DE69634733T2

DE69634733T2 - Benzamidoxime prodrugs und verwendung zur behandlung von pneumonie

Info

Publication number: DE69634733T2
Application number: DE69634733T
Authority: DE
Inventors: Edwin James HALL; Ray Richard TIDWELL; Withers David BOYKIN
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Georgia State University
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Georgia State University
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1996-11-15
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2016-11-16
Also published as: EP1561463B1; CA2237650A1; US5843980A; CA2237650C; US5723495A; CA2549534A1; US6025398A; US20010044468A1; US6214883B1; ATE430562T1; US6423737B2; DE69634733D1; EP0861071A1; EP1561463A3; AU1160597A; WO1997017949A1; DE69637924D1; EP1561463A2; ES2241008T3; JP2000500469A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Bis-Benzamidoxim-Derivate, pharmazeutische Zubereitungen, die diese enthalten, und deren Verwendung für die Herstellung eines Medikaments, das nützlich in der Bekämpfung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie ist, sowie Prodrug-Verbindungen, die dafür nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Pentamidin wird für die Behandlung von P. Carinii-Pneumonie (Pneumocystis carinii pneumonia, PCP) verwendet. Die Wichtigkeit von Pentamidin hat sich in jüngerer Zeit dramatisch verstärkt aufgrund eines erheblichen Anstiegs der Zahl von Patienten, die an PCP leiden. Die Erhöhung der Zahl in der befallenen Patienten-Population ist eine unglückliche Folge der steigenden Präsenz des erworbenen Immunmangel-Syndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome, Aids). Es wird derzeit geschätzt, dass sich etwa 70% der Aids-Patienten PCP zuziehen. Aufgrund des starken Vorkommens von PCP bei Aids-Patienten hat Pentamidin Nutzen nicht nur bei der Behandlung von PCP gefunden, sondern auch als Prophylaxe bei der Vorbeugung oder Verzögerung des anfänglichen Auftretens oder einem Rückfall von PCP, speziell bei Aids-Patienten. Derzeit wird Pentamidin am weitesten verbreitet als therapeutisches Mittel durch intravenöse Infusion und als prophylaktisches Mittel über eine Aerosol-Dosierung verabreicht.
Jedoch ist eine unglückliche Nebenwirkung von Pentamidin seine Toxizität. Einige Todesfälle wurden starker Hypotonie, Disglykämie (Störung des Blutzucker-Gehalts) und Herz-Arrhythmien bei Patienten zugeschrieben, die mit Pentamidin behandelt worden waren. Andererseits kann eine unzureichende Dosierung zu einer Verbreitung der Krankheit über die Lunge hinaus führen, einem Ereignis, das mit einer schlechten Prognose verbunden ist. Eine therapeutische Arzneimittel-Überwachung wird wegen der Kosten und der Komplexität der derzeit erhältlichen Assay-Techniken nicht angewandt, die die Extraktion von Plasma und eine High-Performance-Liquid-Chromatographie Analyse (HPLC) erfordern. Im Ergebnis ist die Toxizität von Pentamidin ein signifikant wichtiger Punkt, der den Markt in Richtung auf die Entwicklung von Pentamidin- Ersatzstoffen vorantreibt, die in der Lage sind, die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Verwendung von Pentamidin verbunden sind, zu vermeiden oder zu minimieren. Dazu wird beispielsweise auf folgende Druckschriften verwiesen: J. Spychala et al., Eur. J. Med. Chem. 29, 363–367 (1994); I. O. Donkor et al., J. Med. Chem. 37, 4554–4557 (1994); R. R. Tidwell et al., J. Protozool. 6, 148S–150S (1991).
Die Druckschrift WO 95/01168 offenbart pharmazeutische Formulierungen, die nützlich für die Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie sind. Der aktive Wirkstoff enthält wenigstens eine Amidin-wirksame funktionelle Gruppe in Form eines Amidoxims, eines Amidoximesters oder eines 1,2,4-Oxadiazols. Bevorzugte aktive Verbindungen haben die Formel Ph-X-(CH₂)_n-Y-Ph, worin X und Y unabhängig voneinander für O, N oder S stehen und die beiden Phenyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine Amidin-wirksame funktionelle Gruppe in 4-Stellung substituiert sind sowie gegebenenfalls in 2- und 5-Stellung substituiert sind.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen bereitzustellen, die nützlich bei der Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen, die nützlich zur Behandlung von PCP sind, sowie pharmazeutische Formulierungen, die die Verbindungen enthalten, und ihre Verwendung für die Herstellung von Medikamenten bereit.
In einem weiteren Aspekt besteht die Erfindung in der Verwendung bestimmter Verbindungen für die Herstellung intravenös verabreichbarer Medikamente zur Behandlung von PCP.
Die Verbindungen sind Bis-Benzamidoxime, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, auf die der Leser für eine noch vollständigere Offenbarung der verschiedenen Aspekte der Erfindung und deren Ausführungsformen verwiesen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus von Bis-Benzamidoximen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Überstands-Fraktion eines bei 9000 × g behandelten Rattenleber-Homogenats. In den Metabolismus-Untersuchungen, die in den 1A, 1B, 1C und 1D veranschaulicht werden, wurden Homogenate, die 167 μM-Test-Verbindung als Substrat plus eine Cofaktor-Lösung enthielten, bei 37°C 10 min lang inkubiert und wurden anschließend mittels HPLC getestet, wie dies weiter unten in Beispiel 7 beschrieben ist. In allen Figuren bedeutet „IS" interner Standard. 1A veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 1 in ihr Amidin-Analog Pentamidin (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 2) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivat (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 9). 1B veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 3 in ihr Amidin-Analog (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 4). 1C veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 5 in ihr Amidin-Analog (in der Figur bezeichnet durch die Ziffer 6). 1D veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 7 in ihr Amidin-Analog (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 8).
2 ist eine graphische Veranschaulichung des Zeit-Verlaufs einer Reduktion der Bis-Benzamidoxim-Verbindung 1 in ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Produkt, ausgedrückt als Maß von nMol Produkt/mg Protein (Wert auf der Y-Achse) als Funktion der Zeit in min (Wert auf der X-Achse). Die offenen Kreise stehen für Datenpunkte für die Reduktion von Verbindung 1 in der post-mitochondrialen Überstands-Fraktion von Rattenleber, beschrieben unten in Beispiel 7. Die geschlossenen Kreise stehen für Datenpunkte für die Reduktion von Verbindung 1 in Rattenleber-Mikrosomen-Fraktionen, ebenfalls beschrieben in Beispiel 7.
3 ist eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus der Bis-Benzamidoxim-Verbindung 1 in ihr Amidin-Analog Pentamidin (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 2) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivats (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer 9) anhand der bei 9000 × g behandelten Überstands-Flüssigkeiten von Homogenaten von Rattenleber (3A); Rattenniere (3B), Rattenlunge (3C) und Rattenherz (3D).
4 ist eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus von Bis-Benzamidoximen der vorliegenden Erfindung in intakten BRL-3A-Hepatocyten in vitro. In den Metabolismus-Untersuchungen, die in den 4A, 4B, 4C und 4D veranschaulicht sind, wurden Zellen, die in Ham's F-12-Medium kultiviert wurden, das 5 fetales Rinderserum und 10 μM Diamidoxim-Substrat enthielt, 24 h bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Das extrazelluläre Medium wurde extrahiert und anschließend mittels HPLC einem Assay unterworfen, wie dies unten in Beispiel 7 beschrieben ist. In allen Figuren bedeutet „IS" innerer Standard. 4A veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 1 in ihr Amidin-Analog Pentamidin (in der Figur durch die Ziffer 2 bezeichnet) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivat (in der Figur durch die Ziffer 9 bezeichnet). 4B veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 3 in ihr Amidin-Analog (in der Figur mit der Ziffer 4 bezeichnet). 4C veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 5 in ihr Amidin-Analog (in der Figur mit der Ziffer 6 bezeichnet). 4D veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung 7 in ihr Amidin-Analog (in der Figur durch die Ziffer 8 bezeichnet).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Aktive Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind allgemein Bis-Benzamidoxim-Derivate von Benzamidinen, die eine gegen Pneumocystis Carinii gerichtete Aktivität aufweisen. Die Benzamidine, die eine gegen P. Carinii gerichtete Aktivität aufweisen, können Monobenzamidine sein, in denen eine Amidoxim-Gruppe des Bis-Benzamidoxim-Derivats reduziert ist. Alternativ dazu können sie Bis-Benzamidine sein, in denen beide Amidoxim-Gruppen des Bis-Benzamidoxim-Derivats reduziert sind. So sind Bis-Benzamidoxim-Derivate von Benzamidinen, die gegen Pneumocystis Carinii gerichtete Aktivität aufweisen, ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Beispiele solcher Benzamidine sind beispielsweise offenbart in den US-Patenten Nrn. 2,277,861 (Ewins et al.); 2,410,796 (Newberry et al.); 4,933,347 (Tidwell et al.) und in der PCT-Anmeldung Nr. US 93/09477.
Der Begriff „Cycloalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf cyclisches C₃- bis C₆-Alkyl, wie beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Cyclohexyl und Cyclopentyl sind derzeit bevorzugt.
Der Ausdruck „Aryl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf cyclische C₃- bis C₁₀-Aromaten-Gruppen wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl und dergleichen und schließt substituierte Aryl-Gruppen wie beispielsweise Tolyl ein.
Der Begriff „Hydroxyalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf lineares oder verzweigtes, Hydroxysubstituiertes C₁- bis C₄-Alkyl, d. h. -CH₂OH, -(CH₂)₂OH usw.
Der Begriff „Aminoalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf lineares oder verzweigtes, Aminosubstituiertes C₁- bis C₄-Alkyl, wobei sich der Begriff „Amino" auf die Gruppe NR'R'' bezieht, in der R' und R'' unabhängig voneinander gewählt sind aus H oder Niederalkyl, wie es oben definiert wurde, d. h. -NH₂, -NHCH₃, -N(CH₃)₂ usw.
Der Begriff „Oxyalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf mit Sauerstoff substituiertes C₁- bis C₄-Alkyl, d. h. -OCH₃, und der Begriff „Oxyaryl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf mit Sauerstoff substituierte cyclische C₃- bis C₁₀-Aromaten-Gruppen.
Die Verbindungen, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Bis-Benzamidoxime der Formel Ia:
worin:
R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl;
R₃ steht für H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl oder Halogen;
n steht für 2 bis 6;
X steht für O oder S; und
Y steht für H oder Niederalkyl;
oder pharmazeutische annehmbare Salze davon.
Die Verbindungen der Formel (Ia) und ihre Salze sind nützlich für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von PCP durch intravenöse Verabreichung des Medikaments.
Bestimmte Bis-Benzamidoxime der Formel (Ia) sind neu, und diese haben die Formel (Ib):
worin entweder

A) R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl; R₃ steht für Niederalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl; n steht für 2 bis 6; X steht für O oder S; und Y steht für H oder Niederalkyl; oder
B) n steht für 3 oder 4; X steht für O; Y steht für H; R₁ und R₂ stehen jeweils für H; und R₃ steht für H oder -OCH₃.

Wie oben angemerkt, sind die Produkte und Verwendungen der vorliegenden Erfindung nützlich in Bezug auf eine Behandlung von P. Carinii-Pneumonie, und zwar dahingehend, dass sie das Einsetzen, das Steigern oder die Verbreitung des Zustands inhibieren, eine Regression des Zustands hervorrufen, den Zustand heilen oder in anderer Weise das allgemeine Wohlbefinden eines Wesens verbessern, das von dem Zustand heimgesucht wird oder in Gefahr steht, sich diesen Zustand zuzuziehen.
Wesen, die zu behandeln sind, sind typischerweise menschliche Wesen, obwohl die Produkte und Anwendungen der vorliegenden Erfindung nützlich in Beziehung auf irgendein geeignetes Wesen sein können, was Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt ist.
Wie oben angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Formulierungen bereit, die die vorgenannten aktiven Verbindungen umfassen, oder pharmazeutisch an nehmbare Salze davon, und zwar in pharmazeutisch annehmbaren Trägern für eine orale, intravenöse oder Aerosol-Verabreichung, wie sie weiter im Einzelnen nachfolgend diskutiert wird.
Die therapeutisch wirksame Dosis irgendeiner speziellen Verbindung, deren Verwendung im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, schwankt ein wenig von Verbindung zu Verbindung, von Patient zu Patient und hängt ab von dem Zustand des Patienten und dem Verabreichungsweg. Als allgemeiner Vorschlag weist eine Dosierung von etwa 0,1 bis etwa 100 mg/kg therapeutische Wirksamkeit auf, wobei alle Gewichte berechnet sind auf der Grundlage des Gewichts der aktiven Basis, einschließlich der Fälle, in denen ein Salz verwendet wird. Eine Dosierung von etwa 10 mg/kg bis etwa 50 mg/kg kann bei einer oralen Verabreichung eingesetzt werden. Die Dauer der Behandlung ist üblicher Weise einmal pro Tag für einen Zeitraum von 2 bis 3 Wochen oder bis die P. Carinii-Pneumonie im Wesentlichen unter Kontrolle ist. Geringere Dosierungen, die weniger häufig verabreicht werden, können verwendet werden, um das Auftreten eines Rückfalls der Infektion zu verhindern oder zu reduzieren.
In Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren kann eine aktive Verbindung, wie sie vorliegend beschrieben wird, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oral als Feststoff oder als Flüssigkeit verabreicht werden oder kann intravenös verabreicht werden. Alternativ kann die aktive Verbindung oder das Salz auch durch Inhalation verabreicht werden. Wenn die aktive Verbindung oder das Salz durch Inhalation verabreicht wird, sollte sie/es in Form einer Vielzahl von festen Teilchen oder Tröpfchen vorliegen, die eine Teilchengröße von etwa 0,5 bis etwa 5 Mikron haben, vorzugsweise von 1 bis 2 Mikron. Die neuen Verbindungen der Formel (Ib) können in jeder beliebigen Formulierung verwendet werden, während die einzig beanspruchten Aspekte der Erfindung, die auf die ganze Klasse der Verbindungen der Formel (Ia) diejenigen sind, die sich auf eine intravenöse Verabreichung beziehen.
Über die Tatsache hinaus, dass die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen und in den Patentansprüchen beanspruchten Verbindungen die Behandlung von P. Carinii- Pneumonie vorsehen, sehen sie auch die Prophylaxe gegen P. Carinii-Pneumonie in einem immungeschwächten Patienten, wie beispielsweise einem solchen, der an Aids leidet, vor, der mindestens eine Episode von P. Carinii-Pneumonie hatte, der jedoch zum Zeitpunkt der Behandlung keine Zeichen von Pneumonie zeigt. Da P. Carinii-Pneumonie eine speziell potentiell zerstörerische Krankheit für immungeschwächte Patienten ist, ist es bevorzugt, das Einsetzen P. Carinii-Pneumonie zu vermeiden, verglichen mit einem Behandeln der Krankheit, nachdem sie symptomatisch geworden ist. Dementsprechend ermöglicht die vorliegende Erfindung die Prophylaxe gegen P. Carinii-Pneumonie, die ein Verabreichen einer prophylaktisch wirksamen Menge der aktiven Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an einen Patienten umfasst. Die Formen der Verabreichung der Verbindung oder des Salzes in Übereinstimmung mit diesem Verfahren können dieselben sein, wie sie für den Zweck einer tatsächlichen Behandlung eines Patienten eingesetzt werden, der an P. Carinii-Pneumonie leidet.
Eine zusätzliche nützliche Behandlung, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird, ist die Prophylaxe gegen selbst eine anfängliche Episode von P. Carinii-Pneumonie in einem immungeschwächten Patienten, der niemals eine Episode von P. Carinii-Pneumonie erfahren hat. In dieser Hinsicht kann ein Patient, dem die Diagnose gestellt wurde, dass er immungeschwächt ist, beispielsweise einer, der unter Aids oder ARC (dem Aids verwandten Komplex; Aids related complex) leidet, selbst vor dem Einsetzen einer anfänglichen Episode von P. Carinii-Pneumonie ein Erkranken an der Infektion vermeiden oder dieses hinaus zögern, indem man ihm eine prophylaktisch wirksame Menge einer aktiven Verbindung verabreicht, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben oder in den Patentansprüchen beansprucht ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon. Die Verbindung oder das Salz können in derselben Weise wie bei der Behandlung von Patienten verabreicht werden, die unter P. Carinii-Pneumonie leiden.
Bei der Herstellung eines Medikaments gemäß der Erfindung (einer „Formulierung") werden aktive Mittel oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze (die „aktive Verbin dung") typischerweise gemischt u. a. mit einem annehmbaren Träger. Der Träger muss natürlich annehmbar in dem Sinn sein, dass er mit beliebigen anderen Bestandteilen in der Formulierung verträglich ist, und darf für das Wesen nicht schädlich sein. Der Träger kann fest oder flüssig oder beides sein und wird vorzugsweise mit der Verbindung als Einheitsdosis-Formulierung formuliert, beispielsweise als Tablette, die 0,05 Gew.-% bis 99 Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten kann. Eine oder mehrere aktive Verbindungen) kann/können in die Formulierung der Erfindung eingearbeitet werden (z. B. kann die Formulierung ein oder mehrere zusätzliches) Anti-P. Carinii-Pneumonie-Mittel enthalten, wie sie oben genannt wurden), wobei Formulierungen nach beliebigen der wohlbekannten Verfahrensweisen der Pharmazie hergestellt werden können, die im Wesentlichen aus einem Mischen der Komponente einschließlich einer oder mehrerer therapeutischer Zusatz- bzw. Hilfs-Komponenten besteht.
Formulierungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, können in diskreten Einheiten wie beispielsweise Kapseln, kapselförmigen Verabreichungsformen, Pastillen oder Tabletten präsentiert werden, von denen jede eine vorbestimmt Menge der aktiven Verbindung enthält, als Pulver oder Granulat, als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion. Derartige Formulierungen können hergestellt werden nach irgendeinem geeigneten Verfahren der Pharmazie, welches den Schritt des In-Verbindung-Bringens der aktiven Verbindung mit einem geeigneten Träger einschließt (der ein oder mehrere Zusatzs- bzw. Hilfs-Bestandteile enthalten kann, wie dies oben angegeben wurde). Allgemein werden die Formulierungen der Erfindung dadurch hergestellt, dass man einheitlich und innig die aktive Verbindung mit einer Flüssigkeit oder einem feinteiligen festen Träger oder beiden mischt und danach – sofern erforderlich – die resultierende Mischung in Form bringt. Beispielsweise kann eine Tablette hergestellt werden durch Verpressen oder Formen eines Pulvers oder Granulats, das die aktive Verbindung enthält, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Zusatz- bzw. Hilfs-Komponenten. Komprimierte Tabletten können hergestellt werden durch Verpressen der Verbindung in freifließender Form, beispielsweise eines Pulvers oder Granulats, das gegebenenfalls mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel und/oder einem oder mehre ren oberflächenaktiven/dispergierenden Mittel(n) gemischt ist, in einer geeigneten Vorrichtung. Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen der pulverförmigen Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Bindemittel befeuchtet ist, in einer geeigneten Vorrichtung. Formulierungen für eine orale Verabreichung können gegebenenfalls darmlösliche Überzüge einschließen, wie sie in diesem technischen Bereich bekannt sind, um einen Abbau der Formulierung im Magen zu verhindern und eine Freisetzung des Arzneimittels im Dünndarm sicherzustellen.
Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen oder ihren Salzen können die pharmazeutischen Zubereitungen andere Zusatzstoffe wie beispielsweise den pH-Wert einstellende Zusätze enthalten. Insbesondere schließen nützliche, den pH-Wert einstellende Mittel Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Basen oder Puffer wie beispielsweise Natriumlactat, Natriumacetat, Natriumphosphat, Natriumcitrat, Natriumborat oder Natriumgluconat ein. Weiter können die Zubereitungen Mittel zur Haltbarmachung gegen mikrobiellen Befall enthalten. Nützliche Mittel zum Haltbarmachen gegen mikrobiellen Befall schließen Methylparaben, Propylparaben und Benzylalkohol ein. Das Mittel zum Haltbarmachen gegen mikrobiellen Befall wird typischerweise verwendet, wenn die Formulierung in eine Phiole gegeben wird, die für eine Mehr-Dosis-Verwendung vorgesehen ist. Natürlich können – wie angegeben – die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Verfahrensweisen, wie sie in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind, lyophilisiert werden.
Andere pharmazeutische Zubereitungen können aus in Wasser unlöslichen aktiven Verbindungen oder deren Salzen hergestellt werden, wie beispielsweise Emulsionen auf Wasser-Basis. In einem derartigen Beispiel enthält die Zubereitung eine ausreichende Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Emulgiermittels, um die gewünschte Menge der aktiven Verbindung oder von deren Salz zu emulgieren. Besonders nützliche emulgierende Mittel schließen Phosphatidylcholine und Lecithin ein.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung liposomale Formulierungen der aktiven Verbindungen und von deren Salzen bereit. Die Technologie zur Bildung liposomaler Suspen sionen ist in diesem technischen Bereich wohlbekannt, wenn die aktive Verbindung oder ihr Salz ein wasserlösliches Salz ist, kann dieses unter Anwendung einer herkömmlichen Liposomen-Technologie in Lipid-Vesikel eingearbeitet werden. In einem derartigen Beispiel wird die Verbindung oder ihr Salz aufgrund der Wasserlöslichkeit der Verbindung oder des Salzes in das hydrophile Zentrum oder den Kern der Liposome im Wesentlichen eingeschlossen. Die verwendete Lipid-Schicht kann aus irgendeiner herkömmlichen Zusammensetzung bestehen und kann entweder Cholesterin enthalten oder kann cholesterinfrei sein. Wenn die Verbindung oder das Salz von Interesse in Wasser unlöslich ist, kann das Salz – wiederum unter Anwendung herkömmlicher Technologie zur Bildung von Liposomen – im Wesentlichen in die hydrophobe Lipid-Doppelschicht eingeschlossen werden, die die Struktur des Liposoms bildet. In jedem der Beispiele können die Liposomen, die hergestellt werden, in Bezug auf ihre Größe verkleinert werden, wie beispielsweise durch die Verwendung von Standard-Ultraschall- und -Homogenisierungs-Verfahren.
Natürlich können die Liposomen-Formulierungen, die die aktiven Verbindungen oder ihre Salze enthalten, lyophilisiert werden, um ein Lyophilisat herzustellen, das mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie beispielsweise Wasser wieder hergestellt werden kann, um so die Liposomen-Suspension zu regenerieren.
Es werden auch pharmazeutische Formulierungen bereitgestellt, die für eine Verabreichung als Aerosol durch Inhalation geeignet sind. Diese Formulierungen umfassen eine Lösung oder Suspension der gewünschten aktiven Verbindung oder ihres Salzes oder eine Mehrzahl fester Teilchen der Verbindung oder des Salzes. Die gewünschte Formulierung kann in eine kleine Kammer gegeben und vernebelt werden. Eine Vernebelung kann bewirkt werden durch komprimierte Luft oder durch Ultraschall-Energie unter Bildung einer Mehrzahl von Flüssigkeitströpfchen oder Feststoff-Teilchen, die die Verbindungen oder ihre Salze umfassen. Die Flüssigkeitströpfchen oder Feststoff-Teilchen sollten eine Teilchengröße im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 5 Mikron aufweisen. Die festen Teilchen können erhalten werden durch Verarbeitung der festen aktiven Verbindung oder ihres Salzes in irgendeiner passenden Weise, die in diesem technischen Be reich bekannt ist, wie beispielsweise durch Mikronisierung. Am meisten bevorzugt liegt die Größe der festen Teilchen oder Tröpfchen im Bereich von etwa 1 bis etwa 2 Mikron. In dieser Hinsicht sind handelsübliche Vernebler erhältlich, um dieses Ziel zu erreichen.
Vorzugsweise umfasst dann, wenn die pharmazeutische Formulierung, die für eine Verabreichung als Aerosol geeignet ist, in Form einer Flüssigkeit vorliegt, eine wasserlösliche aktive Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Salz davon in einem Träger, der Wasser umfasst. Ein oberflächenaktives Mittel bzw. Tensid kann zugegen sein, das die Oberflächenspannung der Formulierung ausreichend senkt, was zur Bildung von Tröpfchen mit dem gewünschten Größen-Bereich führt, wenn die Formulierung einer Verneblung unterworfen wird.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für eine intravenöse Verabreichung geeignet sind, umfassen sterile wässrige und nicht-wässrige Injektions-Zubereitungen der aktiven Verbindung, wobei die Zubereitungen vorzugsweise isoton mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers sind. Diese Zubereitungen können Oxidationsinhibitoren, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Substanzen einschließen, die die Formulierung isoton mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen. Wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen können suspendierende Mittel und Verdickungsmittel einschließen. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behälter präsentiert werden, beispielsweise in versiegelten Ampullen und Phiolen, und können in gefriergetrocknetem (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert, beispielsweise Kochsalzlösung oder Wasser für eine Injektion. Unvorbereitete Injektions-Lösungen und -Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten derart hergestellt werden, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
Wie angegeben, liefert die vorliegende Erfindung sowohl in Wasser lösliche als auch in Wasser unlösliche Verbindungen und Salze. Der Begriff „in Wasser löslich", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, ist so gemeint, dass er irgendeine Zubereitung definiert, die in Wasser in einer Menge von etwa 50 mg/m. oder mehr löslich ist. Der Begriff „in Wasser unlöslich", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, ist so gemeint, dass er irgendeine Zubereitung definiert, die eine Löslichkeit in Wasser von weniger als etwa 20 mg/ml aufweist. Für bestimmte Anwendungen können wasserlösliche Verbindungen oder Salze wünschenswert sein, während für andere Anwendungen in Wasser unlösliche Verbindungen oder Salze in gleicher Weise wünschenswert sein können.
Beispiele von aktiven Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen ein:
1,3-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan;
1,3-Bis(2'-methyoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy)propan;
1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan;
1,3-Bis(4'-(4-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat;
1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat;
1-(4'-N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan-bis-maleinat.
Verbindungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können hergestellt werden in Übereinstimmung mit Verfahrensweisen, wie sie Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt sind, insbesondere im Lichte der Beschreibung und Beispiele, wie sie nachfolgend angegeben werden.
Wie angegeben, können die Verbindungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, als pharmazeutisch annehmbare Salze zugegen sein. Solche Salze schließen die Maleinat-Salze, Gluconat-Salze, Lactat-Salze, Acetat-Salze, Tartrat-Salze, Citrat-Salze, Phosphat-Salze, Borat-Salze, Nitrat-Salze, Sulfat-Salze und Hydrochlorid-Salze ein.
Die Salze gemäß der vorliegenden Erfindung können allgemein hergestellt werden, indem man zwei Äquivalente der Pyrimidin-Basis-Verbindung mit der gewünschten Säure in Lösung umsetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden die Salze aus der Lösung durch die Zugabe einer passenden Menge von Lösungsmittel kristallisiert, in dem das Salz unlöslich ist.
Wie oben angegeben, können die aktiven Verbindungen nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die in diesem technischen Bereich bekannt sind, und beispielsweise können die oben angegeben aktiven Verbindungen hergestellt werden, indem man zuerst bekannte Bis-Nitrile unter Anwendung des Allen's-Verfahrens zur Alkylierung von Phenolen synthetisiert; siehe J. N. Ashley et al., J. Chem. Soc. 103–116 (1942); C. F. H. Allen et al. Org. Synth. Coll. III, 141–41 (1955). Die aktiven Verbindungen können dann erhalten werden, indem man Varianten der bekannten Verfahrensweisen von Clement und Raether anwendet und entsprechende Reagenzien verwendet; siehe B. Clement und W. Raether, Arzneim. Forsch. 35, 1009–1014 (1985).
Wesen mit anderen mikrobiellen Infektionen zusätzlich zu P. Carinii-Pneumonie können auch durch die aktiven Verbindungen in derselben Weise behandelt werden, wie es oben beschrieben wurde. Diese Infektionen können hervorgerufen werden durch eine Vielzahl von Mikroben, einschließlich Pilze, Algen, Protozoen, Bakterien und Viren. Exemplarische mikrobielle Infektionen, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Infektionen ein, die hervorgerufen werden durch Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida tropicalis, Salmonella typhimurium, Plasmodium falciparum und Leishmania mexicana amazonensis.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen. In diesen Beispielen bedeutet mM Millimolar, bedeutet ml Milliliter, bedeutet mm Millimeter, bedeutet cm Centimeter, bedeutet °C Grad Celsius, bedeutet g Gramm, bedeutet kg Kilogramm, bedeutet m. p. Schmelzpunkt, bedeutet MHz Megaherz, bedeutet M Molar, bedeutet h Stunden, bedeutet NMR Kernmagnetresonanz, bedeutet FAB Bombardiement mit schnellen Atomen, bedeutet DMF Dimethylformamid, bedeutet EtOH Ethylalkohol, bedeutet DMSO Dimethylsulfoxid, bedeutet HPLC Hoch druck-Flüssigkeits-Chromatographie, bedeutet TLC Dünnschicht-Chromatographie und bedeutet dec Zerfallspunkt.

In den folgenden Beispielen werden folgenden Bezeichnungen für die Verbindungen durchgehend verwendet:

Verbindung#	Name
a	1,5-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)pentan
b	1,3-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan
c	1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan
d	1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan
1	1,5-Bis(4'-(N-hydroxyamidino)phenoxy-)pentan-di-hemimaleinat
2	1,5-Bis(4'-amidinophenoxy-)pentan; pentamidin
3	1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan-di-maleinat
4	1,4-Bis(4'-amidinophenoxy-)butan
5	1,3-Bis(4'-(4-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat
6	1,3-Bis(4'-amidinophenoxy-)propan
7	1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat
8	1,3-Bis(2'-methoxy-4'-amidinophenoxy-)propan

Beispiel 1
Synthese von Verbindungen der Formel I: Herstellung von Bis-Benzonitrilen
42 nMol 1,5-Dibrompentan (zur Herstellung von Pentamidin-Derivaten) oder 1,3-Dibrompentan (zur Herstellung von Propamidin-Derivaten) wurde einer Suspension von 84 nMol des passenden 4-Hydroxybenzonitrils und 126 nMol K₂CO₃ in 200 ml DMF zugesetzt. Die Mischung wurde auf 65 bis 70°C erwärmt, und man ließ sie über Nacht rühren. Die Mischung wurde in 400 ml H₂O verdünnt, und das gefällte Produkt wurde gewonnen und mit H₂O gewaschen. Die rohen Bis-Benzonitrile wurden aus Ethanol umkristallisiert.
Beispiel 2
Synthese von Verbindungen der Formel I: Herstellung von Bis-Benzamidoximen
32 ml einer 21%igen Natriumethoxid-Lösung (in Ethanol) wurden einer heißen Lösung von 98 nMol NH₂OH × HCL in 100 ml Ethanol zugesetzt. Das NaCl wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde direkt in einen Kolben gegeben, der 10 nMol des passenden Bis-Benzonitrils aus Beispiel 1 enthielt. Die Mischung wurde auf Rückfluß-Temperatur erwärmt, und man ließ sie 5 h rühren, kühlte sie auf Raumtemperatur ab und ließ sie über Nacht stehen. Das gefällte Produkt wurde gewonnen, mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuum-Exiccator getrocknet. Die folgenden Spektral-Daten und Analyse-Daten wurden gewonnen:
Verbindung (a): m. p. > 164–165°C (Literatur-Wert: 163°C; siehe: „R. R. Tidwell et al., J. Med. Chem. 26, 294–298 (1983)"); 3,6 g; 60%.
Neue Verbindung (b): m. p. 162°C (1,6 g, 47%); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 2,18 (m, 2H), 4,16 (t, J = 5,9 Hz, 4H), 5,72 (s, 4H), 6,95 (d, 4H, J = 8,6 Hz), 7,59 (d, 4H, J = 8,6 Hz), 9,45 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 345 (M + H); exakte Masse, berechnet für C₁₇H₂₁N₁₄O₄: 345,1563; gefunden: 345,1557; Analyse (C₁₇H₂₁N₁₄O₄): C, H, N.
Neue Verbindung (c): m. p. 117°C (2,9 g, 73%); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 2,17 (m, 2H), 4,14 (t, 4H, J = 5,9 Hz), 5,74 (s, 4H) 6,98 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 9,46 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 405 (M + H); exakte Masse, berechnet für C₁₉H₂₅N₄O₆: 405,1774, gefunden: 405,1795; Analyse (C₁₉H₂₅N₄O₆ × (H₂O)_1,3: C, H, N.
Neue Verbindung (d): m. p. 200°C (dec) (1,0 g, 33%); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1,87 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 5,72 (s, 4H), 6,95 (d, 4H, J = 8,7 Hz), 7,60 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 9,45 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 359 (M + H); Analyse (C₁₈H₂₂N₄O₄): C, H, N.
Beispiel 3
Synthese von Verbindungen der Formel I: Herstellung von Maleinat-Salzen von Bis-Benzamidoxim-Verbindungen
2,7 nMol des passenden Bis-Amidoxims von Beispiel 2 wurden in 20 ml heißen THF aufgenommen. Unlösliche Verunreinigungen (Monoaddukte) wurden durch Zugabe von 20 ml einer THF-Lösung von entweder 6,8 nMol oder 3,6 nMol Maleinsäure entfernt. Der resultierende Niederschlag wurde gewonnen und mit Ether/Ethanol und anschließend mit Ether gewaschen und ergab in den meisten Fällen die Bis-Hemimaleinate als farblose Pulver. Es wurden die folgenden Analyse- und Spektraldaten aufgenommen:
Verbindung (1): m. p. 118–120°C (Literatur: 115–120°C; siehe: „R. R. Tidwell et al., J. Med. Chem. 26, 294–298 (1983)"), (1,2 g, 75%).
Neue Verbindung (3): m. p. 154°C (1,1 g, 67%); Analyse [C₁₈H₂₂N₄O₄]: (C, H, N).
Neue Verbindung (5): m. p. 135°C (dec) (800 mg, 91%); Analyse [C₂₅H₂₈N₄O₁₂ × (H₂O)_1,6)]: (C, H, N).
Neue Verbindung (7): m. p. 134°C (dec) (700 mg, 86%); Analyse [C₂₇H₃₂N₄O₁₄ × (H₂O)]: (C, H, N).
Weitere Elementar-Analysedaten sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 4
Aktivität der neuen Verbindungen von Formel I gegen Pneumocystis Carinii
Die Aktivität der Verbindungen von Formel I gegen Pneumocystis Carinii wurde nach einem etablierten Verfahren getestet: siehe: „Tidwell, R. R., et al., J. Protozool. 36, 74S–76S (1989)"; „Jones, S. K., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1026–1030 (1990)"; „Tidwell, R. R., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1713–1716 (1993)". Kurz beschrieben, wurden männliche Sprague-Dawley Ratten (in abgeschlossenen Kä figen aufgezogen, nicht zertifiziert virusfrei), die jeweils 150 bis 200 g wogen, erhalten von der Firma Hilltop Laboratories, Scottsdale, PA. Unmittelbar nach ihrer Ankunft wurden die Tiere einzeln in Käfige gesetzt und auf eine Niedrig-Protein-Nahrung (8%) und Trinkwasser gesetzt, das Tetracyclin (0,5 mg/ml) und Dexamethason (1,0 μg/ml) enthielt. Diese Ernährung wurde für die Zeit von 8 Wochen fortgesetzt. Zum Beginn der siebten Woche wurden die Tiere in Gruppen von acht oder mehr Tieren geteilt, und die Testverbindungen wurden für 14 Tage verabreicht. Gruppen, die Kochsalzlösung und eine Pentamidin-Behandlung erhielten, wurden als Kontrollgruppen eingeschlossen.
Am Ende der acht Wochen wurden die Tiere durch Chloroform-Inhalation getötet. Die linke Lunge wurde gewogen, auf eine Partikelgröße gemahlen, die durch ein Drahtsieb mit einer Maschengröße Nr. 60 gegeben werden konnte und in einer Menge von 1:10 (Gewicht/Volumen) in eine 10 mM β-Mercaptoethanol enthaltende Hanks' Balanced Salts Solution (HBSS) ohne Kationen suspendiert. Es wurden Deckgläser hergestellt durch Aufspotten von 5 μl Lungenhomogenat, das in einer Menge von 1:10 in HBSS mit β-Mercaptoethanol verdünnt war, und diese ließ man an der Luft trocknen. Die Gläser wurden mit Cresylviolett gefärbt, und die Cysts wurden durch Blind-Protokoll gezählt. Die Zahl der Cysts pro Gramm Original-Lungengewebe wurde berechnet, und die Gruppen wurden als Prozentwert der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen angegeben.
Der Anti-P. Carinii-Wert für jede Verbindung wird ausgedrückt als Prozentwert der Cysts in der Behandlungsgruppe, verglichen mit der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppe. Die Werte wurden auch mit einer positiven Kontrollgruppe verglichen, die aus Tieren bestand, die intravenös mit Pentamidin behandelt worden waren.
Alle vier getesteten aromatischen Amidoxime waren aktiv gegen P. Carinii, wenn sie oral über die künstliche Ernährung einmal täglich für die Zeit von 14 Tagen verabreicht wurden (s. Tabelle 2). Die mittleren Cyst-Counts für jede Test-Gruppe waren signifikant reduziert, verglichen mit der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppe. Die Verbindungen 3, 5 und 7 waren am meisten aktiv. Die aromatischen Diamidine, die den Amid oximen 3, 5 und 7 entsprachen (Verbindungen 4, 6 und 8) hatten im Gegensatz dazu reduzierte oder keine Anti-P. Carinii-Aktivität, wenn sie oral verabreicht wurden (siehe Tabelle 3). Das einzige Diamidin mit signifikanter oraler Aktivität war Verbindung B. Sein entsprechendes Diamidoxim (Verbindung 7) war aktiver (siehe Tabelle 2).
Alle getesteten aromatischen Amidoxime hatten eine exzellente Anti-P. Carinii-Aktivität, wenn sie intravenös verabreicht wurden. Die mittleren Cyst-Counts für die Verbindungen 1, 3, 5 und 7 waren signifikant reduziert, verglichen mit denen der Tiere der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppen (siehe Tabelle 2), und sie waren auch niedriger als die Cyst-Counts für die intravenös behandelte Pentamidin-Gruppe. Die Diamidin-Verbindungen 4, 6 und 8 haben, wie bereits früher gezeigt wurde, intravenöse Aktivität (siehe Tabelle 3). Direkte Vergleiche der Aktivitäten von Diamidinen und den entsprechenden Diamidoximen (Verbindungen 3, 5 und 7) bei intravenöser Verabreichung können nicht durchgeführt werden, da die intravenösen Aktivitäten von Diamidinen früher nach einem unterschiedlichen Bewertungsverfahren bei geringfügig unterschiedlichen Dosierungen ermittelt wurden. Jedoch geben die Daten an, dass sich die Amidoxime vorteilhaft in Bezug auf die intravenöse Wirksamkeit vergleichen lassen.
Beispiel 5
Reduzierte akute Toxizität von Amidoximen der Formel I in normalen Ratten
Die Toxizität wurde in Ratten untersucht, die nicht im Rahmen einer Dexamethason-Behandlung immunsuppressiv behandelt worden waren. Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten, die in geschlossenen Käfigen aufgezogen worden waren und nicht zertifiziert virusfrei waren und zu dem Zeitpunkt 300 bis 450 g wogen, wurden erhalten von der Firma Hilltop Laboratories (Scottsdale, PA). Die einzeln in Käfigen gehaltenen Tiere erhielten Wasser und Rattenfutter (Firma Agway, Syracuse, NY) nach Wunsch. Jedem Tier wurde über die Schwanzvene eine Dosis einer Test-Verbindung injiziert. Die Tiere wurden für einen Zeitraum von 10–12 Minuten im Anschluss an eine Injektion des Test-Arzneimittels jeden Tag auf Zeichen von akuter Toxizität genau beobachtet, einschließlich der hypotensiven Response (Erblassen der Augen und Pfoten, Dyspnoe, Lethargie und abgesenkte Körpertemperatur), wie sie durch intravenöse Verabreichung von Pentamidin bei seiner wirksamen Dosis hervorgerufen wird (siehe „R. R. Tidwell et al., J. Protozool. 36, 74S–76S (1989)"; „R. R. Tidewell et al., J. Med. Chem. 33, 1252 (1990)"). Jedes Tier wurde für einen Zeitraum von 15 min nach der Injektion genau beobachtet und zum Zeitpunkt von 30 min, 60 min und 24 h lang nach der Injektion überwacht. Die Gesundheit und das allgemeine Wohlbefinden der Ratten wurden auf täglicher Basis für den Rest des Experiments beobachtet und aufgezeichnet. Übermäßiger Gewichtsverlust (ein Gewichtsverlust von mehr als 25 g über die zweiwöchige Dosierungs-Periode wurde als übermäßig im Vergleich mit den mit Kochsalz behandelten Tieren angesehen) wurde als Schlüssel-Indikator einer sich verschlechternden Gesundheit aufgrund der Toxizität des Arzneimittels angesehen. Zum Zeitpunkt der Necroskopie wurden die Leber, die Milz, die Nieren und der Pankreas von jedem Tier entfernt, in Bezug auf die grobe Pathologie untersucht und für eine Histopathologie aufgehoben.
In diesen normalen Ratten waren offenkundige akute nachteilige Reaktionen im Anschluss an einzelne intravenöse Injektionen in starkem Maße reduziert bei drei Bis-Benzamidoximen (Verbindungen 1, 5 und 7), verglichen mit den Bis-Benzamidinen (Verbindungen 2 (Pentamidin), 6 und 8). Keine nachteilige Reaktion wurde nach der hohen oral verabreichten Einzel-Dosierungen der Bis-Benzamidoxim-Verbindungen beobachtet. Zum Vergleich: normale Ratten, denen über einen Zeitraum von 30 s 20 μMol/kg Pentamidin injiziert worden war, erschienen hypotensiv, wo bei Extremitäten schnell verblassten und eine Hypoaktivität und Dyspnoe auftrat, was bis zu einer schwachen Cyanose der Extremitäten fortschritt. Eine erhöhte Lakrimation (Tränenabscheidung) und eine geringere Hinterpfoten-Ataxie wurden unmittelbar vor dem Eintreten einer Hypoaktivität beobachtet. Die Tiere schienen sich innerhalb von 5 min nach der Injektion zu erholen. Tiere, denen 40 μMol/kg Pentamidin injiziert worden war, hatten sofortige starke Hinterpfoten-Kontraktionen, erhöhte Speichelbildung, Dyspnoe, anfängliches Verblassen der Extremitäten, das zu einer merklichen Cyanose voranschritt, und verstärkte Hypoaktivität, und sie bewegten sich für wenigstens 5 min gar nicht. Die Tiere schienen sich im Verlauf von etwa 20 min nach der Injektion zu erho len. Im Gegensatz dazu verursachte das Diamidoxim-Analog von Pentamidin (Verbindung 1), das in derselben Weise verabreicht wurde, keine beobachtbaren nachteiligen Reaktionen in einem Konzentrationsbereich von 20 bis 60 μMol/kg. Schwache toxische Reaktionen einschließlich einer kaum beobachtbaren Hinterpfoten-Ataxie und geringer Hypoaktivität wurden bei einer Konzentration von 80 μMol/kg beobachtet, wobei eine vollständige Erholung in der Zeit von 5 min nach der Injektion eintrat. Bolus-Injektionen oberhalb von 120 μMol/kg erzeugten eine schwere Dyspnoe und eine verstärkte Hypoaktivität.
Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet für die Diamidoxim-Verbindungen 5 und 7, wenn diese mit ihren jeweiligen Diamidin-Analogen verglichen wurden. Die Diamidin-Verbindung 6 schien weniger akut toxisch zu sein als Pentamidin, und es gab keine offensichtliche Toxizität bei 20 μMol/kg. Eine Dyspnoe, die zu einer Cyanose fortschritt, eine übermäßige Speichel- und Tränen-Absonderung und Hypoaktivität wurden bei 40 μMol/kg beobachtet. Diese Antworten wurden stärker bei Dosierungen von 80 und 100 μMol/kg, wobei die Symptome für 30 min nach einer Injektion anhielten. Im Gegensatz dazu verursachte die Diamidoxim-Verbindung 5 keine offensichtliche Toxizität bei 20, 40 oder 80 μMol/kg und nur eine schwache Ataxie und/oder Hypoaktivität bei der hohen Dosierung bei 160 μMol/kg. Die Tiere hatten sich 5 min nach der Injektion vollständig wieder erholt.
Die Diamidin-Verbindung 8 schien sogar auch stärker akut toxisch zu sein als die beiden anderen getesteten Diamidine, wobei eine merkliche Hypoaktivität bei Tieren auftrat, die eine Dosis von 10 μMol/kg erhalten hatten. Starke Muskel-Kontraktionen und Tremor, extensive Absonderung von Speichel und Tränen, Dyspnoe und merkliche Hypoaktivität, die für mehr als 15 min anhielt, wurden bei Tieren beobachtet, die eine Dosis von 20 μMol/kg per Injektion erhalten hatten. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die eine Injektion mit dem Diamidoxim-Analog, Verbindung 7, erhalten hatten, keine beobachtbaren nachteiligen Wirkungen bei 20 oder 40 μMol/kg und nur eine sehr schwache Hypoaktivität und Dyspnoe bei 80 μMol/kg, wobei eine Erholung nach 5 min eintrat. Verbindung 7, wenn per Injektion verabreicht in einer Dosis von 160 μMol/kg, rief eine deutliche Hypoaktivität, Dyspnoe, Cyanose und verstärkte Speichel- und Tränen-Absonderung hervor, wobei die Symptome für etwa 10 min nach der Injektion anhielten.
Keine offensichtlichen toxischen Reaktionen wurden beobachtet, wenn den Ratten irgendeine der Test-Verbindungen oral verabreicht wurde, einschließlich einzelner oraler Dosen einer Konzentration von 160 μMol/kg für jede der Diamidoxim-Verbindungen 1, 5 und 7.
Beispiel 6
In-Vitro-Metabolismus der Verbindungen der Formel I
Untersuchungen des In-Vitro-Metabolismus der Diamidoxime 1, 3, 5 und 7 anhand von bei 9000 × g behandelten Überständen von Rattenleber-Homogenat, bei 105.000 × g behandelten Postmitochondrial-Überständen oder Mikrosomen-Fraktionen wurden durchgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde („B. J. Berger et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 36, 1825–1831 (1992)"; B. J. Berger et al., J. Pharmacol. Experimental Therapeutics. 256, 883–889 (1991)"). Kurz beschrieben, wurde erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die in Käfigen aufgezogen worden waren (Hilltop Laboratories, Scottsdale, PA) Wasser und Rattenfutter (Firma Agway, Syracuse, NY) nach belieben verabreicht. Die Ratten wurden durch Enthaupten getötet, die Lebern wurden sofort entfernt, mit 50 nM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) gespült und auf Eis gepackt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Lebern wurden zerkleinert, homogenisiert, und es wurden nach Zentrifugieren bei 9000 × g Überstandsflüssigkeiten hergestellt, bei 105.000 × g Überstandsflüssigkeiten hergestellt oder bei 105.000 × g Mikrosomen-Pellets hergestellt. Jede Fraktion wurde auf ihren Protein-Gehalt getestet, wie dies beschrieben ist in der Druckschrift „M. M. Bredfort, Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976)", und die Fraktionen wurden bei –80°C gelagert. Fraktionen von Ratten-Nieren, Lungen, Herzen und Gehirnen wurden in ähnliche Weise hergestellt.
Reaktionsmischungen bestanden aus 1,5 ml 50 nM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 0,5 ml Cofaktor-Lösung (2 mg/ml NADPH), 1,6 mg/ml MgCl₂, 1,04 mg/ml Glucose-6-Phosphat und 2 Einheiten/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 0,5 ml Gewebe-Homogenat und 0,5 ml des passenden Diamidoxim-Substrats in einer Konzentration von 167 μM. Die Reaktionen wurden gestartet, indem man das Substrat zusetzte; danach wurden die Mischungen bei 37°C in einem Schüttel-Wasserbad für die in den Figuren gezeigten Zeiten inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet durch Extrahieren über C₁₈-Patronen und Testen gemäß der nachfolgenden Beschreibung.
Metabolismus-Experimente mit intakten kultivierten Zellen wurden durchgeführt unter Verwendung der BRL-3A-Hepatocyten-Linie, erhalten von der Firma UNC-Chapel Hill Lineberger Tissue Culture Facility. Die Zellen wurden routinemäßig in der Firma Costar (Cambridge, MA) erhaltenen 25 cm³ passenden Gewebekultur-Kolben bei 37°C unter feuchter Mischung aus 5% CO₂ und 95% Luft in Ham's F-12-Medium (Firma Gibco, Gaithersburg, MD), das 5% fetales Rinderserum enthielt (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), kultiviert. Konfluente Kulturen wurden mit 0,25% Trypsin-Lösung (Firma Sigma Chemical Co., St. Louis MO) behandelt, und anschließend wurden Unterkulturen von etwa 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in Costar-6-Vertiefungs-Gewebe-Kammern kultiviert, und man ließ die Zellen dann konfluent wachsen. 10 ml frisches Medium wurde jeder Kultur-Vertiefung zugegeben, und Inkubationen wurden gestartet durch Zusatz von 100 μl Amidoxim-Lösung (hergestellt in sterilem Wasser) bis zu einer End-Konzentration von 10 μM. Die Zellkulturen wurden bei 37°C unter einer Mischung aus 5% feuchtem CO₂ und 95% Luft 24 h lang inkubiert. Danach wurden aliquote Mengen der Kultur-Überstandsflüssigkeiten extrahiert und auf Metaboliten getestet, wie es nachfolgend gezeigt ist. Ähnliche Metabolismus-Experimente wurden durchgeführt mit kultivierten J774 A.1 Mouse-Monocyten-Makrophagen-Zellen, die in DMEM F-12-Medium kultiviert worden waren, das 10% fetales Rinderserum enthielt, und mit H9c2-Rattenherz-Myoblasten-Zellen, die in DMEM-H-Medium kultiviert worden waren, das 10% fetales Rinderserum enthielt.
Die Proben wurden unter Verwendung von Festphasen-Extraktion extrahiert und unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) getestet, und zwar nach Verfahren, die ähnlich denjenigen waren, die früher beschrieben wurden in „Berger et al. (1992)" und „Berger et al. (1991), a.a.O.".
Kurz beschrieben, wurden Proben, die mit 2,5-Bis[4-(N-isoproylamidino-)phenyl]furan-dihydochlorid als internen Standard (IS) gespeikt worden waren, über aktivierten C₁₈-Bond-Elut-Patronen (Firma Varian Associates, Sunnydale, CA) extrahiert, mit Wasser und anschließend mit 100% Acetonitril gewaschen, anschließend mit 75% Acetonitril/25% Wasser eluiert, das 15 mM Triethylamin enthielt, und anschließend mit 35 mM Essigsäure eluiert. Die Diamidoxim-Substrate wurden in der Phase mit 100% Acetonitril eluiert, während die Mono-Amidin- und Diamidin-Produkte in der Acetonitril/Wasser-Mischung eluiert wurden, die Triethylamin und Essigsäure enthielt. Die Eluate wurden bei 40°C zur Trockene eingedampft, und zwar unter einem schwachen Strom von Stickstoff, und wurden in Wasser (Qualitätsanforderungen für HPLC) resuspendiert.
Die Auflösung der Verbindungen erfolgte unter Verwendung eines HPLC-Geräts (Modell 1090 der Firma Hewlett-Packard, Avendale, PA), das ausgestattet war mit einem hinsichtlich der Wellenlänge variablen Detektor-Set (HP 1050) bei 265 nm, einer 4,6 × 250 mm Zorbax-RX-Diisopropyl-C8-Säule (Firma Mac-Mod, Chadd's Ford, PA), die bei 40°C gehalten wurde, und einem Vectra 486/66U-Computer mit HP Chemstations-Software. Die mobile Phase bestand aus 15 mM Triethylamin und 35 mM Essigsäure in Wasser (HPLC-Qualitätsstufe) für Pumpe A und aus 15 mM Triethylamin und 35 mM Essigsäure in 75% Acetonitril in Wasser für Pumpe B. Die Strömungsgeschwindigkeit des Lösungsmittels betrug 1,5 ml/min, und der Lösungsmittel-Gradient lief von 0% B bis 25% B bei 22 min zu 40% B bei 25 min und dann zu 90% B bei 35 min. Alle für die Tests verwendeten Lösungsmittel und Reagenzien waren solche der Reinheitsstufe für HPLC. Die Menge der gebildeten Metabolite wurden berechnet, wobei man die Peak-Flächen-Verhältnisse authentischer Standard-Proben verwendete, aus Standard- Additionskurven, die durch Einspeiken von Standards in Gewebe-Homogenate oder Gewebe-Kulturmedium erzeugt worden waren.
Es wurde gezeigt, dass bei 9000 × g behandelte Rattenleber-Homogenat-Überstandsflüssigkeiten leicht das Diamidoxim-Analog von Pentamidin (Verbindung 1) reduzieren und dabei große Mengen des Monoamidin-Monoamidoxim-Derivats und kleinere Menge von Pentamidin (Verbindung 2) zu bilden („B. Clement et al., Drug Metabol. Dispos. 22, 486–497 (1994)"; siehe 1A). Die Metabolite wurden vorher durch Massenspektrometrie identifiziert („U. Bronner et al., Pharmacol. Toxicol., 77, 114–120 (1995)"). Die Bis-Benzamidoxime gemäß der vorliegenden Erfindung (Verbindungen 3, 5 und 7) scheinen in ähnlicher Weise durch bei 9000 × g behandelte Rattenleber-Homogenat-Überstands-Flüssigkeiten metabolisiert zu werden, wie dies in den 1B, 1C bzw. 1D gezeigt ist. In jedem Fall wurden zwei Produkt-Peaks eluiert, und zwar die kleineren Peaks in 1B, 1C und 1D, die mit der Diamidin-Standard-Verbindung 4, 6 bzw. 8 co-eluiert wurden. Obwohl synthetische Standards für die Monoamidin-Monoamidoxim-Deriverate der Verbindungen 3, 5 und 7 nicht erhältlich sind, sind die relativen Retentionszeiten der chromatographisch erhaltenen Peaks vollständig konsistent mit denjenigen, die für die Monoamidoxim-Derivate vorausgesagt wurden.
Die N-Hydroxylierung von aromatischen Amidinen unter Bildung aromatischer Amidoxime wird – wie bekannt ist – durch spezielle Cytochrome P450 katalysiert (siehe „B. Clement et al., Drug Metabol. Dispos. 22, 486–497 (1994)"). Jedoch wurde berichtet, dass eine Reduktion von Amidoximen zurück zu den Amidinen durch eine nicht-Cytochrome P450 abhängige Reduktase-Aktivität katalysiert wird (id). Die in den 2 und 3 präsentierten Daten zeigen an, dass die Reduktase in der Post-Mitochondiralen-Mikrosomen-Fraktion zugegen ist. Jedoch scheint die Reduktase-Aktivität in der Post-Mitochondiralen-Überstands-Fraktion sogar noch höher zu sein (2). Die Ergebnisse zeigen auch, dass eine hohe Reduktase-Aktivität auch in Homogenaten aus Rattennieren und -lange sowie in Homogenaten aus dem Herz und dem Gehirn gefunden wird (3). Von den letztgenannten Geweben ist bekannt, dass sie nur eine geringe Cytochrom P450-Aktivität enthalten.
Schlussendlich absorbierten und metabolisierten intakte Zellen der etablierten Leber-Zell-Linie BRL 3A (4), der Herz-Zell-Linie H9c2 (Daten nicht gezeigt) und der Makrophagen Zell-Linie J774 A.1 (Daten nicht gezeigt) alle leicht die Diamidoxim-Verbindungen. Diese Daten zeigen an, dass ein Metabolismus von Amidoxim-Prodrugs durch von Cytochromen P450 verschiedene Aktivitäten katalysiert wird, und zeigen, dass Gewebe und andere Zellen, die von denen der Leber verschieden sind, hohe Aktivitäts-Levels besitzen. Es scheint, dass dafür, dass die Amidoxim-Prodrugs wirksam gegen extrazelluläre Parasiten wie beispielsweise P. Carinii sind, die Verbindungen offensichtlich in die Wirtszellen eintreten müssen, chemisch zurück zu dem aktiven Amidin-Analogen reduziert werden müssen und dann extrazellulär freigesetzt und durch den infektiösen Organismus aufgenommen werden müssen. Der Prozess der Zellaufnahme, des Metabolismus und der Freisetzung erfolgt leicht BRL-3A-Hepatocyten, die in vitro kultiviert wurden (4). Jedes der oral aktiven Bis-Benzamidoxime 1, 3, 5 und 7 wurde vornehmlich zu dem entsprechenden Diamidin metabolisiert, welches dann in hohen Konzentrationen zurück in die Kultur-Überstände freigesetzt wurde.

Claims

Verbindung, die ein Bis-Benzamidoxim der Formel Ib ist oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist:
worin entweder A) R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl; R₃ ein Niederalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl ist; n für 2 bis 6 steht; X für O oder S steht; und Y für H oder Niederalkyl steht; oder B) n für 3 oder 4 steht; X für O steht; Y für H steht; R₁ und R₂ jeweils für H stehen; und R₃ für H oder -OCH₃ steht.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl; R₃ Niederalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl ist; n für 2 bis 6 steht; X für O oder S steht; und Y für H oder Niederalkyl steht.
Verbindung nach Anspruch 1, worin n für 3 oder 4 steht; X für O steht; Y für H steht; R₁ und R₂ jeweils für H stehen; und R₃ für H oder -OCH₃ steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Verbindung ein Maleinat-Salz der Verbindung von Formel Ib ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die 1,3-Bis-(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan; 1,3-Bis-(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan; 1,4-Bis-(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan; 1,3-Bis-(4'-(4-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat; 1,3-Bis-(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat oder 1-(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan-bis-maleinat ist.
Pharmazeutische Zubereitung, die ausschließlich für die orale Verabreichung geeignet ist und die in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 6, die in einer separaten Einheit, beispielsweise einer Kapsel, einer Oblatenkapsel, einer Pastille oder einer Tablette, dargeboten wird.
Verbindung, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert wird, zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie durch orale Verabreichung des Medikaments.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das Medikament (i) zur Therapie eines Wesens, das mit Pneumocystis Carinii-Pneumonie befallen ist; oder (ii) zur Prophylaxe eines Wesens, das gefährdet ist, sich Pneumocystis Carinii-Pneumonie zuzuziehen.
Verwendung eines Bis-Benzamidoxims der nachfolgenden Formel (Ia) oder pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie durch intravenöse Verabreichung des Medikaments:
worin A) R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Amionalkyl oder Alkylaminoalkyl; R₃ H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl oder Halogen ist; n für 2 bis 6 steht; X für O oder S steht; und Y für H oder Niederalkyl steht.
Verwendung nach Anspruch 11, worin das Bis-Benzamidoxym oder Salz dasjenige ist, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist.
Pharmazeutische Zubereitung, die eine Verbindung enthält, wie sie in Anspruch 11 oder Anspruch 12 definiert ist, und die ausschließlich zur intravenösen Verabreichung angepasst ist.
Pharmazeutische Zubereitung, die eine Verbindung enthält, wie sie in Anspruch 11 oder Anspruch 12 definiert ist, und in einer versiegelten Ampulle oder Phiole enthalten ist, wobei die Verbindung in einem gefriergetrockneten Zustand, bereit für die Zugabe eines flüssigen Trägers vorliegt, um eine intravenöse Formulierung herzustellen, oder in einer Injektionszubereitung, bereit für die Injektion, vorliegt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion durch orale Verabreichung des Medikaments.
Verwendung nach Anspruch 15, worin die mikrobielle Infektion hervorgerufen wird durch eine Mikrobe, die ausgewählt ist aus Pilzen, Algen, Protozoen, Bakterien und Viren.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die Mikrobe ausgewählt ist aus Gardia lamblia, Cryptospridium parvum, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida tropicalis, Salmonella typhimurium, Plasmodium falciparum und Leishmania mexicana amazonensis.