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Bereich der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Bis-Benzamidoxim-Derivate, pharmazeutische
Zubereitungen, die diese enthalten, und deren Verwendung für die Herstellung
eines Medikaments, das nützlich
in der Bekämpfung
von Pneumocystis Carinii-Pneumonie ist, sowie Prodrug-Verbindungen,
die dafür
nützlich
sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Pentamidin
wird für
die Behandlung von P. Carinii-Pneumonie (Pneumocystis carinii pneumonia,
PCP) verwendet. Die Wichtigkeit von Pentamidin hat sich in jüngerer Zeit
dramatisch verstärkt
aufgrund eines erheblichen Anstiegs der Zahl von Patienten, die
an PCP leiden. Die Erhöhung
der Zahl in der befallenen Patienten-Population ist eine unglückliche
Folge der steigenden Präsenz
des erworbenen Immunmangel-Syndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome,
Aids). Es wird derzeit geschätzt,
dass sich etwa 70% der Aids-Patienten PCP zuziehen. Aufgrund des
starken Vorkommens von PCP bei Aids-Patienten hat Pentamidin Nutzen nicht
nur bei der Behandlung von PCP gefunden, sondern auch als Prophylaxe
bei der Vorbeugung oder Verzögerung
des anfänglichen
Auftretens oder einem Rückfall
von PCP, speziell bei Aids-Patienten. Derzeit wird Pentamidin am
weitesten verbreitet als therapeutisches Mittel durch intravenöse Infusion
und als prophylaktisches Mittel über
eine Aerosol-Dosierung verabreicht.
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Jedoch
ist eine unglückliche
Nebenwirkung von Pentamidin seine Toxizität. Einige Todesfälle wurden starker
Hypotonie, Disglykämie
(Störung
des Blutzucker-Gehalts) und Herz-Arrhythmien bei Patienten zugeschrieben,
die mit Pentamidin behandelt worden waren. Andererseits kann eine
unzureichende Dosierung zu einer Verbreitung der Krankheit über die
Lunge hinaus führen,
einem Ereignis, das mit einer schlechten Prognose verbunden ist.
Eine therapeutische Arzneimittel-Überwachung wird wegen der Kosten
und der Komplexität
der derzeit erhältlichen
Assay-Techniken nicht angewandt, die die Extraktion von Plasma und
eine High-Performance-Liquid-Chromatographie Analyse (HPLC) erfordern.
Im Ergebnis ist die Toxizität
von Pentamidin ein signifikant wichtiger Punkt, der den Markt in
Richtung auf die Entwicklung von Pentamidin- Ersatzstoffen vorantreibt, die in der
Lage sind, die unerwünschten
Nebenwirkungen, die mit der Verwendung von Pentamidin verbunden
sind, zu vermeiden oder zu minimieren. Dazu wird beispielsweise
auf folgende Druckschriften verwiesen: J. Spychala et al., Eur.
J. Med. Chem. 29, 363–367
(1994); I. O. Donkor et al., J. Med. Chem. 37, 4554–4557 (1994);
R. R. Tidwell et al., J. Protozool. 6, 148S–150S (1991).
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Die
Druckschrift WO 95/01168 offenbart pharmazeutische Formulierungen,
die nützlich
für die
Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie sind. Der aktive Wirkstoff
enthält
wenigstens eine Amidin-wirksame funktionelle Gruppe in Form eines
Amidoxims, eines Amidoximesters oder eines 1,2,4-Oxadiazols. Bevorzugte
aktive Verbindungen haben die Formel Ph-X-(CH2)n-Y-Ph, worin X und Y unabhängig voneinander
für O,
N oder S stehen und die beiden Phenyl-Gruppen unabhängig voneinander
durch eine Amidin-wirksame funktionelle Gruppe in 4-Stellung substituiert
sind sowie gegebenenfalls in 2- und 5-Stellung substituiert sind.
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Dementsprechend
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen
bereitzustellen, die nützlich
bei der Behandlung von Pneumocystis Carinii-Pneumonie sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen, die nützlich zur
Behandlung von PCP sind, sowie pharmazeutische Formulierungen, die
die Verbindungen enthalten, und ihre Verwendung für die Herstellung von
Medikamenten bereit.
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In
einem weiteren Aspekt besteht die Erfindung in der Verwendung bestimmter
Verbindungen für
die Herstellung intravenös
verabreichbarer Medikamente zur Behandlung von PCP.
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Die
Verbindungen sind Bis-Benzamidoxime, wie sie in den Ansprüchen definiert
sind, auf die der Leser für
eine noch vollständigere
Offenbarung der verschiedenen Aspekte der Erfindung und deren Ausführungsformen
verwiesen wird.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 ist
eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus von Bis-Benzamidoximen gemäß der vorliegenden
Erfindung durch die Überstands-Fraktion
eines bei 9000 × g
behandelten Rattenleber-Homogenats. In den Metabolismus-Untersuchungen, die
in den 1A, 1B, 1C und 1D veranschaulicht
werden, wurden Homogenate, die 167 μM-Test-Verbindung als Substrat
plus eine Cofaktor-Lösung
enthielten, bei 37°C
10 min lang inkubiert und wurden anschließend mittels HPLC getestet,
wie dies weiter unten in Beispiel 7 beschrieben ist. In allen Figuren
bedeutet „IS" interner Standard. 1A veranschaulicht den Metabolismus von Verbindung
1 in ihr Amidin-Analog Pentamidin (in der Figur bezeichnet mit der
Ziffer 2) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivat (in der Figur
bezeichnet mit der Ziffer 9). 1B veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 3 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
bezeichnet mit der Ziffer 4). 1C veranschaulicht den
Metabolismus von Verbindung 5 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
bezeichnet durch die Ziffer 6). 1D veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 7 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
bezeichnet mit der Ziffer 8).
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2 ist
eine graphische Veranschaulichung des Zeit-Verlaufs einer Reduktion
der Bis-Benzamidoxim-Verbindung 1 in ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Produkt,
ausgedrückt
als Maß von
nMol Produkt/mg Protein (Wert auf der Y-Achse) als Funktion der
Zeit in min (Wert auf der X-Achse). Die offenen Kreise stehen für Datenpunkte
für die
Reduktion von Verbindung 1 in der post-mitochondrialen Überstands-Fraktion
von Rattenleber, beschrieben unten in Beispiel 7. Die geschlossenen
Kreise stehen für
Datenpunkte für
die Reduktion von Verbindung 1 in Rattenleber-Mikrosomen-Fraktionen,
ebenfalls beschrieben in Beispiel 7.
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3 ist
eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus der Bis-Benzamidoxim-Verbindung 1 in ihr
Amidin-Analog Pentamidin (in der Figur bezeichnet mit der Ziffer
2) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivats (in der Figur bezeichnet
mit der Ziffer 9) anhand der bei 9000 × g behandelten Überstands-Flüssigkeiten von
Homogenaten von Rattenleber (3A);
Rattenniere (3B), Rattenlunge (3C) und Rattenherz (3D).
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4 ist
eine Spektral-Veranschaulichung des Metabolismus von Bis-Benzamidoximen der
vorliegenden Erfindung in intakten BRL-3A-Hepatocyten in vitro.
In den Metabolismus-Untersuchungen, die in den 4A, 4B, 4C und 4D veranschaulicht sind, wurden Zellen,
die in Ham's F-12-Medium
kultiviert wurden, das 5 fetales Rinderserum und 10 μM Diamidoxim-Substrat
enthielt, 24 h bei 37°C
unter 5% CO2 inkubiert. Das extrazelluläre Medium
wurde extrahiert und anschließend
mittels HPLC einem Assay unterworfen, wie dies unten in Beispiel
7 beschrieben ist. In allen Figuren bedeutet „IS" innerer Standard. 4A veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 1 in ihr Amidin-Analog Pentamidin
(in der Figur durch die Ziffer 2 bezeichnet) und ihr Monoamidin-Monoamidoxim-Derivat
(in der Figur durch die Ziffer 9 bezeichnet). 4B veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 3 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
mit der Ziffer 4 bezeichnet). 4C veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 5 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
mit der Ziffer 6 bezeichnet). 4D veranschaulicht
den Metabolismus von Verbindung 7 in ihr Amidin-Analog (in der Figur
durch die Ziffer 8 bezeichnet).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Aktive
Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung sind allgemein Bis-Benzamidoxim-Derivate von
Benzamidinen, die eine gegen Pneumocystis Carinii gerichtete Aktivität aufweisen.
Die Benzamidine, die eine gegen P. Carinii gerichtete Aktivität aufweisen,
können
Monobenzamidine sein, in denen eine Amidoxim-Gruppe des Bis-Benzamidoxim-Derivats
reduziert ist. Alternativ dazu können
sie Bis-Benzamidine sein, in denen beide Amidoxim-Gruppen des Bis-Benzamidoxim-Derivats
reduziert sind. So sind Bis-Benzamidoxim-Derivate von Benzamidinen,
die gegen Pneumocystis Carinii gerichtete Aktivität aufweisen,
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Beispiele solcher Benzamidine
sind beispielsweise offenbart in den US-Patenten Nrn. 2,277,861
(Ewins et al.); 2,410,796 (Newberry et al.); 4,933,347 (Tidwell
et al.) und in der PCT-Anmeldung
Nr. US 93/09477.
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Der
Begriff „Cycloalkyl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf cyclisches C3- bis C6-Alkyl,
wie beispielsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Cyclohexyl und Cyclopentyl sind derzeit bevorzugt.
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Der
Ausdruck „Aryl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf cyclische C3- bis C10-Aromaten-Gruppen
wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl und dergleichen und schließt substituierte
Aryl-Gruppen wie
beispielsweise Tolyl ein.
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Der
Begriff „Hydroxyalkyl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf lineares oder verzweigtes, Hydroxysubstituiertes C1- bis C4-Alkyl,
d. h. -CH2OH, -(CH2)2OH usw.
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Der
Begriff „Aminoalkyl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf lineares oder verzweigtes, Aminosubstituiertes C1- bis C4-Alkyl,
wobei sich der Begriff „Amino" auf die Gruppe NR'R'' bezieht,
in der R' und R'' unabhängig voneinander gewählt sind
aus H oder Niederalkyl, wie es oben definiert wurde, d. h. -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2 usw.
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Der
Begriff „Oxyalkyl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf mit Sauerstoff substituiertes C1-
bis C4-Alkyl,
d. h. -OCH3, und der Begriff „Oxyaryl", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht
sich auf mit Sauerstoff substituierte cyclische C3-
bis C10-Aromaten-Gruppen.
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Die
Verbindungen, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, sind Bis-Benzamidoxime der Formel Ia:
worin:
R
1 und R
2 jeweils
unabhängig
voneinander gewählt
sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl,
Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl;
R
3 steht für
H, Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl,
Aryl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl oder Halogen;
n steht für 2 bis
6;
X steht für
O oder S; und
Y steht für
H oder Niederalkyl;
oder pharmazeutische annehmbare Salze davon.
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Die
Verbindungen der Formel (Ia) und ihre Salze sind nützlich für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von PCP durch intravenöse Verabreichung
des Medikaments.
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Bestimmte
Bis-Benzamidoxime der Formel (Ia) sind neu, und diese haben die
Formel (Ib):
worin
entweder
- A) R1 und
R2 jeweils unabhängig voneinander gewählt sind
aus der Gruppe, die besteht aus Niederalkyl, Oxyalkyl, Alkoxyalkyl,
Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Aminoalkyl oder Alkylaminoalkyl;
R3 steht für
Niederalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aminoalkyl
oder Alkylaminoalkyl;
n steht für 2 bis 6;
X steht für O oder
S; und
Y steht für
H oder Niederalkyl;
oder
- B) n steht für
3 oder 4;
X steht für
O;
Y steht für
H;
R1 und R2 stehen
jeweils für
H; und
R3 steht für H oder -OCH3.
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Wie
oben angemerkt, sind die Produkte und Verwendungen der vorliegenden
Erfindung nützlich
in Bezug auf eine Behandlung von P. Carinii-Pneumonie, und zwar
dahingehend, dass sie das Einsetzen, das Steigern oder die Verbreitung
des Zustands inhibieren, eine Regression des Zustands hervorrufen,
den Zustand heilen oder in anderer Weise das allgemeine Wohlbefinden
eines Wesens verbessern, das von dem Zustand heimgesucht wird oder
in Gefahr steht, sich diesen Zustand zuzuziehen.
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Wesen,
die zu behandeln sind, sind typischerweise menschliche Wesen, obwohl
die Produkte und Anwendungen der vorliegenden Erfindung nützlich in
Beziehung auf irgendein geeignetes Wesen sein können, was Fachleuten in diesem
technischen Bereich bekannt ist.
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Wie
oben angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische
Formulierungen bereit, die die vorgenannten aktiven Verbindungen
umfassen, oder pharmazeutisch an nehmbare Salze davon, und zwar in pharmazeutisch
annehmbaren Trägern
für eine
orale, intravenöse
oder Aerosol-Verabreichung, wie sie weiter im Einzelnen nachfolgend
diskutiert wird.
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Die
therapeutisch wirksame Dosis irgendeiner speziellen Verbindung,
deren Verwendung im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, schwankt
ein wenig von Verbindung zu Verbindung, von Patient zu Patient und
hängt ab
von dem Zustand des Patienten und dem Verabreichungsweg. Als allgemeiner
Vorschlag weist eine Dosierung von etwa 0,1 bis etwa 100 mg/kg therapeutische
Wirksamkeit auf, wobei alle Gewichte berechnet sind auf der Grundlage
des Gewichts der aktiven Basis, einschließlich der Fälle, in denen ein Salz verwendet
wird. Eine Dosierung von etwa 10 mg/kg bis etwa 50 mg/kg kann bei
einer oralen Verabreichung eingesetzt werden. Die Dauer der Behandlung
ist üblicher
Weise einmal pro Tag für
einen Zeitraum von 2 bis 3 Wochen oder bis die P. Carinii-Pneumonie
im Wesentlichen unter Kontrolle ist. Geringere Dosierungen, die
weniger häufig
verabreicht werden, können
verwendet werden, um das Auftreten eines Rückfalls der Infektion zu verhindern
oder zu reduzieren.
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In Übereinstimmung
mit dem vorliegenden Verfahren kann eine aktive Verbindung, wie
sie vorliegend beschrieben wird, oder ein pharmazeutisch annehmbares
Salz davon oral als Feststoff oder als Flüssigkeit verabreicht werden
oder kann intravenös
verabreicht werden. Alternativ kann die aktive Verbindung oder das
Salz auch durch Inhalation verabreicht werden. Wenn die aktive Verbindung
oder das Salz durch Inhalation verabreicht wird, sollte sie/es in
Form einer Vielzahl von festen Teilchen oder Tröpfchen vorliegen, die eine
Teilchengröße von etwa
0,5 bis etwa 5 Mikron haben, vorzugsweise von 1 bis 2 Mikron. Die
neuen Verbindungen der Formel (Ib) können in jeder beliebigen Formulierung
verwendet werden, während
die einzig beanspruchten Aspekte der Erfindung, die auf die ganze
Klasse der Verbindungen der Formel (Ia) diejenigen sind, die sich
auf eine intravenöse
Verabreichung beziehen.
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Über die
Tatsache hinaus, dass die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen
und in den Patentansprüchen
beanspruchten Verbindungen die Behandlung von P. Carinii- Pneumonie vorsehen,
sehen sie auch die Prophylaxe gegen P. Carinii-Pneumonie in einem
immungeschwächten
Patienten, wie beispielsweise einem solchen, der an Aids leidet,
vor, der mindestens eine Episode von P. Carinii-Pneumonie hatte,
der jedoch zum Zeitpunkt der Behandlung keine Zeichen von Pneumonie
zeigt. Da P. Carinii-Pneumonie
eine speziell potentiell zerstörerische
Krankheit für
immungeschwächte
Patienten ist, ist es bevorzugt, das Einsetzen P. Carinii-Pneumonie
zu vermeiden, verglichen mit einem Behandeln der Krankheit, nachdem
sie symptomatisch geworden ist. Dementsprechend ermöglicht die
vorliegende Erfindung die Prophylaxe gegen P. Carinii-Pneumonie,
die ein Verabreichen einer prophylaktisch wirksamen Menge der aktiven
Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an
einen Patienten umfasst. Die Formen der Verabreichung der Verbindung
oder des Salzes in Übereinstimmung
mit diesem Verfahren können
dieselben sein, wie sie für
den Zweck einer tatsächlichen
Behandlung eines Patienten eingesetzt werden, der an P. Carinii-Pneumonie leidet.
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Eine
zusätzliche
nützliche
Behandlung, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird,
ist die Prophylaxe gegen selbst eine anfängliche Episode von P. Carinii-Pneumonie in einem
immungeschwächten Patienten,
der niemals eine Episode von P. Carinii-Pneumonie erfahren hat.
In dieser Hinsicht kann ein Patient, dem die Diagnose gestellt wurde,
dass er immungeschwächt
ist, beispielsweise einer, der unter Aids oder ARC (dem Aids verwandten
Komplex; Aids related complex) leidet, selbst vor dem Einsetzen
einer anfänglichen
Episode von P. Carinii-Pneumonie ein Erkranken an der Infektion
vermeiden oder dieses hinaus zögern,
indem man ihm eine prophylaktisch wirksame Menge einer aktiven Verbindung
verabreicht, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben oder
in den Patentansprüchen
beansprucht ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.
Die Verbindung oder das Salz können
in derselben Weise wie bei der Behandlung von Patienten verabreicht
werden, die unter P. Carinii-Pneumonie leiden.
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Bei
der Herstellung eines Medikaments gemäß der Erfindung (einer „Formulierung") werden aktive Mittel
oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze (die „aktive Verbin dung") typischerweise
gemischt u. a. mit einem annehmbaren Träger. Der Träger muss natürlich annehmbar
in dem Sinn sein, dass er mit beliebigen anderen Bestandteilen in
der Formulierung verträglich
ist, und darf für
das Wesen nicht schädlich
sein. Der Träger
kann fest oder flüssig
oder beides sein und wird vorzugsweise mit der Verbindung als Einheitsdosis-Formulierung
formuliert, beispielsweise als Tablette, die 0,05 Gew.-% bis 99
Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten kann. Eine oder mehrere
aktive Verbindungen) kann/können
in die Formulierung der Erfindung eingearbeitet werden (z. B. kann
die Formulierung ein oder mehrere zusätzliches) Anti-P. Carinii-Pneumonie-Mittel enthalten,
wie sie oben genannt wurden), wobei Formulierungen nach beliebigen
der wohlbekannten Verfahrensweisen der Pharmazie hergestellt werden
können,
die im Wesentlichen aus einem Mischen der Komponente einschließlich einer
oder mehrerer therapeutischer Zusatz- bzw. Hilfs-Komponenten besteht.
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Formulierungen,
die für
eine orale Verabreichung geeignet sind, können in diskreten Einheiten
wie beispielsweise Kapseln, kapselförmigen Verabreichungsformen,
Pastillen oder Tabletten präsentiert
werden, von denen jede eine vorbestimmt Menge der aktiven Verbindung
enthält,
als Pulver oder Granulat, als Lösung
oder Suspension in einer wässrigen
oder nicht-wässrigen
Flüssigkeit
oder als eine Öl-in-Wasser-
oder Wasser-in-Öl-Emulsion.
Derartige Formulierungen können
hergestellt werden nach irgendeinem geeigneten Verfahren der Pharmazie,
welches den Schritt des In-Verbindung-Bringens der aktiven Verbindung
mit einem geeigneten Träger
einschließt
(der ein oder mehrere Zusatzs- bzw. Hilfs-Bestandteile enthalten
kann, wie dies oben angegeben wurde). Allgemein werden die Formulierungen
der Erfindung dadurch hergestellt, dass man einheitlich und innig
die aktive Verbindung mit einer Flüssigkeit oder einem feinteiligen
festen Träger
oder beiden mischt und danach – sofern
erforderlich – die
resultierende Mischung in Form bringt. Beispielsweise kann eine
Tablette hergestellt werden durch Verpressen oder Formen eines Pulvers
oder Granulats, das die aktive Verbindung enthält, gegebenenfalls mit einem
oder mehreren Zusatz- bzw. Hilfs-Komponenten. Komprimierte Tabletten
können
hergestellt werden durch Verpressen der Verbindung in freifließender Form,
beispielsweise eines Pulvers oder Granulats, das gegebenenfalls
mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel und/oder einem
oder mehre ren oberflächenaktiven/dispergierenden
Mittel(n) gemischt ist, in einer geeigneten Vorrichtung. Geformte
Tabletten können
hergestellt werden durch Formen der pulverförmigen Verbindung, die mit
einem inerten flüssigen
Bindemittel befeuchtet ist, in einer geeigneten Vorrichtung. Formulierungen
für eine
orale Verabreichung können
gegebenenfalls darmlösliche Überzüge einschließen, wie
sie in diesem technischen Bereich bekannt sind, um einen Abbau der
Formulierung im Magen zu verhindern und eine Freisetzung des Arzneimittels
im Dünndarm
sicherzustellen.
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Zusätzlich zu
den aktiven Verbindungen oder ihren Salzen können die pharmazeutischen Zubereitungen
andere Zusatzstoffe wie beispielsweise den pH-Wert einstellende
Zusätze
enthalten. Insbesondere schließen
nützliche,
den pH-Wert einstellende Mittel Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Basen
oder Puffer wie beispielsweise Natriumlactat, Natriumacetat, Natriumphosphat,
Natriumcitrat, Natriumborat oder Natriumgluconat ein. Weiter können die
Zubereitungen Mittel zur Haltbarmachung gegen mikrobiellen Befall enthalten.
Nützliche
Mittel zum Haltbarmachen gegen mikrobiellen Befall schließen Methylparaben,
Propylparaben und Benzylalkohol ein. Das Mittel zum Haltbarmachen
gegen mikrobiellen Befall wird typischerweise verwendet, wenn die
Formulierung in eine Phiole gegeben wird, die für eine Mehr-Dosis-Verwendung vorgesehen
ist. Natürlich
können – wie angegeben – die pharmazeutischen
Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung
unter Verwendung von Verfahrensweisen, wie sie in diesem technischen
Bereich wohlbekannt sind, lyophilisiert werden.
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Andere
pharmazeutische Zubereitungen können
aus in Wasser unlöslichen
aktiven Verbindungen oder deren Salzen hergestellt werden, wie beispielsweise
Emulsionen auf Wasser-Basis. In einem derartigen Beispiel enthält die Zubereitung
eine ausreichende Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Emulgiermittels,
um die gewünschte
Menge der aktiven Verbindung oder von deren Salz zu emulgieren.
Besonders nützliche
emulgierende Mittel schließen
Phosphatidylcholine und Lecithin ein.
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Weiter
stellt die vorliegende Erfindung liposomale Formulierungen der aktiven
Verbindungen und von deren Salzen bereit. Die Technologie zur Bildung
liposomaler Suspen sionen ist in diesem technischen Bereich wohlbekannt,
wenn die aktive Verbindung oder ihr Salz ein wasserlösliches
Salz ist, kann dieses unter Anwendung einer herkömmlichen Liposomen-Technologie
in Lipid-Vesikel eingearbeitet werden. In einem derartigen Beispiel
wird die Verbindung oder ihr Salz aufgrund der Wasserlöslichkeit
der Verbindung oder des Salzes in das hydrophile Zentrum oder den
Kern der Liposome im Wesentlichen eingeschlossen. Die verwendete
Lipid-Schicht kann aus irgendeiner herkömmlichen Zusammensetzung bestehen
und kann entweder Cholesterin enthalten oder kann cholesterinfrei
sein. Wenn die Verbindung oder das Salz von Interesse in Wasser
unlöslich ist,
kann das Salz – wiederum
unter Anwendung herkömmlicher
Technologie zur Bildung von Liposomen – im Wesentlichen in die hydrophobe
Lipid-Doppelschicht
eingeschlossen werden, die die Struktur des Liposoms bildet. In
jedem der Beispiele können
die Liposomen, die hergestellt werden, in Bezug auf ihre Größe verkleinert
werden, wie beispielsweise durch die Verwendung von Standard-Ultraschall- und
-Homogenisierungs-Verfahren.
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Natürlich können die
Liposomen-Formulierungen, die die aktiven Verbindungen oder ihre
Salze enthalten, lyophilisiert werden, um ein Lyophilisat herzustellen,
das mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie beispielsweise Wasser
wieder hergestellt werden kann, um so die Liposomen-Suspension zu
regenerieren.
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Es
werden auch pharmazeutische Formulierungen bereitgestellt, die für eine Verabreichung
als Aerosol durch Inhalation geeignet sind. Diese Formulierungen
umfassen eine Lösung
oder Suspension der gewünschten
aktiven Verbindung oder ihres Salzes oder eine Mehrzahl fester Teilchen
der Verbindung oder des Salzes. Die gewünschte Formulierung kann in
eine kleine Kammer gegeben und vernebelt werden. Eine Vernebelung
kann bewirkt werden durch komprimierte Luft oder durch Ultraschall-Energie
unter Bildung einer Mehrzahl von Flüssigkeitströpfchen oder Feststoff-Teilchen,
die die Verbindungen oder ihre Salze umfassen. Die Flüssigkeitströpfchen oder
Feststoff-Teilchen sollten eine Teilchengröße im Bereich von etwa 0,5
bis etwa 5 Mikron aufweisen. Die festen Teilchen können erhalten
werden durch Verarbeitung der festen aktiven Verbindung oder ihres
Salzes in irgendeiner passenden Weise, die in diesem technischen
Be reich bekannt ist, wie beispielsweise durch Mikronisierung. Am
meisten bevorzugt liegt die Größe der festen
Teilchen oder Tröpfchen im
Bereich von etwa 1 bis etwa 2 Mikron. In dieser Hinsicht sind handelsübliche Vernebler
erhältlich,
um dieses Ziel zu erreichen.
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Vorzugsweise
umfasst dann, wenn die pharmazeutische Formulierung, die für eine Verabreichung
als Aerosol geeignet ist, in Form einer Flüssigkeit vorliegt, eine wasserlösliche aktive
Verbindung gemäß der vorliegenden
Erfindung oder ein Salz davon in einem Träger, der Wasser umfasst. Ein
oberflächenaktives
Mittel bzw. Tensid kann zugegen sein, das die Oberflächenspannung
der Formulierung ausreichend senkt, was zur Bildung von Tröpfchen mit
dem gewünschten
Größen-Bereich
führt,
wenn die Formulierung einer Verneblung unterworfen wird.
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Formulierungen
der vorliegenden Erfindung, die für eine intravenöse Verabreichung
geeignet sind, umfassen sterile wässrige und nicht-wässrige Injektions-Zubereitungen
der aktiven Verbindung, wobei die Zubereitungen vorzugsweise isoton
mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers sind. Diese Zubereitungen
können
Oxidationsinhibitoren, Puffer, bakteriostatische Mittel und gelöste Substanzen
einschließen,
die die Formulierung isoton mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen.
Wässrige
und nicht-wässrige
sterile Suspensionen können
suspendierende Mittel und Verdickungsmittel einschließen. Die
Formulierungen können in
Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behälter präsentiert werden, beispielsweise
in versiegelten Ampullen und Phiolen, und können in gefriergetrocknetem
(lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des
sterilen flüssigen
Trägers
unmittelbar vor der Verwendung erfordert, beispielsweise Kochsalzlösung oder Wasser
für eine
Injektion. Unvorbereitete Injektions-Lösungen und -Suspensionen können aus
sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten derart hergestellt werden,
wie sie vorstehend beschrieben wurden.
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Wie
angegeben, liefert die vorliegende Erfindung sowohl in Wasser lösliche als
auch in Wasser unlösliche
Verbindungen und Salze. Der Begriff „in Wasser löslich", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, ist so
gemeint, dass er irgendeine Zubereitung definiert, die in Wasser in
einer Menge von etwa 50 mg/m. oder mehr löslich ist. Der Begriff „in Wasser
unlöslich", wie er in der vorliegenden
Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, ist so
gemeint, dass er irgendeine Zubereitung definiert, die eine Löslichkeit
in Wasser von weniger als etwa 20 mg/ml aufweist. Für bestimmte
Anwendungen können
wasserlösliche
Verbindungen oder Salze wünschenswert
sein, während
für andere
Anwendungen in Wasser unlösliche
Verbindungen oder Salze in gleicher Weise wünschenswert sein können.
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Beispiele
von aktiven Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung schließen
ein:
1,3-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan;
1,3-Bis(2'-methyoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy)propan;
1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan;
1,3-Bis(4'-(4-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat;
1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat;
1-(4'-N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan-bis-maleinat.
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Verbindungen,
die bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können hergestellt werden in Übereinstimmung
mit Verfahrensweisen, wie sie Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt
sind, insbesondere im Lichte der Beschreibung und Beispiele, wie
sie nachfolgend angegeben werden.
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Wie
angegeben, können
die Verbindungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
als pharmazeutisch annehmbare Salze zugegen sein. Solche Salze schließen die
Maleinat-Salze, Gluconat-Salze, Lactat-Salze, Acetat-Salze, Tartrat-Salze,
Citrat-Salze, Phosphat-Salze, Borat-Salze, Nitrat-Salze, Sulfat-Salze
und Hydrochlorid-Salze
ein.
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Die
Salze gemäß der vorliegenden
Erfindung können
allgemein hergestellt werden, indem man zwei Äquivalente der Pyrimidin-Basis-Verbindung
mit der gewünschten
Säure in
Lösung
umsetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden die Salze
aus der Lösung
durch die Zugabe einer passenden Menge von Lösungsmittel kristallisiert,
in dem das Salz unlöslich
ist.
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Wie
oben angegeben, können
die aktiven Verbindungen nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die
in diesem technischen Bereich bekannt sind, und beispielsweise können die
oben angegeben aktiven Verbindungen hergestellt werden, indem man
zuerst bekannte Bis-Nitrile unter Anwendung des Allen's-Verfahrens zur
Alkylierung von Phenolen synthetisiert; siehe J. N. Ashley et al.,
J. Chem. Soc. 103–116
(1942); C. F. H. Allen et al. Org. Synth. Coll. III, 141–41 (1955).
Die aktiven Verbindungen können
dann erhalten werden, indem man Varianten der bekannten Verfahrensweisen
von Clement und Raether anwendet und entsprechende Reagenzien verwendet;
siehe B. Clement und W. Raether, Arzneim. Forsch. 35, 1009–1014 (1985).
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Wesen
mit anderen mikrobiellen Infektionen zusätzlich zu P. Carinii-Pneumonie
können
auch durch die aktiven Verbindungen in derselben Weise behandelt
werden, wie es oben beschrieben wurde. Diese Infektionen können hervorgerufen
werden durch eine Vielzahl von Mikroben, einschließlich Pilze,
Algen, Protozoen, Bakterien und Viren. Exemplarische mikrobielle
Infektionen, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
behandelt werden können,
schließen
Infektionen ein, die hervorgerufen werden durch Giardia lamblia,
Cryptosporidium parvum, Cryptococcus neoformans, Candida albicans,
Candida tropicalis, Salmonella typhimurium, Plasmodium falciparum
und Leishmania mexicana amazonensis.
-
Die
folgenden Beispiele werden angegeben, um die vorliegende Erfindung
zu veranschaulichen. In diesen Beispielen bedeutet mM Millimolar,
bedeutet ml Milliliter, bedeutet mm Millimeter, bedeutet cm Centimeter,
bedeutet °C
Grad Celsius, bedeutet g Gramm, bedeutet kg Kilogramm, bedeutet
m. p. Schmelzpunkt, bedeutet MHz Megaherz, bedeutet M Molar, bedeutet
h Stunden, bedeutet NMR Kernmagnetresonanz, bedeutet FAB Bombardiement
mit schnellen Atomen, bedeutet DMF Dimethylformamid, bedeutet EtOH
Ethylalkohol, bedeutet DMSO Dimethylsulfoxid, bedeutet HPLC Hoch druck-Flüssigkeits-Chromatographie,
bedeutet TLC Dünnschicht-Chromatographie
und bedeutet dec Zerfallspunkt.
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In
den folgenden Beispielen werden folgenden Bezeichnungen für die Verbindungen
durchgehend verwendet:
Verbindung# | Name |
a | 1,5-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)pentan |
b | 1,3-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan |
c | 1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan |
d | 1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan |
1 | 1,5-Bis(4'-(N-hydroxyamidino)phenoxy-)pentan-di-hemimaleinat |
2 | 1,5-Bis(4'-amidinophenoxy-)pentan;
pentamidin |
3 | 1,4-Bis(4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)butan-di-maleinat |
4 | 1,4-Bis(4'-amidinophenoxy-)butan |
5 | 1,3-Bis(4'-(4-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat |
6 | 1,3-Bis(4'-amidinophenoxy-)propan |
7 | 1,3-Bis(2'-methoxy-4'-(N-hydroxyamidino-)phenoxy-)propan-di-hemimaleinat |
8 | 1,3-Bis(2'-methoxy-4'-amidinophenoxy-)propan |
-
Beispiel 1
-
Synthese von Verbindungen
der Formel I: Herstellung von Bis-Benzonitrilen
-
42
nMol 1,5-Dibrompentan (zur Herstellung von Pentamidin-Derivaten)
oder 1,3-Dibrompentan
(zur Herstellung von Propamidin-Derivaten) wurde einer Suspension
von 84 nMol des passenden 4-Hydroxybenzonitrils und 126 nMol K2CO3 in 200 ml DMF
zugesetzt. Die Mischung wurde auf 65 bis 70°C erwärmt, und man ließ sie über Nacht
rühren.
Die Mischung wurde in 400 ml H2O verdünnt, und
das gefällte
Produkt wurde gewonnen und mit H2O gewaschen.
Die rohen Bis-Benzonitrile wurden aus Ethanol umkristallisiert.
-
Beispiel 2
-
Synthese von Verbindungen
der Formel I: Herstellung von Bis-Benzamidoximen
-
32
ml einer 21%igen Natriumethoxid-Lösung (in Ethanol) wurden einer
heißen
Lösung
von 98 nMol NH2OH × HCL in 100 ml Ethanol zugesetzt.
Das NaCl wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde direkt
in einen Kolben gegeben, der 10 nMol des passenden Bis-Benzonitrils
aus Beispiel 1 enthielt. Die Mischung wurde auf Rückfluß-Temperatur erwärmt, und
man ließ sie
5 h rühren,
kühlte
sie auf Raumtemperatur ab und ließ sie über Nacht stehen. Das gefällte Produkt
wurde gewonnen, mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuum-Exiccator
getrocknet. Die folgenden Spektral-Daten und Analyse-Daten wurden
gewonnen:
Verbindung (a): m. p. > 164–165°C (Literatur-Wert:
163°C; siehe: „R. R.
Tidwell et al., J. Med. Chem. 26, 294–298 (1983)"); 3,6 g; 60%.
Neue Verbindung
(b): m. p. 162°C
(1,6 g, 47%); 1H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 2,18 (m,
2H), 4,16 (t, J = 5,9 Hz, 4H), 5,72 (s, 4H), 6,95 (d, 4H, J = 8,6
Hz), 7,59 (d, 4H, J = 8,6 Hz), 9,45 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 345 (M
+ H); exakte Masse, berechnet für
C17H21N14O4: 345,1563; gefunden: 345,1557; Analyse
(C17H21N14O4): C, H, N.
Neue
Verbindung (c): m. p. 117°C
(2,9 g, 73%); 1H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 2,17 (m,
2H), 4,14 (t, 4H, J = 5,9 Hz), 5,74 (s, 4H) 6,98 (d, 2H, J = 8,4
Hz), 9,46 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 405 (M + H); exakte Masse, berechnet für C19H25N4O6: 405,1774, gefunden: 405,1795; Analyse
(C19H25N4O6 × (H2O)1,3: C, H, N.
Neue
Verbindung (d): m. p. 200°C
(dec) (1,0 g, 33%); 1H-NMR (300 MHz, DMSO) δ 1,87 (s,
2H), 4,05 (s, 2H), 5,72 (s, 4H), 6,95 (d, 4H, J = 8,7 Hz), 7,60
(d, 2H, J = 8,7 Hz), 9,45 (s, 2H) ppm; FABMS m/z 359 (M + H); Analyse
(C18H22N4O4): C, H, N.
-
-
Beispiel 3
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Synthese von Verbindungen
der Formel I: Herstellung von Maleinat-Salzen von Bis-Benzamidoxim-Verbindungen
-
2,7
nMol des passenden Bis-Amidoxims von Beispiel 2 wurden in 20 ml
heißen
THF aufgenommen. Unlösliche
Verunreinigungen (Monoaddukte) wurden durch Zugabe von 20 ml einer
THF-Lösung
von entweder 6,8 nMol oder 3,6 nMol Maleinsäure entfernt. Der resultierende
Niederschlag wurde gewonnen und mit Ether/Ethanol und anschließend mit
Ether gewaschen und ergab in den meisten Fällen die Bis-Hemimaleinate als
farblose Pulver. Es wurden die folgenden Analyse- und Spektraldaten
aufgenommen:
Verbindung (1): m. p. 118–120°C (Literatur: 115–120°C; siehe: „R. R.
Tidwell et al., J. Med. Chem. 26, 294–298 (1983)"), (1,2 g, 75%).
Neue Verbindung
(3): m. p. 154°C
(1,1 g, 67%); Analyse [C18H22N4O4]: (C, H, N).
Neue
Verbindung (5): m. p. 135°C
(dec) (800 mg, 91%); Analyse [C25H28N4O12 × (H2O)1,6)]: (C, H,
N).
Neue Verbindung (7): m. p. 134°C (dec) (700 mg, 86%); Analyse
[C27H32N4O14 × (H2O)]: (C, H, N).
-
Weitere
Elementar-Analysedaten sind in Tabelle 1 gezeigt.
-
Beispiel 4
-
Aktivität der neuen
Verbindungen von Formel I gegen Pneumocystis Carinii
-
Die
Aktivität
der Verbindungen von Formel I gegen Pneumocystis Carinii wurde nach
einem etablierten Verfahren getestet: siehe: „Tidwell, R. R., et al., J.
Protozool. 36, 74S–76S
(1989)"; „Jones,
S. K., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1026–1030 (1990)"; „Tidwell,
R. R., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1713–1716 (1993)". Kurz beschrieben,
wurden männliche
Sprague-Dawley Ratten (in abgeschlossenen Kä figen aufgezogen, nicht zertifiziert
virusfrei), die jeweils 150 bis 200 g wogen, erhalten von der Firma
Hilltop Laboratories, Scottsdale, PA. Unmittelbar nach ihrer Ankunft
wurden die Tiere einzeln in Käfige
gesetzt und auf eine Niedrig-Protein-Nahrung (8%) und Trinkwasser
gesetzt, das Tetracyclin (0,5 mg/ml) und Dexamethason (1,0 μg/ml) enthielt.
Diese Ernährung
wurde für
die Zeit von 8 Wochen fortgesetzt. Zum Beginn der siebten Woche
wurden die Tiere in Gruppen von acht oder mehr Tieren geteilt, und
die Testverbindungen wurden für 14
Tage verabreicht. Gruppen, die Kochsalzlösung und eine Pentamidin-Behandlung
erhielten, wurden als Kontrollgruppen eingeschlossen.
-
Am
Ende der acht Wochen wurden die Tiere durch Chloroform-Inhalation
getötet.
Die linke Lunge wurde gewogen, auf eine Partikelgröße gemahlen,
die durch ein Drahtsieb mit einer Maschengröße Nr. 60 gegeben werden konnte
und in einer Menge von 1:10 (Gewicht/Volumen) in eine 10 mM β-Mercaptoethanol
enthaltende Hanks' Balanced
Salts Solution (HBSS) ohne Kationen suspendiert. Es wurden Deckgläser hergestellt durch
Aufspotten von 5 μl
Lungenhomogenat, das in einer Menge von 1:10 in HBSS mit β-Mercaptoethanol verdünnt war,
und diese ließ man
an der Luft trocknen. Die Gläser
wurden mit Cresylviolett gefärbt,
und die Cysts wurden durch Blind-Protokoll gezählt. Die Zahl der Cysts pro
Gramm Original-Lungengewebe wurde berechnet, und die Gruppen wurden
als Prozentwert der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen
angegeben.
-
Der
Anti-P. Carinii-Wert für
jede Verbindung wird ausgedrückt
als Prozentwert der Cysts in der Behandlungsgruppe, verglichen mit
der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppe.
Die Werte wurden auch mit einer positiven Kontrollgruppe verglichen,
die aus Tieren bestand, die intravenös mit Pentamidin behandelt
worden waren.
-
Alle
vier getesteten aromatischen Amidoxime waren aktiv gegen P. Carinii,
wenn sie oral über
die künstliche
Ernährung
einmal täglich
für die
Zeit von 14 Tagen verabreicht wurden (s. Tabelle 2). Die mittleren Cyst-Counts
für jede
Test-Gruppe waren signifikant reduziert, verglichen mit der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppe.
Die Verbindungen 3, 5 und 7 waren am meisten aktiv. Die aromatischen
Diamidine, die den Amid oximen 3, 5 und 7 entsprachen (Verbindungen
4, 6 und 8) hatten im Gegensatz dazu reduzierte oder keine Anti-P.
Carinii-Aktivität,
wenn sie oral verabreicht wurden (siehe Tabelle 3). Das einzige
Diamidin mit signifikanter oraler Aktivität war Verbindung B. Sein entsprechendes
Diamidoxim (Verbindung 7) war aktiver (siehe Tabelle 2).
-
Alle
getesteten aromatischen Amidoxime hatten eine exzellente Anti-P.
Carinii-Aktivität, wenn
sie intravenös
verabreicht wurden. Die mittleren Cyst-Counts für die Verbindungen 1, 3, 5
und 7 waren signifikant reduziert, verglichen mit denen der Tiere
der Kochsalzbehandlungs-Kontrollgruppen (siehe Tabelle 2), und sie waren
auch niedriger als die Cyst-Counts für die intravenös behandelte
Pentamidin-Gruppe. Die Diamidin-Verbindungen 4, 6 und 8 haben, wie
bereits früher
gezeigt wurde, intravenöse
Aktivität
(siehe Tabelle 3). Direkte Vergleiche der Aktivitäten von
Diamidinen und den entsprechenden Diamidoximen (Verbindungen 3,
5 und 7) bei intravenöser
Verabreichung können
nicht durchgeführt
werden, da die intravenösen
Aktivitäten
von Diamidinen früher
nach einem unterschiedlichen Bewertungsverfahren bei geringfügig unterschiedlichen
Dosierungen ermittelt wurden. Jedoch geben die Daten an, dass sich
die Amidoxime vorteilhaft in Bezug auf die intravenöse Wirksamkeit
vergleichen lassen.
-
Beispiel 5
-
Reduzierte
akute Toxizität
von Amidoximen der Formel I in normalen Ratten
-
Die
Toxizität
wurde in Ratten untersucht, die nicht im Rahmen einer Dexamethason-Behandlung immunsuppressiv
behandelt worden waren. Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten,
die in geschlossenen Käfigen
aufgezogen worden waren und nicht zertifiziert virusfrei waren und
zu dem Zeitpunkt 300 bis 450 g wogen, wurden erhalten von der Firma
Hilltop Laboratories (Scottsdale, PA). Die einzeln in Käfigen gehaltenen
Tiere erhielten Wasser und Rattenfutter (Firma Agway, Syracuse,
NY) nach Wunsch. Jedem Tier wurde über die Schwanzvene eine Dosis
einer Test-Verbindung injiziert. Die Tiere wurden für einen
Zeitraum von 10–12
Minuten im Anschluss an eine Injektion des Test-Arzneimittels jeden
Tag auf Zeichen von akuter Toxizität genau beobachtet, einschließlich der
hypotensiven Response (Erblassen der Augen und Pfoten, Dyspnoe, Lethargie
und abgesenkte Körpertemperatur),
wie sie durch intravenöse
Verabreichung von Pentamidin bei seiner wirksamen Dosis hervorgerufen
wird (siehe „R.
R. Tidwell et al., J. Protozool. 36, 74S–76S (1989)"; „R. R.
Tidewell et al., J. Med. Chem. 33, 1252 (1990)"). Jedes Tier wurde für einen
Zeitraum von 15 min nach der Injektion genau beobachtet und zum
Zeitpunkt von 30 min, 60 min und 24 h lang nach der Injektion überwacht. Die
Gesundheit und das allgemeine Wohlbefinden der Ratten wurden auf
täglicher
Basis für
den Rest des Experiments beobachtet und aufgezeichnet. Übermäßiger Gewichtsverlust
(ein Gewichtsverlust von mehr als 25 g über die zweiwöchige Dosierungs-Periode
wurde als übermäßig im Vergleich
mit den mit Kochsalz behandelten Tieren angesehen) wurde als Schlüssel-Indikator
einer sich verschlechternden Gesundheit aufgrund der Toxizität des Arzneimittels
angesehen. Zum Zeitpunkt der Necroskopie wurden die Leber, die Milz,
die Nieren und der Pankreas von jedem Tier entfernt, in Bezug auf
die grobe Pathologie untersucht und für eine Histopathologie aufgehoben.
-
In
diesen normalen Ratten waren offenkundige akute nachteilige Reaktionen
im Anschluss an einzelne intravenöse Injektionen in starkem Maße reduziert
bei drei Bis-Benzamidoximen
(Verbindungen 1, 5 und 7), verglichen mit den Bis-Benzamidinen (Verbindungen
2 (Pentamidin), 6 und 8). Keine nachteilige Reaktion wurde nach
der hohen oral verabreichten Einzel-Dosierungen der Bis-Benzamidoxim-Verbindungen
beobachtet. Zum Vergleich: normale Ratten, denen über einen
Zeitraum von 30 s 20 μMol/kg
Pentamidin injiziert worden war, erschienen hypotensiv, wo bei Extremitäten schnell
verblassten und eine Hypoaktivität
und Dyspnoe auftrat, was bis zu einer schwachen Cyanose der Extremitäten fortschritt.
Eine erhöhte
Lakrimation (Tränenabscheidung)
und eine geringere Hinterpfoten-Ataxie wurden unmittelbar vor dem
Eintreten einer Hypoaktivität beobachtet.
Die Tiere schienen sich innerhalb von 5 min nach der Injektion zu
erholen. Tiere, denen 40 μMol/kg Pentamidin
injiziert worden war, hatten sofortige starke Hinterpfoten-Kontraktionen,
erhöhte
Speichelbildung, Dyspnoe, anfängliches
Verblassen der Extremitäten,
das zu einer merklichen Cyanose voranschritt, und verstärkte Hypoaktivität, und sie
bewegten sich für
wenigstens 5 min gar nicht. Die Tiere schienen sich im Verlauf von
etwa 20 min nach der Injektion zu erho len. Im Gegensatz dazu verursachte
das Diamidoxim-Analog von Pentamidin (Verbindung 1), das in derselben
Weise verabreicht wurde, keine beobachtbaren nachteiligen Reaktionen
in einem Konzentrationsbereich von 20 bis 60 μMol/kg. Schwache toxische Reaktionen
einschließlich einer
kaum beobachtbaren Hinterpfoten-Ataxie und geringer Hypoaktivität wurden
bei einer Konzentration von 80 μMol/kg
beobachtet, wobei eine vollständige
Erholung in der Zeit von 5 min nach der Injektion eintrat. Bolus-Injektionen oberhalb
von 120 μMol/kg
erzeugten eine schwere Dyspnoe und eine verstärkte Hypoaktivität.
-
Ähnliche
Ergebnisse wurden beobachtet für
die Diamidoxim-Verbindungen 5 und 7, wenn diese mit ihren jeweiligen
Diamidin-Analogen verglichen wurden. Die Diamidin-Verbindung 6 schien
weniger akut toxisch zu sein als Pentamidin, und es gab keine offensichtliche
Toxizität
bei 20 μMol/kg.
Eine Dyspnoe, die zu einer Cyanose fortschritt, eine übermäßige Speichel-
und Tränen-Absonderung
und Hypoaktivität
wurden bei 40 μMol/kg
beobachtet. Diese Antworten wurden stärker bei Dosierungen von 80
und 100 μMol/kg,
wobei die Symptome für
30 min nach einer Injektion anhielten. Im Gegensatz dazu verursachte
die Diamidoxim-Verbindung 5 keine offensichtliche Toxizität bei 20,
40 oder 80 μMol/kg
und nur eine schwache Ataxie und/oder Hypoaktivität bei der
hohen Dosierung bei 160 μMol/kg.
Die Tiere hatten sich 5 min nach der Injektion vollständig wieder
erholt.
-
Die
Diamidin-Verbindung 8 schien sogar auch stärker akut toxisch zu sein als
die beiden anderen getesteten Diamidine, wobei eine merkliche Hypoaktivität bei Tieren
auftrat, die eine Dosis von 10 μMol/kg
erhalten hatten. Starke Muskel-Kontraktionen und Tremor, extensive
Absonderung von Speichel und Tränen,
Dyspnoe und merkliche Hypoaktivität, die für mehr als 15 min anhielt,
wurden bei Tieren beobachtet, die eine Dosis von 20 μMol/kg per
Injektion erhalten hatten. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die
eine Injektion mit dem Diamidoxim-Analog, Verbindung 7, erhalten
hatten, keine beobachtbaren nachteiligen Wirkungen bei 20 oder 40 μMol/kg und
nur eine sehr schwache Hypoaktivität und Dyspnoe bei 80 μMol/kg, wobei
eine Erholung nach 5 min eintrat. Verbindung 7, wenn per Injektion
verabreicht in einer Dosis von 160 μMol/kg, rief eine deutliche Hypoaktivität, Dyspnoe,
Cyanose und verstärkte
Speichel- und Tränen-Absonderung
hervor, wobei die Symptome für
etwa 10 min nach der Injektion anhielten.
-
Keine
offensichtlichen toxischen Reaktionen wurden beobachtet, wenn den
Ratten irgendeine der Test-Verbindungen oral verabreicht wurde,
einschließlich
einzelner oraler Dosen einer Konzentration von 160 μMol/kg für jede der
Diamidoxim-Verbindungen
1, 5 und 7.
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Beispiel 6
-
In-Vitro-Metabolismus
der Verbindungen der Formel I
-
Untersuchungen
des In-Vitro-Metabolismus der Diamidoxime 1, 3, 5 und 7 anhand von
bei 9000 × g behandelten Überständen von
Rattenleber-Homogenat, bei 105.000 × g behandelten Postmitochondrial-Überständen oder
Mikrosomen-Fraktionen wurden durchgeführt, wie dies vorher beschrieben
wurde („B.
J. Berger et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 36, 1825–1831 (1992)"; B. J. Berger et
al., J. Pharmacol. Experimental Therapeutics. 256, 883–889 (1991)"). Kurz beschrieben,
wurde erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten,
die in Käfigen
aufgezogen worden waren (Hilltop Laboratories, Scottsdale, PA) Wasser
und Rattenfutter (Firma Agway, Syracuse, NY) nach belieben verabreicht.
Die Ratten wurden durch Enthaupten getötet, die Lebern wurden sofort
entfernt, mit 50 nM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) gespült und auf
Eis gepackt. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die
Lebern wurden zerkleinert, homogenisiert, und es wurden nach Zentrifugieren
bei 9000 × g Überstandsflüssigkeiten
hergestellt, bei 105.000 × g Überstandsflüssigkeiten
hergestellt oder bei 105.000 × g
Mikrosomen-Pellets hergestellt. Jede Fraktion wurde auf ihren Protein-Gehalt
getestet, wie dies beschrieben ist in der Druckschrift „M. M.
Bredfort, Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976)", und die Fraktionen wurden bei –80°C gelagert.
Fraktionen von Ratten-Nieren, Lungen, Herzen und Gehirnen wurden
in ähnliche
Weise hergestellt.
-
Reaktionsmischungen
bestanden aus 1,5 ml 50 nM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4),
0,5 ml Cofaktor-Lösung
(2 mg/ml NADPH), 1,6 mg/ml MgCl2, 1,04 mg/ml
Glucose-6-Phosphat und 2 Einheiten/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert: 7,4), 0,5 ml Gewebe-Homogenat
und 0,5 ml des passenden Diamidoxim-Substrats in einer Konzentration
von 167 μM.
Die Reaktionen wurden gestartet, indem man das Substrat zusetzte;
danach wurden die Mischungen bei 37°C in einem Schüttel-Wasserbad
für die
in den Figuren gezeigten Zeiten inkubiert. Die Reaktionen wurden
beendet durch Extrahieren über
C18-Patronen und Testen gemäß der nachfolgenden
Beschreibung.
-
Metabolismus-Experimente
mit intakten kultivierten Zellen wurden durchgeführt unter Verwendung der BRL-3A-Hepatocyten-Linie,
erhalten von der Firma UNC-Chapel Hill Lineberger Tissue Culture
Facility. Die Zellen wurden routinemäßig in der Firma Costar (Cambridge,
MA) erhaltenen 25 cm3 passenden Gewebekultur-Kolben
bei 37°C
unter feuchter Mischung aus 5% CO2 und 95%
Luft in Ham's F-12-Medium
(Firma Gibco, Gaithersburg, MD), das 5% fetales Rinderserum enthielt
(HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), kultiviert. Konfluente Kulturen
wurden mit 0,25% Trypsin-Lösung
(Firma Sigma Chemical Co., St. Louis MO) behandelt, und anschließend wurden
Unterkulturen von etwa 2 × 105 Zellen pro Vertiefung in Costar-6-Vertiefungs-Gewebe-Kammern kultiviert,
und man ließ die
Zellen dann konfluent wachsen. 10 ml frisches Medium wurde jeder Kultur-Vertiefung
zugegeben, und Inkubationen wurden gestartet durch Zusatz von 100 μl Amidoxim-Lösung (hergestellt
in sterilem Wasser) bis zu einer End-Konzentration von 10 μM. Die Zellkulturen
wurden bei 37°C unter
einer Mischung aus 5% feuchtem CO2 und 95%
Luft 24 h lang inkubiert. Danach wurden aliquote Mengen der Kultur-Überstandsflüssigkeiten
extrahiert und auf Metaboliten getestet, wie es nachfolgend gezeigt
ist. Ähnliche
Metabolismus-Experimente wurden durchgeführt mit kultivierten J774 A.1
Mouse-Monocyten-Makrophagen-Zellen, die in DMEM F-12-Medium kultiviert
worden waren, das 10% fetales Rinderserum enthielt, und mit H9c2-Rattenherz-Myoblasten-Zellen,
die in DMEM-H-Medium kultiviert worden waren, das 10% fetales Rinderserum
enthielt.
-
Die
Proben wurden unter Verwendung von Festphasen-Extraktion extrahiert
und unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC)
getestet, und zwar nach Verfahren, die ähnlich denjenigen waren, die
früher
beschrieben wurden in „Berger
et al. (1992)" und „Berger
et al. (1991), a.a.O.".
-
Kurz
beschrieben, wurden Proben, die mit 2,5-Bis[4-(N-isoproylamidino-)phenyl]furan-dihydochlorid als
internen Standard (IS) gespeikt worden waren, über aktivierten C18-Bond-Elut-Patronen
(Firma Varian Associates, Sunnydale, CA) extrahiert, mit Wasser
und anschließend
mit 100% Acetonitril gewaschen, anschließend mit 75% Acetonitril/25%
Wasser eluiert, das 15 mM Triethylamin enthielt, und anschließend mit
35 mM Essigsäure
eluiert. Die Diamidoxim-Substrate wurden in der Phase mit 100% Acetonitril
eluiert, während
die Mono-Amidin- und Diamidin-Produkte in der Acetonitril/Wasser-Mischung
eluiert wurden, die Triethylamin und Essigsäure enthielt. Die Eluate wurden
bei 40°C
zur Trockene eingedampft, und zwar unter einem schwachen Strom von
Stickstoff, und wurden in Wasser (Qualitätsanforderungen für HPLC)
resuspendiert.
-
Die
Auflösung
der Verbindungen erfolgte unter Verwendung eines HPLC-Geräts (Modell
1090 der Firma Hewlett-Packard, Avendale, PA), das ausgestattet
war mit einem hinsichtlich der Wellenlänge variablen Detektor-Set
(HP 1050) bei 265 nm, einer 4,6 × 250 mm Zorbax-RX-Diisopropyl-C8-Säule (Firma
Mac-Mod, Chadd's
Ford, PA), die bei 40°C
gehalten wurde, und einem Vectra 486/66U-Computer mit HP Chemstations-Software. Die mobile
Phase bestand aus 15 mM Triethylamin und 35 mM Essigsäure in Wasser (HPLC-Qualitätsstufe)
für Pumpe
A und aus 15 mM Triethylamin und 35 mM Essigsäure in 75% Acetonitril in Wasser
für Pumpe
B. Die Strömungsgeschwindigkeit
des Lösungsmittels
betrug 1,5 ml/min, und der Lösungsmittel-Gradient
lief von 0% B bis 25% B bei 22 min zu 40% B bei 25 min und dann
zu 90% B bei 35 min. Alle für
die Tests verwendeten Lösungsmittel
und Reagenzien waren solche der Reinheitsstufe für HPLC. Die Menge der gebildeten
Metabolite wurden berechnet, wobei man die Peak-Flächen-Verhältnisse
authentischer Standard-Proben verwendete, aus Standard- Additionskurven,
die durch Einspeiken von Standards in Gewebe-Homogenate oder Gewebe-Kulturmedium
erzeugt worden waren.
-
Es
wurde gezeigt, dass bei 9000 × g
behandelte Rattenleber-Homogenat-Überstandsflüssigkeiten leicht
das Diamidoxim-Analog von Pentamidin (Verbindung 1) reduzieren und
dabei große
Mengen des Monoamidin-Monoamidoxim-Derivats und kleinere Menge von
Pentamidin (Verbindung 2) zu bilden („B. Clement et al., Drug Metabol.
Dispos. 22, 486–497
(1994)"; siehe 1A). Die Metabolite wurden vorher durch
Massenspektrometrie identifiziert („U. Bronner et al., Pharmacol.
Toxicol., 77, 114–120
(1995)"). Die Bis-Benzamidoxime
gemäß der vorliegenden
Erfindung (Verbindungen 3, 5 und 7) scheinen in ähnlicher Weise durch bei 9000 × g behandelte
Rattenleber-Homogenat-Überstands-Flüssigkeiten
metabolisiert zu werden, wie dies in den 1B, 1C bzw. 1D gezeigt
ist. In jedem Fall wurden zwei Produkt-Peaks eluiert, und zwar die
kleineren Peaks in 1B, 1C und 1D, die mit der Diamidin-Standard-Verbindung
4, 6 bzw. 8 co-eluiert wurden. Obwohl synthetische Standards für die Monoamidin-Monoamidoxim-Deriverate
der Verbindungen 3, 5 und 7 nicht erhältlich sind, sind die relativen
Retentionszeiten der chromatographisch erhaltenen Peaks vollständig konsistent mit
denjenigen, die für
die Monoamidoxim-Derivate vorausgesagt wurden.
-
Die
N-Hydroxylierung von aromatischen Amidinen unter Bildung aromatischer
Amidoxime wird – wie bekannt
ist – durch
spezielle Cytochrome P450 katalysiert (siehe „B. Clement et al., Drug Metabol.
Dispos. 22, 486–497
(1994)"). Jedoch
wurde berichtet, dass eine Reduktion von Amidoximen zurück zu den
Amidinen durch eine nicht-Cytochrome
P450 abhängige
Reduktase-Aktivität
katalysiert wird (id). Die in den 2 und 3 präsentierten
Daten zeigen an, dass die Reduktase in der Post-Mitochondiralen-Mikrosomen-Fraktion zugegen
ist. Jedoch scheint die Reduktase-Aktivität in der Post-Mitochondiralen-Überstands-Fraktion
sogar noch höher
zu sein (2). Die Ergebnisse zeigen auch,
dass eine hohe Reduktase-Aktivität
auch in Homogenaten aus Rattennieren und -lange sowie in Homogenaten
aus dem Herz und dem Gehirn gefunden wird (3). Von
den letztgenannten Geweben ist bekannt, dass sie nur eine geringe
Cytochrom P450-Aktivität enthalten.
-
Schlussendlich
absorbierten und metabolisierten intakte Zellen der etablierten
Leber-Zell-Linie
BRL 3A (4), der Herz-Zell-Linie H9c2
(Daten nicht gezeigt) und der Makrophagen Zell-Linie J774 A.1 (Daten nicht
gezeigt) alle leicht die Diamidoxim-Verbindungen. Diese Daten zeigen an,
dass ein Metabolismus von Amidoxim-Prodrugs durch von Cytochromen
P450 verschiedene Aktivitäten
katalysiert wird, und zeigen, dass Gewebe und andere Zellen, die
von denen der Leber verschieden sind, hohe Aktivitäts-Levels
besitzen. Es scheint, dass dafür,
dass die Amidoxim-Prodrugs wirksam gegen extrazelluläre Parasiten
wie beispielsweise P. Carinii sind, die Verbindungen offensichtlich
in die Wirtszellen eintreten müssen,
chemisch zurück
zu dem aktiven Amidin-Analogen reduziert werden müssen und
dann extrazellulär
freigesetzt und durch den infektiösen Organismus aufgenommen
werden müssen.
Der Prozess der Zellaufnahme, des Metabolismus und der Freisetzung
erfolgt leicht BRL-3A-Hepatocyten, die in vitro kultiviert wurden
(4). Jedes der oral aktiven Bis-Benzamidoxime 1,
3, 5 und 7 wurde vornehmlich zu dem entsprechenden Diamidin metabolisiert,
welches dann in hohen Konzentrationen zurück in die Kultur-Überstände freigesetzt
wurde.
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