verabreichungsweg: intravenös
Studiendesign: Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 20 Tieren, und zwar GRUPPE 1 und GRUPPE 2, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt die konventionelle Amphotericin-B-Injektion in einer Dosis von 1 mg/kg und GRUPPE 2 erhielt Amphotericin-B-Emulsion in einer Dosis von 5 mg/kg. Jede Probenentnahme bestand aus 4 Mäusen. Organproben, und zwar Leber, Lunge, Nieren, Milz und das Gehirn, wurden am Ende der jeweiligen Zeitpunkte, d.h. 0,5, 1, 2, 4, 24 Std., herausseziert. Die Organe wurden sofort eingefroren, um jedwede enzymatischen Reaktionen zu stoppen. Die Organe wurden gewogen und es wurde 3-mal das Volumen von Wasser zugegeben. Dies wurde dann homogenisiert.
TABELLE 16. DOSEN VON KONVENTIONELLER AMPHOTERICIN-B-INJEKTION UND AMPHOTERICIN-B-EMULSION, DIE FÜR EINZELDOSISSTUDIEN ZUR ORGANVERTEILUNG IN MÄUSEN UNTERSUCHT WURDEN
Analyse des Amphotericin-B-Gehalts
Es wurde Methanol in einem Verhältnis von 3 : 1 zum Homogenat gegeben. Dies wurde dann bei einer hohen Geschwindigkeit von 13 000-14 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf die HPLC-Säule zur Analyse von Amphotericin B injiziert.
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden zum Vergleich der behandelten Gruppen durch den Student-t-Test analysiert.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 17: GIBT DIE PARAMETER DER ORGANVERTEILUNG FÜR DIE 2 FORMULIERUNGEN AN
Im Vergleich zur konventionellen Amphotericin-B-Injektion zeigt die Amphotericin-B-Emulsion hohe Spiegel in allen Organen, außer der Niere (Verweis auf 10a bis 10d). Höhere Werte der Halbwertszeit und niedrigere Clearance-Raten der Emulsion bestätigen weiter diese Daten. Es wurde ermittelt, dass somit die Aufnahme von Amphotericin B aus der Emulsion in die Organe größer ist als für die konventionelle Amphotericin-B-Injektion, was im Fall der Milz statistisch signifikant ist (P < 0,05).
Nephrotoxizität ist der Hauptnachteil, der mit Amphotericin-B-Therapie in Verbindung gebracht wird und tritt aufgrund der hohen Spiegel von Amphotericin B in der Niere auf. Aus AUC_(0-∞) wird es offensichtlich, dass die Emulsion wesentlich niedrigere Spiegel von Amphotericin B erreicht als die konventionelle Amphotericin-B-Injektion (P < 0,05). Die Emulsion wurde auch schneller aus den Nieren entfernt, was die geringe Toxizität und den höheren LD₅₀-Wert im Vergleich zur Formulierung von konventioneller Amphotericin-B-Injektion erklärt.
Trotz der sinkenden Plasmakonzentrationen stiegen die Spiegel in Leber und Milz weiter an. Ähnliche Beobachtungen wurden für Liposome berichtet, was andeutet, das liposomale Arzneimittel in retikuloendothelialen Geweben nicht in freiem Gleichgewicht mit dem Plasma stehen, wie die nicht-liposomalen Arzneimittel.
(Feilding, R. M. et al., 1998). Dies erklärt möglicherweise die hohe Retention von Amphotericin B in retikuloendothelialen Geweben im Fall der Emulsion im Vergleich zur konventionellen Amphotericin-B-Injektion.
X-B) STUDIE MIT WIEDERHOLTER DOSIS ZUR ORGANVERTEILUNG IN MÄUSEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Weibliche Schweizer Albinomäuse im Gewichtsbereich von 20-22 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Konventionelle Amphotericin-B-Injektion (5 mg/ml) wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Studiendesign:
Die Tiere wurden in 2 Gruppen von jeweils 24, GRUPPE 1 UND GRUPPE 2, eingeteilt. GRUPPE 1 erhielt die konventionelle Amphotericin-B- Injektion in einer Dosis von 1 mg/kg und GRUPPE 2 erhielt Amphotericin-B-Emulsion in einer Dosis von 5 mg/kg. Es wurden 12 Tiere für eine Dauer von 7 dosiert und die anderen 12 wurden für 14 Tage dosiert. Leber, Lunge, Niere und Milz wurden nach 6 Std. der letzten Dosis herausseziert. Die Organe wurden sofort eingefroren, um jedwede enzymatischen Reaktionen zu stoppen. Die Organe wurden gewogen und es wurde ein Wasseräquivalent zum 3-fachem Organgewicht zugegeben. Dies wurde dann homogenisiert.
Verabreichungsweg: intravenös
TABELLE 18. DOSEN VON KONVENTIONELLER AMPHOTERICIN-B-INJEKTION UND AMPHOTERICIN-B-EMULSION, DIE FÜR EINZELDOSISSTUDIEN ZUR ORGANVERTEILUNG IN MÄUSEN UNTERSUCHT WURDEN
Analyse des Amphotericin-B-Gehalts
Der Amphotericin-B-Gehalt im Plasma wurde durch die HPLC-Methode unter Verwendung einer C-18-Säule analysiert. Amphotericin B im Plasma wurde unter Verwendung von Methanol von HPLC-Qualität in einem Verhältnis von Plasma zu Methanol von 1 : 3 extrahiert. Die Proben wurden dann bei 3000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde auf die Säule injiziert.
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten wurden zum Vergleich der behandelten Gruppen durch den Student-t-Test analysiert.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TABELLE 19: GIBT DIE PARAMETER DER ORGANVERTEILUNG FÜR DIE 2 FORMULIERUNGEN AN
Es war interessant, zu beobachten, dass die Gewebekonzentrationen von der 7. bis 14. Dosis nicht wesentlich anstiegen (Verweis auf 11a und 11b), was mit der Literatur übereinstimmt (Olsen, S. J. et al., 1991). Trotz der erhöhten Amphotericin-B-Spiegel im Gewebe traten in der mit Amphotericin-B-Emulsion behandelten Gruppe keine Todesfälle auf. Im Gegensatz dazu, zeigte die konventionelle Amphotericin-B-Injektion während der Studiendauer Mortalität.
Es kann eingesehen werden, dass die Amphotericin-B-Spiegel in den Nieren für konventionelle Amphotericin-B-Injektion und die Emulsion die gleichen sind, obgleich bei der Nephrotoxizität ein gewaltiger Unterschied beobachtet wurde. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass es das Amphotericin B ist, das in den Organen bewertet wird, ohne Rücksicht darauf, ob es als ein Komplex mit den Lipiden oder als freies Arzneimittel vorliegt. Im Fall von konventioneller Amphotericin-B-Injektion liegt Amphotericin B vorwiegend in der freien Form vor und ist daher nephrotoxisch. Doch im Fall der lipidbasierten Emulsion liegt Amphotericin B möglicherweise als ein Komplex mit den Lipiden vor, der sein Toxizität nicht auf die Gewebe ausübt.
Amphotericin B, das ein amphiphiles Arzneimittel ist, liegt als lösliches Monomer oder als selbstassoziierte Oligomere vor und über der kritischen Mizellenkonzentration bildet es Mizellen. Jedwede Faktoren, die das Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Spezies von Amphotericin B in wässrigem Medium verändern, können seine gesamte Aktivität und Toxizität verändern. Tabosa Do Egito (1996) betrachten die Amphotericin-B-Emulsion, als ob sie als ein Reservoir der monomeren Form von Amphotericin B fungiert. Diese höchst stabile Formulierung setzt stetig nur begrenzte Mengen von freiem Amphotericin-B-Monomer frei. Diese Form kann wahrscheinlich nur zu Ergosterin der Pilzzellen binden und eine verminderte Wechselwirkung mit dem Cholesterin von Säugetierzellen aufweisen (Tabosa Egito et ad., 1996). Daher ist die Emulsion, obgleich sie ähnliche Spiegel wie die konventionelle Amphotericin-B-Injektion zeigt, nicht stark toxisch.
SCHLUSSFOLGERUNG
Amphotericin-B-Emulsion wurde mit dem folgenden Ziel formuliert:

1. das Sicherheitsprofil zu verbessern
2. es kostengünstig zu machen

Die Toxizitätsstudien zeigen, dass die Sicherheitsspanne der Emulsion tatsächlich eine Verbesserung im Vergleich zu konventioneller Amphotericin-B-Injektion darstellt. Dies kann der Form, in der die Emulsion sich seinen fungalen Zielzellen präsentiert, zugeschrieben werden. Konventionelle Amphotericin-B-Injektion setzt Amphotericin B in sehr großen Mengen frei und die so freigesetzten Monomer assoziieren zur Bildung von Oligomeren, die ebenso zu Säugetierzellen binden, was zu starker Toxizität fährt. Hingegen ist die Emulsion aufgrund von schneller Phagozytose durch das RES nicht fähig, derartige hohe Konzentrationen im Plasma zu erreichen, und zeigt eine langsame fortschreitende Freisetzung von Monomeren. Dies erklärt die selektive Wirkung der Emulsion auf die Pilzzellen und somit die geringe Toxizität (Tabosa Do Egito, E. S. et al., 1996). Die niedrigen Plasmaspiegel und die schnelle Verteilung von Amphotericin-B-Emulsion in die Organe ist ebenfalls ein Vorteil im Vergleich zur konventionellen Amphotericin-B-Injektion, hinsichtlich seines Zielpotenzials. Ferner ist Amphotericin-B-Emulsion ein kostengünstiges Produkt im Vergleich zu anderen lipidbasierten Formulierungen, wie die Zubereitungen von Lipidkomplexen & Liposomen.
Somit ist die Amphotericin-B-Emulsion der vorliegenden Erfindung ein vielversprechender Kandidat zur gezielten Therapie von Pilzinfektionen.
Beispiel XI
Amphotericin-B-Emulsion, die in Beispiel IV, Beispiel V und Beispiel VI hergestellt wurde, wurde in-vivo-Toxizitätsstudien in Mäusen unterzogen.
EINZELDOSIS-TOXIZITÄTSSTUDIE IN MÄUSEN
MATERIAL UND METHODE
Testsystem: Weibliche Schweizer Albinomäuse im Gewichtsbereich von 20-22 Gramm wurden von der Tierabteilung von Bharat Serums & Vaccines Ltd (BSVL) erhalten und für die Studie verwendet. Die Tiere wurden mit Standardfutter und Aquaguard^®-Wasser, ad libitum, versorgt.
Teststoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die in Beispiel IV, Beispiel V und Beispiel VI hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Vergleichsstoff: Amphotericin-B-Emulsion (5 mg/ml), die gemäß dem Verfahren und der Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurde, wurde intravenös als eine Bolusdosis verabreicht.
Alle Gruppen erhielten die Injektionen auf intravenösem Weg. Alle Tiere wurden für eine Dauer von 72 Stunden bezüglich irgendwelcher Anzeichen von klinischer Toxizität und bezüglich Mortalität beobachtet. Die prozentuale Mortalität wurde für alle Dosen berechnet.
Beobachtungen:
Die Gruppen, die Proben aus Beispiel IV, Beispiel V & Beispiel VI erhielten, entwickelten Symptome von Herztoxizität, wie zum Beispiel schwere Atemnot, lokale Reizung, Bauchschmerz und Ruhelosigkeit. Jedoch wurden diese toxischen Symptome nicht in der Gruppe beobachtet, die Proben erhielten, die durch das Verfahren und die Vorschrift von Beispiel I hergestellt wurden.
Die Vorteile der Erfindung:
Das Formulieren von Amphotericin B als strukturierte Emulsion von Öl-in-Wasser-Art zur parenteralen Verabreichung durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verringerte seine Toxizität beträchtlich und gewährleistete Sterilität ohne Veränderung seiner antifungalen Aktivität.
Amphotericin B, das in die ölige Phase der Emulsion, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eingeschlossen ist, bleibt während des gesamten Herstellungsverfahrens, einschließlich des Sterilisationsverfahrens des Autoklavierens und danach, bis zu seiner Haltbarkeitsdauer oder Verwendung, stabil.
Die durchschnittliche Öltröpfchengröße in der parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B strukturiert in einer Öl-in-Wasser-artigen Emulsion, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, wird im optimalen Bereich geregelt, sodass es bevorzugt im retikuloendothelialen System verteilt wird, was zu einer niedrigen Plasmakonzentration führt.

Claims

Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform mit einem LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen, die Folgendes umfasst a) ölige Phase in einer Menge von bis zu 30% w/v der Zusammensetzung, die aus pflanzlichen Ölen ausgewählt ist; b) Amphotericin B in einer Menge von 0,05% bis 1% w/v der Zusammensetzung, das in der öligen Phase dispergiert ist; c) Wässriges Phasenwasser; d) ein die Tonizität modifizierendes Mittel, das in der wässrigen Phase gelöst ist; und e) natürlichen Phosphatid-Emulgator in einer Menge von bis zu 3% w/v der Zusammensetzung, der in der wässrigen Phase dispergiert ist.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach Anspruch 1, worin Amphotericin B in einer Menge von 0,05% bis 0,5% w/v der Zusammensetzung, das in der öligen Phase dispergiert ist, vorliegt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach Anspruch 1 oder 2, worin die ölige Phase von 10% bis 20% w/v der Zusammensetzung beträgt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 1-3, worin das verwendete pflanzliche Öl Sojaöl, Sesamöl oder Saflordistelöl ist.
Im Autoklaven sterilisiere parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach Anspruch 4, worin das Öl Sojaöl ist, dessen Gehalt etwa 20% w/v der Zusammensetzung beträgt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 1-5, worin der Gehalt an Amphotericin B etwa 0,5% w/v der Zusammensetzung beträgt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 1-6, worin der natürliche Phosphatid-Emulgator ein gereinigtes Eiphosphatid ist.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in stukturierter Emulsionsform nach Anspruch 7, worin der Gehalt an gereinigtem Eiphosphatid etwa 1,2% w/v der Zusammensetzung beträgt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in stukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 1-8, worin der verwendete Modifikator der Tonizität Glycerin, Mannitol oder Dextrose oder eine Kombination davon ist.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach Anspruch 9, worin der Modifikator der Tonizität Glycerin ist, dessen Gehalt etwa 2,25% w/v der Zusammensetzung beträgt.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 1-10, worin die Emulsion Folgendes umfasst: Amphotericin B in einer Menge von 0,5% w/v der Zusammensetzung, dass die ölige Phase Sojaöl in einer Menge von 20% w/v der Zusammensetzung ist, der Emulgator gereinigtes Eiphosphatid in einer Menge von 1,2% w/v der Zusammensetzung ist, das die Tonizität modifizierende Mittel Glycerin in einer Menge von 2,25% w/v der Zusammensetzung ist und Wasser q.s. bis 100 Volumen-% der Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung einer im Autoklaven sterilisierten parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform mit einem LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen nach einem der Ansprüche 1-11, das Folgendes umfasst: i) Dispergieren von Amphotericin B in öliger Phase; ii) Auflösen des die Tonizität modifizierenden Mittels in wassrigem Phasenwasser; iii) Dispergieren des Emulgierungsmittels in der wässrigen Phase; iv) Einstellen des pH der wässrigen Phase auf etwa 8-11; v) Zugeben der öligen Phase zur wässrigen Phase unter Rühren, um eine grob strukturierte Emulsion zu erhalten; vi) Homogenisieren der grob stukturierten Emulsion auf eine durchschnittliche Partikelgröße von unter 2 μm; vii) Filtrieren, Füllen der homogenisierten strukturierten Emulsion unter Stickstoff in Glasgefäße; Schließen der Glasgefäße; Abdichten der geschlossenen Glasgefäße; und Sterilisieren der abgedichteten gefüllten Gefäße durch Autoklavieren.
Verfahren zur Herstellung einer im Autoklaven sterilisierten parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in stukturierter Emulsionsform nach Anspruch 12, worin die ölige Phase oder die wässrige Phase oder beide Phasen während des Emulgierungsverfahrens bei einer Temperatur von bis zu 75°C gehalten werden.
Verfahren zur Herstellung einer im Autoklaven sterilisierten parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 12 oder 13, worin die Natriumhydroxid-Lösung in Wasser zur Einstellung des pH der wässrigen Phase, die den Emulgator Eiphosphatid enthält, auf zwischen 8 und 11 zugegeben wird.
Verfahren zur Herstellung einer im Autoklaven sterilisierten parenteralen Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform nach einem der Ansprüche 12-14, das Folgendes umfasst: Dispergieren von Amphotericin B in Sojaöl; Zubereiten der wässrigen Phase durch Zugeben von Glycerin zu Wasser; gefolgt vom Dispergieren des gereinigten Eiphosphatids in der wässrigen Phase; Einstellen des pH der wässrigen Phase auf 10,8; Zugeben des Sojaöls, das das darin dispergierte Amphotericin B enthält, zur wässrigen Phase zur wässrigen Phase, die das dann dispergierte Eiphosphatid enthält, unter Rühren, um eine grob strukturierte Emulsion zu erhalten; Homogenisieren der grob strukturierten Emulsion auf eine durchschnittliche Partikelgröße von unter 2 μm; Filtrieren durch einen 2 μm-Filter, Füllen der homogenisierten strukturierten Emulsion unter Stickstoff in Glasgefäße, Schließen der Glasgefäße, Abdichten der geschlossenen Glasgefäße und Sterilisieren der abgedichteten gefüllten Gefäße durch Autoklavieren.
Im Autoklaven sterilisierte parenterale Zusammensetzung von ölbeschichtetem Amphotericin B in strukturierter Emulsionsform mit einem LD₅₀ von mindestens 400 mg/kg in Mäusen nach einem der Ansprüche 1-11, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 12-15 hergestellt wird.