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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beladung von therapeutischen
Mitteln in vorgeformte Liposomen und das dabei erhaltene Produkt,
insbesondere zur Beladung von protonierbaren Verbindungen mit einem
Ammoniumionengradienten, der Glucuranat als Ausgleichsanion hat.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Abgabe von therapeutischen Mitteln über liposomale Zusammensetzungen
hat die Arzneimittelpharmakokinetiken und -biodistribution von einigen
Mittel drastische verändert
(Martin, F. M., in MEDICAL APPLICATION OF LIPOSOMES, Lasic, D. D.
und Papahadjopaulos, eds., S. 635–88, Elsevier, Amsterdam (1998)).
Zum Beispiel zeigt Doxorubicin, das für seine dosislimitierende Kardialtoxizität bekannt
ist, keine offenkundige (klinische und funktionelle) Kardialtoxizität in Patienten
mit festen Tumoren, wenn es in Liposomen eingeschlossen verabreicht
wird (Doxil®,
ALZA Corporation, Mountain View, CA; Uziely, B. et al., J. Clin.
Onco., 13: 1777–1785
(1995), Working, P. K. et al., J. Pharmaco. Exp. Ther., 289: 1128–1133 (1999)).
Eine Kardialbiopsieuntersuchung von Patienten mit dem Acquired immune
deficiency Syndrome-(AIDS)-verwandten Kaposi Sarkom (KS), die große kumulative
Dosierungen von Doxil® erhielten, zeigten keine
Gewebeschädigung,
was darauf hindeutet, daß die
liposomale Formulierung eine kardioprotektive Wirkung auf das Doxorubicin
haben könnte
(Berry, G. et al, Ann. Oncol., 9: 71–76 (1998)). Das Fehlen von
Kardialtoxizität
ist teilweise auf die lange Zirkulationshalbwertzeit von Liposomen
(Polyethylenglykol-beschichtete Liposomen, bekannt als Stealth®, ALZA
Corporation, Mountain View, CA) und die stabile Arzneimittelretention
zurückzuführen, so
daß der
Großteil
der verabreichten Dosis das Gewebe in liposom-eingeschlossener Form
erreicht, bei der nur eine minimale Menge an Arzneimittel (< 5%) aus den Liposomen
während
der Zirkulation austritt und in dem Gewebe als freies Arzneimittel
verteilt wird (Martin, F. M., supra (1998; Gabizon, A. et al., Cancer
Res., 54: 987–92
(1994)).
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Es
ist bekannt, daß langzeitzirkulierende
Liposomen vorzugsweise (10fach) in Gewebe mit erhöhter mikrovaskulärer Permeabilität akkumulieren,
was die meisten Tumore mit aktiver Neoangiogenese einschließt (Wu,
N. Z., et al. Cancer Res., 53: 3765–3770 (1993); Yuan, F. et al.,
Cancer Res, 54: 3352–3356
(1994)). Langzeitzirkulierende Liposomen akkumulieren auch in verschiedenen
gesunden und anfälligen
Geweben, zum Beispiel der Haut (Gabizon, A., et al., Adv. Drug Deliv.
Rev., 24: 337–344
(1997)) und wahrscheinlich in Schleimhäuten. Bei längerer Exposition kann die
Akkumulierung von Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin in der Haut
Palmar-Plantar-Erythrodysestheresie (PPE, auch als "hand-foot-Syndrom" bekannt; Lyass et
al., Cancer 89: 1037–1047
(2000)) verursachen. Der Ausbruch von PPE kann durch die Verlängerung
der Dosierungsintervalle verhindert werden, jedoch können die
Veränderungen
der Dosierung und/oder des Zeitplans die Wirksamkeit gegenüber Tumoren,
z. B. Brustkarzinom reduzieren (Lyass et al., supra (2000), Ranson,
M. R. et al., J. Clin. Oncol., 15: 3185–3191 (1997)).
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Aktuelle
vorklinische und klinische Daten bezüglich der Langzeitzirkulation
von Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin (Doxil®) deuten
darauf hin, daß eine
unbedeutende Abgabe von Arzneimittel aus den zirkulierenden Liposomen
auftritt (< 5%
der injizierten Dosis). Wenn die Liposomen einmal in die extrazelluläre Gewebeflüssigkeit
ausgetreten sind, ist wenig über
die Prozesse, mit denen die Arzneimittelabgabe bestimmt wird, bekannt.
Es wird angenommen, daß ein
gradueller Verlust des Protongradienten, der das Arzneimittel zurückhält, enzymatische
Beschädigung
von liposomalen Phospholipiden durch Phospholipasen und/oder Endozytose
durch Scavengermakrophagen wahrscheinlich dazu beitragen, das Arzneimittel
freizusetzen. Doxorubicin bildet, wenn es in kommerziell verfügbaren liposomalen
Doxil®-Formen
eingeschlossen ist, ein Salz mit dem zweiwertigen Sulfatanion. Das
Salz fällt
aus oder geliert infolge seiner geringen Löslichkeit in dem wässerigen
inneren liposomalen Kompartiment. Diese Gelbildung stabilisiert
das eingeschlossene Doxorubicin in dem Lipid-Vesikel und verhindert
seine Abflußrate.
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Die Änderung
des Fassungsvermögens
des Anions auf das Doxorubicin könnte
eine Hauptauswirkung auf die Rate der Arzneimittelfreisetzung haben.
Zum Beispiel könnte
die Beschleunigung der Rate der Arzneimittelfreisetzung aus Doxil®-Liposomen,
ohne Wechselwirkung mit ihrer Langzeitzirkulation und Tumorzieleigenschaften,
aus den folgenden Gründen
wichtig sein: (1) die Tumorinhibitionsaktivität kann aufgrund der zeitintensiveren
Exposition der Tumore gegenüber
dem Arzneimittel ansteigen, und (2) die Hauttoxizität kann abnehmen,
weil diese Art der Toxizität
hauptsächlich
eine Funktion der längeren
Exposition des Hautgewebes gegenüber
dem Arzneimittel ist.
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Demgemäß wird eine
Liposomzusammensetzung, die die Abgabe einer eingeschlossenen Verbindung
und insbesondere von Doxorubucin aus Liposomen variiert, gewünscht. Ein
Verfahren zur Verkapselung therapeutischer Verbindungen in vorgeformte
Liposomen, das die Vorteile des Ammoniumsulfatgradienten behält, z. B.
Wirksamkeit und Stabilität,
ist wünschenwert,
die es sogar ermöglicht,
daß die
eingeschlossene Verbindung in einer höheren Rate freigesetzt wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung eine liposomale Zusammensetzung,
Liposomen, die Vesikel-bildende Lipide umfassen, und ein eingeschlossenes
ionisierbares therapeutisches Mittel in Verbindung mit einem Glucuronatanion
bereit. Das so geladene therapeutische Mittel hat eine höhere Freisetzungsrate
als das, das durch einen Ammoniumgradienten mit Sulfat als Balance
oder Gegenanion geladen ist.
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In
einer Ausführungsform
sind die Vesikel-bildenden Lipide, die die Liposomen bilden, Phospholipide. In
einer anderen Ausführungsform
umfassen die Liposomen des weiteren zwischen etwa 1 bis 20 Molprozent eines
Vesikelbildenden Lipids, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert
ist, wie zum Beispiel Polyethylenglykol.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Vesikel-bildende Lipid hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin
(HSPC) und das mit einem hydrophilen Polymer derivatisierte Vesikel-bildende
Lipid ist mit Polyethylenglykol derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin
(DSPE). Eine beispielhafte Verbindung ist HSPC, Cholesterin und
DSPE-PEG in einem molaren Verhältnis
von 92,5:70:7,5.
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In
einer noch anderen Ausführungsform
ist das therapeutische Mittel ein Anthracyclinantibiotikum. Beispielhafte
Anthracyclinantibiotika schließen
Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin ein.
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Die
oben beschriebene Verbindung wird verwendet, um unter einem anderen
Aspekt einen Patienten zu behandeln. Die Verbindung wird verwendet,
um unter einem anderen Aspekt einen Tumor in einem Patienten zu
behandeln.
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Unter
einem weiteren Aspekt schließt
die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Liposomen
mit einem eingeschlossenen therapeutischen Mittel ein, wobei das
therapeutische Mittel in vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumionengradienten
mit Sulfat als Gegenion beladen wird. Die Verbesserung umfaßt die Beladung
des ionisierbaren therapeutischen Mittels in Liposomen mit einem
Ammoniumionengradienten mit Glucuronat als einem Gegenion.
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Bei
diesem verbesserten Verfahren schließt die Beladung die Herstellung
einer Suspension aus Liposomen ein, jedes Liposom hat wenigstens
ein inneres wässeriges
Kompartiment, das in einer Ausführungsform
Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration enthält.
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In
einer anderen Ausführungsform
schließt
das verbesserte Verfahren die Herstellung einer Suspension aus Liposomen
ein, die in einem externen Grundmedium mit einer zweiten Konzentration
Ammoniumglucuronat suspendiert sind, wobei die erste Konzentration
höher ist
als die zweite Konzentration, wodurch ein Ammoniumionengradient über die
Lipiddoppelschicht der Liposomen geschaffen wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
schließt
das verbesserte Verfahren die Zugabe einer Menge des therapeutischen
Mittels zu der Liposomensuspension ein.
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In
einem anderen Aspekt schließt
das Verfahren die Herstellung von Liposomen ein, umfassend die Bildung
von Liposomen mit einem inneren Kompartiment und einer Doppelschichtlipidmembran
ein. Die Liposomen haben einen Konzentrationsgradienten mit Ammoniumglucuronat über ihre
Doppelschichtlipidmembranen. Die Liposomen sind mit einem ionisierbaren
therapeutischen Mittel in Kontakt gebracht, um den Transport des
Mittels in das innere Kompartiment zu erreichen.
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In
einer Ausführungsform
umfaßt
das Verfahren (i) die Herstellung einer Suspension mit Liposomen, jedes
Liposom in der Suspension hat wenigstens ein inneres wässeriges
Kompartiment, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration
enthält,
die Liposomen sind in einem externen Grundmedium suspendiert, das
Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration umfaßt; (ii) Reduzierung
der ersten Konzentration an Ammoniumglucuronat in dem externen Grundmedium
auf eine niedrigere zweite Konzentration an Ammoniumglucuronat,
wodurch ein Konzentrationsgradient von Ammoniumionen über die
Lipiddoppelschichten der Liposomen geschaffen wird.
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In
verschiedenen Ausführungsformen
wird der Schritt der Reduzierung durch Verdünnung, Dialyse, Diafiltration
oder Ionenaustausch erreicht.
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Unter
noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren
zur Zuführung
einer protonierbaren Verbindung in vorgeformte Liposomen ein, umfassend
die Herstellung einer Suspension mit Liposomen mit einer größeren Konzentration
an Ammoniumglucuronat innerhalb als außerhalb der Liposomen, wodurch ein
Konzentrationsgradient von Ammoniumionen vom Innern zum Äußern der
Liposomen geschaffen wird. Der Gradient ist zum aktiven Transport
der protonierbaren Verbindung in Richtung auf das Innere der Liposomen in
der Lage. Das Verfahren schließt
auch die Zugabe einer Menge der protonierbaren Verbindung zu der
Suspension ein, und ermöglicht,
daß die
protonierbare Verbindung in die Liposomen transportiert wird, um
einen Gehalt der protonierbaren Verbindung innerhalb der Liposomen
zu erreichen, der größer als
der außerhalb
der Liposomen ist.
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In
einer Ausführungsform
schließt
das Verfahren die Bildung der Liposomen in Gegenwart einer Ammoniumglucuronatlösung mit
einer ersten Konzentration und das Einschließen der Ammoniumglucuronatlösung mit
der ersten Konzentration im Innern der Liposomen und die Reduzierung
der ersten Konzentration der Ammoniumglucuronatlösung außerhalb der Liposomen auf eine
zweite Konzentration, die geringer ist als die erste Konzentration,
ein.
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Das
Verfahren der Erfindung hat eine hohe Beladungseffizienz. In einer
Ausführungsform
werden mehr als 50% der Menge an protonierbarer Verbindung, die
zu der Suspension zugefügt
ist, in das Innere der Liposomen transportiert. In einer anderen
Ausführungsform
werden ungefähr
90% der Menge an protonierbarer Verbindung, die zu der Suspension
zugefügt
sind, in das Innere der Liposomen transportiert. In besonderen Ausführungsformen
ist die Beladungseffizienz für
Doxorubicin mehr als 90% und das Verhältnis von Doxorubicin zu Phospholipid
liegt im Bereich von etwa 100 bis 150 μg/μmol.
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Diese
und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden vollständiger verstanden,
wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung
mit den beigefügten
Zeichnungen gelesen wird.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1A bis 1E sind
Wachstumsinhibitionskurven, die die Wachtumsrate als Prozent von
unbehandelten Kontrollzellen der Mauszellinien M109ST (1A),
M109R (1B) und von humanen Zellinien C-26
(1C), KB (1D) und
KB-V (1E) gegen die Doxorubicin-Konzentration
(in nM), nach Behandlung mit freiem Doxorubicin (Kreise), Liposom-eingeschlossenem
Doxorubicin, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen
einen Ammoniumsulfatgradienten, (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten
(Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde,
graphisch darstellen;
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2 zeigt
die in vitro-Verlustrate von Doxorubicin aus Liposomen, wobei das
Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten,
(Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen
Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde;
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3 ist
ein Balkendiagramm, das die Doxorubicinkonzentration (μg/ml) in
Mausplasma zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion von Liposomen,
die Doxorubicin enthalten, zeigt, wobei das Doxorubicin andernorts
in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (gepunktete
Balken) oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (schraffierte
Balken) geladen wurde;
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4 ist
ein Plot von Mittelwerten der Dicke von Fußballen (foodpad) in mm in
Mäusen,
die mit M109-S-Zellen inokuliert wurden als eine Funktion von Tagen
nach Behandlung mit Salzlösung
(geschlossene Quadrate), freiem Doxurubicin (Kreise) oder Doxorubicin
eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in
die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen
Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde;
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5 ist
ein Plot von Mittelwerten der Dicke von Fußballen (foodpad) in mm in
Mäusen,
die mit M109R-Zellen inokuliert wurden als eine Funktion von Tagen
nach Behandlung mit Salzlösung
(geschlossene Quadrate), freiem Doxurubicin (Kreise) oder Doxorubicin
eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in
die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen
Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde,
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6 ist
ein Plot der Anzahl von überlebenden
Mäusen
als eine Funktion von Tagen nach Inokulation mit C-26 Tumorzellen
und Behandlung mit freiem Doxorubicin (Kreise) oder mit Doxorubicin
eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in
die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen
Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt eine liposomale Zusammensetzung bereit, bei der
ein ionisierbares therapeutisches Mittel in dem(n) inneren liposomalen
Kompartiment(en) in der Form eines ionisches Salzes mit einwertigen
Glucuronatanionen eingeschlossen ist. Wie unten gezeigt wird, hat
das eingeschlossene therapeutische Mittel eine schnellere Freisetzungsrate
aus den Liposomen verglichen mit der Freisetzungsrate des Mittels, das
in den Liposomen in Form eines ionischen Salzes mit zweiwertigen
Sulfatanionen eingeschlossen ist. Die Erfindung stellt auch ein
Fernbeladungsverfahren zur Ladung eines therapeutischen Mitteln
in vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten
bereit. Die schnellere Rate der Freisetzung des therapeutischen
Mittels aus den Liposomen ermöglicht
Flexibilität,
um Dosierungszeitpläne
ohne Gefährdung
der biologischen Effizienz der therapeutischen Mittel einzustellen.
Das Verfahren der Erfindung stellt deshalb eine nützliche
Alternative des Beladens mit Ammoniumsulfat bereit.
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Ähnlich dem
herkömmlichen
Ammoniumsulfatgradientverfahren erfordert das Fernbeladungsverfahren
mit Ammoniumglucuronat nicht, daß die Liposomen in einem sauren
pH-Wert hergestellt werden, noch, daß das extraliposomale Medium
basisch eingestellt wird. Der Ansatz ermöglicht auch die Beladung mit
dem therapeutischen Mittel in einem breiten Spektrum von Liposomen
unterschiedlicher Typen, Größen und
Zusammensetzungen, einschließlich
räumlich-stabilisierte
Liposomen, Immunoliposomen und räumlich-stabilisierte
Immunoliposomen. "Eingeschlossen", wie es hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein Mittel, das innerhalb der wässerigen
Räume der
Liposomen oder innerhalb der Lipiddoppelschicht eingeschlossen ist.
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Die
höhere
Freisetzungsrate ist ein Ergebnis der Verwendung von Glucuronat
als dem Ausgleichsanion. Weil es in der Theorie nicht gewünscht ist,
das es gebunden ist, gibt es die Hypothese, daß das Glucuronatanion, das
einwertig ist und verschiedene funktionelle Hydroxylgruppen in seinem
sechsgliedrigen Ring enthält,
weniger wirksam ist verglichen mit einem Sulfation bei der Induzierung
von Aggregation und Präzipitation des
therapeutischen Mittels nachdem es in die Liposomen transportiert
wurde. Die Erfinder haben beobachtet, daß die Löslichkeit von Doxorubicin ungefähr 100 mal
größer in einer
250 mM Ammoniumglucuronat (AG)-Lösung
als in einer 250 mM Ammoniumsulfat (AS)-Lösung ist. Zusätzlich präzipitiert
Doxorubicin bei weniger als 2 mM Konzentration in Gegenwart eine
Sulfations, während
eine viel höhere
Konzentration an Doxorubicin in Gegenwart eines Glucuronatanions
zur Präzipitation
erforderlich ist. Wenn demgemäß Glucuronat
das Ausgleichsanion ist, ist mehr therapeutisches Mittel in einer
löslichen
Form vorhanden und deshalb verfügbarer zur
Freisetzung aus den Lipsomen. Des weiteren ist die Permeabilität von Glucuronat
durch die liposomalen Membranen sehr gering, möglicherweise infolge seines
geringen pKa-Werts, seiner Sperrigkeit und/oder Polarität, was es
sehr wirksam zur Aufrechterhaltung des Ammoniumionengradienten zur
Beladung mit den therapeutischen Mitteln macht.
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Das
Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um andernorts im
wesentlichen jedes therapeutische Mittel zu laden, das protonierbar
ist (es kann in einem positiv geladenen Zustand existieren), wenn
es in einem geeigneten wässerigen
Medium gelöst
ist. Vorzugsweise sollte das Mittel relativ lipophil sein, so daß es sich
in der Lipidvesikelmembran aufteilen wird. Vorzugsweise ist die
zu ladende therapeutische Verbindung auch eine schwache amphipatische
Verbindung, daß heißt, eine
Verbindung mit entweder schwachen basischen oder sauren Anteilen.
Beispiele an therapeutischen Mitteln, mit denen die Liposomen mit
dem Verfahren der Erfindung beladen werden können, schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf, Doxorubicin, Mitomycin, Bleomycin, Daunorubicin, Streptozocin,
Vinblastin, Vincristin, Mechlorethaminhydrochlorid, Melphalan, Cyclosphosphamid,
Triethylenethiophosphoramid, Carmustin, Lomustin, Semustin, Fluoruracil,
Hydroxyharnstoff, Thioguanin, Cytarabin, Floxuridin, Decarbazin,
Cisplatin, Procarbazin, Ciprofloxacin, Epirubicin, Carcinomycin, N-Acetyladriamycin,
Rubidazon, 5-Imidodaunomycin, N-Acetyldaunomycin, alle Anthracyclin-Arzneimittel, Daunorylin,
Propranolol, Pentamindin, Dibucain, Tetracain, Procain, Chlorpromazin,
Pilocarpin, Physostigmin, Neostigmin, Chloroquin, Amodiaquin, Chlorguanid,
Primaquin, Mefloquin, Chinin, Pridinol, Prodipin, Benztropinmesylat,
Trihexylphenidylhydrochlorid, Propranolol, Timolol, Pindolol, Quinacrin,
Benadryl, Promethazin, Dopamin, Serotonin, Epinephrin, Codein, Meperidin,
Methadon, Morphin, Atropin, Decyclomin, Methixen, Propanthelin,
Imipramin, Amitriptylin, Doxepin, Desipramin, Quinidin, Propranolol,
Lidocain, Chlorpromazin, Promethazin, Perphenazin, Acridinorange,
Prostaglandine, Fluorescein, Carboxyfluorescein, und andere Moleküle, die
diesen ähnlich
sind.
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Zusätzlich zu
der Beladung mit einem einzelnen therapeutischen Mittel kann das
Verfahren auch verwendet werden, um mehrer therapeutische Mittel
entweder gleichzeitig oder nachfolgend zu laden. Auch können die
Liposomen, die mit den protonierbaren therapeutischen Mitteln beladen
werden, ihrerseits mit anderen pharmazeutischen Mitteln oder Arzneimitteln
vorbeladen sein, wozu bekannte Verkapselungstechniken (z. B. durch
Einbringen des Arzneimittels in einen Puffer, aus dem die Liposomen
hergestellt werden) verwendet werden. Das Verfahren der Erfindung
stellt deshalb eine große
Flexibilität
bei der Herstellung von Liposomen bereit, in denen "Arzneimittelcocktails" zur therapeutischen
Verwendung eingeschlossen sind. Natürlich kann, wenn gewünscht, mit
einem oder mehreren protonierbaren Arzneimitteln, die oben aufgeführt sind,
eine Vorbeladung stattfinden und dann das gleiche oder ein anderes
Arzneimittel zu den Liposomen zugegeben werden, wobei der Ammoniumglucuronatgradient
der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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Das
Verfahren ist insbesondere geeignet, um mit schwachen amphipatischen
Arzneimitteln, wie Doxorubicin zu beladen. Mit Doxorubicin beladene
Liposomen, die eine externe Oberflächenbeschichtung mit hydrophilen
Polymerketten durch einen Ammoniumglucuronatgradienten (bezeichnet
als "Lipo-dox-AG") aufweisen, zeigen
eine schnellere Freisetzungsrate als mit Doxorubicin beladene Liposomen,
die eine externe Oberflächenbeschichtung
mit hydrophilen Polymerketten durch einen Ammoniumsulfatgradienten
(bezeichnet als "Lipo-dox-AS", kommerziell als
Doxil® bekannt),
und haben eine ähnliche
biologische Effizienz. Es wird angenommen, daß die schnellere Freisetzung
des Arzneimittels, wenn es in Liposomen gegen eine Ammoniumglucuronatgradienten
vorhanden ist, die Verweilzeit im Blut abschwächt und die Möglichkeit
des Doxorubicin in der Haut zu akkumulieren, erniedrigt, um Palmar-Planar-Erythrodysesthesie
(PPE), auch als das Hand-Fuß-Syndrom
bekannt) zu bewirken, eine Nebenwirkung, die beobachtet wird, wenn
liposomal-verkapseltes Doxorubicin verabreicht wird.
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In
Untersuchungen, die zur Unterstützung
der Erfindung durchgeführt
wurden, wurden Liposomen hergestellt, die eingeschlossenes Doxorubicin
enthielten, wobei vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten
oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten mit Doxorubicin fernbeladen
wurden. In unteren Abschnitt I wird die Liposomzusammensetzung und
das Fernbeladungsverfahren beschrieben. Diese Liposomen werden in
vitro charakterisiert, um ihre Zytotoxizität, die zelluläre Arzneimittelaufnahme
und die Plasmaaustrittsrate zu bestimmen, die ebenfalls in Abschnitt
I beschrieben werden. In den Abschnitten II und III wird die in
vivo Clearance-Rate und die therapeutische Aktivität des Liposom-verkapselten
Doxorubicins diskutiert.
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I. Liposomenkomponenten und Präparationen
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A. Liposomenkomponente
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Liposomen,
die zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, schließen
solche ein, die primär
aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt sind. Vesikel-bildende Lipide,
beispielhaft dargestellt durch Phospholipide, bilden bei physiologischem
pH-Wert und Temperaturen in Wasser spontan Doppelschichtvesikel.
Die Liposomen können
auch andere Lipide, die in die Lipiddoppelschichten eingebracht
sind, umfassen, wobei sich der hydrophobe Anteil in Kontakt mit
dem Inneren, der hydrophoben Region der Doppelschichtmembran, und
der Kopfgruppenanteil sich nach außen, der polaren Oberfläche der
Doppelschichtmembran, orientiert.
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Die
Vesikel-bildenden Lipide sind vorzugsweise die, die zwei Kohlenwasserstoffketten,
typischerweise Acyketten, und eine Kopfgruppe aufweisen, die entweder
polar oder nicht-polar ist. Es gibt eine Vielzahl synthetischer
Vesikel-bildender Diacyl-Lipide und natürlich vorkommende Vesikelbildende
Lipide, wie Phospholipide, Diglyceride, dialiphatische Glycolipide,
Einzellipide, wie Sphingomyelin und Glycosphosphingolipid, Chlolesterin
und deren Derivate, einzeln oder in Kombination und/oder mit oder
ohne Liposomenmembran versteifende Mittel. Wie hier definiert, schließen "Phospholipide" Phosphatidylchlolin
(PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol
(PI), Sphingomyelin, Plasmalogene und Phosphatidylcholinlipidderivate
ein, wo die zwei Kohlenwasserstoffketten typischerweise zwischen
etwa 14 bis 22 Kohlenstoffatome in der Länge aufweisen und verschiedene
Grade an Ungesättigtkeit
haben. Die oben beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten
unterschiedliche Grade and Ungesättigtkeit
haben, können kommerziell
oder gemäß den veröffentlichten
Verfahren hergestellt werden.
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Kationische
Lipide sind ebenfalls für
die Verwendung in den Liposomen der Erfindung geeignet, wobei die
kationischen Lipide als eine geringfügige Komponente der Lipidzusammensetzung
oder als eine Haupt- oder einzige Komponente vorhanden sein können. Solche
kationischen Lipide haben typischerweise einen lipophilen Anteil,
wie z. B. Sterin, eine Acyl- oder eine Diacylkette, und wobei das
Lipid eine insgesamt positive Nettoladung hat. Vorzugsweise trägt die Kopfgruppe
des Lipids die positive Ladung. Beispiele solcher Lipide schließen 1,2-Dioleyloxy-3-(trimethylamino)propan
(DOTAP), N-[I(2,3-Ditetradecycloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid
(DMRIE), N-[I-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid
(DORIE), N-[I-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), 30-[N-(N,N'-Dimethylaminoethan)-carbamoly]cholesterin
(DC-Chol) und Dimethyldioctadecylammonium (DDAB), ein.
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Das
kationische Vesikel-bildende Lipid kann auch ein natürliches
Lipid, wie zum Beispiel Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder
ein amphiphatisches Lipid, wie Phospholipid, das mit einem kationischen
Lipid derivatisiert ist, wie Polylysin oder andere Polyaminlipide,
sein. Zum Beispiel kann das neutrale Lipid (DOPE) mit Polylysin
derivatisiert sein, um eine kationisches Lipid zu bilden.
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Das
Vesikel-bildende Lipid kann ausgewählt werden, um einen besonderen
Grad an Fluidität
oder Starrheit zu erreichen, um die Stabilität des Liposoms im Serum zu
kontrollieren und um die Freisetzungsrate des eingekapselten Mittels
in dem Liposom zu kontrollieren. Liposomen, die eine starrere Lipiddoppelschicht oder
eine flüssige
kristalline Doppelschicht haben, werden erhalten durch das Einbringen
eines relativ starren Lipids, z. B. einem Lipid mit einer relativ
hohen Phasenumwandlungstemperatur, z. B. oberhalb der Raumtemperatur,
noch bevorzugter oberhalb der Körpertemperatur
und bis hin zu 80°C.
Starre, d. h. ungesättigte,
Lipide tragen zu einer größeren Membranstarrheit
in der Lipiddoppelschicht bei. Andere Lipidkomponenten, wie zum Beispiel
Cholesterin, sind auch dafür
bekannt, daß sie
zur Membranstarrheit in den Lipiddoppelschichtstrukturen beitragen.
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Lipidfluidität wird durch
Einbringen eines relativ flüssigen
Lipids, typischer weise einem mit einer Lipidphase mit einer relativ
niedrigen flüssig-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur,
z. B. bei oder unter Raumtemperatur, noch bevorzugten bei oder unter
Körpertemperatur,
erhalten.
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Die
Liposomen können
wahlweise ein Vesikel-bildendes Lipid einschließen, das mit einem hydrophilen Polymer
derivatisiert ist, das zum Beispiel beschrieben wurde in
US-Patent Nr. 5 013 556 und
in der
WO 98/07409 ,
die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Das Einbringen eines
hydrophilen Polymer-Lipid-Konjugats
in den liposomalen Doppelschichtpolymer bewirkt eine Oberflächenbeschichtung
von hydrophilen Polymerketten sowohl auf den inneren als auch auf
den äußeren Oberflächen der
Liposomlipiddoppelschichtmembranen. Die äußerste Oberflächenbeschichtung
mit hydrophilem Polymerketten bewirkt, daß die Blutzirkulationsldauer
in vivo im Vergleich zu den Liposomen ohne Polymerketten beschichtung
auszudehnt wird. Die innere Beschichtung der hydrophilen Polymerketten
dehnt sich in die wässerigen
Kompartimente in den Liposomen aus, d. h. zwischen die Lipiddoppelschichten
und in das zentrale Kernkompartiment, und ist mit jedem eingeschlossenen
Mittel in Kontakt. Vesikelbildende Lipide, die zur Derivatisierung
mit einem hydrophilen Polymer geeignet sind, schließen jedes
der oben genannten Lipide ein, und insbesondere Phospholipide, wie
Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE).
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Hydrophile
Polymere, die zur Derivatisierung mit einem Vesikel-bildenden Lipid
geeignet sind, schließen
Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin,
Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid,
Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat,
Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglykol
und Polyaspartamid ein. Die Polymere können als Homopolymere oder
als Block- oder Zufallspolymer verwendet werden.
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Eine
bevorzugte hydrophile Polymerkette ist Polyethylenglykol (PEG),
vorzugsweise eine PEG-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen
etwa 500 und etwa 10.000 Dalton, noch bevorzugter zwischen etwa
500 und etwa 5.000 Dalton, insbesondere bevorzugt zwischen etwa
1.000 und etwa 2.000 Dalton. Methoxy- oder Ethoxy-bedeckte Analoge des PEG
sind ebenfalls bevorzugte hydrophile Polymere, die kommerziell in
einer Vielzahl von Polymergrößen, z.
B. 120 bis 20.000 Dalton, verfügbar
sind.
-
Die
Präparation
von Vesikel-bildenden Lipiden, die mit hydrophilen Polymeren derivatisiert
sind, ist zum Beispiel in dem
US-Patent
Nr. 5 395 619 beschrieben. Die Herstellung von Liposomen
einschließlich
solcher derivatisierten Lipide wurde ebenfalls beschrieben, wobei
typischerweise zwischen 1 bis 20 Molprozent eines solchen derivatisierten
Lipids in der Liposomenformulierung enthalten sind. Es ist so zu
verstehen, daß das
hydrophile Polymer stabil mit dem Lipid verbunden ist oder mittels
einer unstabilen Bindung verbunden ist, die es ermöglicht,
daß die
beschichteten Liposomen die Beschichtung der Polymerketten abtrennen
können, wenn
sie im Blutstrom zirkulieren oder als Antwort auf einen Stimulus,
wie es zum Beispiel in dem
US-Patent Nr.
6 043 094 beschrieben wird, das hier durch Bezugnahme aufgenommen
ist.
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B. Liposomenpräparation
-
Liposomale
Suspensionen, die aus Liposomen bestehen, haben einen Ionengradienten über die
Liposomdoppelschicht (auch als ein "Transmembrangradient" bezeichnet), der für die Fernbeladung verwendet wird,
können
mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, wie denen,
die ausführlich
in Szoka, F. Jr., et al., Ann Rev Biophys Bioeng 9: 467 (1980) beschrieben
sind. Multilamellare Vesikel (MLV) können durch eine einfache Lipid-Film-Hydratations-Technik
gebildet werden. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung Liposom-bildender
Lipide des oben beschriebenen Typs in einem geeigneten organischen
Lösungsmittel
gelöst und
das Lösungsmittel
wird später
verdampft, wodurch ein dünner
Film hinterlassen wird. Der Film wird dann mit einem wässerigen
Medium bedeckt, das den gelösten
Stoff enthält,
z. B. Ammoniumglucuronat, das die wässerige Phase in den Liposomeninnenräumen und
auch die extraliposomale Suspensionslösung bildet. Der Lipidfilm
hydratisiert, um MLVs zu bilden, typischerweise mit Größen zwischen
etwa 0,1 bis 10 Mikrometer.
-
Die
Lipide, die für
die Bildung der Liposomen in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, sind vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von etwa 70 bis 100 Molprozent
Vesikel-bildender Lipide, wahlweise 1 bis 20 Molprozent eines Lipids,
das mit einer hydrophilen Polymerkette derivatisiert ist, vorhanden.
Eine beispielhafte Formulierung schließt 80 bis 90 Molprozent Phosphatidylethanolamin,
1 bis 20 Molprozent PEG-DSPE ein. Cholesterin kann in der Formulierung
zwischen etwa 1 bis 50 Molprozent vorhanden sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind die Lipidkomponenten hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC), Cholesterin
und Methoxy-bedecktes Polyethylenglykol, das mit Distearylphosphatidylethanolamin (mPEG(2000)-DSPE)
derivatisiert ist, in einem molaren Verhältnis von 92,5:70:7,5.
-
Zur
Herstellung von Liposomen, die einen Ammoniumglucuronatgradienten
besitzen, enthält
das Hydratationsmedium Ammoniumglucuronat. Die Konzentration des
Ammoniumglucuronat hängt
von der Menge des therapeutischen Mittels ab, das geladen wird.
Typischerweise ist die Konzentration zwischen 100 bis 300 mM Ammoniumglucuronat.
In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Hydratationsmedium 250 mM Ammoniumglucuronat.
-
Die
Vesikel, die durch das Dünnfilmverfahren
hergestellt werden, werden in der Größe so angepaßt, das
eine Größenverteilung
innerhalb eines ausgewählten
Bereichs, gemäß bekannten
Verfahren, erhalten wird. Vorzugsweise sind die Liposomen einheitlich
in der Größe, in einem
Größenbereich
zwischen 0,04 bis 0,25 μm.
Kleine unilamellare Vesikel (SUVs), typischerweise im Bereich von
0,04 bis 0,08 μm,
können
durch Nachformation mittels Sonifizierung oder Homogenisierung hergestellt
werden. Homogen in der Größe eingestellte
Liposomen, die Größen in einem
ausgewählten
Bereich von etwa 0,08 bis 0,4 μm
haben, können
durch Extrusion durch Polycarbonatmembranen oder anderen Membranen
mit definierten Porengrößen hergestellt werden,
die einheitliche Porengrößen im Bereich
von 0,03 bis 0,5 μm,
typischerweise 0,05, 0,08, 0,1, oder 0,2 μm aufweisen. Die Porengröße der Membran
entspricht annähernd
der größten Größe der Liposomen,
die durch Extrusion durch die Membran hergestellt werden, insbesondere
wo die Präparation
zwei oder mehr Mal durch die gleiche Membran extrudiert wurde. Die
Größeneinteilung
wird vorzugsweise in dem Original-Lipid-Hydratisierungspuffer durchgeführt, so
daß die
Liposomeninnenräume
dieses Medium durch die anfänglichen
Liposomenherstellungsschritte behalten. In Beispiel 1 ist beispielhaft
die Herstellung einer liposomalen Formulierung beschrieben.
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Im
allgemeinen werden die Liposomen nach der Größeneinteilung mit einem therapeutischen
Mittel beladen. Ein "Fern-" oder "Aktiv-"Beladungsverfahren
ergibt sich aus dem Austausch des therapeutischen Mittels aus dem
externen oder Grundmedium, in dem die Liposomen mit einem Ammoniumion
in dem inneren liposomalen Kompartiment suspendiert sind. Die Effizienz
der Beladung hängt
wenigstens teilweise von einem Ammoniumionengradienten ab, wobei
die Konzentration des Ammoniumions im Inneren der Liposomen höher ist,
als die Konzentration des Ammoniumions in dem externen Grundsuspensionsmedium.
Die Magnitude dieses Gradienten bestimmt in einem großen Ausmaß das Niveau
des Einschlusses; je größer der
Gradient, desto höher
ist im allgemeinen der Einschluß.
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Ein
Ammoniumglucuronatgradient über
die liposomale Lipiddoppelschicht, bei dem die Ammoniumionenkonzentration
auf der Innenseite der Liposomen höher ist als in dem externen
Suspensionsmedium (d. h. ein höherer
Innen-/niedrigerer Außen-Ammoniumionengradient)
kann auf eine Vielzahl von Wegen gebildet werden, z. B. durch (i)
kontrollierte Verdünnung
eines externen Mediums, (ii) Dialyse gegen das gewünschte Endmedium,
(iii) Molekularsiebchromatographie, z. B. unter Verwendung von Sephadex
G-50 gegen das gewünschte
Medium oder (iv) Hochgeschwindigkeitszentrifugation und Resuspension
der pelletierten Liposomen in dem gewünschten Endmedium. Das ausgewählte endgültige externe
Medium wird von dem Mechanismus der Gradientenbildung und der gewünschten
externen Ionenkonzentration abhängen.
Der Gradient wird gemessen als das Verhältnis von Ammoniumglucuronat
innen zu dem außerhalb
der Liposomen. Im allgemeinen hat der Gradient ein Verhältnis 1000–10 innen/außen. Vorzugsweise
liegt der Gradient im Bereich von 500–50.
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Die
Konzentration von Ammoniumglucuronat in einem externen Medium, das
auch Elektrolyte enthält, kann
als Ammoniumkonzentration bei einem pH-Wert von 13–14 (Bolotin,
E. M., et al., Journal of Liposome Research 4(I): 455–479 (1984))
mittels eines Ionenanalysators gemessen werden, z. B. einem Corning
250 pH/Ionenanalysator (Corning Science Products, Corning, NY),
der mit einer Corning 476130 Ammoniumelektrode und einer automatischen
Temperaturkompensations-(ATC) rostfreien Stahlsonde ausgestattet
ist. Wenn das endgültige
externe Medium keine Elektrolyten enthält, kann der Ammoniumglucuronatgradient
durch Leitfähigkeitsmessungen
mit einem Leifähigkeitsmeßgerät bestimmt
werden, z. B. vom Typ CDM3-Leitfähigkeitsmeßgerät, ausgestattet
mit einer CDC 304 Eintauchelektrode mit manuellem Temperaturkompensator
vom Typ CDA 100 (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark).
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In
einem Ansatz wird der Ammoniumionengradient durch kontrollierte
Verdünnung
erzeugt. Dieses Verfahren ergibt eine verdünnte Liposomenpräparation.
Nach der Größeneinstellung
hat die liposomale Suspension eine ausgewählte erste Konzentration an
Ammoniumglucuronat in dem Liposom und in dem externen Grundmedium.
Das externe Grundmedium wird mit einem zweiten Medium verdünnt, das
kein Ammoniumglucuronat enthält.
Beispielhafte zweite Medien schließen wässerige Lösungen, die Elektrolyte (Natriumchlorid oder
Kaliumchlorid) enthalten oder wässerige
Lösungen,
die keine Elektrolyte (Glukose oder Saccharose) enthalten, ein.
Die inneren und äußeren Medien
werden vorzugsweise so ausgewählt,
daß sie
die gleiche Osmolarität
aufweisen, z. B. durch geeignetes Einstellen der Konzentration des
Puffers, Salzes oder dem gelösten Stoff
mit niedrigem Molekulargewicht, wie Saccharose. Ein bevorzugtes
zweites Medium ist 15 mM HEPES-Puffer, der 5% Dextrose bei einem
ungefähren
pH-Wert von 7 enthält.
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In
einem anderen Ansatz wird ein Protonengradient über die Lipiddoppelschicht
durch Dialyse erzeugt, wobei das externe Grundmedium gegen eines
ausgetauscht wird, daß keine
Ammoniumionen enthält,
z. B. der gleiche Puffer, aber bei dem Ammoniumglucuronat durch
ein Salz wie NaCl oder KCl oder durch einen Zucker ausgetauscht
wird, der die gleiche Osmolarität
innerhalb und außerhalb
der Liposomen ergibt. Für
Präparationen
im kleinen Maßstab
kann der Gradient durch vier aufeinanderfolgende Dialyseaustausche
gegen 25 Volumen des Dialysepuffer hergestellt werden. Für Präparationen
im großen
Maßstab
kann der Gradient durch eine tangentiale Flußdialyse in drei Schritten
hergestellt werden, z. B. unter Verwendung eines Minitan Ultrafiltrationssystems
(Millipore Corp., Redford, MA), das ausgestattet ist mit "300 K"-Polysulfonmembranen. Der
Dialysepuffer enthält
Elektrolyte (z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid) oder keine
Elektrolyte (Glukose oder Saccharose). In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Dialysepuffer 15 mM HEPES, der 5% Dextrose bei einem ungefähren pH-Wert
von 7 enthält.
Entweder unter Verwendung der Dialyseansätze (im großen oder kleinen Maßstab) oder
unter Bedingungen, bei denen das Hydratationsmedium 60 bis 250 mM
Ammoniumglucuronat ist, kann ein Gradient von 1.000 oder mehr ohne
Verdünnung
der liposomalen Dispersion erhalten werden.
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Die
Ionisierungsereignisse, die auftreten, wenn Liposomen mit ionisierbaren-Arzneimitteln gegen
eines Ammoniumionengradienten beladen werden, sind im Stand der
Technik beschrieben (siehe
US-Patent
Nr. 5 192 549 ). Kurz gesagt, nach der Bildung der Liposomen
und der Etablierung des Gradienten über die liposomalen Doppelschichten
dissoziieren die Ammoniumionen innerhalb der Liposomen und sind
im Gleichgewicht mit Ammoniak und Protonen. Ammoniakgas ist in der
Lipiddoppelschicht mit einem Permeabilitätskoeffizienten von um die
1,3 × 10
–1 cm/Sekunde
permeabel, und ist in der Lage, die liposomale Doppelschicht zu durchdringen.
Der Austritt von Ammoniak verschiebt das Gleichgewicht in den Liposomen
gegenüber
der Produktion von Protonen, was zu einem [H
+]-Gradienten führt, bei
dem die intraliposomale Konzentration höher als die des extraliposomalen
Mediums ist. Unprotoniertes Arzneimittel durchquert die liposomale
Doppelschicht, wird in dem Liposom protoniert und wird durch Anionen
stabilisiert, die in dem internen wässerigen Kompartiment des Liposoms
verhanden sind. Die Bildung eines Arzneimittel-Glucuronat-Salzes
erhöht
den intraliposomalen pH-Wert und induziert die Bildung von NH
3 in den Liposomen. Diese zyklischen Wiederholungen
wiederholen sich, bis im wesentlichen alle Ammoniumionen aus dem
liposomalen internen Kompartiment als NH
3 abgeflossen
sind. Ein therapeutisches Mittel, z. B. Doxorubicin kann in die
Liposomen durch Zugabe einer Lösung
dieses Mittels zu einer Suspension von Liposomen mit einem Ammoniumionengradienten über die
liposomalen Membranen eingebracht werden. Die Suspension wird unter
Bedingungen behandelt, die wirksam sind, um die Passage der Verbindung
von dem externen Medium in die Liposomen zu ermöglichen. Inkubationsbedingungen,
die für
die Arzneimittelbeladung geeignet sind, sind solche, die (i) die
Diffusion der Verbindung, die in eine ungeladenen Form vorliegt,
in die Liposomen ermöglichen
und (ii) die vorzugsweise zu einer hohen Arzneimittelbeladungskonzentration
führen,
z. B. 5–500
mM eingeschlossenem Arzneimittel, vorzugsweise zwischen 20–300 mM,
noch bevorzugter zwischen 50–200
mM.
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Die
Beladung wird vorzugsweise bei einer Temperatur oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur der
Liposomenlipide durchgeführt.
So kann für
Liposomen, die vorwiegend aus gesättigten Phospholipiden gebildet
sind, die Beladungstemperatur höher
als 60°C
oder mehr sein. Die Beladungsdauer ist typischerweise zwischen 15
bis 120 Minuten, abhängig
von der Durchlässigkeit
des Arzneimittels gegenüber
der Liposomdoppelschichtmembran, der Temperatur und den relativen
Konzentrationen von Liposomlipid und Arzneimittel. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird die Beladung bei 60°C
und für
60 Minuten durchgeführt.
-
So
können
mit einer exakten Auswahl von Liposomkonzentration, externer Konzentration
der zugefügten
Verbindung, und dem Ionengradienten im wesentlichen alle zugefügten Verbindungen
in die Liposomen eingebracht werden. Zum Beispiel kann mit einem
Ammoniumgradienten von ungefähr
1000, die Verkapselung von Doxorubicin größer als 90% sein. Bei Kenntnis
des berechneten internen Liposomenvolumens und der maximalen Konzentration
des zu ladenden Arzneimittels kann man dann eine Menge an Arzneimittel
in dem externen Medium auswählen,
das dazu führt,
daß die
Liposomen im wesentlichen vollständig
beladen sind.
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Wenn
die Arzneimittelbeladung nicht effektiv ist, um im wesentlichen
in dem externen Medium freies Arzneimittel zu vermindern, kann die
Liposomensuspension nach der Arzneimittelbeladung behandelt werden, um
nicht-verkapseltes Arzneimittel zu entfernen. Freies Arzneimittel
kann zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie,
Dialyse oder Zentrifugation entfernt werden. In einer Ausführungsform
wird das nicht eingeschlossene Arzneimittel mit einer Dowex 50WX-4
(Dow Chemical, MI) entfernt. Zum Beispiel bindet freies Doxorubicin
(aber nicht liposomales Doxorubicin) an ein Kationaustauscherharz
(Storm, G. et al., Biochim Biophys Acta, 818: 343 (1985)).
-
II. In vitro Charakterisierung
-
A. In vitro Cytotoxizität
-
Die
in vitro Cytotoxizität
von freiem Doxorubicin (freies DOX), von liposomeneinschlossenem
Doxorubicin, die gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Lipodox-AS)
oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Lipo-dox-AG) beladen
wurden, wurde gegen zwei Mauszellinien (M109-S und M109-R) und drei
Tumorzellinien (C-26, KB und KB-V) getestet. M109-R und KB-V Zellinien
sind Doxorubicin-resistente Unterlinien von M109-S beziehungsweise
KB. Die Zellen werden kontinuierlich der Arzneimittelformulierung
für 72
Stunden ausgesetzt, die nach den experimentellen Details, die von
Hornwitz, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1109: 203–209 (1992)
und auch in Beispiel 2 beschrieben sind, durchgeführt wurden.
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Tabelle
1 zeigt die Doxorubicin-Konzentration, die benötigt wird, um 50% des Zellwachstums (IC50-Werte)
für freies
Doxorubicin (F-Dox), Lipo-dox-AG und Lipo-dox-AS zu inhibieren.
Doxorubicin in freier Form ist cytotoxischer als eine der beiden
liposomalen Doxorubicinformulierungen. Doxorubicin, das in Liposomen
gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten geladen wurde, ist cytotoxischer
als wenn es in Liposomen gegen Ammoniumsulfatgradienten geladen
wurde, was darauf hin deutet, daß das Arzneimittel bioverfügbarer aus
einem Glucuronatsalz als aus einem Sulfatsalz ist. Tabelle 1: Werte für die inhibitorische Konzentration
(IC50)
IC50 (μM) |
Zellinie | F-DOX | Lipo-DOX-AS | Lipo-DOX-AG |
M109-S | 0,56 | 9,8 | 1,4 |
M109-R | 2,00 | > 300 | 28,0 |
KB | 0,04 | 7,6 | 1,4 |
KB-V | 0,69 | > 300 | 21,0 |
C26 | 0,96 | > 200 | 64,0 |
-
Daß Lipo-dox-AG
cytotoxischer ist als Lipo-dox-AS wird des weiteren durch die Inhibitionskurven
in 1A bis 1E gezeigt,
die die Wachstumsrate der Zellen als Prozent der Zellen, die nicht
mit Arzneimittel behandelt wurden (Kontrolle), gegen die Menge an
Doxorubicin, das zu dem Wachstumsmedium gegeben wurde, zeigen. 1A bis 1E zeigen
die Inhibitionskurven für
die Mauszellinien M109-S (1A), M109-R
(1B) und die humanen Zellinien C-26 (1C),
KB (1D) und KB-V (1E). Die
Doxorubicin-Konzentration in nM der verschiedenen Formulierungen
ist dargestellt als freies Doxorubicin (Kreise), Lipo-dox-AG (Quadrate)
und Lipo-dox-AS (Dreiecke). Alle Arzneimittelformulierungen bei
Doxorubicin-Konzentrationen zwischen 102 bis
106 sind gegenüber jeder getesteten Zellinie
cytotoxisch. In allen Fällen
mit Veränderungen
in der Inhibition der Wachstumsrate war Lipo-dox-AG cytotoxischer
als Lipo-dox-AS, was zeigt, daß das
Arzneimittel aus der liposomalen Ammoniumglucuronat-Plattform schneller
bioverfügbar
war als Arzneimittel aus der liposomalen Ammoniumsulfat-Plattform.
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B. In vitro Arzneimittelaufnahme von Tumorzellen
-
In
vitro Anreicherung von Doxorubicin in Maustumorzellen wurde mittels
Exposition von KB, KB-V und M109-R Zellen gegenüber freiem Doxorubicin, Lipodox-AS
oder Lipo-dox-AG für
1, 5 und 24 Stunden, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung. Es gibt eine größere Arzneimittelanreicherung
in Zellen, die mit Lipo-dox-AG als in denen, die mit Lipo dox-AS
behandelt wurden. Dies ist in Übereinstimmung
mit den in vitro Cytotoxizitätsergebnissen,
die oben beschrieben sind (
1A bis
1E),
die zeigen, daß das
Lipo-dox-AG cytotoxischer als das Lipo-dox-AS ist. Tabelle 2: In vitro Aufnahme von Doxorubicin
in Tumorzellen
Doxorubicin
Aufnahme (ng DOX/106 Zellen) |
Zellinie,
Expositionszeit | Freies DOX | Lipo-DOX-AS | Lipo-DOX-AG |
KB,
1 Std. | 426
(33) | 5,0
(0,4) | 7,8
(0,6) |
KB,
5 Std. | 937
(46) | 8,8
(0.4) | 15,0
(0,4) |
KB,
24 Std. | 840
(15) | 24,0
(1) | 154,0
(9) |
KB-V,
1 Std. | 311
(22) | 5,4
(0,8) | 9,6
(1,5) |
KB-V,
5 Std. | 931
(21) | 12,3
(1,2) | 18,0
(0,8) |
M109-R,
24 Std. | 80
(3) | 7,0
(2) | 25,0
(5) |
-
C. In vitro Verlust im Plasma
-
Um
den in vitro Verlust des Liposomen-eingeschlossenen Arzneimittels
im Plasma zu bestimmen, wurden Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG in 90%
humanem Plasma bei 37°C
unter kontinuierlichem Schütteln
in Inkubationsbehältern,
die Dowex Kation-Austauscherharzkügelchen enthielten, inkubiert.
Die Harzkügelchen binden
freigesetztes Arzneimittel entweder frei oder Protein-gebunden.
Zu vorherbestimmten Intervallen werden Proben zur sauren Alkoholextraktion
und fluorimetrischer Bestimmung der Fraktion an Arzneimittel genommen,
die mit Liposomen assoziiert bleibt (d. h. die nicht durch Harzkügelchen
abgefangen sind).
-
Die
Ergebnisse sind in 2 gezeigt und weisen darauf
hin, daß Doxorubicin
aus Lipo-dox-AG aus dem Liposom schneller ist als das Arzneimittel
aus Lipo-dox-AS.
-
Die
Unterschiede zwischen den zwei Präparationen beginnen offenkundig
nach 24 Stunden nach der Inkubation. Am Ende der Inkubation (96
Std.) hat Lipo-dox-AG etwa zweimal so viel Doxorubicin als Lipo-dox-AS
(–80%
gegen 40%) freigesetzt.
-
III. In vivo Charakterisierung
-
A. Plasma-Clearance
-
Die
Pharmakokinetiken von Doxorubicin, das in Liposomen durch Beladung
gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten eingeschlossen ist, wird
mit 3 Monate alten weiblichen BALB/c Mäusen bestimmt. Wie in Beispiel
3A beschrieben werden Liposomen, in denen Doxorubicin gegen Ammoniumsulfat
oder Ammoniumglucuronat geladen wurde, intravenös in die Mäuse injiziert. Blutproben wurden
zu bestimmten Zeitpunkten genommen und auf ihre Doxorubicin-Konzentration analysiert. 3 zeigt
die Plasma-Doxorubicin-Konzentration bei Mäusen, die mit Lipo-Dox-AG (quer
schraffierte Balken) oder mit Lipo-Dox-AS (gepunktete Balken) behandelt
wurden. Die Halbwertszeit von Doxorubicin, wenn es in Form einer
Lipo-dox-AG-Plattform verabreicht wurde, beträgt ungefähr 16 Stunden, während die
von Doxorubicin, das aus einer Lipo-dox-AG-Plattform verabreicht
wurde, ungefähr
24 Stunden beträgt.
Es ist also ersichtlich, daß Lipodox-AG
schneller weniger wird als Lipo-dox-AS. Die Lipo-dox-AG Blutkonzentrationen
sind 25% niedriger bei 4 Stunden nach intravenöser Verabreichung, 33% niedriger
bei 24 Stunden und nahezu 50% niedriger bei 48 Stunden nach intravenöser Verabreichung.
Weil die Zusammensetzung und die Größe der Liposomen identisch
sind, sollte die Rate der Aufnahme durch das reticuloendotheliale
System (RES.) ähnlich
sein. Demgemäß ist die
schnellere Clearance wahrscheinlich das Ergebnis einer schnelleren
Freisetzungsrate in vivo des Doxorubicins aus der Lipo-dox-AG-Formulierung,
was mit den in vitro Experimenten übereinstimmt.
-
B. In vivo therapeutische Aktivität
-
Um
zu bestimmen, ob die schnellere Clearance von Doxorubicin, wenn
es aus Liposomen verabreicht wird, die ein Doxorubicin-Glucuronat-Salz
enthalten, eine Auswirkung auf die therapeutische Effizienz hat,
werden die liposomalen Formulierungen tumor-tragenden Mäusen verabreicht.
-
Wie
in Beispiel 3B beschrieben, werden Mäuse mit M109S-Tumor-Zellen
(106 Zellen) inokuliert und mit einer einzelnen
Dosis Doxorubicin mit 10 mg/kg entweder als freies Doxorubicin,
Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG nach der Tumor-Inokulation behandelt. 4 zeigt
den Mittelwert (n = 10) der Dicke von Fußballen in mm gegen die Tage
nach Doxorubicin-Behandlung. Beide liposomalen Präparationen
sind in der Suppression des Tumorwachstums effektiver als das freie
Arzneimittel (Kreise). Es gibt eine kleine, aber signifikante Verbesserung
der Effizienz, wenn Mäuse
mit Lipo-dox-AG (Quadrate) verglichen mit Lipo-dox-AS (Dreiecke) behandelt
werden.
-
In
einer anderen Untersuchung, ebenfalls in Beispiel 3B beschrieben,
werden Mäuse
mit M109R-Zellen (106 Zellen) inokuliert.
Zehn Tage nach der Inokulation werden die Mäuse entweder mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS
oder Lipo-dox-AS
mit einer Dosis von 8 mg/kg behandelt. Die gleiche Dosis wurde erneut
eine Woche und drei Wochen später
verabreicht. 5 zeigt den Mittelwert (n =
10) der Dicke der Fußballen
in mm gegen die Tage nach Doxorubicin-Behandlung. Beide liposomalen
Präparationen
(Dreiecke, offene Quadate) sind in der Inhibierung des Tumorwachstums
effektiver als das freie Arzneimittel (Kreise), trotz des progressiven
Tumorwachstums in allen Testgruppen, wahrscheinlich in Folge der
resistenten Natur dieses Tumors.
-
In
einer weiteren Untersuchung, ebenfalls in Beispiel 3B beschrieben,
werden Mäuse
mit C-26-Zellen (106 Zellen) inokuliert,
um einen Tumor zu induzieren und fünf Tage nach der Inokulation
werden die Mäuse entweder
mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AS mit einer Dosis
von 10 mg/kg behandelt. 6 zeigt die Zahl der überlebenden
Mäuse als
eine Funktion der Zeit nach Tumor-Inokulation. Unbehandelte(Kontroll-)Mäuse starben
schnell mit einem mittleren Überleben
von 13 Tagen (nicht gezeigt). Mäuse,
die mit freiem Doxorubicin (Kreise) behandelt wurden, zeigten einen
vernachlässigbaren
Anstieg beim Mittelwert der Überlebenszeit
(4 Tage mehr als die Kontrolle, d. h. 17 Tage). Beide liposomalen
Präparationen
(Quadrate, Dreiecke) sind bei der Verlängerung der Überlebenszeit
von tumortragenden Mäusen
effektiver als das freie Doxorubicin.
-
Alle
obigen Modelle sind Tumore vom Karzinoma-Typ. Ein zusätzliches
getestetes Modell (Ergebnisse nicht gezeigt) war das J6456-Lymphom
aus BALG/c Mäusen
mit einem experimentellen Design ähnlich der des C-26-Modells
(intraperitoneal 106 Tumorzellen, intravenöse Therapie
mit einer Dosis von 10 mg/kg an Tag 5 nach Tumor-Inokulation). Die
liposomalen Formulierungen sind effektiver als das freie Arzneimittel,
ohne signifikante Unterschiede zwischen der Überlebenszeit der Mäuse nach
Behandlung mit Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG.
-
Aus
dem vorstehenden kann erkannt werden, wie verschiedene Aufgaben
und Ausgestaltungen der Erfindung getroffen wurden. Liposomen, die
ein Arzneimittel in der Form eines Glucuronatsalzes eingeschlossen
haben, stellen eine höhere
Freisetzungsrate des Arzneimittels bereit, als dies bei einem ähnlichen
Liposom, der Fall ist, das das Arzneimittel in der Form eines Sulfatsalzes
eingeschlossen hat, ohne signifikanten Effekt der Arzneimitteleffizienz.
Klinische Daten mit Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin (Doxil®)
deuten darauf hin, daß die
Dauer und Schwere von PPE mit einer Verkürzung der Zirkulationshalbwertzeit
von Doxil® abnehmen,
die schnellere Freisetzung und die kürzere Zirkulation von Doxorubicin
in der Form von Lipo-dox-AG stellen eine gute Alternative zur Doxorubicinabgabe
bereit. Es ist anzumerken, daß die
Ergebnisse, die für
Doxorubicin spezifisch sind, auf andere Arzneimittel, die fähig sind,
gegen einen Ammoniumgradienten ferngeladen zu werden, wie denen,
die hier beschrieben sind, ausgedehnt werden können.
-
IV. Beispiele
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen des weiteren die hier beschriebene
Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
-
Beispiel 1
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Liposomenpräparation und Beladung
-
A. Liposomenpräparation
-
Liposomen,
die Ammoniumglucuronat in den wässerigen
Kompartimenten enthalten, werden wie folgt hergestellt. Die Lipidkomponente,
hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin
(HSPC), Cholesterin und Methoxy-bedecktes Polyethylenglykol derivatisiertes
Distearylphosphatidylethanolamin (mPEG(200)-DSPE) in einem molaren
Verhältnis
von 92,5:70:7,5 wurden in Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit einem
Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck abgezogen, was danach
zu einem trockenen Lipidfilm führt.
Der getrocknete dünne
Lipidfilm wurde mit 250 mM wässerigeR
Ammoniumglucuronatpufferlösung
(pH 5,5) hydratisiert, wobei Liposomen mit Ammoniumglucuronat in
den inneren wässerigen
Kompartimenten gebildet wurden; und in einem wässerigen externen Ammoniumglucuronat-Grundmedium
suspendiert. Die Liposomengröße wurde
dann mittels Extrusion durch Membranen mit einer Porengröße von 0,5 μm eingestellt.
-
Nach
der Extrusion wurde der externe Ammoniumglucuroatpuffer mittels
Dialyse gegen einen Dialysepuffer enthaltend 5% Dextrose und 15
mM HEPES pH 7 ausgetauscht.
-
Eine
Vergleichsliposomenformulierung enthaltend 250 mM Ammoniumsulfat
in den inneren wässerigen
Kompartimenten wurde in ähnlicher
Weise mit 250 μm
Ammoniumsulfat als Hydratationspuffer hergestellt. Die so erhaltenen
Chargen waren den Ammoniumglucuronatpräparationen in Vesikelgröße, Arzneimittelbeladungseffizienz
und dem Arzneimittel-zu-Phospholid-Verhältnis vergleichbar.
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B. Fernbeladung (Remote Loading)
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Doxorubicin
wurde in die Liposomen gebracht, die Ammoniumglucuronat (Lipodox-AG)
enthielten und in die Liposomen, die Ammoniumsulfat (Lipo-dox-AS) enthielten,
wobei die Liposomen, die unter A. hergestellt wurden, mit einer
Lösung
Doxorubicin für
1 Stunde bei 60°C
inkubiert wurden. Die Verkapselung von Doxorubicin führte zu
einer Effizienz von > 90%.
Das endgültige
Arzneimittel-zu-Phospholipid-Verhältnis war
100–150 μg/μmol.
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Freies
Doxorubicin (d. h. Doxorubicin, das nicht in einem Liposom eingeschlossen
war) in dem externen Grundmedium wurde mittels Chromatographie auf
eine Sephadex G-50 Säule
durch Elution mit entgastem Dextrose-HEPES-Puffer entfernt.
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Beispiel 2
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In vitro Charakterisierung
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A. In vitro Toxizität
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Freies
Doxorubicin und liposomale Formulierungen des Doxorubicins, die
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, wurden gegen 5
Maus- und humane Tumorzellinien (M109-S, M109-R, C-26, KB, KB-V)
getestet.
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Zellen
von jeder Zellinie wurden kontinuierlich dem Arzneimittel für 72 Stunden
ausgesetzt. Weitere experimentelle Details sind von Hornwitz et
al., Biochim Biophys Acta 1109 (2): 203 (1992) beschrieben. Kurz gesagt,
5 × 103 Zellen aus exponentiell wachsenden Kulturen
in 200 μl
Aliquots wurden auf 96-Well-Mikrotiterplatten
mit flachem Boden gegeben. Nach 20 Stunden in Kultur, während dessen
die Zellen anheften und das Wachstum fortsetzen, werden 20 μl jeder der
zu testenden Arzneimittelformulierungen (freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS,
Lipodox-AG) in jedes Well gegeben. Für jeden 10fachen Anstieg in
der Arzneimittelkonzentration werden 6 Arzneimittelkonzentrationspunkte
gemessen. Jeder Test wurde in dreifachen Wellkulturen und zwei parallelen
Platten durchgeführt.
Die Zellen wurden kontinuierlich für 72 Stunden behandelt. Die
Kulturen wurden durch Zugabe von 50 μl 2,5% Glutaraldehyd zu jedem
Well für
10 Minuten fixiert. Die Platten wurden dreimal mit deionisiertem
Wasser, einmal mit 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) gewaschen und dann
für 60
Minuten mit 100 μl
Methylenblau (1% in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5) bei Raumtemperatur
gefärbt.
Die Platten wurden in fünf Bädern mit
deionisiertem Wasser gespült,
um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen und wurden dann
getrocknet. Der Farbstoff wurde mit 200 μl 0,1 M HCl für 60 Minuten
bei 37°C
extrahiert und die optische Dichte wurde unter Verwendung eines
Mikroplatten-Spektrophotometers gemessen.
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Die
Wachstumsrate wurde durch Teilen der Verdopplungszeit von Arzneimittelbehandelten
Zellen durch die der Kontrollzellen berechnet. Die Arzneimittelkonzentration,
die eine 50%ige Inhibition der Kontrollzellenwachstumsrate (IC50)
bewirkt, wurde durch Interpolation der zwei am nächsten liegenden Werte der Wachstumsinhibitionskurve
berechnet.
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Tabelle
1 zeigt die IC50-Werte für
freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG für
jede der Zellinien und die entsprechenden Wachtumskurven sind in
den 1A bis 1E gezeigt.
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B. In vitro Arneimittelaufnahme
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Zelluläre Akkumulation
von Doxorubicin wurde mit einem Verfahren untersucht, das ähnlich dem
in Chambers, S. K. et al, Cancer Res., 49: 6275–6279 (1989) beschriebenen
ist. Monoschichten von KB-, KB-V- und M109-R-Zellen (exponentielle
Wachstumskulturen von etwa 106 Zellen in
35 mm Platten) wurden mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG
für 1,
5 und 24 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen
dreimal mit PBS gespült
und das Arzneimittel aus den Zellen mit 1 ml angesäuertem Isopropanol (0,075
M HCl in 90% Isopropanol) für
20 Stunden bei 4°C
extrahiert. Die Doxorubicin-Konzentration
wurde spektrofluorimetrisch mit eine Anregungswellenlänge von
470 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm bestimmt. Die
emittierte Fluoreszenzintensität
wurde in Doxorubicin-Äquivalente,
basierend auf einer Doxorubicin-Standardkurve, übertragen, nachdem die Ablesung
von unbehandelten Hintergrundzellen subtrahiert war.
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Das
Ergebnis der Arzneimittelaufnahm durch die KB-, KB-V- und M109-R-Zellen
nach Exposition mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG
nach 1, 5 und 24 Stunden ist in Tabelle 2 gezeigt.
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C. In vitro Plasma-Austritt
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Materialien
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Lipo-dox-AS
und Lipo-dox-AG wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer
Konzentration von > 500 μg Doxorubicin/ml
hergestellt.
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2
ml 50% Dowex® Kationaustauschharzkügelchen
(Sigma, 50 W-Wasserstoff, 50% in Salzlösung vorgereinigt) wurden zu
15 ml Gewebekultur-Rundbodenröhrchen aus
Plastik gegeben. Die Röhrchen
wurden für 15
Min. bei 2000 Upm (859 g) zentrifugiert und dann wurde die Flüssigkeit
dekantiert. Die liposomalen Präparationen
wurden mit humanem Plasma auf ungefähr 5 μg Doxorubicin/ml in 90% humanem
Plasma verdünnt. Doppelte
Röhrchen
wurden für
jede liposomale Präparation
präpariert
und Röhrchen,
die die liposomalen Präparationen
ohne Dowex Harzkügelchen
enthielten, wurden präpariert.
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Eine
saure Isopropanol-Lösung
wurde aus 10% 0,75 N HCl in 90% Isopropanol Volumen/Volumen hergestellt.
Die Reagentien waren Chemikalien von Reagenzgrad, die von Sigma
bezogen wurden.
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Alle
in dieser Untersuchung verwendeten Materialien waren steril, und
alle Versuche wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Assay
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Dowex® Kationaustauschharzkügelchen
binden Doxorubicin in humanem Plasma, ob das Arzneimittel frei oder
Protein-gebunden ist. In diesem Assay werden Lipodox-AG und Lipo-dox-AS
in Röhrchen,
die Harzkügelchen
und humanes Plasma (wie oben beschrieben) enthalten, bei 37°C unter kontinuierlichem
Schütteln mit
einer Rotationsschüttelvorrichtung
zur Verhinderung der Sedimentation der Harzkügelchen inkubiert. Zu vorbestimmten
Zeitintervallen wurden Proben für
die saure Alkoholextraktion und zur fluorimetrischen Bestimmung
der Fraktion von Arzneimittel, das mit Liposomen verbunden verbleibt
(d. h. nicht durch die Harzkügelchen
eingefangen wurde). Dem nachfolgenden schrittweisen Protokoll für die Analyse
wurde gefolgt.
- 1. Zugabe von 30 ml humanem
Plasma in ein 50 ml Röhrchen.
- 2. Zugabe von 2 ml 50% sterilen Dowex® Harzkügelchen
in Salzlösung
zu den Zentrifugationsröhrchen
(15 ml, Plastikrundboden) und Zentrifugation für 10 Min. bei 2000 Upm (850
g). Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit
aus den Zentrifugenröhrchen.
- 3. Verwendung der liposomalen Präparationen, die in Beispiel
1 beschrieben sind, Zugabe einer Menge der Liposomensuspension zu
den 50 ml Röhrchen
enthaltend 30 ml humanes Plasma, um eine Stammlösung mit einer Endkonzentration
von 5 μg/ml
Doxorubicin zu erhalten.
- 4. Zugabe von 9 ml der liposomalen Suspensions-Stammlösung mit
5 μg/ml
Doxorubicin in jedes der Zentrifugenröhrchen, das Harzkügelchen
enthält
(Röhrchen
Nr. A, B) und Zugabe von 10 ml der liposomalen Stammlösung in
ein Röhrchen
ohne Harzkügelchen
(Röhrchen
Nr. C). Mischen.
- 5. Entnehmen von 1 ml Aliquots aus jedem Röhrchen (A, B, C) und Zentrifugation
für 3 Min.
bei 14000 Upm. Entnehmen von 200 μl
des Überstandes
für einen
Wert zum Zeitpunkt Null und Einfrieren der Proben bei –20°C bis zur
Analyse.
- 6. Inkubation der Röhrchen
bei 37°C
unter kontinuierlichem Schütteln
mit einer Rotationsschüttelvorrichtung,
die die Röhrchen
um 360° bei
geringer Bewegung umgreift und rotieren läßt, mit einer ausreichenden Geschwindigkeit,
um die Sedimentation der Harzkügelchen
zu verhindern.
- 7. Entnehmen eines 1 ml Aliquots aus jedem der Röhrchen nach
1, 4, 24, 48, 72 und 96 Stunden. Zentrifugation jedes Aliquots bei
14000 Upm für
3 Minuten, Entnehmen eines 20 μl
Aliquots des klaren Überstandes.
Einfrieren des Aliquots bei etwa –20°C bis zur Analyse.
- 8. Zur Analyse der Proben, werden 1,8 ml gesäuertes Isopropanol zu den 20 μl Proben
gegeben, um Doxorubicin aus den Liposomen zu extrahieren. Die Proben
werden über
Nacht bei 4°C
inkubiert, und dann zur Entfernung des Präzipitats (2000 Upm für 10 Minuten)
zentrifugiert. Die klaren Überstände werden
in einem Spektrofluorimeter, ausgestattet mit Hochwellenlängenphotomultiplier,
Anregung bei 470 nm und Emission bei 590 nm, untersucht. Die Doxorubicin-Konzentration
wurden basierend auf einer Standardkalibierungskurve bestimmt, wobei
die erhaltene Konzentration die Menge an Doxorubicin darstellt,
die in Liposomen zurückbehalten
wurde.
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Die
Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
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Beispiel 3
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In vivo Charakterisierung
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A. In vivo Plasma-Clearance-Rate
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Drei
Monate alten weiblichen BALB/c Mäusen
wurden intravenös
10 mg/kg entweder Lipo-dox-AG oder Lipo-dox-AS injiziert, die wie
in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden. Blutproben wurden
nach 4, 24 und 48 Stunden nach der Injektion zur Analyse des Plasmadoxorubicinlevels
genommen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
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B. In vivo therapeutische Aktivität
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Dreißig Mäusen wurden
die Fußballen
mit M109-S-Zellen (106 Zellen) inokuliert.
Sieben Tage später, wenn
die Dicke der Fußballen
von einem normalen Wert von ungefähr 1,5 mm auf einen Durchschnitt
von 2.0 bis 2,5 mm angestiegen war, wurden die Mäuse in drei Gruppen zu je 10
aufgeteilt und den Mausgruppen wurden intravenös entweder freies Doxorubicin,
Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis von 10 mg/kg.
Danach wurde die Dicke der Fußballen
zweimal die Woche mit einem Zirkel gemessen, um das Tumorwachstum
und den Effekt der Therapie zu verfolgen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
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In
einer separaten Untersuchung wurden dreißig Mäusen die Fußballen mit M109-R-Zellen (106 Zellen) inokuliert. Zehn Tage später, wenn
die Dicke der Fußballen von
einem normalen Wert von ungefähr
1,5 mm auf einen Durchschnitt von 2.0 bis 2,5 mm angestiegen war,
wurden die Mäuse
in drei Gruppen zu je 10 aufgeteilt und den Mausgruppen wurden intravenös entweder
freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS
oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis von 8 mg/kg. Zwei zusätzliche
Injektionen wurden in der gleichen Dosis 1 Woche und 3 Wochen später gegeben.
Die Dicke der Fußballen
wurde zweimal die Woche mit einem Zirkel gemessen und die Ergebnisse
sind in 5 gezeigt.
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In
einer weiteren Untersuchung wurden Mäuse mit C-26-Zellen i. p. (106 Zellen) inokuliert. Fünf Tage später wurden die Mäuse in drei
Gruppen zu je 10 aufgeteilt und jeder Gruppe wurden intravenös entweder freies
Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis
von 10 mg/kg. Das Überleben
dieser Mäuse
wurde verfolgt und die Überlebenskurven
sind in 6 gezeigt.
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Obwohl
die Erfindung in Hinblick auf besondere Ausführungsformen beschrieben wurde,
ist es für
den Fachmann klar, daß verschiedene Änderungen
und Abänderungen
gemacht werden können,
ohne sich von der Erfindung zu entfernen.