DE3880397T2

DE3880397T2 - Amphotericin b/cholesterolsulfat-zusammensetzung und -verfahren.

Info

Publication number: DE3880397T2
Application number: DE8888902717T
Authority: DE
Inventors: Robert Abra
Original assignee: Liposome Technology Inc
Current assignee: Intermune Inc
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1993-07-29
Anticipated expiration: 2008-02-27
Also published as: ATE88348T1; US4822777A; HK80596A; AU599779B2; JPH01502270A; DK598388A; WO1988006450A1; FI884889A; DE3880397D1; EP0303683B1; CA1336890C; NO884741L; DK174871B1; NO884741D0; FI884889A0; EP0303683A1; JPH0610134B2; EP0303683A4; DK598388D0; AU1482688A

Description

Die Erfindung betrifft eine Amphotericin-B-Zusammsetzung zur Behandlung von Pilzinfektionen und im besonderen eine Amphotericin-B-Zusammensteuerung, die sowohl einen hohen LD&sub5;&sub0;-Wert als auch eine therapeutische Wirksamkeit aufweist.

Referenzen

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Amphotericin-B (AMB) ist ein wirksames Antipilzmittel und zur Zeit ist es für die meisten schwerwiegenden systemischen Pilzinfektionen das Mittel der Wahl (Referenz 1) . Dieses Arzneimittel ist zur Zeit für den Humangebrauch als lyophylisiertes Pulver von NMB und Deoxycholat ("Fungizone") erhältlich. Der Arzneistoff bindet äußerst stark an Ergosterol, einer Hauptsterolkomponente der Pilzmembranen und bildet Poren in den Membranen aus, durch die gelöste Moleküle bzw. Lösungsmoleküle austreten. Der Arzneistoff weist auch eine starke Bindungsaffinität bezüglich Cholesterin auf, einem Sterin, das in den meisten Säugetierzellmembranen vorliegt, weshalb dieser Arzneistoff auch die Wirtszellen zerstören kann.
Wenn AMB in freier Form (d.h. als rekonstituierter AMB/Deoxycholatkomplex) verabreicht wird, werden zu Beginn Nebenwirkungen beobachtet, die von der Zerstörung der roten Blutzellen herrühren, auf die dann schwerwiegende Cardiotoxizitäts-, CNS- und Knochenmarksnebenwirkungen folgen. Eine renale Toxizität, die daher rührt, daß der Körper versucht, diesen Arzneistoff wieder auszuscheiden, tritt ebenfalls auf.
Verschiedene Studien zeigten, daß die AMB-Toxizität durch Verabreichung des Arzneistoffs in einer an Liposomen gebundenen Form vermindert werden kann (Referenzen 2-12). Typischerweise erhöht sich der LD&sub5;&sub0;-Wert des Arzneistoffes von etwa 2 - 3 mg/kg Körpergewicht für den freien Arzneistoff auf etwa 8 - 15 mg/kg, wenn der Arzneistoff in liposomaler Form verabreicht wird. Eine Beschränkung der liposomalen Formulierung ist jedoch die auftretende Instabilität der Partikelgröße der Amphotericin-B/Liposomen, wenn diese in einem wäßrigen Medium gelagert werden. Typischerweise bilden AMB enthaltende Liposomen, die eine ursprüngliche Größenverteilung von 200-300 nm aufweisen, spontan größere liposomale Strukturen aus, und zwar von bis zu mehreren um (Microns) bei der Langzeitlagerung in einem wäßrigen Medium. Liposome, die größer sind als 1 - 2 um (Microns) sind generell toxischer als kleinere Liposomen, wenn diese parenteral, d.h. in den Blutkreislauf verabreicht werden. Die Toxizität von großen Liposomen im Blutkreislauf hängt teilweise mit der Blockierung von alveolären Kapillaren durch Liposome zusammen. Es gibt auch Hinweise, daß relativ große Liposomen in der Leber stärker toxisch wirken, und zwar vermutlich wegen der Liposomenanhäufung in den reticuloendothelialen Zellen. Die US-Patentanmeldung des gleichen Inhabers, betreffend "Amphotericin-B-Liposom-Zusammensetzung", Serial Nr. 781,395, eingereicht am 27. September 1985 (jetzt US-A-4 766 046) beschreibt ein neues Verfahren zur Herstellung und Lagerung von AMB-Liposomen, welches die zuvor erwähnten Größenprobleme überwindet.
Eine Amphotericin-B-Zusammensetzung, die durch Komplexieren von AMB mit einem Polyethylenderivat von Cholesterin (PEG- Cholesterin) gebildet wird, wurde ebenfalls vorgeschlagen (PCT-Anmeldung WO-A-8505030). Diese Formulierung erhöhte die LD&sub5;&sub0; von AMB auf 10,0 mg/kg in Mäusen, und zwar von 3,8 mg/kg für Fungizone und war ebenfalls weniger toxisch in einer Zellkultur. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie AMB, das an PEG-Cholesterin komplexiert ist, die therapeutische Wirksamkeit gegen Pilzinfektionen In Vivo beeinflußt noch ob dieser Komplex in einer stabilen Form bezüglich der Größe gelagert werden kann.
Die Erfindung hat zum einen zum Ziel, eine AMB-Zusammensetzung bereitzustellen, die eine wesentlich höhere LD&sub5;&sub0; aufweist als die im Stand der Technik bekannten AMB-Formulierungen und die auch wesentlich wirksamer bei der Behandlung von Pilzinfektionen In Vivo ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine AMB-Formulierung bereitzustellen, die über den Zeitraum von mehreren Tagen ohne signifikante Veränderung der Partikelgröße in Suspension gelagert werden kann und die über einen langen Zeitraum in einer lyophilisierten Präparation gelagert werden kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es auch, ein verbessertes Verfahren zur Behandlung von Pilzinfektionen mit AMB bereitzustellen.
Die Erfindung umfaßt eine AMB-Zusammensetzung, die Partikel von AMB und Cholesterinsulfat in einem Molverhältnis von AMB zu Cholesterinsulfat enthält, das zwischen 1:1 bis 1:4 liegt. Wenn die Partikel in Form einer Suspension in dem wäßrigen Medium hergestellt werden, weisen sie eine bevorzugte Größe von 100 - 400 nm auf. Osmotische Quell- und Lösungsmittel-Einschlußstudien zeigen, daß die Partikel nicht liposomal sind. Eine bevorzugte Zusammensetzung die AMB und Cholesterinsulfat in einem Molverhältnis von etwa 1:1 enthält, zeigt nur eine geringe Änderung in der Partikelgröße, wenn sie über einen Zeitraum von mehreren Tagen in Form einer Lösung gelagert wird.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Zusammensetzung dadurch geformt, daß eine wäßrige Suspension von Amphotericin-B/Cholesterinsulfat-Partikeln in einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:4 bis zu ihrer optischen Klärung dispergiert wird, wobei die Partikelgröße hauptsächlich 100 - 200 nm beträgt. Die Suspension wird dann in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, wie Lactose, lyophilisiert, ehe eine wesentliche Zunahme der Partikelgröße stattfindet. Nach Rekonstitution in einem wäßrigen Medium, liegt die Partikelgröße hauptsächlich in dem Bereich von 200 - 300 nm.
Die Zusammensetzung hat einen LD&sub5;&sub0;-Wert, der in Mäusen größer als 15 mg/kg ist gegenüber 3,2 mg/kg für Fungizone im gleichen Tiermodellsystem und die Zusammensetzung mit dem Molverhältnis 1:1 hat einen LD&sub5;&sub0;-Wert, der größer als 30-40 mg/kg ist. Die therapeutische Wirksamkeit der ANB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung bei der Behandlung von Pilzinfektionen In Vivo ist mit derjenigen vergleichbar oder sogar noch größer, die für freies AMB beobachtet wird und hängt vom gesamten AMB-Dosisspiegel ab.
Die Erfindung umfaßt auch eine Verwendung zur Behandlung von Pilzinfektionen mit AMB mit beträchtlich geringerer Toxizität und größerer Wirksamkeit als sie bisher erreicht worden ist. Die Verwendung umfaßt das Formulieren einer wäßrigen Partikelsuspension von AMB/Cholesterinsulfat der zuvor beschriebenen Art und die Verabreichung dieser Suspension in einer therapeutisch wirksamen Menge.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung noch deutlicher ersichtlich.
Die Figuren 1A-1C sind Plots von überlebenden Tieren als Funktion von Tagen, die einer Infektion folgten, wobei die Tiere systemisch mit Candida albicans infiziert wurden und die danach mit einer Bolus-Injektion mit ANB-Dosen von 0,5 mg/kg/Dosis (Figur 1A), 0,125 mg/kg/Dosis (Figur 1B) oder 0,031 mg/kg/Dosis (Figur 1C) behandelt wurden.

I. Herstellung der Partikelzusammensetzung

A. Partikelsuspension

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen AMB/Cholesterinsulfat- Partikelsuspension wird AMB und Gholesterinsulfat in trockener oder gelöster Form zusammengegeben und zwar bei einem ausgewählten Molverhältnis von AMB zu Cholesterinsulfat von 1:1 bis 1:4. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die beiden Komponenten beim jeweils gewählten Molverhältnis in trockener Form gemischt, dann mit einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und zwar vorzugsweise in einem Alkohol wie Methanol. Im Bereich des Molverhältnisses von AMB zu Cholesterin zwischen 1:1 und 1:4 ist eine Gesamtmolarität von AMB und Cholesterinsulfat in Methanol von 50 uMol/ml geeignet. Z.B. liegen dann in einer 1:1-Formulierung sowohl AMB als auch Cholesterinsulfat in einer Konzentration von 25 uMol/ml vor.
Ein Kälteschutzmittel kann der AMB/Cholesterinsulfat-Lösung bis zu der bevorzugten Endkonzentration von 5 - 15 % zugesetzt werden. Das Kälteschutzmittel dient zwei Zwecken in späteren Bearbeitungsschritten. Erstens stellt es einen kristallinen Wasserlöslichen Füllstoff dar, an dem sich die AMB- und Cholesterinsulfat-Komponenten ausbilden können, wenn das Lösungsmittel aus der Mischung entfernt wird. Das bedeutet, daß die getrockneten Kristalle des Kälteschutzmittels die Oberfläche erhöhen, an der der Lipidfilm durch die Entfernung des Lösungsmittels gebildet wird, und dies erleichtert die Hydratisierung der Partikel, wenn ein wäßriges Medium wieder zu der getrockneten Mischung zugegeben wird. Zweitens kann, wenn die hydratisierten Partikel in einem lyophilisierten Zustand gelagert werden, was im folgenden besprochen wird, das Kälteschutzmittel die Schädigung der Partikel erniedrigen, die beim Einfrieren stattfinden kann, wodurch das Größenwachstum der rehydratisierten Partikel vermindert wird. Geeignete Kälteschutzmittel sind Kohlenhydrate wie Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Sucrose, Glucose, Fructose, Sorbit, Raffinose, myo-Inosit und Glycerin (Referenz 14). Eine Vielzahl von anderen wasserlöslichen Füllstoffen wie Maltodextrin oder Salze können anstelle des Kälteschutzmittels verwendet werden, wenn die Verarbeitung der Partikel keine Gefrierstufe umfaßt, wie dies der Fall ist, wenn zum Lagern die Partikel durch Sprühtrocknen getrocknet werden.
Die Lipidlösung von AMB/Cholesterinsulfat wird zu einem Lipidfilm getrocknet. Wie zuvor angegeben, wird der Film vorzugsweise aus einer Lösung gebildet, die einen Füllstoff enthält, wodurch getrocknete Partikel des Stoffes erhalten werden, die mit der Lipidmischung überzogen sind. Das Lösungsmittel wird durch Verdunsten im Vakuum oder mittels eines inerten Gasstromes, beispielsweise Stickstoff, entfernt. Der getrocknete Lipidfilm kann unter einem inerten Gas vorzugsweise bei 4ºC oder darunter gelagert werden.
Eine wäßrige Partikelsuspension wird durch Zugabe eines wäßrigen Mediums zu der getrockneten Lipidmischung erhalten. Das Medium, das in Beispiel 1 verwendet wird, ist geeignet und enthält 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4. Es wird eine solche Menge an Medium zugesetzt, daß es ausreicht, ein vorzugsweise zwischen 25 - 100 uMol/ml liegendes Endkonzentrat von AMB herzustellen.
Zu Beginn wird das Lipidmaterial mittels eines Spatels oder mechanischen Rührens solange grob suspendiert, bis die Lipidklumpen in das wäßrige Medium freigesetzt werden und sich eine aufschlämmungsartige Mischung bildet. Dieses Material wird nun mittels Ultraschallbehandlung, Homogenisieren, einer französischen Presse (French press) oder einem anderen Mittel zum Einbringen von hoher Energie dispergiert. Die Dispersion wird solange durchgeführt, bis eine gewünschte Partikelgröße, vorzugsweise zwischen 0,1 bis 1 um (Micron), erreicht wird. Die Suspension kann sich während der Dispersion erwärmen und sollte unter einer inerten Atmosphäre gehalten werden. In dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird die Suspension bei 45ºC bis zu ihrer optischen Klärung mit Ultraschall behandelt. Die so erhaltene Endpartikelgröße lag zwischen 0,1 und 0,2 um (Microns). Hierbei ist zu beachten, daß Formulierungen die weniger als etwa 1 Mol Cholesterinsulfat pro Mol AMB enthalten, nicht bis zur optischen Klärung beschallt werden können, was darauf hinweist, daß die Partikeldispersion zumindest eine stöchiometrische Menge von Cholesterinsulfat benötigt.
Die Partikelsuspension kann beispielsweise mittels Chromatographie über ein Molekularsieb oder mittels Dialyse behandelt werden, um Spuren von nichtinkorporiertem AMB zu entfernen. Geeignete Dialysebedingungen sind in Beispiel 1 angegeben. Die Endkonzentration von AMB in der dispergierten Partikelsuspension kann durch Verdünnen eines Aliquots der Suspension in Methanol und spektrophotometrischem Messen von AMB bei 406 nm bestimmt werden. Typische AMB-Konzentrationen, die bei den verschiedenen Herstellungsstufen der Dispersion auftreten, sind in der in Beispiel 1 beschriebenen Tabelle angegeben,

B. Getrocknete Partikelsuspension

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen AMB/Cholesterinsulfat-Partikel über einen langen Zeitraum in getrockneter Form gelagert werden können, ohne daß dabei eine signifikante Zunahme der Partikelgröße bei der Rehydration stattfindet.
Die getrocknete Partikelformulierung kann entweder durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen hergestellt werden. In beiden Fällen wird der Trocknungsschritt durchgeführt, ehe die Größe der AMB/Cholesterinsulfat-Partikel wesentlich zunimmt. Beim Lyophilisationsverfahren wird die Suspension der kleinen Partikel schnell eingefroren und bei einer Standtemperatur von vorzugsweise 20ºC oder weniger wie im Beispiel I beschrieben lyophilisiert. Die Auswirkung der Lyophilisation auf die Partikelgröße kann in der Tabelle 2 von Beispiel 2 für jede der 4 Formulierungen entnommen werden, die AMB:Cholesterinsulfat Mol-Verhältnisse zwischen 1:1 und 1:4 aufweisen. In jedem Fall nahm die durchschnittliche Partikelgröße von 100 - 200 nm vor der Lyophilisation auf 200 - 300 nach der Lyophilisation und Rehydration mit Wasser zu. Die Stabilität der Partikel vor und nach der Lyophilisation wird in der Sektion II weiter unten betrachtet.
Beim Sprühtrocknen wird die Partikelsuspension in einer herkömmlichen Vorrichtung getrocknet, in der die zu trocknenden Partikel in einer aerosolisierten Suspensionsform in einen Strom aus heißer Luft oder einem inerten Gas eingesprüht und die aerosolisierten Tröpfchen in dem Gasstrom getrocknet werden, während sie zu einem Plattenkollektor getragen werden, wo die getrockneten Liposomen gesammelt werden. Ein Beispiel eines solchen Sprühtrocknungsapparates ist ein Buchi 190 Mini-Sprühtrockner.
Die Trocknungstemperatur beträgt mindestens 37ºC und liegt vorzugsweise zwischen 40 und 50ºC. Die Temperatur der Sammelkammer ist generell niedriger als diejenige der getrockneten Luft und beträgt typischerweise 37ºC. Die getrockneten Partikel werden gesammelt und in dehydratisierter Form unter einer inerten Atmosphäre gelagert.

II. Größenstabilität

In diesem Abschnitt wird die Größenstabilität von AMB:Cholesterin-Partikelsuspensionen unter verschiedenen Bedingungen untersucht, welche die molare Zusammensetzung der partikel, das Suspensionsmedium und die Lagerzeit betreffen.
In einer ersten Studie, die in Beispiel 3 beschrieben ist, werden AMB:Cholesterinsulfat-Partikel hergestellt, die Mol- Verhältnisse von AMB:Cholesterinsulfat von 1:1, 1:2, 1:3 und 1:4 aufweisen und die sofort nach Dialyse für Zeiträume von bis zu 8 Tagen bei 4ºC gelagert wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 von Beispiel 3 angegeben. Die 1:1-Formulierung war im wesentlichen über die 8-tägige Testdauer hinweg stabil, wohingegen die anderen Formulierungen mit zunehmendem Mol-Verhältnis von Cholesterinsulfat progressiv eine stärkere Größenzunahme zeigten.
Die Größenstabilität der gleichen 4 Formulierungen wurde auf ähnliche Weise nach Lyophilisierung und Rehydratisierung untersucht, wie dies ebenfalls in Beispiel 3 angegeben ist. Werte für die Größenstabilität des 8-Tage-Tests sind in der Tabelle 3 angegeben. Interessanterweise gab es nur einen geringen Unterschied in der Größenstabilität unter den vier Formulierungen, und für jede Formulierung nahm die mittlere Partikelgröße höchstens um etwa das zweifache während der acht Tage langen Testperiode zu. Die Ergebnisse der Tabellen 2 und 4 zusammengenommen zeigen, daß (a) lyophilisierte AMB/Cholesterin-Partikel mit nur einer geringer Zunahme der mittleren Größe und der Größenverteilung rekonstituiert werden können und daß (b) die Partikel in der rekonstituierten Suspension bei einer Lagerung in Lösung über einen Zeitraum von mehreren Tagen hinweg relativ stabil sind.
Die Wirkung Salzlösung von physiologischer Stärke und von Plasma auf die Größencharakteristik der Partikel wurde ebenfalls untersucht, was in Beispiel 4 angegeben ist. In einer ersten Studie wurden die vier obigen AMB/Cholesterinsulfat- Formulierungen nach Dialyse in 0,9 %iger Salzlösung verdünnt und die Partikelgröße wurde unmittelbar danach bestimmt. Wie dies in der obersten Reihe in Tabelle 5 angegeben ist, zeigten alle Partikel eine starke Größenzunahme, obwohl die 1: 1-Formulierung am wenigsten Aggregation zeigte. Eine ähnliche Studie wurde auch mit Partikeln nach Lyophilisierung durchgeführt, deren Ergebnisse in der ersten Reihe der Tabelle 6 in Beispiel 4 angegeben sind. Ein Vergleich der Werte der Tabelle 5 und 4 zeigt, daß die 1:1-Formulierung in Kochsalz nach der Lyophilisierung wesentlich größenstabiler ist als nach der Dialyse. Die anderen drei Formulierungen, die ein größeres Cholesterinsulfat-Mol-Verhältnis aufweisen, zeigten eine starke Zunahme der Größe in Kochsalz sowohl vor als auch nach Lyophilisierung.
Eine zweite Studie wurde ebenfalls entworfen, um die AMB/Cholesterinsulfat-Partikelgröße in Blutplasma sowie die Wirkung der anschließenden Verdünnung des Plasmamediums mit Suspensionspuffer zu untersuchen. Zu Beginn wurde jede der 4 Proben (sowohl vor und nach Lyophilisierung) mit Humanplasma im Verhältnis 1:1 verdünnt, und dann nach einigen Minuten mit Suspensionspuffer, der 10 % Lactose enthält, weiterverdünnt. Die Größenmessungen wurden unmittelbar nach Verdünnung gemessen und dann nochmals 20 Min. später. Die Ergebnisse sind in den beiden letzten Zeilen der Tabellen 5 und 6 in Beispiel 4 angegeben. Zusammengefaßt läßt sich aus diesen Werten entnehmen, daß das Plasma bei allen Formulierungen eine Größenzunahme verursachte. Die geringste Größenzunahme wurde in der 1: 1-Formulierung beobachtet, bei der die Partikelgrößen weniger als 1 um (Micron), d.h. 1000 nm betrug. Die Größenzunahme, die beim Kontakt mit Plasma erzeugt wurde, war zumindest teilweise bei allen Formulierungen mit Ausnahme der 1:4-Formulierung reversibel, was sich durch eine signifikante Abnahme der Partikelgröße nach einer 20-minütigen Inkubationszeit in verdünnter Form im Suspensionsmedium zeigte. Es zeigte sich nur ein geringfügiger Unterschied in dem Größenverhalten der Partikel bei Prä- und Postlyophilisationsformulierungen.
Die obigen Werte zeigen, daß die AMB:Cholesterinsulfat- Formulierung gemäß der Erfindung über lange Zeit in getrockneter Form gelagert werden können, ohne daß bei Rehydratatisierung eine signifikante Zunahme der Größe oder eine signifikante Änderung der Größenstabilität im Plasma auftritt. Ein signifikanter Vorteil der getrockneten Partikel war, daß bei Lagerung im Puffer eine wesentlich ausgeprägtere Größenstabilität zu beobachten ist. Innerhalb des Bereiches der untersuchten AMB:Cholesterinsulfat-Mol-Verhältnisse, zeigte die 1:1-Formulierung die höchste Größenstabilität und die geringste durchschnittliche Partikelgröße unter den verschiedenen untersuchten Bedingungen.

III. Partikelcharakteristika

Es wurde berichtet, daß Cholesterinsulfat Lipidvesikel oder Liposomen ausbilden kann, wenn es über einen längeren Zeitraum (mehrere Stunden) mit Ultraschall behandelt wird (Referenz 13). Es war daher interessant zu untersuchen, ob die AMB- und Cholesterinsulfat-Partikel der vorliegenden Erfindung in liposomaler Form vorliegen. Für diese Studien wurde die 1:4 AMB/Cholesterinsulfat-Formulierung ausgewählt, da es bei einem relativ hohen Verhältnis von Cholesterinsulfat wahrscheinlicher ist, daß sich liposomale Strukturen ausbilden.
Eine Eigenschaft von Liposomen ist ihre fortlaufende Lipiddoppelschicht, die wasserlösliche und gelöste Feststoffmoleküle einkapseln kann. Viele wasserlösliche Moleküle, wie Zucker und andere gelöste Stoffmarker werden sofort in Liposomen eingekapselt, wenn die liposomalen Lipide in einem wäßrigen Medium, das den gelösten Markerstoff enthält, hergestellt (dispergiert) werden. Kleinere Markermoleküle wie Zucker weisen auch die Tendenz auf, langsam durch die Lipiddoppelschichtmembranen hindurchzutreten, was sich durch eine Äquilibrierung des gelösten Stoffs zwischen der eingekapselten und der äußeren wäßrigen Trägerphasenbereiche über einen Austauschzeitraum für den Stoff von mehreren Stunden bis mehreren Tagen zeigen läßt.
Um die Fähigkeit der AMB/Cholesterinsulfat-(1:1)-Partikel, die Sucrose einzuschließen, zu untersuchen, wurden die Partikel mittels Dispersion in einem Medium hergestellt, das ¹&sup4;C-Sucrose enthält. Nach Ultraschallbehandlung bis zur optischen Klärung wurden die Partikel von dem Suspensionsmedium mittels Chromatographie über ein Molekularsieb abgetrennt, wobei ein Siebmaterial für die Säule verwendet wurde, das Partikel im Größenbereich der AMB/Cholesterinsulfat-Partikel ausschließt. Details dieser Untersuchung sind in Beispiel 5 angegeben. 95 % des AMB war in den Partikeln enthalten, die mit dem Ausschlußvolumen eluiert wurden. Es wurde jedoch kein nachweisbarer Peak mit Radioaktivität gefunden, die mit den Partikeln zusammenhingen. Ausgehend von dieser Untersuchung scheint es, daß die Partikel keine einschließenden bzw. einkapselnden (liposomalen) Strukturen ausbilden, oder daß alternativ dazu die Partikel sehr durchlässige Strukturen bilden. Die letzte Erklärung ist sehr unwahrscheinlich und zwar deswegen, weil (a) Cholesterin dazu neigt, die Permeabilität in Liposomen gegenüber kleinen wasserlöslichen Permeaten herabzusetzen und weil (b) die Liposomen aus reinen Cholesterinderivaten, die beschrieben worden sind (Referenz 13), eine sehr geringe Permeabilität zeigten. Studien an Cholesterin-Hemisuccinat-Liposomen zeigen ebenfalls eine stabile Verkapselung von einer Vielzahl von geringen wasserlöslichen Molekülen (PCT Patentanmeldung WO- A-8504578).
Andere charakteristische Merkmale von Liposomen ist die Fähigkeit von isotonischen Liposomen, daß sie bei Injektion in ein hypotonisches Medium anschwellen. Hier wirken die Liposome als Reaktion auf den über die Membrandoppelschicht hinweg entstehenden Gradienten der gelösten Stoffe wie kleine Osmometer. Das Anschwellen von isotonischen Liposomen wurde bei Liposomen beobachtet, die aus einer Vielzahl von Cholesterinderivaten hergestellt wurden einschließlich Cholesterin-PEG und Cholesterinsulfat (Referenz 13) und Cholesterin-Hemisuccinat- Liposomen (PCT Patentanmeldung WO-A-8504578). Cholesterin- Derivat-Liposoiie zeigen die erwartete Absorptionszunahme, wenn sie in zunehmend stärker verdünnte Medien injiziert werden, obwohl sich diese Liposomen weniger als ideale Osmometer verhalten, als dies bei Liposomen aus herkömmlichen Phospholipidkomponenten der Fall ist.
Jede der obigen vier AMB/Cholesterin-Partikelzusammensetzung (mit den Mol-Verhältnissen 1:1, 1:2, 1:3 und 1:4) wurde in 10 % Lactose hergestellt. Es wurden sowohl Partikel vor als auch nach Dialyse auf osmotisches Anschwellen in destilliertem Wasser untersucht, wobei die Partikelgröße sofort nach der Verdünnung mit der Partikelgröße von 20 Min. nach der Verdünnung verglichen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 in Beispiel 6 angegeben. In keiner der Partikelformulierungen wurde ein Anschwellen beobachtet. Diese Tests bestätigen die Ergebnisse der obigen Verkapselungsuntersuchungen, nämlich, daß die erfindungsgemäßen AMB/Cholesterinsulfat-Partikel keine geschlossenen Vesikelstrukturen ausbilden.

IV. Therapeutische Verwendungen

AMB ist zur Behandlung von einer Vielzahl von systemischen Pilzorganismen geeignet, umfassend Coccidiomycosis, Cryptococcosis, systemische Moniliasis, Histoplasmosis, Aspergillosis, Rhodoptorulosis, Sporotrichosis, Phycomycosis und Blastomycosis und es ist auch wirksam gegen einige Arten von Leishmania (Referenz 15). Wegen der schweren Nebenwirkungen des Arzneistoffes in seiner zur Zeit erhältlichen freien Form wird es allgemein nur an Patienten mit progressiven, möglicherweise fatalen, systemischen Pilzinfektionen verabreicht und der Patient muß während der gesamten Behandlung mit der Arznei zur laufenden Überwachung der Nierenfunktion im Krankenhaus verbleiben.
Dieser Abschnitt beschreibt die Abnahme der Toxizität und die erhöhte Wirksamkeit von AMB in der vorliegenden Formulierung sowie des daher rührenden Potentials einer stärkeren weiter verbreiteten Verwendung der Arznei, im besonderen zur prophylaktischen Verwendung bei der Verhütung von opportunistischen Pilzinfektionen in immundefizienten oder in immunkompromittierten Patienten, wie bei solchen, die mit einer chemotherapeutischen Krebsbehandlung, einer Behandlung mit immunsupprimierenden Arzneistoffen oder mit einer Bestrahlungstherapie behandelt werden.

A. AMB/Cholesterinsulfat-Toxizität

Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung wurde gefunden, daß die hier beschriebene AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung im wesentlichen weniger toxisch ist als freies AMB (Fungizone), was durch wesentlich höhere LD&sub5;&sub0;-Werte belegt wird. Darüberhinaus ist die Zusammensetzung wesentlich weniger toxisch als liposomale Formen oder Lipidkomplexformen von AMB, die bisher im Stand der Technik beschrieben werden, was sich durch einen Vergleich der berichteten LD&sub5;&sub0;-Werte belegen läßt. Toxizitätsstudien zur Bestimmung der LD&sub5;&sub0;-Werte der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind in Beispiel 7 genau angegeben. Ein anfänglicher Test bestimmt die letale Toxizität von Fungazone und 1:4 AMB/Cholesterinsulfat-Partikel. Auf der Basis dieser Werte, die in Tabelle 8 angegeben sind, beträgt die LD&sub5;&sub0; einer freien AMB- (Fungizone) Zusammensetzung zwischen 1-4 mg/kg Tiergewicht. Dieser Wert erhöht sich bei der AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung auf 15-25 mg/kg. Dieser LD&sub5;&sub0;-Wert ist beträchtlich höher als Werte die bislang für liposomale oder Lipidkomplexe von AMB-Formulierungen im Stand der Technik beschrieben sind.
In weiteren Untersuchungen, die im Beispiel 8 angegeben sind, wird die letale Toxizität der vier verschiedenen Mol-Verhältnisse der AMB-Formulierungen, die zuvor beschrieben wurden, bei einer Dosis von bis zu 40 mg/kg untersucht. Wie dies in dem Beispiel angegeben ist, ergaben die AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen einen LD&sub5;&sub0;-Wert von bis zu 40 mg/kg. Diese Werte zeigen, daß der LD&sub5;&sub0; für die anderen drei Formulierungen weniger als 20 mg/kg beträgt und daß er für die 1:4-Formulierung am geringsten ist und zwischen 15 und 20 mg/kg liegt. Die Erfindung hat ebenfalls den Vorteil, daß das Cholesterinsulfat eine natürliche Cholesterinkomponente ist, die weitgehend im Tierreich aufgefunden wird. Diese Cholesterin-Verbindung zeigt keine bekannte Toxizität und wird im Körper durch Cholesterinsulfatase verstoffwechselt.
Da angenommen wird, daß die Toxizität mit zunehmender Partikelgröße ebenfalls zunimmt, tragen die stabilen und relativ kleinen Partikel, die nunmehr injiziert werden können, ebenfalls zur verringerten Toxizität bei.

B. Wirksamkeit

Ein anderes wichtiges Merkmal der AMB/Cholesterinsulfat- Zusammensetzung ist eine signifikant erhöhte Arzneimittelwirksamkeit bei der Behandlung von systemischen Pilzinfektionen. Eine Wirksamkeitsstudie, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde, ist detailliert in Beispiel 9 angegeben. Dabei wurden Tiere, die intravenös mit C, albicans infiziert wurden, mit Fungizone behandelt und zwar mit Dosen zwischen 0,3 und 0,9 mg/kg Körpergewicht oder mit 1:4 AMB:Cholesterinsulfat mit Dosen zwischen 0,3 und 2,0 mg/kg. Die Arzneimittelwirksamkeit wurde durch das Überleben von 25 Tagen nach der Arzneiverabreichung bestimmt. Die Werte, die in Tabelle 11 angegeben sind, zeigen, daß die AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung eine signifikant höhere Überlebensrate bei jedem der Dosisspiegel zwischen 0,3 und 0,9 mg/kg ergibt. Bei 2,0 mg/kg überlebten alle Tiere, die mit der erfindungsgemäßen Formulierung behandelt wurden.
In einer zweiten Studie, die ebenfalls in Beispiel 9 angegeben ist, wird die Überlebensrate in Prozent von mit C. albicans infizierten Mäusen bei Dosisspiegeln von 0,031, 0,125, und 0,5 mg/kg verglichen, wobei jedes Tier zwei Dosen am Tag der Infektion erhielt sowie zwei Dosen an dem darauffolgenden Tag. Die Werte sind in den Fig. 1A-1C für die Kontrolle (Kreise), freies AMB (Quadrate), AMB/CHSO&sub4; (1:4) (Dreiecke) und AMB/CHSO&sub4; (1:1) (Karos) für jede der drei unterschiedlichen Dosisspiegel angegeben. Bei den zwei niedrigeren Dosisspiegeln (Fig. 1B und 1C) waren die zwei AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen bei der Behandlung in ihrer Wirksamkeit mit dem freien AMB vergleichbar. Bei dem höchsten Dosisspiegel (Fig. 1A) ergab die 1:1 AMB/CHSO&sub4;- Formulierung 100 % Überlebensrate; im Vergleich dazu war die Überlebensrate sowohl für freies AMB als auch die 1:4 AMB/CHSO&sub4;-Formulierung 60 bis 80%.

C. Arten der Verabreichung

Die vorliegende Erfindung stellt eine dehydratisierte AMB- Zusammensetzung bereit, die, wenn sie nach einer längeren Lagerzeit wieder rehydratisiert wird, eine Suspension von AMB-Teilchen ausbildet, die einen ausgewählten Größenbereich von weniger als etwa 1 um aufweisen. Da die Partikel in einer wäßrigen inerten Umgebung gelagert werden können, werden die durch Toxizität und dem Lipid- und dem Arzneistoffabbau hervorgerufenen Probleme minimiert, die auf Oxidation und mechanischer Zerstörung an einer Gas-/Flüssigkeitsgrenzschicht beruhen. Bei einer parenteralen Verwendung, z.B. bei intravenöser Verabreichung, wird die Zusammensetzung vorzugsweise aus AMB-Liposomen gebildet, die Größen von zwischen 0,1 bis 0,4 um (Microns) aufweisen, wie sie mit den zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt werden können. Die AMB/Lipid-Zusammensetzung wird typischerweise auf eine vorgewählte AMB- Konzentration zwischen etwa 50 und 200 mg/ml hydratisiert und bei Konzentrationen von zwischen 1 und 5 mg AMB/kg Körpergewicht verabreicht. Die Verabreichung wird durchgeführt, ehe die Größe der AMF/CHSO&sub4;-Partikel wesentlich zunimmt.
Wenn der Arzneistoff intramuskulär verabreicht wird, um eine langsame Arzneistoffreisetzung an der Injektionsstelle zu bewirken, wird die Zusammensetzung vorzugsweise in einer konzentrierten Form rehydratisiert, die ohne weiteres an der Injektionsstelle lokalisiert werden kann.
Aus dem vorhergehenden kann ohne weiteres entnommen werden, wie verschiedene Ziele und Merkmale der Erfindung durchzuführen sind. Die Erfindung stellt AMB-Formulierungen bereit, die gegenüber dem freien AMB oder den AMB-Lipid-Formulierungen eine wesentlich verringerte Toxizität aufweisen und die eine Arzneistoffwirksamkeit haben, die zumindestens so groß ist wie diejenigen, die für die AMB-Formulierungen des Standes der Technik einschließlich freiem AMB berichtet werden. Der erhöhte therapeutische Index des Arzneimittels, im besonderen bezüglich der verminderten Toxizität, ermöglicht eine breitere Verwendung des Arzneimittels, beispielsweise bei der prophylaktischen Behandlung von immungeschwächten Patienten, und es wird auch eine größere therapeutische Wirksamkeit bei der Behandlung von aktiven systemischen Pilzinfektionen erreicht.
Die Zusammensetzung ist schnell hergestellt und die Cholesterinsulfatkomponente ist auch in gereinigter Form relativ billig und ist, wenn sie parenteral verabreicht wird, natürlich zu verwenden. Die Formulierung läßt sich in getrockneten Form leicht lagern und, wenn sie rehydratisiert wird, ergibt sie eine Partikelsuspension von ausgewählten kleinen Größen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellungsverfahren, die Charakterisierung und die Verwendung der erfindungsgemäßen AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung. Die Beispiele sollen jedoch den Umfang der Erfindung keineswegs einschränken.

Materialien

CHSO&sub4; (Cholesterin-3-Sulfat, Natriumsalz) wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten; AMB (Amphotericin-B, Typ 1) wurde von E.R. Squibb & Sons, Inc. (Chargen-Nr 20-914-5978-001) gestiftet. Sämtliche anderen Materialien sind handelsübliche Produkte von üblichem Reagens-Reinheitsgrad oder einer höheren Reinheit.

Beispiel 1

Herstellung von AMB/CHSO&sub4;-Partikeln

AMB und CHSO&sub4; wurde in trockener Pulverform gewogen und zusammengegeben, wobei eines der vier AMB:Cholesterinsulfat-Mol- Verhältnisse erhalten wurde, die in der folgenden Tabelle 1 angeführt sind. Die Menge an zugesetztem AMB und Cholesterinsulfat war ausreichend, um in der Partikelsuspension eine AMB plus Cholesterinsulfat-Endkonzentration von 50 uMol/ml herzustellen.
Trockenes Methanol wurde zu dem AMB/Cholesterinsulfatpulver gegeben, um eine AMB-Endkonzentration von zwischen 0,2 bis 0,6 mg/ml herzustellen und die Suspension wurde solange gerührt, bis das Pulver aufgelöst war. Zu dieser Lösung wurde Lactose zugegeben, um auf diese Weise im wäßrigen Endprodukt eine 10 %ige (Gew./Vol.) Lactoselösung herzustellen. Die Lösung wurde unter Vakuum getrocknet, wobei getrocknete Lactosepartikel erhalten wurden, die mit einem lipophilen AMB/Cholesterinsulfat-Film überzogen waren.
Ein Suspensionspuffer, der 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4, 67 mOsm enthielt, wurde zu der getrockneten Mischung in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine AMB plus Cholesterinsulfat- Endkonzentration von 50 uMol/ml erhalten wurde. Diese Suspension wurde mit einem Ultrasonic Liquid Processor (Heat Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY), Model W-800, Proben- Sonicator solange mit Ultraschall behandelt, bis die Suspension optisch klar wurde. (Dieser Vorgang wird dadurch erleichtert, daß man die Suspension auf 45 ºC in einem Wasserbad erwärmt.) Die Ultraschall-Behandlung wurde unter Stickstoffgas durchgeführt.
Die Ultraschall-behandelten AMB/CHSO&sub4;-Partikel wurden dialysiert, um Spuren von nichtinkorporiertem AMB zu entfernen, wobei ein Dialyseschlauch verwendet wurde, der ein molekulares Ausschlußvolumen von 6000-8000 aufwies. Das Material wurde gegen einen Puffer dialysiert, der 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 10 % (Gew./Vol.) Lactose, pH 7,4, 300 mOsm enthielt. Die klare Suspension wurde dadurch getrocknet, daß man sie in einer Trockeneis/Isopropanol-Mischung schnell einfror und dann über Nacht bei einer Lagertemperatur von -25 ºC lyophilisierte, worauf eine weitere 2-stündige Lyophilisation bei 25 ºC erfolgte. (15 SRC-X Lyophilisator; Virtis, Gardiner, NY). Lyophilisierte Proben wurden durch Zugabe einer gleichen Volumenmenge an Wasser und leichtem Mischen rekonstituiert. Die folgende Tabelle 1 zeigt die AMB-Konzentrationen der vier Zusammensetzungen in verschiedenen Stufen ihrer Herstellung. Tabelle 1 AMB-Konzentration (mg/ml) Mol-Verhältnis Theoretisch vor Dialyse nach Dialyse nach Lyophilisation/Rehydratisierung

Beispiel 2

Wirkung der Lyophilisierung auf die Partikelgröße

Die Partikelgrößen wurden durch dynamische Streuung mit Laserlicht bestimmt, wobei ein Nicomp Model 200 Sizer verwendet wurde (Nicomp Instruments Inc., Goleta, CA). Die Proben wurden für eine solche Messung typischerweise auf 0,3 uMol/ml verdünnt, wobei ein 10 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,1 mM EDTA, 10 % (Gew./Vol.) Lactose und einem pH von 7,4 verwendet wurde. Die durchschnittliche Partikelgröße und die Standardabweichung (S.D.) der vier Zusammensetzungen von Beispiel 1 sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben, Wie daraus zu entnehmen ist, weisen alle vier Zusammensetzungen vor der Lyophilisierung eine durchschnittliche Partikelgröße zwischen 130 und 180 nm und nach der Lyophilisierung zwischen 210 und 280 nm auf. Tabelle 2 Partikeldurchmesser (Mittel ± S.D. nm) Molarverhältnis AMB/CHSO&sub4; Partikel sofort nach Dialyse Partikel nach Lyophilisierung/Rehydratisierung

Beispiel 3

Auswirkung der Lagerung in Lösung auf die Partikelgröße

Die vier Proben von Beispiel 1, von denen jedes AMB plus Cholesterinsulfat in einer Konzentration von etwa 50 uMol/ml enthielt, wurden bei 4 ºC für bis zu 8 Tage inkubiert. An den Tagen 0, 2, 6 und 8 wurde ein Aliquot von jeder Suspension entnommen und auf etwa 0,3 uMol/ml verdünnt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf die Verteilung der Partikelgröße untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Daraus ist ersichtlich, daß die 1:1-Zusammensetzung, bezogen auf eine Änderung der Partikelgröße stabil ist, wohingegen die Zusammensetzungen, die höhere molekulare Mengen von Cholesterinsulfat aufweisen, bei der Lagerung zunehmend weniger stabil sind. Tabelle 3 Lagerung in Tagen Partikeldurchmesser (Mittel ± S.D. nm) als Funktion des AMB/CHSO&sub4;/Mol-Verhältnisses (nach Dialyse)
Eine ähnliche Stabilitätsstudie wurde mit den gleichen Zusammensetzungen nach Lyophilisierung und Rekonstituierung in destilliertem Wasser, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben und zeigen (a) relativ kleine Zunahmen in der Größe für jede der vier Zusammensetzungen bei dem 8-Tage-Test und (b) geringe Auswirkungen auf die Größenänderungen auf die molare Menge an Cholesterinsulfat. Tabelle 4

Lagerung in Tagen Partikeldurchmesser (Mittel ± S.D. nm) als Funktion des AMB/CHSO&sub4;/Mol-Verhältnisses (nach Lyophilisierung)

Beispiel 4

Wirkung einer Kochsalzlösung und Plasma auf die Partikelgröße

Die vier Proben von Beispiel 1 wurden mit 0,9 %iger (Gew./Vol.) Kochsalzlösung auf annähernd 0,3 uMol/ml verdünnt und ihre Partikelgrößen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in der ersten Zeile in der folgenden Tabelle 5 angegeben. Bei jeder Formulierung erzeugte die Kochsalzlösung eine mehr als 10fache Zunahme der durchschnittlichen Partikelgröße. Das Größenwachstum der 1: 1-Zusammensetzung war im wesentlichen geringer als für jede der drei Zusammensetzungen mit größeren Mengen an Cholesterinsulfat.
Die vier Proben wurden auch mit Humanplasma im Verhältnis 1:1 (Vol./Vol.) verdünnt und anschließend (innerhalb weniger Minuten nach dem Kontakt mit dem Plasma) mit 10 mM Tris/HCl-Puffer verdünnt, der 0,1 mM EDTA und 10 % Lactose (Gew./Vol.) enthielt und einen pH von 7,4 aufwies, um damit die Größenbestimmung durchzuführen. Größenmessungen, die in der folgenden Tabelle 5 angegeben sind, wurden sofort nach der Verdünnung und dann noch 20 Minuten nach der Verdünnung durchgeführt. Die Werte zeigen, daß die 1:1-Formulierung beim Kontakt mit Plasma gegenüber einer Größenänderung am wenigsten empfindlich ist und daß alle Formulierungen bei einer Inkubation in verdünntem Medium über 20 Minuten eine Größenabnahme zeigen. Tabelle 5 Behandlung Partikeldurchmesser (Mittel ± S.D. nm) als Funktion des AMB/CHSO&sub4;/Mol-Verhältnisses (nach Dialyse) Verdünnung in Kochsalzlösung Mischung + Plasma, Verdünnung + Suspensionspuffer nach 20 Minuten
Ähnliche Größenbestimmungen wurden nach dem Mischen mit 0,9 %iger Kochsalzlösung oder Plasma an AMB/Cholesterinsulfat- Partikeln nach Lyophilisierung und Rehydratisierung mit destilliertem Wasser, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben. Dabei wurden Größenänderungen beobachtet, die denjenigen ähnlich sind wie sie mit den Partikeln vor Lyophilisierung zu sehen sind (Werte der Tabelle 5) Tabelle 6 Behandlung Partikelgröße (Mittel ± S.D. nm) als eine Funktion des AMB/CHSO&sub4;/Mol-Verhältnisses (nach Leophilisierung/Hydratisierung) Verdünnung in Kochsalzlösung Mischung + Plasma, Verdünnung + Suspensionspuffer nach 20 Minuten

Beispiel 5

Untersuchungen zur Einkapselung der Partikel

Es wurde die Fähigkeit der AMB/Cholesterinsulfat-Partikel untersucht, einen mit einem Radiolabel versehenen Marker einzukapseln. CHSO&sub4;/AMB-Partikel mit einem Mol-Verhältnis von 4:1 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Tris-Puffer-Medium, das zum Suspendieren der getrockneten AMB/Cholesterinsulfat-Mischung verwendet wurde, 1 uCi ¹&sup4;C-Sucrose enthielt. Die Suspension wurde auf eine Säule mit einem Sephadex G50 Ausschlußgel gegeben, das mit einem 10 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,1 mM EDTA, 10 % (Gew./Vol.) Lactose, pH 7,4, äquilibriert war und das aufgetragene Material wurde mit dem gleichen Puffer eluiert. Die Partikel wurden mit dem Leervolumen eluiert, was mittels UV-Absorption bei 280 nm verfolgt wurde. Die Proben wurden aufgefangen und mittels herkömmlicher Scintillationszählung auf Radioaktivität untersucht. Es wurde gefunden, daß 95 % des AMB im Partikel-Peak wiederzufinden ist, wohingegen kein nachweisbarer Peak von C¹&sup4;-Sucrose in diesem Bereich aufzufinden war.

Beispiel 6

Untersuchungen zum osmotischen Anschwellen

CHSO&sub4;/AMB-Formulierungen mit den vier verschiedenen Mol-Verhältnissen von AMB zu Cholesterinsulfat wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, (in dem üblichen Suspensionsmedium, das 10 % Lactose enthält). Diese Beispiele werden in der folgendem Tabelle 7 als Suspensionen nach der Dialyse oder Post-Dialyse-Suspensionen (P.D.) bezeichnet. Ein Teil von jeder Probe (der 10 % Lactose enthielt) wurde lyophilisiert und mit destilliertem Wasser rekonstituiert, und diese Proben werden in der Tabelle als lyophilisiert und rekonstituiert (L.R.) bezeichnet.
Die P.D.- und L.R.-Proben wurden jeweils auf 0,3 uMol/ml mit destilliertem Wasser verdünnt und die Größenverteilung der Partikel wurde sofort nach Verdünnung in dem hypotonen Medium sowie 20 Minuten nach der Verdünnung gemessen, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben. Wie daraus ersichtlich ist, tritt während der 20-minütigen Inkubationsdauer in keiner der untersuchten Proben ein merkbares Anschwellen auf, wie dies mittels einer Zunahme der durchschnittlichen Partikelgröße angezeigt wird. Tabelle 7 Mol-Verhältnis AMB/CHSO&sub4; Probe nach der Dialyse (PD) oder nach Lyophilisierung/Rehydratisierung (LR) Zeit (Min.) Partikelgröße (mittel ± S.D. nm)

Beispiel 7

Toxizität (LD&sub5;&sub0;) der Partikelsuspensionen

Aus nichtzuchtverwandten Individuen gezüchtete Swiss/Webster- Mäuse wurden von Simonsen Labs, Inc. erhalten. Die Tiere zeigten am Tage der Behandlung ein Gewicht von etwa 15 bis 45 g und waren zwischen 4 und 8 Wochen alt. Die Tiere wurden mindestens 3 Tage vor Beginn der Untersuchung in Quarantäne gehalten und es wurden nur Mäuse verwendet, die sich während der Quarantäne-Periode als gesund erwiesen. Den Tieren wurde Nahrung und Wasser ad libitum gegeben.
In einer ersten Studie wurden die Tiergruppen entweder mit Fungizone (Squibb) behandelt, das in einer sterilen Kochsalzlösung suspendiert war oder sie wurden mit einer 1:4 AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung behandelt, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde. In jedem Fall wurde die AMB-Konzentration derart eingestellt, daß die gewählte AMB-Dosis (in Tabelle 8 angegeben) in einem Endvolumen von 0,2 ml verabreicht werden konnte. Vier bis acht Tiere wurden für jede Dosis-Gruppe verwendet. Das Testmaterial wurde durch eine einzelne intravenöse Injektion über die laterale Schwanzvene verabreicht. Jede Dosis wurde über einen Zeitraum von etwa 1,5 Minuten verabreicht.
Die Tiere wurden am Behandlungstag mindestens 3 mal (1, 2 und 4 Stunden nach der Behandlung) auf Anzeichen von Toxizität und Tod hin untersucht. Während der verbleibenden Untersuchungszeit von 5 Tagen wurden die Tiere täglich, und zwar am Morgen und am Nachmittag, untersucht. Die Testergebnisse, die als Verhältnis der Anzahl von Überlebenden am 5. Tag zur Gesamtanzahl der behandelten Tiere angegeben sind, sind in Tabelle 8 aufgeführt. Der LD&sub5;&sub0;-Wert für Fungizone, der mittels herkömmlichen Verfahren berechnet wurde, beträgt 3,2 mg/kg. Der LD&sub5;&sub0;-Wert für die AMB/Cholesterinsulfat-Zusammensetzung liegt zwischen 15 und 20 mg/kg. Tabelle 8 Behandlung Anzahl der Überlebenden am 5. Tag (nach Injektion/Gesamtzahl der behandelten Tiere) FUNGIZONE
In einem zweiten Toxizitätstest wurden Mäuse mit 20 mg/kg von einer der vier AMB/Cholesterinsulfat-Formulierungen von Beispiel 1 behandelt, wobei die Arzneimittelverabreichung und das Monitoring der Tiere wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde. Die Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle 9 angegeben sind, zeigen, daß die 1:1-Formulierung einen LD&sub5;&sub0;-Wert von mehr als 20 mg/kg aufweist. Tabelle 9 Behandlung (AMB/CHSO&sub4;) Anzahl der Überlebenden am 5. Tag (nach Injektion/Gesamtzahl der behandelten Tiere) Molverhältnis
Ein dritter Toxizitätstest wurde durch ein unabhängiges Labor durchgeführt, das männliche Crl:CD-1(ICR)BR-Mäuse von 18-20 g verwendete, die vom Charles River Laboratorium (Wilmington, MA) erhalten wurden. Die AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen enthielten entweder die Molverhältnisse 1:4 oder 1:1 von AMB:Cholesterinsulfat und wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Fungizone und freies AMB wurden in pyrogen-freiem Wasser gelöst und 10 Minuten bei Raumtemperatur ultraschallbehandelt. Alle Arzneistoffpräparationen wurden mit einem geeigneten Verdünnungspuffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
Nichtinfizierte Mäuse erhielten eine Einzeldosis von einer der AMB-Präparationen durch langsame intravenöse Bolus-Injektion. Die Dosen für die AMB/CHSO&sub4;-Cholesterinsulfat-Formulierungen betrugen 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 und 0,94 mg AMB/kg Körpergewicht. Die Dosen für Fungizone und freies AMB betrugen 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 mg AMB/kg Körpergewicht. Die Mortalität wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen nach der Behandlung bestimmt und die Dosis von 50 % Letalität (LD&sub5;&sub0;) wurde mittels Standard-Verfahren für jede der Präparationen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Wie daraus zu sehen ist, sind die LD&sub5;&sub0;-Werte der 1:1 und 1:4 AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen um ein mehrfaches höher als diejenigen für freies AMB oder Fungizone , wobei die 1:1-Formulierung einen LD&sub5;&sub0;-Wert von mehr als 30 mg/kg aufwies. Tabelle 10 LD&sub5;&sub0; (mg/kg/Dosis) (95 % Conf. Int.) AMB Form freies AMB Fungizone
Vor kurzem wurde die Toxizität der 1:4 und 1:1 AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen von anderen unabhängigen Laboratorien getestet, wobei Bolus-Injektionen von bis zu 40 mg AMB/kg Körpergewicht untersucht wurden. Diese Studien zeigten einen LD&sub5;&sub0;-Wert für die 1:1 AMB/CHSO&sub4;-Formulierung von mehr als 40 mg/kg.

Beispiel 8

Wirksamkeit der AMB/Cholesterinsulfat-Formulierung

Cr1:CFW(SW)BR-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g wurden vom Charles River Zuchtlaboratorium erhalten und es wurde ihnen Nahrung und Wasser ad libitum gegeben. Stamm 30 von C. albicans wurde bei 35 ºC auf SDA (Sabourand Dextrose A Gas) 18 Stunden lang gezüchtet und der Organismus wurde geerntet und mit steriler nichtpyrogener Kochsalzlösung verdünnt, wobei etwa 7 x 10&sup8; Kolonie-bildende Einheiten in einem 0,2 ml Volumen erhalten wurden.
Acht bis zehn Tieren wurde in die Schwanzvene jeweils 0,2 ml der obigen C. albicans-Mischung injiziert. Zwei Tage nach der Pilzinjektion wurden den Tieren abgestufte Dosen von Fungizone oder AMB/Cholesterinsulfat (1:4) das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, injiziert. Die AMB-Präparationen wurden bezüglich ihrer Konzentration derart eingestellt, daß jedes Tier ein Gesamtvolumen von ml enthielt, das intravenös über die Schwanzvene verabreicht wurde. Die Menge an verabreichtem AMB, die in mg Arzneistoff/kg Körpergewicht des Tieres angegeben ist, ist links in der Tabelle 10 angeführt. Die Tiere wurden 25 Tage lang nach der Arzneimittelverabreichung überwacht. Die Anzahl der Überlebenden nach 25 Tagen bezogen auf die gesamte Anzahl der untersuchten Tiere ist in der Tabelle für die zwei AMB-Präparationen und für die Kontrolle mit Puffer angegeben. Tabelle 11 Überlebende nach 25 Tagen/Gesamtzahl an behandelten Tieren Dosis freies AMB Kontrolle
In einer zweiten Studie wurden männliche Crl:CD-1(ICR)BR-Mäuse mit einem Gewicht von 18-20 g mit 0,1 ml C. albicans (10&sup6; Zellen/Tier) infiziert und in Behandlungsgruppen von 10 Tieren pro Gruppe aufgeteilt. Freies AMB und 1:1 sowie 1:4 B/CHSO&sub4;-Formulierungen wurden ebenso wie in Beispiel 7 und in Beispiel 1 hergestellt. Infizierte Mäuse erhielten zwei Dosen von jeder Arzneistoffpräparation am Tage der Infektion und zwei weitere Dosen am folgenden Tag durch intravenöse Verabreichung bis zu einer Gesamtmenge von 4 Dosen. Die Spiegel der Einzeldosis von AMB betrugen bei jeder Testgruppe 0,5, 0,125 und 0,031 mg AMB/kg Körpergewicht/DOSIS. Eine Kontrollgruppe erhielt nur den Verdünnungspuffer. Die Mäuse wurden bezüglich ihrer Mortalität für einen Zeitraum von 30 Tagen nach der Infektion überwacht. Die Dosis von 50 %igem Schutz bzw. die 50 % protektive Dosis (PD&sub5;&sub0;) wurde aus den Überlebensdaten mittels konventionellen Methoden berechnet.
In Tabelle 12 sind die PD&sub5;&sub0;-Werte zusammengefaßt, die für die zwei AMB/CHSO&sub4;-Formulierungen und für freies AMB erhalten wurden. Beide der AMB-CHSO&sub4;-Formulierungen waren so wirksam wie das freie AMB bei der Behandlung der Pilzinfektionen. Tabelle 12 PD&sub5;&sub0; (mg/kg/Dosis) (95 % Conf. Int.) Amphotericin B Form Freies AMB
Die Überlebenskurven der obigen Studie sind in Fig. 1A-1C angegeben, wie dies zuvor diskutiert ist. Die Kurven zeigen im besonderen die größere Wirksamkeit der Behandlung mit einer 1:1 AMB/CHSO&sub4;-Formulierung bei höheren AMB-Dosisspiegeln gegenüber freiem AMB.
Obwohl die Erfindung bezüglich spezifischer Ausführungsformen, Verwendungen und Herstellungsmethoden beschrieben und veranschaulicht worden ist, ist es offensichtlich, daß eine Vielzahl von Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können ohne daß dabei vom Umfang der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Amphotericin B-Zusammensetzung, umfassend Partikel von Amphotericin B, die Cholesterinsulfat in einem Molverhältnis von Amphotericin B zu Cholesterinsulfat von 1:1 bis 1:4 enthalten.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Partikel in einem wäßrigen Medium suspendiert sind und eine Partikelgröße zwischen 100-400 nm aufweisen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, die durch die Verfahrensschritte erhalten wurde:

(a) Dispergieren einer wäßrigen Suspension von Amphotericin B und Cholesterinsulfat in einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:4 bis zur optischen Klärung,

(b) Lyophilisieren der Suspension in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, ehe die Partikelgröße in der Suspension wesentlich zunimmt und

(c) Rekonstituieren des lyophilisierten Materials mit einem wäßrigen Medium.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Molverhältnis von Amphotericin B und Cholesterinsulfat etwa 1:1 beträgt.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der Behandlung von Pilzinfektionen.

6. Verfahren zur Herstellung von Amphotericin B in einer Form, die einen LD&sub5;&sub0;-Wert von größer als 15 mg/kg aufweist, und die mit einem wäßrigen Medium zu Partikeln mit einer Größe zwischen 100-400 nm rekonstituiert werden kann, umfassend

(a) Dispergieren einer wäßrigen Suspension von Amphotericin B und Cholesterinsulfat in einem Molverhältnis zwischen 1:1 bis 1:4, bis zur optischen Klärung und

(b) Lyophilisieren der Suspension in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, ehe die Größe der Partikel in der Suspension wesentlich zunimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem das Molverhältnis von Amphotericin B zu Cholesterin in der Suspension etwa 1:1 beträgt.