DE3751258T2

DE3751258T2 - Mikrokristalle, die eine aktive Substanz mit phospholipidischer Affinität enthalten und mindestens ein Phospholipid, Verfahren zur Herstellung.

Info

Publication number: DE3751258T2
Application number: DE3751258T
Authority: DE
Inventors: Roger Baurain; Andre Trouet
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1986-12-05
Filing date: 1987-12-03
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2007-12-04
Also published as: EP0270460B1; ATE121301T1; US4973465A; JPS63208515A; EP0270460A2; HK1007502A1; DE3751258D1; JP2852421B2; EP0270460A3; CA1338736C; ES2070827T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen, sogenannte Mikrokristalle. Es handelt sich bei den Mikrokristallen um eine in Wasser unlösliche Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide und mindestens ein Phospholipid aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokristallen einer in Wasser unlöslichen Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide aufweist. Sie betrifft die erhaltenen Mikrokristalle sowie die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:
a) man verdampft das oder die organische(n) Lösungsmittel einer Lösung von Phospholipiden und der genannten Substanz, und
b) man bringt den nach dem Verdampfen des oder der Lösungsmittel(s) erhaltenen Film in einer wäßrigen Lösung nach kräftigem Rühren wieder in Suspension.
In der vorliegenden Anmeldung versteht man unter "Mikrokristallen" die lipidischen Mikropartikel mit kristallinem Aussehen, erhalten insbesondere durch das obengenannte oder ein davon abgeleitetes Verfahren, mit der Maßgabe, daß die kristalline Struktur genau genommen nicht notwendigerweise erhalten wird.
In diesem Verfahren muß man unter "in Wasser unlösliche Substanz" eine Substanz verstehen, die wenig oder nicht in Wasser löslich ist und unter "Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide aufweist" eine chemische Verbindung, die fähig ist, mit den Phospholipiden auf physikalischem Wege zusammenzuwirken. Im folgenden werden dafür Beispiele angegeben.
Der Artikel in Journal of Pharmaceutical Sciences, vol.73 (1984) No.6 beschreibt Mikrokristalle von Griseofulvin und Dimyristoylphosphatidylcholin mit geringer Stabilität. Außerdem wird keine therapeutisch vorteilhafte Anwendung beschrieben.
Die gemäß der Erfindung erhaltenen Mikrokristalle bieten hauptsächlich den Vorteil, eine stabile Suspension von Mikrokristallen einer außerdem unlöslichen Substanz in wäßriger Lösung zu erhalten, was ermöglicht, die genannte Substanz zu verabreichen, wenn es sich um ein Medikament in injizierbarer oder versprühbarer Form handelt. Im Vergleich zu den Liposomen sind die erfindungsgemäßen Präparationen in Form von Mikrokristallen zunächst einfacher und ökonomischer in dem Maße herzustellen, wo die Anwesenheit von Bestandteilen in verringerter Anzahl vorliegt. Sie sind weitaus stabiler, während die Instabilität der Liposome sogar beträchtlich die Anwendungsbedingungen begrenzt.
Außerdem ergeben die Präparationen von Mikrokristallen, vermutlich wegen eines insbesondere gegenüber Makrophagen gesteigerten Steuerungseffektes einerseits und eines Effektes zur progressiven Freisetzung der inkorporierten aktiven Substanz andererseits, deutlich vorteilhaftere Resultate der therapeutischen Aktivität und ebenfalls der Toxizität als die Bläschen des Liposom-Typs.
Im allgemeinen wird man gemäß der Erfindung als Phospholipid vorzugsweise Phosphatidylcholin verwenden. Dieses kann jedoch gegebenenfalls in Kombination mit anderen bekannten Elementen verwendet werden, beispielsweise bei der Herstellung der Liposome, nämlich der Sterole wie Cholesterol oder auch Stearylamin.
Wenn es sich jedoch um die Bildung von Mikrokristallen handelt, besitzt das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/Substanz) einen bestimmenden Einfluß, insbesondere gegenüber dem molaren Verhältnis (Phospholipid(e)/Sterol(e)), das darauf keinen Einfluß hat.
In einigen Fällen kann es jedoch von Bedeutung sein, ein oder mehrere Sterole zuzusetzen, um die Aktivität der einzubringenden, unlöslichen aktiven Substanz zu verstärken.
Das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/Substanz) soll unterhalb von der Grenze liegen, über der man nur Bläschen vom Liposom-Typ beobachtet.
Wenn nämlich das in dem Verfahren der Erfindung eingesetzte molare Verhältnis (Phospholipid(e)/Substanz) zu hoch ist, insbesondere höher als 10 beispielsweise, so beobachtet man im wesentlichen die Bildung von lipidischen Bläschen, die den Liposomen ähnlich sehen.
Wenn demgegenüber das molare Verhältnis niedriger oder gleich 2 ist, vorzugsweise in der Nähe von 1, beobachtet man ein spezifisches Zusammenwirken mit der homogenen Produktion von Mikrokristallen, deren mittlere Größe zwischen 0,1 um und 1 um liegt.
Bei den dazwischenliegenden Verhältnissen werden Mischungen von lipidischen Bläschen und Mikrokristallen erhalten.
Das eventuelle molare Verhältnis zwischen dem(n) Phospholipid(en) und einem oder mehreren Sterol(en), wie Cholesterol, hat keinen bestimmenden Einfluß auf die Bildung von Mikrokristallen. Jedoch kann es in einigen Fällen von Bedeutung sein, ein oder mehrere Sterol(e) hinzuzusetzen, um die Aktivität der aktiven Substanz zu verstärken.
Gemäß einer Variante des Verfahrens unterteilt sich die Stufe a) wie folgt:
a&sub1;) man verdampft das (die) Lösungsmittel der Lösung des (der) Phospholipide (s),
a&sub2;) man bringt den nach dem Verdampfen erhaltenen lipidischen Film wieder in Lösung, indem man eine Lösung der genannten Substanz hinzugibt,
a&sub3;) man verdampft von neuem das (die) Lösungsmittel der Lösung von Phospholipid(en) und der genannten Substanz.
In dem Verfahren liegt das molare Verhältnis zwischen dem oder den Phospholipid(en) und der Substanz zwischen 0,1 und 2, und vorzugsweise zwischen 0,8 und 1,2, oder auch in der Nähe von 1.
Wenn man ein Sterol mit der zu behandelnden Substanz assoziiert, liegt das molare Verhältnis in dem Verfahren zwischen dem oder den Phospholipid(en) und dem oder den Sterol(en) vorzugsweise zwischen 1 und 2.
Um den in Stufe b) erhaltenen Film wieder in Suspension zu bringen, können verschiedene Techniken durchgeführt werden, aber es interessant, die Behandlung mit Ultraschall anzuwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die verwendeten Lösungsmittel gebräuchliche organische Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methanol, oder auch Mischungen von Lösungsmitteln, wie beispielsweise von Chloroform und Methanol.
Beispielsweise ist die Lösung der Phospholipide eine Lösung von Chloroform und die Lösung der in Frage kommenden Substanz eine Lösung einer Mischung von Chloroform/Methanol. Die eventuelle Lösung von Sterol kann eine Lösung von Methanol sein.
Gemäß einer anderen Charakteristik des Verfahrens werden die Mikrokristalle durch Zentrifugieren und Waschen mit destilliertem Wasser oder mit einer wäßrigen Lösung gereinigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft beispielsweise Mikrokristalle, die als aktive Substanz Ginkgolide enthalten.
Die bekanntesten Ginkgolide sind die Ginkgolide A, B, C und M, die in der Therapeutik zur Behandlung und Vorbeugung von durch PAF-Acether hervorgerufenen Krankheiten verwendet werden, wie in dem belgischen Patent 901915 beschrieben ist. Unter diesen Verbindungen hat sich das Ginkgolid B als besonders interessant erwiesen.
Das Ginkgolid B ist sehr wenig löslich, was einen Nachteil bildet, wenn man es in verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen einbringen will, insbesondere in injizierbare Zusammensetzungen. Außerdem ist interessant, bei der Verfügbarkeit der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die fähig sind, die aktive Substanz bis in die Bereiche der Wirksamkeit zu begleiten und auf diese Weise deren Spezifität zu steigern, eine so hoch als mögliche Verringerung unerwünschter Wirkungen zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die vorstehend dargelegten Probleme mit der neuen kristallinen Form, den sogenannten "Mikrokristallen", zu lösen.
In dem besonders erörterten Fall werden die unlöslichen Substanzen gemäß der Erfindung unter den Ginkgoliden und ihren Derivaten ausgewählt, und ganz besonders wird es sich um das Ginkgolid B handeln. Obwohl man unter den Ginkgoliden das Ginkgolid B bevorzugt, ist es ebenfalls möglich die Derivate zu verwenden, wie die Monoacetate, die Triacetate, die Tetrahydrooder die acetylierten Derivate.
Die Ginkgolide sind Substanzen, die zur Behandlung von Krankheiten herangezogen werden können, die durch den Acether des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" hervorgerufen werden.
Der "Faktor der Aktivierung der Plättchen" (PAF-Acether) ist ein Phospholipid, das die Ursache für zahlreiche Erkrankungen beim Menschen oder beim Tier bilden kann. Der Acether des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" ruft die Aggregation der Plättchen hervor sowie die Freisetzung ihres baso-aktiven Amins. Die Freisetzung wird beim Menschen und beim Tier unter der Wirkung verschiedener Typen von Schocks hervorgerufen, wie den anaphylaktischen Schocks, den Verbrennungen, den septischen Schocks, den Schocks durch Strahlungseinwirkung und den Traumen. Die Freisetzung führt infolgedessen zu einer Unterdrückung der Immunreaktionen, gefolgt von der Erschöpfung der Abwehrmittel des Organismus. Seit seiner Identifizierung [1-O-Alkyl-2-(R)- acetyl-glycero-3-phosphorylcholin] sind nämlich seine Totalsynthese und die Beweise für seine Beteiligung an einigen physiopathologischen Prozessen verdichtet worden, hauptsächlich bei der pulmonären Anaphylaxie und bei verschiedenen Schockzuständen.
Man kennt zahlreiche spezifische Antagonisten von PAF- Acether und unterscheidet dabei hauptsächlich zwei Reihen:
1) Produkte, die eine analoge Struktur zu der des PAF-Acether aufweisen,
2) natürliche Produkte mit spezifischer antagonistischer Aktivität.
In dieser zweiten Kategorie findet man einerseits die Lignane und Neolignane, wie Kadsurenon (Piper futokadsurae), Magnosalicin (Magnolia salicifolia), die Nectandrine A und B (Nectandra rigida) und die Synthese-Dinorlignane L-652.731, und andererseits die Terpenoide, isoliert aus Ginkgo biloba (Ginkgolide).
Jedoch weisen diese antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" einen erheblichen Nachteil auf, der darin besteht, daß sie sehr wenig löslich sind, was ihre Anwendung daher quasi gegenstandslos macht, denn in der Praxis ist sie einer Verabreichung durch Perfusion untergeordnet.
In ganz und gar überraschender Weise wurde gemäß der Erfindung entdeckt, daß die Ginkgolide injizierbar gemacht werden können, indem sie mit den Phospholipiden in Form von Mikrokristallen zusammenwirken.
Dasselbe gilt für die anderen antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen", hydrophobe Substanzen, die mit den Phospholipiden zusammenwirken. Die Mehrzahl dieser Substanzen erweist sich nämlich einerseits als hydrophob, und andererseits besitzen sie ebenfalls eine Affinität für die Phospholipide und sind daher mit den Phospholipiden zur Bildung von Mikrokristallen befähigt, wobei diese Mikrokristalle eine stabile Mikrosuspension in wäßriger Lösung bilden.
Die Affinität der antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" für die Phospholipide ist ohne Zweifel auf ihre Inhibitorwirkung zu PAF-Acether zurückzuführen, der ebenfalls wie bereits betrachtet, eine phospholipidische Struktur aufweist. Wie durch die Anmelderin gefunden wurde, eröffnet diese Affinität die Möglichkeit, diese Substanzen durch die Herstellung von Mikrokristallen zu injizieren. Es ist jedoch außerdem möglich, daß die Ahnlichkeit der phospholipidischen Strukturen der gebildeten Mikrokristalle einerseits und des PAF-Acethers andererseits, ebenfalls zu einer größeren therapeutischen Aktivität der pharmazeutischen Zusammensetzungen beiträgt, die diese Mikrokristalle der antagonistischen Substanzen des PAF-Acethers enthalten.
Gemäß einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung kann die in Frage kommende aktive Substanz daher unter den antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" ausgewählt werden.
In diesem Verfahren muß man unter antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" eine Substanz verstehen, die es ermöglicht, die durch den Acether des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" hervorgerufenen Erkrankungen wirksam zu behandeln.
Ganz besonders können gemäß der vorliegenden Erfindung die antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" unter den Syntheseprodukten ausgewählt werden, die eine analoge Struktur zu der des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" aufweisen, oder unter natürlichen Produkten wie den Terpenoiden, den Lignanen und den Neolignanen.
Insbesondere bei den Lignanen und Neolignanen werden die antagonistischen Substanzen des Acethers des "Faktors der Aktivierung der Plättchen" unter Kadsurenon, Magnosalicin, den Nectandrinen A und B und Synthese-Dinorlignan L-652.731 ausgewählt.
Unter den Syntheseprodukten kann man die Derivate von Canthen 5, 6 nennen.
Gemäß einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung kann die in Frage kommende aktive Substanz unter Amphotericin B und seinen Derivaten ausgewählt werden, die eine antifungische Wirkung besitzen. Eine Beschreibung von einigen dieser Verbindungen kann in der Literatur gefunden werden [1].
Das Amphotericin B und seine Derivate, insbesondere Aminoacyl-Derivate, sind nach wie vor die Medikamente der Wahl bei der Behandlung von zahlreichen hartnäckigen fungischen Infektionen, trotz ihrer ernstzunehmenden Toxizität und den beträchtlichen schädlichen Nebenwirkungen.
Es wurde im Hinblick auf die Verringerung der Toxizität und die Steigerung der Aktivität von Amphotericin B bereits vorgeschlagen, dieses in Liposomen zu verkapseln. Jedoch sind die zu diesem Gesichtspunkt erhaltenen Resultate wenn auch positiv, so doch nicht befriedigend.
Die Mikrokristalle von Amphotericin B oder seinen Derivaten ermöglichen, diese Nachteile der beträchtlichen Toxizität unter Erhöhung der antifungischen Aktivität der genannten Substanzen in deutlich wirksamerer Weise als die Liposome zu beseitigen, vermutlich unter anderem wegen eines Steuerungseffektes der Substanz gegenüber den Zielzellen wie Makrophagen, sowie eines Effektes zur progressiven Freisetzung der verbesserten aktiven Substanz. Außerdem ist das Verfahren zur Herstellung der Mikrokristalle im allgemeinen einfacher zu realisieren als die Verkapselung in den Liposomen und die erhaltenen Präparate sind stabiler.
Die Herstellung von Mikrokristallen ermöglicht ebenfalls, das Amphotericin B ohne Verwendung von Deoxycholat, das wie in Fungizon toxisch ist, zu injizieren.
Das Amphotericin besitzt eine Affinität für die Sterole, deshalb sind in einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung dem Amphotericin B oder einem seiner Derivate Sterol(e), insbesondere Cholesterol (Ch) oder Ergosterol, zugesetzt.
Wenn die in Frage kommende Substanz ein Anti-PAF-Acethermittel ist, so bringt man in der Stufe b) des Verfahrens in vorteilhafter Weise den nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Film in einer Lösung in Suspension, die auf einen pH- Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise auf pH 5,9, gepuffert ist, beispielsweise in einem Acetat- oder Phosphatpuffer.
Wenn in der Stufe b) des Verfahrens die Substanz Amphotericin B ist, insbesondere in Abwesenheit von Sterol, so ist die wäßrige Lösung beispielsweise eine Lösung von NaCl. In Anwesenheit von Sterol kann die wäßrige Lösung der Stufe b) des Verfahrens destilliertes Wasser oder NaCl sein. So werden in vorteilhafter Weise die Mikrokristalle im Anschluß an die Stufe b) des Verfahrens durch Zentrifugieren und Waschen in der wäßrigen Lösung der Stufe b) gereinigt.
Man kann ebenfalls vorteilhafterweise, besonders wenn die in Frage kommende Substanz Amphotericin B ist, als wäßrige Lösung die Lösungen von Sacchariden, beispielsweise von Lactose oder auch Glucose, insbesondere 0,1 M Lösungen, verwenden. Die erhaltenen Mikrokristalle können unter diesen Bedingungen lyophilisiert werden. Darin besteht eine Möglichkeit zur Konservierung über längere Zeit.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls die erhaltenen Mikrokristalle und insbesondere die Mikrokristall-Präparate zum Gegenstand, die lyophilisiert werden können.
Wenn es sich um Mikrokristalle einer in Wasser unlöslichen Substanz handelt, die eine Affinität für die Phospholipide und mindestens ein Phospholipid aufweisen, so beträgt das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/unlösliche Substanz) unterhalb von oder gleich 2, und liegt insbesondere zwischen 0,8 und 1,4, oder auch in der Nähe von 1.
Diese Mikrokristalle besitzen eine Größe zwischen 0,1 um und 2 um, und ganz besonders in der Nähe von 500 nm.
Die Mikrokristalle gemäß der Erfindung können beispielsweise eine unlösliche Substanz umfassen, ausgewählt unter den Ginkgoliden und ihren Derivaten, und ein Phospholipid, das Phosphatidylcholin oder eines seiner Derivate sein kann.
Beispielsweise kann man Mikrokristalle nennen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Ginkgolid B und Phosphatidylcholin in einem etwa äquimolaren Verhältnis umfassen.
Allgemeiner gesagt hat die Erfindung Mikrokristalle zum Gegenstand, die ein Anti-PAF-Acether-Mittel und ein oder mehrere Phospholipid(e) vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von etwa 1 umfassen.
Gemäß einem anderen Beispiel hat die vorliegende Erfindung Mikrokristalle zum Gegenstand, die Amphotericin B oder eines seiner antifungischen Derivate umfassen.
In einer besonderen Ausführungsform umfassen diese Mikrokristalle Amphotericin B oder eines seiner Derivate, dem gegebenenfalls Sterol(e) und Phosphatidylcholin zugesetzt werden.
Beispielsweise enthalten diese Mikrokristalle Amphotericin B und Phosphatidylcholin in einem molaren Verhältnis von etwa 1.
Wenn man vom Standpunkt des molaren Verhältnisses der in die Mikrokristalle eingebrachten Bestandteile aus ein Sterol mit der aktiven Substanz assoziiert, so liegt das molare Verhältnis (Phospholipid(e) /Sterol (e)+Substanz) zwischen 0,8 und 1,4 oder auch bei etwa 1.
Man kann daher insbesondere das molare Verhältnis (Phosphatidylcholin/Cholesterol/Amphotericin B) von 4/2/1 nennen (das ist ein globales molares Verhältnis zwischen dem Phospholipid und der zu behandelnden aktiven Substanz, der Sterol (e) zugesetzt ist (sind), von 4/3).
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zum Gegenstand, die als Wirkstoffe Mikrokristalle der vorliegenden Erfindung umfassen.
Vorzugsweise werden diese pharmazeutischen Zusammensetzungen in injizierbarer oder versprühbarer Form oder auch in lyophilisierter Form konditioniert.
Weitere Charakteristiken und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in Lichte der detaillierten Beschreibung hervortreten, die in Form von Beispielen folgt.

BEISPIEL 1

AUSARBEITUNG VERABREICHBARER FORMEN VON GINKGOLID B

Die Ginkgolide A, B und C sind aus Blättern von Ginkgo biloba isolierte Terpene, die eine antagonistische Aktivität gegenüber dem Acether des Faktors der Aktivierung der Plättchen besitzen, einem Phospholipid, das bei inflammatorischen Reaktionen und der direkten Hypersensibilität einbezogen ist (beispielsweise Plättchen-Aggregation, Bronchialspasmen u.a.).
Die wirksamste Verbindung, das Ginkgolid B, hat eine begrenzte Löslichkeit in Wasser von 100 ug/ml. Demgegenüber erfordert die Behandlung oder die Vorbeugung von Erkrankungen, die von dem Acether des Faktors der Aktivierung der Plättchen hervorgerufen werden, die Verabreichung von 1 bis 50 mg Ginkgolid pro kg, das sind bei einem Menschen von 70 kg zwischen 70 und 3500 mg Ginkgolid B.
Es würde sich daher das Problem einer verabreichbaren Form von Ginkgolid B stellen. Das Molekül ist sehr hydrophob und man hat zuerst daran gedacht, das Ginkgolid B mit lipidischen Bläschen (Liposomen) zu umhüllen. Später wurde eine Methode zur Herstellung von Mikrokristallen von Ginkgolid B entwickelt, assoziiert mit Phosphatidylcholin, die die besten Resultate ergibt.

A) INKORPORATION IN DIE LIPOSOME

Es wurde zuerst eine Inkorporation in multilamellare Liposome gewählt, zusammengesetzt aus Phosphatidylcholin (PC), Cholesterol (Ch) und Stearylamin (SA)
Die Liposome wurden bei pH 7,4 und anschließend bei einem leicht sauren pH hergestellt.

1. Herstellung der Liposome

Die Ginkgolid B enthaltenden multilamellaren Liposome wurden wie folgt hergestellt.
Die Lipide: 50 uMol (39,25 mg) Phosphatidylcholin (PC), 37,5 uMol (14,51 mg) Cholesterol (Ch) und 12,5 uMol (3,37 mg) Stearylamin (SA) werden in 10 ml Chloroform/Methanol (4/1, Vol.) in einem Kolben von 500 ml gelöst. Anschließend wird das in Methanol gelöste Ginkgolid B zugesetzt (0,86 bis 4,25 mg, das sind 2 bis 10 uMol) und das Lösungsmittel unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von 30 ºC verdampft. Der Film wird wieder in 10 ml Chloroform aufgenommen und nochmals eingedampft, um in dem Kolben einen gleichmäßigen, lipidischen Film zu erhalten.
Die multilamellaren Liposome (MLV) werden durch Zugabe von 4 ml 0,15 M Phosphatpuffer (pH 7,4) in NaCl und kräftigen Rühren mit dem Vortex innerhalb von 5 Minuten gebildet, wonach man sie 16 Stunden lang unter Stickstoff stehenläßt.
Die Wirksamkeit der Inkorporation von Ginkgolid B in die Liposome MLV hängt von der eingesetzten Menge an Ginkgolid B ab und erreicht bei pH 7,4 ein Maximum von 64 %.
Eine Untersuchung der Stabilität dieser Ginkgolid B enthaltenden Liposome zeigt, daß man bei jedem Waschen des MLV bis zu etwa 100 ug Ginkgolid B verliert.

2. Bei pH 6,5 hergestellte Liposome

Das Ginkgolid B wurde in die Liposome MLV, zusammengesetzt aus Phosphatidylcholin, Cholesterol und Stearylamin (4:3:1) bei pH 6,5 (0,15 M Phosphatpuffer) gemäß der gleichen Prozedur inkorporiert, wie bei pH 7,4, jedoch unter Erhöhung der in den Lipiden anwesenden Ginkgolidmenge. Die Resultate zeigen, daß der Prozentsatz der Inkorporation 87 % erreicht, das ist 1 Molekül Ginkgolid B pro 4,4 Moleküle Phosphatidylcholin.

3. Bei pH 5,9 hergestellte Liposome

Das Ginkgolid B wurde in die Liposome MLV bei pH 5,9 gemäß der gleichen Prozedur inkorporiert, wie bei pH 7,4. Die Resultate zeigen, daß der Prozentsatz der Inkorporation noch weiter erhöht ist, das ist 1 Molekül G-B pro 2,8 Moleküle PC. Die beste Inkorporation bei pH 5,9 erklärt sich ohne Zweifel durch die größte Stabilität des Ginkgolid B bei diesem pH-Wert. Die Öffnung des Lactonringes bei neutralem oder alkalischen pH-Wert, die zu hydrophileren Produkten führt, ist bekannt. Die Stabilität der Liposome ist jedoch nicht verbessert.

B) HERSTELLUNG DER MIKROKRISTALLE VON GINKGOLID B

Zusätzlich zu den Liposomen beobachtet man die Anwesenheit von stabilen Mikrokristallen in einer Präparation, deren molares Verhältnis PC/GB 1,54 beträgt.
Die Beobachtung von Ginkgolid B enthaltenden Mikrokristallen anstelle von Liposomen hat dazu geführt, die Bedingungen für ihr maximales Erhalten zu untersuchen. Zuerst wurde der Einfluß der lipidischen Zusammensetzung der Liposome und der des Verhältnisses zwischen der Menge an Phosphatidylcholin und Ginkgolid B auf ihre Entstehung analysiert.

1. Ausgehend von PC, Ch und SA erhaltene Mikrokristalle

In einem ersten Schritt wurden die Verhältnisse von Phosphatidylcholin (PC), Cholesterol (Ch) und Stearylamin (SA) variiert. Jedoch sind die molaren Verhältnisse PC/GB nicht gleichartig und es geht aus den in der nachstehenden Tabelle I aufgeführten Resultaten hervor, daß das Verhältnis zwischen Phosphatidylcholin und Cholesterol keinen bestimmenden Einfluß auf die Bildung der Mikrokristalle hat. Demgegenüber ist das Verhältnis PC/GB von Bedeutung, und es wurde daher in einem zweiten Schritt untersucht.
Es wurden Präparate des Typs "Liposom", zusammengesetzt aus PC:Ch:SA in einem Verhältnis von 5:4:1 mit einem Verhältnis PC/GB von 7,5 und mehr erhalten (Herstellung E-31) . Die Untersuchung in der optischen Phasenkontrast-Mikroskopie zeigt, daß die Präparation nach Ultraschall-Behandlung im wesentlichen aus Liposomen mit wenig Mikrokristallen der gleichen Größe, wie sie die Liposome besitzen, besteht.
Der Einfluß des Verhältnisses PC/GB auf die Bildung von Ginkgolid B enthaltenden Mikrokristallen ist detailliert in der nachstehenden Tabelle II für lipidische Mischungen beschrieben, die aus PC:Ch:SA in einem molaren Verhältnis von 4:3:1 zusammengesetzt sind. Es geht daraus hervor, daß man in dem Fall, wo das Verhältnis PC/GB höher als 7,5 beträgt, im wesentlichen die Bildung von lipidischen Bläschen beobachtet, die den Liposomen ähneln, während man dann, wenn das molare Verhältnis unterhalb von oder gleich 2 beträgt, oder vorzugsweise in der Nähe von 1 liegt, hauptsächlich Mikrokristalle beobachtet, deren mittlere Größe zwischen 0,2 und 0,7 um beträgt. Für dazwischenliegende Verhältnisse von PC/GB werden Mischungen von Liposomen und Mikrokristallen beobachtet.
Diese Mikrokristalle sind weitaus kleiner als die durch Behandlung von Ginkgolid B allein unter den gleichen Bedingungen erhaltenen.

2. Toxizität

Es wurden aliquote Anteile der Präparationen E-31 (Liposome) und E-34 (Mikrokristalle) für eine Untersuchung der akuten Toxizität bei der Maus konserviert.
Die Präparation E-31 (Liposome), injiziert i.v. an Mäuse in einer Dosierung von B,1 und 25,9 mg/kg, ruft einen Gewichtsverlust von jeweils 1,8 und 7,1 % nach 12 Tagen hervor. Demgegenüber ist die Präparation E-34 (Mikrokristalle) nur in einer Dosierung von 48,9 mg/kg toxisch (gestorbene Mäuse 2 Stunden nach der Injektion i.v.), während bei 21,8 mg/kg keine Toxizität beobachtet wird. Demgegenüber beobachtet man einen Gewinn an Gewicht von 24 % nach 12 Tagen.

BEISPIEL 2

HERSTELLUNG VON MIKROKRISTALLEN VON GINKGOLID B DURCH BEVORZUGTES ZUSAMMENWIRKEN MIT PHOSPHATIDYLCHOLIN

Das Erhalten von Mikrokristallen durch Zusammenwirken von Ginkgolid B und den üblichen zur Herstellung von Liposomen verwendeten Bestandteilen hat jedesmal zum Weglassen von einem der Bestandteile geführt, wodurch eine einfachere Herstellung ermöglicht wurde. Es scheint, daß das Phosphatidylcholin wesentlich ist, aber daß die Anwesenheit von Cholesterol und Stearylamin nicht unbedingt für das Erhalten von Mikrokristallen, wo man eine große Einfachheit des Verfahrens wünscht, erforderlich ist.
Wenn man Mikrokristalle mit einem molaren Verhältnis PC/GB von 1,0 ohne Cholesterol herstellt, erhält man von der Größe her kleine Mikrokristalle und homogene Formen. Die in der gleichen Weise ausgehend von PC und Ch ohne SA und mit einem molaren Verhältnis PC/GB von 1,0 hergestellten Mikrokristalle besitzen die Tendenz, sich zusammenzuballen und ihre mittlere Größe liegt oberhalb von 4 um.

1. Mikrokristalle PC:GB

Wenn man schließlich das Cholesterol und das Stearylamin wegläßt, verbleiben nur Phosphatidylcholin und Ginkgolid B. Wenn das molare Verhältnis PC/GB unterhalb von oder gleich 2 beträgt, erhält man nur Mikrokristalle.
Wenn das molare Verhältnis PC/GB über 2 liegt, so beobachtet man in dem Präparat, wie in der nachfolgenden Tabelle III gezeigt, die Anwesenheit von lipidischen Mikrobläschen ("Liposomen"), deren mittlere Größe höher als 1 um beträgt. Wenn das molare Verhältnis PC/GB unterhalb von 1 liegt, wird eine Population von im Hinblick auf Größe und Form heterogenen Mikrokristallen beobachtet, deren mittlere Größe jedoch über 1 um beträgt.
Bei einem äquimolaren Verhältnis PC/GB werden kleinere Mikrokristalle beobachtet, mit einer mittleren Größe zwischen 0,2 und 0,7 um. Ihre Bildung beruht auf einem spezifischen Zusammenwirken zwischen dem Ginkgolid B und dem Phosphatidylcholin.

Herstellung von Mikrokristallen bei pH 5,9 (E-35)

Die Ginkgolid B (GB) enthaltenden Mikrokristalle werden ausgehend von 0,10 mMol PC und 0,10 mMol Ginkgolid B hergestellt.

a) Herstellung

Der lipidische Film wird in einem Kolben von 500 ml gebildet, indem man 78,5 mg PC ins 10 ml Chloroform/Methanol (4/1, Vol.) und 42,5 mg Ginkgolid B in 50 ml Methanol auflöst und das Lösungsmittel unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von 30 ºC verdampft.
Die Mikrokristalle werden durch Zugabe von 50 ml 0,15 M Acetatpuffer pH 5,9 und Behandlung 5 Minuten lang bei 100 W in einem Ultraschall-Bad gebildet. Die Mikrokristalle GB:PC werden unter Stickstoff bei 4 ºC aufbewahrt.

b) Reinigung

Die Präparation der Mikrokristalle wird 15 Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert und die Mikrokristalle zweimal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Die Mikrokristalle in Wasser besitzen das gleiche mikroskopische Aussehen wie die in dem Acetatpuffer bei pH 5,9 erhaltenen.
Man erhält eine Suspension von Mikrokristallen von Ginkgolid B mit einer homogenen Größe im Bereich von 500 nm bei einer Konzentration an Ginkgolid B von 12,8 mg/ml.

2) Anti-PAF-Acether-Aktivität

Es wurde das Ginkgolid B mit 2 Liposomen-Präparationen, die Ginkgolid B (Präparation E-30 und E-31) enthalten, sowie mit einer Präparation von Mikrokristallen (Präparation E-34) in den Tests ex vivo am Kaninchen verglichen, ausgedrückt im Prozentsatz der Inhibierung an der Plättchenaggregation (PAF 2, 5 nM).
Es geht daraus hervor, daß die Präparationen auf der Basis von Liposomen im wesentlichen nur bis zu 1 Stunde 30 Minuten eine Inhibitorwirkung auf die Plättchenaggregation besitzen, während die Wirkung der Mikrokristalle länger andauert, in Dosierungen von 1 mg/kg, verabreicht i.v.
E-30 = Liposome (PC/Ch/SA) = (7/2/1) zu 1,283 mg GB/ml
E-31 = Liposome (PC/Ch/SA) = (5/4/1) zu 2,695 mg GB/ml
E-34 = Mikrokristalle mit 4,250 mg GB/ml
Puffer = Acetatpuffer pH 6,0; 0,15 M. TABELLE I:WIRKUNG DER LIPIDISCHEN ZUSAMMENSETZUNG AUF DAS ERHALTEN VON GINGKOLID B ENTHALTENDEN MIKROKRISTALLEN Zusammensetzung Molares Verhältnis (PC/GB) Mittlere Größe (nm) Aussehen in der optischen Phasenkontrast-Mikroskopie runde und längliche Liposome, keine Mikrokristalle Mikrokristalle, wenig oder keine Liposome Liposome (> 95%) + einige Mikrokristalle längliche Mikrokristalle + große Kristalle von Cholesterol * Präparation E-30 ** Präparation E-31 n.b.=nicht bestimmt TABELLE II:WIRKUNG DES MOLAREN VERHÄLTNISSES PC/GB AUF DAS ERHALTEN VON GINGKOLID B ENTHALTENDEN MIKROKRISTALLEN Zusammensetzung Molares Verhältnis (PC/GB) Mittlere Größe (nm) Aussehen in der optischen Phasenkontrast-Mikroskopie im wesentlichen kleine Liposome runde und längliche Liposome + wenig Mikrokristalle (1-5%) Mikrokristalle + Liposome (50-70%) haups.kleine Mikrokrist. + wenig Liposome (1-5%) im wesentlichen Mikrokrist. mit ± homogen. Größe *Präparation E-34 TABELLE III:WIRKUNG DES MOLAREN VERHÄLTNISSES PC/GB AUF DAS ERHALTEN VON GINGKOLID B ENTHALTENDEN MIKROKRISTALLEN Zusammensetzung Molares Verhältnis (PC/GB) Mittlere Größe (nm) Aussehen in der optischen Phasenkontrast-Mikroskopie - Liposome + Zusammenballungen von Liposomen - wenig Mikrokristalle Mischung von kleinen und zusammengeballten Liposomen und Mikrokristalle kleine Mikrokristalle, keine Liposome kleine Mikrokristalle und heterogene Population von größeren Kristallen größere, längere Mikrokristalle von unregelmäßigerer Form als beim molaren Verhältnis PC/GB von 1.0 * Präparation E-39 ** Präparation E-35 *** Präparation E-40

3. Toxizität

Die Präparation E-35 von Mikrokristallen GB:PC (molares Verhältnis 1,0) wurde i.v. an Mäuse Balb/c von 22 Gramm injiziert. In der Dosierung von 118,4 mg/kg beträgt der maximale Gewichtsverlust 16,2 % am Tag 3, anschließend gewinnt die Maus ihr Ausgangsgewicht am Tag 8 wieder zurück.
In der Dosierung 178,5 mg/kg ist der Gewichtsverlust kontinuierlich und die Maus stirbt am Tag 5. In Dosierungen von 56,5 und 28,4 mg/kg wurde keine Toxizität beobachtet. Man verzeichnet sogar einen Gewinn an Gewicht von 6 bis 8 % nach 2 Tagen bei der geringsten untersuchten Dosis.

4. Stabilität der Mikrokristalle von GB

Die Präparation E-35 (Verhältnis PC/GB von 1,0) wurde bei einer Temperatur von 4 ºC 100 Tage lang aufbewahrt und mittels optischer Phasenkontrast-Mikroskopie am Tag ihrer Herstellung und zu den Tagen 7, 15, 20 und 100 untersucht. Am Tag 7 ist die Population relativ homogen mit einer etwas erhöhten mittleren Größe als am Tag 1. Am Tag 100 beobachtet man immer kleine Mikrokristalle, aber ebenfalls die Anwesenheit von Mikrokristall-Bünde In. Die Messung der mittleren Größe mittels Nanosizer bestätigt diese Resultate. Zwischen dem Tag 1 und dem Tag 20 hat sich die mittlere Größe verdoppelt und am Tag 100 beträgt sie etwa 2 um.
Die Erhöhung der mittleren Größe der Mikrokristalle resultiert daher aus der langsamen Bildung von Zusammenballungen der Mikrokristalle, deren individuelle Größen sich im Laufe der Zeit nicht zu erhöhen scheinen. Diese Bildung von Zusammenballungen im Verlauf der Zwischenlagerung bei 4 ºC kann durch Beigabe von Zusatzstoffen, wie Antioxydantien oder Saccharide vermieden werden.
Daraus schlußfolgernd kann man eine relativ homogene Population von Mikrokristallen des Ginkgolids B mit einer Größe zwischen 0,1 und 1 um durch spezifisches und äquimolares Zusammenwirken dieses Anti-PAF-Acether-Mittels mit einem amphiphilen Molekül wie Phosphatidylcholin erhalten. Anhand der Prüfung in der optischen Mikroskopie scheint es, daß die Population von Mikrokristallen hinsichtlich ihrer Größe und Form relativ homogen ist. In der Elektronenmikroskopie stellen sich diese Mikrokristalle in Form von "Kieseln" mit abgerundeten Kanten dar.
Man kann ohne Schwierigkeiten bei der Herstellung eine milchige Suspension erhalten, die 12,8 mg Ginkgolid B pro ml enthält.
Die Toxizität dieser Präparation von Mikrokristallen nach der Verabreichung i.v. bei der Maus ist gering. Die Anti-PAF- Acether-Aktivität dieser Präparation wird untersucht.
Mikrokristalle werden ebenfalls erhalten, wenn man außerdem Phosphatidylcholin, Cholesterol und Stearylamin (PC:Ch:SA ; 4:3:1) unter der Bedingung hinzusetzt, daß das molare Verhältnis PC/GB unterhalb von 2 liegt.

BEISPIEL 3

ANTI-PAF-ACETHER-MITTEL

Man wird in der Literatur zahlreiche andere Anti-PAF-Acether-Mittel finden, die geeignet sind, im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden zu können, insbesondere in "PAF-acether specific binding sites : 2. Design of specific antagonists" von P. Braquet und J.J. Godfroid (TIPS - October 1986 - Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam)
Man unterscheidet mehrere Reihen von Anti-PAF-Mitteln, unter anderem:
1) die Antagonisten, die eine analoge Molekularstruktur zu der des PAF-Acether aufweisen, wie CV-3988 (TAKEDA), RU-45703 (ROUSSEL-UCLAF/PHARMACOCHIMIE MOLECULAIRE), ONO-6240 (ONO), Ro 19-3704 (HOFMNN-LA ROCHE), SRI 63-119 (SANDOZ) und SRI 63-072 (SANDOZ) oder auch die Antagonisten, die eine modifizierte Struktur zu der des PAF-Acethers aufweisen, wie PIPERIDIN SRI 63-073 (SANDOZ) oder DIOXANONE (HOFMANN-LA ROCHE);
2) natürliche Produkte wie die Lignane und Neolignane, wie KADSURENON (PIPER FUTOKADSURAE), MAGNOSALICIDE (MAGNOLIA SALICIFOLIA), die NECTANDRINE A und B (NECTANDRA RIGIDA) und SYNTHESEDINORLIGNAN L-652.731 der Formel:
Andere, aus GINKGO BILOBA (GINKGOLIDE) isolierte Terpenoide betreffen ebenfalls die vorliegende Patentanmeldung.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON MIKROKRISTALLEN VON KADSURENON BEI PH 5,9

Mikrokristalle, die Kadsurenon und Phosphatidylcholin enthalten, werden nach dem folgenden Schema hergestellt.

a) Herstellung

Es wird in einem Kolben ein lipidischer Film gebildet, indem man Phosphatidylcholin in einem Lösungsmittel und Kadsurenon in einem anderen Lösungsmittel in äquimolaren Mengen auflöst und danach das Lösungsmittel unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von 30 ºC verdampft.
So wurden zu 1 mg Kadsurenon (1 mg/ml) in Chloroform/Methanol (1/1, Vol.) in einem Kolben von 50 ml 4,6 ml Phosphatidylcholin (0,5 mg/ml) in Chloroform/Methanol (4/1, Vol.) gegeben.
Die Mikrokristalle werden durch Zugabe von 0,5 ml 0,15 M Acetatpuffer pH 5,9 und Behandlung 5 Minuten lang bei 100 W in einem Ultraschall-Bad gebildet. Die Mikrokristalle werden unter Stickstoff bei 4 ºC aufbewahrt. Man erhält auf diese Weise Mikrokristalle mit in etwa homogener Größe im Bereich von 500 nm.

b) Reinigung

Die Präparation der Mikrokristalle wird 15 Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert und die Mikrokristalle zweimal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Die Mikrokristalle in Wasser besitzen das gleiche mikroskopische Aussehen wie die in dem Acetatpuffer bei pH 5,9 erhaltenen.

BEISPIEL 5

HERSTELLUNG VON MIKROKRISTALLEN BEI PH 5,9, DIE DAS PRODUKT L-652.731 (MSD) ENTHALTEN

Mikrokristalle, die Phosphatidylcholin und das Produkt L-652.731 (MSD) enthalten, werden nach dem in dem vorstehenden Beispiel beschriebenen Schema hergestellt. Zu 1 mg Produkt L-652.731 gibt man in einem Kolben von 50 ml 3,9 ml Phosphatidylcholin (0,5 mg/ml) und verdampft das Lösungsmittel unter Vakuum bei 30 ºC.
Der Film wird wieder in 0,5 ml 0,15 M Acetatpuffer pH 5,9 aufgenommen und 5 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung mit einer Leistung von 100 W unterzogen.

BEISPIEL 6

HERSTELLUNG VON MIKROKRISTALLEN VON AMPHOTERICIN B

Mikrokristalle, die Amphotericin B und Phosphatidylcholin in einem äquimolaren Verhältnis enthalten, werden nach dem folgenden Schema hergestellt:

a) Herstellung

In einem Kolben von 500 ml trägt man 15,7 ml Phosphatidylcholin (egg lecithin 99% rein) mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Chloroform ein (0,2 mM). Durch Verdampfen des Lösungsmittels bei einer Temperatur von 30 ºC unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers wird ein lipidischer Film gebildet. Dann setzt man 370 ml Amphotericin B mit einer Konzentration von 0,5 g/ml in der Mischung Chloroform/Methanol (1/1, Vol.), das entspricht 0,2 mM, hinzu.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum mit Hilfe eines Rotationsverdampfers werden die Mikrokristalle durch Zugabe von 10 ml NaCl (9 Promille) und Behandlung während 15 Minuten in einem Ultraschallbad JULABO, Modell USR 6, gebildet.

b) Reinigung

Die Präparation der Mikrokristalle von Amphotericin B wird 2 Minuten lang bei 2000 g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der aufschwimmende Anteil wird auf den Scheitel einer Kolonne Sepharose 6B gegeben und mit NaCl (9 Promille) eluiert. Die Fraktion des ersten Peaks, die am meisten mit Amphotericin B angereichert ist, enthielt 8,23 mg Amphotericin B/ml und 7,10 mg Phosphatidylcholin/ml, das entspricht einem molaren Verhältnis von Ampho/PC von 0,98.

c) Akute Toxizität bei der Maus

Bei der Dosierung an Amphotericin B von 82,2 mg/kg, verabreicht auf intravenösem Wege, ist die Präparation von Mikrokristallen von Amphotericin B gegenüber weiblichen Mäusen OF1 toxisch, und die Mäuse sterben-nach 3 Minuten, die auf die Injektion folgen. In einer Dosierung von 41,1 mg/kg sterben die intravenös injizierten Mäuse am 2. Tag. Demgegenüber verliert bei einer Dosierung von 20,6 mg/kg die intravenös injizierte Maus 20 % ihres Gewichtes im Verlauf der 7 auf die Injektion folgenden Tage. Anschließend gewinnt sie ihr Gewicht am Tag 22 zurück.
Das in Form von Fungizon (Amphotericin B-Deoxycholat) auf intravenösem Wege verabreichte Amphotericin besitzt eine LD&sub5;&sub0; von 1,2 mg/kg gemäß LOPEZ-BERESTEIN et al. [2], von 2,3 mg/kg gemäß SZOKA et al. [3] und von 5 mg/kg gemäß WRIGHT et al. [1].
Die LD&sub5;&sub0; von Amphotericin B-Liposome auf intravenösem Wege schwankt von 4 bis 19 mg/kg je nach Zusammensetzung der Liposome (SZOKA et al., a.a.O.)
Die akute Toxizität von Mikrokristallen von Amphotericin B- Phosphatidylcholin, verabreicht i.v. an Mäuse MNRI, wurde mit der des Amphotericin-Komplexes mit Deoxycholat (Fungizon ) und mit der der aus Phosphatidylcholin, Cholesterol und Stearylamin (molare Verhältnisse = 4:3:1) zusammengesetzten Liposome verglichen, die Amphotericin B enthalten, hergestellt nach der gleichen Technik wie in Beispiel I-A)1. für Ginkgolid B beschrieben.
Die den Tod von 50 % der Mäuse 14 Tage nach der einzigen Verabreichung der Produkte hervorrufende Dosis (LD&sub5;&sub0;) beträgt 2,5 mg/kg für freies Amphotericin B und 18,3 mg/kg für die Mikrokristalle PC:AMPHO B.
In Form von Mikrokristallen ist AMPHO B daher 7,3 mal weniger toxisch als seine Form des Komplexes mit Deoxycholat.

d) Cytotoxizität in vitro

Die Cytotoxizität in vitro wird durch die Verringerung der reduzierenden enzymatischen Aktivität gegenüber MTT (Tetrazolium-Salz) von Makrophagen Murins J774-G8 beendet, inkubiert über Nacht in Anwesenheit von mit 10 % Kälberfötus-Serum angereichertem Milieu RPMI, das die Produkte in verschiedenen Dosierungen enthält.
Die Cytotoxizität wird in Form der mikromolaren Konzentration von Amphotericin B ausgedrückt, die 50 % der reduzierenden enzymatischen Aktivität der Makrophagen (TOX&sub5;&sub0;) verringert. TABELLE I - Cytotoxizität verschiedener Formulierungen von Amphotericin B Produkt FUNGIZON Mikrokristalle PC:AMPHO lyophilisierte und wiederhergestellte Mikrokristalle Liposome : AMPHO
Die Tabelle zeigt, daß AMPHO B in Form der Mikrokristalle in vitro gegenüber Makrophagen J774-G8 33 mal weniger toxisch als freies AMPHO B und 7,7 mal weniger toxisch als die Form der Liposomen ist.
Die Lyophilisation der Mikrokristalle in Anwesenheit von 0,1 M Sucrose und ihre Wiederherstellung haben deren Cytotoxizität nicht verändert.

e) Direkte antifungische Aktivität (d.h. in vitro an extracellularen Parasiten)

Die Aktivität von Mikrokristallen von Amphotericin B wurde mit der von Amphotericin B verglichen, das kontrolliert in DMSO aufgelöst und anschließend in einem Kulturmilieu RPMI verdünnt wurde, das 10 % Serum enthält, dem die Lipide entzogen wurden. Gegenüber Candida Albicans und Candida Tropicalis ist die MIC (minimale Konzentration, die das Wachstum der Parasiten in vitro inhibiert) von 2 Formen Amphotericin B identisch und liegt zwischen 0,05 und 0,1 uM (0,04 und 0,08 ug/ml).
Die direkte antifungische Aktivität von Amphotericin B in Form von Fungizon, von Mikrokristallen und von Liposomen wurde ebenfalls am Wachstum von Candida tropicalis in dem Milieu RPMI, das 20 % Kälberfötus-Serum enthält, gemessen. Es wurde die Inhibierung des Wachstums nach 16 Stunden an steigenden Konzentrationen von Amphotericin B (14 Konzentrationen von 0,012 bis 100 uM) beobachtet. Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) ist die geringste Konzentration, bei der kein Wachstum von Candida zu verzeichnen ist.
Die MIC von Amphotericin B in Form von Mikrokristallen ampho B:PC oder in Form von Fungizon ist identisch (0,195 uM) Demgegenüber ist das Amphotericin B, verkapselt in Liposomen und zusammengesetzt mit Phosphatidylcholin, Cholesterol und Stearylamin in einem molaren Verhältnis von 4:3:1 achtmal weniger aktiv als das freie Amphotericin (1,56 uM).
Die Lyophilisation der Mikrokristalle von Amphotericin B:PC in Anwesenheit von 0,1 M Sucrose beeinträchtigt nicht deren antifungische Aktivität gegenüber extracellularen Fungi.

f) Aktivität in vitro gegenüber mit Candida Tropicalis infizierten Makrophagen (gegenüber intracellularen Parasiten)

Die antifungische Aktivität von Amphotericin B gegenüber intracellularen Fungi wird in vitro in dem Modell der Linie J-774-G8 von Makrophagen bestimmt, die im Verhältnis von 1 Candida tropicalis pro 10 Makrophagen infiziert wurden. Die Makrophagen werden in einem Milieu RPMI kultiviert, das 10 mM MES pH 7,2 enthält, ergänzt durch 10 % dekomplementiertes Humanplasma. Die Wirkung der Medikamente wird in LIMBRO-Schalen mit 24 Vertiefungen gemessen, die 10% infizierte, an den Glaslamellen haftende Makrophagen enthalten, wobei der getestete Konzentrationsbereich von 0,048 uM bis 100 uM variiert.
Der Prozentsatz von infizierten Zellen wird nach 16 Stunden Co-Kultur bestimmt. Auf den Platten des Mikroskops zählt man nach Anfärbung mit MAY-GRUNWALT-GIEMSA die Anzahl aller Makrophagen (NT) sowie die Anzahl von mit Candida infizierten Makrophagen (Ni). Der Prozentsatz der Infektion ist das Verhältnis Ni/NT (ausgedrückt in %)
Anschließend wird die Konzentration, ausgedrückt in uM, die 50 % der intracellularen Infektion herabsetzt (IC&sub5;&sub0;) bestimmt.
Die IC&sub5;&sub0; von FUNGIZON beträgt 0,2 uM, während sie für die Mikrokristalle bei 0,1 uM liegt. Die IC&sub5;&sub0; der AMPHO B enthaltenden Liposome beträgt 0,8 uM.
Die Mikrokristalle sind daher mindestens ebenso aktiv wie Amphotericin B, auch gegenüber extracellularen Fungi sowie gegenüber intracellularen Fungi.

g) Therapeutischer Index

Der therapeutische Index (TI), definiert an den intracellularen Formen von Candida, ist das Verhältnis zwischen der Toxizität des Produktes bei Makrophagen, ausgedrückt durch TOX&sub5;&sub0;, und der therapeutischen Aktivität, ausgedrückt durch IC&sub5;&sub0;, das ist die Dosis, die 50 % der intracellularen Infektion verringert.
Wie in der nachstehenden Tabelle veranschaulicht, ist der therapeutische Index der Mikrokristalle PC:AMPHO B 66 mal höher als der des freien AMPHO B (in Form von Fungizon) und 60 mal höher als der AMPHO B enthaltender Liposome. TABELLE II - Therapeutischer Index der verschiedenen Formulierungen von Amphotericin B Produkt FUNGIZON Mikrokristalle PC:AMPHO B lyophilisierte Liposome:AMPHO a. TOX&sub5;&sub0; : Konzentration, ausgedrückt in uMol, die 50 % der reduzierenden enzymatischen Aktivität von Makrophagen gegenüber Tetrazolium-Salzen herabsetzt; b. IC&sub5;&sub0; : Konzentration, ausgedrückt in uMol, die 50 % der intracellularen Infektion von durch Candida tropicalis infizierten Makrophagen J-774-G8 verringert; c. TI : Therapeutischer Index, Verhältnis zwischen TOX&sub5;&sub0; und IC&sub5;&sub0;.

BEISPIEL 7

HERSTELLUNG VON CHOLESTEROL ENTHALTENDEN MIKROKRISTALLEN VON AMPHOTERICIN B

Die Assoziation von Anphotericin B mit Sterolen wurde bereits untersucht, insbesondere mit Cholesterol und Ergosterol (WITZKE et al., [4]). Das Einbringen von Sterol in die Amphotericin B enthaltenden Liposome verringert deren Toxizität (SZOKA et al., [3]).
Die Zugabe von Cholesterol zu Mikrokristallen von Amphotericin B hat unter Erhöhung ihrer Aktivität den gleichen Effekt.
Die Mikrokristalle von Amphotericin B, die Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterol (Ch) enthalten, wurden nach dem folgenden Schema hergestellt:

a) Herstellung

In einen Kolben von 500 ml trägt man 15,7 ml Phosphatidylcholin (PC) in einer Konzentration von 10 mg/ml in CHCl&sub3; (0,2 mM), 370 ml Amphotericin B in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Chloroform/Methanol (1/1, Vol.), das sind 0,2 mM, und 58 mg Cholesterol, gelöst in 10 ml Methanol (0,15 mM), ein.
Das Lösungsmittel wird bei einer Temperatur von 30 ºC mit Hilfe eines Rotationsverdampfers unter Vakuum verdampft.
Die Mikrokristalle werden durch Zugabe von 10 ml Wasser und Behandlung während 15 Minuten in einem Ultraschallbad JULABO, Modell USR 6, gebildet.

b) Reinigung

Die Präparation wird wie in Beispiel 6 gereinigt. Die Fraktion des ersten Peaks, die am meisten mit Amphotericin B angereichert ist, enthält 2,55 mg Ampho/ml, 9,11 mg PC/ml und 1,93 mg Ch/ml, das entspricht einem molaren Verhältnis PC/Ch/Amphotericin B von 4/2/1.

c) Akute Toxizität bei der Maus

In einer Dosierung von 25,5 mg/kg Amphotericin B, verabfolgt an 2 weibliche Mäuse OF1, ruft die Präparation von Mikrokristallen von Amphotericin B, die Cholesterol enthält, einen maximalen Gewichtsverlust von 8 % am Tag 6 bei einer Maus und einen Gewinn an Gewicht von 9 % am Tag 6 bei der zweiten Maus hervor (im Mittel: kein Gewichtsverlust) . Das mittlere Gewicht der zwei Mäuse am Tag 19 beträgt 100 % des Ausgangsgewichtes.

d) Direkte antifungische Aktivität

Die antifungische Aktivität von Amphotericin B der Kontrolle (DM&sub5;&sub0; und RPMI) und der Präparation von Mikrokristallen von Amphotericin B, die Cholesterol enthält, liegt in der gleichen Größenordnung. Die MIC beträgt zwischen 0,05 und 0,1 uM.

e) Aktivität in vitro gegenüber infizierten Makrophagen

Die MIC der Präparation von Mikrokristallen von Amphotericin 13, die Cholesterol enthält, beträgt 0,1 uM, während sie für Amphotericin B, gelöst in DM50, bei 0,4 uM liegt. Das Amphotericin B in Form von Mikrokristallen, die Cholesterol enthalten, ist daher mindestens viermal weniger toxisch und viermal mehr aktiv bei infizierten Makrophagen, als das Amphotericin B.

IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE BIBLIOGRAPHISCHE REFERENZEN

[1] : WRIGHT et al. The Journal of antibiotics 1982 Vol. 35 No. 7 S. 911-914
[2] : LOPEZ-BERESTEIN et al. The Journal of infections diseases Vol. 145, No. 5, May 1983 S. 939-945
[3] : SZOKA et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, March 1987, S. 421-429 Vol. 31 No. 3
[4] : WITZKE et al. Biochemistry 1984, 23, 1668-1674

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von lipidischen Mikropartikeln mit kristallinem Aussehen einer in Wasser unlöslichen Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide und mindestens ein Phospholipid aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das oder die organische(n) Lösungsmittel einer Lösung von Phospholipiden und der genannten Substanz verdampft, und

b) den nach dem Verdampfen des oder der Lösungsmittel(s) erhaltenen Film in einer wäßrigen Lösung durch kräftiges Rühren wieder in Suspension bringt, wobei das molare Verhältnis zwischen dem oder den Phospholipid(en) und der Substanz zwischen 0,1 und 2 beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis zwischen dem oder den Phospholipid(en) einerseits und der Substanz andererseits zwischen 0,8 und 1,2 beträgt.

3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid Phosphatidylcholin ist.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Lösungsmittel der verwendeten Lösungen unter den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln ausgewählt werden, insbesondere Methanol, Chloroform und ihren Mischungen.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Stufe a) wie folgt unterteilt:

a&sub1;) man verdampft das (die) Lösungsmittel der Lösung des (der) Phospholipide (s),

a&sub2;) man bringt den nach dem Verdampfen erhaltenen lipidischen Film wieder in Lösung, indem man eine Lösung der genannten Substanz hinzugibt,

a&sub3;) man verdampft von neuem das (die) Lösungsmittel der Lösung von Phospholipid(en) und der genannten Substanz.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kräftige Rühren in der Stufe b) durch Ultraschall-Behandlung erhalten wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des(r) Phospholipide(s) eine Lösung von Chloroform oder Chloroform/Methanol ist.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung der genannten Substanz eine Lösung von Chloroform/Methanol ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Substanz unter den antagonistischen Substanzen des Acethers des "Aktivierungsfaktors der Plättchen" ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in Frage kommende Substanz unter den Lignanen und Neolignanen ausgewählt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dar die Substanz unter Kadsurenon oder seinen Derivaten und Synthese-Dinorlignan L-652-731 und seinen Derivaten ausgewählt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die in Frage kommende Substanz unter den Ginkgoliden und ihren Derivaten ausgewählt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz unter den antagonistischen Substanzen des PAF-Acethers ausgewählt wird, die eine analoge Struktur des genannten PAF- Acethers aufweisen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Substanz unter Amphotericin B und seinen Derivaten ausgewählt wird, die eine antifungische Aktivität aufweisen.

15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung der genannten Substanz Sterol(e), insbesondere Cholesterol und/oder Ergosterol, zugesetzt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis zwischen dem oder den Phospholipid(en) einerseits und dem oder den Sterol(en) andererseits zwischen 1 und 2 beträgt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis B, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) des Verfahrens den nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Film in einer Lösung in Suspension bringt, die auf einen pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise auf pH 5,9, gepuffert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) des Verfahrens den nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Film in einer Lösung von Acetat- oder Phosphat-Puffer in Suspension bringt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe b) des Verfahrens die wäßrige Lösung eine 0,1 M Lösung von NaCl oder Saccharid ist.

20. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Stufe b) des Verfahrens die lipidischen Mikropartikeln mit kristallinen Aussehen durch Zentrifugieren und Waschen mit destilliertem Wasser oder durch eine wäßrige Lösung gereinigt werden.

21. Lipidische Mikropartikel mit kristallinen Aussehen, insbesondere erhalten durch die Anwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche.

22. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen, die im wäßrigen Medium einer in Wasser unlöslichen Substanz stabil sind und eine Affinität für die Phospholipide und mindestens ein Phospholipid aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/aktive Substanz) unterhalb von oder gleich 2 beträgt.

23. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen einer aktiven Substanz, ausgewählt unter Amphotericin B und seinen antifungischen Derivaten, und mindestens einem Phospholipid in einem molaren Verhältnis (Phospholipid(e)/aktive Substanz) von unterhalb oder gleich 2.

24. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/Substanz) zwischen 0,8 und 1,4 liegt.

25. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid Phosphatidylcholin oder eines seiner Derivate ist.

26. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 21, 22, 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß die unlösliche Substanz, die eine Affinität für die Phospholipide aufweist, ein Anti-PAF-Acether- Mittel ist.

27. Mikropartikel nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz unter den Ginkgoliden und ihren Derivaten ausgewählt wird.

28. Mikropartikel nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz unter den Lignanen und Neolignanen, wie Kadsurenon oder seinen Derivaten und Synthese-Dinorlignan L-652-731 und seinen Derivaten ausgewählt wird.

29. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz unter Amphotericin B und seinen antifungischen Derivaten ausgewählt wird.

30. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen nach einem der Ansprüche 21 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Substanz Sterol (e) zugesetzt wird (werden)

31. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis (Phospholipid(e)/Substanz+Sterol (e)) zwischen 0,8 und 1,4 liegt.

32. Lipidische Mikropartikel mit kristallinem Aussehen nach einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie Amphotericin B, Cholesterol und Phosphatidylcholin in einem molaren Verhältnis von 1:2:4 umfassen.

33. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 21 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie in lyophilisierter Form vorliegen.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Mikropartikel nach einem der Ansprüche 21 bis 33 enthält.

35. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie in injizierbarer oder versprühbarer Form konditioniert wird.

36. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie in lyophilisierter Form konditioniert wird.