DE602004011982T2 - Verfahren zur Beladung von therapeutischen Mitteln in vorgeformte Liposomen und das dabei erhaltene Produkt - Google Patents

Verfahren zur Beladung von therapeutischen Mitteln in vorgeformte Liposomen und das dabei erhaltene Produkt Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beladung von therapeutischen Mitteln in vorgeformte Liposomen und das dabei erhaltene Produkt, insbesondere zur Beladung von protonierbaren Verbindungen mit einem Ammoniumionengradienten, der Glucuranat als Ausgleichsanion hat.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Abgabe von therapeutischen Mitteln über liposomale Zusammensetzungen hat die Arzneimittelpharmakokinetiken und -biodistribution von einigen Mittel drastische verändert (Martin, F. M., in MEDICAL APPLICATION OF LIPOSOMES, Lasic, D. D. und Papahadjopaulos, eds., S. 635–88, Elsevier, Amsterdam (1998)). Zum Beispiel zeigt Doxorubicin, das für seine dosislimitierende Kardialtoxizität bekannt ist, keine offenkundige (klinische und funktionelle) Kardialtoxizität in Patienten mit festen Tumoren, wenn es in Liposomen eingeschlossen verabreicht wird (Doxil®, ALZA Corporation, Mountain View, CA; Uziely, B. et al., J. Clin. Onco., 13: 1777–1785 (1995), Working, P. K. et al., J. Pharmaco. Exp. Ther., 289: 1128–1133 (1999)). Eine Kardialbiopsieuntersuchung von Patienten mit dem Acquired immune deficiency Syndrome-(AIDS)-verwandten Kaposi Sarkom (KS), die große kumulative Dosierungen von Doxil® erhielten, zeigten keine Gewebeschädigung, was darauf hindeutet, daß die liposomale Formulierung eine kardioprotektive Wirkung auf das Doxorubicin haben könnte (Berry, G. et al, Ann. Oncol., 9: 71–76 (1998)). Das Fehlen von Kardialtoxizität ist teilweise auf die lange Zirkulationshalbwertzeit von Liposomen (Polyethylenglykol-beschichtete Liposomen, bekannt als Stealth®, ALZA Corporation, Mountain View, CA) und die stabile Arzneimittelretention zurückzuführen, so daß der Großteil der verabreichten Dosis das Gewebe in liposom-eingeschlossener Form erreicht, bei der nur eine minimale Menge an Arzneimittel (< 5%) aus den Liposomen während der Zirkulation austritt und in dem Gewebe als freies Arzneimittel verteilt wird (Martin, F. M., supra (1998; Gabizon, A. et al., Cancer Res., 54: 987–92 (1994)).
  • Es ist bekannt, daß langzeitzirkulierende Liposomen vorzugsweise (10fach) in Gewebe mit erhöhter mikrovaskulärer Permeabilität akkumulieren, was die meisten Tumore mit aktiver Neoangiogenese einschließt (Wu, N. Z., et al. Cancer Res., 53: 3765–3770 (1993); Yuan, F. et al., Cancer Res, 54: 3352–3356 (1994)). Langzeitzirkulierende Liposomen akkumulieren auch in verschiedenen gesunden und anfälligen Geweben, zum Beispiel der Haut (Gabizon, A., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 24: 337–344 (1997)) und wahrscheinlich in Schleimhäuten. Bei längerer Exposition kann die Akkumulierung von Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin in der Haut Palmar-Plantar-Erythrodysestheresie (PPE, auch als "hand-foot-Syndrom" bekannt; Lyass et al., Cancer 89: 1037–1047 (2000)) verursachen. Der Ausbruch von PPE kann durch die Verlängerung der Dosierungsintervalle verhindert werden, jedoch können die Veränderungen der Dosierung und/oder des Zeitplans die Wirksamkeit gegenüber Tumoren, z. B. Brustkarzinom reduzieren (Lyass et al., supra (2000), Ranson, M. R. et al., J. Clin. Oncol., 15: 3185–3191 (1997)).
  • Aktuelle vorklinische und klinische Daten bezüglich der Langzeitzirkulation von Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin (Doxil®) deuten darauf hin, daß eine unbedeutende Abgabe von Arzneimittel aus den zirkulierenden Liposomen auftritt (< 5% der injizierten Dosis). Wenn die Liposomen einmal in die extrazelluläre Gewebeflüssigkeit ausgetreten sind, ist wenig über die Prozesse, mit denen die Arzneimittelabgabe bestimmt wird, bekannt. Es wird angenommen, daß ein gradueller Verlust des Protongradienten, der das Arzneimittel zurückhält, enzymatische Beschädigung von liposomalen Phospholipiden durch Phospholipasen und/oder Endozytose durch Scavengermakrophagen wahrscheinlich dazu beitragen, das Arzneimittel freizusetzen. Doxorubicin bildet, wenn es in kommerziell verfügbaren liposomalen Doxil®-Formen eingeschlossen ist, ein Salz mit dem zweiwertigen Sulfatanion. Das Salz fällt aus oder geliert infolge seiner geringen Löslichkeit in dem wässerigen inneren liposomalen Kompartiment. Diese Gelbildung stabilisiert das eingeschlossene Doxorubicin in dem Lipid-Vesikel und verhindert seine Abflußrate.
  • Die Änderung des Fassungsvermögens des Anions auf das Doxorubicin könnte eine Hauptauswirkung auf die Rate der Arzneimittelfreisetzung haben. Zum Beispiel könnte die Beschleunigung der Rate der Arzneimittelfreisetzung aus Doxil®-Liposomen, ohne Wechselwirkung mit ihrer Langzeitzirkulation und Tumorzieleigenschaften, aus den folgenden Gründen wichtig sein: (1) die Tumorinhibitionsaktivität kann aufgrund der zeitintensiveren Exposition der Tumore gegenüber dem Arzneimittel ansteigen, und (2) die Hauttoxizität kann abnehmen, weil diese Art der Toxizität hauptsächlich eine Funktion der längeren Exposition des Hautgewebes gegenüber dem Arzneimittel ist.
  • Demgemäß wird eine Liposomzusammensetzung, die die Abgabe einer eingeschlossenen Verbindung und insbesondere von Doxorubucin aus Liposomen variiert, gewünscht. Ein Verfahren zur Verkapselung therapeutischer Verbindungen in vorgeformte Liposomen, das die Vorteile des Ammoniumsulfatgradienten behält, z. B. Wirksamkeit und Stabilität, ist wünschenwert, die es sogar ermöglicht, daß die eingeschlossene Verbindung in einer höheren Rate freigesetzt wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung eine liposomale Zusammensetzung, Liposomen, die Vesikel-bildende Lipide umfassen, und ein eingeschlossenes ionisierbares therapeutisches Mittel in Verbindung mit einem Glucuronatanion bereit. Das so geladene therapeutische Mittel hat eine höhere Freisetzungsrate als das, das durch einen Ammoniumgradienten mit Sulfat als Balance oder Gegenanion geladen ist.
  • In einer Ausführungsform sind die Vesikel-bildenden Lipide, die die Liposomen bilden, Phospholipide. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Liposomen des weiteren zwischen etwa 1 bis 20 Molprozent eines Vesikelbildenden Lipids, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert ist, wie zum Beispiel Polyethylenglykol.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Vesikel-bildende Lipid hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) und das mit einem hydrophilen Polymer derivatisierte Vesikel-bildende Lipid ist mit Polyethylenglykol derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE). Eine beispielhafte Verbindung ist HSPC, Cholesterin und DSPE-PEG in einem molaren Verhältnis von 92,5:70:7,5.
  • In einer noch anderen Ausführungsform ist das therapeutische Mittel ein Anthracyclinantibiotikum. Beispielhafte Anthracyclinantibiotika schließen Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin ein.
  • Die oben beschriebene Verbindung wird verwendet, um unter einem anderen Aspekt einen Patienten zu behandeln. Die Verbindung wird verwendet, um unter einem anderen Aspekt einen Tumor in einem Patienten zu behandeln.
  • Unter einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Liposomen mit einem eingeschlossenen therapeutischen Mittel ein, wobei das therapeutische Mittel in vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumionengradienten mit Sulfat als Gegenion beladen wird. Die Verbesserung umfaßt die Beladung des ionisierbaren therapeutischen Mittels in Liposomen mit einem Ammoniumionengradienten mit Glucuronat als einem Gegenion.
  • Bei diesem verbesserten Verfahren schließt die Beladung die Herstellung einer Suspension aus Liposomen ein, jedes Liposom hat wenigstens ein inneres wässeriges Kompartiment, das in einer Ausführungsform Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration enthält.
  • In einer anderen Ausführungsform schließt das verbesserte Verfahren die Herstellung einer Suspension aus Liposomen ein, die in einem externen Grundmedium mit einer zweiten Konzentration Ammoniumglucuronat suspendiert sind, wobei die erste Konzentration höher ist als die zweite Konzentration, wodurch ein Ammoniumionengradient über die Lipiddoppelschicht der Liposomen geschaffen wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform schließt das verbesserte Verfahren die Zugabe einer Menge des therapeutischen Mittels zu der Liposomensuspension ein.
  • In einem anderen Aspekt schließt das Verfahren die Herstellung von Liposomen ein, umfassend die Bildung von Liposomen mit einem inneren Kompartiment und einer Doppelschichtlipidmembran ein. Die Liposomen haben einen Konzentrationsgradienten mit Ammoniumglucuronat über ihre Doppelschichtlipidmembranen. Die Liposomen sind mit einem ionisierbaren therapeutischen Mittel in Kontakt gebracht, um den Transport des Mittels in das innere Kompartiment zu erreichen.
  • In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren (i) die Herstellung einer Suspension mit Liposomen, jedes Liposom in der Suspension hat wenigstens ein inneres wässeriges Kompartiment, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration enthält, die Liposomen sind in einem externen Grundmedium suspendiert, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration umfaßt; (ii) Reduzierung der ersten Konzentration an Ammoniumglucuronat in dem externen Grundmedium auf eine niedrigere zweite Konzentration an Ammoniumglucuronat, wodurch ein Konzentrationsgradient von Ammoniumionen über die Lipiddoppelschichten der Liposomen geschaffen wird.
  • In verschiedenen Ausführungsformen wird der Schritt der Reduzierung durch Verdünnung, Dialyse, Diafiltration oder Ionenaustausch erreicht.
  • Unter noch einem anderen Aspekt schließt die Erfindung ein Verfahren zur Zuführung einer protonierbaren Verbindung in vorgeformte Liposomen ein, umfassend die Herstellung einer Suspension mit Liposomen mit einer größeren Konzentration an Ammoniumglucuronat innerhalb als außerhalb der Liposomen, wodurch ein Konzentrationsgradient von Ammoniumionen vom Innern zum Äußern der Liposomen geschaffen wird. Der Gradient ist zum aktiven Transport der protonierbaren Verbindung in Richtung auf das Innere der Liposomen in der Lage. Das Verfahren schließt auch die Zugabe einer Menge der protonierbaren Verbindung zu der Suspension ein, und ermöglicht, daß die protonierbare Verbindung in die Liposomen transportiert wird, um einen Gehalt der protonierbaren Verbindung innerhalb der Liposomen zu erreichen, der größer als der außerhalb der Liposomen ist.
  • In einer Ausführungsform schließt das Verfahren die Bildung der Liposomen in Gegenwart einer Ammoniumglucuronatlösung mit einer ersten Konzentration und das Einschließen der Ammoniumglucuronatlösung mit der ersten Konzentration im Innern der Liposomen und die Reduzierung der ersten Konzentration der Ammoniumglucuronatlösung außerhalb der Liposomen auf eine zweite Konzentration, die geringer ist als die erste Konzentration, ein.
  • Das Verfahren der Erfindung hat eine hohe Beladungseffizienz. In einer Ausführungsform werden mehr als 50% der Menge an protonierbarer Verbindung, die zu der Suspension zugefügt ist, in das Innere der Liposomen transportiert. In einer anderen Ausführungsform werden ungefähr 90% der Menge an protonierbarer Verbindung, die zu der Suspension zugefügt sind, in das Innere der Liposomen transportiert. In besonderen Ausführungsformen ist die Beladungseffizienz für Doxorubicin mehr als 90% und das Verhältnis von Doxorubicin zu Phospholipid liegt im Bereich von etwa 100 bis 150 μg/μmol.
  • Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden vollständiger verstanden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1A bis 1E sind Wachstumsinhibitionskurven, die die Wachtumsrate als Prozent von unbehandelten Kontrollzellen der Mauszellinien M109ST (1A), M109R (1B) und von humanen Zellinien C-26 (1C), KB (1D) und KB-V (1E) gegen die Doxorubicin-Konzentration (in nM), nach Behandlung mit freiem Doxorubicin (Kreise), Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten, (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde, graphisch darstellen;
  • 2 zeigt die in vitro-Verlustrate von Doxorubicin aus Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten, (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde;
  • 3 ist ein Balkendiagramm, das die Doxorubicinkonzentration (μg/ml) in Mausplasma zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion von Liposomen, die Doxorubicin enthalten, zeigt, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (gepunktete Balken) oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (schraffierte Balken) geladen wurde;
  • 4 ist ein Plot von Mittelwerten der Dicke von Fußballen (foodpad) in mm in Mäusen, die mit M109-S-Zellen inokuliert wurden als eine Funktion von Tagen nach Behandlung mit Salzlösung (geschlossene Quadrate), freiem Doxurubicin (Kreise) oder Doxorubicin eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde;
  • 5 ist ein Plot von Mittelwerten der Dicke von Fußballen (foodpad) in mm in Mäusen, die mit M109R-Zellen inokuliert wurden als eine Funktion von Tagen nach Behandlung mit Salzlösung (geschlossene Quadrate), freiem Doxurubicin (Kreise) oder Doxorubicin eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde,
  • 6 ist ein Plot der Anzahl von überlebenden Mäusen als eine Funktion von Tagen nach Inokulation mit C-26 Tumorzellen und Behandlung mit freiem Doxorubicin (Kreise) oder mit Doxorubicin eingeschlossen in Liposomen, wobei das Doxorubicin andernorts in die Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Dreiecke, "Lipo-dox-AS") oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Quadrate, "Lipo-dox-AG") geladen wurde.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt eine liposomale Zusammensetzung bereit, bei der ein ionisierbares therapeutisches Mittel in dem(n) inneren liposomalen Kompartiment(en) in der Form eines ionisches Salzes mit einwertigen Glucuronatanionen eingeschlossen ist. Wie unten gezeigt wird, hat das eingeschlossene therapeutische Mittel eine schnellere Freisetzungsrate aus den Liposomen verglichen mit der Freisetzungsrate des Mittels, das in den Liposomen in Form eines ionischen Salzes mit zweiwertigen Sulfatanionen eingeschlossen ist. Die Erfindung stellt auch ein Fernbeladungsverfahren zur Ladung eines therapeutischen Mitteln in vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten bereit. Die schnellere Rate der Freisetzung des therapeutischen Mittels aus den Liposomen ermöglicht Flexibilität, um Dosierungszeitpläne ohne Gefährdung der biologischen Effizienz der therapeutischen Mittel einzustellen. Das Verfahren der Erfindung stellt deshalb eine nützliche Alternative des Beladens mit Ammoniumsulfat bereit.
  • Ähnlich dem herkömmlichen Ammoniumsulfatgradientverfahren erfordert das Fernbeladungsverfahren mit Ammoniumglucuronat nicht, daß die Liposomen in einem sauren pH-Wert hergestellt werden, noch, daß das extraliposomale Medium basisch eingestellt wird. Der Ansatz ermöglicht auch die Beladung mit dem therapeutischen Mittel in einem breiten Spektrum von Liposomen unterschiedlicher Typen, Größen und Zusammensetzungen, einschließlich räumlich-stabilisierte Liposomen, Immunoliposomen und räumlich-stabilisierte Immunoliposomen. "Eingeschlossen", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Mittel, das innerhalb der wässerigen Räume der Liposomen oder innerhalb der Lipiddoppelschicht eingeschlossen ist.
  • Die höhere Freisetzungsrate ist ein Ergebnis der Verwendung von Glucuronat als dem Ausgleichsanion. Weil es in der Theorie nicht gewünscht ist, das es gebunden ist, gibt es die Hypothese, daß das Glucuronatanion, das einwertig ist und verschiedene funktionelle Hydroxylgruppen in seinem sechsgliedrigen Ring enthält, weniger wirksam ist verglichen mit einem Sulfation bei der Induzierung von Aggregation und Präzipitation des therapeutischen Mittels nachdem es in die Liposomen transportiert wurde. Die Erfinder haben beobachtet, daß die Löslichkeit von Doxorubicin ungefähr 100 mal größer in einer 250 mM Ammoniumglucuronat (AG)-Lösung als in einer 250 mM Ammoniumsulfat (AS)-Lösung ist. Zusätzlich präzipitiert Doxorubicin bei weniger als 2 mM Konzentration in Gegenwart eine Sulfations, während eine viel höhere Konzentration an Doxorubicin in Gegenwart eines Glucuronatanions zur Präzipitation erforderlich ist. Wenn demgemäß Glucuronat das Ausgleichsanion ist, ist mehr therapeutisches Mittel in einer löslichen Form vorhanden und deshalb verfügbarer zur Freisetzung aus den Lipsomen. Des weiteren ist die Permeabilität von Glucuronat durch die liposomalen Membranen sehr gering, möglicherweise infolge seines geringen pKa-Werts, seiner Sperrigkeit und/oder Polarität, was es sehr wirksam zur Aufrechterhaltung des Ammoniumionengradienten zur Beladung mit den therapeutischen Mitteln macht.
  • Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um andernorts im wesentlichen jedes therapeutische Mittel zu laden, das protonierbar ist (es kann in einem positiv geladenen Zustand existieren), wenn es in einem geeigneten wässerigen Medium gelöst ist. Vorzugsweise sollte das Mittel relativ lipophil sein, so daß es sich in der Lipidvesikelmembran aufteilen wird. Vorzugsweise ist die zu ladende therapeutische Verbindung auch eine schwache amphipatische Verbindung, daß heißt, eine Verbindung mit entweder schwachen basischen oder sauren Anteilen. Beispiele an therapeutischen Mitteln, mit denen die Liposomen mit dem Verfahren der Erfindung beladen werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Doxorubicin, Mitomycin, Bleomycin, Daunorubicin, Streptozocin, Vinblastin, Vincristin, Mechlorethaminhydrochlorid, Melphalan, Cyclosphosphamid, Triethylenethiophosphoramid, Carmustin, Lomustin, Semustin, Fluoruracil, Hydroxyharnstoff, Thioguanin, Cytarabin, Floxuridin, Decarbazin, Cisplatin, Procarbazin, Ciprofloxacin, Epirubicin, Carcinomycin, N-Acetyladriamycin, Rubidazon, 5-Imidodaunomycin, N-Acetyldaunomycin, alle Anthracyclin-Arzneimittel, Daunorylin, Propranolol, Pentamindin, Dibucain, Tetracain, Procain, Chlorpromazin, Pilocarpin, Physostigmin, Neostigmin, Chloroquin, Amodiaquin, Chlorguanid, Primaquin, Mefloquin, Chinin, Pridinol, Prodipin, Benztropinmesylat, Trihexylphenidylhydrochlorid, Propranolol, Timolol, Pindolol, Quinacrin, Benadryl, Promethazin, Dopamin, Serotonin, Epinephrin, Codein, Meperidin, Methadon, Morphin, Atropin, Decyclomin, Methixen, Propanthelin, Imipramin, Amitriptylin, Doxepin, Desipramin, Quinidin, Propranolol, Lidocain, Chlorpromazin, Promethazin, Perphenazin, Acridinorange, Prostaglandine, Fluorescein, Carboxyfluorescein, und andere Moleküle, die diesen ähnlich sind.
  • Zusätzlich zu der Beladung mit einem einzelnen therapeutischen Mittel kann das Verfahren auch verwendet werden, um mehrer therapeutische Mittel entweder gleichzeitig oder nachfolgend zu laden. Auch können die Liposomen, die mit den protonierbaren therapeutischen Mitteln beladen werden, ihrerseits mit anderen pharmazeutischen Mitteln oder Arzneimitteln vorbeladen sein, wozu bekannte Verkapselungstechniken (z. B. durch Einbringen des Arzneimittels in einen Puffer, aus dem die Liposomen hergestellt werden) verwendet werden. Das Verfahren der Erfindung stellt deshalb eine große Flexibilität bei der Herstellung von Liposomen bereit, in denen "Arzneimittelcocktails" zur therapeutischen Verwendung eingeschlossen sind. Natürlich kann, wenn gewünscht, mit einem oder mehreren protonierbaren Arzneimitteln, die oben aufgeführt sind, eine Vorbeladung stattfinden und dann das gleiche oder ein anderes Arzneimittel zu den Liposomen zugegeben werden, wobei der Ammoniumglucuronatgradient der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Das Verfahren ist insbesondere geeignet, um mit schwachen amphipatischen Arzneimitteln, wie Doxorubicin zu beladen. Mit Doxorubicin beladene Liposomen, die eine externe Oberflächenbeschichtung mit hydrophilen Polymerketten durch einen Ammoniumglucuronatgradienten (bezeichnet als "Lipo-dox-AG") aufweisen, zeigen eine schnellere Freisetzungsrate als mit Doxorubicin beladene Liposomen, die eine externe Oberflächenbeschichtung mit hydrophilen Polymerketten durch einen Ammoniumsulfatgradienten (bezeichnet als "Lipo-dox-AS", kommerziell als Doxil® bekannt), und haben eine ähnliche biologische Effizienz. Es wird angenommen, daß die schnellere Freisetzung des Arzneimittels, wenn es in Liposomen gegen eine Ammoniumglucuronatgradienten vorhanden ist, die Verweilzeit im Blut abschwächt und die Möglichkeit des Doxorubicin in der Haut zu akkumulieren, erniedrigt, um Palmar-Planar-Erythrodysesthesie (PPE), auch als das Hand-Fuß-Syndrom bekannt) zu bewirken, eine Nebenwirkung, die beobachtet wird, wenn liposomal-verkapseltes Doxorubicin verabreicht wird.
  • In Untersuchungen, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, wurden Liposomen hergestellt, die eingeschlossenes Doxorubicin enthielten, wobei vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumsulfatgradienten oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten mit Doxorubicin fernbeladen wurden. In unteren Abschnitt I wird die Liposomzusammensetzung und das Fernbeladungsverfahren beschrieben. Diese Liposomen werden in vitro charakterisiert, um ihre Zytotoxizität, die zelluläre Arzneimittelaufnahme und die Plasmaaustrittsrate zu bestimmen, die ebenfalls in Abschnitt I beschrieben werden. In den Abschnitten II und III wird die in vivo Clearance-Rate und die therapeutische Aktivität des Liposom-verkapselten Doxorubicins diskutiert.
  • I. Liposomenkomponenten und Präparationen
  • A. Liposomenkomponente
  • Liposomen, die zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen solche ein, die primär aus Vesikel-bildenden Lipiden zusammengesetzt sind. Vesikel-bildende Lipide, beispielhaft dargestellt durch Phospholipide, bilden bei physiologischem pH-Wert und Temperaturen in Wasser spontan Doppelschichtvesikel. Die Liposomen können auch andere Lipide, die in die Lipiddoppelschichten eingebracht sind, umfassen, wobei sich der hydrophobe Anteil in Kontakt mit dem Inneren, der hydrophoben Region der Doppelschichtmembran, und der Kopfgruppenanteil sich nach außen, der polaren Oberfläche der Doppelschichtmembran, orientiert.
  • Die Vesikel-bildenden Lipide sind vorzugsweise die, die zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acyketten, und eine Kopfgruppe aufweisen, die entweder polar oder nicht-polar ist. Es gibt eine Vielzahl synthetischer Vesikel-bildender Diacyl-Lipide und natürlich vorkommende Vesikelbildende Lipide, wie Phospholipide, Diglyceride, dialiphatische Glycolipide, Einzellipide, wie Sphingomyelin und Glycosphosphingolipid, Chlolesterin und deren Derivate, einzeln oder in Kombination und/oder mit oder ohne Liposomenmembran versteifende Mittel. Wie hier definiert, schließen "Phospholipide" Phosphatidylchlolin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin, Plasmalogene und Phosphatidylcholinlipidderivate ein, wo die zwei Kohlenwasserstoffketten typischerweise zwischen etwa 14 bis 22 Kohlenstoffatome in der Länge aufweisen und verschiedene Grade an Ungesättigtkeit haben. Die oben beschriebenen Lipide und Phospholipide, deren Acylketten unterschiedliche Grade and Ungesättigtkeit haben, können kommerziell oder gemäß den veröffentlichten Verfahren hergestellt werden.
  • Kationische Lipide sind ebenfalls für die Verwendung in den Liposomen der Erfindung geeignet, wobei die kationischen Lipide als eine geringfügige Komponente der Lipidzusammensetzung oder als eine Haupt- oder einzige Komponente vorhanden sein können. Solche kationischen Lipide haben typischerweise einen lipophilen Anteil, wie z. B. Sterin, eine Acyl- oder eine Diacylkette, und wobei das Lipid eine insgesamt positive Nettoladung hat. Vorzugsweise trägt die Kopfgruppe des Lipids die positive Ladung. Beispiele solcher Lipide schließen 1,2-Dioleyloxy-3-(trimethylamino)propan (DOTAP), N-[I(2,3-Ditetradecycloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), N-[I-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE), N-[I-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), 30-[N-(N,N'-Dimethylaminoethan)-carbamoly]cholesterin (DC-Chol) und Dimethyldioctadecylammonium (DDAB), ein.
  • Das kationische Vesikel-bildende Lipid kann auch ein natürliches Lipid, wie zum Beispiel Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder ein amphiphatisches Lipid, wie Phospholipid, das mit einem kationischen Lipid derivatisiert ist, wie Polylysin oder andere Polyaminlipide, sein. Zum Beispiel kann das neutrale Lipid (DOPE) mit Polylysin derivatisiert sein, um eine kationisches Lipid zu bilden.
  • Das Vesikel-bildende Lipid kann ausgewählt werden, um einen besonderen Grad an Fluidität oder Starrheit zu erreichen, um die Stabilität des Liposoms im Serum zu kontrollieren und um die Freisetzungsrate des eingekapselten Mittels in dem Liposom zu kontrollieren. Liposomen, die eine starrere Lipiddoppelschicht oder eine flüssige kristalline Doppelschicht haben, werden erhalten durch das Einbringen eines relativ starren Lipids, z. B. einem Lipid mit einer relativ hohen Phasenumwandlungstemperatur, z. B. oberhalb der Raumtemperatur, noch bevorzugter oberhalb der Körpertemperatur und bis hin zu 80°C. Starre, d. h. ungesättigte, Lipide tragen zu einer größeren Membranstarrheit in der Lipiddoppelschicht bei. Andere Lipidkomponenten, wie zum Beispiel Cholesterin, sind auch dafür bekannt, daß sie zur Membranstarrheit in den Lipiddoppelschichtstrukturen beitragen.
  • Lipidfluidität wird durch Einbringen eines relativ flüssigen Lipids, typischer weise einem mit einer Lipidphase mit einer relativ niedrigen flüssig-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur, z. B. bei oder unter Raumtemperatur, noch bevorzugten bei oder unter Körpertemperatur, erhalten.
  • Die Liposomen können wahlweise ein Vesikel-bildendes Lipid einschließen, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert ist, das zum Beispiel beschrieben wurde in US-Patent Nr. 5 013 556 und in der WO 98/07409 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Das Einbringen eines hydrophilen Polymer-Lipid-Konjugats in den liposomalen Doppelschichtpolymer bewirkt eine Oberflächenbeschichtung von hydrophilen Polymerketten sowohl auf den inneren als auch auf den äußeren Oberflächen der Liposomlipiddoppelschichtmembranen. Die äußerste Oberflächenbeschichtung mit hydrophilem Polymerketten bewirkt, daß die Blutzirkulationsldauer in vivo im Vergleich zu den Liposomen ohne Polymerketten beschichtung auszudehnt wird. Die innere Beschichtung der hydrophilen Polymerketten dehnt sich in die wässerigen Kompartimente in den Liposomen aus, d. h. zwischen die Lipiddoppelschichten und in das zentrale Kernkompartiment, und ist mit jedem eingeschlossenen Mittel in Kontakt. Vesikelbildende Lipide, die zur Derivatisierung mit einem hydrophilen Polymer geeignet sind, schließen jedes der oben genannten Lipide ein, und insbesondere Phospholipide, wie Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE).
  • Hydrophile Polymere, die zur Derivatisierung mit einem Vesikel-bildenden Lipid geeignet sind, schließen Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylmethylether, Polymethyloxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyhydroxypropylmethacrylat, Polyhydroxyethylacrylat, Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglykol und Polyaspartamid ein. Die Polymere können als Homopolymere oder als Block- oder Zufallspolymer verwendet werden.
  • Eine bevorzugte hydrophile Polymerkette ist Polyethylenglykol (PEG), vorzugsweise eine PEG-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 500 und etwa 10.000 Dalton, noch bevorzugter zwischen etwa 500 und etwa 5.000 Dalton, insbesondere bevorzugt zwischen etwa 1.000 und etwa 2.000 Dalton. Methoxy- oder Ethoxy-bedeckte Analoge des PEG sind ebenfalls bevorzugte hydrophile Polymere, die kommerziell in einer Vielzahl von Polymergrößen, z. B. 120 bis 20.000 Dalton, verfügbar sind.
  • Die Präparation von Vesikel-bildenden Lipiden, die mit hydrophilen Polymeren derivatisiert sind, ist zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 5 395 619 beschrieben. Die Herstellung von Liposomen einschließlich solcher derivatisierten Lipide wurde ebenfalls beschrieben, wobei typischerweise zwischen 1 bis 20 Molprozent eines solchen derivatisierten Lipids in der Liposomenformulierung enthalten sind. Es ist so zu verstehen, daß das hydrophile Polymer stabil mit dem Lipid verbunden ist oder mittels einer unstabilen Bindung verbunden ist, die es ermöglicht, daß die beschichteten Liposomen die Beschichtung der Polymerketten abtrennen können, wenn sie im Blutstrom zirkulieren oder als Antwort auf einen Stimulus, wie es zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 6 043 094 beschrieben wird, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • B. Liposomenpräparation
  • Liposomale Suspensionen, die aus Liposomen bestehen, haben einen Ionengradienten über die Liposomdoppelschicht (auch als ein "Transmembrangradient" bezeichnet), der für die Fernbeladung verwendet wird, können mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, wie denen, die ausführlich in Szoka, F. Jr., et al., Ann Rev Biophys Bioeng 9: 467 (1980) beschrieben sind. Multilamellare Vesikel (MLV) können durch eine einfache Lipid-Film-Hydratations-Technik gebildet werden. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung Liposom-bildender Lipide des oben beschriebenen Typs in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst und das Lösungsmittel wird später verdampft, wodurch ein dünner Film hinterlassen wird. Der Film wird dann mit einem wässerigen Medium bedeckt, das den gelösten Stoff enthält, z. B. Ammoniumglucuronat, das die wässerige Phase in den Liposomeninnenräumen und auch die extraliposomale Suspensionslösung bildet. Der Lipidfilm hydratisiert, um MLVs zu bilden, typischerweise mit Größen zwischen etwa 0,1 bis 10 Mikrometer.
  • Die Lipide, die für die Bildung der Liposomen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise in einem molaren Verhältnis von etwa 70 bis 100 Molprozent Vesikel-bildender Lipide, wahlweise 1 bis 20 Molprozent eines Lipids, das mit einer hydrophilen Polymerkette derivatisiert ist, vorhanden. Eine beispielhafte Formulierung schließt 80 bis 90 Molprozent Phosphatidylethanolamin, 1 bis 20 Molprozent PEG-DSPE ein. Cholesterin kann in der Formulierung zwischen etwa 1 bis 50 Molprozent vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lipidkomponenten hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC), Cholesterin und Methoxy-bedecktes Polyethylenglykol, das mit Distearylphosphatidylethanolamin (mPEG(2000)-DSPE) derivatisiert ist, in einem molaren Verhältnis von 92,5:70:7,5.
  • Zur Herstellung von Liposomen, die einen Ammoniumglucuronatgradienten besitzen, enthält das Hydratationsmedium Ammoniumglucuronat. Die Konzentration des Ammoniumglucuronat hängt von der Menge des therapeutischen Mittels ab, das geladen wird. Typischerweise ist die Konzentration zwischen 100 bis 300 mM Ammoniumglucuronat. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Hydratationsmedium 250 mM Ammoniumglucuronat.
  • Die Vesikel, die durch das Dünnfilmverfahren hergestellt werden, werden in der Größe so angepaßt, das eine Größenverteilung innerhalb eines ausgewählten Bereichs, gemäß bekannten Verfahren, erhalten wird. Vorzugsweise sind die Liposomen einheitlich in der Größe, in einem Größenbereich zwischen 0,04 bis 0,25 μm. Kleine unilamellare Vesikel (SUVs), typischerweise im Bereich von 0,04 bis 0,08 μm, können durch Nachformation mittels Sonifizierung oder Homogenisierung hergestellt werden. Homogen in der Größe eingestellte Liposomen, die Größen in einem ausgewählten Bereich von etwa 0,08 bis 0,4 μm haben, können durch Extrusion durch Polycarbonatmembranen oder anderen Membranen mit definierten Porengrößen hergestellt werden, die einheitliche Porengrößen im Bereich von 0,03 bis 0,5 μm, typischerweise 0,05, 0,08, 0,1, oder 0,2 μm aufweisen. Die Porengröße der Membran entspricht annähernd der größten Größe der Liposomen, die durch Extrusion durch die Membran hergestellt werden, insbesondere wo die Präparation zwei oder mehr Mal durch die gleiche Membran extrudiert wurde. Die Größeneinteilung wird vorzugsweise in dem Original-Lipid-Hydratisierungspuffer durchgeführt, so daß die Liposomeninnenräume dieses Medium durch die anfänglichen Liposomenherstellungsschritte behalten. In Beispiel 1 ist beispielhaft die Herstellung einer liposomalen Formulierung beschrieben.
  • Im allgemeinen werden die Liposomen nach der Größeneinteilung mit einem therapeutischen Mittel beladen. Ein "Fern-" oder "Aktiv-"Beladungsverfahren ergibt sich aus dem Austausch des therapeutischen Mittels aus dem externen oder Grundmedium, in dem die Liposomen mit einem Ammoniumion in dem inneren liposomalen Kompartiment suspendiert sind. Die Effizienz der Beladung hängt wenigstens teilweise von einem Ammoniumionengradienten ab, wobei die Konzentration des Ammoniumions im Inneren der Liposomen höher ist, als die Konzentration des Ammoniumions in dem externen Grundsuspensionsmedium. Die Magnitude dieses Gradienten bestimmt in einem großen Ausmaß das Niveau des Einschlusses; je größer der Gradient, desto höher ist im allgemeinen der Einschluß.
  • Ein Ammoniumglucuronatgradient über die liposomale Lipiddoppelschicht, bei dem die Ammoniumionenkonzentration auf der Innenseite der Liposomen höher ist als in dem externen Suspensionsmedium (d. h. ein höherer Innen-/niedrigerer Außen-Ammoniumionengradient) kann auf eine Vielzahl von Wegen gebildet werden, z. B. durch (i) kontrollierte Verdünnung eines externen Mediums, (ii) Dialyse gegen das gewünschte Endmedium, (iii) Molekularsiebchromatographie, z. B. unter Verwendung von Sephadex G-50 gegen das gewünschte Medium oder (iv) Hochgeschwindigkeitszentrifugation und Resuspension der pelletierten Liposomen in dem gewünschten Endmedium. Das ausgewählte endgültige externe Medium wird von dem Mechanismus der Gradientenbildung und der gewünschten externen Ionenkonzentration abhängen. Der Gradient wird gemessen als das Verhältnis von Ammoniumglucuronat innen zu dem außerhalb der Liposomen. Im allgemeinen hat der Gradient ein Verhältnis 1000–10 innen/außen. Vorzugsweise liegt der Gradient im Bereich von 500–50.
  • Die Konzentration von Ammoniumglucuronat in einem externen Medium, das auch Elektrolyte enthält, kann als Ammoniumkonzentration bei einem pH-Wert von 13–14 (Bolotin, E. M., et al., Journal of Liposome Research 4(I): 455–479 (1984)) mittels eines Ionenanalysators gemessen werden, z. B. einem Corning 250 pH/Ionenanalysator (Corning Science Products, Corning, NY), der mit einer Corning 476130 Ammoniumelektrode und einer automatischen Temperaturkompensations-(ATC) rostfreien Stahlsonde ausgestattet ist. Wenn das endgültige externe Medium keine Elektrolyten enthält, kann der Ammoniumglucuronatgradient durch Leitfähigkeitsmessungen mit einem Leifähigkeitsmeßgerät bestimmt werden, z. B. vom Typ CDM3-Leitfähigkeitsmeßgerät, ausgestattet mit einer CDC 304 Eintauchelektrode mit manuellem Temperaturkompensator vom Typ CDA 100 (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark).
  • In einem Ansatz wird der Ammoniumionengradient durch kontrollierte Verdünnung erzeugt. Dieses Verfahren ergibt eine verdünnte Liposomenpräparation. Nach der Größeneinstellung hat die liposomale Suspension eine ausgewählte erste Konzentration an Ammoniumglucuronat in dem Liposom und in dem externen Grundmedium. Das externe Grundmedium wird mit einem zweiten Medium verdünnt, das kein Ammoniumglucuronat enthält. Beispielhafte zweite Medien schließen wässerige Lösungen, die Elektrolyte (Natriumchlorid oder Kaliumchlorid) enthalten oder wässerige Lösungen, die keine Elektrolyte (Glukose oder Saccharose) enthalten, ein. Die inneren und äußeren Medien werden vorzugsweise so ausgewählt, daß sie die gleiche Osmolarität aufweisen, z. B. durch geeignetes Einstellen der Konzentration des Puffers, Salzes oder dem gelösten Stoff mit niedrigem Molekulargewicht, wie Saccharose. Ein bevorzugtes zweites Medium ist 15 mM HEPES-Puffer, der 5% Dextrose bei einem ungefähren pH-Wert von 7 enthält.
  • In einem anderen Ansatz wird ein Protonengradient über die Lipiddoppelschicht durch Dialyse erzeugt, wobei das externe Grundmedium gegen eines ausgetauscht wird, daß keine Ammoniumionen enthält, z. B. der gleiche Puffer, aber bei dem Ammoniumglucuronat durch ein Salz wie NaCl oder KCl oder durch einen Zucker ausgetauscht wird, der die gleiche Osmolarität innerhalb und außerhalb der Liposomen ergibt. Für Präparationen im kleinen Maßstab kann der Gradient durch vier aufeinanderfolgende Dialyseaustausche gegen 25 Volumen des Dialysepuffer hergestellt werden. Für Präparationen im großen Maßstab kann der Gradient durch eine tangentiale Flußdialyse in drei Schritten hergestellt werden, z. B. unter Verwendung eines Minitan Ultrafiltrationssystems (Millipore Corp., Redford, MA), das ausgestattet ist mit "300 K"-Polysulfonmembranen. Der Dialysepuffer enthält Elektrolyte (z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid) oder keine Elektrolyte (Glukose oder Saccharose). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Dialysepuffer 15 mM HEPES, der 5% Dextrose bei einem ungefähren pH-Wert von 7 enthält. Entweder unter Verwendung der Dialyseansätze (im großen oder kleinen Maßstab) oder unter Bedingungen, bei denen das Hydratationsmedium 60 bis 250 mM Ammoniumglucuronat ist, kann ein Gradient von 1.000 oder mehr ohne Verdünnung der liposomalen Dispersion erhalten werden.
  • Die Ionisierungsereignisse, die auftreten, wenn Liposomen mit ionisierbaren-Arzneimitteln gegen eines Ammoniumionengradienten beladen werden, sind im Stand der Technik beschrieben (siehe US-Patent Nr. 5 192 549 ). Kurz gesagt, nach der Bildung der Liposomen und der Etablierung des Gradienten über die liposomalen Doppelschichten dissoziieren die Ammoniumionen innerhalb der Liposomen und sind im Gleichgewicht mit Ammoniak und Protonen. Ammoniakgas ist in der Lipiddoppelschicht mit einem Permeabilitätskoeffizienten von um die 1,3 × 10–1 cm/Sekunde permeabel, und ist in der Lage, die liposomale Doppelschicht zu durchdringen. Der Austritt von Ammoniak verschiebt das Gleichgewicht in den Liposomen gegenüber der Produktion von Protonen, was zu einem [H+]-Gradienten führt, bei dem die intraliposomale Konzentration höher als die des extraliposomalen Mediums ist. Unprotoniertes Arzneimittel durchquert die liposomale Doppelschicht, wird in dem Liposom protoniert und wird durch Anionen stabilisiert, die in dem internen wässerigen Kompartiment des Liposoms verhanden sind. Die Bildung eines Arzneimittel-Glucuronat-Salzes erhöht den intraliposomalen pH-Wert und induziert die Bildung von NH3 in den Liposomen. Diese zyklischen Wiederholungen wiederholen sich, bis im wesentlichen alle Ammoniumionen aus dem liposomalen internen Kompartiment als NH3 abgeflossen sind. Ein therapeutisches Mittel, z. B. Doxorubicin kann in die Liposomen durch Zugabe einer Lösung dieses Mittels zu einer Suspension von Liposomen mit einem Ammoniumionengradienten über die liposomalen Membranen eingebracht werden. Die Suspension wird unter Bedingungen behandelt, die wirksam sind, um die Passage der Verbindung von dem externen Medium in die Liposomen zu ermöglichen. Inkubationsbedingungen, die für die Arzneimittelbeladung geeignet sind, sind solche, die (i) die Diffusion der Verbindung, die in eine ungeladenen Form vorliegt, in die Liposomen ermöglichen und (ii) die vorzugsweise zu einer hohen Arzneimittelbeladungskonzentration führen, z. B. 5–500 mM eingeschlossenem Arzneimittel, vorzugsweise zwischen 20–300 mM, noch bevorzugter zwischen 50–200 mM.
  • Die Beladung wird vorzugsweise bei einer Temperatur oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur der Liposomenlipide durchgeführt. So kann für Liposomen, die vorwiegend aus gesättigten Phospholipiden gebildet sind, die Beladungstemperatur höher als 60°C oder mehr sein. Die Beladungsdauer ist typischerweise zwischen 15 bis 120 Minuten, abhängig von der Durchlässigkeit des Arzneimittels gegenüber der Liposomdoppelschichtmembran, der Temperatur und den relativen Konzentrationen von Liposomlipid und Arzneimittel. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beladung bei 60°C und für 60 Minuten durchgeführt.
  • So können mit einer exakten Auswahl von Liposomkonzentration, externer Konzentration der zugefügten Verbindung, und dem Ionengradienten im wesentlichen alle zugefügten Verbindungen in die Liposomen eingebracht werden. Zum Beispiel kann mit einem Ammoniumgradienten von ungefähr 1000, die Verkapselung von Doxorubicin größer als 90% sein. Bei Kenntnis des berechneten internen Liposomenvolumens und der maximalen Konzentration des zu ladenden Arzneimittels kann man dann eine Menge an Arzneimittel in dem externen Medium auswählen, das dazu führt, daß die Liposomen im wesentlichen vollständig beladen sind.
  • Wenn die Arzneimittelbeladung nicht effektiv ist, um im wesentlichen in dem externen Medium freies Arzneimittel zu vermindern, kann die Liposomensuspension nach der Arzneimittelbeladung behandelt werden, um nicht-verkapseltes Arzneimittel zu entfernen. Freies Arzneimittel kann zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie, Dialyse oder Zentrifugation entfernt werden. In einer Ausführungsform wird das nicht eingeschlossene Arzneimittel mit einer Dowex 50WX-4 (Dow Chemical, MI) entfernt. Zum Beispiel bindet freies Doxorubicin (aber nicht liposomales Doxorubicin) an ein Kationaustauscherharz (Storm, G. et al., Biochim Biophys Acta, 818: 343 (1985)).
  • II. In vitro Charakterisierung
  • A. In vitro Cytotoxizität
  • Die in vitro Cytotoxizität von freiem Doxorubicin (freies DOX), von liposomeneinschlossenem Doxorubicin, die gegen einen Ammoniumsulfatgradienten (Lipodox-AS) oder gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten (Lipo-dox-AG) beladen wurden, wurde gegen zwei Mauszellinien (M109-S und M109-R) und drei Tumorzellinien (C-26, KB und KB-V) getestet. M109-R und KB-V Zellinien sind Doxorubicin-resistente Unterlinien von M109-S beziehungsweise KB. Die Zellen werden kontinuierlich der Arzneimittelformulierung für 72 Stunden ausgesetzt, die nach den experimentellen Details, die von Hornwitz, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1109: 203–209 (1992) und auch in Beispiel 2 beschrieben sind, durchgeführt wurden.
  • Tabelle 1 zeigt die Doxorubicin-Konzentration, die benötigt wird, um 50% des Zellwachstums (IC50-Werte) für freies Doxorubicin (F-Dox), Lipo-dox-AG und Lipo-dox-AS zu inhibieren. Doxorubicin in freier Form ist cytotoxischer als eine der beiden liposomalen Doxorubicinformulierungen. Doxorubicin, das in Liposomen gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten geladen wurde, ist cytotoxischer als wenn es in Liposomen gegen Ammoniumsulfatgradienten geladen wurde, was darauf hin deutet, daß das Arzneimittel bioverfügbarer aus einem Glucuronatsalz als aus einem Sulfatsalz ist. Tabelle 1: Werte für die inhibitorische Konzentration (IC50)
    IC50 (μM)
    Zellinie F-DOX Lipo-DOX-AS Lipo-DOX-AG
    M109-S 0,56 9,8 1,4
    M109-R 2,00 > 300 28,0
    KB 0,04 7,6 1,4
    KB-V 0,69 > 300 21,0
    C26 0,96 > 200 64,0
  • Daß Lipo-dox-AG cytotoxischer ist als Lipo-dox-AS wird des weiteren durch die Inhibitionskurven in 1A bis 1E gezeigt, die die Wachstumsrate der Zellen als Prozent der Zellen, die nicht mit Arzneimittel behandelt wurden (Kontrolle), gegen die Menge an Doxorubicin, das zu dem Wachstumsmedium gegeben wurde, zeigen. 1A bis 1E zeigen die Inhibitionskurven für die Mauszellinien M109-S (1A), M109-R (1B) und die humanen Zellinien C-26 (1C), KB (1D) und KB-V (1E). Die Doxorubicin-Konzentration in nM der verschiedenen Formulierungen ist dargestellt als freies Doxorubicin (Kreise), Lipo-dox-AG (Quadrate) und Lipo-dox-AS (Dreiecke). Alle Arzneimittelformulierungen bei Doxorubicin-Konzentrationen zwischen 102 bis 106 sind gegenüber jeder getesteten Zellinie cytotoxisch. In allen Fällen mit Veränderungen in der Inhibition der Wachstumsrate war Lipo-dox-AG cytotoxischer als Lipo-dox-AS, was zeigt, daß das Arzneimittel aus der liposomalen Ammoniumglucuronat-Plattform schneller bioverfügbar war als Arzneimittel aus der liposomalen Ammoniumsulfat-Plattform.
  • B. In vitro Arzneimittelaufnahme von Tumorzellen
  • In vitro Anreicherung von Doxorubicin in Maustumorzellen wurde mittels Exposition von KB, KB-V und M109-R Zellen gegenüber freiem Doxorubicin, Lipodox-AS oder Lipo-dox-AG für 1, 5 und 24 Stunden, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung. Es gibt eine größere Arzneimittelanreicherung in Zellen, die mit Lipo-dox-AG als in denen, die mit Lipo dox-AS behandelt wurden. Dies ist in Übereinstimmung mit den in vitro Cytotoxizitätsergebnissen, die oben beschrieben sind (1A bis 1E), die zeigen, daß das Lipo-dox-AG cytotoxischer als das Lipo-dox-AS ist. Tabelle 2: In vitro Aufnahme von Doxorubicin in Tumorzellen
    Doxorubicin Aufnahme (ng DOX/106 Zellen)
    Zellinie, Expositionszeit Freies DOX Lipo-DOX-AS Lipo-DOX-AG
    KB, 1 Std. 426 (33) 5,0 (0,4) 7,8 (0,6)
    KB, 5 Std. 937 (46) 8,8 (0.4) 15,0 (0,4)
    KB, 24 Std. 840 (15) 24,0 (1) 154,0 (9)
    KB-V, 1 Std. 311 (22) 5,4 (0,8) 9,6 (1,5)
    KB-V, 5 Std. 931 (21) 12,3 (1,2) 18,0 (0,8)
    M109-R, 24 Std. 80 (3) 7,0 (2) 25,0 (5)
  • C. In vitro Verlust im Plasma
  • Um den in vitro Verlust des Liposomen-eingeschlossenen Arzneimittels im Plasma zu bestimmen, wurden Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG in 90% humanem Plasma bei 37°C unter kontinuierlichem Schütteln in Inkubationsbehältern, die Dowex Kation-Austauscherharzkügelchen enthielten, inkubiert. Die Harzkügelchen binden freigesetztes Arzneimittel entweder frei oder Protein-gebunden. Zu vorherbestimmten Intervallen werden Proben zur sauren Alkoholextraktion und fluorimetrischer Bestimmung der Fraktion an Arzneimittel genommen, die mit Liposomen assoziiert bleibt (d. h. die nicht durch Harzkügelchen abgefangen sind).
  • Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt und weisen darauf hin, daß Doxorubicin aus Lipo-dox-AG aus dem Liposom schneller ist als das Arzneimittel aus Lipo-dox-AS.
  • Die Unterschiede zwischen den zwei Präparationen beginnen offenkundig nach 24 Stunden nach der Inkubation. Am Ende der Inkubation (96 Std.) hat Lipo-dox-AG etwa zweimal so viel Doxorubicin als Lipo-dox-AS (–80% gegen 40%) freigesetzt.
  • III. In vivo Charakterisierung
  • A. Plasma-Clearance
  • Die Pharmakokinetiken von Doxorubicin, das in Liposomen durch Beladung gegen einen Ammoniumglucuronatgradienten eingeschlossen ist, wird mit 3 Monate alten weiblichen BALB/c Mäusen bestimmt. Wie in Beispiel 3A beschrieben werden Liposomen, in denen Doxorubicin gegen Ammoniumsulfat oder Ammoniumglucuronat geladen wurde, intravenös in die Mäuse injiziert. Blutproben wurden zu bestimmten Zeitpunkten genommen und auf ihre Doxorubicin-Konzentration analysiert. 3 zeigt die Plasma-Doxorubicin-Konzentration bei Mäusen, die mit Lipo-Dox-AG (quer schraffierte Balken) oder mit Lipo-Dox-AS (gepunktete Balken) behandelt wurden. Die Halbwertszeit von Doxorubicin, wenn es in Form einer Lipo-dox-AG-Plattform verabreicht wurde, beträgt ungefähr 16 Stunden, während die von Doxorubicin, das aus einer Lipo-dox-AG-Plattform verabreicht wurde, ungefähr 24 Stunden beträgt. Es ist also ersichtlich, daß Lipodox-AG schneller weniger wird als Lipo-dox-AS. Die Lipo-dox-AG Blutkonzentrationen sind 25% niedriger bei 4 Stunden nach intravenöser Verabreichung, 33% niedriger bei 24 Stunden und nahezu 50% niedriger bei 48 Stunden nach intravenöser Verabreichung. Weil die Zusammensetzung und die Größe der Liposomen identisch sind, sollte die Rate der Aufnahme durch das reticuloendotheliale System (RES.) ähnlich sein. Demgemäß ist die schnellere Clearance wahrscheinlich das Ergebnis einer schnelleren Freisetzungsrate in vivo des Doxorubicins aus der Lipo-dox-AG-Formulierung, was mit den in vitro Experimenten übereinstimmt.
  • B. In vivo therapeutische Aktivität
  • Um zu bestimmen, ob die schnellere Clearance von Doxorubicin, wenn es aus Liposomen verabreicht wird, die ein Doxorubicin-Glucuronat-Salz enthalten, eine Auswirkung auf die therapeutische Effizienz hat, werden die liposomalen Formulierungen tumor-tragenden Mäusen verabreicht.
  • Wie in Beispiel 3B beschrieben, werden Mäuse mit M109S-Tumor-Zellen (106 Zellen) inokuliert und mit einer einzelnen Dosis Doxorubicin mit 10 mg/kg entweder als freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG nach der Tumor-Inokulation behandelt. 4 zeigt den Mittelwert (n = 10) der Dicke von Fußballen in mm gegen die Tage nach Doxorubicin-Behandlung. Beide liposomalen Präparationen sind in der Suppression des Tumorwachstums effektiver als das freie Arzneimittel (Kreise). Es gibt eine kleine, aber signifikante Verbesserung der Effizienz, wenn Mäuse mit Lipo-dox-AG (Quadrate) verglichen mit Lipo-dox-AS (Dreiecke) behandelt werden.
  • In einer anderen Untersuchung, ebenfalls in Beispiel 3B beschrieben, werden Mäuse mit M109R-Zellen (106 Zellen) inokuliert. Zehn Tage nach der Inokulation werden die Mäuse entweder mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AS mit einer Dosis von 8 mg/kg behandelt. Die gleiche Dosis wurde erneut eine Woche und drei Wochen später verabreicht. 5 zeigt den Mittelwert (n = 10) der Dicke der Fußballen in mm gegen die Tage nach Doxorubicin-Behandlung. Beide liposomalen Präparationen (Dreiecke, offene Quadate) sind in der Inhibierung des Tumorwachstums effektiver als das freie Arzneimittel (Kreise), trotz des progressiven Tumorwachstums in allen Testgruppen, wahrscheinlich in Folge der resistenten Natur dieses Tumors.
  • In einer weiteren Untersuchung, ebenfalls in Beispiel 3B beschrieben, werden Mäuse mit C-26-Zellen (106 Zellen) inokuliert, um einen Tumor zu induzieren und fünf Tage nach der Inokulation werden die Mäuse entweder mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AS mit einer Dosis von 10 mg/kg behandelt. 6 zeigt die Zahl der überlebenden Mäuse als eine Funktion der Zeit nach Tumor-Inokulation. Unbehandelte(Kontroll-)Mäuse starben schnell mit einem mittleren Überleben von 13 Tagen (nicht gezeigt). Mäuse, die mit freiem Doxorubicin (Kreise) behandelt wurden, zeigten einen vernachlässigbaren Anstieg beim Mittelwert der Überlebenszeit (4 Tage mehr als die Kontrolle, d. h. 17 Tage). Beide liposomalen Präparationen (Quadrate, Dreiecke) sind bei der Verlängerung der Überlebenszeit von tumortragenden Mäusen effektiver als das freie Doxorubicin.
  • Alle obigen Modelle sind Tumore vom Karzinoma-Typ. Ein zusätzliches getestetes Modell (Ergebnisse nicht gezeigt) war das J6456-Lymphom aus BALG/c Mäusen mit einem experimentellen Design ähnlich der des C-26-Modells (intraperitoneal 106 Tumorzellen, intravenöse Therapie mit einer Dosis von 10 mg/kg an Tag 5 nach Tumor-Inokulation). Die liposomalen Formulierungen sind effektiver als das freie Arzneimittel, ohne signifikante Unterschiede zwischen der Überlebenszeit der Mäuse nach Behandlung mit Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG.
  • Aus dem vorstehenden kann erkannt werden, wie verschiedene Aufgaben und Ausgestaltungen der Erfindung getroffen wurden. Liposomen, die ein Arzneimittel in der Form eines Glucuronatsalzes eingeschlossen haben, stellen eine höhere Freisetzungsrate des Arzneimittels bereit, als dies bei einem ähnlichen Liposom, der Fall ist, das das Arzneimittel in der Form eines Sulfatsalzes eingeschlossen hat, ohne signifikanten Effekt der Arzneimitteleffizienz. Klinische Daten mit Liposom-eingeschlossenem Doxorubicin (Doxil®) deuten darauf hin, daß die Dauer und Schwere von PPE mit einer Verkürzung der Zirkulationshalbwertzeit von Doxil® abnehmen, die schnellere Freisetzung und die kürzere Zirkulation von Doxorubicin in der Form von Lipo-dox-AG stellen eine gute Alternative zur Doxorubicinabgabe bereit. Es ist anzumerken, daß die Ergebnisse, die für Doxorubicin spezifisch sind, auf andere Arzneimittel, die fähig sind, gegen einen Ammoniumgradienten ferngeladen zu werden, wie denen, die hier beschrieben sind, ausgedehnt werden können.
  • IV. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen des weiteren die hier beschriebene Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
  • Beispiel 1
  • Liposomenpräparation und Beladung
  • A. Liposomenpräparation
  • Liposomen, die Ammoniumglucuronat in den wässerigen Kompartimenten enthalten, werden wie folgt hergestellt. Die Lipidkomponente, hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC), Cholesterin und Methoxy-bedecktes Polyethylenglykol derivatisiertes Distearylphosphatidylethanolamin (mPEG(200)-DSPE) in einem molaren Verhältnis von 92,5:70:7,5 wurden in Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck abgezogen, was danach zu einem trockenen Lipidfilm führt. Der getrocknete dünne Lipidfilm wurde mit 250 mM wässerigeR Ammoniumglucuronatpufferlösung (pH 5,5) hydratisiert, wobei Liposomen mit Ammoniumglucuronat in den inneren wässerigen Kompartimenten gebildet wurden; und in einem wässerigen externen Ammoniumglucuronat-Grundmedium suspendiert. Die Liposomengröße wurde dann mittels Extrusion durch Membranen mit einer Porengröße von 0,5 μm eingestellt.
  • Nach der Extrusion wurde der externe Ammoniumglucuroatpuffer mittels Dialyse gegen einen Dialysepuffer enthaltend 5% Dextrose und 15 mM HEPES pH 7 ausgetauscht.
  • Eine Vergleichsliposomenformulierung enthaltend 250 mM Ammoniumsulfat in den inneren wässerigen Kompartimenten wurde in ähnlicher Weise mit 250 μm Ammoniumsulfat als Hydratationspuffer hergestellt. Die so erhaltenen Chargen waren den Ammoniumglucuronatpräparationen in Vesikelgröße, Arzneimittelbeladungseffizienz und dem Arzneimittel-zu-Phospholid-Verhältnis vergleichbar.
  • B. Fernbeladung (Remote Loading)
  • Doxorubicin wurde in die Liposomen gebracht, die Ammoniumglucuronat (Lipodox-AG) enthielten und in die Liposomen, die Ammoniumsulfat (Lipo-dox-AS) enthielten, wobei die Liposomen, die unter A. hergestellt wurden, mit einer Lösung Doxorubicin für 1 Stunde bei 60°C inkubiert wurden. Die Verkapselung von Doxorubicin führte zu einer Effizienz von > 90%. Das endgültige Arzneimittel-zu-Phospholipid-Verhältnis war 100–150 μg/μmol.
  • Freies Doxorubicin (d. h. Doxorubicin, das nicht in einem Liposom eingeschlossen war) in dem externen Grundmedium wurde mittels Chromatographie auf eine Sephadex G-50 Säule durch Elution mit entgastem Dextrose-HEPES-Puffer entfernt.
  • Beispiel 2
  • In vitro Charakterisierung
  • A. In vitro Toxizität
  • Freies Doxorubicin und liposomale Formulierungen des Doxorubicins, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, wurden gegen 5 Maus- und humane Tumorzellinien (M109-S, M109-R, C-26, KB, KB-V) getestet.
  • Zellen von jeder Zellinie wurden kontinuierlich dem Arzneimittel für 72 Stunden ausgesetzt. Weitere experimentelle Details sind von Hornwitz et al., Biochim Biophys Acta 1109 (2): 203 (1992) beschrieben. Kurz gesagt, 5 × 103 Zellen aus exponentiell wachsenden Kulturen in 200 μl Aliquots wurden auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden gegeben. Nach 20 Stunden in Kultur, während dessen die Zellen anheften und das Wachstum fortsetzen, werden 20 μl jeder der zu testenden Arzneimittelformulierungen (freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS, Lipodox-AG) in jedes Well gegeben. Für jeden 10fachen Anstieg in der Arzneimittelkonzentration werden 6 Arzneimittelkonzentrationspunkte gemessen. Jeder Test wurde in dreifachen Wellkulturen und zwei parallelen Platten durchgeführt. Die Zellen wurden kontinuierlich für 72 Stunden behandelt. Die Kulturen wurden durch Zugabe von 50 μl 2,5% Glutaraldehyd zu jedem Well für 10 Minuten fixiert. Die Platten wurden dreimal mit deionisiertem Wasser, einmal mit 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) gewaschen und dann für 60 Minuten mit 100 μl Methylenblau (1% in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5) bei Raumtemperatur gefärbt. Die Platten wurden in fünf Bädern mit deionisiertem Wasser gespült, um den nicht zellgebundenen Farbstoff zu entfernen und wurden dann getrocknet. Der Farbstoff wurde mit 200 μl 0,1 M HCl für 60 Minuten bei 37°C extrahiert und die optische Dichte wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometers gemessen.
  • Die Wachstumsrate wurde durch Teilen der Verdopplungszeit von Arzneimittelbehandelten Zellen durch die der Kontrollzellen berechnet. Die Arzneimittelkonzentration, die eine 50%ige Inhibition der Kontrollzellenwachstumsrate (IC50) bewirkt, wurde durch Interpolation der zwei am nächsten liegenden Werte der Wachstumsinhibitionskurve berechnet.
  • Tabelle 1 zeigt die IC50-Werte für freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG für jede der Zellinien und die entsprechenden Wachtumskurven sind in den 1A bis 1E gezeigt.
  • B. In vitro Arneimittelaufnahme
  • Zelluläre Akkumulation von Doxorubicin wurde mit einem Verfahren untersucht, das ähnlich dem in Chambers, S. K. et al, Cancer Res., 49: 6275–6279 (1989) beschriebenen ist. Monoschichten von KB-, KB-V- und M109-R-Zellen (exponentielle Wachstumskulturen von etwa 106 Zellen in 35 mm Platten) wurden mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG für 1, 5 und 24 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gespült und das Arzneimittel aus den Zellen mit 1 ml angesäuertem Isopropanol (0,075 M HCl in 90% Isopropanol) für 20 Stunden bei 4°C extrahiert. Die Doxorubicin-Konzentration wurde spektrofluorimetrisch mit eine Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm bestimmt. Die emittierte Fluoreszenzintensität wurde in Doxorubicin-Äquivalente, basierend auf einer Doxorubicin-Standardkurve, übertragen, nachdem die Ablesung von unbehandelten Hintergrundzellen subtrahiert war.
  • Das Ergebnis der Arzneimittelaufnahm durch die KB-, KB-V- und M109-R-Zellen nach Exposition mit freiem Doxorubicin, Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG nach 1, 5 und 24 Stunden ist in Tabelle 2 gezeigt.
  • C. In vitro Plasma-Austritt
  • Materialien
  • Lipo-dox-AS und Lipo-dox-AG wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer Konzentration von > 500 μg Doxorubicin/ml hergestellt.
  • 2 ml 50% Dowex® Kationaustauschharzkügelchen (Sigma, 50 W-Wasserstoff, 50% in Salzlösung vorgereinigt) wurden zu 15 ml Gewebekultur-Rundbodenröhrchen aus Plastik gegeben. Die Röhrchen wurden für 15 Min. bei 2000 Upm (859 g) zentrifugiert und dann wurde die Flüssigkeit dekantiert. Die liposomalen Präparationen wurden mit humanem Plasma auf ungefähr 5 μg Doxorubicin/ml in 90% humanem Plasma verdünnt. Doppelte Röhrchen wurden für jede liposomale Präparation präpariert und Röhrchen, die die liposomalen Präparationen ohne Dowex Harzkügelchen enthielten, wurden präpariert.
  • Eine saure Isopropanol-Lösung wurde aus 10% 0,75 N HCl in 90% Isopropanol Volumen/Volumen hergestellt. Die Reagentien waren Chemikalien von Reagenzgrad, die von Sigma bezogen wurden.
  • Alle in dieser Untersuchung verwendeten Materialien waren steril, und alle Versuche wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
  • Assay
  • Dowex® Kationaustauschharzkügelchen binden Doxorubicin in humanem Plasma, ob das Arzneimittel frei oder Protein-gebunden ist. In diesem Assay werden Lipodox-AG und Lipo-dox-AS in Röhrchen, die Harzkügelchen und humanes Plasma (wie oben beschrieben) enthalten, bei 37°C unter kontinuierlichem Schütteln mit einer Rotationsschüttelvorrichtung zur Verhinderung der Sedimentation der Harzkügelchen inkubiert. Zu vorbestimmten Zeitintervallen wurden Proben für die saure Alkoholextraktion und zur fluorimetrischen Bestimmung der Fraktion von Arzneimittel, das mit Liposomen verbunden verbleibt (d. h. nicht durch die Harzkügelchen eingefangen wurde). Dem nachfolgenden schrittweisen Protokoll für die Analyse wurde gefolgt.
    • 1. Zugabe von 30 ml humanem Plasma in ein 50 ml Röhrchen.
    • 2. Zugabe von 2 ml 50% sterilen Dowex® Harzkügelchen in Salzlösung zu den Zentrifugationsröhrchen (15 ml, Plastikrundboden) und Zentrifugation für 10 Min. bei 2000 Upm (850 g). Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit aus den Zentrifugenröhrchen.
    • 3. Verwendung der liposomalen Präparationen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, Zugabe einer Menge der Liposomensuspension zu den 50 ml Röhrchen enthaltend 30 ml humanes Plasma, um eine Stammlösung mit einer Endkonzentration von 5 μg/ml Doxorubicin zu erhalten.
    • 4. Zugabe von 9 ml der liposomalen Suspensions-Stammlösung mit 5 μg/ml Doxorubicin in jedes der Zentrifugenröhrchen, das Harzkügelchen enthält (Röhrchen Nr. A, B) und Zugabe von 10 ml der liposomalen Stammlösung in ein Röhrchen ohne Harzkügelchen (Röhrchen Nr. C). Mischen.
    • 5. Entnehmen von 1 ml Aliquots aus jedem Röhrchen (A, B, C) und Zentrifugation für 3 Min. bei 14000 Upm. Entnehmen von 200 μl des Überstandes für einen Wert zum Zeitpunkt Null und Einfrieren der Proben bei –20°C bis zur Analyse.
    • 6. Inkubation der Röhrchen bei 37°C unter kontinuierlichem Schütteln mit einer Rotationsschüttelvorrichtung, die die Röhrchen um 360° bei geringer Bewegung umgreift und rotieren läßt, mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um die Sedimentation der Harzkügelchen zu verhindern.
    • 7. Entnehmen eines 1 ml Aliquots aus jedem der Röhrchen nach 1, 4, 24, 48, 72 und 96 Stunden. Zentrifugation jedes Aliquots bei 14000 Upm für 3 Minuten, Entnehmen eines 20 μl Aliquots des klaren Überstandes. Einfrieren des Aliquots bei etwa –20°C bis zur Analyse.
    • 8. Zur Analyse der Proben, werden 1,8 ml gesäuertes Isopropanol zu den 20 μl Proben gegeben, um Doxorubicin aus den Liposomen zu extrahieren. Die Proben werden über Nacht bei 4°C inkubiert, und dann zur Entfernung des Präzipitats (2000 Upm für 10 Minuten) zentrifugiert. Die klaren Überstände werden in einem Spektrofluorimeter, ausgestattet mit Hochwellenlängenphotomultiplier, Anregung bei 470 nm und Emission bei 590 nm, untersucht. Die Doxorubicin-Konzentration wurden basierend auf einer Standardkalibierungskurve bestimmt, wobei die erhaltene Konzentration die Menge an Doxorubicin darstellt, die in Liposomen zurückbehalten wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
  • Beispiel 3
  • In vivo Charakterisierung
  • A. In vivo Plasma-Clearance-Rate
  • Drei Monate alten weiblichen BALB/c Mäusen wurden intravenös 10 mg/kg entweder Lipo-dox-AG oder Lipo-dox-AS injiziert, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden. Blutproben wurden nach 4, 24 und 48 Stunden nach der Injektion zur Analyse des Plasmadoxorubicinlevels genommen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
  • B. In vivo therapeutische Aktivität
  • Dreißig Mäusen wurden die Fußballen mit M109-S-Zellen (106 Zellen) inokuliert. Sieben Tage später, wenn die Dicke der Fußballen von einem normalen Wert von ungefähr 1,5 mm auf einen Durchschnitt von 2.0 bis 2,5 mm angestiegen war, wurden die Mäuse in drei Gruppen zu je 10 aufgeteilt und den Mausgruppen wurden intravenös entweder freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis von 10 mg/kg. Danach wurde die Dicke der Fußballen zweimal die Woche mit einem Zirkel gemessen, um das Tumorwachstum und den Effekt der Therapie zu verfolgen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
  • In einer separaten Untersuchung wurden dreißig Mäusen die Fußballen mit M109-R-Zellen (106 Zellen) inokuliert. Zehn Tage später, wenn die Dicke der Fußballen von einem normalen Wert von ungefähr 1,5 mm auf einen Durchschnitt von 2.0 bis 2,5 mm angestiegen war, wurden die Mäuse in drei Gruppen zu je 10 aufgeteilt und den Mausgruppen wurden intravenös entweder freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis von 8 mg/kg. Zwei zusätzliche Injektionen wurden in der gleichen Dosis 1 Woche und 3 Wochen später gegeben. Die Dicke der Fußballen wurde zweimal die Woche mit einem Zirkel gemessen und die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
  • In einer weiteren Untersuchung wurden Mäuse mit C-26-Zellen i. p. (106 Zellen) inokuliert. Fünf Tage später wurden die Mäuse in drei Gruppen zu je 10 aufgeteilt und jeder Gruppe wurden intravenös entweder freies Doxorubicin, Lipo-dox-AS oder Lipo-dox-AG injiziert mit einer Dosis von 10 mg/kg. Das Überleben dieser Mäuse wurde verfolgt und die Überlebenskurven sind in 6 gezeigt.
  • Obwohl die Erfindung in Hinblick auf besondere Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann klar, daß verschiedene Änderungen und Abänderungen gemacht werden können, ohne sich von der Erfindung zu entfernen.

Claims (25)

  1. Liposomzusammensetzung umfassend Liposomen, die Vesikel-bildende Lipide aufweisen und ein eingeschlossenes ionisierbares therapeutisches Mittel in Verbindung mit einem Glucuronatanion haben.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, in der die Vesikel-bildenden Lipide Phospholipide sind.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, in der die Liposomen des weiteren zwischen etwa 1 bis 20 Molprozent eines Vesikel-bildendendes Lipids umfassen, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, bei der das hydrophile Polymer Polyethylenglykol ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 3, in der das Vesikel-bildende Lipid hydratisiertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) ist und das mit einem hydrophilen Polymer derivatisierte Vesikel-bildende Lipid ist mit Polyethylenglykol derivatisiertes Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE).
  6. Verbindung nach Anspruch 5, in der die Liposomen desweiteren Cholesterin umfassen.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, in der die Liposomen HSPC, Cholesterin und DSPE-PEG in einem molaren Verhältnis von 92,5:70:7,5 umfassen.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, Anspruch 3 oder Anspruch 5, in der das therapeutische Mittel ein Anthracyclinantibiotikum ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, in der das Antibiotikum ausgewählt wird aus Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin.
  10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Behandlung eines Patienten.
  11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Behandlung eines Neoplasma bei einem Patienten.
  12. Verfahren zur Herstellung von Liposomen mit einem eingeschlossenen therapeutischen Mittel, wobei vorgeformte Liposomen gegen einen Ammoniumionengradienten mit Sulfat als Gegenion mit dem therapeutischen Mittel beladen werden, die Verbesserung umfaßt Beladung des ionisierbaren therapeutischen Mittels in Liposomen mit einem Ammoniumionengradienten mit Glucuronat als ein Gegenion.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Beladung die Herstellung einer Suspension aus Liposomen umfaßt, jedes Liposom hat wenigstens ein inneres wässeriges Kompartiment, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration enthält.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Herstellung einer Suspension aus Liposomen die Herstellung von Liposomen einschließt, die in einem externen Grundmedium mit einer zweiten Konzentration Ammoniumglucuronat suspendiert sind, wobei die erste Konzentration höher ist als die zweite Konzentration, wodurch ein Ammonioumionengradient über die Lipiddoppelschicht der Lipososmen geschaffen wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, das des weiteren die Zugabe einer Menge des therapeutischen Mittels zu der Liposomensuspension umfaßt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Zugabe die Zugabe eines Anthracyclinantibiotikums umfaßt.
  17. Verfahren zur Herstellung von Liposomen umfassend Bildung von Liposomen mit einem inneren Kompartiment und einer Doppelschichtlipidmembran, die Liposomen haben einen Konzentrationsgradienten mit Ammoniumglucuronat über ihre Doppelschichtlipidmembranen; Inkontaktbringen der Liposomen mit einem ionisierbaren therapeutischen Mittel, um den Transport des Mittels in das innere Kompartiment zu erreichen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Inkontaktbringen umfaßt, daß die Liposomen mit einem ionisierbaren Anthracyclin-therapeutischen Mittel in Kontakt gebracht werden.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei wobei das Inkontaktbringen umfaßt, daß die Liposomen mit einem ionisierbaren Anthracyclin-therapeutischen Mittel ausgewählt aus Doxorubicin, Daunorobicin und Epirubicin in Kontakt gebracht werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Bildung der Liposomen einschließt (i) Herstellung einer Suspension mit Liposomen, jedes Liposom in der Suspension hat wenigstens ein inneres wässeriges Kompartiment, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration enthält, die Liposomen sind in einem externen Grundmedium suspendiert, das Ammoniumglucuronat mit einer ersten Konzentration umfaßt; (ii) Reduzierung der ersten Konzentration an Ammoniumglucuronat in dem externen Grundmedium auf eine niedrigere zweite Konzentration an Ammoniumglucuronat, wodurch ein Konzentrationsgradient von Ammoniumionen über die Lipiddoppelschichten der Liposomen geschaffen wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Reduzierung durch Verdünnung, Dialyse, Diafiltration oder Ionenaustausch erreicht wird.
  22. Verfahren zur Zuführung einer protonierbaren Verbindung in vorgeformte Liposomen umfassend: Herstellung einer Suspension mit Liposomen mit einer größeren Konzentration an Ammoniumglucuronat innerhalb als außerhalb der Liposomen, wodurch ein Konzentrationsgradient von Ammoniumionen vom Innern zum Äußern der Liposomen geschaffen wird, wobei der Gradient zum aktiven Transport der protonierbaren Verbindung in Richtung auf das Innere der Liposomen in der Lage ist; Zugabe einer Menge der protonierbaren Verbindung zu der Suspension, und Ermöglichen, daß die protonierbare Verbindung in die Liposomen transportiert wird, um einen Gehalt der protonierbaren Verbindung innerhalb der Liposomen zu erreichen, der größer als der außerhalb der Liposomen ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Herstellung umfaßt Bildung der Liposomen in Gegenwart einer Ammoniumglucuronatlösung mit einer ersten Konzentration; Einschließen der Ammoniumglucuronatlösung mit der ersten Konzentration im Innern der Liposomen; und Reduzieren der ersten Konzentration der Ammoniumglucuronatlösung außerhalb der Liposomen auf eine zweite Konzentration, die geringer ist als die erste Konzentration.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die protonierbare Verbindung ein Anthracyclinantibiotikum ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Anthracyclinantibiotikum Doxorubicin oder Daunorobicin ist.
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