JP2024514649A - 肝細胞の遺伝子修飾 - Google Patents

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Abstract

本発明は、肝細胞移植に好適な遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生する方法を提供し、本方法は、塩基エディター及び１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子における標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡを導入することによって、単離されたヒト肝細胞又は肝細胞前駆細胞における１つ以上のクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を破壊し、それによって、遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生することを含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１６日に出願された、米国仮特許出願第６３／１７６，１０４号の優先権を主張し、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
同所性肝移植（ＯＬＴ）は、末期肝疾患、急性肝不全、及び肝臓ベースの代謝障害のためのゴールドスタンダードな治療法である。ＯＬＴには、ドナー臓器の不足、手術に関連する合併症のリスク、処置の高コスト、及び生涯にわたる免疫抑制の必要性を含むいくつかの主要な欠点がある。
肝細胞移植（ＨＴ）は、侵襲性が低く、より安価であるため、ＯＬＴに非常に魅力的で臨床的に安全な代替療法であり、必要に応じて繰り返し実施され得る。ＨＴの制限は、高品質の肝細胞の供給が限られていること、及び同種移植片の生着／長期受容が不十分であることに関連する。同種肝細胞を移植された患者では、励みになる臨床的改善が見られているが、免疫抑制にもかかわらず、同種細胞移植片の長期受容が限られているため、長期的な有効性は依然として妨げられている。
ヒト初代肝細胞は、非常に免疫原性であり、したがって、肝細胞の生着を改善するには、それらの移植前の免疫調節の代替戦略が望ましい。肝疾患を治療するために肝細胞を使用することに関して、現在いくつかの障害が存在している。これらは、一般に、１）ヒト肝細胞の供給が限られていること、及び２）対象への肝細胞の生着が不十分であること、である。高品質の肝細胞の供給が限られているのは、少なくとも部分的には、高品質の肝細胞が単離され得るドナー肝臓の供給が限られているためである。肝細胞バイオリアクターとして機能するヒト化動物モデルの作出及び使用により、プログラム規模の開発のためのヒト肝細胞の調達及び増殖が可能になった。上で参照した第２の障害は、不十分な生着のことであり、これまでのところ、免疫抑制にもかかわらず、同種細胞移植片の長期受容が制限されている。本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子修飾肝細胞を、それを必要とする対象への投与に好適にする、肝細胞を遺伝子修飾するための独自の方法論を発見した。
一部の態様では、肝細胞移植に好適な遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生する方法が提供され、本方法は、塩基エディターと、１つ以上のクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子における標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡと、を導入することによって、単離されたヒト肝細胞又は肝細胞前駆細胞における１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を破壊し、それによって、遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生することを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を破壊することは、単離されたヒト肝細胞において生じる。単離されたヒト肝細胞は、新たに単離すること、又は事前に増殖させることができる。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子は、当該技術分野で既知である。例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｋ、及びＨＬＡ－Ｌを含む。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲを含む。
一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼに融合されたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、標的配列に１つ以上の核酸塩基編集を有する。例えば、遺伝子修飾は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超の核酸塩基編集を有し得る。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、破壊された標的配列を有する。一部の実施形態では、破壊された標的配列は、標的遺伝子の発現の減少をもたらす。一部の実施形態では、破壊された標的配列は、標的遺伝子の発現の増加をもたらす。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、同種反応性が低減又は除去されている。したがって、一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、同種反応性が低減されている。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、同種反応性が除去されている。「除去（ａｂｏｌｉｓｈｅｄ）」とは、当該技術分野で既知の方法を使用することによって検出可能な同種反応性が存在しないことを意味する。
一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上から選択される。したがって、一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、Ｂ２Ｍである。一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、ＣＤ１４２である。一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、ＣＩＩＴＡである。一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａである。一部の実施形態では、クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂである。
一部の実施形態では、終止コドン又はスプライス部位は、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に導入される。したがって、一部の実施形態では、終止コドンが、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に導入される。一部の実施形態では、スプライス部位が、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に導入される。
一部の実施形態では、スプライス部位は、Ｂ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド位置１９に導入される。
一部の実施形態では、終止コドンは、Ｂ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド位置５に導入される。
一部の実施形態では、スプライス部位は、ＣＤ１４２遺伝子のヌクレオチド位置２８に導入される。
一部の実施形態では、終止コドンは、ＣＤ１４２遺伝子のヌクレオチド位置１９に導入される。
一部の実施形態では、スプライス部位は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のヌクレオチド位置１４７に導入される。
一部の実施形態では、終止コドンは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のヌクレオチド位置１３０に導入される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）である。したがって、一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来である。様々なＣａｓ９タンパク質が、当該技術分野において記載されており、変異を有するＣａｓ９を含む、様々な細菌から取得又は修飾される。Ｃａｓ９及びその変異体は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＵＳ１０，２６６，８５０、ＷＯ２０１４／０９３６６１、ＷＯ２０１４／０９３６５５、ＷＯ２０１４／０９３５９５（それらの内容は、参照により本明細書に援用される）を含む、様々な刊行物に記載されている。
様々なＣａｓ１２タンパク質が、当該技術分野で既知であり、例えば、クラス２Ｖ型及びＶＩ型タンパク質を含む。例えば、クラス２Ｖ型Ｃａｓ１２には、とりわけ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃが含まれる。Ｃａｓ１２の様々な名称が使用されており、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ１ｐ、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃｐ３、Ｃ２ｃ２ｐが挙げられる。本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、クラス２Ｖ型又はＶＩ型タンパク質由来のＣａｓ１２タンパク質が使用される。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃａｓ１２ｃタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃｐｆ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃ２ｃ１タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃ２ｃ１ｐタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃ２ｃ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃ２ｃｐ３タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２は、Ｃ２ｃ２ｐタンパク質を含む。様々なＣａｓ１２が、ＷＯ／２０１６／２０５７１１及びＷＯ／２０１６／２０５７４９に記載されている（それらの内容は、参照により援用される）。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超高精度Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）を参照して、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＨ６９８Ａに対応する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、高忠実度Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）を参照して、Ｎ４６７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＱ９２６Ａに対応する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、変異を含み、ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）に対応するＹ１０１６、Ｒ１０１９、Ｙ１０１０、Ｙ１０１３、Ｋ１０３１、Ｑ１０２７、及び／又はＶ１０１８残基がアスパラギン酸に変異している。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、アデニン又はアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）、シチジン又はシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、又はイノシン塩基エディター（ＩＢＥ）に融合される。したがって、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＡＢＥに融合される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣＢＥに融合される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＩＢＥに融合される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、アデニン若しくはアデノシンデアミナーゼドメイン、又はシチジン若しくはシトシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターに融合される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲは、アデニン又はアデノシンデアミナーゼドメイン、及びシチジン又はシトシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターに融合される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）、及び／又はＦＬＡＧ、ＨＩＳ、若しくはＨＡタグを含む。したがって、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＦＬＡＧタグを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＨＩＳタグを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＨＡタグを含む。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、配列番号１（ＳｐＣａｓ９）、配列番号２（ＳａＣａｓ９）、又は配列番号３（Ｃｐｆ１ Ｃａｓ１２）において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個の変異を含む。ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、及びＣｐｆ１ Ｃａｓ１２のアミノ酸配列を、以下の表に示す。
一部の実施形態では、変異は、アミノ酸置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。
一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｃａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメイン、ＲｕｖＣドメイン、及び／又はＨＮＨドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換である。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＰＡＭ相互作用ドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換である。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＲｕｖＣドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換である。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＨＮＨドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換である。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換は、ＰＡＭ相互作用ドメイン、ＲｕｖＣドメイン、及びＨＮＨドメインに生じる。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換は、ＰＡＭ相互作用ドメイン及びＲｕｖＣドメインに生じる。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換は、ＰＡＭ相互作用ドメイン及びＨＮＨドメインに生じる。一部の実施形態では、少なくとも１つ以上のアミノ酸置換は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインに生じる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）、又はＣａｓ９タンパク質におけるその対応する変異である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸８４０におけるヒスチジンからアラニンへの置換（Ｈ８４０Ａ）、又はＣａｓ９タンパク質におけるその対応する変異である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ニッカーゼ活性を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質における１つ以上の変異は、Ｃａｓ９を触媒的に不活性にし、さもなければ「不活性型Ｃａｓ９」又は「ｄＣａｓ９」と称される。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、アデノシンデアミナーゼに融合され、配列番号６５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、シトシンデアミナーゼに融合され、配列番号４～６４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＡ－３’、又は５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＧＧ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＧＡ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。
一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＮＮＲＲＴ－３’又は５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＮＮＲＲＴ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９タンパク質は、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。
一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、５’－ＲＴＴＮ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する。
一部の実施形態では、単離されたヒト肝細胞は、以前に凍結保存され、その後解凍されている。一部の実施形態では、単離されたヒト肝細胞は、初代培養物である。一部の実施形態では、単離されたヒト肝細胞は、新たに単離される。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、ＣＩＩＴＡを過剰発現する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、Ｂ２Ｍを過剰発現する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合タンパク質を過剰発現する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、ＰＤＬ１を過剰発現する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、ＰＤＬ２を過剰発現する。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、増殖のためにヒト化動物モデルに移植される。
一部の実施形態では、ヒト化動物モデルは、ＦＲＧブタ、ＦＲＧマウス、又はＦＲＧラットである。したがって、一部の実施形態では、ヒト化動物モデルは、ＦＲＧブタである。一部の実施形態では、ヒト化動物モデルは、ＦＲＧマウスである。一部の実施形態では、ヒト化動物モデルは、ＦＲＧラットである。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、最初の細胞増殖のために、まず、ＦＲＧマウス又はＦＲＧラットに移植される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、最初の増殖のために、ＦＲＧマウスに移植される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、最初の増殖のために、ＦＲＧラットに移植される。
一部の実施形態では、最初の細胞増殖の後、遺伝子修飾細胞は、続いて、更なる細胞増殖のためにＦＲＧブタに移植される。
一部の実施形態では、最初に増殖した細胞又は更に増殖した細胞は、動物から単離される。
一部の実施形態では、最初に増殖した細胞又は更に増殖した細胞は、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気細胞分離、密度勾配遠心分離、及び／又は免疫密度細胞分離によって単離される。細胞生存率を維持する任意の種類の単離戦略を、本明細書の方法で使用することができる。一部の実施形態では、細胞は、蛍光活性化細胞選別によって単離される。一部の実施形態では、細胞は、免疫磁気細胞分離によって単離される。一部の実施形態では、細胞は、密度勾配遠心分離によって単離される。一部の実施形態では、細胞は、免疫密度細胞分離によって単離される。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を有する。したがって、一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、１つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、２つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、３つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、４つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、５つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、６つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、７つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、８つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、９つの核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、１０個の核酸塩基編集を有する。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、１０個超の核酸塩基編集を有する。
一部の実施形態では、１つ超のガイドと組み合わせて使用される単一の塩基エディターは、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成する。したがって、一部の実施形態では、１つ超のガイドと組み合わせて使用される単一の塩基エディターは、２つの核酸塩基編集を生成する。一部の実施形態では、１つ超のガイドと組み合わせて使用される単一の塩基エディターは、３つの核酸塩基編集を生成する。一部の実施形態では、１つ超のガイドと組み合わせて使用される単一の塩基エディターは、３つ超の核酸塩基編集を生成する。したがって、この方法は、核酸塩基編集の多重化を可能にする。
一部の実施形態では、１つ超の塩基エディターは、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成する。
一部の態様では、塩基エディターをコードする核酸と、本明細書に記載される標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡと、が提供される。
一部の実施形態では、核酸は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。
一部の実施形態では、核酸は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。
一部の態様では、本明細書に記載される核酸をコードするベクターが提供される。
一部の態様では、塩基エディターと、本明細書に記載される標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡと、を含む、真核細胞が提供される。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、リンパ球である。
一部の態様では、肝疾患を治療する方法が提供され、本方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法に従って産生された遺伝子修飾ヒト肝細胞を投与することを含む。
一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、それを必要とする対象の門脈に注入される。
一部の実施形態では、約１００億～１５０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、それを必要とする対象の門脈に注入される。一部の実施形態では、約５０億～２００億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。一部の実施形態では、約１００億～１２０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。一部の実施形態では、約１２０億～１５０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。
一部の態様では、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡが提供され、塩基エディター及び対応する１つ以上のガイドＲＮＡが表２から選択される。
一部の態様では、ＣＤ１４２遺伝子を標的化する塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡが提供され、塩基エディター及び対応する１つ以上のガイドＲＮＡが、表３から選択される。
一部の態様では、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡが提供され、塩基エディター及び対応する１つ以上のガイドＲＮＡが、表４から選択される。
一部の態様では、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、塩基エディター及び対応する１つ以上のガイドＲＮＡが、表５から選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
一部の態様では、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、塩基エディター及び対応する１つ以上のガイドＲＮＡが、表６から選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
一部の実施形態では、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡが提供され、標的遺伝子に対して１、２、３つ、又は３つ超の編集が行われる。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、ガイド標的化配列に対して１～４つのミスマッチを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表２Ａ～６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つ、又は表２～６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンに対応する１～４つのミスマッチを含む。
一部の態様では、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡを含む細胞が提供される。
一部の態様では、ＭＨＣ遺伝子に１つ以上の編集を有する遺伝子修飾ヒト肝細胞が、本明細書に記載のように提供される。
一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂから選択される。したがって、一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、Ｂ２Ｍ遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、ＣＤ１４２遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子である。
一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に対する編集は、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子の発現の増加をもたらす。例えば、一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子に対する編集は、ＣＤ１４２遺伝子の発現の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する編集は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の発現の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ遺伝子に対する編集は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の発現の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子に対する編集は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の発現の増加をもたらす。
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語についての更なる定義は、本明細書全体を通して記載される。
ａ又はａｎ：「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は１つ超の要素を意味する。
およそ又は約：本明細書で使用される場合、「およそ」又は「約」という用語は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記載される参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、別段の記載がない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいか、より小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満内に収まる値の範囲を指す（かかる数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
関連する：一方の存在、レベル及び／又は形態が、他方の存在、レベル及び／又は形態と相関する場合に用語が本明細書で使用される場合、２つの事象又は実体は、互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル及び／又は形態が（例えば、関連する集団全体にわたって）疾患、障害若しくは状態の発生率及び／又はその感受性と相関する場合、特定の疾患、障害若しくは状態と関連するとみなされる。一部の実施形態では、２つ以上の実体が、直接的又は間接的に相互作用する場合、それらが互いに物理的に近接し、それを維持するように、物理的に互いに「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合しており、一部の実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって、非共有結合的に会合している。
塩基エディター「塩基エディター（ＢＥ）」又は「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」は、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基修飾活性を有する薬剤を意味する。様々な実施形態では、塩基エディターは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）と併せて、核酸塩基修飾ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）及びポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む。様々な実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えば、ＤＮＡ）内の塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、又はＵ）を修飾することができるドメインを含む生体分子複合体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合又は連結される。一実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有する１つ以上のドメインを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドＲＮＡに連結される（例えば、ガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフ及びデアミナーゼに融合されたＲＮＡ結合ドメインを介して）。一部の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の１つ以上の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）又はアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）及びアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）及びシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン、又はｄＩＳＮドメイン）に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、塩基除去修復の阻害因子（例えば、ＵＧＩドメイン又はｄＩＳＮドメイン）と、を含む。他の実施形態では、塩基エディターは、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）塩基エディターである。塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願第２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ” Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）、及びＲｅｅｓ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１８ Ｄｅｃ；１９（１２）：７７０－７８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７６－０１８－００５９－１も参照されたい（その内容全体が、参照により本明細書に援用される）。本明細書で使用される場合、「塩基エディター」という用語は、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質などのＣＲＩＳＰＲタンパク質も含み得る。
塩基編集活性：「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内の塩基を化学的に改変するように作用することを意味する。一実施形態では、第１の塩基は、第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、アデノシンデアミナーゼ活性又はアデニンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する。別の実施形態では、塩基編集活性は、シチジンデアミナーゼ活性（例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換する）、及びアデノシンデアミナーゼ活性又はアデニンデアミナーゼ活性（例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換する）である。
塩基エディターシステム：「塩基エディターシステム」という用語は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するためのシステムを指す。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、（１）標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２）、デアミナーゼドメイン、及びシチジンデアミナーゼドメイン、並びに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと併せて、１つ以上のガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ、及び核酸配列特異的結合活性を有するドメインから選択される核酸塩基エディタードメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）標的ヌクレオチド配列中の１つ以上の核酸塩基を脱アミノ化するための、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン及びデアミナーゼドメインを含む塩基エディター（ＢＥ）、並びに（２）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと併せて、１つ以上のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニン又はアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニン又はアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）又はシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という句は、生物学的システム、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与される場合、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、ペプチドが生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的に活性」な部分と称される。
開裂：本明細書で使用される場合、開裂は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって作製される標的核酸の切断を指す。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、一本鎖ＲＮＡ切断である。一部の実施形態では、開裂事象は、二本鎖ＲＮＡ切断である。
相補的：本明細書で使用される場合、相補的とは、Ａ塩基がＴと対になり、Ｃ塩基がＧと対になるような、ワトソン－クリック塩基対形成、又は第２の核酸鎖上の塩基での非従来的な塩基対形成を形成する核酸鎖を指す。言い換えれば、適切な条件下で互いにハイブリダイズする核酸を指す。
クラスター化して間隔を開けた短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム：本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＣＲＩＳＰＲエフェクター、ＲＮＡガイド、及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクターの発現に関与する、又はその活性を指向する核酸及び／又はタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、操作された天然に生じないＣＲＩＳＰＲシステムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、システムの１つ以上の成分をコードする核酸（例えば、ベクター）、タンパク質形態の成分、又はそれらの組み合わせを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲアレイ：「ＣＲＩＳＰＲアレイ」という用語は、本明細書で使用される場合、第１のＣＲＩＳＰＲ反復の第１のヌクレオチドで始まり、最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲ反復の最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲ反復及びスペーサーを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは、２つの反復の間に位置する。「ＣＲＩＳＰＲ反復」又は「ＣＲＩＳＰＲ直接反復」、又は「直接反復」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲアレイ内の配列バリエーションをほとんど示さないか、又は全く示されない複数の短い直接反復配列を指す。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）：「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、本明細書で使用される場合、酵素活性を行うか、又はＲＮＡガイドによって特定される核酸上の標的部位に結合するタンパク質を指す。種々の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、トランスポザーゼ活性、及び／又は切除活性を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓは、高精度Ｃａｓである。一部の実施形態では、Ｃａｓは、高忠実度Ｃａｓである。一部の実施形態では、Ｃａｓは、ＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓである。一部の実施形態では、高精度、高忠実度、及びＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓは、Ｂｒａｖｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｎａｔｕｒｅ，６０３，Ｍａｒｃｈ ２０２２に記載されるとおりである。
ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の核酸配列を標的化するためにＣＲＩＳＰＲエフェクターによって使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡと二本鎖を形成する配列を含有する。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに結合する。
エクスビボ：本明細書で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、多細胞生物内ではなく、外部で増殖した細胞又は組織において生じる事象を指す。
機能的同等物又は類似体：本明細書で使用される場合、「機能的同等物」又は「機能的類似体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の状況において、元の配列の生物学的活性と実質的に同様の生物学的な活性（機能又は構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体又は同等物は、天然誘導体であり得るか、又は合成的に調製され得る。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的な活性が保存されることを条件として、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されたアミノ酸と同様の化学物理的特性を有する。同様の望ましい化学物理的特性としては、電荷の類似性、かさ高さ、疎水性、親水性などが含まれる。
半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、タンパク質濃度又は活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分に低下するのに必要な時間である。
改善する、増加する、又は低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、若しくは「低減する」という用語、又は文法的同等物は、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定値、又は本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（又は複数の対照対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照対象」は、治療されている対象と同じ形態の疾患に罹患している対象であり、治療されている対象とほぼ同じ年齢である。
阻害：本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害する」、及び「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質又は遺伝子の活性及び／又は発現を減少又は低減するプロセス又は方法を指す。典型的には、タンパク質又は遺伝子を阻害することは、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野で認識される１つ以上の方法によって測定される、タンパク質又は遺伝子の発現又は関連する活性を少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、若しくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上低減させること、又は１倍より大きい、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍若しくはそれ以上の発現又は関連する活性の低下を指す。
ハイブリダイゼーション：本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つ以上の核酸が、ワトソン－クリック対形成、フーグスティーン結合、又は２つの核酸の塩基間の他の配列特異的結合による水素結合を介して互いに結合する反応を指す。別の配列とハイブリダイズすることができる配列は、配列の「補体」と呼ばれ、「相補的」であるか、又は「相補性」を示すと言われる。
インデル：本明細書で使用される場合、「インデル」という用語は、核酸配列における塩基の挿入又は欠失を指す。一般的に変異をもたらし、遺伝的バリエーションの一般的な形態である。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養内などにおいて生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈では、用語は、（例えば、インビトロシステムとは対照的に）生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、例えば、点突然変異、置換、挿入、欠失、逆位、及び欠失を含む。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、約５～約１００個のヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても既知であり、遺伝子から単離され得るか、又は化学的に合成され得る。
ＰＡＭ：「ＰＡＭ」又は「プロトスペーサー隣接モチーフ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などの、ＣＲＩＳＰＲシステムによる開裂の標的となる核酸領域に続く短い核酸配列（通常、２～６個の塩基対の長さ）を指す。ＰＡＭは、切断するためにＣａｓヌクレアーゼに必要とされ、概して、切断部位から３～４ヌクレオチド下流に見出される。
ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介してともに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、用語が長鎖に限定されず、ペプチド結合を介してともに連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に既知のように、ポリペプチドは、処理及び／又は修飾され得る。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、互換的に使用される。
予防する：本明細書で使用される場合、「予防する」又は「予防」という用語は、疾患、障害、及び／又は状態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／又は状態を発症するリスクを低減することを指す。
タンパク質：「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的又は一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され得る。個別機能単位が、互いに物理的に会合する１つより多くのポリペプチドからなる場合、「タンパク質」という用語は、物理的にカップリングされ、個別単位としてともに機能する複数のポリペプチドを指す。
参照：「参照」の実体、システム、量、条件のセットなどは、本明細書に記載のように試験の実体、システム、量、条件のセットなどと比較されるものである。例えば、一部の実施形態では、「参照」抗体は、本明細書に記載のように操作されていない対照抗体である。
ＲＮＡガイド：ＲＮＡガイドという用語は、本明細書に記載のタンパク質の標的核酸への標的化を促進するＲＮＡ分子を指す。例示的な「ＲＮＡガイド」又は「ガイドＲＮＡ」としては、同族のｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせたｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。後者は、独立したＲＮＡであり得るか、又はリンカー（ｓｇＲＮＡ）を使用して単一のＲＮＡとして融合され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、化学的又は生化学的修飾を含むように操作され、一部の実施形態では、ＲＮＡガイドは、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。
対象：「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、診断、予後、又は療法が所望される任意の対象を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト霊長類（類人猿、サル、オランウータン、又はチンパンジーなど）、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、又はウシ（ｃｏｗ）であり得る。
ｓｇＲＮＡ：「ｓｇＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」という用語は、（ｉ）ガイド配列（ｃｒＲＮＡ配列）及び（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ動員配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有するシングルガイドＲＮＡを指す。
実質的な同一性：「実質的な同一性」という句は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者に理解されるように、２つの配列は、概して、対応する位置に同一の残基を含有する場合、「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較され得、それは、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む。例示的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列が、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上が、関連するひと続きの残基にわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連するひと続きは、完全な配列である。一部の実施形態では、関連するひと続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００又はそれ以上の残基である。
標的核酸：「標的核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが結合する任意の長さのヌクレオチド（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかを指す。標的核酸は、コード領域又は非コード領域を含み得る三次元構造を有し得、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、プラスミド、ベクター、外因性配列、内因性配列を含み得る。標的核酸は、修飾されたヌクレオチド、メチル化されたヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体を含み得る。標的核酸は、非核酸成分とともに散布され得る。標的核酸は、一本鎖、二本鎖、若しくは多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、若しくは他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーであるが、これらに限定されない。
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比で治療される対象に治療効果を与える治療分子（例えば、本明細書に記載の操作された抗体）の量を指す。治療効果は、客観的であり得る（すなわち、何らかの試験又はマーカーによって測定可能である）、又は主観的であり得る（すなわち、対象が効果の指標を与えるか、又は効果を感じる）。特に、「治療有効量」とは、疾患と関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防又は遅延させること、及び／又は疾患の症状の重症度若しくは頻度を減少させることなどによって、特定の疾患若しくは状態を治療、改善、若しくは予防するのに有効であるか、又は検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すのに有効である治療分子又は組成物の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投与レジメンで投与することができる。任意の特定の治療分子について、治療有効量（及び／又は有効な投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬剤との組み合わせに依存して変化し得る。また、任意の特定の対象に対する特定の治療有効量（及び／又は単位用量）は、治療されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の薬剤の活性；用いられる特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；用いられる特定の治療分子の投与時間、投与経路、及び／又は排泄若しくは代謝速度；治療期間；並びに医学分野で周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存し得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡ：「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＲｌＳＰＲ関連タンパク質が特定された標的核酸に結合するのに必要な構造を形成する配列を含むＲＮＡを指す。
治療：本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」又は「治療すること」も）という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴の発症を部分的に又は完全に緩和、改善、軽減、阻害、遅延、それらの重症度の低減、及び／又はそれらの発生率を低減する治療分子（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ治療タンパク質又はシステム）の任意の投与を指す。かかる治療は、関連する疾患、障害、及び／若しくは状態の兆候を示していない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の早期兆候のみを示している対象の治療であり得る。代替的又は追加的に、かかる治療は、関連する疾患、障害及び／又は状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであり得る。
Ｂ２Ｍ遺伝子ＢＥ４及びＡＢＥ適合性標的配列、並びに関連するＰＡＭ及びプロトスペーサー領域部位を示す概略図である。 Ｂ２Ｍ遺伝子の塩基編集を示すグラフである。これらの研究からのデータは、ＡＢＥエディター（ＡＢＥ７．１０）又はＢＥ４エディターのいずれかを使用したＢ２Ｍ遺伝子の編集効率を示す。 ＣＩＩＴＡ ＢＥ４及びＡＢＥ適合性標的配列、並びに関連するＰＡＭ及びプロトスペーサー領域部位を示す概略図である。 ＣＩＩＴＡ遺伝子の塩基編集を示すグラフである。これらの研究からのデータは、ＡＢＥエディター（ＡＢＥ８．２ｍ）又はＢＥ４エディターのいずれかを使用したＣＩＩＴＡ遺伝子の編集効率を示す。 培養４日後及び６日後の例示的なＢ２Ｍ標的遺伝子の塩基編集効率、編集後反応、及び６日目のＣＩＩＴＡ遺伝子の塩基編集効率のグラフである。 ＣＩＩＴＡ遺伝子のタンパク質レベルのＫＯを分析し、編集効率を評価するためのフローサイトメトリーデータである。 フローサイトメトリーによる、ＨＥＫ２ Ｓ２対照に対する、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ標的遺伝子の塩基編集効率のグラフである。 例示的な塩基エディターのヌクレオフェクション及びトランスフェクションの例示的な反応条件及びｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比を描示する表である。 １：１、２：１、３：１、４：１のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの例示的な比での、ＢＥ４遺伝子座での例示的な塩基編集効率及び細胞生存率を示すグラフである。 Ｂ２Ｍ遺伝子座での塩基編集効率及び細胞生存率を示すグラフである。バーは、Ｂ２Ｍ遺伝子座での編集効率を表し、ドットは、フローサイトメトリーによって評価されたＢ２Ｍ陰性細胞の割合を表し、「ＨＥＫ２－２」は、標的化された対照遺伝子座を示す。 エクスビボ手順への組み込みのための導入遺伝子（Ｔｇ＃１又はＴｇ＃２）の導入と組み合わせたＢ２Ｍ遺伝子座での比較用遺伝子編集効率を示すグラフである。 導入遺伝子の導入によるＢＥ４ Ｂ２Ｍ遺伝子座での塩基編集を含む二重操作の効率を示すグラフである。
本明細書において、疾患の治療における使用に好適な遺伝子修飾ヒト肝細胞の産生が記載される。また、遺伝子修飾ヒト肝細胞を達成するベクター、核酸、及び／又は細胞を含む好適な組成物も記載される。更に、遺伝子修飾肝細胞を使用して、それを必要とする対象を治療する様々な方法が記載される。
遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生する方法
肝細胞移植に好適な遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生する方法が提供され、本方法は、塩基エディター及びの１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子における標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡを導入することによって、単離されたヒト肝細胞又は肝細胞前駆細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を破壊し、それによって、遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生することを含む。遺伝子修飾ヒト肝細胞は、対応するＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子の発現を変化させる１つ以上の核酸塩基編集を有することができる。代替的に、又は相補的に、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子の発現が低減又は抑制されている。このようにして、遺伝子修飾肝細胞は、それを必要とする対象に移植されると、移植された遺伝子修飾肝細胞の選択的死につながる拒絶反応を引き起こさないであろう。したがって、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、同種反応性が低減又は除去されている。
任意の種類の又はＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ遺伝子は、遺伝子発現の低減、除去、又は抑制のいずれかを標的化することができる。例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｋ、及びＨＬＡ－Ｌを含む。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲを含む。一部の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、遺伝子発現を増加させるように標的化される。一部の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子は、遺伝子発現を減少させるように標的化される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、ＣＤ４７及び／又はＣＤ１４２を過剰発現する。
単離されたヒト肝細胞は、任意の好適なドナーから得ることができる。一部の実施形態では、ドナーは、肝疾患を有しない。一部の実施形態では、ドナーは、肝疾患を有する。本方法は、新たに単離された肝細胞又は一度凍結してから解凍した肝細胞とともに使用され得る。一部の実施形態では、本方法は、前駆細胞又は幹細胞から得られた肝細胞を使用する。例えば、前駆細胞又は幹細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹（ＥＳ）細胞などの任意の好適な多能性細胞であり得る。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表２に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表３に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表４に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表５に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、表２に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含むガイドＲＮＡが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表３に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表４に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表５に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む。
一部の実施形態では、表２Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含むガイドＲＮＡが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表３Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表４Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表５Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表２Ａに列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、表３Ａに列挙された塩基エディター及びプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表４Ａに列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表５Ａに列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
一部の実施形態では、本方法は、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、塩基エディター及び表６Ａに列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される。
様々な塩基エディターを、遺伝子修飾ヒト肝細胞を作製するための方法において使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質、及びアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、又はイノシン塩基エディター（ＩＢＥ）のうちのいずれか１つ以上を含む塩基エディターは、本明細書に記載の方法に好適である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を使用して、目的の遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子のうちの１つ以上）の標的化された抑制を達成することによって達成することができる。
本明細書に記載の方法に好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質は全体にわたって記載されており、任意のＣａｓ９又はＣａｓ１２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む。例えば、Ｃａｓ９は、任意の好適な細菌から選択することができ、これには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）から単離された記載のＣａｓ９が含まれる。本明細書に記載の方法に好適なＣａｓ１２ ＣＲＩＳＰＲタンパク質としては、任意のクラス２Ｖ型又はＶＩ型Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、クラス２Ｖ型Ｃａｓ１２を含む）が挙げられる。とりわけ、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃが含まれる。
本明細書に記載の方法に好適なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上の変異を有し得る。１つ以上の変異は、ニッカーゼ又は触媒不活性ＣＲＩＳＰＲタンパク質であるＣＲＩＳＰＲタンパク質をもたらし得る。「変異」とは、点変異、置換、欠失、逆位、若しくは融合のいずれか、又はそれらのいずれかの組み合わせを意味する。融合は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質における任意の場所、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端のいずれか、又はＮ末端とＣ末端との間で生じ得る。ニッカーゼ又は触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質を達成するために、ＰＡＭ相互作用ドメイン、ＲｕｖＣドメイン、及び／若しくはＨＮＨドメインのいずれか、又はそれらのいずれかの組み合わせにおいて、１つ以上の変異が作製され得る。様々な変異は、当該技術分野に記載されており、例えば、ＵＳ９，７９０，４９０に記載されているものが含まれる（その内容は、本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、高忠実度Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９バリアントは、増強された特異性を含み、これは、オフターゲット開裂を最小限に抑える。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、超高精度Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、操作されたバリアント、例えば、主にＲＥＣ３ドメイン内の変異を含み、より高い特異性及び忠実度を達成する、「超高精度Ｃａｓ９」（ＳｐｙＣａｓ９に対応するＮ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＨ６９８Ａ変異）及び／又は「高忠実度Ｃａｓ９」（ＳｐｙＣａｓ９に対応するＮ４６７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＱ９２６Ａ変異）が使用される。高忠実度バリアントは、ミスマッチを安定化し、オフターゲットＤＮＡ開裂を低減するＣａｓ９の能力を低減する。一部の実施形態では、特異性の増加は、オンターゲット開裂の効率の約１００倍の喪失を伴う。一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９に相当するオンターゲット開裂率を維持する高忠実度バリアントである、ＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓ９が使用される。一部の実施形態では、ＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣループにおける変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ｇＲＮＡ－ＴＳ二本鎖の後続の開裂を促進するねじれたコンフォメーションの形成を阻害する。一部の実施形態では、ＳｐｙＣａｓ９に対応するＹ１０１６、Ｒ１０１９、Ｙ１０１０、Ｙ１０１３、Ｋ１０３１、Ｑ１０２７、及び／又はＶ１０１８残基は、例えば、アスパラギン酸に変異している。（Ｂｒａｖｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｎａｔｕｒｅ，６０３，Ｍａｒｃｈ ２０２２）。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はイノシンデアミナーゼなどのデアミナーゼと融合される。塩基エディターの複数の構成は、複数の塩基編集の多重化タイプを達成することが可能である。例えば、一部の実施形態では、単一の塩基エディターが、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成するために、１つ超のガイドと組み合わせて使用される。代替的に、一部の実施形態では、好適なガイドと対になる複数の塩基エディターを使用して、２、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成する。複数の塩基エディター及び関連ガイドを、表２、３、４、５、及び６に示す。したがって、一部の実施形態では、塩基エディター、並びにＢ２Ｍ遺伝子、ＣＤ１４２遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子などの１つ以上の特定の遺伝子を標的化する好適なガイドが提供される。
一部の実施形態では、塩基編集システムは、１つ以上のベクターで提供される。例えば、塩基編集システムは、単一のベクター又は塩基編集システムの成分を送達する１つ超のベクターからなる「スプリットベクター」で提供され得る。対応する核酸は、コドン最適化され得る。かかるコドン最適化は、ヒト細胞における発現のための核酸を最適化するために実行される。
遺伝子修飾肝細胞の産生に続いて、遺伝子修飾細胞は、好適なヒト化動物モデルにおいて増殖される。この増殖は、それを必要とする対象への移植に十分な好適な数の細胞の産生を可能にする。様々なヒト化動物モデルは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＦＲＧブタ、ＦＲＧマウス、及びＦＲＧラット動物を含む。一部の実施形態では、ＦＲＧマウス及び／又はＦＲＧマウス動物内で第１の増殖下にある遺伝子修飾肝細胞に、より大きいヒト化ＦＲＧ動物（例えば、ブタ）における第２の増殖が続く。一般的に、約５０万～１００万個の細胞が、ＦＲＧマウス当たり約０．８億～１．５億個の肝細胞を生成する。一般的に、約５０万～１００万個の細胞が、ＦＲＧラット当たり約４．８億～９億個の肝細胞を生成する。ＦＲＧブタは、一般に、細胞増殖の点で、ＦＲＧラットよりも約１００倍多く生成することができる。
増殖段階後、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、続いて、ＦＲＧ動物から単離される。かかる単離は、当該技術分野で既知の方法に従い、例えば、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気細胞分離、密度勾配遠心分離、及び／又は免疫密度細胞分離が挙げられる。
肝疾患を治療する方法
本明細書において、肝疾患を有する対象を治療するために、記載の遺伝子修飾ヒト肝細胞を使用する方法が記載される。遺伝子修飾ヒト肝細胞は、例えば、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、クリグラー・ナジャー症候群１型、家族性高コレステロール血症、先天性凝固第ＶＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、糖原病Ｉ型、乳児レフサム病、メープルシロップ尿症、新生児ヘモクロマトーシス、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２型（ＰＦＩＣ２）、尿素サイクル異常症（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンターゼ１型欠損症、シトルリン血症、ウィルソン病）、急性肝不全、妊娠脂肪肝、及び慢性肝不全の急性増悪を含む様々な肝疾患の治療に使用することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、先天性又は後天性肝疾患のいずれかを治療するために使用され得る。したがって、一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、アルファ－１アンチトリプシン欠損症の治療に使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、クリグラー・ナジャー症候群１型を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、家族性高コレステロール血症を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、先天性凝固第ＶＩＩ因子欠損症を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、血友病Ａを治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、糖原病Ｉ型を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、乳児レフサム病を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、メープルシロップ尿症を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、新生児ヘモクロマトーシスを治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２型（ＰＦＩＣ２）を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２型（ＰＦＩＣ２）を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンターゼ１型欠損症、シトルリン血症、ウィルソン病などの尿素サイクル異常症を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、急性肝不全を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、妊娠中の妊娠脂肪肝を治療するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、慢性肝不全の急性増悪を治療するために使用される。
治療を必要とする対象を治療する方法は、本明細書に記載の遺伝子修飾ヒト肝細胞の投与を含む。様々な投与様式（例えば、門脈内注入又は細胞の注入）は、それを必要とする対象の治療に好適である。一部の実施形態では、遺伝子修飾ヒト肝細胞は、それを必要とする対象の門脈内に投与される。投薬目的のために、それを必要とする対象に投与される遺伝子修飾ヒト肝細胞の量は、約５０億～２００億個の細胞である。一部の実施形態では、約５０億～２００億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。一部の実施形態では、約１００億～１２０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。一部の実施形態では、約１２０億～１５０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される。
一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約２～１５％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約５～１０％の量で対象に投与される。したがって、一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約２％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約３％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約４％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約５％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約６％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約７％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約８％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約９％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１０％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１１％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１２％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１３％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１４％の量で対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、総肝臓質量の約１５％の量で対象に投与される。
一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約２×１０８個の細胞を対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約１．５×１０８個の細胞を対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約１．２×１０８個の細胞を対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約１．０×１０８個の細胞を対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約０．８×１０８個の細胞を対象に投与される。一部の実施形態では、遺伝子修飾肝細胞は、体重１ｋｇ当たり最大約０．５×１０８個の細胞を対象に投与される。
ＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質
一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメインに融合している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２酵素は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のタンパク質ドメインに融合している。一部の実施形態では、異種タンパク質ドメインは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２酵素のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、異種タンパク質ドメインは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２酵素のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、異種タンパク質ドメインは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２酵素のＣ末端とＮ末端との間で内部融合している。一部の実施形態では、内部融合は、Ｃａｓ９ ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、ＨＮＨ、ＲＥＣ Ｉ、又はＰＡＭ相互作用ドメイン内で行われる。
Ｃａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質は、別のタンパク質ドメインに直接的又は間接的に結合され得る。一部の実施形態では、好適なＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９タンパク質及び異種タンパク質を結合するリンカー又はスペーサーを含有する。アミノ酸リンカー又はスペーサーは、一般に、可撓性であるように、又はアルファ－ヘリックスなどの構造を、２つのタンパク質部分の間に介在させるように設計される。リンカー又はスペーサーは、比較的短い場合があるか、又はより長い場合がある。典型的には、リンカー又はスペーサーは、例えば、１～１００（例えば、１～１００、５～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、５～５５、１０～５０、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０）アミノ酸長を含有する。一部の実施形態では、リンカー又はスペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００アミノ酸長以上である。典型的には、より長いリンカーは、立体障害を減少させ得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリン残基の混合物を含むであろう。一部の実施形態では、リンカーは、スレオニン、プロリン、及び／又はアラニン残基を更に含み得る。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質は、酵素活性、エピジェネティック修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、核酸結合活性、転写調節活性を有する細胞局在化シグナル、エピトープタグ、レポーター遺伝子、及びタンパク質ドメインに融合している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＦＬＡＧタグ、ＨＩＳタグ、及び／又はＨＡタグに融合している。
好適な融合パートナーとしては、これらに限定されないが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、又はヌクレアーゼ活性を提供するポリペプチドが挙げられ、これらのいずれかは、ＤＮＡ又はＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＤＮＡ結合タンパク質）を修飾することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヒストンデメチラーゼ、転写アクチベーター、又はデアミナーゼに融合している。
更なる好適な融合パートナーとしては、これらに限定されないが、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が挙げられる。
特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、例えば、塩基編集における使用のために、シチジン又はアデノシンデアミナーゼドメインに融合している。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、アデニン及びシトシン塩基エディター（ＡＣＢＥ又はＣＡＢＥ）に融合しており、ＡＣＢＥ又はＣＡＢＥは、ＴａｄＡのヘテロ二量体及び活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）のＮ末端及びＣ末端に融合することによって生成される。一部の実施形態では、ＡＣＢＥ又はＣＡＢＥは、同じ標的部位でＣからＴへの及びＡからＧへの塩基編集を同時に誘導する。Ｘｉｅ，Ｊ ｅｔ ａｌ．ＡＣＢＥ，ａ ｎｅｗ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｃ－ｔｏ－Ｔ ａｎｄ Ａ－ｔｏ－Ｇ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｙｓｔｅｍｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１８：１３１），２０２０）
特定の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２は、例えば、塩基編集における使用のために、シチジン又はアデノシンデアミナーゼドメインに融合している。一部の実施形態では、「シチジンデアミナーゼ」及び「シトシンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用することができる。特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、本明細書に記載される任意のシチジンデアミナーゼと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼ活性を有する（例えば、ＣをＵに変換する）。特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、本明細書に記載される任意のアデノシンデアミナーゼと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する（例えば、ＡをＩに変換する）。一部の実施形態では、「アデノシンデアミナーゼ」及び「アデニンデアミナーゼ」という用語は、交換可能に使用することができる。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼの全部又は一部を含むことができる。ＡＰＯＢＥＣは進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーである。このファミリーのメンバーは、ＣからＵの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは、触媒ドメインであり、Ｃ末端ドメインは、偽触媒ドメインである。より具体的には、触媒ドメインは、亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーには、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（現在、「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は、これを指す）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、及び活性化誘導（シチジン）デアミナーゼが含まれる。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼの全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質に組み込まれるデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）の全部又は一部を含む。融合タンパク質は、任意の好適な生物（例えば、ヒト又はラット）由来のデアミナーゼを含み得ることを理解されたい。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、又はマウス由来である。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、ラット（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１）に由来する。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１である。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ｐｍＣＤＡ１である。
例示的なシチジンデアミナーゼの配列は、以下に提供される。
ｐｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）
ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＩＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ（配列番号４）
ヒトＡＩＤ：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＡＰＶ（配列番号５）
ヒトＡＩＤ：

（配列番号６）（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）
マウスＡＩＤ：

（配列番号７）（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）
イヌＡＩＤ：

（配列番号８）（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）
ウシＡＩＤ：

（配列番号９）（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）
ラットＡＩＤ：

（配列番号１０）
（下線：核局在化配列、二重下線：核外輸送シグナル）
ｃｌＡＩＤ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＫＱＲＫＦＬＹＨＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＳＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＹＰＮＬＳＬＲＩＦＡＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＲＥＫＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号１１）
ｂｔＡＩＤ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＫＫＱＲＱＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＰＴＳＦＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＡＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＹＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＤＫＥＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号１２）
ｍＡＩＤ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＦＳＬＤＦＧＹＬＲＮＫＮＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＤＦＬＲＧＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＡＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＨＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＳＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＴＬＧＬ（配列番号１３）
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ（配列番号１４）
ｍａＡＰＯＢＥＣ－１（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＶＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＤＡＦＦＤＱＧＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＲＷＧＧＲＨＮＩＷＲＨＴＧＱＮＴＳＲＨＶＥＩＮＦＩＥＫＦＴＳＥＲＹＦＹＰＳＴＲＣＳＩＶＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＫＡＩＴＥＦＬＳＧＨＰＮＶＴＬＦＩＹＡＡＲＬＹＨＨＴＤＱＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＲＧＶＴＩＲＩＭＴＥＱＥＹＣＹＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＳＮＥＶＹＷＰＲＹＰＮＬＷＭＲＬＹＡＬＥＬＹＣＩＨＬＧＬＰＰＣＬＫＩＫＲＲＨＱＹＰＬＴＦＦＲＬＮＬＱＳＣＨＹＱＲＩＰＰＨＩＬＷＡＴＧＦＩ（配列番号１５）
ｐｐＡＰＯＢＥＣ－１（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）：
ＭＴＳＥＫＧＰＳＴＧＤＰＴＬＲＲＲＩＥＳＷＥＦＤＶＦＹＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＫＷＧＭＳＲＫＩＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＩＫＫＦＴＳＥＲＲＦＨＳＳＩＳＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＱＡＩＲＥＦＬＳＱＨＰＧＶＴＬＶＩＹＶＡＲＬＦＷＨＭＤＱＲＮＲＱＧＬＲＤＬＶＮＳＧＶＴＩＱＩＭＲＡＳＥＹＹＨＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＧＤＥＡＨＷＰＱＹＰＰＬＷＭＭＬＹＡＬＥＬＨＣＩＩＬＳＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＷＱＮＨＬＡＦＦＲＬＨＬＱＮＣＨＹＱＴＩＰＰＨＩＬＬＡＴＧＬＩＨＰＳＶＴＷＲ（配列番号１６）
ｏｃＡＰＯＢＥＣ１（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）：
ＭＡＳＥＫＧＰＳＮＫＤＹＴＬＲＲＲＩＥＰＷＥＦＥＶＦＦＤＰＱＥＬＲＫＥＡＣＬＬＹＥＩＫＷＧＡＳＳＫＴＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＬＥＫＬＴＳＥＧＲＬＧＰＳＴＣＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＭＡＩＲＥＦＬＳＱＨＰＧＶＴＬＩＩＦＶＡＲＬＦＱＨＭＤＲＲＮＲＱＧＬＫＤＬＶＴＳＧＶＴＶＲＶＭＳＶＳＥＹＣＹＣＷＥＮＦＶＮＹＰＰＧＫＡＡＱＷＰＲＹＰＰＲＷＭＬＭＹＡＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＨＱＫＱＬＴＦＦＳＬＴＰＱＹＣＨＹＫＭＩＰＰＹＩＬＬＡＴＧＬＬＱＰＳＶＰＷＲ（配列番号１７）
ｍｄＡＰＯＢＥＣ－１（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）：
ＭＮＳＫＴＧＰＳＶＧＤＡＴＬＲＲＲＩＫＰＷＥＦＶＡＦＦＮＰＱＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＫＷＧＮＱＮＩＷＲＨＳＮＱＮＴＳＱＨＡＥＩＮＦＭＥＫＦＴＡＥＲＨＦＮＳＳＶＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＫＡＩＲＫＦＬＤＨＹＰＮＶＴＬＡＩＦＩＳＲＬＹＷＨＭＤＱＱＨＲＱＧＬＫＥＬＶＨＳＧＶＴＩＱＩＭＳＹＳＥＹＨＹＣＷＲＮＦＶＤＹＰＱＧＥＥＤＹＷＰＫＹＰＹＬＷＩＭＬＹＶＬＥＬＨＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＫＩＳＧＳＨＳＮＱＬＡＬＦＳＬＤＬＱＤＣＨＹＱＫＩＰＹＮＶＬＶＡＴＧＬＶＱＰＦＶＴＷＲ（配列番号１８）
ｐｐＡＰＯＢＥＣ－２（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＴＥＡＡＳＱＮＧＥＤＬＥＮＬＤＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＧＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＡＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＲＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＩＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＬＥＩＱＤＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＶＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＱＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号１９）
ｂｔＡＰＯＢＥＣ－２（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＡＥＰＡＳＱＮＧＥＥＶＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＨＹＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＴＮＨＡＥＥＡＦＦＮＳＩＭＰＴＦＤＰＡＬＲＹＭＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＶＫＴＬＮＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＲＫＬＫＥＡＧＣＲＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号２０）
ｍＡＰＯＢＥＣ－３－（１）（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＱＰＱＲＬＧＰＲＡＧＭＧＰＦＣＬＧＣＳＨＲＫＣＹＳＰＩＲＮＬＩＳＱＥＴＦＫＦＨＦＫＮＬＧＹＡＫＧＲＫＤＴＦＬＣＹＥＶＴＲＫＤＣＤＳＰＶＳＬＨＨＧＶＦＫＮＫＤＮＩＨＡＥＩＣＦＬＹＷＦＨＤＫＶＬＫＶＬＳＰＲＥＥＦＫＩＴＷＹＭＳＷＳＰＣＦＥＣＡＥＱＩＶＲＦＬＡＴＨＨＮＬＳＬＤＩＦＳＳＲＬＹＮＶＱＤＰＥＴＱＱＮＬＣＲＬＶＱＥＧＡＱＶＡＡＭＤＬＹＥＦＫＫＣＷＫＫＦＶＤＮＧＧＲＲＦＲＰＷＫＲＬＬＴＮＦＲＹＱＤＳＫＬＱＥＩＬＲＰＣＹＩＳＶＰＳＳＳＳＳＴＬＳＮＩＣＬＴＫＧＬＰＥＴＲＦＷＶＥＧＲＲＭＤＰＬＳＥＥＥＦＹＳＱＦＹＮＱＲＶＫＨＬＣＹＹＨＲＭＫＰＹＬＣＹＱＬＥＱＦＮＧＱＡＰＬＫＧＣＬＬＳＥＫＧＫＱＨＡＥＩＬＦＬＤＫＩＲＳＭＥＬＳＱＶＴＩＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＮＣＡＷＱＬＡＡＦＫＲＤＲＰＤＬＩＬＨＩＹＴＳＲＬＹＦＨＷＫＲＰＦＱＫＧＬＣＳＬＷＱＳＧＩＬＶＤＶＭＤＬＰＱＦＴＤＣＷＴＮＦＶＮＰＫＲＰＦＷＰＷＫＧＬＥＩＩＳＲＲＴＱＲＲＬＲＲＩＫＥＳＷＧＬＱＤＬＶＮＤＦＧＮＬＱＬＧＰＰＭＳ（配列番号２１）
マウスＡＰＯＢＥＣ－３－（２）：

（配列番号２２）（斜体：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ－３：

（配列番号２３）（斜体：核酸編集ドメイン）
ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ａ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＥＡＳＰＡＳＧＰＲＨＬＭＤＰＨＩＦＴＳＮＦＮＮＧＩＧＲＨＫＴＹＬＣＹＥＶＥＲＬＤＮＧＴＳＶＫＭＤＱＨＲＧＦＬＨＮＱＡＫＮＬＬＣＧＦＹＧＲＨＡＥＬＲＦＬＤＬＶＰＳＬＱＬＤＰＡＱＩＹＲＶＴＷＦＩＳＷＳＰＣＦＳＷＧＣＡＧＥＶＲＡＦＬＱＥＮＴＨＶＲＬＲＩＦＡＡＲＩＹＤＹＤＰＬＹＫＥＡＬＱＭＬＲＤＡＧＡＱＶＳＩＭＴＹＤＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ（配列番号２４）
ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＫＰＨＦＲＮＴＶＥＲＭＹＲＤＴＦＳＹＮＦＹＮＲＰＩＬＳＲＲＮＴＶＷＬＣＹＥＶＫＴＫＧＰＳＲＰＲＬＤＡＫＩＦＲＧＱＶＹＳＱＰＥＨＨＡＥＭＣＦＬＳＷＦＣＧＮＱＬＰＡＹＫＣＦＱＩＴＷＦＶＳＷＴＰＣＰＤＣＶＡＫＬＡＥＦＬＡＥＨＰＮＶＴＬＴＩＳＡＡＲＬＹＹＹＷＥＲＤＹＲＲＡＬＣＲＬＳＱＡＧＡＲＶＫＩＭＤＤＥＥＦＡＹＣＷＥＮＦＶＹＳＥＧＱＰＦＭＰＷＹＫＦＤＤＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＬＲＮＰＭＥＡＭＹＰＨＩＦＹＦＨＦＫＮＬＲＫＡＹＧＲＮＥＳＷＬＣＦＴＭＥＶＶＫＨＨＳＰＶＳＷＫＲＧＶＦＲＮＱＶＤＰＥＴＨＣＨＡＥＲＣＦＬＳＷＦＣＤＤＩＬＳＰＮＴＮＹＥＶＴＷＹＴＳＷＳＰＣＰＥＣＡＧＥＶＡＥＦＬＡＲＨＳＮＶＮＬＴＩＦＴＡＲＬＹＹＦＷＤＴＤＹＱＥＧＬＲＳＬＳＱＥＧＡＳＶＥＩＭＧＹＫＤＦＫＹＣＷＥＮＦＶＹＮＤＤＥＰＦＫＰＷＫＧＬＫＹＮＦＬＦＬＤＳＫＬＱＥＩＬＥ（配列番号２５）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：

（配列番号２６）（斜体：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：

（配列番号２７）
（斜体：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ミドリザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：

（配列番号２８）
（斜体：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：

（配列番号２９）
（斜体：核酸編集ドメイン、下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ：

（配列番号３０）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：

（配列番号３１）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＭＱＰＱＧＬＧＰＮＡＧＭＧＰＶＣＬＧＣＳＨＲＲＰＹＳＰＩＲＮＰＬＫＫＬＹＱＱＴＦＹＦＨＦＫＮＶＲＹＡＷＧＲＫＮＮＦＬＣＹＥＶＮＧＭＤＣＡＬＰＶＰＬＲＱＧＶＦＲＫＱＧＨＩＨＡＥＬＣＦＩＹＷＦＨＤＫＶＬＲＶＬＳＰＭＥＥＦＫＶＴＷＹＭＳＷＳＰＣＳＫＣＡＥＱＶＡＲＦＬＡＡＨＲＮＬＳＬＡＩＦＳＳＲＬＹＹＹＬＲＮＰＮＹＱＱＫＬＣＲＬＩＱＥＧＶＨＶＡＡＭＤＬＰＥＦＫＫＣＷＮＫＦＶＤＮＤＧＱＰＦＲＰＷＭＲＬＲＩＮＦＳＦＹＤＣＫＬＱＥＩＦＳＲＭＮＬＬＲＥＤＶＦＹＬＱＦＮＮＳＨＲＶＫＰＶＱＮＲＹＹＲＲＫＳＹＬＣＹＱＬＥＲＡＮＧＱＥＰＬＫＧＹＬＬＹＫＫＧＥＱＨＶＥＩＬＦＬＥＫＭＲＳＭＥＬＳＱＶＲＩＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＮＣＡＲＱＬＡＡＦＫＫＤＨＰＤＬＩＬＲＩＹＴＳＲＬＹＦＷＲＫＫＦＱＫＧＬＣＴＬＷＲＳＧＩＨＶＤＶＭＤＬＰＱＦＡＤＣＷＴＮＦＶＮＰＱＲＰＦＲＰＷＮＥＬＥＫＮＳＷＲＩＱＲＲＬＲＲＩＫＥＳＷＧＬ（配列番号３２）
ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＭＤＧＷＥＶＡＦＲＳＧＴＶＬＫＡＧＶＬＧＶＳＭＴＥＧＷＡＧＳＧＨＰＧＱＧＡＣＶＷＴＰＧＴＲＮＴＭＮＬＬＲＥＶＬＦＫＱＱＦＧＮＱＰＲＶＰＡＰＹＹＲＲＫＴＹＬＣＹＱＬＫＱＲＮＤＬＴＬＤＲＧＣＦＲＮＫＫＱＲＨＡＥＲＦＩＤＫＩＮＳＬＤＬＮＰＳＱＳＹＫＩＩＣＹＩＴＷＳＰＣＰＮＣＡＮＥＬＶＮＦＩＴＲＮＮＨＬＫＬＥＩＦＡＳＲＬＹＦＨＷＩＫＳＦＫＭＧＬＱＤＬＱＮＡＧＩＳＶＡＶＭＴＨＴＥＦＥＤＣＷＥＱＦＶＤＮＱＳＲＰＦＱＰＷＤＫＬＥＱＹＳＡＳＩＲＲＲＬＱＲＩＬＴＡＰＩ（配列番号３３）
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
ＭＮＰＱＩＲＮＰＭＥＷＭＹＱＲＴＦＹＹＮＦＥＮＥＰＩＬＹＧＲＳＹＴＷＬＣＹＥＶＫＩＲＲＧＨＳＮＬＬＷＤＴＧＶＦＲＧＱＭＹＳＱＰＥＨＨＡＥＭＣＦＬＳＷＦＣＧＮＱＬＳＡＹＫＣＦＱＩＴＷＦＶＳＷＴＰＣＰＤＣＶＡＫＬＡＫＦＬＡＥＨＰＮＶＴＬＴＩＳＡＡＲＬＹＹＹＷＥＲＤＹＲＲＡＬＣＲＬＳＱＡＧＡＲＶＫＩＭＤＤＥＥＦＡＹＣＷＥＮＦＶＹＮＥＧＱＰＦＭＰＷＹＫＦＤＤＮＹＡＦＬＨＲＴＬＫＥＩＩＲＨＬＭＤＰＤＴＦＴＦＮＦＮＮＤＰＬＶＬＲＲＨＱＴＹＬＣＹＥＶＥＲＬＤＮＧＴＷＶＬＭＤＱＨＭＧＦＬＣＮＥＡＫＮＬＬＣＧＦＹＧＲＨＡＥＬＲＦＬＤＬＶＰＳＬＱＬＤＰＡＱＩＹＲＶＴＷＦＩＳＷＳＰＣＦＳＷＧＣＡＧＱＶＲＡＦＬＱＥＮＴＨＶＲＬＲＩＦＡＡＲＩＹＤＹＤＰＬＹＫＥＡＬＱＭＬＲＤＡＧＡＱＶＳＩＭＴＹＤＥＦＥＹＣＷＤＴＦＶＹＲＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＥＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＶＲＡＳＳＬＣＭＶＰＨＲＰＰＰＰＰＱＳＰＧＰＣＬＰＬＣＳＥＰＰＬＧＳＬＬＰＴＧＲＰＡＰＳＬＰＦＬＬＴＡＳＦＳＦＰＰＰＡＳＬＰＰＬＰＳＬＳＬＳＰＧＨＬＰＶＰＳＦＨＳＬＴＳＣＳＩＱＰＰＣＳＳＲＩＲＥＴＥＧＷＡＳＶＳＫＥＧＲＤＬＧ（配列番号３４）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ：

（配列番号３５）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ゴリラＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ

（配列番号３６）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：

（配列番号３７）
（斜体：核酸編集ドメイン）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：

（配列番号３８）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：

（配列番号３９）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：

（配列番号４０）
（斜体：核酸編集ドメイン）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
ＭＡＬＬＴＡＫＴＦＳＬＱＦＮＮＫＲＲＶＮＫＰＹＹＰＲＫＡＬＬＣＹＱＬＴＰＱＮＧＳＴＰＴＲＧＨＬＫＮＫＫＫＤＨＡＥＩＲＦＩＮＫＩＫＳＭＧＬＤＥＴＱＣＹＱＶＴＣＹＬＴＷＳＰＣＰＳＣＡＧＥＬＶＤＦＩＫＡＨＲＨＬＮＬＲＩＦＡＳＲＬＹＹＨＷＲＰＮＹＱＥＧＬＬＬＬＣＧＳＱＶＰＶＥＶＭＧＬＰＥＦＴＤＣＷＥＮＦＶＤＨＫＥＰＰＳＦＮＰＳＥＫＬＥＥＬＤＫＮＳＱＡＩＫＲＲＬＥＲＩＫＳＲＳＶＤＶＬＥＮＧＬＲＳＬＱＬＧＰＶＴＰＳＳＳＩＲＮＳＲ（配列番号４１）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｄ：

（配列番号４２）
（斜体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－１：
ＭＴＳＥＫＧＰＳＴＧＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＷＥＦＤＶＦＹＤＰＲＥＬＲＫＥＡＣＬＬＹＥＩＫＷＧＭＳＲＫＩＷＲＳＳＧＫＮＴＴＮＨＶＥＶＮＦＩＫＫＦＴＳＥＲＤＦＨＰＳＭＳＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＷＥＣＳＱＡＩＲＥＦＬＳＲＨＰＧＶＴＬＶＩＹＶＡＲＬＦＷＨＭＤＱＱＮＲＱＧＬＲＤＬＶＮＳＧＶＴＩＱＩＭＲＡＳＥＹＹＨＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＧＤＥＡＨＷＰＱＹＰＰＬＷＭＭＬＹＡＬＥＬＨＣＩＩＬＳＬＰＰＣＬＫＩＳＲＲＷＱＮＨＬＴＦＦＲＬＨＬＱＮＣＨＹＱＴＩＰＰＨＩＬＬＡＴＧＬＩＨＰＳＶＡＷＲ（配列番号４３）
マウスＡＰＯＢＥＣ－１：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＶＷＲＨＴＳＱＮＴＳＮＨＶＥＶＮＦＬＥＫＦＴＴＥＲＹＦＲＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＨＰＹＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＴＤＱＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＹＣＹＣＷＲＮＦＶＮＹＰＰＳＮＥＡＹＷＰＲＹＰＨＬＷＶＫＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＫＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＴＬＱＴＣＨＹＱＲＩＰＰＨＬＬＷＡＴＧＬＫ（配列番号４４）
ラットＡＰＯＢＥＣ－１：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ（配列番号４５）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＶＡＴＥＡＡＳＱＮＧＥＤＬＥＮＬＤＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＧＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＡＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＲＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＩＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＶＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＱＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号４６）
マウスＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＥＡＡＡＰＡＳＱＮＧＤＤＬＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＤＬＰＰＦＥＩＶＴＧＶＲＬＰＶＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＶＱＳＫＧＧＱＡＱＡＴＱＧＹＬＥＤＥＨＡＧＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＫＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＬＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＳＲＬＦＭＷＥＥＰＥＶＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号４７）
ラットＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＥＡＡＡＰＡＳＱＮＧＤＤＬＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＤＬＰＰＦＥＩＶＴＧＶＲＬＰＶＮＦＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＴＱＧＹＬＥＤＥＨＡＧＡＨＡＥＥＡＦＦＮＴＩＬＰＡＦＤＰＡＬＫＹＮＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＬＫＴＬＳＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＳＲＬＦＭＷＥＥＰＥＶＱＡＡＬＫＫＬＫＥＡＧＣＫＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＬＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号４８）
ウシＡＰＯＢＥＣ－２：
ＭＡＱＫＥＥＡＡＡＡＡＥＰＡＳＱＮＧＥＥＶＥＮＬＥＤＰＥＫＬＫＥＬＩＥＬＰＰＦＥＩＶＴＧＥＲＬＰＡＨＹＦＫＦＱＦＲＮＶＥＹＳＳＧＲＮＫＴＦＬＣＹＶＶＥＡＱＳＫＧＧＱＶＱＡＳＲＧＹＬＥＤＥＨＡＴＮＨＡＥＥＡＦＦＮＳＩＭＰＴＦＤＰＡＬＲＹＭＶＴＷＹＶＳＳＳＰＣＡＡＣＡＤＲＩＶＫＴＬＮＫＴＫＮＬＲＬＬＩＬＶＧＲＬＦＭＷＥＥＰＥＩＱＡＡＬＲＫＬＫＥＡＧＣＲＬＲＩＭＫＰＱＤＦＥＹＩＷＱＮＦＶＥＱＥＥＧＥＳＫＡＦＥＰＷＥＤＩＱＥＮＦＬＹＹＥＥＫＬＡＤＩＬＫ（配列番号４９）
Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ ＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡｌ）：
ＭＴＤＡＥＹＶＲＩＨＥＫＬＤＩＹＴＦＫＫＱＦＦＮＮＫＫＳＶＳＨＲＣＹＶＬＦＥＬＫＲＲＧＥＲＲＡＣＦＷＧＹＡＶＮＫＰＱＳＧＴＥＲＧＩＨＡＥＩＦＳＩＲＫＶＥＥＹＬＲＤＮＰＧＱＦＴＩＮＷＹＳＳＷＳＰＣＡＤＣＡＥＫＩＬＥＷＹＮＱＥＬＲＧＮＧＨＴＬＫＩＷＡＣＫＬＹＹＥＫＮＡＲＮＱＩＧＬＷＮＬＲＤＮＧＶＧＬＮＶＭＶＳＥＨＹＱＣＣＲＫＩＦＩＱＳＳＨＮＱ ＬＮＥＮＲＷＬＥＫＴＬＫＲＡＥＫＲＲＳＥＬＳＦＭＩＱＶＫＩＬＨＴＴＫＳＰＡＶ（配列番号５０）
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ｄ３１６Ｒ Ｄ３１７Ｒ：
ＭＫＰＨＦＲＮＴＶＥＲＭＹＲＤＴＦＳＹＮＦＹＮＲＰＩＬＳＲＲＮＴＶＷＬＣＹＥＶＫＴＫＧＰＳＲＰＰＬＤＡＫＩＦＲＧＱＶＹＳＥＬＫＹＨＰＥＭＲＦＦＨＷＦＳＫＷＲＫＬＨＲＤＱＥＹＥＶＴＷＹＩＳＷＳＰＣＴＫＣＴＲＤＭＡＴＦＬＡＥＤＰＫＶＴＬＴＩＦＶＡＲＬＹＹＦＷＤＰＤＹＱＥＡＬＲＳＬＣＱＫＲＤＧＰＲＡＴＭＫＦＮＹＤＥＦＱＨＣＷＳＫＦＶＹＳＱＲＥＬＦＥＰＷＮＮＬＰＫＹＹＩＬＬＨＦＭＬＧＥＩＬＲＨＳＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＶＲＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＲＲＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＥＮ（配列番号５１）
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ａ鎖：
ＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＷＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＮＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＤＤＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤ ＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱ（配列番号５２）
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ａ鎖 Ｄ１２０Ｒ Ｄ１２１Ｒ：
ＭＤＰＰＴＦＴＦＮＦＮＮＥＰＷＶＲＧＲＨＥＴＹＬＣＹＥＶＥＲＭＨＮＤＴＷＶＬＬＮＱＲＲＧＦＬＣＮＱＡＰＨＫＨＧＦＬＥＧＲＨＡＥＬＣＦＬＤＶＩＰＦＷＫＬＤＬＤＱＤＹＲＶＴＣＦＴＳＷＳＰＣＦＳＣＡＱＥＭＡＫＦＩＳＫＮＫＨＶＳＬＣＩＦＴＡＲＩＹＲＲＱＧＲＣＱＥＧＬＲＴＬＡＥＡＧＡＫＩＳＦＭＴＹＳＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＤＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱ（配列番号５３）
ｈＡＰＯＢＥＣ－４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＥＰＩＹＥＥＹＬＡＮＨＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＦＳＬＤＣＳＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＳＬＴＥＦＣＱＩＦＧＦＰＹＧＴＴＦＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＫＴＳＳＧＳＬＶＱＫＧＨＡＳＳＣＴＧＮＹＩＨＰＥＳＭＬＦＥＭＮＧＹＬＤＳＡＩＹＮＮＤＳＩＲＨＩＩＬＹＳＮＮＳＰＣＮＥＡＮＨＣＣＩＳＫＭＹＮＦＬＩＴＹＰＧＩＴＬＳＩＹＦＳＱＬＹＨＴＥＭＤＦＰＡＳＡＷＮＲＥＡＬＲＳＬＡＳＬＷＰＲＶＶＬＳＰＩＳＧＧＩＷＨＳＶＬＨＳＦＩＳＧＶＳＧＳＨＶＦＱＰＩＬＴＧＲＡＬＡＤＲＨＮＡＹＥＩＮＡＩＴＧＶＫＰＹＦＴＤＶＬＬＱＴＫＲＮＰＮＴＫＡＱＥＡＬＥＳＹＰＬＮＮＡＦＰＧＱＦＦＱＭＰＳＧＱＬＱＰＮＬＰＰＤＬＲＡＰＶＶＦＶＬＶＰＬＲＤＬＰＰＭＨＭＧＱＮＰＮＫＰＲＮＩＶＲＨＬＮＭＰＱＭＳＦＱＥＴＫＤＬＧＲＬＰＴＧＲＳＶＥＩＶＥＩＴＥＱＦＡＳＳＫＥＡＤＥＫＫＫＫＫＧＫＫ（配列番号５４）
ｍＡＰＯＢＥＣ－４（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）：
ＭＤＳＬＬＭＫＱＫＫＦＬＹＨＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＨＥＴＹＬＣＹＶＶＫＲＲＤＳＡＴＳＣＳＬＤＦＧＨＬＲＮＫＳＧＣＨＶＥＬＬＦＬＲＹＩＳＤＷＤＬＤＰＧＲＣＹＲＶＴＷＦＴＳＷＳＰＣＹＤＣＡＲＨＶＡＥＦＬＲＷＮＰＮＬＳＬＲＩＦＴＡＲＬＹＦＣＥＤＲＫＡＥＰＥＧＬＲＲＬＨＲＡＧＶＱＩＧＩＭＴＦＫＤＹＦＹＣＷＮＴＦＶＥＮＲＥＲＴＦＫＡＷＥＧＬＨＥＮＳＶＲＬＴＲＱＬＲＲＩＬＬＰＬＹＥＶＤＤＬＲＤＡＦＲＭＬＧＦ（配列番号５５）
ｒＡＰＯＢＥＣ－４（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）：
ＭＥＰＬＹＥＥＹＬＴＨＳＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＶＳＬＮＣＴＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＰＹＴＥＦＨＱＴＦＧＦＰＷＳＴＹＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＲＳＳＳＧＮＬＩＱＫＧＬＡＳＮＣＴＧＳＨＴＨＰＥＳＭＬＦＥＲＤＧＹＬＤＳＬＩＦＨＤＳＮＩＲＨＩＩＬＹＳＮＮＳＰＣＤＥＡＮＨＣＣＩＳＫＭＹＮＦＬＭＮＹＰＥＶＴＬＳＶＦＦＳＱＬＹＨＴＥＮＱＦＰＴＳＡＷＮＲＥＡＬＲＧＬＡＳＬＷＰＱＶＴＬＳＡＩＳＧＧＩＷＱＳＩＬＥＴＦＶＳＧＩＳＥＧＬＴＡＶＲＰＦＴＡＧＲＴＬＴＤＲＹＮＡＹＥＩＮＣＩＴＥＶＫＰＹＦＴＤＡＬＨＳＷＱＫＥＮＱＤＱＫＶＷＡＡＳＥＮＱＰＬＨＮＴＴＰＡＱＷＱＰＤＭＳＱＤＣＲＴＰＡＶＦＭＬＶＰＹＲＤＬＰＰＩＨＶＮＰＳＰＱＫＰＲＴＶＶＲＨＬＮＴＬＱＬＳＡＳＫＶＫＡＬＲＫＳＰＳＧＲＰＶＫＫＥＥＡＲＫＧＳＴＲＳＱＥＡＮＥＴＮＫＳＫＷＫＫＱＴＬＦＩＫＳＮＩＣＨＬＬＥＲＥＱＫＫＩＧＩＬＳＳＷＳＶ（配列番号５６）
ｍｆＡＰＯＢＥＣ－４（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）：
ＭＥＰＴＹＥＥＹＬＡＮＨＧＴＩＶＫＰＹＹＷＬＳＦＳＬＤＣＳＮＣＰＹＨＩＲＴＧＥＥＡＲＶＳＬＴＥＦＣＱＩＦＧＦＰＹＧＴＴＹＰＱＴＫＨＬＴＦＹＥＬＫＴＳＳＧＳＬＶＱＫＧＨＡＳＳＣＴＧＮＹＩＨＰＥＳＭＬＦＥＭＮＧＹＬＤＳＡＩＹＮＮＤＳＩＲＨＩＩＬＹＣＮＮＳＰＣＮＥＡＮＨＣＣＩＳＫＶＹＮＦＬＩＴＹＰＧＩＴＬＳＩＹＦＳＱＬＹＨＴＥＭＤＦＰＡＳＡＷＮＲＥＡＬＲＳＬＡＳＬＷＰＲＶＶＬＳＰＩＳＧＧＩＷＨＳＶＬＨＳＦＶＳＧＶＳＧＳＨＶＦＱＰＩＬＴＧＲＡＬＴＤＲＹＮＡＹＥＩＮＡＩＴＧＶＫＰＦＦＴＤＶＬＬＨＴＫＲＮＰＮＴＫＡＱＭＡＬＥＳＹＰＬＮＮＡＦＰＧＱＳＦＱＭＴＳＧＩＰＰＤＬＲＡＰＶＶＦＶＬＬＰＬＲＤＬＰＰＭＨＭＧＱＤＰＮＫＰＲＮＩＩＲＨＬＮＭＰＱＭＳＦＱＥＴＫＤＬＥＲＬＰＴＲＲＳＶＥＴＶＥＩＴＥＲＦＡＳＳＫＱＡＥＥＫＴＫＫＫＫＧＫＫ（配列番号５７）
ｐｍＣＤＡ－１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＡＧＹＥＣＶＲＶＳＥＫＬＤＦＤＴＦＥＦＱＦＥＮＬＨＹＡＴＥＲＨＲＴＹＶＩＦＤＶＫＰＱＳＡＧＧＲＳＲＲＬＷＧＹＩＩＮＮＰＮＶＣＨＡＥＬＩＬＭＳＭＩＤＲＨＬＥＳＮＰＧＶＹＡＭＴＷＹＭＳＷＳＰＣＡＮＣＳＳＫＬＮＰＷＬＫＮＬＬＥＥＱＧＨＴＬＴＭＨＦＳＲＩＹＤＲＤＲＥＧＤＨＲＧＬＲＧＬＫＨＶＳＮＳＦＲＭＧＶＶＧＲＡＥＶＫＥＣＬＡＥＹＶＥＡＳＲＲＴＬＴＷＬＤＴＴＥＳＭＡＡＫＭＲＲＫＬＦＣＩＬＶＲＣＡＧＭＲＥＳＧＩＰＬＨＬＦＴＬＱＴＰＬＬＳＧＲＶＶＷＷＲＶ（配列番号５８）
ｐｍＣＤＡ－２（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＥＬＲＥＶＶＤＣＡＬＡＳＣＶＲＨＥＰＬＳＲＶＡＦＬＲＣＦＡＡＰＳＱＫＰＲＧＴＶＩＬＦＹＶＥＧＡＧＲＧＶＴＧＧＨＡＶＮＹＮＫＱＧＴＳＩＨＡＥＶＬＬＬＳＡＶＲＡＡＬＬＲＲＲＲＣＥＤＧＥＥＡＴＲＧＣＴＬＨＣＹＳＴＹＳＰＣＲＤＣＶＥＹＩＱＥＦＧＡＳＴＧＶＲＶＶＩＨＣＣＲＬＹＥＬＤＶＮＲＲＲＳＥＡＥＧＶＬＲＳＬＳＲＬＧＲＤＦＲＬＭＧＰＲＤＡＩＡＬＬＬＧＧＲＬＡＮＴＡＤＧＥＳＧＡＳＧＮＡＷＶＴＥＴＮＶＶＥＰＬＶＤＭＴＧＦＧＤＥＤＬＨＡＱＶＱＲＮＫＱＩＲＥＡＹＡＮＹＡＳＡＶＳＬＭＬＧＥＬＨＶＤＰＤＫＦＰＦＬＡＥＦＬＡＱＴＳＶＥＰＳＧＴＰＲＥＴＲＧＲＰＲＧＡＳＳＲＧＰＥＩＧＲＱＲＰＡＤＦＥＲＡＬＧＡＹＧＬＦＬＨＰＲＩＶＳＲＥＡＤＲＥＥＩＫＲＤＬＩＶＶＭＲＫＨＮＹＱＧＰ（配列番号５９）
ｐｍＣＤＡ－５（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）：
ＭＡＧＤＥＮＶＲＶＳＥＫＬＤＦＤＴＦＥＦＱＦＥＮＬＨＹＡＴＥＲＨＲＴＹＶＩＦＤＶＫＰＱＳＡＧＧＲＳＲＲＬＷＧＹＩＩＮＮＰＮＶＣＨＡＥＬＩＬＭＳＭＩＤＲＨＬＥＳＮＰＧＶＹＡＭＴＷＹＭＳＷＳＰＣＡＮＣＳＳＫＬＮＰＷＬＫＮＬＬＥＥＱＧＨＴＬＭＭＨＦＳＲＩＹＤＲＤＲＥＧＤＨＲＧＬＲＧＬＫＨＶＳＮＳＦＲＭＧＶＶＧＲＡＥＶＫＥＣＬＡＥＹＶＥＡＳＲＲＴＬＴＷＬＤＴＴＥＳＭＡＡＫＭＲＲＫＬＦＣＩＬＶＲＣＡＧＭＲＥＳＧＭＰＬＨＬＦＴ（配列番号６０）
ｙＣＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：
ＭＶＴＧＧＭＡＳＫＷＤＱＫＧＭＤＩＡＹＥＥＡＡＬＧＹＫＥＧＧＶＰＩＧＧＣＬＩＮＮＫＤＧＳＶＬＧＲＧＨＮＭＲＦＱＫＧＳＡＴＬＨＧＥＩＳＴＬＥＮＣＧＲＬＥＧＫＶＹＫＤＴＴＬＹＴＴＬＳＰＣＤＭＣＴＧＡＩＩＭＹＧＩＰＲＣＶＶＧＥＮＶＮＦＫＳＫＧＥＫＹＬＱＴＲＧＨＥＶＶＶＶＤＤＥＲＣＫＫＩＭＫＱＦＩＤＥＲＰＱＤＷＦＥＤＩＧＥ（配列番号６１）
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Δ１７７－１８６）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＬＴＦＦＴＩＡＬＱＳＣＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ（配列番号６２）
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（Δ２０２－２１３）：
ＭＳＳＥＴＧＰＶＡＶＤＰＴＬＲＲＲＩＥＰＨＥＦＥＶＦＦＤＰＲＥＬＲＫＥＴＣＬＬＹＥＩＮＷＧＧＲＨＳＩＷＲＨＴＳＱＮＴＮＫＨＶＥＶＮＦＩＥＫＦＴＴＥＲＹＦＣＰＮＴＲＣＳＩＴＷＦＬＳＷＳＰＣＧＥＣＳＲＡＩＴＥＦＬＳＲＹＰＨＶＴＬＦＩＹＩＡＲＬＹＨＨＡＤＰＲＮＲＱＧＬＲＤＬＩＳＳＧＶＴＩＱＩＭＴＥＱＥＳＧＹＣＷＲＮＦＶＮＹＳＰＳＮＥＡＨＷＰＲＹＰＨＬＷＶＲＬＹＶＬＥＬＹＣＩＩＬＧＬＰＰＣＬＮＩＬＲＲＫＱＰＱＨＹＱＲＬＰＰＨＩＬＷＡＴＧＬＫ（配列番号６３）
マウスＡＰＯＢＥＣ－３：

（配列番号６４）
（斜体：核酸編集ドメイン）
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）の全部又は一部を含むことができる。別の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼＡＤＡＴの全部又は一部を含むことができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の変異のうちの１つ以上を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＡＤＡＴ（ＥｃＴａｄＡ）の全部又は一部を含むことができる：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５７Ｆ、又は別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異。アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１つ以上の変異を含む、天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。任意の相同タンパク質における対応する残基は、例えば、配列整列及び相同残基の判定によって特定することができる。本明細書に記載される変異のいずれか（例えば、ｅｃＴａｄＡにおいて特定された変異のいずれか）に対応する、任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼにおける（例えば、ｅｃＴａｄＡと相同性を有する）変異は、それに応じて生成することができる。特定の実施形態では、ＴａｄＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）に記載されるＴａｄＡのいずれか１つである（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。表７に示されるように一本鎖ＤＮＡに所望のアデノシンデアミナーゼ活性を有する変異を、進化及び選択のラウンド（例えば、ＴａｄＡ＊７．１０＝進化の第７ラウンドからのバリアント１０）を通して特定した。
一部の実施形態では、ＴａｄＡは、単量体又は二量体（例えば、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＴａｄＡ及び操作されたＴａｄＡバリアントのヘテロ二量体）として提供される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の表８に示される第８世代ＴａｄＡ＊８バリアントである。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の参照配列に示されているＴａｄＡバリアントの以下：２１、２３、２５、３８、５１、５４、７０、７１、７２、７２、９４、１２４、１３３、１３８、１３９、１４６、及び１５８から選択されるアミノ酸位置での改変を含有する第９世代ＴａｄＡ＊９バリアントである。

(配列番号65)
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、上記のＴａｄＡ参照配列の以下：２１、２３、２５、３８、５１、５４、７０、７１、７２、９４、１２４、１３３、１３８、１３９、１４６、及び１５８から選択される２つ以上のアミノ酸位置での改変を含有する。別の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下から選択される１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）の改変を含有する：配列番号１のＲ２１Ｎ、Ｒ２３Ｈ、Ｅ２５Ｆ、Ｎ３８Ｇ、Ｌ５１Ｗ、Ｐ５４Ｃ、Ｍ７０Ｖ、Ｑ７１Ｍ、Ｎ７２Ｋ、Ｙ７３Ｓ、Ｍ９４Ｖ、Ｐ１２４Ｗ、Ｔ１３３Ｋ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１３９Ｍ、Ｃ１４６Ｒ、及びＡ１５８Ｋ。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下の改変のうちの１つ以上を更に含有する：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、及びＱ１５４Ｒ。更に他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下から選択される上記ＴａｄＡ参照配列に対する改変の組み合わせを含有する：
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ，Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｐ１２４Ｗ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｌ５１Ｗ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｃ１４６Ｒ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｐ５４Ｃ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｙ７３Ｓ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ３８Ｇ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２３Ｈ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２１Ｎ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；
Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｌ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｅ２５Ｆ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３９Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｍ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３８Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｙ７２Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｅ２５Ｆ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｔ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ３８Ｇ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２３Ｈ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｐ５４Ｃ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｒ２１Ｎ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｄ１３８Ｍ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｙ７２Ｓ＋Ｉ７６Ｙ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；及び
Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｑ７１Ｍ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；
Ｍ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｎ７２Ｋ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｑ７１Ｍ＿Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｍ７０Ｖ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｍ９４Ｖ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ；
Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ａ１５８Ｋ；及び
Ｍ７０Ｖ＋Ｑ７１Ｍ＋Ｎ７２Ｋ＋Ｖ８２Ｓ＋Ｙ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ。
一部の実施形態では、デアミナーゼ又は他のポリペプチド配列は、例えば、融合タンパク質の成分として含まれる場合、メチオニンを欠く。これにより、位置の番号付けが変化する場合がある。しかしながら、当業者は、かかる対応する変異が、同じ変異（例えば、Ｙ７３Ｓ及びＹ７２Ｓ、並びにＤ１３９Ｍ及びＤ１３８Ｍ）を指すことを理解するであろう。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２は、ＳＶ４０大Ｔ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン、ｃ－ｍｙｃ、ｈＲＮＰＡ１Ｍ９、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメイン、筋腫Ｔタンパク質のＮＬＳ、ヒトｐ５３、ｃ－ａｂｌＩＶ、インフルエンザウイルスＮＳ１、肝炎ウイルスデルタ抗原、マウスＭｘ１、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドを含む、核局在化配列に融合している。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、ＳＮＡＰタグ、チオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含むが、これらに限定されないエピトープタグに融合している。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２は、これらに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及び青色蛍光タンパク質、増強バージョン又はスーパーフォールダーＧＦＰを含む緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、並びにレポーター遺伝子の他の修飾バージョンを含む、レポーター遺伝子に融合している。
一部の実施形態では、操作されたＣａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質の血清中半減期は、カルボキシ末端ペプチド（絨毛性ゴナドトロピンβ鎖のＣＴＰ）などの、ヒト血清アルブミンタンパク質、トランスフェリンタンパク質、ヒトＩｇＧ及び／又はシアリル化ペチドなどの、異種タンパク質との融合によって増加する。
一部の実施形態では、操作されたＣａｓ９又はＣａｓ１２タンパク質の血清中半減期は、ジェミニン、ユビキチン、ＦＫＢＰ１２－Ｌ１０６Ｐ、及び／又はジヒドロ葉酸レダクターゼを含むが、これらに限定されない、不安定化ドメインとの融合によって減少する。
増加又は減少した安定性をもたらす好適な融合パートナーとしては、これらに限定されないが、デグロン配列が挙げられる。デグロンは、当業者によって、それらがその一部であるタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であると容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、デグロン配列によって少なくとも部分的に制御される。場合によっては、好適なデグロンは、デグロンが、実験対照とは無関係に、タンパク質の安定性に対してその影響を及ぼすように構成的である（すなわち、デグロンは、薬物誘導性、温度誘導性などではない）。場合によっては、デグロンは、バリアントＣａｓ９ポリペプチドを、所望の条件に応じて「オン」（すなわち、安定）又は「オフ」（すなわち、不安定、分解）にすることができるように、制御可能な安定性を有するバリアントＣａｓ９ポリペプチドを提供する。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃など）を下回る機能的（すなわち、「オン」、安定）であり得るが、閾値温度を上回る非機能的（すなわち、「オフ」、分解）であり得る。別の例として、デグロンが薬物誘導性デグロンである場合、薬物の存在又は不在は、タンパク質を「オフ（すなわち、不安定）状態」から「オン」（すなわち、安定）状態に、又はその逆に切り替えることができる。例示的な薬物誘導性デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性は、デグロンに結合する小分子の存在又は不在によって制御される。
好適なデグロンの例としては、これらに限定されないが、Ｓｈｉｅｌｄ－１、ＤＨＦＲ、オーキシン、及び／又は温度によって制御されるそれらのデグロンが挙げられる。好適なデグロンの非限定的な例は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｄｏｈｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４．２６３（５１５１）：ｐ．１２７３－１２７６：Ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ、Ｓｃｈｏｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｊａｎ；２９６（ｌ）：Ｆ２０４－ｌ ｌ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｆａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ＴＲＰＶ５ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｈｉｅｌｄ－１、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００８ Ｎｏｖ １５；１８（２２）：５９４１－４：Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｗｉｔｈ ＦＫＢＰ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ、Ｋａｎｅｍａｋｉ，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．２０１２ Ｄｅｃ ２８：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｇｒｏｎｓ、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ｎｏｖ ３０；４８（４）：４８７－８：Ｔｉｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ ｄｅｇｒｏｎ、Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３ Ｊａｎ １８；３３（１）．：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｄｅｇｒｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、及びＧｒｅｕｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１２ Ｎｏｖ １０；（６９）：Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｄｅｇｒｏｎ（ｄｇｎ）－ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）－ｂａｓｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎであり、これらの全ては、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
例示的なデグロン配列は、細胞及び動物の両方において十分に特徴分析され、試験されている。したがって、不活性型Ｃａｓ９又はＣａｓ１２をデグロン配列に融合することにより、「調節可能な」及び「誘導可能な」不活性型Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ポリペプチドが産生される。
本明細書に記載される融合パートナーのいずれかは、任意の所望の組み合わせで使用することができる。この点を例解するための１つの非限定的な例として、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、及び標的ＤＮＡの転写を増加させるための転写アクチベーター配列を含むことができる。更に、ｄＣａｓ９融合タンパク質において使用することができる融合パートナーの数は、無制限である。場合によっては、Ｃａｓ９融合タンパク質は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上）の異種配列を含む。
組換え遺伝子技術
本開示によれば、当該技術分野内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法が用いられ得る。かかる技法は、文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい）。
本明細書に記載される操作されたＣａｓ９又はＣａｓ１２酵素などの、ポリペプチドをコードする核酸などの、遺伝子の組換え発現は、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターの構築を含むことができる。ポリヌクレオチドが得られると、ポリペプチドの産生のためのベクターは、当該技術分野で既知の技法を使用した組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。既知の方法を使用して、ポリペプチドコード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロで組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。
発現ベクターは、従来の技法によって宿主細胞に導入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞は、従来の技法によって培養して、ポリペプチドを産生することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又はＣａｓ９若しくはＣａｓ１２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの、転写制御エレメントに作動可能に結合している。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、又は原核細胞（例えば、細菌又は古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的であり得る。一部の実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又はＣａｓ９若しくはＣａｓ１２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方においてコードされるヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に結合している。
プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得るが、誘導性プロモーター（すなわち、その状態、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であり得、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得、時間的に制限されたプロモーターであり得る（すなわち、プロモーターは、胚発生の特定の段階中、又は生物学的プロセスの特定の段階、例えば、マウスにおける毛包サイクル中に「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にある）。
好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがって、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物若しくは真核生物を含む、任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動するために使用することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０，４９７－５００（２００２））、増強されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３Ｓｅｐ１；３１（１７））、及び／又はヒトＨＩプロモーター（ＨＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、Ｔｅｔ－ＯＮ、Ｔｅｔ－ＯＦＦなど）、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）、エストロゲン受容体、及び／又はエストロゲン受容体融合物を含むがこれらに限定されない分子によって調節され得る。
一部の実施形態では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、多細胞生物において、プロモーターは、特定の細胞のサブセットにおいて活性（すなわち、「ＯＮ」）である。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などとも称され得る。任意の便利な空間的に制限されたプロモーターが使用され得、好適なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットにおける発現を駆動するプロモーター、生殖細胞系における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の膵島細胞における発現を駆動するプロモーターなど）の選択は、生物に依存するであろう。よって、空間的に制限されたプロモーターは、生物に応じて、多種多様な異なる組織及び細胞型における対象部位特異的ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節するために使用することができる。いくつかの空間的に制限されたプロモーターはまた、プロモーターが胚発生の特定の段階中又は生物学的プロセスの特定の段階（例えば、毛包サイクル）中に「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にあるように、時間的に制限される。
核酸塩基エディター
一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、標的ポリヌクレオチド配列において、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、又は０．０１％未満のインデル形成をもたらす。
本開示の一部の態様は、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかが、意図されない点変異などの、相当数の意図されない変異を生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）において、意図された変異、例えば、点変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、少なくとも０．０１％の意図された変異（すなわち、少なくとも０．０１％の塩基編集効率）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターのいずれかは、意図された変異の少なくとも０．０１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％を生成することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、１：１を超えるインデルに対する意図される点変異の比を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも８．５：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、少なくとも１３：１、少なくとも１４：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、又は少なくとも１０００：１以上である、意図される点変異対インデルの比を生成することができる。
意図された変異及びインデルの数は、例えば、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１号（ＷＯ２０１８／０２７０７８）及び第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４号（ＷＯ２０１７／０７０６３２）、Ｋｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（２０１６）、Ｇａｕｄｅｌｌｉ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ” Ｎａｔｕｒｅ ５５１，４６４－４７１（２０１７）、並びにＫｏｍｏｒ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ” Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３：ｅａａｏ４７７４（２０１７）に記載されている任意の好適な方法を使用して判定することができる（それらの内容全体が、参照により本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、インデル頻度を計算するために、シーケンシングリード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ）は、インデルが生じ得るウィンドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列と正確に一致するようにスキャンされる。正確な一致が見つからない場合、リードは、分析から除外される。このインデルウィンドウの長さが参照配列と完全に一致する場合、リードは、インデルを含有しないものとして分類される。インデルウィンドウが参照配列よりも２塩基以上長い又は短い場合、シーケンシングリードは、それぞれ、挿入又は欠失として分類される。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、核酸の領域におけるインデルの形成を制限し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドにあるか、又は塩基エディターによって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ヌクレオチド以内の領域にある。
標的ヌクレオチド領域で形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される時間の量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数又は割合は、標的ヌクレオチド配列（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露して少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、又は少なくとも１４日後に判定される。本明細書に記載される塩基エディターの特徴は、融合タンパク質、又は本明細書に提供される融合タンパク質を使用する方法のいずれかに適用することができることを理解されたい。
治療用途
本明細書に記載の方法及び組成物は、様々な治療用途（例えば、肝疾患の治療における）を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ方法又はシステムは、（例えば、１つ以上の核酸残基を挿入、欠失、又は変異させることによって）標的核酸を修飾するように標的核酸を編集するために使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、所望の核酸配列を含む、外因性ドナーテンプレート核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）を含む。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで誘導される開裂事象の解消後、細胞の分子機構は、開裂事象の修復及び／又は解消において外因性ドナーテンプレート核酸を利用するであろう。代替的に、細胞の分子機構は、開裂事象の修復及び／又は解消において内因性テンプレートを利用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、標的核酸を改変して、挿入、欠失、及び／又は点変異をもたらすために使用され得る。一部の実施形態では、挿入は、瘢痕のない挿入である（すなわち、開裂事象の解決時に追加の意図されない核酸配列をもたらさない標的核酸への意図された核酸配列の挿入）。ドナーテンプレート核酸は、二本鎖又は一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ方法又はシステムは、核酸塩基エディターを含む。
ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列中に挿入することが望ましい用途においては、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に提供される。「ドナー配列」又は「ドナーポリヌクレオチド」とは、部位指向性修飾ポリペプチドによって誘導される開裂部位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、開裂部位でのゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、開裂部位に隣接する、例えば、開裂部位の約５０塩基以下以内、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内、又は開裂部位に直接隣接するヌクレオチド配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の相同性を含有し、それと相同性を有するゲノム配列との間の相同性指向性修復を支持する。およそ２５、５０、１００、若しくは２００ヌクレオチド、又は２００ヌクレオチド超の、ドナーとゲノム配列との間の配列相同性（又は１０～２００ヌクレオチド以上の任意の整数値）は、相同性指向性修復を支持するであろう。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上などであり得る。
ドナー配列は、典型的には、置換するゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性指向性修復を支持するのに十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して、少なくとも１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、又は転位を含有し得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向性修復が標的領域に非相同配列の挿入をもたらすように、２つの相同領域と隣接する非相同配列を含む。ドナー配列はまた、目的のＤＮＡ領域に相同ではなく、目的のＤＮＡ領域への挿入を意図していない配列を含有するベクター骨格を含み得る。概して、ドナー配列の相同領域は、組換えが所望されるゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％～１００％の任意の値の配列同一性が存在し得る。
ドナー配列は、ゲノム配列と比較して特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、開裂部位でのドナー配列の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的化されたゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る。場合によっては、コード領域に位置する場合、かかるヌクレオチド配列の差異は、アミノ酸配列を変化させないか、又はサイレントアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造又は機能に影響を与えない変化）を行うであろう。代替的に、これらの配列の差異には、マーカー配列の除去のために後で活性化され得るＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。細胞内に直鎖状形態又は環状形態で導入され得る。直鎖状形態で導入された場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレオチド分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３´末端に付加され、かつ／又は自己相補性オリゴヌクレオチドが一方又は両方の末端にライゲーションされる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、並びに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、並びにＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるが、これらに限定されない。直鎖状ドナー配列の末端を保護する代替として、配列の追加の長さは、組換えに影響を与えることなく分解され得る相同性の領域の外側に含まれ得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について上に記載されるように、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
上に記載の方法に従って、エクスビボで目的のＤＮＡ領域を開裂及び修飾、すなわち、「遺伝子修飾」し得る。一部の実施形態では、選択可能なマーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されている場合と同様に、細胞の集団は、遺伝子修飾細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子修飾を含むものに対して濃縮され得る。濃縮する前に、「遺伝子修飾」細胞は、細胞集団の約１％以上（例えば、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、又は２０％以上）しか構成しない可能性がある。「遺伝子修飾」細胞の分離は、使用される選択可能なマーカーに適切な任意の好都合な分離技術によって達成され得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞選別によって分離され得、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、親和性分離技術、例えば、磁気分離、親和性クロマトグラフィー、固体マトリックスに親和性試薬が結合した「パニング」、又は他の好都合な技術によって、不均一集団から分離され得る。正確な分離を提供する技術としては、蛍光活性化細胞選別機が挙げられ、これは、複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な程度の洗練を有することができる。細胞は、死細胞と関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。遺伝子修飾された細胞の生存率に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。修飾されたＤＮＡを含む細胞に対して高度に濃縮された細胞組成物は、この様式で達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子修飾細胞が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、約９５％以上、又は９８％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子修飾細胞の実質的に純粋な組成物であり得る。
本明細書に記載の方法によって産生される遺伝子修飾細胞（例えば、遺伝子修飾ヒト肝細胞）は、直ちに使用され得る。代替的に、細胞を、液体窒素温度で凍結し、長時間保管し、解凍して再利用可能であり得る。かかる場合、細胞は、通常、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％の血清、４０％の緩衝培地、又はかかる凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般的に使用されるいくつかの他のかかる溶液中で凍結され、凍結された培養細胞を解凍するために当該技術分野で一般的に既知の様式で解凍される。
遺伝子修飾細胞は、様々な培養条件下で、インビトロで培養され得る。細胞は、培養で増殖し得る、すなわち、細胞の増殖を促進する条件下で増殖し得る。培養培地は、液体又は半固体（例えば、寒天、メチルセルロースなどを含有する）であり得る。細胞集団は、通常、ウシ胎児血清（約５％～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール（特に、２－メルカプトエタノール）、及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）が補充された、イスコフ改変ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０などの適切な栄養培地に懸濁され得る。培養物は、制御性Ｔ細胞が応答性である成長因子を含有し得る。本明細書で定義される成長因子は、膜貫通受容体に対する特定の効果を介して、培養物中又は無傷の組織中のいずれかで、細胞の生存、増殖及び／又は分化を促進することができる分子である。成長因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。
このように遺伝子修飾された細胞は、例えば、疾患を治療するために、若しくは抗ウイルス薬、抗病原薬、又は抗がん治療薬として、遺伝子治療などの目的のために、農業における遺伝子修飾生物の産生のために、又は生物学的研究のために、対象に移植され得る。対象は、新生児、若年者、又は成人であり得る。特に目的であるのは、哺乳動物の対象である。本方法で治療され得る哺乳動物種としては、イヌ及びネコ、ウマ、ウシ、ヒツジなど、並びに霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラゴモルファ（例えば、ウサギ）など）が実験調査のために使用され得る。
細胞は、対象に単独で、又は、例えば、細胞が移植される組織内の細胞の増殖及び／又は組織化を支持するための好適な基質若しくはマトリックスとともに、提供され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、以下の経路、非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、又は脊髄液中のうちのいずれかを介して対象に導入され得る。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。
対象への治療の投与回数は変化し得る。遺伝子修飾細胞を対象内に導入することは、１回の事象であり得るが、特定の状況においては、かかる治療は、限られた期間にわたって改善を誘発し、一連の継続的な反復治療を必要とする場合がある。他の状況においては、効果が観察される前に、遺伝子修飾細胞の複数回投与が必要とされる場合がある。正確なプロトコルは、疾患又は状態、疾患のステージ、及び治療される個々の対象のパラメータに依存する。
薬学的調製物は、薬学的に許容されるビヒクルに本明細書に記載の塩基エディター又は塩基エディターシステムのうちの１つ以上を含む組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」とは、連邦又は州政府の規制機関によって承認された、又は米国においてリスト化されたビヒクルであり得る。
薬局方又はヒトなどの哺乳動物において使用するための他の一般に認められた薬局方。「ビヒクル」という用語は、哺乳動物に投与するために本発明の化合物が製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は担体を指す。かかる薬学的ビヒクルは、脂質、例えば、リポソーム、例えば、リポソームデンドリマー；水、並びに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源、又は合成起源のものを含む油、生理食塩水などの液体；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤が使用され得る。薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化され得る。したがって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／又は部位指向性修飾ポリペプチド及び／又はドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内などの投与を含む様々な方式で達成され得る。活性剤は、投与後に全身性であり得るか、又は、局所投与の使用、壁内投与、若しくは移植部位に活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局所的であり得る。活性剤は、即時活性のために製剤化され得るか、又は持続放出のために製剤化され得る。
特定の患者に与えられる有効量は、様々な要因に依存し、そのうちのいくつかは患者ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じて疾患状態の進行を停止又は逆転させるために、患者に投与する治療剤の有効量を判定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、及び薬剤についての利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を判定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療用組成物が投与される流体のより大きい体積を考えると、髄腔内投与される用量よりも多い場合がある。同様に、治療濃度を維持するために、身体から急速に除去される組成物は、より高い用量で、又は反復用量で投与され得る。通常の技術を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができるであろう。
薬学的組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒト投与のための薬学的組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される希釈剤の薬学的に許容される非毒性の担体を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。加えて、薬学的組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤並びに洗剤などの、生理学的条件に近似する追加の物質を含み得る。
組成物はまた、例えば抗酸化物質などの様々な安定化剤のうちのいずれも含み得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を増強するか、又はそれ以外の場合、その薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させ、その毒性を低減し、溶解性又は取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体化され得る。かかる修飾又は複合体化剤の例としては、サルフェート、グルコネート、シトレート及びホスフェートが挙げられる。組成物の核酸又はポリペプチドはまた、それらのインビボ属性を増強する分子と複合体化され得る。かかる分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が含まれる。
薬学的組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。活性成分の毒性及び治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を判定することを含む、細胞培養物及び／又は実験動物における標準的な薬学的手順に従って判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指標を示す療法が好ましい。
細胞培養及び／又は動物研究から得られたデータを、ヒトについての投薬量の範囲の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、低毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内のラインである。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。
薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは、高純度のものであり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、概して少なくとも分析グレード、及びより典型的には少なくとも医薬グレード）。更に、インビボでの使用を意図した組成物は、通常、無菌である。所与の化合物を使用する前に合成しなければならない範囲で、得られる産物は、典型的には、合成又は精製プロセス中に存在し得る任意の潜在的な毒性剤、特に任意のエンドトキシンを実質的に含まない。親投与のための組成物はまた、無菌であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
送達システム
本明細書に記載される塩基エディター若しくは塩基エディターシステム、又はその成分、その核酸分子、及び／又はその成分をコード若しくは提供する核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はＲＮＡガイドは、例えば、ベクター（プラスド及び送達ベクターなど）の様々な送達システムによって送達することができる。例示的な実施形態は、以下に記載される。塩基エディター又は塩基エディターシステム（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２を含み、任意選択的に、本明細書に記載の核酸塩基エディターを含む）は、ウイルスベクターに含有される核酸でコードすることができる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられ得る。ウイルスベクターは、用途に基づいて選択することができる。例えば、ＡＡＶは、それらの軽度の免疫原性のために、インビボでの遺伝子送達に一般的に使用される。アデノウイルスは、それらが強い免疫原性応答を誘導するため、ワクチンとして一般的に使用される。ウイルスベクターのパッケージング容量は、ベクターにパッケージングされ得る塩基エディターのサイズを制限し得る。例えば、ＡＡＶのパッケージング容量は、２つの１４５塩基逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．５ｋｂである。
ＡＡＶは、パルボウイルス科に属する小型の一本鎖ＤＮＡ依存性ウイルスである。４．７ｋｂの野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムは、それぞれ４つの複製タンパク質と３つのカプシドタンパク質とをコードする２つの遺伝子で構成され、両側に１４５ｂｐの逆位末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。ビリオンは、３つのカプシドタンパク質であるＶｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３から構成され、同じオープンリーディングフレームから１：１：１０の比率で生成されるが、差次的スプライシング（Ｖｐ１）及び選択的翻訳開始部位（それぞれ、Ｖｐ２及びＶｐ３）から産生される。Ｖｐ３は、ビリオン内で最も豊富なサブユニットであり、ウイルスのトロピズムを定義する細胞表面での受容体認識に関与する。ウイルス感染性において機能するホスホリパーゼドメインは、Ｖｐ１の固有のＮ末端に特定されている。
ｗｔＡＡＶと同様に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、隣接ベクター導入遺伝子カセットに対する１４５ｂｐのシス作用性ＩＴＲを利用し、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染後、ｒＡＡＶは、本発明の融合タンパク質を発現することができ、環状ヘッド・トゥ・テール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）コンカテマーでエピソーム的に存在することによって、宿主ゲノムに組み込まれることなく持続する。このシステムをインビトロ及びインビボで使用したｒＡＡＶの成功例は多数あるが、遺伝子のコード配列の長さがｗｔＡＡＶゲノムと同等又はそれ以上である場合、パッケージング容量の制限により、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達の使用が制限される。
ＡＡＶベクターの小さいパッケージング容量は、このサイズを超えるいくつかの遺伝子の送達及び／又は大きい生理学的調節エレメントの使用を困難にする。これらの課題は、例えば、送達されるタンパク質を２つ以上の断片に分割することによって対処することができ、Ｎ末端断片は、スプリットインテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、スプリットインテイン－Ｃに融合される。次いで、これらの断片は、２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングされる。本明細書で使用される場合、「インテイン」とは、隣接するＮ末端及びＣ末端エクステイン（例えば、結合する断片）をライゲートする自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）を指す。異種タンパク質断片を連結するための特定のインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）に記載されている。インテインのＩｎｔＮ及びＩｎｔＣは、例えば、タンパク質断片を分離するために融合された場合、互いを認識し、それらがスプライシングで除かれ、同時に、それらが融合されたタンパク質断片の隣接するＮ末端エクステイン及びＣ末端エクステインがライゲーションされ、それによって、２つのタンパク質断片から全長タンパク質が再構成される。他の好適なインテインは、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムは、長さが変動することができる。一部の実施形態では、タンパク質断片は、２アミノ酸長～約１０００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約５アミノ酸長～約５００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約２０アミノ酸長～約２００アミノ酸長の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、約１０アミノ酸長～約１００アミノ酸長の範囲である。他の長さの好適なタンパク質断片は、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２）の一部分又は断片がインテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質の一部分又は断片は、インテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼ、及びカプシドタンパク質は、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合され得る。一部の実施形態では、インテインのＮ末端は、融合タンパク質のＣ末端に融合され、インテインのＣ末端は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端に融合される。
一実施形態では、デュアルＡＡＶベクターは、大きい導入遺伝子発現カセットを２つの別々の半分（５’末端及び３’末端、又は頭部及び尾部）に分割することによって生成され、カセットの各半分は、単一のＡＡＶベクター（５ｋｂ未満）にパッケージングされる。次いで、全長の導入遺伝子発現カセットの再構築は、両方のデュアルＡＡＶベクター、続いて、（１）５’ゲノムと３’ゲノムとの間の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）、（２）５’ゲノムと３’ゲノムとのＩＴＲ媒介性テール・トゥ・ヘッド（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｈｅａｄ）コンカテマー化（デュアルＡＡＶトランススプライシングベクター）、又は（３）これらの２つの機構の組み合わせ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）によって同じ細胞を同時感染させると達成される。インビボでのデュアルＡＡＶベクターの使用は、全長タンパク質の発現をもたらす。デュアルＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが４．７ｋｂ超の導入遺伝子のための効率的かつ実行可能な遺伝子導入戦略を表す。
本明細書に記載の塩基エディターを設計するための開示された戦略は、ウイルスベクターにパッケージングすることができる塩基エディターを生成するために有用であり得る。塩基エディターの送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、培養物中又は宿主内の特定の細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核又は宿主細胞ゲノムに輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、培養物中の細胞、患者に（インビボで）直接投与することができ、又は、インビトロで細胞を処理するためにそれらを使用することができ、修飾細胞は、任意選択的に（エクスビボで）患者に投与され得る。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含み得る。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。更に、多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。
外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスのトロピズムを変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入又は感染させることができ、典型的には、高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存することになる。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用型の長鎖末端反復から構成される。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、次いで、療法的遺伝子を標的細胞に統合して永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びこれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターは、標的細胞への効率的な組み込みのために、所与の長さよりも小さいポリヌクレオチド配列を必要とし得る。例えば、９ｋｂを超える長さのレトロウイルスベクターは、より小さいサイズのものと比較して、低いウイルス力価をもたらし得る。一部の態様では、本開示のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に開示されるＣａｓ９を含む）は、効率的なパッケージング及びレトロウイルスベクターを介した標的細胞への送達を可能にするように十分なサイズである。場合によっては、Ｃａｓ９は、ガイド核酸及び／又は標的化可能なヌクレアーゼシステムの他の成分と一緒に発現されるときでも、効率的なパッキング及び送達を可能にするようなサイズである。
一過的な発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を有することが可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順のために、標的核酸を用いて細胞を形質導入するために使用することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物に記載されており、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が挙げられる。
したがって、塩基エディター又は塩基エディターシステム（例えば、本明細書に開示されるＣａｓ９又はＣａｓ１２を含む）は、ウイルスベクターで送達され得る。塩基エディターシステムの１つ以上の成分は、１つ以上のウイルスベクター上にコードすることができる。例えば、塩基エディター及びガイド核酸は、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の場合では、塩基エディター及びガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。いずれの場合も、塩基エディター及びガイド核酸は、各々、プロモーター及びターミネーターに作動可能に結合され得る。
ウイルスベクター上にコードされる成分の組み合わせは、選択されたウイルスベクターのカーゴサイズ制約によって判定することができる。
塩基エディターの非ウイルス送達
塩基エディター及び塩基エディターシステムのための非ウイルス送達アプローチも利用可能である。非ウイルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーは、ナノ粒子であり、有機又は無機であり得る。ナノ粒子は、当該技術分野で周知である。任意の好適なナノ粒子設計を使用して、ゲノム編集システムの成分、又はかかる成分をコードする核酸を送達することができる。例えば、有機（例えば、脂質及び／又はポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形態では、送達ビヒクルとして使用するのに好適であり得る。ナノ粒子製剤、及び／又は遺伝子導入における使用のための例示的な脂質を表９（以下）に示す。
表１０は、遺伝子導入及び／又はナノ粒子製剤における使用のための例示的なポリマーを列挙する。
表１１は、本明細書に記載されるＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドのための送達方法を要約する。
別の態様では、ゲノム編集システム成分又はかかる成分をコードする核酸、例えば、任意選択的に生物学的活性を有するポリペプチド（例えば、核酸塩基エディター）に融合した、例えば、Ｃａｓ９若しくはそのバリアント又はＣａｓ１２若しくはそのバリアントなどの核酸結合タンパク質、及び目的のゲノム核酸配列を標的化するｇＲＮＡの送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成され得る。ＲＮＰは、標的ｇＲＮＡとの複合体中に、核酸結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ＲＮＰは、例えば、Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３３（１）：７３－８０によって報告されているように、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、又はカチオン性脂質媒介性の方法などの既知の方法を使用して細胞に送達され得る。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターシステムでの使用に有利であり、特に、トランスフェクトが困難な細胞（例えば、初代細胞）に有利である。加えて、ＲＮＰはまた、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミドにおいて使用され得る真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶ又はＥＦ１Ａ）が十分に発現していない場合、細胞内のタンパク質発現で生じ得る困難を緩和することができる。有利には、ＲＮＰの使用は、細胞内への外来ＤＮＡの送達を必要としない。更に、核酸結合タンパク質とｇＲＮＡ複合体とを含むＲＮＰは、時間とともに分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性がある。プラスミドベースの技術の場合と同様の様式で、ＲＮＰを使用して、結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント又はＣａｓ１２バリアント）を送達し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導することができる。
塩基エディター又は塩基エディターシステム（例えば、本明細書に記載のＣａｓ９又はＣａｓ１２を含む）を駆動するために使用されるプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含むことができる。これは、ベクター内の空間を占有し得る追加のプロモーターエレメントの必要性を排除するために有利であり得る。解放された追加の空間を使用して、追加のエレメント（例えば、ガイド核酸又は選択可能なマーカー）の発現を駆動することができる。ＩＴＲ活性は比較的弱いため、選択されたヌクレアーゼの過剰発現による潜在的な毒性を低減するために使用することができる。
任意の好適なプロモーターを使用して、Ｃａｓ９及び該当する場合、ガイド核酸の発現を駆動し得る。遍在的な発現の場合、使用され得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖などが挙げられる。脳又は他のＣＮＳ細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、全てのニューロンに対してシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対してＣａＭＫＩＩアルファ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対してＧＡＤ６７若しくはＧＡＤ６５又はＶＧＡＴなどが挙げられ得る。肝細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞での発現の場合、好適なプロモーターとしては、ＳＰ－Ｂが挙げられ得る。内皮細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＣＡＭが挙げられ得る。造血細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＩＦＮベータ又はＣＤ４５が挙げられ得る。骨芽細胞の場合、好適なプロモーターとしては、ＯＧ－２が挙げられ得る。
場合によっては、本開示のＣａｓ９は、別個のプロモーターが、同じ核酸分子内の塩基エディター及び適合性ガイド核酸の発現を駆動することを可能にするのに十分に小さいサイズのものである。例えば、ベクター又はウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に作動可能に結合された第１のプロモーターと、ガイド核酸に作動可能に結合された第２のプロモーターとを含むことができる。
ガイド核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーターとしては、Ｕ６若しくはＨ１などのＰｏｌＩＩＩプロモーター又はＰｏｌＩＩプロモーター及びｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を発現するイントロンカセットの使用が挙げられる。
１つ以上のガイド核酸を含む又は含まない本明細書に記載されるＣａｓ９又はＣａｓ１２は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを使用して、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスのための製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号（ＡＡＶのための製剤、用量）、及び米国特許第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）からの、並びにレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスを伴う臨床試験に関する臨床試験及び刊行物からの、製剤及び用量を使用して送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号及びＡＡＶを伴う臨床試験と同様であり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号及びアデノウイルスを伴う臨床試験と同様であり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号及びプラスミドを伴う臨床試験と同様であり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）に基づくか、又は推定され得、患者、対象、異なる体重及び種の哺乳動物に対して調整され得る。投与頻度は、年齢、性別、全般的な健康状態、患者若しくは対象の他の状態、及び対処される特定の状態若しくは症状を含む通常の要因に応じて、医師又は獣医（例えば、医師、獣医）の範疇である。ウイルスベクターは、目的の組織に注入され得る。細胞型特異的塩基エディターの場合、塩基エディター及び任意選択的なガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。
インビボでの送達の場合、ＡＡＶは、他のウイルスベクターよりも有利であり得る。場合によっては、ＡＡＶは低毒性を可能にし、これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る。場合によっては、ＡＡＶは、宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入変異誘発を引き起こす低い確率を可能にする。
ＡＡＶは、４．５又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂを超える構築物は、ウイルス産生の著しい低減をもたらし得る。例えば、ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶへのパッケージングが困難になる。したがって、本開示の実施形態は、従来のＣａｓ９よりも長さが短い開示されるＣａｓ９の利用を含む。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。標的化される細胞に関してＡＡＶのタイプを選択することができ、例えば、脳又は神経細胞を標的化するためのＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ、心組織を標的化する場合、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の表は、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）に見出すことができる。
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、分裂細胞と分裂終了細胞の両方において感染し、それらの遺伝子を発現する能力を有する。最も一般的に既知のレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して、広範囲の細胞型を標的化する。
レンチウイルスは、以下のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス転写プラスミド骨格を含有する）をクローニングした後、トランスフェクションの前日に、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で、Ｔ－７５フラスコ内で５０％コンフルエンスに播種した。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を、１０μｇのレンチウイルス導入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、培地を、１０％胎仔ウシ血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換する。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法が好ましい。
レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に回収する。上清は、最初にデブリを除去し、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次いで、超遠心分離機で、２４，０００ｒｐｍで２時間スピンする。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中に、４℃で一晩再懸濁する。次いで、それらをアリコートし、－８０℃ですぐに凍結する。
別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づく最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）は、ウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであり、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現し、これは、網膜下注射によって送達されることが企図される。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が企図される。
システムの任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達され得る。Ｃａｓ９又はＣａｓ１２コードｍＲＮＡは、インビトロ転写を使用して生成することができる。例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２のｍＲＮＡは、以下のエレメントを含有するＰＣＲカセットを使用して合成することができる：Ｔ７プロモーター、任意選択的なｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、及び３’ＵＴＲ（例えば、ベータグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲ）。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、Ｔ７プロモーター、続いて、配列「ＧＧ」、及びガイドポリヌクレオチド配列を含有するカセットからのインビトロ転写を使用して転写することもできる。
発現を増強し、可能性のある毒性を低減するために、Ｃａｓ９配列及び／又はガイド核酸は、例えば、シュードＵ又は５－メチルＣを使用して、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含むように修飾され得る。
本開示は、一部の実施形態では、細胞又は生物を修飾する方法を包含する。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の多くは、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類、又はマウス細胞である。本開示の塩基エディター、組成物、及び方法によって細胞に導入される修飾は、抗体、デンプン、アルコール、又は他の所望の細胞出力などの生物学的産物の産生の改善のために細胞及び細胞の子孫が変化されるようにすることができる。本開示の方法により細胞に導入される修飾は、細胞及び細胞の子孫が、産生された生物学的産物を変化させる変化を含むようにすることができる。
システムは、１つ以上の異なるベクターを含むことができる。一態様では、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２は、所望の細胞型、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のために、コドン最適化される。一部の実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞である。
概して、「コドン最適化」とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１又は約１より大きい、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、又はそれ以上のコドン）において、天然アミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、目的の宿主細胞における発現を増強させるための核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、これは次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用率表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に参照）で入手可能な「コドン使用率データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列を最適化するためのコドンに関するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれ以上のコドン、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞又はＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を産生することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージング及び組み込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングすることができる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染され得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進することができる。場合によっては、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために、かなりの量でパッケージ化されない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。
薬学的組成物
本開示の他の態様は、（例えば、本明細書に開示されるＣａｓ９又はＣａｓ１２を含む）塩基エディター又は塩基エディターシステムを含む薬学的組成物に関する。「薬学的組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的使用のために製剤化された組成物を指す。一部の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、追加の薬剤（例えば、特異的送達用、半減期の増加、又は他の治療用化合物）を含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、化合物を体のある部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織、又は体の一部分）に運搬若しくは輸送することに関与する、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸亜鉛、又は立体酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、又は溶媒封入材などの、薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを意味する。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」ものであり、対象の組織に害を及ぼさない（例えば、生理学的に適合性、無菌性、生理学的ｐＨなど）。
薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：（１）糖類（例えば、乳糖、グルコース及びスクロース）、（２）デンプン（例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン）、（３）セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、及び酢酸セルロース）、（４）粉末トラガント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク）、（８）賦形剤（例えば、ココアバター及び坐剤ワックス）、（９）油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油）、（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）、（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル）、（１３）寒天、（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ酸無水物、（２２）膨張剤（例えば、ポリペプチド及びアミノ酸）、（２３）血清アルコール（例えば、エタノール）、並びに（２３）薬学的製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、及び抗酸化剤も、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。
薬学的組成物は、製剤のｐＨを、生理学的ｐＨを反映する所定のレベルで、例えば、約５．０～約８．０の範囲に維持するために、１つ以上のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸、又はアミノ酸の混合物（例えば、ヒスチジン、又はヒスチジン及びグリシンなどのアミノ酸の混合物）であり得る。代替的に、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを所定のレベルに（例えば、約５．０～約８．０の範囲に）維持し、かつカルシウムイオンをキレートしない薬剤である。かかるｐＨ緩衝化合物の例解的な例としては、イミダゾール及び酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルに維持するのに好適な任意の量で存在し得る。
薬学的組成物はまた、１つ以上の浸透圧調節剤、すなわち、製剤の浸透圧特性（例えば、張力、オスモラリティ、及び／又は浸透圧）を、レシピエント個体の血流及び血液細胞で許容されるレベルに調節する化合物を含有し得る。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節する、当業者に既知又は利用可能な任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の製剤で使用される所与の浸透圧調節剤の適合性を経験的に判定し得る。好適なタイプの浸透圧調節剤の例解的な例としては、塩（例えば、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウム）、糖（例えば、スクロース、デキストロース、及びマンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、並びにこれらの薬剤及び／又は薬剤のタイプのうちの１つ以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤は、製剤の浸透圧特性を調節するのに十分な任意の濃度で存在し得る。
一部の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、遺伝子編集のために、対象への送達のために製剤化される。本明細書に記載の薬学的組成物を投与する好適な経路としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、鼓室内、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、及び脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、疾患部位に局所的に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、又はインプラントによって、対象に投与され、インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜又は繊維などの膜を含む、多孔性、非多孔性、又はゲル状物質である。
他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、制御放出システムにおいて送達される。一実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい。また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。他の制御放出システムは、例えば、上記のＬａｎｇｅｒで考察されている。
一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象（例えば、ヒト）への静脈内又は皮下投与に適合された組成物として、通常の手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための薬学的組成物は、可溶化剤としての滅菌等張使用における溶液、及び注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔剤である。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどの密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、別々に又は単位剤形で一緒に混合されてのいずれかで供給される。医薬品が注入によって投与される場合、医薬品は、滅菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注され得る。薬学的組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
全身投与のための薬学的組成物は、液体（例えば、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲル溶液、又はハンクス溶液）であり得る。加えて、薬学的組成物は、固体形態であり得、使用の直前に再溶解又は懸濁され得る。凍結乾燥形態も企図される。薬学的組成物は、脂質粒子又は小胞（例えば、非経口投与にも好適なリポソーム又は微結晶）内に含有され得る。粒子は、組成物がその中に含有されている限り、単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）又は多層（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ）などの任意の好適な構造の粒子であり得る。化合物は、融合脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０ｍｏｌ％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド脂質粒子」（ＳＰＬＰ）に封入され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Ｚｈａｎｇ Ｙ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９，６：１４３８－４７を参照されたい）。かかる粒子及び小胞には、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルサルフェート又は「ＤＯＴＡＰ」などの正に帯電した脂質が特に好ましい。かかる脂質粒子の調製は周知である。例えば、米国特許第４，８８０，６３５号、同第４，９０６，４７７号、同第４，９１１，９２８号、同第４，９１７，９５１号、同第４，９２０，０１６号、及び同第４，９２１，７５７号を参照されたい（それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載の薬学的組成物は、例えば、単位用量として投与又は包装され得る。「単位用量」という用語は、本開示の薬学的組成物に関して使用される場合、対象のための単位投薬量として好適な物理的に分離された単位を指し、各単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体又はビヒクル）と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性物質を含有する。
更に、薬学的組成物は、薬学的キットとして提供され得、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器、及び（ｂ）薬学的に許容される希釈剤（例えば、本発明の凍結乾燥化合物の再構築又は希釈に使用される滅菌物）を含有する第２の容器を含む。任意選択的に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が、かかる容器に付随し得、通知は、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関の承認を反映する。
別の態様では、上に記載の疾患の治療に有用な材料を含有する製造品（ａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）が含まれる。一部の実施形態では、製造品は、容器及びラベルを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成され得る。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載の疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内輸液バッグ又はバイアルであり得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上の、又は容器に付随するラベルは、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、又はデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含み得る。これには、商業及び使用者の観点から望ましい他の材料が更に含まれ得、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書が挙げられる。
一部の実施形態では、塩基エディター又は塩基エディターシステム（例えば、本明細書に記載のＣａｓ９又はＣａｓ１２を含む）は、薬学的組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される融合タンパク質のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される複合体のいずれかを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡとカチオン性脂質との複合体を形成するＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療活性物質を含むことができる。
キット
一態様では、本発明は、上記の方法及び組成物において開示されるエレメントのうちのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、ベクターシステムと、キットを使用するための説明書と、を含む。一部の実施形態では、ベクターシステムは、ガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含み、発現されるとき、ガイド配列は、真核細胞における標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされる配列、並びに／又は（ｂ）核局在化配列を含む当該ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合した第２の調節エレメントと複合体化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。エレメントは、個別に又は組み合わせて提供され得、バイアル、ボトル、又はチューブなどの、任意の好適な容器で提供され得る。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語での説明書を含む。
一部の実施形態では、キットは、核酸塩基エディターを含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載のエレメントのうちの１つ以上を利用するプロセスで使用するための１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器に提供され得る。例えば、キットは、１つ以上の反応又は保管緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態、又は使用前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮物又は凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液は、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態では、緩衝液は、アルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨが、約７～約１０である。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを作動可能に連結するように、ベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体において参照により援用される。更に、材料、方法、及び例は、例解的であるにすぎず、限定することを意図しない。別途明示されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が本明細書に記載されている。
以下の実施例は、本発明の作製及び実施の好ましいモードのいくつかを説明する。しかしながら、これらの実施例は、例解目的のみであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
実施例１．肝移植のための初代ヒト肝細胞におけるＣａｓ９を使用したインビトロ塩基編集
この例は、初代ヒト肝細胞における例示的なＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ抗原遺伝子を標的化するインビトロＣａｓ９塩基編集を例解する。
この実施例では、初代肝細胞を含む同種移植片の免疫拒絶を低減するために、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ抗原遺伝子を標的化する塩基編集を行った。
簡潔には、例示的なＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ抗原遺伝子、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの、スプライス部位及び／又は終止コドン内の特定のヌクレオチド位置を標的化するＣａｓ９ガイドＲＮＡを、肝細胞への導入のために設計した（表１）。
初代ヒト肝細胞を、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）又はシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）及びガイドＲＮＡ（表１）に融合したＣａｓ９酵素を含有する発現ベクターで、播種の２４時間後にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの５時間後に回収し、全ＤＮＡを抽出した。
初代ヒト肝細胞におけるＡからＧへの変換又はＣからＴへの変換を特徴付けるために、ディープシーケンシングを実施した。例示的な標的を、２ラウンドＰＣＲを使用して増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及び独自のバーコードを標的アンプリコンに添加した。ＰＣＲ生成物を、２％ゲルで実行し、ゲル抽出した。試料をプールし、定量化し、ｃＤＮＡライブラリーを調製し、ＭｉＳｅｑで配列決定した。ディープシーケンシングによって、ＡからＧへの変換及びＣからＴへの変換の割合（％）を判定し、塩基編集を観察した。
この実施例における結果は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９が、初代ヒト肝細胞においてＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ免疫遺伝子の塩基編集を達成したことを示した。
塩基編集は、ヒト肝細胞の初代培養物においても行った。これらの研究のために、塩基エディターを、培養初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）においてＢ２Ｍ（ＨＬＡ ＭＨＣクラスＩ）及び／又はＣＩＩＴＡ（ＨＬＡ ＭＨＣクラスＩＩ）のいずれかを標的化するそれらの能力について評価した。Ｃ－Ｔエディター（ＢＥ４）及びＡ－Ｇエディター（ＡＢＥ）の両方を試験した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９）も、編集対照として使用した。Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のスプライス部位を破壊するように設計されたガイドＲＮＡを、ＢＥ４又はＡＢＥのいずれかと組み合わせて試験した。これらのガイドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとともに使用した場合、インデルを生成することも示された。ヒト初代肝細胞を播種し、塩基エディター（又はＣａｓ９）をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含有する混合物でプレートしでトランスフェクション（リポフェクション）した。トランスフェクションの５日後、ゲノムＤＮＡ抽出及びＮＧＳ分析のために細胞を回収した。
これらの塩基編集実験からのデータを、図１Ａ～１Ｂ及び図２Ａ～２Ｂに示す。図１Ａは、赤色で示されている潜在的なスプライス部位を生成するために使用されたＢ２Ｍ塩基エディターの標的を示す。また、図１Ａは、灰色で示されている意図されたスプライス部位領域の外側の潜在的なバイスタンダー編集を示す。図２Ａは、赤色で示されている潜在的なスプライス部位を生成するために使用されたＣＩＩＴＡ塩基エディターの標的を示す。図２Ａはまた、灰色で示されているインデントされたスプライス部位領域の外側の潜在的なバイスタンダー編集を示す。
これらの研究の両方からのデータは、Ｂ２Ｍ遺伝子（図２Ａ）及びＣＩＩＴＡ遺伝子（図２Ｂ）の有意な塩基編集を示した。図１Ｂは、ＢＥ４塩基エディターを使用したＢ２Ｍ編集効率が５５％も高かったことを示す。すなわち、ＢＥ４は、ＢＥ－４会合部位で５５％のＣからＴへの変換をもたらした。図１Ｂはまた、ＡＢＥ部位エディター（ＡＢＥ７．１０）の使用が、Ｂ２Ｍ ＡＢＥ会合部位で最良の編集効率を有し、３５％のＡからＧへの変換をもたらしたことを示す。Ｃａｓ９を、遺伝子破壊の直接比較として使用した。塩基編集は、Ｃａｓ９によって生成されたインデルよりも、提案されたスプライス部位で同等又はより優れた編集効率を示す。図２Ｂは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化するＡＢＥエディター（ＡＢＥ８．２ｍ）及びＢＥ４を使用した塩基編集の結果を示す。結果は、ＡＢＥエディターが４０％のＡからＧへの変換を伴う有意な編集をもたらし、ＢＥ４が５０％のＣからＴへの変換をもたらすことを示した。図１Ｂと同様に、Ｃａｓ９を、遺伝子破壊の直接比較として使用した。塩基編集は、Ｃａｓ９によって生成されたインデルよりも、提案されたスプライス部位で同等又はより優れた編集効率を示す。
実施例２．初代ヒト肝細胞における複数の免疫遺伝子の塩基編集のための多重化ガイドＲＮＡ。
この実施例は、複数の免疫系遺伝子を標的化し、肝移植のための同種肝細胞の免疫原性を低減するための多重遺伝子編集を例解する。
肝移植では、免疫応答による移植片拒絶が起こりやすい。複数の免疫系遺伝子を標的化する多重化ガイドＲＮＡを使用したＣａｓ９による遺伝子編集は、この例では、免疫応答を低減／除去し、移植された肝細胞の移植片の生存率を改善するために使用される。
例示的なＢ２Ｍ、ＣＤ１４２、及びＣＩＩＴＡ遺伝子における複数の遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡは、複数のプロモーター又はポリシストロニック転写産物のからの複数のガイドのいずれかを発現する発現ベクターにクローニングされる。これらの多重化ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９酵素とともに肝細胞に導入されるであろう。
多重化ガイドＲＮＡを使用する塩基編集の効率は、ディープシーケンシングによってＡからＧへの変換及びＣからＴへの変換の割合を判定することによって測定される。
実施例３．免疫系遺伝子のための追加のガイドＲＮＡを同定するためのバイオインフォマティクススクリーニング
この例は、バイオインフォマティクススクリーニングを使用して、免疫系遺伝子を標的化する追加のガイドＲＮＡの同定を示す。
バイオインフォマティクススクリーニングを使用して、免疫系遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲの標的化範囲を拡張する追加のガイドＲＮＡを探索した。標的化された例示的な免疫系遺伝子としては、β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びクラスＩＩ主要組織適合複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）を含むＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子が挙げられる。スクリーニングは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のシード配列を利用した。バイオインフォマティクスは、ＢＬＡＳＴヒットを考慮するために、１ｅ－６のｅ値閾値を有するＢＬＡＳＴのｔｂｌａｓｔｎバリアントを使用して実施した。追加のバイオインフォマティクススクリーニングを行って、ＣＤ１４２、及びヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）及びヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）を含む他の例示的な免疫系遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを判定することになる。
ガイドＲＮＡ配列及びそれらのＰＡＭを、例示的な免疫系遺伝子Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及びＨＬＡ－Ｂについて、表２、３、４、５、及び６に示す。例示的なスペーサー配列を、表２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、及び６Ａに示す。
実施例４．塩基編集されたヒト肝細胞の大規模産生
この例は、塩基編集されたヒト肝細胞の大規模産生を例解する。
凍結保存された初代肝細胞又は播種可能／移植可能な初代肝細胞が得られるであろう。多重化遺伝子編集は、実施例１及び２に記載されるように、肝細胞上で実施されることになる。
産生される修飾ヒト肝細胞は、Ａ－Ｇ及びＣ－Ｔ塩基変換を測定することによって検証されるであろう。
修飾ヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスに導入され、大規模な生産のために増殖されるであろう。
約２億～５億個の細胞が、初代ヒト肝細胞培養から直接又はＦＲＧマウスからのいずれかで、ＦＲＧブタに移植されるであろう。
この実施例の結果は、肝移植のための宿主の免疫反応を除去又は低減する大規模な塩基編集ヒト肝細胞を産生するであろう。
実施例５．肝不全及び代謝性疾患のＦＲＧマウスモデルにおける塩基編集肝細胞の生着の評価
この例は、肝不全及び代謝性疾患の動物モデルであるＦａｈ－／－／Ｒａｇ２－／－／Ｉｌ２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）マウスにおける生着及び塩基編集肝細胞の保持を例解する。
ＦＲＧマウスは、約５×１０９個のプラーク形成単位（ｐｆｕ／マウス）の用量で、ウロキナーゼ発現アデノウイルス（ｕＰＡウイルス）の静脈内投与によって前処理されるであろう。
約１００万個の塩基編集肝細胞が、ｕＰＡ投与の２４～４８時間後に脾臓内に注入され、ＮＴＢＣを休薬するであろう。フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（Ｆａｈ）変異体マウスにおける肝疾患は、薬物２－（２－ニトロ－４－トリフルオロメチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を休薬したときにのみ発症する。ＦＲＧマウスにおけるＮＴＢＣの休薬は、徐々に肝細胞損傷を引き起こし、修正されない限り、４～８週間後に最終的に死に至る。
移植された細胞の肝細胞機能を判定するために、ＦＡＨ酵素活性を測定する。加えて、ヒトアルブミンレベルを測定して、ヒト編集細胞の存在を確認する。生着を確認するために、組織学的／ＩＨＣ分析を行う。
この実施例の結果は、マウスモデルにおける移植された塩基編集肝細胞の生着及び保持のインビボ効率を判定する。
実施例６．ＦＲＧブタバイオリアクターにおける肝細胞の生着の評価
この例は、肝細胞の大規模な産生のためのＦＲＧブタバイオリアクターにおける塩基編集細胞の生着を例解する。
ＦＲＧブタバイオリアクターにおける肝細胞の取得及び増殖は、臓器移植のためのドナー肝臓の供給が限られているために、高品質の肝細胞の供給が限られるという問題を克服する。
編集された肝細胞の生着及び増殖を評価するために、ＷＴ及び塩基編集肝細胞を、門脈注入によってＦＲＧブタモデルに移植する。
移植後、保護薬２－（２－ニトロ－４－トリフルオロメチルベンジオール）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を、レシピエント豚から休薬し、フマリールアセトアセテートヒドラーゼ（Ｆａｈ＋）細胞の増殖のための選択優位性を提供する。
ヒトアルブミンレベルは、ＦＲＧブタにおけるヒト編集細胞の存在を確認するために、移植後、１、３、及び６ヶ月後に評価されるであろう。少量の血液を、ヘパリン化採血用毛細管で採取する。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水で希釈した後、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キットを使用して、ヒトアルブミン濃度を測定する。肝臓のヒト化の程度は、概して、ヒトアルブミンの血中レベルと相関し、１ｍｇ／ｍＬが約２０％のヒト肝細胞に対応する。
十分な生着を確認するために、マウス肝臓組織の免疫組織化学分析も、４ヶ月目又は６ヶ月目に行われる。ＦＡＨ又はヒトアルブミン又はサイトケラチンの発現について免疫組織化学を実施する。
約１２ヶ月目の終わりに、増殖したヒト肝細胞を単離し、分類し、クラスＩ及びＩＩマーカーの存在／不在についてフローサイトメトリーによって特徴付け、次世代シーケンシングを使用して、生着後の編集保持を評価する（図１）。
この実施例の結果は、肝移植に好適な塩基編集後の修飾肝細胞の大規模産生のためのＦＲＧブタバイオリアクターの使用を実証するであろう。
実施例７．初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の播種プロトコルにおける塩基編集効率の評価
この実施例は、例示的な標的遺伝子座（例えば、Ｂ２Ｍ又はＣＩＩＴＡ）を標的化する例示的な塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８．８、ＡＢＥ８．２０、及びＢＥ４）の塩基編集効率を評価する。
簡潔には、初代ヒト肝細胞を、塩基編集反応後、培養の４日目及び／又は６日目に解離した。塩基編集効率を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングファイルを使用して、ＥｄｉｔＲソフトウェアを用いて評価し、対応するタンパク質のノックアウトを、編集反応後、培養の４日目及び／又は６日目に行われる解離したＰＨＨのフローサイトメトリーによって評価した。
結果は、４日目及び６日目の時点でのＢ２Ｍの編集効率、並びに６日目の時点でのＣＩＩＴＡの編集効率を示した（図３Ａ）。Ｂ２Ｍタンパク質レベルのＫＯ効率は、６日目の時点で測定されたＢ２Ｍ陰性（Ｂ２Ｍ－）細胞の割合（％）として示される（図３Ｂ）。
ＣＩＩＴＡのタンパク質レベルのＫＯを評価するためのＨＬＡクラスＩＩ発現のフローサイトメトリー分析により、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的化するために編集試薬を使用したにもかかわらず、使用したＰＨＨが本質的にＨＬＡクラスＩＩ陰性であったことが明らかになった（図３Ｂ）。
結果は、両方の遺伝子座で効率的な編集が観察され、フローサイトメトリーによって測定されたＢ２Ｍタンパク質ＫＯのレベルがＢ２Ｍの編集効率と相関していることを示した。
全体として、結果は、ＡＢＥ８．２０及びＢＥ４、並びにＡＢＥ８．８の編集試薬が、播種されたＰＨＨにおけるＢ２Ｍ発現を効率的に低減し、効率的な塩基編集を実証することを確認した。塩基エディターは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の編集にも効果的であった。
実施例８．ヌクレオフェクション及びトランスフェクションによる、塩基エディターの初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）への送達の効率の比較
この実施例は、ヌクレオフェクション対トランスフェクションによる、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における例示的な塩基編集試薬の送達の効率を評価する。
簡潔には、例示的な標的遺伝子であるＢ２Ｍを標的とする塩基エディターを、ＰＨＨにトランスフェクト又はヌクレオフェクトし、ＤＮＡ及びタンパク質レベルでのＢ２ＭのＫＯ効率を判定した。編集されたＰＨＨの細胞生存率を、ＰＨＨの解離前に添加した生／死染色を使用して、フローサイトメトリーによって評価して、解離前の細胞生存率を判定した。
簡潔には、ＰＨＨを、図５Ａに列挙された条件で、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）又はトランスフェクションによって、塩基編集試薬で操作した。
操作後、細胞を培養し、処理後６日目に、細胞生存率とともに、ＤＮＡ及びタンパク質レベルでのＢ２ＭのＫＯについて評価した。
図５Ｂに示されるように、同じ実験条件（ＢＥ４／ｇＲＮＡ３：１）で、トランスフェクションベースの送達は、ヌクレオフェクションベースの送達と比較して、ＰＨＨにおいて有意に高いＢ２Ｍ遺伝子のＫＯ効率（Ｂ２ＭのＫＯスコア：９１．５％対６０．０％、Ｂ２Ｍ－細胞（％）：９１．８％対６２．２％）、及び高い編集後の細胞生存率（生存率（％）：６０．３％対４９．６％）をもたらした。
全体として、結果は、ヌクレオフェクションと比較して、ＰＨＨへのトランスフェクションによる送達が、増加された塩基編集効率及びより高い編集後生存率をもたらすことを示した。
実施例９．ＰＨＨエクスビボ調製プロトコルにおける塩基編集試薬の評価
この実施例は、細胞増殖のためのＰＨＨを調製するためのエクスビボ手順に組み込まれた後、例示的な塩基編集試薬を使用して、播種されたＰＨＨにおける標的遺伝子座の編集の効率を評価する。
簡潔には、ＰＨＨを、実施例８に記載のように、トランスフェクションによって塩基編集試薬で操作した。
Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的化する例示的な塩基エディターを、トランスフェクションによって送達した。Ｂ２Ｍ遺伝子座での塩基編集効率を図６に示す。ここで、ドットは、フローサイトメトリーによるＢ２Ｍ－細胞の割合を表し、「ＨＥＫ２－２」は、標的化された対照遺伝子座を示す（図６）。
結果は、ＡＢＥ８．８、ＡＢＥ８．２０、及びＢＥ４の各々を使用して、８０％超のＢ２Ｍ標的遺伝子座での編集効率が観察されたことを示した。これに対応して、ＡＢＥ８．８、ＡＢＥ８．２０、又はＢＥ４で編集されたＢ２Ｍ標的化試料において、フローサイトメトリーによって、高い割合のＢ２Ｍ－細胞も観察された。
エクスビボ手順は、導入遺伝子の導入を含み、したがって、例示的な編集試薬を使用して、エクスビボ手順に従って、Ｂ２Ｍ遺伝子座を編集し、導入遺伝子をＰＨＨに導入する二重操作の効率を評価した。
Ｂ２Ｍ遺伝子座での塩基編集を、ＢＥ４を使用して、２つの例示的な導入遺伝子（Ｔｇ＃１又はＴｇ＃２）のうちの１つの導入と組み合わせて行った。図７に示される結果は、Ｂ２Ｍ遺伝子座で測定された又はフローサイトメトリーによるＢ２Ｍ－細胞の定量によって測定されたＢＥ４による遺伝子編集が、導入遺伝子の導入を含むエクスビボ手順への組み込みによって大きく変化しなかったことを示す。全体として、結果は、ＢＥ４及び導入遺伝子を用いた二重操作の効率が高いことを示した。
図８に示されるように、フローサイトメトリー測定は、Ｂ２Ｍのみで単独で修飾された細胞（「ＢＥ４ Ｂ２Ｍのみ」）と比較して、Ｂ２Ｍ及びＴｇ＃１を標的化するＢＥ４（「ＢＥ４ Ｂ２Ｍ＋Ｔｇ＃１」）の両方で修飾を受けた細胞の８０％超が、いずれもＢ２Ｍ陰性及びＴｇ＃１陽性（「Ｂ２Ｍ－／Ｔｇ＃１＋」）あったことを明らかにした。Ｂ２Ｍ及びＴｇ＃２を標的化するＢＥ４の両方による修飾は、二重に操作された細胞を生成するのにも有効であった。
全体として、結果は、ＰＨＨのエクスビボ調製のための、ＢＥ４及び導入遺伝子によるＰＨＨの効果的な二重操作を示した。
同等物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は通常の実験を超えない実験を使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

Claims (94)

  1. 肝細胞移植に好適な遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生する方法であって、塩基エディター及び１つ以上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子における標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡを導入することによって、単離されたヒト肝細胞又は肝細胞前駆細胞における前記１つ以上のクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子を破壊し、それによって、遺伝子修飾ヒト肝細胞を産生することを含む、方法。
  2. 前記塩基エディターが、デアミナーゼに融合されたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、標的配列に１つ以上の核酸塩基編集を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、破壊された標的配列を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、低減又は除去された同種反応性を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 前記クラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  7. 終止コドン又はスプライス部位が、前記Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に導入される、請求項６に記載の方法。
  8. スプライス部位が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド位置１９に導入される、請求項７に記載の方法。
  9. 終止コドンが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド位置５に導入される、請求項７に記載の方法。
  10. スプライス部位が、前記ＣＤ１４２遺伝子のヌクレオチド位置２８に導入される、請求項７に記載の方法。
  11. 終止コドンが、前記ＣＤ１４２遺伝子のヌクレオチド位置１９に導入される、請求項７に記載の方法。
  12. スプライス部位が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のヌクレオチド位置１４７に導入される、請求項７に記載の方法。
  13. 終止コドンが、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のヌクレオチド位置１３０に導入される、請求項７に記載の方法。
  14. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記Ｃａｓ９が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、超高精度Ｃａｓ９である、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  17. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）を参照して、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＨ６９８Ａに対応する変異を含む、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  18. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、高忠実度Ｃａｓ９である、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  19. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）を参照して、Ｎ４６７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＱ９２６Ａに対応する変異を含む、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  20. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＳｕｐｅｒＦｉ－Ｃａｓ９である、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  21. ＳｐｙＣａｓ９（配列番号６８）に対応するＹ１０１６、Ｒ１０１９、Ｙ１０１０、Ｙ１０１３、Ｋ１０３１、Ｑ１０２７、及び／又はＶ１０１８残基が、アスパラギン酸に変異している、請求項１５に記載のＣａｓ９タンパク質。
  22. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、又はイノシン塩基エディター（ＩＢＥ）に融合される、請求項２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＣＲＩＳＰＲが、アデニン若しくはアデノシンデアミナーゼドメイン、又はシチジン若しくはシトシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターに融合される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＣＲＩＳＰＲが、アデニン又はアデノシンデアミナーゼドメイン、及びシチジン又はシトシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターに融合される、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、核局在化配列（ＮＬＳ）及び／又はＦＬＡＧ、ＨＩＳ、若しくはＨＡタグを含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号１（ＳｐＣａｓ９）、配列番号２（ＳａＣａｓ９）、又は配列番号３（Ｃａｓ１２）において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個の変異を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記変異が、アミノ酸置換である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記少なくとも１つの変異が、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つの変異が、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメイン及び／又はＨＮＨドメインにおける１つ以上のアミノ酸置換である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つの変異が、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）、又はＣａｓ９タンパク質におけるその対応する変異である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記少なくとも１つの変異が、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸８４０におけるヒスチジンからアラニンへの置換（Ｈ８４０Ａ）、又はＣａｓ９タンパク質におけるその対応する変異である、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ニッカーゼ活性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、アデノシンデアミナーゼに融合され、配列番号６５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、シトシンデアミナーゼに融合され、配列番号４～６４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＳｐＣａｓ９タンパク質が、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＮＧＡ－３’、又は５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＳａＣａｓ９タンパク質が、５’－ＮＮＮＲＲＴ－３’又は５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記Ｃａｓ１２タンパク質が、５’－ＲＴＴＮ－３’を含むＰＡＭ配列を認識する、請求項１４及び２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記単離されたヒト肝細胞が、以前に凍結保存され、その後解凍されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、ＣＤ４７及び／又はＣＤ１４２を過剰発現する、請求項２２～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、増殖のためにヒト化動物モデルに移植される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ヒト化動物モデルが、ＦＲＧブタ、ＦＲＧマウス、又はＦＲＧラットである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞を、最初の細胞増殖のために、まず、前記ＦＲＧマウス又はＦＲＧラットに移植される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記最初の細胞増殖の後、前記遺伝子修飾細胞が、続いて、更なる細胞増殖のために前記ＦＲＧブタに移植される、請求項４２に記載の方法。
  44. 最初に増殖した細胞又は更に増殖した細胞が、動物から単離される、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. 前記最初に増殖した細胞又は前記更に増殖した細胞が、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気細胞分離、密度勾配遠心分離、及び／又は免疫密度細胞分離によって単離される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を有する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ２つ以上のガイドと組み合わせた単一の塩基エディターが、前記２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成する、請求項４６に記載の方法。
  48. ２つ以上の塩基エディターが、前記１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の核酸塩基編集を生成する、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、ＣＤ４７及び／又はＣＤ１４２を過剰発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記方法が、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表２に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記方法が、塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表３に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記方法が、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表４に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記方法が、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表５に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記方法が、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記方法が、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表２Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記方法が、塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表３Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記方法が、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表４Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記方法が、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表５Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記方法が、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含み、前記塩基エディター及び表６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  60. 先行請求項のいずれか一項に記載の前記塩基エディター及び標的配列とハイブリダイズする１つ以上のｇＲＮＡをコードする、核酸。
  61. 前記核酸が、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項６０に記載の核酸。
  62. 前記核酸が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項６０に記載の核酸。
  63. 請求項６０～６２のいずれか一項に記載の核酸をコードする、ベクター。
  64. 塩基エディター、及び表２Ａ～６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つ又は標的配列とハイブリダイズする表２～６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む１つ以上のｇＲＮＡを含む、真核細胞。
  65. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項６４に記載の真核細胞。
  66. 前記ヒト細胞が、肝細胞である、請求項６５に記載の真核細胞。
  67. 肝疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～１５及び２２～５９のいずれか一項に記載の産生された遺伝子修飾ヒト肝細胞を投与することを含む、方法。
  68. 前記遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される、請求項６７に記載の方法。
  69. 約１００億～１５０億個の遺伝子修飾ヒト肝細胞が、それを必要とする対象の門脈に注入される、請求項６７に記載の方法。
  70. 塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表２に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  71. 塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表３に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
  72. 塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表４に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
  73. 塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表５に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
  74. 塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡ。
  75. 標的遺伝子に対して１つ、２つ、３つ、又は４つ以上の編集が行われる、塩基エディター、及び表２Ａ～６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つ又は表２～６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む１つ以上のガイドＲＮＡ。
  76. 表２に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、ガイドＲＮＡ。
  77. 表３に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、ガイドＲＮＡ。
  78. 表４に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、ガイドＲＮＡ。
  79. 表５に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、ガイドＲＮＡ。
  80. 表６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、ガイドＲＮＡ。
  81. 表２Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む、ガイドＲＮＡ。
  82. 表３Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む、ガイドＲＮＡ。
  83. 表４Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む、ガイドＲＮＡ。
  84. 表５Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む、ガイドＲＮＡ。
  85. 表６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む、ガイドＲＮＡ。
  86. 塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表２Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＢ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  87. 塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表３Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＣＤ１４２遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  88. 塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表４Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＣＩＩＴＡ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  89. 塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表５Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  90. 塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡであって、前記塩基エディター及び表６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つを含む対応する１つ以上のガイドＲＮＡが選択される、塩基エディター及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ。
  91. 塩基エディター及び１つ以上のガイドＲＮＡを含み、表２Ａ～６Ａに列挙された配列のうちのいずれか１つ又は表２～６に列挙されたプロトスペーサー配列のうちのいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む、細胞。
  92. 請求項１～１５及び２２～５９のいずれか一項に記載の方法に従って、ＭＨＣ遺伝子に１つ以上の編集を有する、遺伝子修飾ヒト肝細胞。
  93. 前記ＭＨＣ遺伝子が、Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂから選択される、請求項９０に記載の遺伝子修飾ヒト肝細胞。
  94. Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子のうちの１つ以上に対する編集が、非遺伝子修飾ヒト肝細胞と比較して、前記Ｂ２Ｍ、ＣＤ１４２、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、及び／又はＨＬＡ－Ｂ遺伝子の発現の増加をもたらす、請求項９１に記載の遺伝子修飾ヒト肝細胞。
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