PT2550963T

PT2550963T - Ésteres de ácido carboxílico de amidoxima de pentamidina como pró-drogas, e a utilização dos mesmos como fármaco

Info

Publication number: PT2550963T
Application number: PT111752523T
Authority: PT
Inventors: Clement Bernd; Kotthaus Joscha; Kotthaus Jürke; Schade Dennis
Original assignee: Dritte Patentportfolio Beteili
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2017-01-19
Also published as: CA2842355A1; SI2550963T1; RU2608388C2; BR112014001787A2; RU2014106867A; DK2550963T3; HUE030245T2; KR20140097108A; JP2017039727A; US20130085180A1; HRP20170013T1; CN103874491A; JP2014529579A; RS55557B1; AU2012288968A1; EP2550963B1; PL2550963T3; ES2610652T3; EP2550963A1; LT2550963T

Description

DESCRIÇÃO

"ÉSTERES DE ÁCIDO CARBOXÍLICO DE AMIDOXIMA DE PENTAMIDINA COMO PRÓ-DROGAS, E A UTILIZAÇÃO DOS MESMOS COMO FÁRMACO" A presente invenção diz respeito a derivados pró-droga da pentamidina, a sua utilização para o tratamento e/ou profilaxia de doenças, em especial de doenças tumorais e cancerígenas, assim como de leishmaniose, tripanossomíase, pneumonia por Pneumocystis carinii (PcP), assim como malária. A pentamidina é um composto com ação antiparasitária e antimicrobiana, cuja utilização está estabelecida para o tratamento de tripanossomíase, leishmaniose e pneumonia por Pneumocystis carinii (PcP). Devido às duas funções amidina fortemente básicas, o composto é carregado em condições fisiológicas e por isso não é assimilado no organismo após administração oral. Por este motivo, o composto tem de ser administrado por via parentérica, por exemplo, intramuscular, intravenosa ou inalatória. Aqui é preciso ter em conta que a maior parte das infeções provocadas pelos agentes anteriormente mencionados ocorre em países tropicais e subtropicais, nos quais os cuidados médicos são frequentemente insuficientes. Formas de administração dispendiosas, tais como aplicação intravenosa e inalatória, dificultam especialmente nestes países, uma terapia medicamentosa segura. Por este motivo, o desenvolvimento de uma pró-droga de pentamidina com biodisponibilidade oral tem enorme significado para melhorar significativamente as possibilidades de tratamento. Um outro aspeto negativo é a não acessibilidade da pentamidina ao SNC, o que leva a que a pentamidina apenas tenha efeito nos estádios iniciais da tripanossomíase (doença do sono africana) , e não na fase meningoencefálica, na qual o agente patogénico penetra no SNC.

Uma outra área de aplicação da pentamidina é a terapia do cancro. 0 efeito inibitório da pentamidina na endo-exonuclease foi extensivamente estudado nos últimos anos.1'2 Os primeiros estudos clinicos mostraram já resultados promissores no tratamento de carcinomas da mama e do cólon.3 Também neste caso, a administração de uma pró-droga de pentamidina com biodisponibilidade oral é de grande importância.

Pelo que foi referido, foram realizadas inúmeras experiências, com o intuito de melhorar tanto a biodisponibilidade oral, como o acesso da pentamidina ao SNC. Nos trabalhos anteriormente referidos, a pentamidina foi convertida na diamidoxima de pentamidina, a qual é menos básica, o que resultou num forte aumento da lipofilia. Uma vez que a amidoxima existe na forma neutra em condições fisiológicas, a absorção deste composto no trato gastrointestinal é significativamente maior.4 A redução significativa da amidoxima nas amidinas farmacologicamente ativas foi demonstrada pela primeira vez em 1988 no composto modelo benzamidoxima.5 Mais tarde, o principio foi transferido para a pentamidina, tendo sido obtidas a monoamidoxima de pentamidina e a diamidoxima de pentamidina (3). Em estudos animais, ambos os compostos mostraram uma baixa biodisponibilidade oral e uma boa ativação na forma ativa pentamidina.6 Entretanto, foi identificado o sistema enzimático responsável pela redução, um sistema contendo molibdénio, até aqui desconhecido, o qual foi denominado mARC (Componente de Redução de Amidoxima mitocondrial) .7'8

De forma a otimizar tanto o perfil farmacocinético para melhoria da biodisponibilidade, como a acessibilidade ao SNC, foram desenvolvidas pró-drogas adicionais. Foi obtido um composto com a N,N-bis(acetoxi)pentamidina o qual, em comparação com outras pró-drogas de pentamidina, dispõe de lipofilia substancialmente mais elevada. Esta pró-droga também demonstrou biodisponibilidade oral em estudos animais, tanto em ratazanas como em porcos. A desvantagem da N,N-bis (acetoxi)pentamidina é, por um lado, a sua baixa solubilidade em água, e por outro lado a biodisponibilidade calculada foi muito baixa e a sua acessibilidade ao SNC não pode ser demonstrada.9 Abordagens semelhantes levaram ao desenvolvimento da N,Ν'-bis(metoxi)pentamidina a qual, à semelhança da N,N-bis(acetoxi)pentamidina, também dispõe de uma solubilidade em água muito baixa. Outros princípios de pró-droga, os quais foram transferidos para a pentamidina, são a hidroxilação para N,N'-bis(dihidroxi)pentamidina e a conjugação com aminoácidos (em especial valina), para N,N'-bis (valoxi) pentamidina.10-12 Resumindo, deve-se notar que até hoje não foi desenvolvida qualquer pró-droga pentamidina que cumpra os critérios necessários (boa biodisponibilidade oral, acessibilidade ao SNC e boa solubilidade).

Tendo em conta este contexto, o objetivo da presente invenção foi preparar pró-drogas pentamidina as quais, em comparação com as pró-drogas de pentamidina conhecidas, apresentam propriedades melhoradas. 0 objetivo mencionado é conseguido de acordo com a invenção, através de um composto de fórmula (I)

na qual n corresponde a 2.

De acordo com a invenção, n representa, na fórmula (I), 2.

Numa outra forma de realização preferida, n representa, na fórmula (I), 3. Numa forma de realização preferida, n representa, na fórmula (I), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

Em especial, em comparação com as pró-drogas pentamidina até agora descritas, a N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1), é claramente superior. Foi observada uma melhoria substancial da solubilidade, o que representa um parâmetro muito critico das outras pró-drogas pentamidina. Através desta melhoria da solubilidade, o comportamento farmacocinético da substância é influenciado de forma positiva, uma vez que boas propriedades de solubilidade são um parâmetro importante na absorção de fármacos. A presente invenção diz ainda respeito também a sais, solvatos e solvatos dos sais dos compostos de fórmula (I) referidos. Além disso, a presente invenção refere-se aos compostos de fórmula (I) referidos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção refere-se aos compostos referidos para utilização no tratamento e/ou profilaxia de doenças oncológicas e tumorais de qualquer patogénese.

Numa outra forma de realização preferida, a presente invenção refere-se aos compostos referidos para utilização no tratamento e/ou profilaxia de leishmaniose, tripanossomiase e/ou pneumonia por Pneumocystis carinii (PcP) .

Numa outra forma de realização preferida, a presente invenção refere-se aos compostos referidos para utilização no tratamento e/ou profilaxia de malária. A presente invenção também se refere a fármacos compreendendo pelo menos um dos compostos de fórmula (I) referidos, eventualmente em combinação com um ou mais adjuvantes inertes, não tóxicos, farmaceuticamente apropriados.

Além disso, a presente invenção refere-se a um fármaco compreendendo pelo menos um dos compostos de fórmula (I) referidos em combinação com um ou mais adjuvantes. A presente invenção refere-se ainda a um fármaco para utilização oral ou parentérica. A presente invenção refere-se ainda a fármacos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças oncológicas e tumorais. A presente invenção refere-se ainda a um fármaco tal como descrito anteriormente, o qual é resistente aos sucos gástricos.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento e/ou profilaxia de doenças tumorais em humanos ou animais, com a utilização de pelo menos um dos compostos de fórmula (I) ou um dos fármacos mencionados.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento e/ou profilaxia de leishmaniose, tripanossomiase e pneumonia por Pneumocystis carinii (PcP). A presente invenção refere-se também a um método para o fabrico de um composto tal como descrito anteriormente, no qual a amidoxima de fórmula (A)

(A) é convertida num composto de fórmula (C)

(C) através de reação com um ácido dicarboxilico anidrido de fórmula (B)

(B) na qual n representa 2.

Um principio de pró-droga mais desenvolvido é o acoplamento de amidoximas em ácidos dicarboxilicos, tal como descrito no pedido de patente W02009095499 e DE102008007381.11 Com referência a estes trabalhos foram desenvolvidas pró-drogas de pentamidina. Os compostos obtidos foram amplamente caracterizados e estudados relativamente à sua biodisponibilidade. Os nossos estudos mostraram que os derivados de ácido dicarboxilico de pentamidina são pró- drogas pentamidina especialmente apropriadas, as quais possuem uma solubilidade excelente e uma boa biodisponibilidade após administração oral. Experiências comparáveis com outras pró-drogas pentamidina mostraram também a superioridade da N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) em comparação com as pró-drogas pentamidina conhecidas até agora.

Descrição da Invenção

Devido à baixa biodisponibilidade oral, a utilização terapêutica de pentamidina é atualmente muito limitada. Em especial nos parses do terceiro mundo, o desenvolvimento de um fármaco com boa biodisponibilidade oral é um avanço substancial na terapia farmacológica, uma vez que podem deste modo ser evitadas aplicações intravenosas dispendiosas e com algum risco. Além disso, as possibilidades atuais de tratamento de infeções por tripanossomas, Pneumocystis carinii, Pneumocystis jirovecii e leishmania não são satisfatórias. Por este motivo, o ponto central desta invenção é o desenvolvimento de uma pró-droga de pentamidina com biodisponibilidade oral.

Além disso, uma pró-droga pentamidina com aplicação oral tem grande importância na terapia do cancro. Atualmente, a pentamidina está a ser estudada em ensaios clínicos em diferentes tipos de cancro (carcinoma da mama e do cólon). Os primeiros estudos clínicos mostraram já resultados promissores.3 Também aqui podem ser usadas as novas pró-drogas pentamidina, as quais melhoram a terapia, também em combinação com outros agentes anticancro.

No contexto desta invenção, foram desenvolvidas novas pró-drogas pentamidina através do acoplamento da diamidoxima de pentamidina (3) com ácidos dicarboxílicos. Os compostos obtidos foram caracterizados in vitro e in vivo, onde demonstraram uma solubilidade excelente assim como boa biodisponibilidade. Experiências de comparação com outras pró-drogas pirimidina mostraram a superioridade da nova N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) em comparação com pró-drogas pentamidina descritas até hoje. Síntese A preparação da pró-droga (1, 2) ocorre a partir de diamidoxima de pentamidina (3) e do anidrido ácido correspondente (anidrido de ácido succinico ou de ácido glutárico) . 0 composto de partida foi aquecido em acetona seca através da adição de anidrido de ácido succinico, em refluxo, durante 4 h (ver Figura 1) . Deixou-se ferver em tolueno, e por filtração direta foram separadas as substâncias 1 e 2, e preparados os compostos desejados em grau de pureza analítica.

Estabilidade

Os ensaios mostraram que o composto 1 é estável em pH neutro e levemente alcalino, ou seja, a pH 7,4 a pH 9,0. Em meio ácido a pH 2,0, os compostos são rapidamente hidrolisados (Figura 2, 3) .

Os ensaios mostraram que a N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) é hidrolisada em mono-succinilpentamidina e diamidoxima de pentamidina em meio aquoso (3) . Ao passo que esta hidrólise ocorre apenas em pequena quantidade a pH 7,4 e pH 9,0, ela é significativa a pH 2,0 e em plasma humano e murino. A hidrólise rápida de N,N'- bis (succiniloxi)pentamidina (1) a pH 2,0 (ver Figura 2, 3) é problemática no contexto da utilização como pró-droga. A N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) irá levar a uma rápida hidrólise da pró-droga em diamidoxima de pentamidina (3) no meio ácido do estômago após aplicação oral. Uma vez que a absorção gastrointestinal ocorre em grande parte na parte superior do intestino delgado, é necessário uma formulação desta pró-droga resistente aos sucos gástricos. Desta forma, a pró-droga passa o meio ácido do estômago inalterada e pode mais tarde ser absorvida no intestino delgado. A instabilidade a pH 2,0 não é assim problemática para a utilização como medicamento.

Solubilidade A N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) possui uma solubilidade muito boa na gama de pH 7,4 a 9,0 (ver Tabela 1). A solubilidade em meio ácido (pH 2,0) não pode ser bem caracterizada neste meio devido à hidrólise já mencionada. No entanto, experiências demonstraram também aqui que a solubilidade se encontra na gama de mM. A Tabela 1 mostra a solubilidade da N,N'- bis (succiniloxi)pentamidina (1), em comparação com outras pró-drogas pentamidina desenvolvidas. A partir destes dados, é claro que o derivado de ácido dicarboxilico (1) é o composto com a melhor solubilidade. A monoamidoxima de pentamidina também é solúvel na gama dos mM, em pHs neutros e ligeiramente alcalinos. No entanto, este composto possui ainda uma função amidina, a qual possui um efeito muito desvantajoso na biodisponibilidade oral. Estas propriedades de solubilidade excelentes tornam possível uma utilização como medicamento, uma vez que uma boa solubilidade é uma condição básica para uma boa absorção oral. Adicionalmente, também são possíveis formas de administração parentéricas, tais como injeções ou infusões, através da boa solubilidade de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1).

Ligação a proteínas

Os ensaios para a ligação a proteínas mostraram que este composto dispõe de uma ligação a proteínas pronunciada, com uma ligação a proteínas do plasma de 97%. A ligação a proteínas calculada é da ordem da descrita para outras pró-drogas de pentamidina, e por isso não representa qualquer desvantagem em comparação com as outras pró-drogas.9

Conceito de pró-droga 0 conceito de pró-droga na base dos compostos de acordo com a invenção foi ele próprio descrito nos pedidos de Patente W02009095499 e DE102008007381. A ativação da pró-droga de acordo com a invenção ocorre por intermédio de esterases e do sistema enzimático mARC, e é assim independente de enzimas citocromo P450. A participação de enzimas P450 envolve o risco de interações, as quais não estão descritas para o mecanismo de ativação escolhido por nós. As enzimas citocromo P450 estão envolvidas no metabolismo de vários medicamentos. Caso sejam utilizados mais medicamentos que são metabolizados através deste sistema enzimático, pode ocorrer um atraso na degradação do fármaco com efeitos secundários clinicamente relevantes.

Activação in vitro

Os estudos de ativação in vitro realizados mostraram que a ativação da N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) ocorre a um bom grau (Tabela 2). A incubação com carboxil-esterases de fígado de porco levou a uma ativação rápida da N,N'- bis(succiniloxi)pentamidina (1) (ver Figura 4). Ocorre a ativação de cerca de 90% do substrato utilizado, logo após uma incubação de 60 minutos. Este resultado mostra que o primeiro passo da ativação da N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) para diamidoxima ocorre com uma velocidade excelente. A redução para pentamidina pode ser demonstrada nas incubações com preparações enzimáticas subcelulares (Tabela 2). Em geral, as fontes enzimáticas de origem porcina são mais ativas do que as humanas, o que está relacionado com a forma de obtenção das preparações enzimáticas. Deve ser tido em conta que o processamento de órgãos humanos é problemática, devido à sua baixa quantidade. Além disso, os órgãos de porco provêm de animais geralmente saudáveis, ao passo que as amostras de tecidos humanos provêm geralmente de doentes com cancro após resseção de órgãos, o que é uma explicação para as comparativamente mais baixas taxas de conversão aquando da utilização de preparações enzimáticas humanas.

Resumindo, pode afirmar-se que a N,N'-bis (succiniloxi)pentamidina (1) é uma pró-droga da pentamidina apropriada. Este estudo prova que ocorre a bioativação da pró-droga para um composto ativo. Deve ser esperado que as taxas de conversão in vivo sejam significativamente mais altas, uma vez que neste caso as enzimas necessárias estão presentes em maior quantidade.

Biodisponibilidade Oral

Nos estudos animais realizados foi demonstrada a biodisponibilidade oral da N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) . Após aplicação oral da pró-droga, não foram detetados quaisquer niveis plasmáticos de pentamidina, o que é justificado pela conhecida acumulação de pentamidina nos órgãos. A análise das amostras de órgãos mostrou que a N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina possui biodisponibilidade oral. Foi possível demonstrar a presença de concentrações relevantes de pró-droga em todos os órgãos estudados (fígado, rins, pulmões, coração, cérebro e baço), após aplicação oral. As concentrações mais elevadas foram encontradas nos rins e fígado (Figura 5). As concentrações no baço, coração, cérebro e pulmões foram significativamente mais baixas. A biodisponibilidade oral relativa foi determinada como sendo de, no máximo, 98%, dependendo do órgão (Tabela 3).

Em resumo, os resultados demonstram a aptidão excelente do princípio de pró-droga de acordo com a invenção para a pentamidina. As concentrações de pentamidina encontrados nos órgãos encontram-se numa gama, a qual permite a terapia de infeções com tripanossomas (IC50: 0,8-3,2 nM) , leishmania (IC50: 820-2590 nM) , e também com plasmódio (IC50: 35-129 nM) .13~16

Resumo A nova pró-droga desenvolvida é uma pró-droga da pentamidina com biodisponibilidade oral. O princípio de pró-droga utilizado conduziu a uma melhoria significativa da solubilidade, o que é um parâmetro muito crítico das outras pró-drogas de pentamidina. Através desta melhoria da solubilidade, o comportamento farmacológico da substância é influenciado de forma positiva, uma vez que boas propriedades de solubilidade são um parâmetro importante na absorção de fármacos, em especial no trato gastrointestinal. 0 composto 1 possui uma boa estabilidade química, exceto em pHs ácidos. A hidrólise acentuada em meio ácido levou a que a pró-droga deva ser administrada como forma resistente ao suco gástrico quando é administrada por via oral, para excluir a hidrólise no estômago.

Nos ensaios de bioativação in vitro pode ser demonstrada uma rápida e extensa ativação da pró-droga para pentamidina. A ativação ocorre de forma independente das enzimas citocromo P450, e evita assim o risco de interações.

Nos estudos animais por fim realizados, a boa biodisponibilidade oral pode ser demonstrada também experimentalmente. Os teores de pentamidina detetáveis nos órgãos encontram-se num intervalo que permite uma eficácia contra infeções por tripanossomas, leishmania e plasmódio.

Resumindo, os derivados de ácido dicarboxílico de pentamidina são pró-drogas excelentes, as quais dispõe de parâmetros físico-químicos excelentes e possuem uma boa biodisponibilidade oral. Devido a estas propriedades, elas são claramente superiores a outras pró-drogas pirimidina. Podem ser utilizadas tanto na terapia do cancro, como também no tratamento de infeções por tripanossomas, leishmania e Pneumocystis carinii. A invenção descrita é explicada em maior detalhe através das Figuras em anexo.

Figura 1: Esquema de síntese da pró-droga pentamidina Figura 2: Estabilidade de N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) a diferentes valores de pH e em plasma murino ou humano, assim como na incubação com esterase.

Figura 3: Estabilidade de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) a diferentes valores de pH e em plasma murino ou humano

Figura 4: Ativação de N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) por esterases.

Figura 5: Teor em pentamidina após aplicação p.o. (50 mg/kg) de pentamidina e N,N-bis(succiniloxi)pentamidina (1) nos órgãos. São representados os valores médios de todas as ratazanas estudadas.

Material e Métodos: Exemplos de formas de realização de sínteses

(N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina) de 4,4'- pentametilenodioxi-bis-[N-(carboxipropioniloxi)] benzamidina (1): 1 g de diamidoxima de pentamidina são dissolvidos em 250 mL de acetona, e adiciona-se 540 mg de anidrido de ácido succinico. A mistura é agitada em refluxo durante 4 h. A seguir, o solvente é removido em vácuo e o resíduo é cristalizado a partir de tolueno.

Rendimento: 68%

Ponto de fusão: 141 °C IR(KBr): v~= 3478, 3348, 2940, 2870, 1732, 1698, 1612, 1472, 12 5 0 cm-1 NMR (DMSO-d6) : δ/ppm (TMS) = 1,59 (m, 2H, CH2) , 1,79 (qn, 4H, 3J = 6,7 Hz, CH2), 2,52 (t, 4H, 3J = 6,6 Hz, CH2) , 2,68 (t, 4H, 3J = 6,6

Hz, CH2), 4,04 (t, 4H, 3J = 6,5 Hz, 0-CH2) , 6,63 (s, 4H, NH2), 6,99 (mc, 4H, AA'BB', Ar-H) , 7,65 (mc, 4H, AA'BB', Ar- H) , 12,18 (brs, 2H, COOH) 13C-NMR (DMSO-d6) : δ/ppm (TMS) = 22,1 (CH2) , 27,9 (CH2) , 28,3 (CH2) , 28,8 (CH2), 67,5 (0-CH2), 113,9 (ArCH) , 123,5 (ArC) , 128,1 (ArCH) , 156,2 (ArC), 160,3 (C-NH2) , 170,2 (COOR) , 173,5 (COOH) MS (ESI) m/z: 573 [M+H]+, 555 [M-H20+H]+, 473 [M-C4H403+H]+, 455 [M-C4H403-H20+H]+, 373 [DAO+H]+, 178

Análise elementar C27H32N4Oi0 (massa molecular: 572,56): Calculado: C 56,64, H 5,63, N 9,79 Obtido: C 56, 85, H 6,01, N 9,60

(N,N'-bis(glutariloxi)pentamidina) de 4,4'-pentametile-nodioxi-bis-[N-(carboxipropioniloxi)] benzamidina (2):

1 g de diamidoxima de pentamidina são dissolvidos em 250 mL de acetona e adiciona-se 616 mg de anidrido de ácido glutárico. A mistura é agitada em refluxo durante 4 h. A seguir, o solvente é removido em vácuo e o residuo é cristalizado a partir de tolueno.

Rendimento: 80%

Ponto de fusão: 155 °C IR(KBr): ν' = 3495, 3350, 2950, 2874, 1747, 1700, 1619, 1520, 14225, 1258 cm-1 3Η NMR (DMSO-dg) : δ/ppm (TMS) = 1,59 (m, 2H, CH2) , 1,81 (m, 8H, CH2) , 2,29 (t, 4H, 3J = 7,4 Hz, CH2), 2,49 (t, 4H, 3J = 7,1 Hz, CH2) , 4,04 (t, 4H, 3J = 6,4 Hz, 0-CH2) , 6,63 (s, 4H, NH2) , 6,98 (m, 4H, AA' BB' , Ar-H) , 7,65 (m, 4H, AA' BB' , Ar-H) , 12,05 (s, 2H, COOH) 13C-NMR (DMSO-d6) : δ/ppm (TMS) = 19,9 (CH2) , 22,1 (CH2) , 28,3 (CH2) , 31,6 (CH2), 32,8 (CH2), 67,5 (0-CH2) , 114,1 (ArCH) , 123,5 (ArC) , 128,1 (ArCH), 156,1 (ArC), 160,3 (C-NH2) , 170,6 (COOR) , 173,9 (COOH) MS (ESI) m/z: 601 [M+H]+, 169

Análise elementar C29H36N4Oio (massa molecular: 600, 62) :

Calculado: C 57,99, H 6,04, N 9,33 Obtido: C 58,05, H 6,24, N 9,72

Caracterização da pró-droga pentamidina

Ensaios de estabilidade da N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina

(D

Para os ensaios de estabilidade, foi preparada uma solução 0,1 mM de N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) em 50 mM de tampão de fosfato de potássio/DMSO (90/10, vol/vol). O ensaio decorre a pH 2,0, 7,4 e 9,0. A cada 15 minutos durante um periodo de tempo de 150 min, foi retirada uma amostra, que foi imediatamente analisada por HPLC.

Foram realizadas mais experiências com plasma humano e murino. 900 yL de plasma foram misturados com 100 yL de uma solução 2 mM de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1). A concentração final de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) foi de 0,2 mM. As amostras foram incubadas num banho de água com agitação a 37 °C e foram retiradas amostras após 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 e 120 min. Para isso, foram retirados 100 yL que foram adicionados a 100 yL de acetonitrilo. As amostras foram agitadas, centrifugadas durante 5 minutos e o sobrenadante foi medido por HPLC.

Adicionalmente, foram realizadas incubações com carboxil-esterase de figado de porco. Para isso, a N,N'-bis (succiniloxi)pentamidina (1) foi incubada numa concentração de 0,1 mM com 1 U de esterase em 250 yL de tampão fosfato a 50 mM, pH 7,4, a 37 °C, ao longo de um periodo de tempo de 60 min. As amostras foram analisadas por HPLC a cada 15 min.

Os ensaios de estabilidade foram analisados através do seguinte método de HPLC:

Sistema HPLC Waters Alliance™ HPLC-System com Waters e2695 XC Separations Modul, Waters 2998 Photodiode Array Detector e software de gravação e cálculo Empower™ 2

Fase Synergi Max-RP 80A (Phenomenex, 250 x 4,6 mm; 4 μπι) estacionária com uma pré-coluna Phenomenex C18 (4 x 3,0 mm)

Fase móvel A 45% tampão fostafo 20 mM pH 7,0 B 55% metanol

Deteção 210-400 (260 nm)

Taxa de fluxo 1,0 mL/min

Tempo de 12 min corrida

Temperatura 25 °C coluna

Volume de 10 pL inj eção

Tempo de N,N'- 3,2 ± 0,1 min retenção bis(succiniloxi)pentamidina (D : succinilpentamidina: 4,8 ± 0,1 min diamidoxima de pentamidina 8,1 ± 0,2 min (3) :

Solubilidade de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1)

Uma quantidade insolúvel em 100 yL do composto foi ressuspensa em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4 ou 9,0), e agitou-se durante 20 min. A seguir, a parte não dissolvida foi centrifugada (12.000 rpm) e as amostras foram imediatamente medidas por HPLC. 0 cálculo da solubilidade é feito através de uma calibração de N,N'-bis (succiniloxi) pentamidina (1) em DMSO. A um pH fisiológico de 7,4, o composto tem boa solubilidade (7,5 mM). A solubilidade é ainda melhorada quando o pH é aumentado (ver Tabela 1).

Como comparação, foram estudadas outras pró-drogas pentamidina diferentes, para poder avaliar melhor a solubilidade em comparação com derivados já descritos. 0 cálculo da solubilidade foi feito de forma análoga ao método descrito para o composto 1.

Tabela 1: Solubilidade de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) e outras pró-drogas pentamidina a pH diferentes

Determinação da ligação a proteínas da N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) A ligação a proteínas do plasma foi feita com três concentrações (10, 20 e 50 μΜ) . Como soluções proteicas, utilizou-se uma solução a 4% de albumina. Pipetaram-se 50 yL de uma solução de substância concentrada 10 vezes em 450 yL de solução proteica. A incubação foi feita ao longo de 15 min num banho de água com agitação a 37 °C. A seguir, as amostras foram colocadas em unidades de ultrafiltração (Vivaspin 500, cut off 10 kDa), e centrifugou-se durante 15 min a 10.000 rpm. O filtrado foi analisado por HPLC. Adicionalmente, fez-se um controlo para cada concentração, o qual não foi adicionado a proteína e não foi centrifugado. Um outro controlo sem adição de proteína o qual foi, contudo, centrifugado, mostrou que as pró-drogas não são retidas na membrana e servem como validação do método. A análise das amostras resultou numa ligação a proteínas do composto 1 de 97,1 ± 1,2%.

Ensaio da bioativação de N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina

(D Cálculo da ativação da pró-droga com diferentes sistemas enzimáticos subcelulares A ativação da pró-droga foi determinada in vitro por intermédio de preparações enzimáticas subcelulares. Como preparações enzimáticas utilizaram-se sobrenadantes de 9000xg, microssomas e mitocôndrias de figado e rins humanos e de porco. As misturas de incubação são constituídas por 500 μΜ de pró-droga, 1 mM de NAHD, 1 U de esterase e 0,3 mg de preparação enzimática, dissolvidas em 150 pL de tampão fosfato 100 mM pH 6,3. A incubação é feita a longo de 20 min a 37 °C num banho de água com agitação. A incubação foi terminada através da adição de 150 pL de acetonitrilo. A seguir, as amostras foram agitadas durante 10 min e a proteína precipitada foi centrifugada a 10.000 rpm durante 15 min. O sobrenadante foi medido por HPLC. As taxas de conversão calculadas são apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2: Ativação de N,Ν'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) na forma ativa com preparações enzimáticas subcelulares, HL= fígado humano, HN= rins humanos, SL= fígado de porco, SN= rins de porco, 9000g= sobrenadante 9000g, MS= microssomas, Mt= mitocôndrias Fonte enzimática pentamidina [nmol*min‘1*mg_1]

Fonte enzimática pentamidina [nmol*min'1*mg'1]

Adicionalmente, foram realizadas incubações com 1 U de carboxilesterase de figado de porco. Para isso, o composto foi incubado numa concentração de 500 μΜ com 1 U de esterase em 250 yL de tampão fosfato pH 7,4, durante 60 min. As incubações são paradas através da adição de 250 pL de acetonitrilo. As incubações com carboxil-esterases de figado de porco levaram a uma rápida ativação de N,N'-bis(succiniloxi)pentamidina (1) (ver Figura 4). Logo após uma incubação de 60 min verificou-se uma ativação de cerca de 90% do substrato utilizado. Este resultado mostra que o primeiro passo da ativação de N,N'- bis(succiniloxi)pentamidina (1) para diamidoxima decorre a grande velocidade. Método de HPLC para a determinação de pentamidina

Sistema HPLC Waters Alliance™ HPLC-System com Waters e2695 XC

Separations Modul, Waters 2998 Photodiode Array Detector e software de gravação e cálculo Empower™ 2 Coluna LiChroCart, LiChrospher 60 RP-select B 125x4 mm, 5 pm

Biodisponibilidade oral (estudos animals) A pentamidina foi administrada por via intravenosa a 10 ratazanas numa concentração de 10 mg/kg. A N,N'-bis (succiniloxi)pentamidina (1) foi aplicada em 10 ratazanas numa concentração de 50 mg/kg, na forma de suspensão com goma arábica (10% massa/volume) , por sonda gástrica. Para a preparação da suspensão utilizou-se tampão fosfato de potássio 100 mM pH 9,0, para evitar uma degradação precoce do succiniléster no meio ácido do estômago. Além disso, aplicou-se pentamidina numa dose de 50 mg/kg a 3 ratazanas por sonda gástrica, para determinar a biodisponibilidade oral do agente ativo.

Após aplicação i.v., recolheram-se amostras após 5, 10, 20, 40, 75, 150 e 300 min, ou 20, 40, 60, 90, 120, 240 e 360 min após aplicação oral. Para isso recolheu-se 300 pL de sangue total com uma agulha de insulina, que se colocou em Microvetten CB 300 (Sarstedt, Numbrecht) revestidas com EDTA. Após cada recolha, lavou-se com 100 pL de solução salina 0,9% ou em intervalos de 60 min com solução de heparina (250 I.E./mL). A amostra de sangue foi brevemente agitada e colocada em gelo até centrifugação (4 °C; 14000 U/min; 10 min) . O restante armazenamento das amostras foi feito a -80 °C. O sacrifício decorreu por decapitação com uma guilhotina, 6 horas após aplicação do medicamento. A seguir, os órgãos foram removidos. Todos os órgãos foram lavados e congelados com 2-metilbutano arrefecido com gelo seco. Recolheu-se fígado, rins, pulmões, baço, coração e cérebro.

Processamento das amostras 1. Amostras de plasma

As amostras de plasma foram descongeladas à temperatura ambiente. Pipetaram-se 65 pL de amostra de plasma para 65 pL de acetonitrilo. A seguir, as amostras foram agitadas dura te 45 min. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 15 min e o sobrenadante foi colocado em frascos de HPLC. Utilizou-se 35 pL de cada amostra para medição por HPLC.

Para o cálculo quantitativo das amostras de plasma foram realizadas ou determinadas calibrações de pentamidina em tampão fosfato pH 7,4 ou em plasma murino. 2. Amostras de órgãos

Os órgãos foram descongelados e pesados à temperatura ambiente. Dependendo do órgão, processaram-se diferentes quantidade de tecido. No caso do fígado, usaram-se cerca de 1000 mg; para todos os outros órgãos usaram-se cerca de 500 mg. Os órgãos foram triturados com auxílio de um almofariz. Para isso, os tecidos pesados foram triturados com 1 mL de água bidestilada durante 5 min. A seguir, o almofariz foi passado por 1 mL de água bidestilada. As amostras foram agitadas durante 45 min e a seguir centrifugadas durante 15 min a 12.000 rpm. O sobrenadante foi colocado em frascos de vidro e concentrado em ar sob pressão. 0 sobrenadante foi lavado com 500 yL de acetonitrilo, novamente centrifugado e a restante amostra adicionada ao sobrenadante. O precipitado foi descartado. Após concentração em ar sob pressão as amostras foram congeladas a seco durante a noite. A dissolução das amostras é feita com 400 yL de uma mistura de metanol/água bidestilada (50/50) . As amostras foram agitadas durante 1,5 h à temperatura ambiente e a seguir o precipitado foi centrifugado (15.000 rpm, 15 min). A concentração de pentamidina foi determinada por HPLC a partir do sobrenadante.

Resultado dos estudos animais A análise das amostras de plasma após aplicação intravenosa de pentamidina resultou em niveis plasmáticos detetáveis num periodo de tempo de 300 min. Após aplicação oral da pró-droga não se detetaram concentrações plasmáticas de pentamidina. Este fenómeno é conhecido para os derivados de pentamidina, já que eles tendem a acumular-se nos tecidos. Assim, não foi possível fazer um cálculo direto da biodisponibilidade em concentrações plasmáticas. Para a determinação da biodisponibilidade oral foram por isso usadas concentrações de pentamidina nos órgãos estudados. Cálculo das amostras de órgãos e biodisponibilidade: A análise das amostras de órgãos processadas produziu quantidades detetáveis de pentamidina em todos os órgãos estudados, com as concentrações mais elevadas no fígado e rins. As concentrações nos pulmões, baço e coração são significativamente mais baixas. As concentrações mais baixas de pentamidina foram detetadas no cérebro. Os resultados estão resumidos na Figura 5.

Em geral, a biodisponibilidade oral de um composto é determinada através das concentrações plasmáticas após aplicação oral e intravenosa do composto. Devido ao elevado grau de ligação proteica da pentamidina e a sua forte tendência para acumulação nos tecidos, não foi possível calcular concentrações plasmáticas. Para o cálculo da biodisponibilidade relativa não são por isso utilizadas as concentrações plasmáticas, mas sim as quantidades detetadas nos órgãos estudados (fígado, rins, pulmões, baço, coração, cérebro). Através da comparação após aplicação intravenosa da substância ativa e aplicação oral da pró-droga, foi possível calcular uma biodisponibilidade relativa da pró-droga pentamidina. As diferentes doses foram tidas em conta no cálculo. As biodisponibilidades relativas são

representadas na Tabela 3. A biodisponibilidade mais elevada foi encontrada no fígado com 98%. A biodisponibilidade nos outros tecidos é significativamente mais baixa. A elevada biodisponibilidade no fígado pode ser explicada com a bioativação da pró-droga. Esta ocorre principalmente no fígado, o que explica as elevadas concentrações neste órgão. A concentração no cérebro é muito baixa, o que indica que a pró-droga não é capaz de passar a barreira hematoencefálica em grandes quantidades.

Tabela 3: Biodisponibilidade relativa dos derivados pentamidina

Análise HPLC

Para a análise das amostras dos órgãos e plasma após aplicação i.v. de pentamidina, foi usada a seguinte análise de HPLC:

Sistema HPLC Waters Autosampler 717plus, Waters 600

Controller, Waters 600 Pump, Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector und EZChrom Elite Client/Server Software de gravação e cálculo (Versão 2.8.3)

Fase Superspher 60 RP-select B (250 x 3 mm) ; pré-coluna: estacionária Merck LiChrospher 60 RP-select B (4 x 4 mm, 5 pm)

Fase móvel 40% metanol 60% TFA 0,1% pH 2,5

Deteção λΕχ=275 nm AEm=340 nm

Taxa de fluxo 0,32 mL/min

Tempo de corrida 35 min

Volume de 35 pL inj eção

Tempo de pentamidina: 22,4 ± 1,2 min retenção

Para a análise das amostras dos órgãos e plasma após aplicação oral de pró-droga pentamidina, foi usada a seguinte análise de HPLC:

Lista de Referências: 1. Chow, T. Y.; Alaoui-Jamali, M. A.; Yeh, C.; Yuen, L.; Griller, D. The DNA double-stranded break repair protein endo-exonuclease as a therapeutic target for cancer. Mol Cancer Ther 2004, 3, 911-9. 2. Pharma, 0. Inhibitors of Endo-Exonuclease activity for treating cancer. 2001. 3. Pharma, 0. Pentamidine Combinations for Treating Cancer. 2010 . 4. Clement, B. Reduction of N-hydroxylated compounds: amidoximes (N-hydroxyamidines) as pro-drugs of amidines. Drug Metab Rev 2002, 34, 565-79. 5. Clement, B.; Schmitt, S.; Zimmermann, M. Enzymatic reduction of benzamidoxime to benzamidine. Arch Pharm (Weinheim) 1988, 321, 955-6. 6. Clement, B.; Imme1, M.; Terlinden, R.; Wingen, F. J. Reduction of amidoxime derivatives to pentamidine in vivo. Arch Pharm (Weinheim) 1992, 325, 61-2. 7. Havemeyer, A.; Bittner, F.; Wollers, S.; Mendel, R.; Kunze, T.; Clement, B. Identification of the missing component in the mitochondrial benzamidoxime prodrugconverting system as a novel molybdenum enzyme. J Biol Chem 2006, 281, 34796-802. 8. Gruenewald, S.; Wahl, B.; Bittner, F.; Hungeling, H.; Kanzow, S.; Kotthaus, J.; Schwering, U.; Mendel, R. R.; Clement, B. The fourth molybdenum containing enzyme mARC: cloning and involvement in the activation of N-hydroxylated prodrugs. J Med Chem 2008, 51, 8173-7. 9. Clement, B.; Burenheide, A.; Rieckert, W.; Schwarz, J. Diacetyldiamidoximeester of pentamidine, a prodrug for treatment of protozoal diseases: synthesis, in vitro and in vivo biotransformation. ChemMedChem 2006, 1, 1260-7. 10. Clement, B. R., C. Improvement of the bioavailability of active substances having an amidine function in medicaments. 2008. 11. Clement, B. R., C.; Hungeling, H. Use of amidoxime carboxylic acid esters and N-hydroxyguanidine carboxylic acid esters for producing prodrugs. 2009. 12. Reeh, C.; Wundt, J.; Clement, B. N,N'-dihydroxyamidines: a new prodrug principle to improve the oral bioavailability of amidines. J Med Chem 2007, 50, 6730-4. 13. Arafa, R. K.; Brun, R.; Wenzler, T.; Tanious, F. A.; Wilson, W. D.; Stephens, C. E.; Boykin, D. W. Synthesis, DNA affinity, and antiprotozoal activity of fused ring dicationic compounds and their prodrugs. J Med Chem 2005, 48, 5480-8. 14. Brendle, J. J.; Outlaw, A.; Kumar, A.; Boykin, D. W.; Patrick, D. A.; Tidwell, R. R.; Werbovetz, K. A. Antileishmanial activities of several classes of aromatic dications. Antimicrob Agents Chemother 2002, 46, 797-807. 15. Donkor, I. 0.; Huang, T. L.; Tao, B.; Rattendi, D.; Lane, S.; Vargas, M.; Goldberg, B.; Bacchi, C. Trypanocidal activity of conformationally restricted pentamidine congeners. J Med Chem 2003, 46, 1041-8. 16. Ismail, M. A.; Brun, R.; Wenzler, T.; Tanious, F. A.; Wilson, W. D.; Boykin, D. W. Dicationic biphenyl benzimidazole derivatives as antiprotozoal agents. Bioorg Med Chem 2004, 12, 5405-13.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto de fórmula

no qual n representa 2.

2. Sais, solvatos e solvatos dos sais dos compostos de acordo com a reivindicação 1.

3. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 para utilização no tratamento e/ou profilaxia de doenças.

4. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 para utilização no tratamento e/ou profilaxia de doenças oncológicas e doenças tumorais de todas as patogéneses.

5. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 para utilização no tratamento e/ou profilaxia de leishmaniose, tripanossomiase e/ou pneumonia por Pneumocystis carinii (PcP).

6. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 para utilização no tratamento e/ou profilaxia de malária.

7. Fármaco compreendendo pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, eventualmente em combinação com um ou mais adjuvantes inertes, não tóxicos farmaceuticamente utilizáveis.

8. Fármaco compreendendo pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 em combinação com um ou mais adjuvantes adicionais.

9. Fármaco compreendendo pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 para utilização oral ou parentérica.

10. Fármaco compreendendo pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, para tratamento e/ou profilaxia de doenças tumorais.

11. Fármaco de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado por ser resistente aos sucos gástricos.

12. Método para o fabrico de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, em que a amidoxima da fórmula (A)

(A) é convertida num composto de fórmula (C)

(C) através de reação com um ácido dicarboxílico anidrido de fórmula (B)

(B) na qual n representa 2.