RS55557B1 - Amidoksimski estri karboksilnih kiselina pentamidina kao prolekovi i njihova primena kao lekova - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na prolekove-derivate pentamidina, na njihovu primenu za lečenje i/ili profilaksu bolesti, a naročito tumorskih i kancerskih bolesti, kao i lajšmanioze, tripanozomijaze, pneumocvstis carinii pneumonije (PcP), kao i malarije. Pentamidin je antiparazitarno i antimikrobno aktivno jedinjenje čija primena je etablirana u lečenju tripanozomijaze, lajšmanioze, kao i pneumocvstis carinii pneumonije (PcP). Zbog dve jako bazne amidinske funkcije, jedinjenje je naelektrisano pod fiziološkim uslovima i organizam ga neće apsorbovati posle oralne primene. Ovo je razlog zbog čega to jedinjenje mora da se daje parenteralno, npr. intramuskularno, intravenski ili inhalativno. U ovom kontekstu treba imati u vidu da se većina infekcija izazvana gore navedenim patogenima pojavljuje u tropskim i suptropskim zemljama u kojima je medicinska nega često nezadovoljavajuća. Komplikovani načini primene, kakve predstavljaju intravenska i inhalativna primena zbog toga znatno otežavaju bezbednu terapiju ovim lekom u ovim zemljama. Iz ovog razloga je razvoj oralno bioraspoloživog pentamidinskog proleka od izuzetne važnosti da bi se odlučujuće poboljšale mogućnosti lečenja. Sledeći negativni aspekt je nepostojanje mogućnosti da pentamidin pređe u CNS, što rezultuje time da je pentamidin efektivan samo u ranom stadijumu tripanozomijaze (afričke bolesti spavanja), a ne u meningo-encefalitičnoj fazi u kojoj patogeni prodiru u CNS.

[0002]Sledeća moguća oblast primene pentamidina je lečenje kancera. Inhibitorno dejstvo pentamidina na endo-egzonukleaze je pažljivo proučavano tokom poslednjih godina. 1 '<2>Prve kliničke studije su već pokazale obećavajuće rezultate u lečenju karcinoma dojke i kolona.<3>Primena oralno bioraspoloživog pentamidinskog proleka je ovde takođe od velikog značaja.

[0003]Iz ovih razloga su bili sprovedeni brojni testovi sa ciljem da se poboljšaju i bioraspoloživost i prolaznost u CNS. U prethodnim studijama, pentamidin je bio provođen u pentamidin diamidoksim manje baznosti, što bi dovelo do velikog povećanja lipofilnosti. Pošto su amidoksimi nenaelektrisani pod fiziološkim uslovima, apsorpcija ovih jedinjenja iz gastrointestinalnog trakta se drastično povećala.<4>Primetna redukcija amidoksima u farmakološki aktivne amidine je mogla biti prvi put pokazana 1988. godine, na modelu jedinjenja benzamidoksima.<5>Taj princip je kasnije bio prenet na pentamidin, čime su bili dobijeni pentamidin-monoamidoksim i pentamidin-diamidoksim (3). U životinjskim studijama su oba jedinjenja ispoljila malu bioraspoloživost i dobru sposobnost da budu aktivirana u aktivni oblik pentamidina.<6>U međuvremenu je mogao biti identifikovan enzimski sistem koji je odgovoran za redukciju kao do sada nepoznati sistem koji sadrži molibden, a koji se naziva mARC (mitohondrijalna komponenta koja redukuje amidoksim, engl. mitochondrial Amidoxime Reducing Component). 7 '<8>

[0004] Da bi se optimizirali i farmakokinetički profil radi poboljšanja bioraspoloživosti, i sposobnost prolaska u CNS pentamidina, razvijeni su drugi prolekovi. Sa N,N-bis(acetoksi)pentamidinom je bilo dobijeno jedinjenje koje je imalo znatno povećanu lipofilnost u poređenju sa drugim pentamidinskim prolekovima. Ovaj prolek je takođe ispoljio oralnu bioraspoloživost u studijama na životinjama, kako na pacovima, tako i na svinjama. Nedostatak N,N-bis(acetoksi)pentamidina je veoma niska vodorastvornost, sa jedne strane, dok je utvrđena bioraspoloživost, sa druge strane, bila veoma niska, a nije mogao biti potvrđen ni prolaz u CNS.<9>Slični pristupi su doveli do razvoja N,N'-bis(metoksi)pentamidina koji, slično N,N'-bis(acetoksi)pentamidinu, ima veoma nisku vodorastvornost. Sledeći principi prolekova koji su mogli bili preneti na pentamidin su hidroksilacija u N,N'-bis(dihidroksi)pentamidin i konjugacija sa aminokiselinama (a naročito valinom) u N,N'-bis(valoksi)pentamidin.<10-12>Ukratko, treba istaći da do danas nije mogao biti razvijen pentamidinski prolek koji bi ispunio zadate kriterijume (dobra oralna bioraspoloživost, prolazak u CNS, i dobra rastvorljivost) na optimalni način.

[0005] Imajući u vidu navedeno, predmetni pronalazak je zasnovan na zadatku da se realizuju pentamidinski prolekovi, koji bi u odnosu na poznate prolekove pentamidina imali poboljšana svojstva.

[0006] Navedeni zadatak je prema pronalasku rešen jedinjenjem formule (I)

u kojoj n predstavlja 2.

[0007] Prema pronalasku n u formuli (T) predstavlja 2.

[0008]U jednom drugom poželjnom primeru izvođenja n u formuli (I) predstavlja 3. U jednom poželjnom primeru izvođenja n u formuli (I) predstavlja 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.

[0009]Posebno je N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) izraženo superioran u odnosu na do sada opisane pentamidinske prolekove. Utvrđeno je značajno poboljšanje rastvorljivosti, koja predstavlja veoma kritičan parametar kod drugih pentamidinskih prolekova. Zbog poboljšane rastvorljivosti, postoji pozitivan uticaj na farmakokinetičko ponašanje supstance, pošto dobra svojstva rastvorljivosti predstavljaju važan parametar za apsorpciju lekovitih materija. Pored toga se predmetni pronalazak takođe odnosi i na soli, solvate i solvate soli navedenih jedinjenja formule (I). Dalje se predmetni pronalazak odnosi na navedena jedinjenja formule (I) za primenu u lečenju i/ili profilaksi bolesti. U jednom poželjnom primeru izvođenja se predmetni pronalazak odnosi na navedena jedinjenja za primenu u lečenju i/ili profilaksi onkoloških bolesti i tumorskih bolesti bilo koje patogeneze.

[0010]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na navedena jedinjenja za primenu u lečenju i/ili profilaksi lajšmanioze, tripanozomijaze i/ili pneumocvstis carinii pneumonije (PcP).

[0011]U sledećem poželjnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na navedena jedinjenja za primenu u lečenju i/ili profilaksi malarije.

[0012]Dalje se predmetni pronalazak takođe odnosi i na lek koji sadrži najmanje jedno od navedenih jedinjenja formule (I), opciono u kombinaciji sa jednim ili više inertnih, netoksičnih, farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

[0013]Pored toga se predmetni pronalazak odnosi na lek koji sadrži najmanje jedno od navedenih jedinjenja formule (I) u kombinaciji sa jednom ili više drugih aktivnih materija.

[0014]Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi i na lek za oralnu ili parenteralnu primenu.

[0015]Predmetni pronalazak se dalje odnosi i na lek za lečenje i/ili profilaksu onkoloških bolesti i tumorskih bolesti.

[0016]Pored toga se predmetni pronalazak takođe odnosi i na lek koji je gore opisan, a koji je formulisan gastrorezistentno.

[0017]Pored toga se predmetni pronalazak odnosi i na metod lečenja i/ili profilakse tumorskih bolesti kod ljudi ili životinja uz primenu najmanje jednog od navedenih jedinjenja formule (I) ili navedenog leka.

[0018]Dalje se predmetni pronalazak odnosi na metod lečenja i/ili profilakse lajšmanioze, tipanozomijaze i pneumocvstis carinii pneumonije (PcP).

[0019]Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju gore opisanog jedinjenja, kod koga se amidoksim formule (A)

reakcijom sa anhidridom dikarboksilne kiseline formule (B) u kojoj n predstavlja 2 prevodi u jedinjenje formule (C)

[0020]Sledeći razvijeni princip proleka je kuplovanje amidoksima sa dikarboksilnim kiselinama, kao što je ona koja je opisana u prijavama patenata WO2009095499 i DE102008007381.<11>Odgovarajući pentamidinski prolekovi su bili razvijeni uz uzimanje u obzir ovih studija. Dobijena jedinjenja su bila detaljno karakterisana i ispitana je njihova bioraspoloživost. Naše studije su pokazale da su pentamidinski derivati dikarboksilnih kiselina posebno podesni pentamidinski prolekovi, koji pored odlične rastvorljivosti takođe poseduju i dobru oralnu bioraspoloživost posle oralne primene. Uporedne analize sa korišćenjem drugih pentamidinskih prolekova su u ovom slučaju pokazale superiornost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u odnosu na do sada opisane pentamidinske prolekove.

Detaljni opis pronalaska

[0021]Terapeutska primena pentamidina je do sada bila veoma ograničena zbog nedovoljne oralne bioraspoloživosti. Posebno bi u strukturno slabim zemljama Trećeg sveta razvoj oralno bioraspoložive farmakoterapije predstavljao značajan progres u farmakoterapiji, pošto bi on omogućio izbegavanje komplikovanih i rizičnih intravenskih primena. Pored toga, aktuelne opcije lečenja, a naročito infekcija sa tripanozomom, pneumocvstis carinii, pneumocvstis jirovecii i lajšmanijom nisu zadovoljavajuće. Iz ovog razloga, glavni fokus ovog pronalaska je razvoj oralno bioraspoloživog proleka pentamidina.

[0022] Pored toga, oralno primenljiv pentamidinski prolek bi mogao dobiti na velikom značaju u terapiji kancera. Pentamidin se trenutno ispituje u kliničkim studijama protiv različitih vrsta kancera (karcinoma dojke i kolona). Prve kliničke studije su već pokazale obećavajuće rezultate. Ovde bi novi pentamidinski prolekovi takođe mogli naći primenu i poboljšati terapiju, čak i u kombinaciji sa drugim onkološki aktivnim materijama.

[0023] Novi pentamidinski prolekovi u okviru predmetnog pronalaska su razvijeni vezivanjem pentamidinskog diamidoksima (3) za dikarboksilne kiseline. Dobijena jedinjenja su bila kompletno karakterisana in vitro i in vivo, pri čemu su ona ispoljila odličnu rastvorljivost, kao i dobru bioraspoloživost. Pored toga, komparativne analize uz korišćenje različitih pentamidinskih prolekova su pokazali superiornost novorazvijenog N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u odnosu na do sada opisane pentamidinske prolekove.

Sinteza

[0024] Dobijanje prolekova (1, 2) je izvedeno od pentamidin diamidoksima (3) i odgovarajućeg anhidrida kiseline (anhidrida ćilibarne kiseline, odn. anhidrida glutarne kiseline). Polazni jedinjenje je zagrevano pod refluksom tokom 4 sata u osušenom acetonu uz dodavanje anhidrida ćilibarne kiseline (vidi sliku 1). Pratećim ključanjem u toluenu i direktnim filtriranjem se omogućava izdvajanje supstanci 1 i 2 i željena jedinjenja se dobijaju u analitički čistom obliku.

Stabilnost

[0025]Analize su pokazale da je jedinjenje 1 stabilno u neutralnom i blago alkalnom pH opsegu, odnosno od pH 7,4 do pH 9,0. U kiselom medijumu na pH 2,0, jedinjenja su se brzo hidrolitički razložila (slike 2, 3).

[0026] Tokom analiza se pokazalo da se N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) u vodenom medijumu hidrolizovao u monosukcinil pentamidin i pentamidin diamidoksim (3). Dok se ova hidroliza na pH 7,4 i pH 9,0 nastavila samo do male mere, ona se u znatnoj meri nastavila na pH 2,0 u humanoj, kao i u mišijoj plazmi. Brza hidroliza N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) na pH 2,0 (vidi slike 2, 3) mora biti klasifikovana kao problematična sa stanovišta primene kao proleka. N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) bi doveo do brze hidrolize proleka u pentamidin diamidoksim (3) u kiselom želudačnom medijumu posle oralne primene. Međutim, pošto se najveći deo gastrointestinalne apsorpcije odvija samo u gornjim delovima tankog creva, onda bi se trebalo usmeriti na gastrorezistentnu formulaciju ovog proleka. Na taj način, prolek bi mogao neoštećen izdržati kiselo okruženje u želucu i mogao bi biti apsorbovan kasnije u tankom crevu. Zbog toga nestabilnost na pH 2,0 treba da bude klasifikovana kao neproblematična za kasniju primenu kao lekovite supstance.

Rastvorljivost

[0027] N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) poseduje veoma dobru rastvorljivost u pH opsegu od 7,4 do 9,0 (vidi Tabelu 1). Rastvorljivost u kiselom medijumu (pH 2,0) nije mogla biti precizno karakterisana zbog gore opisane hidrolize u ovom medijumu. Međutim, eksperimenti su ovde takođe pokazali daje rastvorljivost u mM opsegu.

[0028] Tabela 1 pokazuje rastvorljivost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u poređenju sa drugim razvijenim pentamidinskim prolekovima. Na osnovu ovih podataka postaje jasno daje derivat dikarboksilne kiseline (1) jedinjenje sa najboljom rastvorljivosti. Samo je još pentamidin monoamidoksim isto tako rastvorljiv u mM opsegu na neutralnoj i blago alkalnoj pH vrednosti. Pored toga, ovo jedinjenje još poseduje slobodnu amidinsku funkciju koja ima veoma nepovoljan efekat na oralnu bioraspoloživost. Ova svojstva odlične rastvorljivosti podstiču njegovu kasniju primenu kao medicinske materije, pošto je dovoljna rastvorljivost osnovni preduslov za dovoljnu oralnu apsorpciju. Pored toga, dobra rastvorljivost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) takođe omogućava oblike za parenteralnu primenu, kao što su injekcije ili infuzije.

Vezivanje proteina

[0029]Analize vezivanja za proteine plazme su pokazala da ovo jedinjenje, koje ima vezivanje za protein plazme od 97%, poseduje veoma izraženo vezivanje za proteine. Utvrđeno vezivanje za proteine je u opsegu koji je takođe opisan za druge pentamidinske prolekove i zato ne predstavlja nedostatak u poređenju sa drugim prolekovima.<9>

Koncept proleka

[0030]Sam koncept proleka na kome su bazirana jedinjenja prema pronalasku je bio opisan u prijavama patenata WO2009095499 i DE102008007381.

[0031]Aktivacija proleka prema pronalasku se vrši preko esteraza i mARC enzimskog sistema i zato je nezavisna od citohrom P450 enzima. Učešće P450 enzima uvek uključuje rizik od interakcija koje nisu opisane u našem izabranom mehanizmu aktivacije. Citohrom P450 enzimi učestvuju u metabolizmu brojnih medicinskih materija. Ako se uzme nekoliko medicinskih materija koje se metabolišu preko ovog enzimskog sistema, onda odlaganje razlaganja medicinskih materija može rezultovati klinički značajnim neželjenim dejstvima.

In vitro aktivacija

[0032]Izvedene in vitro studije aktivacije pokazuju da se aktivacija N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) vrši u velikoj meri (Tabela 2). Inkubacija sa karboksil esterazama iz svinjske jetre je rezultovala brzom aktivacijom N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) (vidi sliku 4). Oko 90% upotrebljenog supstrata je bilo aktivirano već posle vremena inkubacije od 60 min. Ovaj rezultat pokazuje da se prvi korak aktivacije N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u diamidoksim vrši izuzetnom brzinom.

[0033]Redukcija pentamidina bi se mogla detektovati u inkubacijama sa subcelularnim enzimskim preparatima (Tabela 2). Generalno su izvori enzima svinjskog porekla aktivniji od humanih, što predstavlja činjenicu koja se može objasniti načinom na koji se dobijaju enzimski preparati. Treba uzeti u obzir da je priprema humanih organa znatno problematični]a, zbog veoma malih inicijalnih količina. Pored toga, svinjski organi po pravilu potiču od zdravih životinja, dok se uzorci humanih tkiva u većini slučajeva uzimaju od pacijenata sa karcinomom posle resekcije organa, što predstavlja objašnjenje za srazmerno male brzine konverzije pri korišćenju humanih enzimskih preparata.

[0034]Sumirajući navedeno treba naglasiti da je N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) podesan prolek pentamidina. Ova studija generalno pokazuje da se vrši bioaktivacija prolekova u aktivno jedinjenje. Može se očekivati da brzine konverzije in vivo budu znatn veće, jer se potrebni enzimi nalaze na raspolaganju u većim količinama.

Oralna bioraspoloživost

[0035]Oralna bioraspoloživost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) bi mogla biti pokazana u studijama sprovedenim na životinjama. Posle oralne administracije proleka, nivoi pentamidina u plazmi nisu mogli biti detektovani, što je činjenica koja se može objasniti poznatom tendencijom prema visokoj akumulaciji pentamidina u organima. Analiza uzoraka organa je pokazala da je N,N'-(bissukciniloksi)pentamidin (1) oralno bioraspoloživ. Posle oralne administracije proleka, relevantne koncentracije su mogle biti identifikovane u svim ispitivanim organima (jetra, bubrezi, pluća, srce, mozak i slezina). Najviše koncentracije su u ovom slučaju bile detektovane u bubrezima i jetri (slika 5). Koncentracije u slezini, srcu, mozgu i plućima su bile znatno manje. Relativna oralna bioraspoloživost za svaki organ je mogla biti određena do 98% (Tabela 3).

[0036]Sumirajući navedeno, podaci pokazuju izuzetnu podesnost principa proleka prema pronalasku za pentamidin. Koncentracije pentamidina koje su detektovane u organima su u opsegu koji omogućava terapiju infekcija sa tripanozomima (IC5o: 0,8-3,2 nM), lajšmanijama (IC50: 820-2590 nM), kao i plazmodijama (IC50: 35-129 nM).<13>"<16>

Rezime

[0037]Novorazvijeni prolekovi su oralno bioraspoloživi prolekovi pentamidina. Primenjeni princip proleka rezultuje značajnim poboljšanjem rastvorljivosti, koja predstavlja veoma kritični parametar za druge pentamidinske prolekove. Ova poboljšana rastvorljivost pozitivno utiče na farmakokinetičko ponašanje supstance, pošto dobra svojstva rastvaranja predstavljaju važan parametar za apsorpciju medicinskih materija, a naročito u gastrointestinalnom traktu.

[0038]Izuzev za kiseli pH opseg, jedinjenje 1 poseduje dobru hemijsku stabilnost. Izražena hidroliza u kiselom medijumu je uslov da prolek koji treba da se daje bude gastrorezistentna formulacija kada se daje oralno, tako da se izbegne hidroliza u želucu.

[0039]In vitro testovi bioaktivacije su mogli da pokažu brzu i opsežnu aktivaciju proleka u pentamidin. Aktivacija se nastavlja nezavisno od citohrom P450 enzima i zato ne uključuje rizik od interakcija.

[0040]Takođe je eksperimentalno mogla biti pokazana dobra oralna bioraspoloživost u studijama izvedenim na životinjama. Detektovani sadržaji pentamidina u organima su u opsegu koji omogućava efikasnost u vezi infekcija sa tripanozomama, lajšmanijama i plazmodijama.

[0041]Sumirajući navedeno, pentamidinski derivati dikarboksilnih kiselina su izuzetni prolekovi koje odlikuju odlični fizikohemijski parametri i koji poseduju dobru oralnu bioraspoloživost. Zbog ovih svojstava oni su znatno superiorniji u odnosu na druge pentamidinske prolekove. Primena je moguća i u terapiji kancera, i u lečenju infekcija sa tripanozomama, lajšmanijama i pneumocvstis carinii.

[0042]Opisani pronalazak će biti još detaljnije objašnjen na osnovu priloženih slika nacrta,

slika 1: šema sinteze pentamidinskih prolekova.

slika 2: stabilnost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) za različite pH-vrednosti i u mišijoj, odn. humanoj plazmi, kao i pri inkubaciji sa esterazom.

slika 3: stabilnost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) za različite pH-vrednosti i u mišijoj, odn. humanoj plazmi.

slika 4: aktivacija N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) pomoću esteraza.

slika 5: sadržaj pentamidina posle p.o.-primene (50 mg/kg) pentamidina i N,N-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u organima. Prikazane su srednje vrednosti za sve testirane pacove.

Materijal i metode: primeri izvođenja sinteza

[0043]

4,4'-pentametilendioksi-bis-[N-(karboksipropioniloksi)]benzamidin(N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin)(1):

[0044]1 g pentamidin diamidoksima se rastvara u 250 ml acetona, pa mu se dodaje 540 mg anhidrida ćilibarne kiseline. Sarža se meša pod refluksom tokom 4 h. Posle toga se rastvarač odstranjuje pod vakuumom, a ostatak se iskristalizuje iz toluena.

Prinos: 68%

Tačka topljenja: 141 °C

IR (KBr):

v~= 3478, 3348, 2940, 2870, 1732, 1698, 1612, 1472, 1250 cm"<1>

'H NMR (DMSO-d6):

5/ppm (TMS) = 1,59 (m, 2H, CH2), 1,79 (qn, 4H,<3>J = 6,7 Hz, CH2), 2,52 (t, 4H,<3>J = 6,6 Hz, CH2), 2,68 (t, 4H,<3>J = 6,6 Hz, CH2), 4,04 (t, 4H,<3>J = 6,5 Hz, 0-CH2), 6,63 (s, 4H, NH2), 6,99 (mc, 4H, AA'BB', Ar-H), 7,65 (mc, 4H, AA'BB', Ar-H), 12,18 (brs, 2H, COOH)

<13>C-NMR (DMSO-d6):

5 /ppm (TMS) = 22,1 (CH2), 27,9 (CH2), 28,3 (CH2), 28,8 (CH2), 67,5 (0-CH2), 113,9

(ArCH), 123,5 (ArC), 128,1 (ArCH), 156,2 (ArC), 160,3 (C-NH2), 170,2 (COOR), 173,5 (COOH)

MS (ESI) m/z:

573 [M+H]<+>, 555 [M-H20+H]<+>, 473 [M-C4H403+H]<+>, 455 [M-C4H403-H20+H]<+>, 373 [DAO+H]<+>, 178

Elementarna analiza C27H32N4Oio(molekulska masa: 572,56):

Izračunato: C 56,64, H 5,63, N 9,79 Utvrđeno: C 56,85, H 6,01, N 9,60

4,4'-pentametilendioksi-bis-[N-(karboksibutioniloksi)]benzamidin(N,N'-bis(glutariloksi)pentamidin) (2):

[0045]1 g pentamidin diamidoksima se rastvara u 250 ml acetona, pa mu se dodaje 616 mg anhidrida glutarne kiseline. Sarža se meša pod refluksom tokom 4 h. Posle toga se rastvarač odstranjuje pod vakuumom, a ostatak se iskristalizuje iz toluena.

Prinos: 80%

Tačka topljenja: 155°C

IR (KBr):

v~ = 3495, 3350, 2950, 2874, 1747, 1700, 1619, 1520, 14225, 1258 cm"<1>

'H NMR (DMSO-d6):

5/ppm (TMS) = 1,59 (m, 2H, CH2), 1,81 (m, 8H, CH2), 2,29 (t, 4H,<3>J = 7,4 Hz, CH2), 2,49 (t, 4H,<3>J = 7,1 Hz, CH2), 4,04 (t, 4H,<3>J = 6,4 Hz, 0-CH2), 6,63 (s, 4H, NH2), 6,98 (m, 4H, AA'BB', Ar-H), 7,65 (m, 4H, AA'BB', Ar-H), 12,05 (s, 2H, COOH)

<13>C-NMR (DMSO-d6):

8/ppm (TMS) = 19,9 (CH2), 22,1 (CH2), 28,3 (CH2), 31,6 (CH2), 32,8 (CH2), 67,5 (O-CH2), 114,1 (ArCH), 123,5 (ArC), 128,1 (ArCH), 156,1 (ArC), 160,3 (C-NH2), 170,6 (COOR), 173,9 (COOH)

MS (ESI) m/z: 601 [M+H]<+>, 169

Elementarna analiza C29H36N40io(molekulska masa: 600,62):

Izračunato: C 57,99, H 6,04, N 9,33

Utvrđeno: C 58,05, H 6,24, N 9,72

Karakterizacija pentamidinskih prolekova

Analize stabilnosti N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1)

[0046] Za analize stabilnosti je bilo pripremljeno 0,1 mM rastvora N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u 50 mM kalijum fosfatnog pufera/DMSO (90/10, vol/vol). Analiza je izvršena za pH vrednosti 2,0, 7,4 i 9,0. Bio je uziman jedan uzorak i odmah zatim je analiziran pomoću HPLC svakih 15 min tokom perioda od 150 min.

[0047] Naredne analize su bile izvedene sa humanom i mišijom plazmom. 900 ul plazme je bilo pomešano sa 100 jal 2 mM rastvora N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1). Shodno tome, finalna koncentracija N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) je bila 0,2 mM. Uzorci su bili inkubirani na 37° C u trešenom vodenom kupatilu, pa su uzorci bili uzeti posle 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 i 120 min. Za ove svrhe je bilo izvučeno po 100 ul i onda je pomešano sa 100 jul acetonitrila. Uzorci su bili trešeni, pa su centrifugirani tokom 5 min, a supernatant je bio izmeren pomoću HPLC.

[0048] Pored toga su bile izvršene inkubacije sa karboksil esterazom iz svinjske jetre. Za ove svrhe, N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) je bio inkubiran u koncentraciji od 0,1 mM sa 1 U esteraze u 250 ul 50 mM fosfatnog pufera, pH 7,4, na 37° C tokom perioda od 60 min. U intervalima od po 15 min su uzorci bili analizirani pomoću HPLC.

[0049] Analize stabilnosti su bile određene sledećim HPLC metodom:

Rastvorljivost N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1)

[0050]Količina jedinjenja koja nije bila rastvorljiva u 100 (0.1 je bila suspendovana u 50 mM fosfatnog pufera (pH 7,4, odgovarajući pH 9,0), pa je bila tresena tokom 20 min. Posle toga je nerastvoreni deo bio odstranjen centrifugiranjem (12.000 o/min), a zatim su uzorci odmah bili izmereni pomoću HPLC. Evaluacija rastvorljivosti je izvršena kalibracijom N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u DMSO. Jedinjenje se dobro rastvara (7,5 mM) na fiziološkoj pH vrednosti 7,4. Rastvorljivost se dalje povećava kada se pH vrednost povećava (vidi Tabelu 1).

[0051]Poređenjem su ispitani različiti drugi pentamidinski prolekovi, tako daje bilo moguće bolje proceniti rastvorljivost u poređenju sa ranije opisanim derivatima. Rastvorljivosti su bile određene analogno metodu opisanom za jedinjenje 1.

Određivanjevezivanja proteina N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1)

[0052] Vezivanje proteina plazme je bilo određeno za tri različite koncentracije (10, 20 i 50 uM). 4% rastvor albumina je bio upotrebljen kao rastvor proteina. Po 50 ul 10-to struko koncentrovanog rastvora supstance je bilo pipetirano u 450 ul rastvora proteina. Inkubacija je bila izvršena tokom 15 min u trešenom vodenom kupatilu na 37° C. Posle toga su uzorci bili preneti u ultrafiltracione jedinice (Vivaspin 500, 10 kDa odsecanje), pa su centrifugirani tokom 15 min na 10.000 o/min. Filtrat je bio analiziran pomoću HPLC. Pored toga, bila je pripremljena kontrola koja nije bila pomešana sa proteinom, niti je bila centrifugirana za svaku koncentraciju. Međutim, sledeća kontrola bez proteina koja je bila centrifugirana pomoću filtracione jedinice je pokazala da dijafragma nije zadržala prolekove i poslužila je za validaciju metodologije.

[0053] Analizom uzorka je određeno vezivanje proteina jedinjenja 1 od 97,1±1,2%.

Analiza bioaktivacije N,N<r->bis(sukciniloksi)pentamidina (1)

Određivanje aktivacije proleka primenom različitih subcelularnih enzimskih sistema

[0054] Aktivacija proleka je bila određena in vitro pomoću subcelularnih enzimskih preparata. 9000xg supernatanata, mikrozoma i mitohondrija iz humanog i svinjskog tkiva jetre i bubrega su bili upotrebljeni kao enzimski preparati. Šarže za inkubaciju su se sastojale od 500 uM proleka, 1 mM NADH, 1 U esteraze i 0,3 mg enzimskog preparata rastvorenog u 150 ul 100 mM fosfatnog pufera, pH 6,3. Inkubacija je bila izvršena tokom 20 min u trešenom vodenom kupatilu na 37° C. Inkubacija je bila okončana dodavanjem 150 ul acetonitrila. Uzorci su zatim bili trešeni tokom 10 min, a istaloženi protein je bio odstranjen centrifugiranjem na 10.000 o/min tokom 15 min. Supernatant je bio izmeren pomoću HPLC. Utvrđeni stepeni konverzije su navedeni u Tabeli 2.

[0055] Pored toga su bile izvršene inkubacije uz korišćenje 1 U karboksil esteraze iz svinjske jetre. Za ove svrhe, jedinjenje je bilo inkubirano preko 60 min u koncentraciji od 500 uM sa 1 U esteraze u 250 ul 50 mM fosfatnog pufera, pH 7,4. Inkubacije su bile okončane dodavanjem 250 ul acetonitrila. Inkubacije sa korišćenjem karboksil esteraza iz svinjske jetre su dovele do brze aktivacije N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) (vidi sliku 4). Oko 90% upotrebljenog supstrata je već bilo aktivirano posle vremena inkubacije od 60 min. Ovaj rezultat pokazuje da se prvi korak aktivacije N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidina (1) u diamidoksim odvija velikom brzinom.

HPLC metod za određivanje pentamidina

Oralnabioraspoloživost (studija na životinjama)

[0056] 10 pacova je dobilo pentamidin intravenski u koncentraciji od 10 mg/kg. 10 pacova je dobilo N,N'-bis(sukciniloksi)pentamidin (1) u koncentraciji od 50 mg/kg kao suspenziju sa guma arabikom (10% m/V) po gavaži. 100 mM kalijum fosfatnog pufera sa pH 9,0 je bilo upotrebljeno za pripremanje suspenzije, tako da se spreči prerano odvajanje sukcinil estra u kiselom okruženju želuca. Pored toga, 3 pacova su dobila pentamidin u dozi od 50 mg/kg po gavaži da bi se odredila oralna bioraspoloživost njegovog aktivnog oblika.

[0057] Posle intravenske administracije, uzorci plazme su bili uzeti posle 5, 10, 40, 75, 150 i 300 min, respektivno i 20, 40, 60, 90, 120, 240 i 360 min posle oralne administracije. Za ove svrhe je bilo uzeto po 300 ul cele krvi uz korišćenje insulinskog šprica, pa je preneto u mikroepruvete (Microvette) CB 300 prevučene sa EDTA (Sarstedt, Numbrecht). Posle svakog uzimanja, uzorak je bio ispran sa 100 ul 0,9% slanog rastvora, odnosno sa rastvorom heparina (250 I.E./ml) u intervalu od 60 min. Uzorak krvi je bio kratko trešen, pa je stavljen na led do centrifugiranja (4° C; 14.000 o/min; 10 min). Uzorci su dalje bili čuvani na -80° C.

[0058] Eutanazija je bila izvršena odrubljivanjem glave giljotinom 6 sati posle administracije leka. Posle toga su bili uklonjeni organi. Svi organi su bili očišćeni, pa su zamrznuti u 2-metilbutanu ohlađenom u suvom ledu. Bili su uklonjeni jetra, bubrezi, pluća, slezina, srce i mozak.

Priprema uzoraka

1. Uzorci plazme

[0059]Uzorci plazme su bili odmrznuti na sobnoj temperaturi. Bilo je pripremljeno po 65 ul acetonitrila i onda je pipetiranjem bilo dodato po 65 ul uzoraka plazme. Uzorci su zatim bili trešeni tokom 45 min. Uzorci su bili centrifugirani na 10.000 o/min tokom 15 min, pa je supernatant bio prenet u HPLC bočice. Bilo je upotrebljeno po 35 ul za HPCL određivanja.

[0060]Kalibracije i analize za ponovno dobij anje/rekuperaciju pentamidina su bili izvršene u fosfatnom pueru sa pH 7,4, odn. u mišijoj plazmi, respektivno, da bi se kvantitativno evaluirali uzorci plazme.

2. Uzorci organa

[0061]Organi su bili odmrznuti na sobnoj temperaturi, pa su izmereni. U zavisnosti od odgovarajućeg organa, bile su pripremljene različite količine tkiva. Oko 1000 mg je bilo upotrebljeno u slučaju uzoraka jetre; oko 500 mg u slučaju svih drugih organa. Organi su bili usitnjeni pomoću potera. Za ove svrhe je svako od izmerenih tkiva bilo usitnjeno sa 1 ml aqua bidest tokom 5 min. Poter je zatim bio ispran sa po 1 ml aqua bidest. Uzorci su bili preneti u reakcione sudove, pa je bila dodata ista zapremina acetonitrila da bi se istaložili proteini. Uzorci su bili trešeni tokom 45 min, pa su zatim centrifugirani na 12.000 o/min tokom 15 min. Supernatant je bio prenet u staklene boce, pa je koncentrovan pod komprimovanim vazduhom. Ostatak je bio ispran sa 500 ul acetonitrila, te je recentrifugiran i onda je supernatant dodat preostalim uzorcima. Ostatak je bio odbačen. Posle koncentrovanja pod komprimovanim vazduhom, uzorci su liofilizovani preko noći.

[0062]Rastvaranje uzoraka je izvršeno sa 400 ul smeše metanol/aqua bidest (50/50). Uzorci su bili trešeni na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sati, a ostatak je bio zatim odstranjen centrifugiranjem (15.000 o/min, 15 min). Koncentracija pentamidina je bila određena iz supernatanta pomoću HPLC.

Rezultati studije na životinjama

[0063] Analiza uzoraka plazme posle intravenske administracije pentamidina je dala detektabilne nivoe u plazmi preko perioda od 300 min. Posle oralne administracije proleka, koncentracije pentamidina u plazmi nisu mogle biti detektovane. Ovaj fenomen je poznat za derivate pentamidina, pošto oni teže da se akumuliraju u tkivima u veoma izraženoj meri. Kao posledica toga ne može biti izvršeno direktno izračunavanje bioraspoloživosti na osnovu koncentracija u plazmi. Zbog toga su za određivanje relativne bioraspoloživosti bile korišćene koncentracije pentamidina u ispitanim organima.

Evaluacija uzoraka organa i bioraspoloživosti:

[0064] Analiza prerađenih uzoraka organa je dala detektabilne sadržaje pentamidina u svim ispitanim organima - sa najvećim koncentracijama u jetri i bubrezima. Koncentracije u plućima, slezini i srcu su bile znatno manje. Najniže koncentracije pentamidina su bile detektovane u mozgovima. Rezultati su sumirani na slici 5.

[0065] Oralna bioraspoloživost jedinjenja se generalno određuje na osnovu koncentracija u plazmi posle oralne i intravenske primene jedinjenja. Međutim, zbog visokog vezivanja proteina od strane pentamidina i njegove izražene tendencije da se akumulira u tkivima, koncentracije u plazmi nisu mogle biti određene posle oralne primene pentamidinskog proleka. Zbog toga se za izračunavanje relativne bioraspoloživosti ne koriste koncentracije u plazmi nego detektovane koncentracije u ispitivanim organima (jetra»bubrezi, pluća, slezina, srce, mozak). Relativna bioraspoloživost pentamidinskog proleka bi bila izračunata poređenjem posle intravenske aplikacije/primene aktivnog oblika i oralne primene proleka. Pri izračunavanju su bile uzete u obzir različite doze. Relativne bioraspoloživosti su ilustrovane u Tabeli 3. Najveća bioraspoloživost od 98% je bila identifikovana u jetri. Bioraspoloživost u drugim tkivima je znatno manja. Visoka bioraspoloživost u jetri se može objasniti bioaktivacijom proleka. Ista se dominantno odvija u jetri, što objašnjava srazmerno visoke koncentracije u ovom organu. Koncentracija u mozgu je veoma niska, što je indikacija da prolek prolazi kroz barijeru krv-mozak samo u veoma maloj meri.

HPLC-analitike

[0066]Sledeća HPLC analitika je bila primenjena za analizu uzoraka organa i plazme posle intravenske primene pentamidinskog proleka:

[0067]Sledeća HPLC analitika je bila primenjena za analizu uzoraka organa i plazme posle oralne primene pentamidinskog proleka:

Claims (12)

1. Jedinjenje formule u kojoj n predstavlja 2.

2. Soli, solvati i solvati soli jedinjenja prema zahtevu 1.

3. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za primenu u lečenju i/ili profilaksi bolesti.

4. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za primenu u lečenju i/ili profilaksi onkoloških bolesti i tumorskih bolesti bilo koje patogeneze.

5. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za primenu u lečenju i/ili profilaksi lajšmanioze, tripanozomije i/ili pneumocvstis carinii pneumonije (PcP).

6. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za primenu u lečenju i/ili profilaksi malarije.

7. Lek koji sadrži najmanje jedno jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2, opciono u kombinaciji sa jednim ili više inertnih, netoksičnih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

8. Lek koji sadrži najmanje jedno jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 u kombinaciji sa jednom ili više drugih aktivnih materija.

9. Lek koji sadrži najmanje jedno jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za oralnu ili parenteralnu primenu.

10.Lek koji sadrži najmanje jedno jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 2 za lečenje i/ili profilaksu tumorskih bolesti.

11. Lek prema jednom od zahteva 7 do 10,naznačen time, štoje lek formulisan gastrorezistentno.

12. Postupak za proizvodnju jedinjenja prema jednom od zahteva 1 do 2,naznačen time, što se amidoksim formule (A) reakcijom sa anhidridom dikarboksilne kiseline formule (B) u kojoj n predstavlja 2 prevodi ujedinjenje formule (C)