DE69531499T2 - Liposomenzubereitungen zur behandlung von viruserkrankungen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Formulierungen von Liposomen und ihre Verwendung bei der Behandlung von Viruserkrankungen und insbesondere bei der Behandlung von Infektionen, ausgelöst durch Viren, wie z. B. in dem humanen Immunodefizienzvirus und Cytomegalovirus.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Viele antivirale Mittel wurden für die Behandlung von Patienten mit humanem Immunodefizienzvirus (HIV)-Infektionen entwickelt. Es werden jedoch nur temporäre und begrenzte Vorteile bei HIV-infizierten Patienten beobachtet, die mit irgendeinem der aktuellen antiretroviralen Mittel oder Kombinationen davon behandelt werden. Die begrenzte Fähigkeit dieser Mittel, die virale Last zu vermindern, die schnelle Entwicklung einer Resistenz und die toxische Nebenwirkungen der meisten Arzneimittel haben ihre Langzeiteffizienz begrenzt. Ein Hauptproblem, das mit der Verabreichung von antiviralen Mitteln an Patienten assoziiert ist, ist ihre schlechte Fähigkeit, die infizierten Zellen zu penetrieren und auf sie abzuzielen. Eine schnelle Arzneimittelclearance und die Toxizität der Elternverbindungen oder Metaboliten konstituieren ebenfalls einige der Hauptnachteile, die die Entwicklung und Verwendung vieler antiviraler Mittel verlangsamen. Aufgrund der schweren Toxizität der aktuell erhältlichen antiviralen Mittel zur Behandlung von AIDS und anderer viraler Erkrankungen und ihrer begrenzten Fähigkeit, infizierte Zellen zielgenau aufzuspüren, sollten Strategien untersucht werden, die auf das Erreichen therapeutischer Niveaus von Arzneimitteln in infizierten Zellen und einer Reduktion der Toxizität abzielen. Das Einfangen von Arzneimitteln in Liposomen bildet einen attraktiven Ansatz zur Verbesserung der Zufuhr aktiver Mittel an infizierte Zellen und zur Reduktion toxischer Wirkungen, assoziiert mit ihrer Verabreichung. Liposomen sind mikroskopische Vesikel, worin eine Vielzahl von Arzneimitteln eingebaut werden kann. Aufgrund der Ähnlichkeit der primären Bestandteile von Liposomen mit natürlichen Membranen sind Liposomen im allgemeinen nicht-toxisch und bioabbaubar. Wir nehmen an, dass ein besseres Verständnis der Rolle der Liposomen als Träger von antiviralen Mitteln zu neuen Strategien führen kann, die die Effizienz und Sicherheit der Arzneimittel verbessert, die für die Behandlung von AIDS und anderen viralen Erkrankungen verwendet werden.
  • Es gibt nun etliche Beweise, die zeigen, dass Makrophagen eine zentrale Rolle bei der HIV-Pathogenese spielen, indem sie als Reservoirs für die Verstreuung von Virus über das Immunsystem wirken (Gendelman et al., 1989, AIDS 3: 475–495; Meltzer et al., 1990; Ann. Rev. Immunol. 8: 169–194). Es wurde kürzlich berichtet, dass in einer frühen Stufe der Infektion und weiterhin während der klinisch latenten Phase HIV in den Lymphoidorganen akkumuliert wird und sich aktiv repliziert trotz einer minimalen viralen Aktivität im peripheren Blut (Pantaleo et al., 1993, Nature 362: 355–358; Embretson et al., 1993, Nature 362: 359–362; Fox et al., 1994, Nature 370–256). Die hohe virale Last, die in den lymphoiden Geweben beobachtet wird, soll mit gefangenen HIV-Partikeln in den follikulären dendritischen Zellen der Keimzentren assoziiert sein. Über den Verlauf der HIV-Infektion wird das follikuläre dendritische Zellnetzwerk graduell aufgebrochen und schließlich zerstört. Da die Mikroumgebung der Lymphgewebe ausschlaggebend für eine effektive Immunreaktion ist, ist es vorrangig, die Akkumulierung von HIV in den Lymphgeweben zu reduzieren oder abzubrechen, um die Integrität des Mikroumgebungsnetzwerks zu erhalten. Die Verwendung von Liposomen als Arzneimittelzufuhrsystem ist insbesondere für die Kontrolle der Progression der HIV-Erkrankung relevant. Da Liposomen auf natürlichem Wege von Zellen des mononukleären Phagocytensystems (MPS) aufgenommen werden, sollte die auf Liposomen-basierende Therapie die antiviralen Mittel in Zellen konzentrieren, die für eine HIV-Infektion empfänglich sind und gleichzeitig die Quantität der Arzneimittel an den Stellen reduzieren, an denen sie potentiell toxisch sein könnten. In Liposomen verkapselte Arzneimittel könnten daher eine geeignete Strategie zur Reduktion der Verstreuung von HIV auf Lymphgewebe darstellen und zur Konservierung der follikulären dendritischen Zellmikroumgebung, was den infizierten Wirt vermutlich von einer Entwicklung des charakteristischen immundefizienten Zustands schützen kann.
  • Die Verwendung von Liposomen als Zufuhrmittelsystem für Arzneimittel könnte wichtige Vorteile bereitstellen im Vergleich mit dem ursprünglichen Arzneimittel. Zum Beispiel könnten die Liposomen Arzneimittel gegen einen enzymatischen Abbau schützen, ihre Pharmakokinetik und Gewebsverteilung verbessern und eine kontrollierte Freisetzung der therapeutischen Mittel an geeignete Zellen ermöglichen. Zusätzlich kann die Verteilung und therapeutische Verfügbarkeit von Liposomen durch Variationen ihrer Größe, ihrer Laminarität, ihrer Lipidzusammensetzung, Ladung und Oberflächeneigenschaften moduliert werden. Es ist daher vorrangig, die physikochemischen Eigenschaften der Liposomen an das gewünschte therapeutische Ziel zu adaptieren. Zurückkehrend zu den im vorliegenden Fall zitierten Referenzen stellt die Anmelderin die folgende Diskussion an: Die Patentveröffentlichung WO 93/19738 beschreibt den Vorteil einer Verwendung von PEG-acylphospholipid in Kombination mit anderen Komponenten zur Bildung von Liposomen, die sterisch modifiziert sind. Die Liposomen umfassen fast systemisch ein Sterol. Es ist in dieser Referenz kein Gewebeverteilungsprofil dargestellt. Was hier ausgesagt ist, ist dass die Lungen die Liposomen fangen, umfassend Gentamycin, dass jedoch Leber und Milz ausdrücklich als Zielgewebe ausgeschlossen sind. Diese Liposomen haben nicht eine Zusammensetzung, die sie von HIV-Zielen einfangen lässt.
  • Die Patentveröffentlichung WO 88/07854 beschreibt ddCTP als antivirales Mittel, gefangen in Liposomen. Das Liposom umfasst DPPC, DPPG und Cholesterin.
  • Die Patentveröffentlichungen WO 90/14074 und US 5,252,212 beschreiben ebenfalls die Liposomenkomponenten, umfassend ein Sterol.
  • Das Ziel wird immer noch aufrechterhalten, effektive liposomale Formulierungen von Arzneimitteln für die Behandlung von AIDS und anderen viralen Erkrankungen zu erzeugen. Solche zielgeführte Zufuhrsysteme sollten hoffentlich zu einer erhöhten Effizienz und reduzierten Toxizität der antiviralen Mittel bei Menschen führen, die an AIDS oder anderen viralen Erkrankungen leiden. Zusätzlich könnte die verbesserte Arzneimittel-Bioverfügbarkeit nach Verkapselung der Arzneimittel in Liposomen das Dosierungsintervall reduzieren und daher die Qualität des Lebens der mit HIV und anderen Viren infizierten Patienten verbessern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Behandlung von viralen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung antiviraler Mittel, verkapselt in Liposomen. Die Erfindung betrifft auch Formulierungen von Liposomen für die Behandlung viraler Erkrankungen und insbesondere für die Behandlung von Infektionen, ausgelöst durch Viren, wie HIV und CMV. Die Liposomenformulierungen bestehen aus spezifischen Klassen von Lipidbestandteilen und enthalten ein gefangenes Arzneimittel, effektiv gegen die virale Erkrankung. Die Originalität der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass diese liposomalen Formulierungen von Arzneimitteln eine höhere zelluläre Penetration in unterschiedlichen Zelllinien, gute in vitroantivirale Aktivität gegenüber HIV und CMV ermöglichen und effizient sind bei der in vivo-Zielführung von HIV-Reservoirs und eine deutliche Verbesserung der Pharmakokonetik von Arzneimitteln bereitstellen (siehe Beispiele).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bestehen Formulierungen von Liposomen aus Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) : Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 mit einem mittleren Teilchendurchmesser von ungefähr 0,05 bis 0,5 μm und enthalten 2'-3'-Didesoxyinosin (ddI) als antivirales Arzneimittel. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform bestehen die Formulierungen der Liposomen aus DSPC : DSPG : Distearoylphosphatidyl-ethanolamin-polyethylenglykol (DSPE-PEG) in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 : 1,45, mit einem mittleren Teilchendurchmesser von ungefähr 0,05 bis 0,5 μm und enthalten 2'-3'-Didesoxyinosin (ddI) als antivirales Arzneimittel. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht von ungefähr 500 bis 5.000 Dalton auf. Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen Liposomenformulierungen, bestehend aus DPPC : Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG) mit einem molaren Verhältnis von 10 : 3 einen mittleren Teilchendurchmesser von ungefähr 0,05 und 0,5 μm auf und enthalten fos-Carnet als antivirales Arzneimittel.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1a und 1b illustrieren die Anhäufung von freiem und liposomalem ddI (20 μM ddI) als Funktion der Zeit in U937 Zellen (1a) und RAW 264,7 Zellen (1b). Die 1c und 1d illustrieren die Anhäufung von freiem und liposomalem ddC (25 μM ddC) als Funktion der Zeit in U937 Zellen (1c) und RAW 264,7 Zellen (1d). Die 1e und 1f illustrieren die Anhäufung von freiem und liposomalem ddC bzw. fos-Carnet als Funktion der Arzneimittelkonzentration in RAW 264,7 Zellen.
  • Die 2a, 2b und 2d zeigen die antivirale Aktivität von freiem und liposomalem ddI (40 μM ddI), ddC (0,01 μM ddC) bzw. fos-Carnet (1 μM fos-Carnet) in U937 Zellen, infiziert mit HIV-1IIIB. Die 2c und 2e zeigen die antivirale Aktivität von freiem und liposomalem ddC (0,01 μM ddC) bzw. fos-Carnet (1 μM fos-Carnet) in Molt-4 Klon-8-Zellen, infiziert mit HIV-1IIIB. 2f zeigt die antivirale Aktivität von freiem und liposomolem fos-Carnet (1 μM) in Supt-1 Zellen, infiziert mit HIV-1IIIB. 2g zeigt die Inhibierung der CMV p72 Proteinexpression in menschlichen Lungen-Fibroblastenzellen (MRC-5 Zelllinie) durch freies und liposomales fos-Carnet (PFA bzw. L-PFA).
  • Die 3a, 3b, 3c stellen die Plasma- und Gewebsverteilung von freiem ddI (3a), liposomalem ddI (3b) und liposomalen Lipiden (3c) bei Ratten dar, nach Verabreichung von freiem ddI oder in Liposomengefangenem ddI, bestehend aus DSPC:DSPG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 und mit einem mittleren Teilchengrößendurchmesser von 0,175 μm. Die 3d und 3e stellen die Plasma- und Gewebsverteilung von liposomalem ddI (3d) und liposomalen Lipiden (3e) bei Ratten dar, nach Verabreichung von ddI, gefangen in Liposomen, bestehend aus DSPC : DSPG : DSPE-PEG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 : 1,45 und mit einem mittleren Teilchengrößendurchmesser von 0,150 μm. Die 3f, 3g, 3h und 3i stellen Plasma- und Gewebsverteilung von freiem und liposomalem ddC (ddC und L-ddC) bei Ratten dar, eine Stunde (3f und 3h) und 3 Stunden (3g und 3i) nach der intravenösen (3f und 3g) oder intraperitonealen (3h und 3i) Verabreichung von freiem ddC oder ddC, gefangen in Liposomen, bestehend aus DPPC : DP : CHOL in einem molaren Verhältnis von 4 : 1 : 5 und mit einem mittleren Teilchengrößendurchmesser von 0,300 μm. Die
  • 3j, 3k und 3l zeigen die Plasma- und Gewebsverteilung von liposomalem fos-Carnet (3j), freiem fos-Carnet (3k) und liposomalen Lipiden (3l) bei Ratten nach Verabreichung von freiem fos-Carnet oder fos-Carnet, gefangen in Liposomen, bestehend aus DPPC : DPPG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 und mit einem mittleren Teilchengrößendurchmesser von 0,165 μm. In den 3a bis 3l stellen die Werte Mittel (+ SEM) dar, erhalten von 4 bis 6 Tieren pro Gruppe pro Zeit.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Lipidbestandteile
  • Bei auf Liposomen basierenden Produkten ist es notwendig, liposomale Bilayer-Eigenschaften zu verwenden, die eine hohe Effizienz der Arzneimittelverkapselung wie auch ein reduziertes Lecken von gefangenem Arzneimittel ermöglichen, um sich der Fähigkeit der Liposomen zur Zufuhr großer Mengen antiviraler Mittel zu infizierten Zellen auf vorteilhafte Weise zu bedienen. Im Fall der Arzneimittel im Umfang dieser Erfindung werden diese Anforderungen durch Verwendung von Liposomen erhalten, bestehend aus einer Mischung aus Diacylphosphatidylcholin und Diacylphosphatidylglycerin (in einem molaren Verhältnis zwischen 10 : 1 und 1 : 1), wobei die Acylketten entweder gesättigte oder nicht-gesättigt sind und eine Länge von 14 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweisen.
  • Die Liposomen der vorliegenden Erfindung beinhalten sterischstabilisierte Liposomen, definiert hier als Liposomen, bestehend aus den oben erwähnten Lipidbestandteilen und die durch den Einbau von Polymeren modifiziert sind, wie z. B. Poloxameren und Poloxaminen oder von amphipathischen Lipiden, derivatisiert mit einem Polymer, wie z. B. DSPE-PEG oder Dioleoylphosphatidylethanolamin-PEG (DOPE-PEG). Details für die Synthese von DSPE-PEG sind in Beispiel 1 bereitgestellt. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung beinhalten auch Immunliposomen, wie hier definiert als Liposomen, oder sterisch-stabilisierte Liposomen, bestehend aus den oben Lipidbestandteilen und die durch die Ankopplung von Antikörpermolekülen modifiziert sind, die die Zielführung zu den spezifischen Zellen erhöhen.
  • Nicht alle getesteten liposomalen Formulierungen haben eine effiziente Arzneimittelverkapselung und Arzneimittelretention gezeigt. Zum Beispiel zeigte das Einfangen von ddI in Liposomen, bestehend aus Ei-Phosphatidylcholin : Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 55 : 45 eine Effizienz der Arzneimittelverkapselung, die ungefähr 30-mal niedriger war als die, die für Liposomen beobachtet wurde, die aus DSPC:DSPG in einem molaren Verhältnis von 10.3 bestanden. Andererseits wurden mehr als 90% ddI aus multilaminaren Visikeln freigesetzt, bestehend aus Eier-PC : Cholesterin : Cardiolipin in einem molaren Verhältnis von 35 : 45 : 10, nach nur 1 Stunde der Inkubation in humanem Serum. Demgegenüber wurden nur 10% ddI aus multilaminaren Vesikeln freigesetzt, bestehend aus DSPC:DSPG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 unter ähnlichen Bedingungen nach 5 h einer Inkubation in menschlichem Serum.
  • Obwohl die folgenden Beispiele spezifische liposomale Formulierungen beschrieben, wird angenommen, dass eine Familie liposomaler Formulierungen einfach davon abgeleitet werden kann, ohne ihre wertvollen Eigenschaften zu beeinflussen. Daher umfasst diese Familie von Verbindungen andere Acylketten gegebener Phospholipidformulierungen, die in der Praxis getestet wurden.
  • Herstellung von Liposomen
  • Eine große Anzahl von Techniken zur Herstellung von Liposomen wurde in den letzten Jahren als Reaktion auf die wachsende Zahl spezifischer Anwendungen für Liposomen als Arzneizufuhrsysteme entwickelt. Die Herstellung von Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vielzahl von Techniken durchgeführt werden, wie z. B. die in der Literatur beschriebenen (Szoka and Papahadjopoulos, 1980, Ann. Rev.
  • Biophys. Bioeng. 9: 467–508; Nässander et al., 1990, Liposomes in Biodegradable polymers as drug delivery systems (S. 261– 338). Unter diesen bildet die Dünnlipidfilm-Hydratationstechnik ein schnelles und einfaches Verfahren zur Erzeugung von Liposomen. Liposomen, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, sind meistens multilaminare Vesikel und liegen allgemein in einem Größenbereich von 0,2 bis 10 μm. Die Dünnlipidfilmhydratationstechnik ist im Detail in Beispiel 2 dargestellt. Ein anderes allgemein übliches Verfahren zur Herstellung von Liposomen ist die Umkehrphasenverdampfungstechnik, dargestellt von Szoka et al. im US-Patent Nr. 4,235,871. Liposomen, die durch diese Technik erzeugt werden, sind unilaminar oder plurilaminar und liegen allgemein in einem Größenbereich von 0,2 bis 5 μm. Die Umkehrphasenverdampfungstechnik ist im Detail in Beispiel 3 dargestellt.
  • Antivirale Mittel
  • Jeder Inhibitor einer viralen DNA- und/oder RNA-Synthese und/oder HIV-Protease liegt im Umfang dieser Erfindung. Beinhaltet in dieser Klasse sind antivirale Mittel wie z. B. 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT), ddI, ddC, fos-Carnet, Ribavirin, Ganciclovir und Saquinavir. Der Einbau dieser Arzneimittel in Liposomen kann durch ein oder mehr Verfahren einer aktiven und/oder passiven Beladung erreicht werden, wie z. B. der in der Literatur beschriebenen (Mayer et al., 1986, Chem. Phys. Lipids 40 : 333–345).
  • Formulierungen von Liposomen der vorliegenden Erfindung beinhalten diejenigen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von jeder Größe, jedoch bevorzugter diejenigen von ungefähr 0,05 bis 0,5 μm. Die Liposomenformulierungen der vorliegenden Erfindung beinhalten auch diejenigen, hergestellt mit irgendeinem molaren Verhältnis von Arzneimittel/Lipid. Wie vorher erwähnt, sollte die Neigung der Liposomen, von Zellen des MPS aufgenommen zu werden, die gefangenen antiviralen Mittel in Zellen konzentrieren, die gegenüber HIV oder anderen viralen Infektionen empfänglich sind, und daher eine Verbesserung ihrer antiviralen Effizienz und Reduktion ihrer Toxizität bereitstellen. Daher sollen die folgenden Beispiele die Herstellung spezifischer liposomaler Formulierungen von antiviralen Arzneimitteln demonstrieren, die für die Behandlung von HIV- und CMV-Infektionen sehr effizient sein könnten, die jedoch auf keine Weise ihren Umfang begrenzen sollte. Zusätzlich, obwohl die Wirkung der liposomalen Formulierungen von Arzneimitteln spezifisch für zwei virale Arten, HIV und CMV, bestätigt wurde, fällt jeder Virus, der gegenüber der Wirkung von Inhibitoren viraler DNA- und/oder RNA-Synthese und/oder HIV-Protease empfindlich ist, unter den Umfang dieser Erfindung.
  • Beispiel 1
  • Synthese von DSPE-PEG
  • Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglykol (DSPE-PEG) wurde wie früher beschrieben hergestellt (Gabizon and Papahadjopoulos, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 6949– 6953; Klibanov et al., 1990, FEBS Letters 268 : 235–237). Kurz gefasst, wurden Methoxypolyethylenglkyol-Succinimidylsuccinat (PEG-OSu; Mw 5.000), DSPE und Triethylamin in einem molaren Verhältnis von 3 : 1 : 3,5, enthaltend 0,01 μCi [14C]-Dioleoylphosphatidylethanolamin DOPE ([14C]-DOPE) pro μmol Lipid über Nacht bei Raumtemperatur in CHCl3 inkubiert. Lösungmittel wurde dann unter einem Stickstoffstrom verdampft und die resultierende trockene Mischung wurde durch 2-fach destilliertes Wasser hydratisiert. Die Micellenlösung wurde durch eine Säule (32 × 2 cm), enthaltend Bio-Gel A-1,5 M (50– 100 mesh) zur Entfernung von nicht-gekoppeltem PEG-OSu gefiltert. Peakfraktionen, enthaltend DSPE-PEG, wurden sowohl durch Szintillationszählungen (für [14C]-DOPE-PEG) und Absorptionsablesungen bei 225 nm (für freies PEG-OSu) bestimmt. Fraktionen, die DSPE-PEG enthielten, wurden gesammelt und 24 h gegen Wasser unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem nominalen Molekulargewicht cut-off (MWCO) von 300.000 (Spectra-Por, Spectrum Medical, Los Angeles, CA) dialysiert und dann lyophilisiert. DSPE-PEG kann auch kommerziell in einer Vielzahl von Molekulargewichten erhalten werden.
  • Beispiel 2
  • 2'-3'-Didesoxyinosin (ddI) wurde in Liposomen, bestehend aus DSPC:DSPG, in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 und DSPC : DSPG : DSPE-PEG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 : 1,45 unter Verwendung einer Dünnlipidfilmhydratation verkapselt. Die DSPE-PEG kann gemäß Beispiel 1 synthetisiert werden oder kommerziell erhalten werden. Kurz gefasst, wurde die Lipidmischung in Chloroform : Methanol (2 : 1 V/V) in Gegenwart eines geringen Anteils ([14C]-DPPC (< 0,002% mol/mol) gelöst und Lösungsmittel wurde als nächstes in einem Rundbodenkolben zur Bildung eines dünnen Lipidfilms auf der Wand des Kolbens verdampft. Der Lipidfilm wurde dann mit einer Phosphatgepufferten Lösung (PBS, 145 mM, pH 7,4) von ddI in einem Arzneimittel/Lipid-molaren Verhältnis von 2 hydratisiert, worin ein geringer Anteil von radioaktiv-markiertem [3H]-ddI zugefügt wurde. Nach ungefähr 30 min Stehen bei Raumtemperatur bildeten sich multilaminare Vesikel (MLVs) bei mechanischer Bewegung der liposomalen Präparation bei einer Temperatur oberhalb des Gel-zu-Flüssigphasen-Übergangs der Lipidmischung. Die MLVs wurden mit einer Extrusionsvorrichtung aus rostfreiem Stahl (Lipex Biomembrane, Vancouver, BC) durch Polycarbonatmembranen (Nuclepore, Cambridge, MA) mit 0,2 μm extrudiert. Die Vesikelgrößenverteilung und Homogenität wurde durch quasielastische Lichtstreuung (QELS) mit einem Submikronpartikelanalysator (Modell N4SD Coulter Electronics, Hialeah, FL) überprüft. Der mittlere Durchmesser der extrudierten Liposomen lag bei 0,175 + 0,035 μm und 0,15 + 0,01 μm für die DSPC : DSPG- bzw. DSPC : DSPG : DSPE-PEG-Formulierungen. Nicht-verkapseltes Arzneimittel wurde entweder durch Zentrifugation (300 g für 15 min bei 4°C) der liposomalen Präparation (1 ml) durch eine 10 ml Säule von grobem Sephadex G-50 (Pharmacia LKB, Montreal, QC), Ultrazentrifugation (160.000 g 90 min bei 4°C) oder durch Dialyse gegen ein bestimmtes Volumen PBS entfernt. Die Wirksamkeit des Einfangens des Arzneimittels wurde durch Verwendung einer Flüssig-Szintillationszählvorrichtung bestimmt (Modell LS 6000TA, Beckman Instruments Canada Inc., Mississauga, ON).
  • Beispiel 3 (nur für Illustrationszwecke, nicht Teil der Erfindung)
  • 2'-3'-Didesoxycytidin (ddC) wurde in Liposomen verkapselt, bestehend aus DPPC : DP : CHOL in einem molaren Verhältnis von 4 : 1 : 5 unter Verwendung des Umkehrphasenverdampfungsverfahrens (Szoka and Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198). Kurz gefasst, wurde die Lipidmischung in Chloroform : Methanol (2 : 1 V/V) in Gegenwart eines kleinen Anteils Cholesteryl ([1-14C]-Oleat gelöst und Lösungsmittel wurde als nächstes in einem Rundbodenkolben zur Bildung eines dünnen Lipidfilms auf der Wand des Kolbens verdampft. Der Lipidfilm wurde dann wieder in Isopropylether : Methanol (3 : 0,8 V/V) gelöst. Zu dieser organischen Phase wurde eine Phosphatgepufferte Lösung (PBS, 145 mM, pH 7,4) ddC in einem Arzneimittel/Lipid-molaren Verhältnis von 3,6, enthaltend einen geringen Anteil radiomarkiertes [3H]-ddC zugefügt. Die Mischung der zwei Phasen wurde als nächstes für 5 min in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur zum Erhalt einer homogenen Lösung mit Ultraschall bestrahlt. Das organische Lösungsmittel wurde unter Vakuum unter kontrollierten Bedingungen durch Retroevaporation bei 50°C eliminiert. Die Liposomensuspensionen wurden dann durch Polycarbonatmembranen mit 0,4 μm extrudiert. Die Vesikelgrößenverteilung und Homogenität wurde durch QELS bewertet. Der mittlere Durchmesser der extrudierten Liposomen lag bei 0,300 ± 0,08 μm. Nicht-verkapselte Arzneimittel wurden wie oben beschrieben entfernt und die Verkapselungseffizienz von ddC wurde durch Radioaktivitätszählungen geschätzt.
  • Beispiel 4
  • fos-Carnet wurde in Liposomen unter Verwendung des Umkehrphasenverdampfungsverfahrens wie beschrieben für die liposomale Präparation von ddC (Beispiel 3) verkapselt, außer dass die Lipidbestandteile DPPC : DPPG in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 waren. In diesem Fall betrug das Arzneimittel/Lipid-molare Verhältnis 5 und [3H]-DPPC und [14C]-fos-Carnet wurden als Lipid bzw. als Arzneimittelmarker verwendet. Die Liposomensuspensionen wurden durch Polycarbonatmembranen mit 0,2 μm extrudiert, was Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 0,165 + 0,030 μm erzeugte. Nicht-verkapselte Arzneimittel wurden wie oben beschrieben entfernt und die Verkapselungseffizienz von fos-Carnet wurde durch Radioaktivitätszählungen geschätzt.
  • Beispiele zum Vergleich von liposomalen Arzneimitteln und freien Arzneimitteln
  • Zelluläre Aufnahme
  • Wir haben in vitro Experimente durchgeführt, um die Anhäufung von freien und in Liposomen verkapselten Anti-HIV-Mitteln in murinen Monocyten-Makrophagen RRW 264,7 Zellen und in menschlischen Prämonocytoid U937 Zellen zu bestimmen. Kurz gefasst, wurden Experimente durchgeführt, indem konfluente Zellen in Kulturmedium in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von freien und in Liposom verkapselten Anti-HIV-Mitteln inkubiert wurden, wozu ein geringer Anteil radioaktiv-markierter Arzneimittel und Lipide zugefügt worden war. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden gewaschen und mit einer Triton X-100-Lösung behandelt. Die Arzneimittel- und Lipidaufnahme wurde bestimmt, indem das Radioaktivitätsniveau mit einem Flüssig-Szintillationszähler gemessen wurde. Die Proteinkonzentration für jede Probe wurde mit einem Pierce Bichinchonin-Säureprotein-Assay (Rockford, IL) auf Mikrotiterplatten bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Einbau von ddC in Liposomen die Arzneimittelaufnahme in sowohl RAW 264,7 als auch U937 Zellen deutlich erhöhte ( 1c, 1d und 1e). Ähnlich häufte sich das liposomale fos-Carnet deutlich besser an als das freie Arzneimittel in RAW 264,7 Zellen (1f). Demgegenüber wurde eine höhere Anhäufung von freiem ddI in beiden Zelllinien beobachtet (1a und 1b), obwohl das Aufnahmeniveau von liposomalem ddI in diesen Zellen ähnlich zu demjenigen der liposomalen Formulierungen von ddC oder fos-Carnet ist, was eine höhere Membranpermeabilität dieser Zelllinien für ddI im Vergleich mit derjenigen für andere anti-HIV-Mittel nahe legt.
  • In vitro-antivirale Effizienz
  • Die antivirale Effizenz der liposomalen Formulierungen der antiviralen Arzneimittel wurde auch bei unterschiedlichen Zelllinien überprüft. Kurz gefasst, wurden Zellen mit unterschiedlichen Stämmen von HIV mit einer Multiplizität der Infektion von 1 (Virus/Zielzelle) infiziert, und sie wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von freien und in Liposomen verkapselten Arzneimitteln behandelt. Die Virusreplikation wurde nach unterschiedlichen Zeitintervallen durch Messung von entweder der reversen Transcriptaseaktivität in zellfreien Überständen oder des viralen p24-Proteins unter Verwendung eines enzymatischen Tests überwacht. Die Virustranskription wurde ebenfalls durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Analyse 24 h nach der Behandlung unter Verwendung eines HIV-Primerpaars (M661/M667) überwacht. Die PCR-Bewertung wurde im Hinblick auf die Menge des humanen β-Globingens in Zellen normalisiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines auf Tetrazolium-basierenden kolorimetrischen (MTT)-Assays bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass der Einbau von ddC in Liposomen zu vergleichbarer oder sogar besserer Anti-HIV-Effizenz als die des freien Mittels gegen eine HIV-1IIIB-Replikation in U937 und Molt-4 Klon-8 Zellen (2b und 2c) führte. Ähnlich zeigte liposomales fos-Carnet vergleichbare oder sogar bessere antivirale Effizienz als die des nicht verkapselten Arzneimittels gegen die HIV-1IIIB-Replikation bei U937, Molt-4 Klon 8 und Supt-1 Zellen (2d, 2e und 2f). Obwohl die antivirale Effizienz der liposomalen Formulierung von ddI niedriger lag als die des freien Mittels gegen die HIV-1IIIB Replikation bei U937 Zellen (2a) wurde eine höhere Anti-HIV-Effizienz für liposomales ddI gegen die HIV-1Ada-M Replikation bei von Monocytenabgeleiteten Makrophagen beobachtet (Tabelle 1). Es wird anerkannt, dass die sehr viel höhere Anti-HIV-Effizienz der liposomalen Arzneimittel gegenüber der der freien Arzneimittel sehr wahrscheinlich bei in vivo-Situationen beobachtet werden wird, da Liposomen von den Zellen des MPS vorzugsweise aufgenommen werden.
  • Tabelle 1: Antivirale Effizienz von freiem und liposomalem ddI bei von primären Monocyten abgeleiteten Makrophagen, infiziert mit HIV-1Ada-M.a
    Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Die Anti-CMV-Aktivität von freiem und in Liposomen verkapseltem fos-Carnet wurde ebenfalls in embryotischen Lungenfibroblastenzellen (MRC-5 Zelllinie) überwacht. Kurz gefasst, wurden Zellen mit dem AD169-Stamm von humanem CMV infiziert und wurden mit seriellen Verdünnungen von freiem und liposomalem fos-Carnet behandelt. Nach einer 96-stündigen Inkubation wurden die Zellen fixiert und eine Immunoperoxydasefärbung wurde durchgeführt unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, gerichtet gegen ein 72-kDa Direktfrühphasen-CMV-Protein. Markierte Plaques wurden gezählt und die Ergebnisse wurden als Prozent der nicht-behandelten infizierten Kontrollzellen gegenüber der Konzentration von fos-Carnet ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigen, dass freies und liposomales fos-Carnet eine vergleichbare inhibitorische Aktivität gegen die CMV p72-Proteinexpression in einer MRC-5 Zelllinie aufweist (2g).
  • In vivo-Studien
  • Die pharmakokinetischen Eigenschaften und Gewebsverteilungen von freien und in Liposomen verkapselten Anti-HIV-Mitteln wurde bei Ratten überprüft. Kurz gefasst, wurden freie und in Liposomen verkapselte Arzneimittel in weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einer einzelnen intravenösen Bolusdosierung über einen Katheter injiziert, der durch die Jugularvene der Tiere inseriert war. Nach spezifischen Zeitpunkten wurden die Tiere geopfert und das Blut wurde in mit Heparin versetzten Röhrchen gesammelt und durch Zentrifugation getrennt. Zum selben Zeitpunkt wurden gewählte Gewebe entfernt, gewaschen, gewogen und homogenisiert. Gewebe und Plasma wurde dann gemäß einem kommerziellen Gewebslöslichmachungsverfahren behandelt. Die Bestimmung von Arzneimittel- und Lipidniveaus in allen Proben wurde durch radioaktive Spurenmarker überwacht.
  • Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Verkapselung der antiviralen Mittel in Liposomen zu einer sehr viel höheren Arzneimittelanhäufung in den Makrophagen-reichen Geweben im Vergleich zu derjenigen führte, die für nicht-verkapselte Arzneimittel beobachtet wurde (3a–3l). Die Zufuhr einer größeren Menge von antiviralen Mitteln zu diesen Geweben, die gegenüber einer HIV-Infektion empfänglich sind und die reduzierte Zufuhr von Arzneimitteln zu Stellen, wo sie potentiell toxisch sein können, sollte zu einer erhöhten Effizienz und reduzierten Toxizität der Anti-HIV-Mittel führen. Es ist von besonderem Interesse, dass wir zeigen konnten, dass die Anhäufung von liposomalem fos-Carnet in den Lymphknoten 8-fach höher war als die des freien Mittels (Tabelle 2; dieselbe Formulierung wie in den 3j, 3k und 3l: 10 mg fos-Carnet/kg).
  • Tabelle 2: Bereich unter der Kurve von freiem und liposomal-verkapseltem fos-Carnet in unterschiedlichen Geweben, folgend auf die Verabreichung einer einzelnen intravenösen Dosierung (10 mg fos-Carnet/kg) bei Ratten.a
    Figure 00180001
  • Eine erhöhte Arzneimittelanhäufung wurde auch im Gehirn von Tieren beobachtet, wenn liposomales fos-Carnet anstelle des freien Mittels den Tieren injiziert wurde. Eine solche Eigenschaft ist von vorrangiger Bedeutung, da schwere zentralnervöse Systemerkrankungen an der HIV-Pathologie beteiligt sind. Zusätzlich sollte die Verabreichung von in Liposomen verkapseltem fos-Carnet die Arzneimitteleffizienz gegen CMV bei Patienten verbessern, die mit HIV infiziert sind und im Hinblick auf eine CMV-Retinitis behandelt werden, da unsere Daten eine erhöhte Arzneimittelanhäufung in den Augen nach der Injektion von liposomalem fos-Carnet im Vergleich mit freiem Arzneimittel demonstrieren. Die verbesserte Pharmakokinetik wurde auch beim Einfangen der antiviralen Mittel in Liposomen beobachtet (Tabellen 3 und 4; dieselben Formulierungen wie in den 3a bis 3e und 3j bis 3l). Die systemische Clearance der gefangenen Arzneimittel erwies sich als sehr viel niedriger als die der freien Mittel, was zu einem starken Anstieg der Eliminationshalbwertszeit der liposomalen Arzneimittel führte. Die verbesserte Pharmakologie der antiviralen Mittel bei Verkapselung in Liposomen sollte hoffentlich die Dosierung der bei konventioneller Therapie verwendeten antiviralen Mittel reduzieren, wie auch die Häufigkeit der Verabreichung der Anti-HIV-Mittel, was die Lebensqualität der Patienten mit AIDS und anderer viraler Erkrankungen daher verbessern sollte.
  • Tabelle 3: Pharmkokinetische Parameter von freiem und liposomalem ddI, folgend auf die Verabreichung einer einzelnen intravenösen Dosierung (3 mg ddI/kg) bei Ratten.a
    Figure 00190001
    • t1/2:
    Eliminationshalbwertszeit;
    AUC0-∞:
    Bereich unter der Plasmakonzentrations-Zeitkurve von Null bis Unendlich;
    Kel:
    Eliminationsratenkonstante;
    Vdss:
    Gleichgewichtsvolumen der Verteilung;
    Cl:
    systemische Clearance;
    MRT:
    mittlere Aufenthaltszeit.
  • Tabelle 4: Pharmakokinetische Parameter von freiem und liposomen-verkapseltem PFA, folgend auf die Verabreichung einer einzelnen intravenösen Dosierung (10 mg/kg) bei Ratten.a
    Figure 00200001
    • t1/2:
    Elimination-Halbwertszeit;
    AUC0->∞:
    Bereich unter der Plasmakonzentrations-Zeitkurve von Null bis Unendlich;
    Kel:
    Eliminationsratenkonstante;
    Vdss:
    Gleichgewichtsvolumen der Verteilung;
    Cl:
    systemische Clearance;
    MRT:
    mittlere Aufenthaltszeit.

Claims (8)

  1. Liposom zur Behandlung einer viralen Erkrankung, umfassend: i) eine Lipidkomponente im wesentlichen bestehend aus einer Mischung von Diacylphosphatidylcholin und Diacylphosphatidylglycerol in einem molaren Verhältnis im Bereich von 10 : 1 bis 1 : 1, wobei die Acylketten entweder Palmitoyl oder Stearoyl sind, und ii) eine therapeutische Menge eines eingeschlossenen Arzneimittels, das gegen die virale Erkrankung wirksam ist.
  2. Liposom gemäß Anspruch 1, wobei das molare Verhältnis 1 0 :3 ist.
  3. Liposom zur Behandlung einer viralen Erkrankung, umfassend: i) eine Lipidkomponente im wesentlichen bestehend aus einer Mischung von Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylglycerol und einem Polyethylenglycol konjugiert an Diacylphosphatidylethanolamin, und ii) eine therapeutische Menge eines eingeschlossenen Arzneimittels, das gegen die virale Erkrankung wirksam ist.
  4. Liposom gemäß Anspruch 3, wobei das Polyethylenglycol ein Molekulargewicht von ca. 500 bis ca. 5.000 Dalton hat.
  5. Liposom gemäß Anspruch 3, wobei Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylglycerol und Diacylphosphatidylethanolamin-polyethylenglycol in einem molaren Verhältnis von 10 : 3 : 1,45 vorhanden sind.
  6. Liposom gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Lipidkomponente eine Mischung umfaßt von Dipalmitoylphosphatidylcholin und Dipalmitoylphosphatidylglycerol oder eine Mischung von Distearoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylglycerol.
  7. Liposom gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das eingeschlossene Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), ddI, ddC, fos-Carnet, Ribavirin, Glanciclovir und Saquinavir.
  8. Liposom gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser im Bereich von 0,05 bis 0,5 μm.
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