DE3587639T3

DE3587639T3 - Entwässerte liposome.

Info

Publication number: DE3587639T3
Application number: DE3587639T
Authority: DE
Inventors: Andrew S. Yardley JANOFF; Pieter R. Cullis; Marcel B. Bally; Michael W. Princeton FOUNTAIN; Richard S. Jamesburg GINSBERG; Michael J. Hope; Thomas D. Madden; Hugh P. Yardley SCHIEREN; Regina L. Trenton JABLONSKI
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1984-08-08
Filing date: 1985-08-07
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2005-08-08
Also published as: IE68686B1; US5578320A; DE3588148T2; DE3587639D1; EP0190315B2; ES8701516A1; ATE149347T1; IE851965L; CA1294548C; CA1283604C; EP0561424A1; JPH0818973B2; DE3588148D1; US5922350A; DE3588146T2; JP2579441B2; US4880635B1; EP0562641B1; CA1270197C; DE3587639T2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Anwendungsgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Liposome und insbesondere entwässerte (im folgenden: dehydratisierte) Liposome, die für längere Zeiträume gelagert und anschließend wieder mit Wasser versetzt (im folgenden: rehydratisiert) werden können, wann und wo sie eingesetzt werden sollen.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Aus dem Stand der Technik ist gut bekannt, daß Liposome geschlossene Vesikel sind mit wenigstens einer Lipid-Bilayer-Membran, die einen wäßrigen Kern umgibt. Eine der Hauptverwendungen für Liposome sind Träger für eine Vielzahl von Materialien, wie Arzneimittel, Kosmetika, diagnostische Mittel, bioaktive Verbindungen und ähnliche.
In Verbindung mit jeder dieser Verwendungsarten ist es wichtig, die Liposome für längere Zeiträume lagern zu können, ohne dass es zu einem erheblichen Austritt der ausgewählten Materialien kommt, die die Liposome tragen. Insbesondere müssen Liposompräparationen, damit sie im kommerziellem Rahmen einsetzbar sind, eine genügend lange Lagerfähigkeit haben, damit sie leicht hergestellt, transportiert und durch Zwischen- und Endverbraucher unter einer Vielzahl von Temperaturbedingungen gelagert werden können.
Insbesondere in Hinblick auf die Arzneimittelindustrie ist es wichtig, in der Lage zu sein, Arzneimittelhersteller mit unbeladenen Liposomen zu versorgen, die der Hersteller anschließend in seinen eigenen Anlagen mit seinen eigenen Arzneimitteln beladen kann. Ein solches Zwei-Stufen- oder Zwei-Firmen-Verfahren (d. h. Herstellung unbeladener Liposomen in einer ersten Anlage und anschließend Befüllung dieser in einer zweiten Anlage) würde den Arzneimittelherstellern gestatten, eine definierte Ware, d.h. unbeladene Liposome, von den Herstellern zu kaufen, und anschließend diese Ware als eine von der Lagerung unabhängige Komponente ihres Endproduktes zu verwenden.
Wenn Arzneimittelhersteller gegenwärtig ihr Geschäft betreiben, bevorzugen sie in starkem Maße, definierte Waren von Zulieferern zu kaufen und anschließend das Endprodukt auf ihren eigenen Anlagen zusammenzusetzen. Auf diese Weise können sie selbst die Qualität der Endprodukte steuern. Der Einsatz der Liposomtechnologie durch die Arzneimittelindustrie würde in starkem Maße gefördert werden, wenn Liposome den Herstellern ebenfalls als eine definierte Ware bereitgestellt werden könnten. Bisher hatten Liposompräparationen im allgemeinen relativ kurze Lagerfähigkeiten. Darüber hinaus ist bisher kein Weg bekannt geworden, Liposome zu einem Zeitpunkt herzustellen und sie dann mit ausgewählten Materialien zu einem wesentlich späteren Zeitpunkt zu füllen. Die vorliegende Erfindung überwindet diese vorhandenen Mängel des bisher bekannten Standes der Technik.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf den obigen Stand der Technik ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Liposompräparationen bereitzustellen, die über verlängerte Zeiträume gelagert werden können ohne erheblichen Austritt der in den Liposomen eingekapselten Materialien.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Liposompräparationen bereitzustellen, die dehydratisiert werden können, während des dehydratisierten Zustandes für längere Zeiträume gelagert werden können und anschließend, wenn und wo sie einbesetzt werden sollen, rehydratisiert werden ohne Verlust eines wesentlichen Teiles ihres Inhalts während der Dehydratisierungs-, Lagerungs- und Rehydratisierungsverfahren.
Es ist ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, Liposompräparationen bereitzustellen, die dehydratisiert, für längere Zeiträume im dehydratisierten Zustand gelagert, rehydratisiert und anschließend mit ausgewählten Materialien befüllt werden können.
Um diese und andere Ziele der Erfindung zu erreichen und in Übereinstimmung mit einem ihrer Aspekte wird ein Verfahren zur Dehydratisierung von Liposomen bereitgestellt, wie es in den Ansprüchen 1 bis 7 beansprucht ist, sowie Liposompräparationen, die in Gegenwart von einem oder von mehreren Schutzzuckern dehydratisiert worden sind, wie in den Ansprüchen 8 bis 12 beansprucht. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Zucker ausgewählt aus der Gruppe, die aus Trehalose, Maltose, Lactose, Saccharose, Glucose und Dextran besteht, wobei die am meisten bevorzugten Zucker vom Standpunkt ihrer Leistungsfähigkeit Trehalose und Saccharose sind.
Die Dehydratisierung erfolgt unter Vakuum und kann entweder mit oder ohne vorherigem Einfrieren der Liposomfraktionen stattfinden.
Gemäß anderen Aspekten der Erfindung wird eine verzögerte Beladung der vorgeformten Liposome erreicht durch Herstellen eines Konzentrationsgradienten über die Liposommembranen hinweg von einem oder mehreren geladenen Spezies, die unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, diese Membranen zu passieren. Dieser Konzentrationsgradient wird dazu verwendet, ausgewählte geladene Materialien, z. B. Arzneimittel, in die Liposome einzutragen (die Liposomen zu beladen) durch Hervorrufen eines Transmembranpotentials.
Es wurde herausgefunden, daß Liposome, die einen Konzentrationsgradienten über ihre Membran hinweg haben, in Gegenwart von einem oder mehreren Zuckern dehydratisiert werden können, wie oben und detaillierter weiter unten beschrieben wurde, daß sie in ihrem dehydratisierten Zustand gelagert werden können, anschließend rehydratisiert werden können und der Konzentrationsgradient dann dazu verwendet werden kann, um ein Transmembranpotential herzustellen, das geladene Materialien in die Liposomen einträgt. Alternativ dazu kann der Konzentrationsgradient hergestellt werden, nachdem die Liposomen dehydratisiert, gelagert und rehydratisiert wurden.
Die Erreichung der vorgenannten und anderen Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird vollständig weiter unten im Zusammenhang mit der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Retention von ²²Na⁺ durch dehydratisierte/rehydratisierte Vesikel als eine Funktion der Trehalosekonzentration. Große unilamellare Vesikel wurden ohne vorheriges Einfrieren (leere Kreise) oder nach Einfrieren in flüssigem Stickstoff (leere Quadrate) getrocknet.
2 zeigt elektronenmikroskopische Gefrierbruch-Aufnahmen von Vesikeln vor (2a – Kontrolle) und nach (2b – gefriergetrocknet) Dehydratisierung/Rehydratisierung mit vorherigem Einfrieren. Ei-Phosphatidylcholin-Vesikel wurden hergestellt durch Extrudieren von großen multilamellaren Vesikeln durch einen 100 nm Polycarbonatfilter. Die Vesikel wurden in Gegenwart von 250 mM Trehalose dehydratisiert.
3 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen eines Gefrierbruches von Ei-Phosphatidylcholin-Vesikeln vor und nach der Dehydratisierung. Diese Vesikel wurden hergestellt durch Extrusion großer multilamellarer Vesikel durch einen 100 nm Polycarbonatfilter. 3a zeigt die Vesikel vor der Dehydratisierung. 3b zeigt die wesentlich größeren Strukturen, die durch Dehydratisieren und anschließendes Rehydratisieren der Vesikel ohne Verwendung von Trehalose erhalten wurden. 3c bzw. 3d zeigen die Vesikel nach Dehydratisierung und Rehydratisierung in Gegenwart von 50 mM bzw. 125 mM Trehalose. Der Durchmesser des großen Liposoms in 3b beträgt etwa 900 nm, und die Pfeile in der oberen rechten Ecke der Figuren zeigen die Richtung der Abschattung.
4 zeigt die Retention von ³H-Inulin als Funktion der Trehalosekonzentration. Große unilamellare Vesikel, die eingeschlossenes H-Inulin enthalten, wurden unter Hochvakuum ohne vorheriges Einfrieren getrocknet.
5 zeigt den Einfluß der Natriumchloridkonzentration auf die Menge von ²²Na⁺, die durch die dehydratisierten/rehydratisierten Vesikel zurückgehalten wird. Die Vesikel wurden in Gegenwart von 250 mM Trehalose unter Hochvakuum für 24 Stunden getrocknet.
6 zeigt die Transmembranpotentiale, die durch einen pH-Gradienten für Kontrollvesikel (Quadrate) und dehydratisierte/rehydratisierte Vesikel (Kreise) erzeugt wurden. Die Vesikel mit einem vorher existierenden Protonengradienten wurden bei 4°C für 24 Stunden (Kontrolle) oder dehydratisiert in Gegenwart von 250 mM Trehalose unter Hochvakuum für den gleichen Zeitraum gehalten. Das in den Vesikeln nach der Rehydratisierung beobachtete Potential wurde in Abwesenheit von CCCP (leere Kreise und Quadrate) oder mit vorhandenen 20 uM CCCP volle Kreise und Quadrate) bestimmt unter Verwendung der Sonde ³H-Tetraphenylphosphoniumbromid. Die in den Vesikeln beobachteten Transmembranpotentiale ohne einen pH-Gradienten in Gegenwart und in Abwesenheit von CCCP werden durch die vollen bzw. leeren Dreiecke verdeutlicht.
7 zeigt die Transmembranpotentiale, die durch einen chemischen Na⁺/K⁺-Gradienten für Kontrollvesikel (Quadrate) und dehydratisierte/rehydratisierte Vesikel (Kreise) erzeugt wurden. Die Vesikel mit einem vorher existierenden Na⁺/K⁺-Gradienten wurden bei 4°C für 24 Stunden (Kontrolle) oder dehydratisiert in Gegenwart von 250 mM Trehalose unter Hochvakuum für den gleichen Zeitraum gehalten. Das in den Vesikeln beobachtete Potential nach Rehydratisie- rung wurde in Abwesenheit von Valinomycin (volle Kreise und Quadrate) bestimmt oder mit vorhandenen 0,5 μg/μMol Phospholipid-Valinomycin (leere Kreise und Quadrate) unter Verwendung der Sonde ³H-Tetraphenylphosphoniumbromid. Die in den Vesikeln beobachteten Transmenbranpotentiale, die Kaliumglutamat auf beiden Seiten der Membran in Gegenwart und in Abwesenheit von Valinomycin aufwiesen, sind durch die leeren bzw. vollen Dreiecke entsprechend dargestellt.
8 erläutert die Verwendung eines Transmembranpotentials zur Beladung von vorher getrockneten Vesikeln durch Adriamycin. Die Vesikel mit einem vorher existierenden Na⁺/K⁺ Gradienten wurden für 24 Stunden in Gegenwart von 250 mM Trehalose dehydratisiert. Nach der Rehydratisierung wurde die Fähigkeit der Vesikel gemessen, Adriamycin in Gegenwart (leere Kreise) oder Abwesenheit (volle Kreise) von Valinomycin (0,5 μg/μMol Phospholipid) anzusammeln. Die Kontrollvesikel, die bei 4°C für den gleichen Zeitraum gehalten wurden, wurden ebenso in Gegenwart (leere Quadrate) oder Abwesenheit (volle Quadrate) von Valinomycin getestet.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie oben beschrieben betrifft die vorliegende Erfindung Liposome, die einer Langzeitlagerung unterworfen werden können, ohne daß ein wesentlicher Verlust ihres inneren Inhalts auftritt. Die Liposome werden in einem dehydratisierten Zustand gelagert, und die Dehydratisierung wird in Gegenwart von einem oder mehreren Schutzzuckern durchgeführt.
Die Liposome, die zu dehydratisieren sind, können eine Vielzahl von Zusammensetzungen und inneren Inhaltsstoffen aufweisen und liegen in Form von großen unilamellaren Vesikeln vor.
Die erfindungsgemäßen Liposomen können wie in der gemeinsam übertragenen und parallel anhängigen WO 86/00238 mit dem Titel "Extrusionsverfahren zur Herstellung unilammelarer Vesikel" beschrieben hergestellt werden. Techniken, wie sie für die Herstellung großer unilamellarer Liposome (LUVs) eingesetzt werden, wie die Umkehrphasenverdampfung, Infusionsverfahren und Detergensverdünnung können zur Herstellung der Liposomen verwendet werden. Ein Überblick über diese und andere Verfahren zur Herstellung von Liposomen können in dem Text Liposome, Marc J. Ostro, Hrsg. Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1; siehe auch Szoka, Jr. et al., (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioengr., 9:467 gefunden werden.
Als weitere Alternativen können die Liposome gemäß den Verfahren hergestellt werden, die in US-A-4522803, US-A-4588578 und US-A-4721612 beschrieben wurden, wie oben angeführt, oder gemäß den Frost-Tau-Verfahren, wie sie in US-Patentanmeldung Nr. 752423 beschrieben wurde, auf die ebenfalls oben Bezug genommen wurde. Im Gegensatz zur Verwendung von Liposomen per se, können auch Lipid-enthaltende Teilchen, wie jene, die in US-A-4610868 beschrieben sind, auf die oben Bezug genommen wurde, bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Weiterhin kann gewünschtenfalls den Liposomen oder den Lipid-enthaltenden Teilchen, die zu dehydratisieren sind, eine gleichmäßigere Größenverteilung verliehen werden, indem sie dem Verfahren gemäß der gemeinsam übertragenen und parallel anhängigen WO 86/00238 mit dem Titel "Liposome mit definierten Größenverteilungen" unterzogen werden.
Die Liposome werden vorzugsweise unter Verwendung von Standardausrüstungen für die Gefriertrocknung oder äquivalenten Vorrichtungen dehydratisiert, d.h., sie werden vorzugsweise unter verringertem Druck dehydratisiert. Falls gewünscht, können die Liposome und deren umgebendes Medium in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, bevor sie dehydratisiert werden. Alternativ dazu und sehr überraschend können die Liposomen auch ohne vorheriges Einfrieren dehydratisiert werden, indem sie einfach unter verringerten Druck gebracht werden. Die Dehydratisierung ohne vorheriges Einfrieren dauert länger als die Dehydratisierung mit vorherigem Einfrieren, jedoch ist der Gesamtprozeß ohne die Einfrierstufe sanfter und dadurch gibt es im allgemeinen weniger Beschädigungen der Liposomen und einen entsprechend geringeren Verlust des inneren Inhalts der Liposomen. Zum Beispiel kann die Dehydratisierung ohne vorheriges Einfrieren bei Raumtemperatur und bei einem verringerten Druck unter Anwendung einer Vakuumpumpe, die fähig ist, einem Druck im Bereich von 1 mm Quecksilber zu erzeugen, zwischen etwa 24 und 36 Stunden dauern, während die Dehydratisierung mit vorherigem Einfrieren unter den gleichen Bedingungen zwischen etwa 12 und 24 Stunden dauern kann.
Damit die Liposome das Dehydratisierungverfahren ohne Verlust eines wesentlichen Teiles inneren inneren Inhaltes überstehen, ist es wichtig, daß ein oder mehrere Schutzzucker verfügbar sind, um mit den Liposommembranen zusammenzuwirken und sie intakt zu halten, wenn das Wasser im System entfernt wird. Eine Vielzahl von Zuckern kann verwendet werden, einschließlich solcher Zucker wie Trehalose, Maltose, Saccharose, Glucose, Lactose und Dextran. Im allgemeinen wurde festgestellt, daß Disaccharidzucker besser wirken als Monosaccharidzucker, wobei die Disaccharidzucker Trehalose und Saccharose am wirksamsten sind. Es können auch andere kompliziertere Zucker verwendet werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß Aminoglycoside einschließlich Streptomycin und Dihydrostreptomycin die Liposome während der Dehydratisierung schützen. Der oder die Zucker sind Teil von entweder dem inneren oder dem äußeren Medium der Liposomen. Am meisten bevorzugt sind die Zucker sowohl im inneren als auch im äußeren Medium enthalten, so dass sie sowohl an der inneren als auch an der äußeren Oberfläche der Liposommembranen Wechselwirken können. Das Einbringen in das innere Medium erfolgt durch Zugabe des Zuckers oder der Zucker zu dem Gelösten, das von den Liposomen eingekapselt werden soll. Da in den meisten Fällen diese Lösung auch das Badmedium für die fertigen Liposomen bildet, sind die in der Lösung vorhandenen Zucker somit auch Teil des äußeren Mediums. Wenn ein äußeres Medium verwendet wird, das nicht die ursprüngliche Lösung ist, z.B. um ein Transmembranpotential herzustellen (siehe unten), sollte natürlich das neue äußere Medium auch einen oder mehrere der Schutzzucker enthalten.
Die Menge des zu verwendenden Zuckers hängt von der Art des verwendeten Zuckers den den Merkmalen der zu schützenden Liposomen ab. Wie durch die Beispiele 1 bis 5 unten erläutert, können Fachleute verschiedene Zuckertypen und -konzentrationen testen, um die beste Kombination für eine bestimmte Liposompräparation zu ermitteln. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass Zuckerkonzentrationen in der Größenordnung von 100 mM und darüber ausreichen, um höchste Schutzniveaus zu erreichen. Ausgedrückt als Mole des Membranphospholipids entsprechen millimolare Niveaus im Bereich von 100 mM etwa 5 Molen Zucker pro Mol Phospholipid.
Wenn die Liposomen dehydratisiert worden sind, können sie für längere Zeiträume bis zu ihrer Verwendung gelagert werden. Die angemessene Temperatur für die Lagerung hängt von der Ausführung der Liposomen und von der Temperaturempfindlichkeit der eingekapselten Materialien ab. So ist z. B. aus dem Stand der Technik bekannt, dass verschiedene Arzneimittelpräparationen hitzeunbeständig sind. Somit sollten dehydratisierte Liposome, die solche Arzneimittel enthalten, unter Kühlbedingungen gelagert werden, so daß die Arzneimittel ihre Wirksamkeit nicht verlieren. Für derartige Arzneimittel wird das Dehydratisierungsverfahren auch vorzugsweise eher bei verringerten Temperaturen als bei Raumtemperatur durchgeführt.
Wenn die dehydratisierten Liposome verwendet werden sollen, erfolgt die Rehydratisierung durch einfache Zugabe einer wäßrigen Lösung, z. B. von destilliertem Wasser, zu den Liposomen, wodurch die Rehydratisierung eintreten kann. Die Liposome können in der wäßrigen Lösung durch mäßiges Rühren der Lösung resuspendiert werden. Die Rehydratisierung kann bei Raumtemperatur oder bei anderen Temperaturen erfolgen, entsprechend der Zusammensetzung der Liposome und deren inneren Inhalt.
Wie oben diskutiert ist es für bestimmte Anwendungsarten, z. B. die Arzneimittelverabreichung, wünschenswert, den Prozeß der Beladung der Liposomen von deren Herstellung zu trennen. Dies kann erfolgen, indem ein Transmembranpotential über die Membranen der vorgeformten Liposome hinweg hergestellt wird und dieses Transmembranpotentials verwendet wird, um geladene Materialien, z. B. geladene Arzneimittel, in die Liposome einzubringen. Das Transmembranpotential wird erzeugt durch Herstellen eines Konzentrationsgradienten für einen oder mehrere geladene Spezies (z. B. K⁺ und/oder H⁺) über die Liposommebranen hinweg. Der Konzentrationsgradient wird hergestellt durch Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen inneren und äußeren Medien, d.h. das innere und äußere Medium weisen unterschiedliche Konzentrationen des oder der geladenen Spezies auf.
Speziell werden Liposomen hergestellt, die ein erstes Medium einkapseln mit einer ersten Konzentration von einem oder mehreren geladenen Spezies. Für eine typische Liposompräparationstechnik (siehe Erörterung oben) umgibt dieses erste Medium die Liposomen, wenn sie gebildet werden, und somit hat das ursprüngliche äußere Medium der Liposomen die gleiche Zusammensetzung wie das erste Medium. Um den Konzentrationsgradienten auszubilden, wird das ursprüngliche äußere Medium ersetzt durch ein neues äußeres Medium mit einer unterschiedli chen Konzentration der einen oder mehreren geladenen Spezies. Das Ersetzen des äußeren Mediums kann durch verschiedene Techniken erfolgen, beispielsweise indem die Liposompräparation durch eine Gelfiltrationssäule geleitet wird, z. B. eine Sephadex-Säule, die mit dem neuen Medium äquilibriert wurde, oder durch Zentrifugieren, Dialyse oder ähnliche Techniken.
In Abhängigkeit von der Durchlässigkeit der Liposommembranen bildet sich das volle Transmembranpotential entsprechend des Konzentrationsgradienten entweder spontan, oder es kann ein die Durchlässigheit verstärkendes Mittel, z. B. ein Ionophor wie Valinomycin zu dem Badmedium hinzugegeben werden (es ist zu beachten, daß gewünschtenfalls das die Durchlässigkeit verstärkende Mittel aus der Präparation, nachdem die Beladung beendet ist, unter Einsatz von Chromatografie oder anderer Techniken entfernt werden kann). In jedem Fall bildet sich über die gesamte Membram der Liposomen hinweg ein Transmembranpotential aus in einer Größenordnung, die durch die Nernst'sche Gleichung definiert wird. Dieses Transmembranpotential führt dazu, daß geladene Materialien z. B. geladene Arzneimittel in die Liposomen eingetragen werden (Beladung der Liposomen). Insbesondere führt das Transmembranpotential dazu, daß solche Materialien, deren Ladung entgegengesetzt zu dem inneren Potential der Liposomen ist (outside ground) sich innerhalb der Liposomen ansammelt. Somit kann durch Zugabe des Materials, das man in die Liposome einbringen möchte, in das äußere Medium und durch Wahl des Konzentrationsgradienten, so dass das Transmembranpotential die geeignete Orientierung hat, das Einbringen (Beladen) der Liposomen als eine separate Verfahrensmaßnahme gegenüber der Herstellung der Liposomen erfolgen.
Die Kombination von Transmembranpotential-Beladung und Liposomdehydratisierung gestattet eine große Flexibilität im Gesamtverfahren zur Herstellung der fertigen, beladenen Liposomen. Zum Beispiel können Liposomen, die die gleichen inneren und äußeren Medien, d.h. keine Transmembranpotentiale, haben, herge- stellt, dehydratisiert, gelagert und rehydratisiert werden, und anschließend kann das äußere Medium durch ein neues Medium ersetzt werden, das eine Zusammensetzung hat, die Transmembranpotentiale erzeugt, und die Transmenbranpotentiale dazu verwendet werden, die Liposome zu beladen. Alternativ dazu können Liposome, die innere und äußere Medien haben, die Transmembranpotentiale erzeugen, hergestellt, dehydratisiert, gelagert, rehydratisiert und anschließend beladen werden unter Verwendung der Transmembranpotentiale.
In jedem Falle können die unbeladenen Liposomen, wenn sie im dehydratisierten Zustand vorliegen, gelagert, transportiert und anderweitig leicht gehandhabt werden. Insbesondere entsprechen die dehydratisierten unbeladenen Liposome genau dem Typ von definierter Handelsware, die Arzneimittelhersteller zu kaufen bevor zugen, und sie befriedigen daher ein lange bestehendes Bedürfnis für ein Liposomprodukt dieser Art (siehe Diskussion oben).
Eine besonders wichtige Anwendung dieser Verfahren von Transmembranpotentialbeladung und/oder Liposomdehydratisierung liegt auf dem Gebiet der Verabreichung von antineoplastischen Mitteln, wie Adriamycin (siehe Beispiele 1 und 6). Eine weitere Erörterung dieser Anwendung kann in der gleichfalls anhängigen und gemeinsam übertragenen WO 86/01102 unter dem Titel "Verkapselung von antineoplastischen Mitteln in Liposomen" gefunden werden.
Die vorliegende Erfindung wird vollständiger in den folgenden Beispielen erläutert. Nachfolgend die Materialien und Verfahren, die in den unterschiedlichen Beispielen gemeinsam verwendet wurden.
Materialien und Verfahren
Materialien
Unter Einsatz von Standardverfahren (siehe zum Beispiel Singleton et al., (1965) Journal of the American Oil Chemical Society, 42:53) wurde Ei-Phosphatidylcholin (EPC) isoliert und hatte eine Reinheit von mehr als 99%, wie durch TLC bestimmt. Trehalose, Maltose, Saccharose und Glucose wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) erhalten, während Lactose von der Fisher Scientific Company (Fairlawn, N.J.) gekauft wurde. ²²Na⁺, ³H-Inulin, ³H-Tetraphenylphosphoniumbromid und ³H-H₂O wurden von New England Nuclear (Lachine, Quebec) erhalten. Adriamycin wurde erhalten von Adria Laboratory (Mississauga, Ontario).
Vesikelherstellung
Vesikel wurden hergestellt nach den Extrusionsverfahren, die in WO 86/00238 beschrieben wurden, auf die oben Bezug genommen wurde. Eine vollständige Beschreibung der verwendeten Techniken erfolgt in jener Anmeldung. Vesikel, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden, werden hier als ETVs bezeichnet, d.h. Extrusion Technique Vesikel.
Es wurden 80 μMol Ei-Phosphatidylcholin mit 2 ml 150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,4), die die angezeigte Konzentration von Trehalose oder anderen Zuckern enthielten, hydratisiert. In jenen Fällen, wo die Menge des restlichen Wassers, das nach der Dehydratisierung vorhanden war, bestimmt wurde, wurde ³H-H₂O (30 μCi) zu der HEPES-Puffer/Zuckerlösung hinzugegeben. ²²Na₊ (5μCi) oder 3H-Inulin (5 μCi; spezifische Aktivität 409 mCi/g), wurden zu dem trockenen Lipid vor der Hydratisierung hinzugegeben.
Das Gemisch wurde durch Verwirbelung dispergiert und anschließend zehnmal durch zwei aufeinandergestapelte Polycarbonatfilter von 100 nm Porengröße (Nuclepore, Inc., Pleasanton, CA) unter Einsatz eines Druckes von 250 psi durchlaufen gelassen. In den Fällen, wo mit einem Frost-Tau-Verfahren gearbeitet wurde, wurden die Vesikel wie oben hergestellt, einmal einem Frost-Tau-Zyklus unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen, und anschließend wurden sie nochmals wiederholt durch die gestapelten Filter gegeben.
Nicht eingekapseltes ²²Na⁺ oder ³H-Inulin wurde entfernt, indem die Vesikel durch eine Säu1e (1,4 × 10 cm) mit entweder Sephades G-50 (fein) zur Entfernung von ²²Na⁺ oder Ultragel AcA 34 zur Entfernung von ³H-Inulin gegeben wurde. Dieses Verfahren verdünnte allgemein den Phospholipidgehalt der Probe um etwa 50%, wobei man eine Konzentration von etwa 20 μMol Phospholipid pro Milliliter erhält.
Dehydratisierung
Proben (1 ml) wurden in 10 ml Kimex-Röhrchen bei Raumtemperatur unter Hochvakuum unter Verwendung eines Virtis-Gefriertrockners (Gardiner, N.Y.) getrocknet. In einigen Fällen wurden die Proben vor der Dehydratisierung in flüssigem Stickstoff eingefroren. In jedem Falle wurde das Dehydratisierungsverfahren unter Verwendung eines verringerten Drucks für etwa 24 Stunden durchgeführt.
Rehydratisierung
Nach der Dehydratisierung und der Lagerung für Zeiträume im Bereich von 1 bis 7 Tagen wurden die Proben mit destilliertem Wasser (900 μl) rehydratisiert, und die Vesikel wurden durch vorsichtiges Verwirbeln dispergiert. Die Menge an eingeschlossenem ²²Na₊, ³H-Inulin oder an Adriamycin, die in den Vesikeln verblieb, wurde mit den nachfolgend beschriebenen Verfahren gemessen (siehe "Assays") nach Durchlaufen von 100 μl Aliquots der Vesikelsuspension durch Säulen (1 ml) von Sephades G-50 (fein} oder Ultragel AcA 34, äquilibriert mit der gleichen Lösung, in der die Vesikel suspendiert waren, um jegliches nicht eingeschlossenes Material zu entfernen (siehe WO 86/00238). Da die Säulen dazu neigen, einen geringen Prozentsatz der aufgetragenen Liposomen zurückzuhalten, sind die unten berichteten Werte für die Mengen an verkapseltem Material, das nach den Dehydratisierungs-/Rehydratisierungsσerfahren verblieb, etwas niedriger als die tatsächlich nach dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren erreichten Werte.
Gefrierbruchelektronenmikroskopie
Proben für den Gefrierbruch enthielten 25% Glycerol und wurden unter Verwendung eines Balzer-Gefrierbruchgerätes gebrochen und repliziert nach den Verfahren, die von Madden, T.D., Hope, M.J. und Cullis, P.R. (1983), Biochemistry, 22, 1970–1974 beschrieben wurden. Die Replika wurden mit Hilfe eines Phillips 400-Elektronenmikroskops sichtbar gemacht.
Quasi-elastische Lichtstreuungsmessungen
Die Größe der Vesikel wurde unter Verwendung eines Nicomp-200 Laser Particle Sizer (Nicomp Instrument, Goleta, CA) gemessen, wobei bei 632,8 nm und 5 mW gearbeitet wurde.
Assays
Phospholipide wurden mengenmäßig bestimmt durch Bestimmung des anorganischen Phosphors wie durch Chen et al., (1956) Anal. Chem. 28:1756 beschrieben. Die Adriamycin-Aufnahme wurde gemessen nach der Solubilisierung von Vesikeln in 0,5% Triton X-100 anhand dessen Absorption bei 480 nm. ³H-Inulin, ³H-H₂O und ³H-Tetraphenylphosphonium wurden in einem Phillips PW 4700 Flüssigkeits-Scintillationszähler gezählt, während ²²Na⁺ durch gamma-Zählung auf einem Beckmann-Gamma 800 gemessen wurde.
Beispiel 1
Dehydratisierung von Liposomen unter Verwendung des Schutzzuckers Trehalose
Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit des Zuckers Trehalose, Liposome vor wesentlichem Verlust ihres inneren Inhalts während der Dehydratisierung und der nachfolgenden Rehydratisierung zu schützen. Es wurden Experimente durchgeführt, die die hohen Retentionsgrade für ²²Na⁺, ³H-Inulin und Adriamycin demonstrieren. Die Ergebnisse sind in 1 bis 4 und in Tabelle 1 aufgeführt.
Im besonderen wurden Ei-Phosphatidylcholin-ETVs hergestellt, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Lösungen die ²²Na⁺ und verschiedene Konzentrationen von Trehalose enthielten. Die ETVs wurden dehydratisiert mit oder ohne vorherigem Einfrieren in flüssigem Stickstoff, rehydratisiert und wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in dieser Figur gezeigt, hängt die Menge an in den Vesikeln nach der Rehydratisierung verbliebenen ²²Na⁺ von der Trehalosekonzentration ab, wobei bis zu 90% des Natriums bei der höchsten getesteten Trehalosekonzentration (500 mM) zurückgehalten wurde. Dieser Figur ist ebenfalls zu entnehmen, daß Vesikel, die ohne vorheriges Einfrieren dehydratisiert wurden, mehr von ihrem Inhalt behielten, als jene, die in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Das heißt, daß die Dehydratisierung ohne Einfrieren insgesamt ein sanfteres Verfahren als die Dehydratisierung mit Einfrieren ist.
Die Fähigkeit von Trehalose, Liposomen während der Dehydratisierung/-Rehydratisierung zu schützen, wird weiterhin erläutert durch die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Gefrierbrüchen in 2, die Liposomen vor (2a – Kontrolle) und nach (2b – gefriergetrocknet) der Dehydratisierung/-Rehydratisierung mit vorherigem Einfrieren zeigen. In diesem Falle betrug die Trehalosekonzentration 250 mM. Wie dieser Figur zu entnehmen ist, wird die äußere Erscheinungsform der Liposomenpopulation durch das Dehydratisierungs/Rehydratisierungsverfahren im wesentlichen nicht verändert, was bedeutet, dass, die Trehalose die Liposomen während dieses Verfahrens zufriedenstellend schützt. Versuche, die ohne jegliche Trehalose in der Lösung des gelösten Stoffes durchgeführt wurden, ergaben eine milchige Suspension nach Rehydratisierung im Gegensatz zu der opaleszenten Erscheinungsform der ursprünglichen Probe. Darüber hinaus war die Ausbeute an Vesikeln aus den 1 ml Sephadex-Säulen gering, die zum Entfernen von nichtverkapseltem ²²Na⁺ verwendet wurden (weniger als 10%), was ein Anzeichen dafür war, daß die Liposomen verschmolzen waren, um größere Strukturen zu bilden.
3 zeigt die Wirkungen der Variierung der Trehalosekonzentration. 3a zeigt die Liposomen vor dem Trocknen, während 3b sie nach dem Trocknen und nach der Rehydratisierung in Abwesenheit von Trehalose zeigt. Aus diesen Figuren ist ersichtlich, daß die ursprünglichen Vesikel klein sind und eine gleichförmige Größe haben, während die dehydratisierten/rehydratisierten Vesikel im allgemeinen wesentlich größer sind.
3c und 3d zeigen Liposomen, die getrocknet und rehydratisiert wurden in Gegenwart von 50 mM und 125 nM Trehalose. Wie aus diesen Figuren ersichtlich, haben Vesikel, die in Gegenwart von 50 mM Trehalose getrocknet und anschließend rehydratisiert wurden, im allgemeinen die gleiche Größe wie vor der Dehydratisierung, jedoch wurde auch eine kleine Fraktion von größeren Strukturen beobachtet. Bei Trehalosekonzentrationen von 125 mM oder größer gibt es keine merklichen Strukturdifferenzen zwischen Vesikeln vor und nach der Dehydratisierung und Rehydratisierung.
Um nachzuweisen, daß die in Gegenwart von Trehalose dehydratisierten Vesikel ihre Inhaltsstoffe beibehalten und es nicht eine einfache Wiedereinkapselung des Markers nach der Rehydratisierung gibt, wurden Vesikel in 250 mM Trehalose herge- stellt und es wurde anschließend zu dem äußeren Medium ²²Na⁺ hinzugegeben. Nach der Dehydratisierung und Rehydratisierung wurden Aliquots der Suspension durch 1 ml Sephadex-Säulen durchlaufen gelassen wie in dem Abschnitt "Materialien und Verfahren" oben beschrieben. Von dem verfügbaren ²²Na⁺ wurden weniger als 0,02% durch die rehydratisierten Vesikel aufgenommen, was eine Bestätigung dafür war, dass sie im äußeren Medium gelöste Substanz nach Rehydratisierung nicht einkapseln.
Die Fähigkeit von dehydratisierten ETVs, Inulin (Molekulargewicht 5000) zurückzuhalten, ist in 4 als Funktion der Trehalosekonzentration gezeigt.
Ein Vergleich dieser Figur mit 1 offenbart, dass bei gleicher Trehalosekonzentration mehr hochmolekulares Inulin zurückgehalten wird als niedermolekulares Natrium. Allerdings ist bei höheren Trehalosekonzentrationen der Unterschied sehr gering, was darauf hinweist, daß die geringe Menge jedes Verlusts an Marker eher das Ergebnis einer Vesikelbeschädigung als das von Veränderungen der Durchlässigkeit ist.
Die Fähigkeit von ETVs, das Antitumor-Arzneimittel Adriamycin zurückzuhalten, wenn sie in Gegenwart von Trehalose dehydratisiert werden, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Die Daten in dieser Tabelle wurden wie folgt erhalten: Ei-Phosphatidylcholin-ETVs wurden, wie oben beschrieben, hergestellt unter Verwendung einer Lösung (169 mM KGlu, 20 mM HEPES (pH 7,4), 40 μMol Lipid/ml), die 250 mM Trehalose enthielt. Anschließend wurde der äußere Kaliumpuffer gegen einen Natriumpuffer ausgetauscht (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,4), 250 mM Trehalose). Adriamycin (200 nMol/μMol Lipid} wurde hinzugegeben zusammen mit Valinomycin (0,5 μg/μMol Lipid), um ein Membranpotential herzustellen. Nach 2 Stunden Inkubationszeit wurde nichtverkapseltes Adriamycin entfernt, indem die Vesikel durch eine Sephadex G-50 Säule, die mit dem oben beschriebenen Trehalose enthaltenden Natriumpuffer äquilibriert war, geführt wurde. Die ETVs, wurden für 24 Stunden ohne vorheriges Einfrieren dehydratisiert und anschließend wie oben beschrieben rehydratisiert.
Die Mengen an in den Vesikeln eingeschlossenem Adriamycin sowohl vor als auch nach der Dehydratisierung/Rehydratisierung sowie die Geschwindigkeit des Arzneimittelverlustes aus den Vesikeln wurde gemessen, indem zuerst 100 μl Aliquots der Vesikelsuspension über die Sephadex G-50 Säulen (1 ml) gegeben wurden, um nichteingeschlossenes Material zu entfernen (siehe WO 86/00238 für weitere Einzelheiten). Eingeschlossenes Adriamycin wurde anschließend mengenmäßig bestimmt, indem ein Aliquot der Vesikelsuspension mit 0,5% Triton X-100 (das die Vesikel zerstörte und das eingeschlossene Arzneimittel freisetzte) vermischt und die Absorption bei 480 nm unter Verwendung eines Spektrofotometers Pye Unicam SP8-200 verfolgt wurde. Da die Säulen dazu neigen, einen geringen Anteil der aufgegebenen Liposomen festzuhalten, wurden die gemessenen Werte für die Mengen an eingeschlossenem Material, das nach dem Dehydratisierungs-/Rehydratisierungsverfahren zurückblieb, etwas niedriger angesetzt als die tatsächlich erreichten Mengen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Wie darin aufgeführt, wurden mehr als 90% des Arzneimittels nach der Dehydratisierung und Rehydratisierung zurückgehalten, d.h. das gleiche Niveau, wie es mit ²²Na⁺ und ³H-Inulin erreicht wurde. Darüber hinaus ist die Verlustrate an Adriamycin aus dem rehydratisierten Vesikel vergleichbar mit der Rate, die bei Vesikeln beobachtet wurden, die nicht dehydratisiert worden sind (siehe Bally et al., (1985), Biochim.Biophys. Acta, 812:66).
Wie durch dieses Beispiel klar demonstriert wurde, ist der Zucker Trehalose zum Schutz der Liposomen während der Dehydratisierung und der nachfolgenden Rehydratisierung in der Lage, so daß mehr als 90% des in den Liposo men verkapselten Materials noch nach der Rehydratisierung zürückbleibt.
Beispiel 2
Exponieren von sowohl der inneren als auch der äußeren Oberfläche der Liposommembranen gegenüber einem Schutzzucker
Dieses Beispiel erläutert den verstärkten Schutzeffekt, der durch einen Schutzzucker (Trehalose) im Kontakt mit sowohl der inneren als auch der äußeren Oberfläche der Liposommembranen erreicht wird.
Es wurden ETVs hergestellt mit Trehalose auf beiden Seiten der Membran (durch Zugabe von Trehalose in die Lösung die zur Bildung der Vesikel verwendet wurde) oder nur auf der Außenseite der Membran (durch Ausschluß von Trehalose von der Lösung und Zugabe von Trehalose zum äußeren Medium, nachdem die Vesikel gebildet wurden). Die Vesikel wurden dehydratisiert, und zu verschiedenen Zeitpunkten, bis zu 72 Stunden, wurden Proben rehydratisiert und der verbliebene Anteil an ²²Na⁺ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt zusammen mit den Werten für die Menge an restlichem Wasser, das in den Proben nach der Dehydratisierung verblieben war.
Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, wird maximaler Schutz erreicht, wenn der Schutzzucker auf beiden Membranoberflächen vorhanden ist. Auch wenn nur die äußere Oberfläche dem Schutzzucker ausgesetzt ist, hängt die Höhe des Schadens an der Struktur, dem die Vesikel unterliegen, mit der Menge des in den Proben vorhandenen restlichen Wassers zusammen.
Beispiel 3
Wirkungen der Vesikelgröße und der Salzkonzentration
Dieses Beispiel beschreibt die Wirkungen der verschiedenen Vesikelgrößen und Salzkonzentrationen auf die Fähigkeit von Trehalose, Vesikel während der Dehydratisierung und Rehydratisierung zu schützen.
Es wurden ETVs von verschiedenen Größen hergestellt unter Verwendung von Polycarbonatfiltern, die Porengrößen im Bereich von 50 nm bis 800 nm hatten. Die ETVs wurden einem Frost-Tau-Zyklus unterworfen, wie oben unter "Materialien und Methoden" beschrieben. Die mittleren Durchmesser der erhaltenen Vesikel wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung gemessen und sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 3 zu entnehmen, wird die Fähigkeit, ²²Na⁺ zurüchzuhalten von der Vesikelgröße kaum beeinflusst. Da darüber hinaus. die größeren Vesikel multilamellare Strukturen enthielten, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass für multilamellare Vesikel Schutz durch Zucker erreicht wird. Obgleich die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß als die stabilsten Vesikel solche erscheinen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 170 nm, macht die multila niellare Struktur der größeren Vesikel einen strengen Vergleich schwierig.
Die Wirkungen des Variierens der Salzkonzentration des inneren und des äußeren Mediums bei einer festgelegten Trehalosekonzentration ist in 5 ausgeführt. Wie daraus zu entnehmen, gibt es eine kleine, jedoch signifikante Erhöhung der Menge an ²²Na⁺, das in den Vesikeln bei höheren Salzkonzentrationen zurückgehalten wird.
Beispiel 4
Relative Fähigkeit von Trehalose und anderen Zuckern, Vesikel während der Dehydratisierung zu schützen Dieses Beispiel erläutert die relative Fähigkeit von Trehalose und anderen Zuckern, Vesikel während der Dehydratisierung zu schützen.
Es wurden Vesikel in 500 mM Trehalose, Maltose, Lactose, Saccharose und Glucose hergestellt und die Menge an ²²Na⁺, die durch die Vesikel zurückgehalten wurde, nach der Dehydratisierung und der Rehydratisierung bestimmt. Wie aus Tabelle 4 zu entnehmen, waren Trehalose und Saccharose die wirksamsten, gefolgt von Maltose, Glucose und Lactose.
Beispiel 5
Beladung von rehydratisierten Liposomen unter Verwendung des Transmembranpotentials
Dieses Beispiel erläutert: 1) daß Liposomen, die einen Konzentrationsgradienten über ihre Membranen hinweg aufweisen, in Gegenwart eines Schutzzuckers dehydratisiert werden können und ohne Verlust des Konzentrationsgradienten rehydratisiert werden können; und 2) daß nach der Rehydratisierung der Konzentrationsgradient dazu verwendet werden kann, ein geladenes Material (das Arzneimittel Adriamycin) in die Liposomen einzutragen.
Vesikel mit einem chemischen Na⁺/K⁺-Gradienten über ihre Membrane hinweg wurden hergestellt durch Bildung von ETVs in einem Kaliumglutamatpuffer (169 mM Kaliumglutamat, 250 mM Trehalose, 20 mM HEPES, pH 7,4), und anschließend wurde der äußere Puffer durch einen NaCl-Puffer ersetzt (150 mM NaCl, 250 mM Trehalose, 20 mM HEPES, pH 7,4), in dem die Vesikel durch eine Sephades G-50 (fein) Säule (1,4 × 10 cm) gegeben wurden, die mit der NaCl-Lösung voräquilibriert worden war. Wenn es angewandt wurde, wurde Valinomycin (Sigma St. Louis, Missouri) in Ethanol hinzugegeben bis zu einer Konzentration von 0,5 μg/μMol Phospholipid.
In ähnlicher Weise wurden Transmembran-pH-Gradienten (innen Säure) gebildet durch Herstellung der Liposome in einem Puffer mit niedrigem pH (135 mM Glutaminsäure, 250 mM Trehalose, auf pH 5,5 durch Zugabe von Kaliumhydroxid gebracht), der dann mit einem Puffer mit hohem pH ausgetauscht wurde (125 mM Glutaminsäure, 30 mM NaCl, 250 mM Trehalose, auf pH 7,5 durch Zugabe von Kaliumhydroxid gebracht) auf einer Sephadex G-50 (fein) Säule. Wo angewandt, wurde das Protonen-Ionophor CCGP bis zu einer Endkonzentration von 20 uM hinzugegeben.
Die Transmembranpotentiale wurden gemessen durch Bestimmung der Verteilung des lipophilen Kations ³H-Tetraphenylphosphoniumbromid (³H-TPPB, NEN, Kanada). Speziell wurde 1 μCi ³H-TPPB in 1 μl Ethanol zu einer 1–2 ml Probe der ETV-Dispersion gegeben, und das Gemisch wurde bei 20°C für 20 Minuten inkubiert. Ein Aliquot (100 μl) wurde abgezogen, und das nichteingekapselte ³H-TPP⁺ wurde entfernt durch Aufgeben des Aliquots auf eine Sephadex G-50 Säule, gepackt in einer 1 ml Wegwerfspritze, und anschließend erfolgte das Zentrifugieren der Säule bei 500 g für 3 Minuten, um die Vesikel zu eluieren. Das eingeschlossene ³H-TPP⁺ wurde bestimmt durch Flüssigkeits-Scintillationszählung und das Phospholipid durch Phosphat-Assay.
Unter Verwendung der Werte für das eingeschlossene Volumen (μl pro μMol Phospholipid) für die ETVs, bestimmt durch Messen der Menge an ²²Na⁺ oder ³H-Inulin, das in den ETVs durch das ETV-Verfahren einbehalten wurde, wurden die Konzentrationen von ³H-TPP⁺ an der Innenseite [³H-TPP⁺]_i und an der Außenseite [³H-TPP+]o der Vesikel berechnet, aus denen das Transmembranpotential (V_m) unter Verwendung der Nernst'schen Gleichung berechnet wurde:
Vm = 59 log [3H-TPP+]i/[3H-TPP+]0
Sowohl die Na⁺/K⁺– als auch die pH-Gradientvesikel wurden unter Hochvakuum für 24 Stunden dehydratisiert und anschließend rehydratisiert. Die Kontrollvesikel wurden bei 4°C für 24 Stunden gehalten. Nach dem Trocknen und der Rehydratisierung wurden die Transmembranpotentiale, die diese Vesikel in Gegenwart und Abwesenheit von Ionophoren zeigten, mit den Transmembranpotentialen verglichen, die von den Kontrollproben erzeugt wurden, ebenfalls in Gegenwart und in Abwesenheit von Ionophoren. Die Ergebnisse sind in 6 (pH) und 7 (Na⁺/K⁺) aufgeführt.
Wie aus diesen Figuren ersichtlich, sind die Transmembranpotentiale, die sich bei den Vesikeln ergaben, die dehydratisiert und anschließend rehydratisiert worden waren, im wesentlichen mit denen identisch, die die Kontrollwerte ergaben. Der einzige offensichtliche Unterschied besteht im Falle der pH-Gradienvesikel darin, daß die Transmembranpotentiale für die dehydratisierten/rehydratisierten Vesikel sich etwas langsamer entwickeln als die Transmembran- potentiale für die Kontrollvesikel.
Die Fähigkeit der Na⁺/K⁺-Vesikel, Adriamycin nach der Dehydratisierung und Rehydratisierung anzusammeln wurde in Gegenwart und in Abwesenheit des Ionophoren Valinomycin getestet und mit der Ansammlung verglichen, die durch die Kontrollvesikel gezeigt wurde, d.h. durch die Vesikel, die bei 4°C für 24 Stunden gelagert und nicht für 24 Stunden dehydratisiert worden waren. Dem äußeren Medium der Vesikel wurde ausreichend Adriamycin hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 0,2 Mol Adriamycin pro Mol Phospholipid einzustellen.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in 8 aufgeführt. Wie daraus ersichtlich, sammeln die dehydratisierten/rehydratisierten Vesikel Adriamycin im wesentlichen mit der gleichen Geschwindigkeit und dem gleichen Gehalt an wie die Kontrollvesikel.
Ohne an eine besondere Theorie des Verfahrensablaufs gebunden sein zu wollen, kann einer der Mechanismen, der in die beobachtete Aufnahme von Adriamycin als Antwort auf den Na⁺/K⁺-Gradienten einbezogen ist, die pH-Gradienten betreffen, die automatisch als Reaktion auf derartige Gradienten gebildet werden infolge der Durchlässigkeit der Liposommembranen für H⁺-Ionen. In Übereinstimmung mit diesem Mechanismus passiert Adriamycin die Membran in ungeladenem Zustand, wobei dessen innere und äußere Konzentrationen eine Funktion der inneren und äußeren H⁺-Ionenhonzentrationen ist. Die innere Konzentration ist noch, wenn die innere H⁺-Konzentration hoch ist und umgekehrt.

Insgesamt zeigt dieses Beispiel, daß eine verzögerte Beladung der Vesikel durch die Kombination von Konzentrationsgradienten und dem Dehydratisierungs/Rehydratisierungsprozeß erfolgen kann. Tabelle 1 Fähigkeit von dehydratisierten Vesikeln zur Zurückhaltung von Adriamycin

	Adriamycingehalt
	(nMol/μMol Lipid)
vor der Dehydratisierung	197
unmittelbar nach Dehydratisierung
und Rehydratisierung	185
1 Stunde nach der Dehydratisierung
und der Rehydratisierung	158
2 Stunden nach der Dehydratisierung
und der Rehydratisierung	145

Die ETVs wurden hergestellt unter Verwendung einer Lösung von gelöstem Stoff, die Adriamycin und 250 mM Trehalose enthielt. Die Proben wurden für 24 Stunden ohne vorheriges Einfrieren dehydratisiert. Der Adriamycingehalt der Anfangsprobe und der rehydratisierten Vesikel wurde bestimmt wie in Beispiel 1 beschrieben. Tabelle 2
Tabelle 3 Einfluß der Vesikelgröße auf die Fähigkeit zur Zurückhaltung von ²²Na⁺
Die Vesikel wurden hergestellt durch Variierung der mittleren Durchmesser infolge Extrudierens multilamellarer Vesikel durch Polycarbonatfilter entsprechender Durchmesser (siehe "Materialien und Methoden"). Die Proben enthielten alle250 mM Trehalose und wurden für 24 Stunden ohne vorheriges Einfrieren dehydratisiert. Tabelle 4 Vergleich der Fähigkeit verschiedener Zucker, die Vesikel im wasserfreien Zustand zu stabilisieren

getesteter Zucker (500 mM) ²²Na⁺ zurückgehalten nach Dehydratisierung und Rehydratisierung in %

Trehalose 88%

Glucose 73%

Saccharose 86%

Maltose 76%

Lactose 66%
Große unilamellare Vesikel wurden hergestellt in Gegenwart von 500 mM eines jeden Zuckers, dehydratisiert für 24 Stunden ohne vorheriges Einfrieren, und die Menge an eingeschlossenem zurückgehaltenen ²²Na⁺ nach Rehydratisierung wurde bestimmt, wie in "Materialien und Methoden" beschrieben.

Claims

Verfahren zur Dehydratisierung von Liposomen, umfassend die Stufen (a) Herstellung eines Liposoms, das einen oder mehrere Schutzzucker enthält mit Extrusionstechniken unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 50 nm bis 100 nm und (b) Entfernung von Wasser aus der Zubereitung, wobei die Zucker mit Schutzkonzentrationen sowohl an der inseitigen als auch an der äußeren Oberfläche der Liposommembranen vorhanden sind, und worin das Liposom im wesentlichen seinen Inhalt beibehält oder seine Durchlässigkeitssperre über den Dehydratisierungs- und Rehydratisierungsprozeß beibehält, und wobei die Liposomen große unilamellare Vesikel sind.
Verfahren zur Drehydratisierung von Liposomen nach Anspruch 1, worin die Liposomen einen Konzentrationsgradienten von einem oder mehreren geladened Spezies über ihre Membranen aufweisen, wobei der Konzentrationsgradient zur Erzeugung eines Transmembranpotentials in der Lage ist, das ein ionisierbares bioaktives Mittel in die Liposomen einträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Konzentration des Zuckers wenigstens 5 Mole Zucker pro Mol Phospholipid beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, worin der eine Schutzzucker ein Disaccharidzucker ist oder mehrere Schutzzucker Disaccharidzucker sind.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, worin der eine oder mehrere Schutzzucker aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, die aus Trehalose, Maltose, Saccharose, Glucose, Lactose und Dextran besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der eine Zucker ein Aminoglycosid ist oder mehrere Zucker Aminoglycoside sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der Zucker Streptomycin oder Dihydrostreptomycin ist.
Liposompräperation, die ein dehydratisiertes Liposom ist, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Liposompräperation nach Anspruch 8, worin der innere Inhalt ein Arzneimittel umfaßt.
Liposompräperation nach Anspruch 8, worin das Arzneimittel ein antineoplastisches Mittel umfaßt.
Liposompräperation nach Anspruch 8, worin das antineoplastische Mittel Doxorubicin umfaßt.
Liposompräperation nach Anspruch 8, worin der innere Inhalt kein Arzneimittel umfaßt.