KR20230136188A - 유전적으로 변형된 간세포 집단 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 집단 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 선조세포의 집단을 사용하는 방법, 예컨대 비제한적으로, 대상체 또는 복수의 대상체를 병태 또는 복수의 병태에 대해 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 경우, 집단의 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 저면역원성이고, 방법은 저면역원성 간세포 및/또는 이의 선조세포를 생성하는 방법을 포함한다. 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 생착된 집단을 함유하는 비인간 포유류가 또한 제공된다. 유용한 키트, 시스템, 시약, 세포 및 세포 치료법 용량이 또한 제공된다.

Description

유전적으로 변형된 간세포 집단
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 1월 26일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/141,769호의 이익을 주장하며, 그 출원은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
미국에서만도 급성 간 질환 환자가 100,000명이 넘고, 비대상성 간경변(decompensated liver cirrhosis) 환자는 50만 명이 넘는다. 간 질환은 미국에서 매년 62,000명 및 전세계에서 대략 2백만 명이 사망하고 있으며, 이 중 130만 명은 특히 간경변으로 인해 사망한다. 2019년에, 간경변은 전세계적으로 사망의 11번째의 가장 흔한 원인이고 미국에서는 12번째의 주된 원인이었다. 전세계적에서 약 20억명이 알코올을 소비하고 있으며, 또 다른 대략 20억의 성인은 비만 또는 과체중이고, 4억명의 성인은 당뇨병을 갖고 있다. 알코올 소비, 간 지질 침착, 및 인슐린 저항성은 모두 섬유증과 궁극적으로는 간경변의 발병에 주요한 위험 인자로 간주된다. 더욱이, 약물-유도성 간 손상은 급성 간염의 주 원인으로서 계속 증가하고 있는 한편, 바이러스성 간염의 전세계 유병률은 여전히 높게 유지된다.
이에 더하여, 전염 가능한 질환의 사망률이 빈번하지 않은 선진국에서, 유전적 장애는 개별적으로 드물긴 하지만 종합적으로는 소아 질환, 장애 및 사망률의 상당한 부담을 나타낸다. 단일유전자 질환(monogenic disease)은 최대 6%의 사람에게 생애 중 어느 지점에서 영향을 미치는 것으로 추정된다. 유전적 장애는 넓게는 단일 유전자 유전자위(locus)에 기인할 만한 장애(즉, 단일유전자 질환을 포함한 "단일 유전자 장애"), 뿐만 아니라 다수의 유전적 위험 인자의 수집 및/또는 특정한 환경적 인자와의 조합에 기인할 만한 다유전자 장애(polygenic disorder)를 포함한다. 유전적 질환의 총 부담(total burden)을 정량화하는 것은 어렵고, 원인 유전자위(causative locus)가 알려져 있는 한편, 유전적 상담은 (스크리닝이 부지런히 적용되었을 때 특정한 병태에 대해 고도로 효과적임에도 불구하고) 단지 전체 유병률을 5% 정도의 감소라는 최소한의 영향만을 미쳤다(예를 들어 문헌[Blencowe et al. J Community Genet. 2018] 참조). 유전적 질환은 많은 희귀 간 질환, 예컨대 페닐케톤뇨증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증(ornithine transcarbamylase deficiency), 아르기나제-1 결핍증, α-1 항트립신 결핍증, 뮤코다당류증(mucopolysaccharidosis), A형 혈우병, B형 혈우병 등을 포함한다. 유전적 질환의 큰 집합적 부담과 더불어 유전 상담이 해당 부담을 감소시키는 데 미치는 낮은 영향은 이러한 질환이 전세계 건강에 미치는 실질적인 진행중인 영향을 예시한다.
간 이식은, 이용 가능하고 성공적이라면, 삶을 변화시키는 치료법이며, 고형 장기 이식 중에서 두번째로 가장 흔한 것이다. 간 이식은 후천적 간 질환과 유전적 간 질환 둘 다에 유용하다. 그러나, 급성 간부전과 같이 급속히 쇠퇴하는 병태를 갖는 대상체의 경우 종종 필요한 양만큼 또는 적시에 적합한 간이 이용 불가능하다. 상기 기술된 광범위한 질환 유병률과 비교하여, 9,000건 미만의 간 이식이 미국에서 수행된다.
면역억제제 및 면역억제제를 이용하는 치료 프로토콜에서의 최근의 진전에도 불구하고, 거부 반응은 간 이식의 흔한 합병증으로 남아 있다. 일부 조치에 의해, 급성 동종이식 거부 반응(acute allograft rejection)의 발생 빈도는 간 이식의 20% 내지 40% 범위이다. 간 이식 거부 반응, 뿐만 아니라 이식 후 이환률 및 사망률을 예측하는 방법은 예비적이고, 이러한 방법의 예측력은 논란의 여지가 있다. 급성 및 만성 거부 반응의 발생 빈도는 간 이식 수용자에서 면역억제 요법의 향상으로 저하되었다. 급성 거부 반응은 통상 향상된 요법에 양호하게 반응하는 한편, 만성 거부 반응은 더 어려운 상황인데, 상당한 비율의 환자가 증가된 면역억제에 반응하지 못하고 종종 재이식 또는 사망을 야기하기 때문이다. 또한, 향상된 면역억제 요법으로 인한 진전에도 불구하고, 많은 환자는 중복이환(comorbidity)으로 인해 면역억제제에 대해 내약성이 있을 수 없거나 기존의 금기(contraindication)로 인해 면역억제제가 안전하게 투여될 수 없다.
본 개시내용은 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 집단 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 선조세포의 집단을 사용하는 방법, 예컨대, 비제한적으로, 대상체 또는 복수의 대상체를 병태 또는 복수의 병태에 대해 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 경우, 집단의 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 저면역원성이고, 방법은 저면역원성 간세포 및/또는 이의 선조세포를 생성하는 방법을 포함한다. 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 생착된 집단을 함유하는 비인간 포유류가 또한 제공된다. 유용한 키트, 시스템, 시약, 세포 및 세포 치료법 용량이 또한 제공된다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 일반적 관례에 따르면, 도면의 다양한 특질은 크기가 조정되지 않는다는 것이 강조된다. 반면, 다양한 특질의 치수는 명확성을 위해 임의로 확장되거나 감소된다. 도면에는 하기 도면이 포함된다.
도 1은 인델(indel)(좌측 y-축, 반점 막대(speckled bar)) 및 녹아웃(KO) 점수(좌측 y-축, 해시 막대(hashed bar))에 의해 측정된 바와 같은 B2M-HLA-E 또는 CD47 이식유전자 전달 시약과 함께 또는 없이, 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 엑손 1 또는 대조군 AAVS1을 표적화하는 편집 조성물과 접촉된 간세포 세포 집단에서의 표적 유전자위 편집 효율을 보여주는 그래프이다. 기술된 유전적 변형 후 상응하는 간세포 세포 집단에서 유세포 측정법(우측 y-축, 검정색 점)에 의해 측정된 바와 같은 B2M KO를 갖는 세포("%B2M-세포")의 백분율이 또한 제공된다.
도 2는 유세포 측정법에 의해 측정된 바와 같은 B2M-HLA-E 또는 CD47 이식유전자 전달 시약과 함께 또는 없이 B2M 엑손 1 또는 대조군 AAV1을 표적화하는 편집 조성물과 접촉된 간세포 세포 집단으로부터 비롯되는, CD47 이식유전자 유전적 변형("%CD47"); B2M KO와 CD47 이식유전자 유전적 변형 둘 다("%B2M-/CD47+"); B2M-인간 백혈구 항원 E(HLA-E) 융합 이식유전자 유전적 변형 단독("%HLA-E"); 및 B2M KO와 B2M-HLA-E 융합 이식유전자 유전적 변형 둘 다("%B2M/HLA-E")를 갖는 생 세포의 백분율을 도시하는 그래프이다. B2M KO를 갖는 각각의 시험군의 세포("%B2M―", 점)의 백분율이 또한 제공된다.
도 3a 내지 도 3d는 DNA 분석에 의해 측정된 바와 같은 B2M KO(도 3a), 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 B2M KO(도 3b), 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 HLA-E 이식유전자 발현(도 3c), 및 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 이중 변형(즉, B2M KO와 이식유전자 발현 둘 다)(도 3d)을 갖는 입력(input) 및 출력(output) 집단에서 편집된 세포의 백분율을 도시하는 일련의 그래프이다. 비처리-대조군(NTC: no-treatment-control) 동물(즉, 비변형된 PHH가 이식된 동물)로부터의 샘플이 또한 병행하여 감정되었다.
도 4는 수용자 마우스 내로의 인자 IX 렌티바이러스 벡터 형질도입된(LV-F9) 간세포 또는 루시퍼라제 렌티바이러스 벡터 형질도입된(LV-Luc) 간세포의 이식 후 3개 시점(제57일 또는 제60일, 제85일 및 제97일)에서 수집된 생물발광 이미지의 매트릭스이다.
도 5는 도 4에 도시된 LV-F9 및 LV-Luc 마우스로부터 검출된 생물발광 신호의 모든 시점에서의 정량화를 제시한다.
도 6은 이식 후 14일, 28일, 47일 및 98일째에 LV-F9 및 LV-Luc 마우스로부터 수집된 말초 혈액 샘플에서 측정된, 이식된 조작 간세포에 의해 생산된 인간 알부민의 수준을 도시하는 그래프이다.
도 7은 이식 후 14일, 28일, 47일 및 98일째에 LV-F9 및 LV-Luc 마우스로부터 수집된 말초 혈액 샘플에서 검출된 인간 인자 IX의 수준을 도시하는 그래프이다. 검출 한계(LOD), 인자 IX의 상응하는 치료 수준 및 인자 IX의 상응하는 정상 생리학적 수준을 나타내는 참조 수준이 비교를 위해 제공된다.
도 8은 LV-F9 및 LV-Luc 마우스에서 이식 후 제47일에 각각의 동물에서 측정된 인간 인자 IX 수준 대 각각의 동물에서의 상응하는 인간 알부민 수준의 플롯이다. 0.1%, 1% 및 5% 생착, 뿐만 아니라 5% 및 100%의 정상 생리학적 인간 인자 XI에 대한 참조 수준은 수직 점선 및 수평 점선으로 각각 제시된다.
도 9는 LV-F9 및 LV-Luc 마우스에서 이식 후 제98일에 각각의 동물에서 측정된 인간 인자 IX 수준 대 각각의 동물에서의 상응하는 인간 알부민 수준의 플롯이다. 0.1%, 1% 및 5% 생착, 뿐만 아니라 5% 및 100%의 정상 생리학적 인간 인자 XI에 대한 참조 수준은 수직 점선 및 수평 점선으로 각각 제시된다.
본 개시내용은 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 집단 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 선조세포의 집단을 사용하는 방법, 예컨대, 비제한적으로, 대상체 또는 복수의 대상체를 병태 또는 복수의 병태에 대해 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 경우, 집단의 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 저면역원성이고, 방법은 저면역원성 간세포 및/또는 이의 선조세포를 생성하는 방법을 포함한다. 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 생착된 집단을 함유하는 비인간 포유류가 또한 제공된다. 유용한 키트, 시스템, 시약, 세포 및 세포 치료법 용량이 또한 제공된다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 실시형태에 제한되지 않고, 당연히 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 하한 단위의 10분의 1까지 해당 범위의 상한 및 하한과 해당 언급된 범위의 다른 언급되거나 중간 값 사이의 각각의 중간 값이 본 발명 내에 포함됨을 이해해야 한다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 다의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위도 본 발명에 포함된다.
특정한 범위는 용어 "약"이 선행되는 수치 값으로 본원에 제시된다. 용어 "약"은 용어가 선행되는 정확한 숫자, 뿐만 아니라 상기 용어가 선행되는 숫자 주변의 숫자 또는 근사한 숫자에 대한 문자적 지원을 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 언급된 숫자에 가깝거나 근사한지의 여부를 결정함에 있어서, 언급되지 않은 숫자에 가깝거나 근사한 숫자는 그것이 제시되어 있는 맥락에서 구체적으로 언급된 숫자와 실질적으로 균등한 것을 제공하는 숫자일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법과 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 방법과 물질이 이제 기술된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 또는 특허는 구체적이고 개별적으로 인용되어 포함되도록 제시된 것과 같이 본원에 인용되어 포함되고, 간행물이 인용된 것과 함께 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 인용되어 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 이의 개시를 위한 것이며, 본 발명이 선행 발명으로 인해 상기 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것으로 인정되어서는 안된다. 추가로, 제공된 발행일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제의 발행일과는 상이할 수 있다.
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본 개시내용을 읽음으로 당업자에게 명백한 것과 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 실시형태는 본 발명의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 실시형태의 특징과 쉽게 분리될 수 있거나 조합될 수 있는 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
기구 및 방법은, 문법적 유동성을 목적으로 기능적 설명을 포함하여 설명되어 있거나 설명될 것이지만, 35 U.S.C. §112에 따라 명백히 공식화되지 않는 한, 청구범위는 "수단" 또는 "단계" 제한의 구성에 의해 어떤 식으로든 반드시 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 사법상의 균등론에 기초하여 청구범위에 의해 제공된 정의의 의미 및 균등물의 전 범위가 부여되어야 하고, 청구범위가 35 U.S.C. §112에 따라 명백히 공식화되는 경우에는, 35 U.S.C. §112에 따라 완전한 법적 균등성이 부여되어야 한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 정의는 또한 해당되는 경우 이의 다양한 문법적 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 단수 형태 "하나(a, an, 또는 the)"는 문맥이 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "제제"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 제제에 대한 언급을 포함하는 식이다.
참조 수치 값과 관련하여 용어 "약"은 해당 값에서 10%를 더하거나 뺀 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 양 "약 10"은 9, 10, 및 11의 값을 포함한 9 내지 11의 값을 포함한다. 참조 수치 값과 관련하여 용어 "약"은 또한 해당 값에서 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%를 더하거나 뺀 값의 범위를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시형태를 설명하기 전, 본 개시내용을 설명하는 데 사용되는 정의를 설명하는 것이 유용할 것이다.
용어 "감정(assessing)"은 임의의 형태의 측정을 포함하고, 요소가 존재하는지 또는 존재하지 않는지를 결정하는 것을 포함한다. 용어 "결정", "측정", "평가", "감정" 및 "검정"은 상호 교환적으로 사용되며, 정량적 및 정성적 결정을 포함한다. 감정은 상대적 또는 절대적일 수 있다.
용어 "대조군", "대조군 검정", "대조군 샘플" 등은 예를 들어 관련 실험 샘플로부터 수득된 결과가 신뢰할 수 있는지의 여부를 나타내기 위해, 관련 실험 결과가 실제 결과를 나타내는 신뢰도를 나타내기 위해, 그리고/또는 실험 결과의 보정을 허용하기 위해 예측 결과가 높은 확실성으로 알려진 실험 또는 진단 절차 또는 실험 설계의 샘플, 시험 또는 다른 부분을 지칭한다. 예를 들어 일부 경우, 실험자가 음성 대조군 검정이 긍정적인 결과를 발휘하지 않을 것이라는 높은 확실성을 가질 수 있도록, 대조군은 검정의 필수 구성요소가 배제되게 하는 "음성 대조군" 검정일 수 있다. 일부 경우, 대조군은 특정 검정의 모든 구성요소가, 조합된 경우, 실험자가 양성 대조군 검정이 긍정적인 결과를 발휘하지 않을 것이라는 높은 확실성을 가질 수 있도록 수행되는 검정에서 특정 결과를 발휘하기 위해 특징화되고 알려지게 하는 "양성 대조군"일 수 있다. 대조군은 또한 "블랭크" 샘플, "표준" 샘플(예를 들어 "골드 표준" 샘플), 검증 샘플 등을 포함할 수 있다.
용어 "수용자", "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 인간 대상체와 같이 진단, 치료 또는 치료법이 요망되거나, 지시되거나, 수행되었던 임의의 포유류 대상체를 지칭한다. 치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 염소, 돼지, 낙타 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포유류는 인간이다. 일부 경우, 개시내용의 방법은 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하지만 이로 제한되지 않는 설치류; 토끼, 개, 고양이, 비인간 영장류 및 다른 동물을 포함하는 실험 동물, 수의학 적용, 및/또는 동물 모델의 개발에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "질환" 및 "병태"는 상호 교환적으로 사용될 수 있거나 특정 질병 또는 병태가 알려진 원인 인자를 갖지 않을 수 있고(병인이 아직 밝혀지지 않았기 때문에) 따라서 이는 아직 질환으로 인식되지 않지만 바람직하지 않은 병태 또는 증후군으로만 인식된다는 점에서 상이할 수 있으며, 여기서 다소 특정한 일련의 증상이 임상의에 의해 확인되었다.
용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 본원에서 일반적으로 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭하기 위해 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상(들)을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 방지적(prophylactic)일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유 관점에서 치료적일 수 있다. 예를 들어, 예방적 치료, 즉 방지적 치료는 병태(예를 들어 간 병태)를 효과적으로 예방하는 치료 또는 병태(예를 들어 간 병태)의 진행을 효과적으로 예방하거나 제어하는 치료를 포함할 수 있다. 일부 경우, 치료는 완전한 반응 또는 부분적 반응과 같은 치료 반응을 초래할 수 있다. 용어 "치료"는 포유류, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환 및/또는 증상(들)을 갖는 것으로 진단되지는 않았지만 질환 및/또는 증상(들)의 소인이 있을 수 있는 대상체에서 발생하는 질환 및/또는 증상(들)을 예방하는 것; (b) 질환 및/또는 증상(들)을 저해하는 것, 즉 질환 및/또는 관련 증상의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질환 및/또는 관련 증상(들)을 완화하는 것, 즉 질환 및/또는 증상(들)의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
치료가 필요한 대상은 이미 고통받고 있는 대상(예를 들어 간 병태(예를 들어 급성 간 병태, 만성 간 병태 등)를 갖는 대상, 간경변을 갖는 대상, 섬유증을 갖는 대상, 질환을 갖는 대상, 단일유전자 질환을 갖는 대상 등), 뿐만 아니라 예방이 요망되는 대상(예를 들어 병태(예를 들어 간 병태)에 대해 증가된 감수성을 갖는 대상; 병태(예를 들어 간 병태)를 갖는 것으로 의심되는 대상; 병태(예를 들어 간 병태) 발증 위험이 증가된 대상; 병태(예를 들어 간 병태)를 야기하는 실행 또는 제제에 대한 환경적 노출이 증가된 대상; 병태(예를 들어 간 병태)에 대한 유전적 또는 행동적 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상; 병태(예를 들어 간 병태)를 갖는 대상; 병태(예를 들어 간 병태)의 증가된 위험을 나타내는 스크리닝 결과를 갖는 대상; 병태(예를 들어 간 병태)에 대해 양성으로 시험된 대상; 병태(예를 들어 간 병태)의 하나 이상의 바이오마커에 대해 양성으로 시험된 대상 등)을 포함할 수 있다.
치료적 치료는 대상체가 투여 전 고통받는 대상체이고, 방지적 치료는 대상체가 투여 전 고통받지 않는 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 고통받을 가능성이 증가하거나 고통받을 가능성이 증가한 것으로 의심되고(예를 들어 표준에 비해, 예를 들어 평균 개체에 비해, 예를 들어 대상체는 병태에 대한 유전적 소인 및/또는 증가된 위험을 나타내는 병태 및/또는 가족력을 가질 수 있음), 이 경우 치료는 방지적 치료일 수 있다.
핵산 분자를 설명하기 위해 본원에 사용된 용어 "재조합"은 이의 기원 또는 조작으로 인해, 자연에서 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부와 관련되지 않는 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 생산된 폴리펩타이드를 의미한다. 숙주 세포 또는 바이러스와 관련하여 사용된 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오타이드가 도입된 숙주 세포 또는 바이러스를 의미한다. 재조합은 또한 물질이 이종성 물질(예를 들어 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)의 도입에 의해 변형된 물질(예를 들어 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 재조합 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 세포 등은 본원에서 조작된 핵산, 조작된 폴리뉴클레오타이드, 조작된 세포 등으로 지칭될 수 있다.
본원에 상호 교환적으로 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 것의 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드를 이의 유사체를 포함하여 지칭한다. 용어는 분자의 1차 구조만을 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, 삼중 DNA, 뿐만 아니라 이중 가닥 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이는 또한 폴리뉴클레오타이드의 예를 들어 메틸화 및/또는 캡핑에 의해 변형된 형태, 및 비변형 형태를 포함한다. 용어는 또한 비자연적으로 발생한 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드, 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 분자를 포함하는 것으로 의미된다. 핵산 및 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 선형 및 원형 핵산, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 프로브, 프라이머, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, DNA-RNA 혼성물, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기, 변형 또는 비자연적 뉴클레오타이드 염기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 잠긴 핵산(LNA: locked-nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드), 및 간섭 RNA를 포함한다. 일부 경우, 폴리뉴클레오타이드는 유기체의 게놈에 존재하는 상응하는 서열로부터 적어도 일부 비코딩 서열을 배제하는 연속적 오픈 리딩 프레임 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질(들)"과 상호 교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩타이드는 본질적으로 임의의 길이뿐만 아니라 전체 길이 단백질의 기능적 단백질 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "펩타이드"는 일반적으로 40개 이하의 아미노산의 폴리펩타이드 사슬을 지칭할 것이다. "펩타이드 치료제"는 확립된 치료 기능을 갖는 펩타이드이다. "치료적 폴리펩타이드"는 확립된 치료 기능을 갖는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 치료적 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함한 폴리펩타이드 및 펩타이드는 이식유전자로부터 발현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질도입(transduction)"은 일반적으로 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 외래 핵산을 도입하는 것을 지칭하고, 본원에 사용된 용어 "형질주입(transfection)"은 비바이러스성(non-viral) 방법에 의해 세포 내로 핵산을 도입하는 과정을 지칭한다. 그러나, 당업자에게 용이하게 명백할 개시내용 전반에 걸쳐 일부 경우, 용어 "형질도입" 및 "형질주입"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 경우, 용어 형질도입의 사용은 핵산의 비바이러스성 전달을 배제할 수 있다. 일부 경우, 용어 형질주입의 사용은 핵산의 바이러스성 전달을 배제할 수 있다.
용어 "바이러스 입자", "바이러스" 등은 예를 들어 바큘로바이러스 입자, 렌티바이러스 입자, 아데노바이러스 입자 등을 포함하는 감염성 바이러스 제제를 지칭한다. 바이러스 및 바이러스 입자는 자연 발생, 재조합, 조작 또는 합성일 수 있다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자 또는 다른 원하는 발현 생성물의 발현을 지시할 수 있고 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다. "벡터" 또는 "발현 벡터"는 또 다른 핵산 분절, 즉, "삽입물"이 부착되어 세포에서 부착된 분절의 발현 및/또는 복제를 유발할 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "레트로바이러스"는 이의 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 카피로 역전사하고, 후속적으로 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈으로 공유 통합하는 RNA 바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 일반적인 도구이다. 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV: moloney murine leukemia virus), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV: moloney murine sarcoma virus), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV: harvey murine sarcoma virus), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV: murine mammary tumor virus), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV: gibbon ape leukemia virus), 고양이 백혈병 바이러스(FLV: feline leukemia virus), 스푸마바이러스(spumavirus), 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스(friend murine leukemia virus), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV: murine stem cell virus) 및 라우스 육종 바이러스(RSV: rous sarcoma virus)) 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍증 바이러스; 1형 HIV 및 2형 HIV 포함); 비스나-매디 바이러스(VMV: visna-maedi virus) 바이러스; 산양 관절염-뇌염 바이러스(CAEV: caprine arthritis-encephalitis virus); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV: equine infectious anemia virus); 고양이 면역결핍증 바이러스(FIV); 소 면역결핍증 바이러스(BIV); 및 시미안 면역결핍증 바이러스(SIV)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, HIV-기반 벡터 백본(즉, HIV 시스(cis)-작용 서열 요소)이 이용될 수 있다.
레트로바이러스 벡터, 보다 특히 렌티바이러스 벡터가 본 발명에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"는 각각 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터"를 포함하는 것으로 의미된다. 이에 더하여, 특정 유형의 레트로바이러스 또는 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 참조하는 경우, 당업자라면, 일부 경우, 다른 레트로바이러스 및/또는 다른 레트로바이러스 벡터 및/또는 일반적으로 레트로바이러스 및/또는 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 구체적으로 언급된 바이러스 또는 벡터에 대해 치환될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "생물반응기"는 일반적으로 제어된 조건 하에 살아 있는 유기체 또는 세포, 또는 이로부터 합성되고 수집되는 생성물의 생산을 위한 기기, 기계 또는 시스템을 지칭한다. 생물반응기는, 강철, 유리, 플라스틱 또는 다른 물질로 만들어진 1회용 또는 재활용 용기와 같이 제작될 수 있고, 원하는 생물학적 활성에 적절한 제어된, 그리고 선택적으로는 균질한 환경을 유지하도록 구성될 수 있다. 제작된 생물반응기는 예를 들어, 온도 제어기, pH 제어기, 가스 제어기 및 교환기(예를 들어 산소, 이산화탄소 및/또는 다른 가스 수준을 제어하기 위한) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 제어 기전을 포함할 수 있으며, 이는 특정 신호를 판독하고 신호화된 조정을 구동하기 위해 센서와 액추에이터의 조합을 포함할 수 있다. 제작된 생물반응기의 비제한적인 예는 교반-탱크, 요동기(rokcer), 에어 리프트(air lift), 고정-베드(fixed-bed), 회전식 벽, 및 관류 생물반응기를 포함한다. 제작된 생물반응기 구성요소의 비제한적인 예는 교반기(agitator), 임펠러, 스파저(sparger), 프로브, 무균 밀봉기(aseptic seal), 배플(baffle), 공급 라인, 배수 라인, 통풍구, 가열기, 냉각기 등을 포함한다. 생물반응기는 비접착성 세포뿐만 아니라 접착성 세포를 성장시키는 데 이용될 수 있다. 생물반응기는 예를 들어 15 mL 부피 이하 내지 2000 L 부피 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않으면서 크기 범위가 클 수 있으며, 일부 경우 1 L 또는 수 L 내지 10, 20, 50 또는 100 L 이상의 범위일 수 있다. 상업적인 공급업체의 예를 포함하여 생물반응기의 추가 설명은 문헌[Stephenson et al. F1000Research (2018)]에 의해 제공되며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 제작된 생물반응기에 더하여, 용어 생물반응기는 또한 살아 있는 동물 또는 생체내 생물반응기를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "살아 있는 생물반응기", "동물 생물반응기" 및 "생체내 생물반응기"는 일반적으로 외인성 세포, 예컨대 간세포-생성 세포(즉, 간세포 및/또는 간세포 선조세포와 같은 간세포를 생산하는 세포)가 생착 및 확장을 위해 도입되는 살아 있는 비인간 동물, 예컨대 비인간 포유류를 지칭한다. 동물 생물반응기는 원하는 세포(도입된 세포 및/또는 이의 자손을 포함할 수 있음)의 확장된 집단, 예컨대 도입된 세포로부터 생성되는 간세포의 확장된 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 생물반응기 내로의 외인성 세포, 예컨대 간세포-생성 세포의 도입은 일반적으로 이종이식(xenotransplantation)을 수반할 것이며, 따라서 이식된 외인성 세포는 일부 경우 이종이식편, 예를 들어, 인간-대-설치류 이종이식편, 인간-대-마우스 이종이식편, 인간-대-래트 이종이식편, 인간-대-돼지 이종이식편, 마우스-대-래트 이종이식편, 래트-대-마우스 이종이식편, 설치류-대-돼지 이종이식편 등으로 지칭될 수 있다. 일부 경우, 생물반응기 내로의 동종이계이식(allotransplantation), 예를 들어 설치류-대-설치류, 돼지-대-돼지 등의 동종이계이식이 수행될 수 있다. 생물반응기는 도입된 외인성 간세포-생성 세포와 같은 도입된 외인성 세포의 생착 및/또는 확장을 촉진하기 위해 이러한 외인성 세포에 선택적 이점을 부여하도록 예를 들어 유전적으로 및/또는 약리학적으로 구성될 수 있다. 생물반응기는 일부 경우 예를 들어 유전적 및/또는 약리학적 면역 억제를 통한 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 도입된 외인성 세포의 거부를 방지하도록 구성될 수 있다. 이와 같이, 생체내 생물반응기는 예를 들어 생착을 촉진하기 위해, 거부를 방지하기 위해, 감염을 예방하기 위해, 건강을 유지시키는 등을 위해 예를 들어 동물의 환경, 식이요법의 조절, 및/또는 하나 이상의 제제의 투여를 통해 외부 조작을 받을 수 있다.
용어 "생체외"는 유기체로부터 수득된 샘플(예를 들어 조직 또는 세포 등)에서 또는 샘플 상에서 수행된 처리, 실험 및/또는 측정을 지칭하기 위해 사용되며, 처리, 실험 및/또는 측정은 유기체에 대한 외부 환경에서 수행된다. 따라서, 세포에 적용되는 용어 "생체외 조작"은 세포를 배양하는 것, 세포에 대한 하나 이상의 유전적 조작을 만드는 것 및/또는 세포를 하나 이상의 제제에 노출시키는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 유기체 외부에서의 세포(예를 들어 간세포)의 임의의 처리를 지칭한다. 이에, 생체외 조작은 예를 들어 이러한 세포가 동물 또는 이의 기관(예를 들어 간)으로부터 수득된 후에 그리고 이러한 세포가 동물, 예컨대 동물 생물반응기 또는 이를 필요로 하는 대상체에게 이식되기 전에 동물 외부에서 수행되는 세포의 처리를 지칭하기 위해 본원에 사용될 수 있다. "생체외"와 대조적으로, 본원에 사용된 용어 "생체내"는 예를 들어 대상체 내의 세포의 생성 및/또는 대상체로의 세포의 이식으로 인해 대상체 또는 이의 간 내에 있는 세포(예를 들어 간세포 및/또는 간세포 선조세포)와 같은 동물 또는 이의 기관 내에 있는 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "수집"은 예를 들어 확장된 인간 간세포를 지칭하는 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같이 단리된 인간 간세포 또는 다른 간세포-생성 세포가 주입되거나 이식된 동물(예를 들어 비인간 포유류, 설치류, 마우스, 래트 또는 돼지 생물반응기)로부터 확장된 간세포를 제거하는 과정을 지칭한다. 일부 경우, 세포, 예를 들어 유전적으로 변형된 세포의 이식을 받는 비인간 동물은 또한 수용 동물로 지칭될 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 확장된 유전적으로 변형된 간세포의 이식을 받는 인간 대상체는 치료되는 대상체, 수용자 등으로 지칭될 수 있다. 수집은 선택적으로 예를 들어 비(non)-간세포 유형(예를 들어 혈액 세포, 간외 면역 세포, 혈관 세포 등), 비-간세포 간 세포(예를 들어 간 성상 세포, 쿠퍼 세포, 및 간 동양혈관(sinusoidal) 내피 세포)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 세포 유형으로부터 간세포와 같은 세포를 분리하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "동결보존된"은 77K 또는 -196℃(액체 질소의 끓는점)와 같은 낮은 영하 온도로 냉각시킴으로써 보존되거나 유지된 세포(예컨대 간세포) 또는 조직을 지칭한다. 이러한 낮은 온도에서, 세포 사멸을 유발할 만한 생화학적 반응을 포함하는 임의의 생물학적 활성이 효과적으로 중단된다. 동결보존 및 동결보존된 세포를 해동시키는 유용한 방법, 뿐만 아니라 이와 관련된 과정 및 시약은 예를 들어 미국 특허 제10370638호; 제10159244호; 제9078430호; 제7604929호; 제6136525호; 및 제5795711호를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 대조적으로, 세포와 관련하여 본원에 사용된 용어 "신선한"은 동결보존되지 않은 세포를 지칭할 수 있고, 예를 들어 대상체 또는 이의 기관으로부터 수집한 후 직접 수득되고/되거나 사용(예를 들어 이식, 배양 등)되었을 수 있다.
용어 "생존"은 시험관내에서 또는 생체내에서 예를 들어 동물 내로의 이식, 면역 세포와의 공동배양, 특정 제제와의 접촉 등과 같은 예를 들어 어느 정도의 사건 후 계속 살아있는 세포를 지칭하는 데 사용된다. 생존은 직접 감정(예를 들어 관심 세포를 함유하거나, 함유하는 것으로 예상되는 샘플에서 세포 생존력의 정성적 또는 정량적 측정과 같은 것) 및 간접 감정(예를 들어 생 세포의 존재에 의한 하나 이상의 기능적 영향(consequence)의 정성적 또는 정량적 측정과 같은)을 포함한 여러 가지 방법을 사용하여 감정될 수 있다. 세포(예를 들어 간세포) 생존의 유용한 직접 및 간접 판독은 세포 계수(예를 들어 혈구계, 면역조직화학, 유세포 측정법 등을 통해), 분비된 인자 또는 바이오마커의 측정(예를 들어 단백질(예를 들어 알부민) ELISA, 웨스턴 블롯 등을 통해), 수용자의 건강 감정(예를 들어 바이탈 측정, 기능 시험(예를 들어 간 기능 시험) 등에 의해) 등을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 용어 "생존"은 또한 대상체, 예를 들어 간 질환이 있는 대상체 또는 이의 동물 모델이 예를 들어, 대상체에게의 세포(예를 들어 간세포)의 투여 또는 이식, 대상체에게의 질환(예를 들어 간 질환) 야기 제제의 투여, 질환(예를 들어 간 질환)의 발증을 저해, 지연, 회피 또는 예방하는 제제의 중단과 같은 일부 치료, 개입 및/또는 도전 후에 계속 살아있는 기간을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 대상체를 지칭하는 바와 같이 생존은 또한 일부 치료, 개입 및/또는 도전 후 주어진 기간 동안 살아있는 집단(예를 들어 대조군 또는 치료군)의 부분(예를 들어 백분율)으로 표현될 수 있다. 생물의학 분야의 당업자는 세포 또는 대상체의 생존이 본원에 사용되는 것과 관련하여 쉽게 분별할 수 있을 것이다.
용어 "생착"은 동물에 세포 또는 조직을 착상(implantation)되는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 수용 동물에서 인간 간세포의 생착은 투여(예를 들어 주사) 후 수용 동물에서 인간 간세포가 (예를 들어 간에서) 착상되는 과정을 지칭한다. 특정한 조건 하에 생착된 인간 간세포는 수용 동물에서 확장될 수 있다. 본원에 사용된 용어 인간 간세포 "확장"은 인간 간세포의 수가 증가하도록 세포 분열을 가능하게 하는 과정을 지칭한다. 용어 "생체내 확장"은 외인성 세포의 세포 분열이 살아있는 숙주(예를 들어 비인간 동물 생물반응기, 예컨대 설치류(예를 들어 마우스 또는 래트) 생물반응기, 돼지 생물반응기, 래트 생물반응기 등) 내에서 가능하게 하여, 외인성 세포의 수가 살아있는 숙주 내에서 증가하게 되는 과정을 지칭한다. 예를 들어, 비인간 동물 생물반응기 내로 이식된 인간 간세포는 생물반응기 내의 인간 간세포의 수가 증가하도록 생물반응기 내에서 생체내 확장을 겪을 수 있다.
용어 "간세포"는 일반적으로 간의 세포질 질량의 70% 내지 80%를 이루는 세포 유형을 지칭한다. 간세포는 단백질 합성, 단백질 저장 및 탄수화물의 형질전환, 콜레스테롤, 담즙염 및 인지질의 합성, 및 외인성 및 내인성 물질의 해독, 변형 및 배설에 관여한다. 간세포는 또한 담즙의 형성과 분비를 개시한다. 간세포는 혈청 알부민, 피브리노겐 및 응고 인자의 프로트롬빈 그룹을 제조하며, 지질단백질, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 보체 및 당단백질 합성의 주요 부위이다. 이에 더하여, 간세포는 약물 및 살충제와 같은 외인성 화합물 및 스테로이드와 같은 내인성 화합물을 대사, 해독 및 비활성화시키는 능력을 갖는다.
"유효량" 또는 "~에 효과적인 양"은 (예를 들어 포유류, 예를 들어 인간 또는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포에게) 투여될 때, 지시된 성과(예를 들어 생착, 확장, 치료 등)에 영향을 미치기에 충분한 화합물 및/또는 세포의 양을 지칭한다. 예를 들어, "유효량", 예컨대 "치료적 유효량"은 포유류, 예를 들어 인간에게 투여될 때 포유류, 예를 들어 인간에서의 치료를 발휘하기에 충분한 개시내용의 화합물 및/또는 세포의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"을 구성하는 개시내용의 조성물의 양은 화합물 및/또는 세포, 병태 및 이의 중증도, 투여 방식, 및 치료될 포유류의 연령에 따라 달라질 것이지만, 당업자는 자신의 지식과 본 개시내용을 고려하여 일상적으로 결정될 수 있다.
방법, 조성물, 세포 집단 및 동물
본 개시내용은 유전적으로 조작된 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하거나, 생성하거나, 이의 제조 또는 사용에 이용되는 방법, 조성물, 세포 집단 및 동물을 포함한다. 본 개시내용의 유전적으로 변형된 간세포는 예를 들어 내인성 유전자위 또는 유전자, 또는 그 안의 유전자의 일부(예를 들어 엑손)의 절제(ablation) 또는 "녹아웃"을 포함하여 유전자 생성물 및/또는 편집된 내인성 유전자위를 인코딩하는 통합된 이식유전자를 포함할 수 있다. 본원에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본질적으로 임의의 유전자 생성물은 이식유전자에 의해 인코딩될 수 있고/있거나 본질적으로 임의의 유전자위는 편집물에 대해 표적화될 수 있다. 유전적으로 변형된 간세포의 생산, 및 궁극적으로 생산된 간세포의 특징, 뿐만 아니라 생산된 간세포를 포함하는 세포 집단은 다양할 것이다.
본원에 기술된 연구가 수행될 때까지는, 본원에 기술된 것과 같은 유전적으로 변형된 간세포가 수용자 생체내 생물반응기의 간에서 생산되고 확장되어, 세포 치료법에 필요하는 바와 같이 원하는 유전적 변형을 갖는 실질적인 수의 간세포를 함유하는 치료적 세포 집단을 생성할 수 있는지의 여부가 알려져 있지 않았다. 예를 들어 이종성 유전자 생성물을 인코딩하고/하거나 기술된 유전적 변경을 포함하도록 변형된 이러한 세포가 예를 들어 래트 및 돼지 생물반응기와 같은 생산 생물반응기를 효율적으로 생착시키고 재증식(repopulate)시켜, 실질적인 수의 유전적으로 변형된 간세포를 포함하는 유용한 확장된 집단의 생성을 촉진하는지의 여부는 알려져 있지 않은 채로 남아 있었다.
이종이식의 맥락에서, 이종성 간세포는 일반적으로 내인성 간세포와 비교하여 생존 단점을 갖고 있다. 이에 더하여, 유전자 편집 시약을 이용한 유전적 변형은 사실상 예를 들어 하나 이상의 다르게는 정상 내인성 유전자위에서 그리고/또는 통합된 이식유전자를 포함하도록 편집되어 집단의 세포에 부정적인 영향을 미쳐서, 저하된 증식, 세포 표현형의 소실, 증가된 세포 취약성 등을 유발할 수 있다. 이러한 영향은 예를 들어 세포 치료법 또는 세포 치료법 생산 목적을 위해 만들어지거나 사용되는 세포 집단을 포함한 세포 집단 내에서 원하는 유전적 변형 세포의 제시(representation)를 감소시킬 수 있다. 단독으로 또는 숙주 면역 반응과 같은 다른 과정과 조합된 이러한 부정적인 영향은 종래의 기법이 이용될 때 이론에 구애됨 없이 심지어 이식물 생착을 촉진하기 위해 숙주 사전-컨디셔닝이 사용될 때에도 도입된 유전적 변형 세포를 능가하는 내인성 세포로 인해, 이식된 편집 세포의 불충분한 생착, 확장, 복구 및/또는 소실을 초래할 수 있다. 이에 따라, 본원에 제시된 바와 같이 예상치 못하게도, 본원에 기술된 방법의 사용을 통해, 원하는 유전적 변형을 보유하는 실질적인 수의 확장된 간세포를 함유하는 세포 집단이 생산될 수 있다는 것이 발견되었다. 더욱이, 조작된 세포 집단 내 원하는 유전적 변형을 갖는 간세포의 백분율은 놀랍게도, 이종이식 및 생체내 생물반응기 확장 전과 후에 실질적으로 일정하게 유지되는 것으로 발견되었으며, 이는 비변형된 세포 및 변형된 세포의 숙주 내에서의 필적할 만한 적합성(fitness)을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 간세포는, 간세포, 및/또는 간세포 선조세포를 함유하는 세포 집단을, 이식유전자를 포함하는 통합 벡터와 접촉시킴으로써 생산될 수 있다. 통합 벡터, 및 세포가 통합 벡터와 접촉되는 조건은 일반적으로, 이식유전자가 세포 집단의 간세포 또는 간세포 선조세포 내로 기능적으로 통합되도록 배치될 것이다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 예를 들어 상동성 유도 수선(HDR: homology directed repair) 또는 다른 수선 과정이 예컨대 비제한적으로 예를 들어 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR 관련(Cas) 단백질과 같은 뉴클레아제의 사용을 통해 촉진되는 과정을 포함한 HDR 또는 다른 DNA 수선 과정에 의해 통합될 수 있다.
저면역원성 간세포, 간세포 및/또는 이의 선조세포를 생산하는 것은 자연 살해(NK) 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 그러므로, NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자의 기능적 통합을 기술하는 구체적인 예가 본원에 제공된다. 그러나, 본 개시내용은 이런 식으로 제한되지 않고, 당업자는 예를 들어 본질적으로 임의의 적합한 그리고 적절한 인코딩된 유전자 생성물의 기능적 통합을 제공하기 위해 관심의 임의의 다른 서열이 기술된 이식유전자를 대체하거나, 변형시키거나, 이에 첨가하도록 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 이와 같이, 예를 들어 NK 유인 수용체와 같은 특정 유전자 생성물을 인코딩하는 특정 이식유전자에 대한 본원의 설명은 본질적으로 임의의 유전자 생성물을 유전적으로 인코딩하는 이식유전자의 용도의 설명을 또한 제공하기 위해 쉽게 이해될 것이다.
예를 들어, 단일유전자 질환을 치료하는 데 유용한 조작된 간세포를 생산하기 위해, 간세포 및/또는 이의 선조세포는 단일유전자 질환에서 교란된 유전자 생성물의 기능적 버전을 인코딩하는 이식유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된다. 단일유전자 질환을 치료하기 위해 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포 내로 기능적으로 통합시키는 데 유용한 이식유전자의 비제한적인 예는 인자 IX, 인자 VIII, 폰빌레브란트 인자, 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1), N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC), 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA), 페닐알라닌 하이드록실라제 효소(PAH), 아르기나제-1, 알파-1 항트립신(AAT), 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH) 등 및 이들의 조합(예를 들어 융합 및/또는 다시스트론성 또는 이시스트론성 버전)의 전체-길이 및/또는 변형된 및/또는 변이체 형태를 인코딩하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "기능적으로 통합된"이란 일반적으로, 인코딩된 유전자 생성물이 발현되도록 이식유전자가 세포의 게놈 내로 통합되는 것으로 의미된다. 인코딩된 유전자 생성물의 발현은 세포의 내인성 구성요소 또는 이식유전자에 포함된 외인성(이종성 포함) 구성요소에 의해 전반적으로 또는 부분적으로 제어될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 인코딩된 유전자 생성물의 발현은 이식유전자가 삽입되는 게놈 유전자위에서 또는 그 부근에서 하나 이상의 내인성 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등에 의해 제어될 수 있다. 일부 경우, 인코딩된 유전자 생성물의 발현은, 삽입 전에 이식유전자에 존재하고 인코딩된 유전자 생성물에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 외인성(이종성 포함) 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등에 의해 제어될 수 있다. 이식유전자의 통합은 간세포 또는 간세포 선조세포와 같은 세포가 유전적으로 변형되어 예를 들어 유전적으로 변형된 간세포 또는 유전적으로 변형된 간세포 선조세포를 생산하게 한다.
이식유전자의 기능적 통합은 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터를 포함한 통합 벡터의 사용을 통하는 것을 포함한 다양한 수단을 통해 달성될 수 있다. 일부 경우, 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 일부 경우, 비(non)-레트로바이러스 통합 벡터가 이용될 수 있다. 통합 벡터는 적합한 형질도입 매질에서, 적합한 농도(또는 감염 다중도)로, 그리고 벡터가 표적 세포를 감염시키기에 적합한 시간 동안 표적 세포와 접촉되어, 이식유전자의 기능적 통합을 용이하게 할 수 있다.
예를 들어 적합한 배지에서의 적합한 인큐베이션 및/또는 형질도입(및/또는 적용 가능한 경우 형질주입) 시간은 다양할 것이다. 일부 경우, 적합한 인큐베이션(또는 형질도입 및/또는 형질주입) 시간은 8시간 이하, 8시간 미만, 6시간 이하, 6시간 미만, 5시간 이하, 5시간 미만, 4시간 이하, 4시간 미만, 3시간 이하, 3시간 미만, 2시간 이하일 수 있다. 일부 경우, 인큐베이션(또는 형질도입 및/또는 형질주입)은 교반과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어 적합한 속도 및 예를 들어 37℃ 또는 약 37℃와 같은 형질도입 온도에서 수행되는 수평형 요동(rocking)/진탕(shaking), 장동(nutation) 및 유사한 모션과 같은 요동을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 교반 방법이 이용될 수 있다. 일부 경우, 8시간 이하, 8시간 미만, 6시간 이하, 6시간 미만, 5시간 이하, 5시간 미만, 4시간 이하, 4시간 미만, 3시간 이하, 3시간 미만, 2시간 이하의 인큐베이션(또는 형질도입 및/또는 형질주입) 시간은 처리된 세포에 미치는 유해 효과를 방지하거나, 제한하거나 다르게는 경감시켜, (예를 들어 더 긴 시간과 비교하여) 예를 들어 증강된 형질도입 및/또는 형질주입 효율 및/또는 향상된 생존력을 통해 원하는 유전적 변형 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 이식유전자의 기능적 통합 및/또는 편집 조성물의 구성요소의 전달에 유용한 방법은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 통합 또는 비통합일 수 있다. 유용한 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 하이브리드 Ad-AAV 벡터 시스템 등을 포함한다. 바이러스 벡터는 일부 경우, 예를 들어 뉴클레아제(예를 들어 ZFN, TALEN, Cas 단백질 등) 인코딩 핵산, 뉴클레아제(예를 들어 ZFN, TALEN, Cas 등) 단백질, Cas9 인코딩 핵산, Cas9 단백질, 가이드 RNA(gRNA), 리보핵단백질(RNP) 등과 같은 유전자 편집 구성요소의 전달과 같은 본원에 기술된 방법의 다른 양태에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 이식유전자의 기능적 통합 및/또는 편집 조성물의 구성요소의 전달에 유용한 방법은 비바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 유용한 비바이러스 벡터는 다양할 것이고, 일반적으로 바이러스 입자를 이용하지 않는 전달 수단을 지칭하고 일반적으로 나상(naked) 핵산, 입자 기반(예를 들어 나노입자), 또는 화학물질 기반의 3가지 범주로 분류되는 것으로 간주될 수 있다. 비바이러스 벡터의 비제한적인 예는 리포플렉스(예를 들어 양이온성 지질-기반 리포플렉스), 에멀젼(예를 들어 지질 나노 에멀젼과 같은), 지질 나노입자(LNP), 고체 지질 나노입자, 펩타이드-기반 벡터, 중합체-기반 벡터(예를 들어 폴리머좀, 폴리플렉스, 폴리에틸렌이민(PEI)-기반 벡터, 키토산-기반 벡터, 폴리(DL-락타이드)(PLA) 및 폴리(DL-락타이드-코-글리코사이드)(PLGA)-기반 벡터, 덴드리머, 비닐 기반 중합체(예를 들어 폴리메타크릴레이트-기반 벡터) 등), 무기 나노입자 등을 포함한다. 비바이러스 벡터는 일부 경우, 예를 들어 뉴클레아제(예를 들어 ZFN, TALEN, Cas 단백질 등) 인코딩 핵산, 뉴클레아제(예를 들어 ZFN, TALEN, Cas 등) 단백질, Cas9 인코딩 핵산, Cas9 단백질, gRNA, RNP 등과 같은 유전자 편집 구성요소의 전달과 같은 본원에 기술된 방법의 다른 양태에서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 세포 집단은 일반적으로 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함할 것이다. 일부 경우, 세포 집단은 간세포 및/또는 간세포 선조세포에 대해 고도로 농화(enriched)될 수 있다. "고도로 농화된"이란, 관심 세포 유형(들)이 세포 조성물 중 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들어 세포 조성물 중 약 95% 이상 또는 98% 이상일 것임을 의미한다. 다시 말해, 집단은 관심 세포 유형(들)의 실질적으로 순수한 조성물일 수 있다. 일부 경우, 관심 세포 집단은 조(crude) 조제물을 포함할 수 있다. 일부 경우, 세포 집단은 해리된 조직으로부터 제조되거나, 여과되거나 여과되지 않을 수 있다. 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 함유하는 세포 집단은 예를 들어 단리 및/또는 제조 방법에 따라 예를 들어 간 비실질 세포(NPC: non-parenchymal cell), 비-간세포 간 연관 세포(예를 들어 성상 세포, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 쓸개 세포 등), 면역 세포(예를 들어 WBC), RBC 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 비-간세포 세포 유형을 포함하거나 배제할 수 있다. 일부 경우, 세포 집단은 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 순수한 또는 본질적으로 순수한 조제물일 수 있다.
일부 경우, 세포 집단은 예를 들어 인간 간, 비인간 포유류 간, 설치류 간, 래트 간, 마우스 간, 돼지 간, 비인간 영장류(NHP) 간 등과 같은 하나 이상의 포유류 간으로부터 제조될 수 있다. 일부 경우, 세포 집단 또는 다수의 세포 집단, 또는 다수의 세포 집단 중 집단의 모든 조작된 세포를 포함한 조작된 세포는 모두 단일 인간 간, 예컨대 단일 사체 공여자 간으로부터 유래되거나 제조될 수 있다. 세포 집단의 세포는 모두 하나의 종(예를 들어 인간, 마우스, 래트, 돼지, NHP 등)일 수 있거나 2개 이상의 종의 혼합물(즉, 이종성 혼합물)일 수 있다. 이종성 세포 혼합물은 비인간 세포와 혼합된 인간 세포(예를 들어 인간-래트 혼합물, 인간-마우스 혼합물, 인간-돼지 혼합물, 인간-NHP 혼합물, 래트-마우스 혼합물, 래트-돼지 혼합물 등과 같은)를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 간의 공급원은 다양할 것이며, 예를 들어 절제된 간 조직, 사체 인간 간, 키메라(예를 들어 인간화) 간, 생물반응기 간 등을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 세포 집단은 예를 들어 해리, 관류, 여과, 분류 등과 같으나 이로 제한되지 않는 임의의 편리한 방법에 따라 그리고/또는 이를 포함하여 전체 간 및 간 부분을 포함한 간으로부터 제조될 수 있다.
일부 경우, 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 간세포 또는 인간 간세포를 포함하여 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 단일 공여자 간 또는 단일 공여자 간의 일부로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 간세포 또는 인간 간세포를 포함하여 세포 집단의 세포는 다수의 상이한 공여자 간 또는 다수의 상이한 공여자 간의 부분으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 단일 인간 공여자 간으로부터 수집된 1차 인간 간세포가 2x 이상, 5x 이상, 10x 이상, 20x 이상, 50x 이상, 100x 이상 등을 포함하는 많은 배수로 확장되어 예를 들어 복수의 대상체를 치료하는 데 유용한 복수의 세포 집단을 생성하는 경우를 포함하여 다수의 세포 집단은 단일 공여자 간으로부터 유래될 수 있다.
일부 경우, 세포 집단은 배양된 간세포 및/또는 배양된 간세포 선조세포로부터 제조될 수 있다. 일부 경우, 세포 집단은 예를 들어 1차 인간 간세포(PHH)를 포함하는 인간 간으로부터 제조된 세포 집단을 포함하여 1차 간 세포 조제물로부터 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 집단은 예를 들어 인간 공여자로부터 임의의 공급원에 대한 표준 기법을 사용하여 단리된 간세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 간세포는 신선한 PHH 또는 동결보존된 PHH를 포함하는 스크리닝된 사체 공여자로부터 단리된 PHH이다. 일부 경우, 세포 집단의 PHH는 간으로부터의 단리 이후 세포 주기/분열을 전혀 겪지 않았거나, 예를 들어 1회 이하, 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 6회 이하, 7회 이하, 8회 이하, 9회 이하, 10회 이하의 주기/분열을 포함하지만 이로 제한되지 않는 최소수의 세포 주기/분열을 겪었다.
일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 함유하는 세포 집단은, 불멸화된 세포주가 아니거나 다르게는 본질적으로 영속적으로 전파되는 세포주가 아닌 세포로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 집단의 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 예를 들어 1차 간 세포의 비불멸화된(non-immortalized) 자손을 포함한 1차 간 세포 및 1차 간 세포의 자손으로부터 유래될 수 있다.
일부 경우, 세포 집단은 간세포 선조세포를 포함할 수 있거나, 구체적으로 배제할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "간세포 선조세포" 및 "간세포의 선조세포" 등은 일반적으로 간세포가 유래되는 세포 및/또는 간세포로 분화되는 세포를 지칭한다. 일부 경우, 간세포 선조세포는 수임(committed) 선조세포일 수 있으며, 이는 선조세포가 본질적으로 간세포로만 분화될 것임을 의미한다. 일부 경우, 간세포 선조세포는 다양화된 잠재력을 가질 수 있으며, 예를 들어 만능성, 다능성 또는 전능성 선조세포일 수 있다. 간세포 선조세포는 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC), 배아 줄기(ES) 세포, 간세포-유사 세포(HLC) 등을 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 간세포 선조세포는 성숙한 간세포 및/또는 다른 비-간세포 세포로부터 예를 들어 간세포의 탈분화 및/또는 다른 간 또는 비-간 세포 유형의 전환분화(transdifferentiation)를 통해 유래될 수 있다.
간세포의 확장된 세포 집단을 포함한 본 개시내용의 세포 집단 또는 하위집단의 세포는 예를 들어 단일 공여자로부터 수득되는 다수의 개별 간세포 또는 다수의 공여자로부터 수득되는 다수의 개별 간세포를 포함한 다수의 개별 세포로부터 유래되거나 파생될 수 있다. 1차 세포의 집단이 단일 공여자로부터 유래되는 경우, 이러한 다수의 개별 세포는 본질적으로 동일한 공여자 게놈을 공유하지만, 그러나 클론적으로 유래되지 않으며, 단일클론이 아니고, 일부 경우 예를 들어 상이한 유전적 변이, 상이한 후생학적 변이, 공여자 간에 있어서 상이한 대상 분포(zonation), 유전자 발현의 차이 등을 포함하여 특정한 차이를 서로 함유할 수 있다. 이에, 클론적으로-유래된 세포 집단과 대조적으로, 단일 공여자 또는 다수의 공여자로부터의 1차 간세포를 포함한 복수의 개별 1차 간세포로부터 확장된 세포 집단은 비-단일클론으로 지칭될 수 있거나, 일부 경우 이러한 확장된 세포는 다클론 또는 비-클론적으로 확장되는 것으로 지칭될 수 있다. 일부 경우, 본 개시내용의 유전적 변형은 집단의 개별 1차 간세포(또는 이의 자손) 상에서 수행되어 조작된 간세포의 비-단일클론 집단을 생성할 수 있고, 이러한 세포는 확장되어 비-단일클론의 조작된 간세포의 확장된 집단을 생성할 수 있다. 일부 경우, 간세포 집단은 확장되어 본질적으로 다클론 집단을 생성할 수 있으며, 이는 후속적으로 유전적으로 변형되어 비-단일클론의 조작된 간세포의 확장된 집단을 생성한다.
일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포, 및/또는 이러한 간세포 및/또는 간세포 선조세포가 유래되는 간, 대상체 및/또는 세포 배양물은 건강한 간세포 및/또는 간세포 선조세포일 수 있다. 본원에 사용된 "건강한 간세포 및/또는 간세포 선조세포"란, 세포가 정상 간 및/또는 간세포 연관 기능에서 또는 이에 영향을 미칠 만한 기능적 및/또는 유전적 결핍 또는 결함이 본질적으로 없는 정상 간세포 표현형 및/또는 유전자형을 나타냄을 의미한다. 간세포-연관 기능은 예를 들어 간 대사(예를 들어 간세포 대사), 암모니아 대사, 아미노산 대사(생합성 및/또는 이화작용), 해독, 간 단백질(예를 들어 알부민, 피브리노겐, 프로트롬빈, 응고 인자(예를 들어 인자 V, VII, IX, X, XI 및 XII), 단백질 C, 단백질 S, 항트롬빈, 지질단백질, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 보체 단백질) 합성과 같이 간에서 간세포에 의해 주로 또는 배제적으로 수행되는 기능을 포함한다. 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 본원에 기술된 바와 같은 유전적 변형(들) 전에, 동안에 그리고/또는 후에 건강할 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 예를 들어 세포의 이종성 이식유전자를 기능적으로 통합시키고/시키거나 하나 이상의 내인성 유전자좌를 변형시키기 위해 유전적 변형 전에 그리고 후에 건강한 세포일 수 있다. 일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 결함 질환-연관 대립유전자 또는 유전자위의 교정 후 건강하다.
건강한 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 일반적으로 예를 들어 유전성 담즙정체 장애, 윌슨 질환, 유전성 혈색소침착증, 티로신혈증, α1 항트립신 결핍증, 요소 회로 장애, 크리글러-나자르 증후군, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 1형 원발성 고옥살산뇨증, 비정형 용혈 요독 증후군-1 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 간-연관 단일유전자 질환과 연관된 유전적 변경을 보유하는 세포를 배제할 것이다. 이에, 건강한 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 예를 들어 ABCB11(BSEP), AGXT, ARG, ASL, ASS, ATP7B, ATP8B1(즉, FIC1), CFH, CPS, FAH, HAMP, HFE, JAG1, JH, MDR3(ABCB4), NAGS, OTC, PI, SLC40A1, TFR2, TTR, UGT1A1 등과 같으나 이로 제한되지 않는 간-연관 단일유전자 질환과 상응하는 유전자위 및/또는 유전자에서 정상유전자/대립유전자(즉, 비-질환 연관 유전자/대립유전자, 즉, 질환-연관 유전자/대립유전자를 함유하지 않음)를 함유할 수 있다. 간-연관 단일유전자 질환에 상응하는 유전자의 추가 예 및 설명은 문헌[Fagiuoli et al. J Hepatol (2013) 59(3):595-612]에서 찾을 수 있으며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 간-연관 단일유전자 질환과 연관된 하나 이상의 유전적 변경을 보유하는 세포는 본원에서 "질환", "질환에 걸린", "질환-연관", "기능장애" 또는 "결함" 세포 등으로 지칭될 수 있다.
간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함한 세포 집단은 살아 있는 유기체의 외부에서, 즉, 생체외에서 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 이러한 조작은 일부 경우, 냉동, 해동, 배양, 여과, 농화, 정제, 단리, 형질주입, 형질도입 등을 포함할 수 있거나 구체적으로 배제할 수 있다. 일부 경우, 세포는 동결된 경우 해동되고, 임의의 적합한 용기 또는 배양 용기에 배치된다. 일부 경우, 세포는 적합한 배양 배지에서 부가적인 구성요소와 함께 또는 없이 배양된다.
다양한 적합한 배양 배지가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 배지는 간세포 기본 배지, FBS 및/또는 ROCK 저해제, 예를 들어 간세포 기본 배지와 Lonza HCM™ Single Quots™의 1:1 혼합물, 5% FBS 및 10 μM Rho 키나제(ROCK) 저해제를 포함한다. 예를 들어, Liebovitz L-15, 최소 필수 배지(MEM), DMEM/F-12, RPMI 1640, Waymouth의 MB 752/1 윌리엄스 배지 E, H 1777, 간세포 해동 배지(HTM), 동결보존된 간세포 리커버리 배지(CHRM®), 인간 간세포 배양 배지(Millipore Sigma), 인간 간세포 평판배양 배지(Millipore Sigma), 인간 간세포 해동 배지(Millipore Sigma), Lonza HCM™, Lonza HBM™, HepatoZYME-SFM(Thermo Fisher Scientific), Cellartis 파워 1차 HEP 배지(Cellartis) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 간세포-호환 배양 배지가 입수 가능하다. 예를 들어 Lonza Single Quots™ 보충물, HepExtend™ 보충물, 우태 혈청, ROCK 저해제, 덱사메타손, 인슐린, HEGF, 하이드로코르티손, L-글루타민, GlutaMAX™, 완충제(예를 들어 HEPES, 중탄산나트륨 완충제 등), 트랜스페린, 셀레늄 복합체, BSA, 리놀레산, 콜라겐, 콜라게나제, Geltrex™, 메틸셀룰로스, 디메틸 설폭사이드, 히알루로니다제, 아스코르브산, 항생제 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 배양 보충물 및/또는 기질이 원하는 배지에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다. 간세포-호환 배지는 일반 사용일 수 있거나 1차, 2차 또는 불멸화 간세포를 위해 특수 제형화될 수 있으며, 이러한 배지는 혈청 또는 성장 인자를 함유하거나 혈청-무함유, 성장 인자-무함유, 또는 최소/감소된 성장 인자로 구성될 수 있다.
일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들어 미국 특허 출원 제16/938,059호(미국 특허 공보 제20210024885호) 및 국제출원 PCT/US 2020/043439호(WO 2021/021612A1호)에 기술된 바와 같은 생체외 조작을 포함하지만 이로 제한되지 않는 생체외 조작을 받을 수 있으며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 이러한 생체외 조작은 수행되는 경우, 예를 들어 단일 후, 생물반응기 내로의 이식 전, (예를 들어 병태에 대해 대상체를 치료하기 위해) 대상체에게의 투여 전 등과 같으나 이로 제한되지 않는 다양한 시점에서 본원에 기술된 방법으로 이용될 수 있다.
일부 경우, 신선하게 제조된 간세포 및/또는 간세포 선조세포, 또는 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 함유하는 세포 집단은 예를 들어 편집 조성물, 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자 등을 포함한 다양한 시약, 조성물 및/또는 벡터와 접촉될 수 있다. 이러한 신선하게 제조된 세포는 신선하게 해동된 세포(예를 들어 이전에 동결보존되었다면), 살아 있는 대상체(예를 들어 인간, 설치류, 돼지 등)로부터 신선하게 단리된 세포, 간 또는 이의 일부(예를 들어 사체 간 또는 이의 일부, 생체내 생물반응기로부터 수득된 간(또는 이의 일부) 등)로부터 신선하게 단리된 세포 등을 포함할 수 있다.
복수의 유전적으로 변형된 세포가 단일 유전적 변형 또는 다수의 변형을 포함하는 경우를 포함하여 이러한 변형된 세포를 함유하는 세포 집단이 생성될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 저면역원성으로 유전적으로 변형된 복수의 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단이 생성될 수 있으며, 따라서 이러한 집단은 복수의 저면역원성 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함할 수 있다. 총 세포 집단에 관하여 복수의 세포의 크기는 다양할 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 복수는 예를 들어 복수가 세포 집단 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 이루는 경우를 포함하지만 이로 제한되지 않는 집단의 모든 세포보다 적은 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 복수의 세포는 특정 세포 집단 중 모두 또는 100%를 이룰 수 있다.
일부 경우, 세포 집단은 저면역이 되도록 변형된 복수의 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 예를 들어 총 세포 집단에 관하여 복수는 세포 집단 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 이룬다.
일부 경우, 세포 집단은 특정 이식유전자를 포함하도록 변형된 복수의 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 예를 들어 총 세포 집단에 관하여 복수는 세포 집단 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 이룬다.
일부 경우, 생물반응기에서 확장 전 및/또는 후 세포 집단은 원하는 유전적으로 변형된 간세포 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 경우, 생물반응기에서 확장 전과 후에 입력 및 출력 세포 집단은 각각 원하는 유전적 변형을 갖는 복수의 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 입력 및 출력 집단 내 복수는 서로의 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 내에 있는 전체 입력 및 출력 집단의 백분율을 포함할 수 있다.
유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하여 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 함유하는 세포 집단은 예를 들어 치료 목적을 위해 인간 또는 비인간 대상체, 확장 및/또는 연구 목적 등을 위해 비인간 대상체를 포함한 대상체 내로 도입되거나 이식될 수 있다. 충분한 조건 하에 수행될 때, 대상체 내로 도입된 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 대상체의 간 내로의 생착을 포함하여 생착될 수 있다. 일부 경우, 생착은 예를 들어 캡슐화 기법의 사용을 통해 방지될 수 있다. 비(non)생착 치료 세포는 예를 들어 복강내 공간, 망낭(omental bursa) 및/또는 다른 적합한 위치에의 캡슐화된 간세포의 적용을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 방법을 통해 전달될 수 있다.
간세포 및/또는 간세포 선조세포를 간 내로 도입하기 위한 임의의 적합한 접근법이 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 간 내로 도입하는 것은 간세포를 수용자의 간에 전달하는 단계를 포함한다. 하나의 비제한적 예에서, 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 비장 주사(예를 들어 개복술 비장 주사 또는 경피 비장 주사)를 통해 간 내로 도입될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 생착된 세포가 비인간 동물의 간에 존재하는 경우를 포함하여 본원에 기술된 간세포 및/또는 간세포 선조세포 세포의 생착된 집단을 포함하는 비인간 동물을 포함한다. 예를 들어 일부 경우, 비인간 동물은 예를 들어 생착된 세포가 저면역원성이 되도록 유전적으로 변형되거나, 치료적 이식유전자를 포함하거나 둘 다일 수 있는 경우를 포함하여, 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 생착된 집단을 포함할 수 있다. 유용한 비인간 동물은 예를 들어 설치류, 뮤린(예를 들어 래트, 마우스), 토끼목(예를 들어 토끼), 비인간 영장류, 개, 고양이, 유제류(예를 들어 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등과 같으나 이로 제한되지 않는 비인간 포유류를 포함한다.
일부 경우, 비인간 동물은 생체내 생물반응기로서 역할을 할 수 있다. 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단은 이식된 세포의 확장에 적합한 조건 하에 생물반응기 내로의 이식 및 생체내 생물반응기의 유지에 의해 확장될 수 있다. 적합한 생체내 생물반응기는 예를 들어 설치류 생물반응기, 예컨대 마우스 생물반응기 및 래트 생물반응기, 돼지 생물반응기 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
간세포의 확장에 적합한 동물 생물반응기는 다양할 것이다. 특정 실시형태에서, 동물은 하나 이상의 유전자위에서 유전적으로 변형된다. 유전적 변형은 하나 이상의 유전자위 또는 하나 이상의 표적 유전자의 활성화가 결핍된 동물을 생성하기 위한 녹아웃 또는 녹다운을 포함할 수 있다. 유전적 변형은 여러 유전자위에서 임의의 조합(하나 이상의 억제 변형 및/또는 하나 이상의 활성화 변형)으로 이루어질 수 있다. 생체내 생물반응기에서 유용한 유전적 변형은 면역 유전자(예를 들어 면역결핍을 초래함), 간 기능 유전자(예를 들어 간 기능 결핍을 초래함), 대사 유전자(예를 들어 대사 결핍을 초래함), 아미노산 이화작용 유전자(예를 들어 아미노산 이화작용 결핍을 초래함) 등을 포함한 다양한 유전자의 변형을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 유용한 유전적으로 변형된 동물은 예를 들어 미국 특허 제8,569,573호; 제9,000,257호 및 미국 특허 공보 제20160249591호에 기술된 바와 같이 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(fah)-결핍 동물이며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. FAH는 티로신 이화작용의 마지막 단계를 촉매하는 대사 효소이다. Fah 유전자의 동형접합 결실을 갖는 동물은 변경된 간 mRNA 발현 및 심각한 간 기능장애를 나타낸다. Fah 유전자의 점 돌연변이는 또한 간부전 및 출생 후 치사율을 야기하는 것으로 나타났다. Fah가 결핍된 인간에서는 간 질환 1형 유전성 티로신혈증(HT1)이 발증되고, 간부전이 발증된다. Fah 결핍은 강력한 산화제인 푸마릴아세토아세테이트의 축적을 유발하며, 이는 궁극적으로 Fah가 결핍된 간세포의 세포 사멸을 유발한다. 따라서, Fah-결핍 동물은 기능적인 fah 유전자를 함유하는 인간을 포함한 다른 종의 간세포로 재증식될 수 있다. 수많은 상이한 종에 대한 fah 게놈, mRNA 및 단백질 서열은 예컨대 GenBank 데이터베이스(예를 들어, 유전자 ID 29383(래트 Fah); 유전자 ID 14085(마우스 Fah); 유전자 ID 610140(개 FAH); 유전자 ID 415482(닭 FAH); 유전자 ID 100049804(말 FAH); 유전자 ID 712716(히말라야 원숭이(rhesus macaque) FAH); 유전자 ID 100408895(마모셋 FAH); 유전자 ID 100589446(긴팔 원숭이 FAH); 유전자 ID 467738(침팬지 FAH); 및 유전자 ID 508721(소 FAH) 참조)에서와 같이 공개적으로 입수 가능하며, 다른 종에서의 fah 게놈 유전자는 생물정보학을 통해 쉽게 확인 가능하다. Fah-결핍 동물은 유전적으로 변형된 fah 유전자위를 포함할 수 있으며, 예를 들어 이러한 동물(예를 들어 마우스, 돼지 또는 래트)이 FAH, RAG-1 또는 RAG-2, 및 IL-2Rγ가 결핍된 경우(일부 경우는 FRG 마우스, FRG 돼지 또는 FRG 래트와 같은 "FRG" 동물로 지칭됨)를 포함하여 다른 유전자위에서 추가의 유전적 변형을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
유용한 유전적 변형은 또한 예를 들어 면역계의 특정 분자 또는 세포 구성요소의 결여, 면역계의 특정 분자 또는 세포 구성요소의 기능성 등으로부터 면역결핍을 초래하는 변형을 포함한다. 일부 경우, 유용한 유전적 변경은 재조합 활성화 유전자 1(Rag1) 유전자의 유전적 변경을 포함한다. Rag1은 면역글로불린 V(D)J 재조합의 활성화에 관여하는 유전자이다. RAG1 단백질은 DNA 기질의 인식에 관여하지만, 안정한 결합 및 절단 활성은 또한 RAG2를 필요로 한다. Rag-1-결핍 동물은 성숙한 B 및 T 림프구를 갖지 않는 것으로 나타났다. 일부 경우, 유용한 유전적 변경은 재조합 활성화 유전자 2(Rag2) 유전자의 유전적 변경을 포함한다. Rag2는 면역글로불린과 T 세포 수용체 유전자위의 재조합에 관여하는 유전자이다. Rag2 유전자가 결핍된 동물은 V(D)J 재조합을 겪을 수 없어서, 기능적 T 세포와 B 세포가 완전히 상실된다(예를 들어 문헌[Shinkai et al. Cell 68:855-867, 1992] 참조). 일부 경우, 유용한 유전적 변경은 인터류킨 수용체의 공통 감마 사슬(Il2rg)의 유전적 변경을 포함한다. Il2rg는 인터류킨 수용체의 공통 감마 사슬을 인코딩하는 유전자이다. Il2rg는 IL-2, IL-4, IL-7 및 IL-15를 포함한 수많은 인터류킨에 대한 수용체의 구성요소이다(예를 들어 문헌[Di Santo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:377-381, 1995] 참조). Il2rg가 결핍된 동물은 B 세포 및 T 세포 감소를 나타내고, 자연 살해 세포가 결여되어 있다. Il2rg는 또한 인터류킨-2 수용체 감마 사슬로 지칭될 수 있다.
일부 경우, 예를 들어 면역억제가 하나 이상의 면역억제제의 투여를 통해 달성되는 경우를 포함하여 동물은 면역억제될 수 있다. 동물에서 면역억제를 달성하는 데 효과적인 임의의 적합한 면역억제제 또는 제제들이 사용될 수 있다. 면역억제제의 예에는 FK506, 사이클로스포린 A, 플루다라빈, 미코페놀레이트, 프레드니손, 라파마이신 및 아자티오프린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 면역억제제의 조합도 투여될 수 있다. 일부 경우, 유전적 면역결핍 대신 면역억제제가 이용된다. 일부 경우, 면역억제제가 유전적 면역결핍과 조합되어 이용된다.
본원에 요약된 바와 같이, 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의(즉, 조합) 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 동물은 rag1 유전적 변형, rag2 유전적 변형, IL2rg 유전적 변형을 포함할 수 있거나, 이러한 동물은 유전자 변경이 상응하게는 기능적 RAG1 단백질, RAG2 단백질, IL-2rg 단백질, 또는 RAG-1/RAG-2 단백질 및 IL-2rg 단백질의 발현 손실을 초래하도록 rag1 또는 rag2 유전적 변형 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함할 수 있다. 일례에서, 하나 이상의 유전적 변경은 Rag2 유전자의 유전적 변경 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함한다. 일례에서, 하나 이상의 유전적 변경은 Rag1 유전자의 유전적 변경 및 Il2rg 유전자의 유전적 변경을 포함한다. 일부 경우, 유용한 유전적 변경은 예를 들어 SCID, NOD, SIRPα, 퍼포린, 또는 누드(nude)를 포함한다. 변경된 유전자위는 유전적 무효(null)(즉, 녹아웃) 또는 상응하는 유전자위에서 유전자 생성물의 결핍을 초래하는 다른 변형일 수 있다. 면역계의 특정 세포(예컨대 대식세포 또는 NK 세포) 또한 고갈될 수 있다. 특정 세포 유형을 고갈시키는 임의의 편리한 방법이 이용될 수 있다.
유도적 손상, 선택적 색전증, 일과성 허혈, 레트로르신, 모노크로톨린, 티오아세트아미드, 감마선 조사, 사염화탄소 및/또는 유전적 변형(예를 들어 Fah 교란, uPA, TK-NOG(문헌[Washburn et al., Gastroenterology, 140(4):1334-44, 2011]), 알부민 AFC8, 알부민 디프테리아 독소, 윌슨 질환 등)을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 간세포 이종이식편에 대한 선택적 성장 이점을 생성하는 다양한 간 손상 모델이 간세포 생착 및 확장을 용이하게 하기 위해 동물 생물반응기(예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 돼지)에서 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 간 손상 기법의 조합이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동물은 이종성 간세포의 주사 전에 유로키나제 유전자(예를 들어 유로키나제 플라스미노겐 활성화제(uPA))를 인코딩하는 벡터(예를 들어 Ad 벡터)를 투여받는다. 간세포에서 uPA의 발현은 간 손상을 야기하여, 이식 시 간세포 이종이식편의 선택적 확장을 허용한다. 일 실시형태에서, 유로키나제 유전자는 인간 유로키나제이고, 분비되거나 분비되지 않을 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제8,569,573호; 제9,000,257호 및 미국 특허 공보 제20160249591호를 참조한다.
일부 경우, TK-NOG 간 손상 모델(즉, 알부민 티미딘 키나제 유전자이식-NOD-SCID-인터류킨 공통 감마 사슬 녹아웃)이 본원에 기술된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. TK-NOG 동물은 간사이클로비르 투여에 의해 조건적으로 활성화될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 간독성 이식유전자를 포함한다. 간사이클로비르의 투여 동안 이식유전자의 활성화로 인한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여, 본원에 기술된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다.
일부 경우, AFC8 간 손상 모델(알부민 프로모터에 의해 구동되는 FKBP-카스파제 8 유전자를 갖는 것을 특징으로 함)은 본원에 기술된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. AFC8 동물은 AP20187의 투여에 의해 조건적으로 활성화될 수 있는 FK508-카스파제 8 융합 간독성 이식유전자를 포함한다. AP20187의 투여 동안 이식유전자의 활성화로 인한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여, 본원에 기술된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다.
일부 경우, NSG-PiZ 간 손상 모델(면역결핍(NGS)과 조합된 α-1 항트립신(AAT) 결핍을 갖는 것을 특징으로 함)이 본원에 기술된 바와 같은 동물 생물반응기로서 사용될 수 있다. NSG-PiZ 동물은 AAT의 분비를 손상시켜, 잘못 접힌 PiZ 돌연변이체 AAT 단백질이 축적되어 간세포 손상을 촉발한다. 이러한 간 손상은 간세포 이종이식편에 선택적 이점을 제공하여, 본원에 기술된 바와 같은 이식된 간세포의 확장을 위한 생체내 생물반응기로서 이러한 동물의 사용을 용이하게 한다. 면역결핍은 동물이 상당한 거부 없이 이종이식편을 수용할 수 있게 한다.
일부 경우, 이식된 세포를 보조하는 수용자 간의 능력을 향상시키기 위해 동물은 사전컨디셔닝될 수 있다. 예를 들어, 조사 사전컨디셔닝(예를 들어 부분 간 조사), 색전형성 사전컨디셔닝, 허혈성 사전컨디셔닝, 화학적/바이러스성 사전컨디셔닝(예를 들어 uPA, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 산화질소, 레트로르신, 모노크로탈린, 독성 담즙염, 사염화탄소, 티오아세트아미드 등을 사용함), 간 절제 사전컨디셔닝 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 사전컨디셔닝 요법이 이용될 수 있다. 일부 경우, 간세포-생성 세포는 사전컨디셔닝의 부재 하에 도입될 수 있고/있거나 절차는 예를 들어 본원에 기술된 것들 중 하나 이상을 포함하는 사전컨디셔닝 요법 또는 특정 시약 중 하나, 모두 또는 일부 조합을 구체적으로 배제할 것이다. 일부 경우, NTBC의 중단을 통한 간 손상의 유도 또는 간사이클로비르 또는 AP20187의 투여가 사전컨디셔닝에 사용될 수 있다. 이용되는 경우, 사전컨디셔닝은 예를 들어, 적어도 이식 전 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 60시간, 적어도 72시간, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 또는 적어도 2주를 포함하여 간세포-생성 세포의 이식 전 수시간, 수일 또는 수주 또는 그 이상을 포함하는 특정 시간에 수행될 수 있다.
동물의 선택적인 사전-컨디셔닝(예를 들어 uPA 사용) 후(예를 들어 사전-컨디셔닝 24시간 후), 이종성 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 임의의 적합한 방법을 통해 동물에게 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 (예를 들어 간문맥 주사를 통해) 간에 직접적으로 투여되고/되거나 간세포 및/또는 선조세포가 혈관구조를 통해 이동하여 간에 도달할 비장내 주사를 통해 투여된다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 예를 들어 아데노바이러스 uPA(예를 들어 1.25×109 PFU/25 그램의 마우스 체중)로 사전-컨디셔닝된(예를 들어 투여 24시간 전에) 동물(예를 들어 FRG 동물)에게 1×105 내지 1×109(예를 들어 5×105/마우스, 5 내지 10×106/래트 등) 간세포 및/또는 간세포 선조세포가 도입된다. 생물반응기 내로 도입되는 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 수는 다양할 것이며, 예를 들어 세포를 받는 동물의 종 및 크기를 포함한 다양한 인자에 따라 예를 들어 1×105 내지 1×109, 1×106 내지 1×109, 1×107 내지 1×109, 1×108 내지 1×109, 1×105 내지 1×106, 1×105 내지 1×107, 1×105 내지 1×108, 1×106 내지 1×107, 1×107 내지 1×108, 1×106 내지 1×108 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 1×105 이하 내지 1×109 이상의 범위일 수 있다. 일부 경우, 투여되는 세포의 수는 예를 들어 0.5×109 이하, 1×108 이하, 0.5×108 이하, 1×107 이하, 0.5×107 이하, 1×106 이하, 0.5×106 이하, 1×105 이하 등을 포함하여 1×109 이하일 수 있다. 생물반응기(또는 일반적으로 비인간 동물) 내로 도입된 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 다양할 수 있고, 이러한 세포는 생물반응기(또는 일반적으로 비인간 동물)에 관하여 동종이계 또는 이종성일 수 있다.
또한, 면역 억제 약물은 이종이식된 이종성 간세포로부터 동물(예를 들어 마우스, 돼지 또는 래트)에서 숙주 대 이식편 반응을 제거하기 위해 이식 전, 이식 동안 및/또는 이식 후에 동물에게 선택적으로 주어질 수 있다. 일부 경우, 정의된 기간 동안 동물에서 면역 억제제를 주기에서 제거(cycling off)함으로써, 간 세포는 휴지기로 되고, 생착된 세포는 내인성 간세포(예를 들어 마우스, 돼지 또는 래트 간세포)를 이종성 간세포(예를 들어 인간 간세포)로 대체하는 증식 이점을 가질 것이다. 인간 간세포의 경우, 이는 간의 인간화, 즉, 인간화된 간 수준이 높은 동물을 생성한다. 이종성 간세포 재증식 수준은 예를 들어 이식된 동물의 간 절편의 면역조직화학과 선택적으로 상관 관계가 있는 인간 혈청 알부민 수준의 정량화를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 조치를 통해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 간 질환의 발증을 저해, 지연, 회피 또는 예방하는 제제는 투여된 간세포의 확장 기간 동안 동물 생물반응기에 투여된다. 이러한 제제의 투여는 건강한(예를 들어 FAH-발현) 이종성 간세포에 의한 동물 생물반응기(예를 들어 마우스, 래트 또는 돼지 생물반응기)의 재증식 전에 동물 생물반응기(예를 들어 마우스, 래트 또는 돼지 생물반응기)의 간 기능장애 및/또는 사망을 회피(또는 예방)한다. 제제는 생물반응기와 관련된 질환 모델에서 간 질환을 저해하는 임의의 화합물 또는 조성물일 수 있다. 하나의 이러한 제제는 2-(2-니트로-4-트리플루오로-메틸-벤조일)-1,3 사이클로헥산디온(NTBC)이지만, 메틸-NTBC와 같은 페닐피루베이트 디옥시게나제의 다른 약리학적 저해제가 사용될 수 있다. NTBC는 Fah-결핍 동물에서 간 질환의 발증을 조절하기 위해 투여된다. Fah-결핍 동물 생물반응기에서 간세포 이종이식편의 확장을 촉진하는 한편, 치명적인 간 기능장애를 회피하기 위해 필요에 따라 용량, 투여 일정 및 투여 방법이 조정되고/되거나 주기화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 간세포 이식 후 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 또는 적어도 6일 동안 Fah-결핍 동물에 NTBC가 투여된다. 일부 실시형태에서, Fah-결핍 동물에 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월 동안 NTBC가 추가로 투여된다. 일부 실시형태에서, NTBC(또는 간 보호 효과를 갖는 또 다른 화합물)는 간세포 이식 후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 중단된다.
Fah-결핍 동물에게 투여되는 NTBC의 용량은 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량은 1일당 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 예를 들어, 1일당 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 1일당 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 1일당 약 20 mg/kg이다. NTBC는 음용수, 음식 또는 주사와 같으나 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 음용수 중 투여되는 NTBC의 농도는 약 1 내지 약 30 mg/L, 예를 들어, 약 10 내지 약 25 mg/L, 약 15 내지 약 20 mg/L, 또는 약 20 mg/L이다. 특정 실시형태에서, NTBC 투여는 이식 전부터 이식 후 4주 내지 8주 이상까지로 주기적이다.
이식된 간세포 및/또는 간세포 선조세포로부터 유래된 확장된 간세포는 이식 후 7일 내지 180일(또는 그 사이의 임의의 날) 또는 그 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 기간 후에 동물 생물반응기로부터 수집될 수 있다.
수집 시, 동물 생물반응기의 간은 도입된 간세포, 간세포 선조세포 및/또는 이의 자손(예를 들어 유전적으로 변형된 간세포, 간세포 선조세포 및/또는 이의 자손 포함)과 다양한 정도로 재증식될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 재증식된 동물의 간은 예를 들어 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 재증식을 포함하지만 이로 제한되지 않는 적어도 30% 이상 재증식될 수 있다. 이와 같이, 재증식된 동물의 간세포는 일부 경우, 예를 들어 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 유전적으로 변형된 간세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 30% 이상의 유전적으로 변형된 간세포를 포함할 수 있다. 이에, 수집된 세포 집단은 예를 들어 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 유전적으로 변형된 간세포를 포함하여 유사한 백분율의 유전적으로 변형된 간세포(도입된 세포(예를 들어 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포) 및/또는 이의 자손 포함)를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 확장된 간세포는 이식 후 28일 내지 56일째(또는 그 사이의 임의의 날)에 수집된다. 일부 경우, 간세포는 1주, 2주 또는 그 전, 3주 또는 그 전, 4주 전, 4주 또는 그 전, 5주 또는 그 전, 6주 또는 그 전, 7주 또는 그 전, 8주 전, 8주 또는 그 전, 9주 또는 그 전, 10주 또는 그 전, 11주 또는 그 전, 12주 전, 12주 또는 그 전, 13주 또는 그 전, 14주 전, 또는 14주 또는 그 전에 수집된다.
더욱이, 확장된 간세포는 다수의 기법 중 임의의 기법을 사용하여 동물로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 간세포는 동물의 간의 효소적 소화에 의해 수집된 다음, 부드러운 다지기, 여과 및 원심분리가 이어질 수 있다. 더욱이, 간세포는 생착된 간세포 종의 세포 유형을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 것과 같은 다양한 방법을 사용하여 다른 세포 유형, 조직 및/또는 파편으로부터 분리될 수 있다. 이러한 항체는 항-인간 HLA-A, B, C와 같은 부류 I 주요 조직적합성 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다(문헌[Markus et al. (1997) Cell Transplantation 6:455-462]). 그 후에, 항체 결합 간세포는 패닝(panning)(고체 매트릭스에 부착된 단일클론 항체를 활용함), 형광 활성화 세포 분류(FACS), 자기 비드 분리 등에 의해 분리될 수 있다. 간세포를 수집하는 대체 방법도 이용될 수 있다.
일부 경우, 수집된 간세포는 부가적인 동물 생물반응기에 1회 이상 연속적으로 이식될 수 있다. 연속 이식은 예를 들어 모든 연속 이식에 래트, 돼지, 마우스 또는 토끼를 사용하거나 대안적으로(래트 중 하나 이상, 돼지 중 하나 이상 등에서) 연속 이식에 적합한 동물 생물반응기의 임의의 조합을 사용하여 동일하거나 상이한 종의 동물에서 2, 3, 4회 또는 그 이상 수행될 수 있다.
더욱이, 동물 생물반응기로부터의 간세포의 수집 후, 간세포는 본원에 기술된 바와 같은 다양한 유전적 조작을 받을 수 있다. 예를 들어, 생물반응기로부터 수집된 간세포는 대상체에게 투여 전 예를 들어 이식유전자의 도입 및/또는 하나 이상의 유전적 유전자위의 편집에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 수집되고 선택적으로 단리된 확장된 간세포는 신선하게 사용될 수 있거나 사용 전에 동결보존될 수 있다.
특정 실시형태에서, 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함한 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 캡슐화될 수 있다. 간세포 및/또는 이의 선조세포는 전형적으로 대상체에 투여하기 전에 임의의 방법을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 예를 들어 문헌[Jitraruch et al. (2014) PLOS One 9:10]; 문헌[Dhawan et al. (2020) J Hepatol. 72(5):877-884]; 문헌[Bochenek et al. (2018) Nature Biomedical Engineering 2:810-821]을 참조한다. 반투과성 하이드로겔 내의 세포 캡슐화는 전신 면역억제가 필요 없는 세포-기반 치료법을 위한 국소 면역-단리 전략을 나타낸다. 하이드로겔 구체는 동종이계 세포를 거부할 만한 면역 세포를 배제하는 한편 세포 기능에 필요한 기질, 영양소 및 단백질의 확산을 용이하게 한다. 알기네이트 구체는 이러한 음이온성 다당류가 세포 친화적인 조건 하에 2가 양이온의 존재 하에 하이드로겔을 형성하기 때문에 가장 널리 조사된 세포 캡슐화 물질 중 하나이다. 일부 경우, 예를 들어 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 저면역원성으로 되게 하는 유전적 변형으로 인해, 세포는 캡슐화 없이 투여될 수 있으며, 이와 같이 세포는 비캡슐화된 채로 또는 나상(naked)으로 사용될 수 있다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 생산된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 집단으로 시딩 및/또는 재증식된 탈세포화된 간 또는 다른 무세포화된(acellularized) 스캐폴드(천연 및 합성 스캐폴드 포함)가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단은, 탈세포화된 간 또는 이의 일부 또는 다른 무세포화된 스캐폴드에 (다른 보조 세포 유형과 함께 또는 없이) 도입될 수 있으며, 이는 후속적으로 세포 집단의 간세포 및/또는 세포 집단으로부터 생성된 간세포에 의해 탈세포화된 간 또는 이의 일부의 재증식에 충분한 조건 하에 유지된다.
간, 예컨대 인간 간 또는 돼지와 같은 비인간 포유류 간, 또는 이의 일부가 수득될 수 있고, 선택적으로 (예를 들어 간의 하나 이상의 부분 또는 엽(들)을 단리하기 위해) 외과적으로 처리될 수 있다. 그 후에, 간 또는 이의 일부는 예를 들어 기계적 세포 손상, 동결/해동, 캐뉼러 삽입 및 하나 이상의 탈세포화 시약(예를 들어 하나 이상의 프로테아제(예를 들어 트립신), 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어 DNase), 하나 이상의 계면활성제(예를 들어 소듐 도데실 설페이트, Triton X-100 등)), 하나 이상의 저장성 시약, 하나 이상의 고장성 시약 또는 이들의 조합의 역행성 확산(retrograde profusion) 등을 포함하는 임의의 편리하고 적절한 수단에 의해 탈세포화된다. 탈세포화된 간 또는 이의 일부는 간세포-호환 배지에 저장되고/되거나 미리 침지될 수 있다. 그 후에, 본원에 기술된 바와 같은 생체외 조작된 간세포-생성 세포를 함유하는 세포 현탁액은 예를 들어 주사, 관류, 국소 적용(예를 들어 점적(drop-by-drop)) 또는 이들의 조합과 같은 임의의 편리한 기전에 의해 탈세포화된 간 또는 이의 일부에 적용될 수 있다. 일부 경우, 생체외 조작된 간세포-생성 세포는 예를 들어 50 μL당 1 내지 2 ×106 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 예를 들어 50 μL당 1×105 이하 내지 1×107 이상의 세포 농도를 포함하는 임의의 편리하고 적절한 농도로 준비된 스캐폴드에 시딩하기 위해 세포 현탁액에 존재할 수 있다. 시딩된 탈세포화된 간, 이의 일부 및/또는 다른 무세포화된 스캐폴드는 도입된 세포의 생착/부착 및/또는 확장에 적합한 조건 하에 유지될 수 있으며, 여기서 이러한 조건은 적합한 습도, 온도, 가스 교환, 영양소 등을 포함할 수 있다. 일부 경우, 시딩된 간, 이의 일부 및/또는 다른 무세포화된 스캐폴드는 37℃에서 또는 약 37℃에서 5% CO2와 함께 습윤 환경의 적합한 배양 배지에서 유지될 수 있다. 탈세포화된 간, 이의 일부 또는 다른 무세포화된 스캐폴드에의 또는 그 내에서의 시딩된 및/또는 생성된 간세포의 부착 및/또는 확장 후, 물질은 예를 들어 저하된 간 기능 및/또는 간 질환이 있는 인간 대상체와 같은 이를 필요로 하는 대상체로의 이식을 포함하는 다양한 용도에 이용될 수 있다. 인간 간을 포함한 간의 탈세포화 및 간세포-인지 무세포 스캐폴드의 생산에 관한 방법 및 시약은 예를 들어 문헌[Mazza et al. Sci Rep 5, 13079 (2015)]; 문헌[Mango et al. Adv. Funct. Mater. 2000097 (2020)]; 문헌[Shimoda et al. Sci Rep 9, 1543 (2019)]; 문헌[Croce et al. Biomolecules. 2019, 9(12):813]; 및 미국 특허 제10,688,221호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 생산된 수집된 간세포 집단 및 이의 치료적 또는 약학적 조성물은 적합한 용기(예를 들어 배양 용기, 튜브, 플라스크, 바이알, 크라이오바이알, 크라이오-백 등)에 존재할 수 있으며, 임의의 적합한 전달 방법 및/또는 장치를 사용하여 이용(예를 들어 대상체에게 투여)될 수 있다. 이러한 간세포의 집단 및 약학적 조성물은 제조될 수 있고/있거나 신선하게 사용될 수 있거나 동결보존될 수 있다. 일부 경우, 간세포의 집단 및 이의 약학적 조성물은 예를 들어 세포가 적합한 희석제에 그리고/또는 원하는 전달 농도(예를 들어 단위 투여 형태) 또는 원하는 전달 농도로 (예들 들어, 적합한 희석제 또는 배지를 이용하여) 쉽게 희석될 수 있는 농도로 존재하는 경우를 포함하여 "즉시 사용 가능한" 형식으로 제조될 수 있다. 간세포의 집단 및 이의 약학적 조성물은 예를 들어 주사기, 주입 백 등과 같으나 이로 제한되지 않는 전달 장치 또는 원하는 전달 기전 또는 원하는 전달 경로와 호환 가능한 장치에서 제조될 수 있다.
일부 경우, 본 개시내용은 예를 들어 복수의 용량의 유전적으로 변형된 간세포가 모두 단일 인간 공여자 간으로부터 생성된 간세포 집단, 예를 들어 마스터 세포 뱅크로부터 확장되는 것을 포함하여 유래되는 경우를 포함한 복수의 세포 치료법 용량을 포함하며, 예를 들어 각각의 용량은 적합한 용기에 함유되어 있다. 일부 경우, 본 개시내용은 예를 들어 복수의 용량의 유전적으로 변형된 간세포가 모두 복수의(예를 들어 2개, 2개 이상, 3개 이하, 3개, 3개 이상, 4개 이하, 4개, 4개 이상, 5개 이하, 5개, 5개 이상, 6개 이하, 6개, 6개 이상, 7개 이하, 7개, 7개 이상, 8개 이하, 8개, 8개 이상, 9개 이하, 9개, 9개 이상, 10개 이하, 10개 이상 등) 인간 공여자 간으로부터 생성된 단일 간세포 집단, 예를 들어 마스터 세포 뱅크로부터 확장되는 것을 포함하여 유래되는 경우를 포함한 복수의 세포 치료법 용량을 포함하며, 예를 들어 각각의 용량은 적합한 용기에 함유되어 있다.
복수의 세포 치료법 용량은 여러 가지 방법을 통해 생성될 수 있다. 일부 경우, 인간 간세포는 유전적으로 변형되고, 유전적으로 변형된 간세포는 하나 이상의 생체내 생물반응기에서 확장되어, 복수의 용량을 제형화하는 데 사용되는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성한다. 일부 경우, 하나 이상의 생체내 생물반응기로부터 수득되는 확장된 인간 간세포는 유전적으로 변형되어, 복수의 용량을 제형화하는 데 사용되는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성한다. 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 복수의 간세포 세포 치료법 용량으로 분취(aliquoting)하는 것은 여러 가지 수단에 의해 수행될 수 있으며, 여러 가지 상이한 수의 간세포를 함유하는 여러 가지 상이한 총량의 단위 용량을 초래할 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, 750 또는 1000개의 단위 용량을 포함하는 적어도 2개 용량이 생성될 수 있으며, 예를 들어 이러한 용량 각각은 예를 들어 적어도 1000만, 적어도 2500만, 적어도 5000만, 적어도 7500만, 적어도 1억, 적어도 2억 5000만, 적어도 5억, 적어도 7억 5000만, 적어도 10억, 적어도 20억, 적어도 30억, 적어도 40억, 적어도 50억, 적어도 60억, 적어도 70억, 적어도 80억, 적어도 90억, 적어도 100억, 적어도 150억, 적어도 200억, 적어도 300억, 적어도 400억, 적어도 500억, 적어도 600억, 적어도 700억, 적어도 800억, 적어도 900억 또는 적어도 1000억개의 간세포를 포함한다.
본 개시내용의 방법은 본원에 기술된 세포 치료법 용량에 함유된 간세포가 예를 들어 단일 인간 공여자 간 또는 다수의 인간 공여자 간으로부터 유래되는 경우를 포함하여 이러한 세포 치료법 용량으로 복수의 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 예를 들어 복수의 용량이 각각 적어도 10억(또는 적어도 100억개) 간세포의 적어도 10개 용량을 포함하는 경우, 이러한 방법은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10명의 별개의 대상체를 적어도 10개 용량으로 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 복수의 용량이 각각 적어도 10억(또는 적어도 100억개) 간세포의 적어도 100개 용량을 포함하는 경우, 이러한 방법은 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100명의 별개의 대상체를 적어도 100개 용량으로 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 용량은 동일한 병태를 갖는 다수의 대상체, 뿐만 아니라 상이한 병태를 갖는 다수의 대상체를 포함하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되어, 대상체의 병태를 치료할 수 있다. 이에, 본원에 기술된 방법을 이용함으로써, 치료법을 필요로 하는 다수의 대상체, 일부 경우 많은 대상체는 단일 인간 공여자 간으로부터 수집된 세포 집단으로부터 유래되고 확장된 유전적으로 변형된 간세포를 사용하여 치료될 수 있다.
상기 요약된 바와 같이, 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 유전적 변형은 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자의 기능적 통합을 포함할 수 있다. 본질적으로 임의의 인코딩된 유전자 생성물이 이용될 수 있다. 인코딩된 유전자 생성물은 예를 들어 원핵 또는 진핵 단백질, 예컨대 포유류(예를 들어 인간, 비인간 영장류, 돼지, 래트 마우스 등) 또는 비포유류 단백질, 단백질 단편, 펩타이드, 합성 단백질, 융합 단백질 등을 포함한 재조합 버전의 단백질, 또는 비코딩 핵산 등일 수 있다.
일부 경우, 세포 집단의 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 예를 들어 T 세포 저해 단백질, NK 세포 저해 단백질 등을 포함한 하나 이상의 면역 저해 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 NK 세포 유인 수용체인 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "NK 세포 유인 수용체"는 일반적으로, 세포의 표면 상에서 발현될 때 예를 들어 NK 저해 수용체(예를 들어 KIR, HLA-cl I-특이적 수용체, NKG2 저해 수용체(예를 들어 CD94/NKG2A 헤테로이량체, NKG2B 수용체), LIR-1, 체크포인트 수용체, SIRPα, PD-1(CD279), Siglec-7(CD328), IRP60(CD300a), Tactile(CD96), IL1R8, TIGIT, TIM-3, NKG2A/KLRD1(CD159a/CD94), KIR2DL1(CD158a), KIR2DL2/3(CD158b), (CD158d)a, KIR2DL5(CD158f), KIR3DL1(CD158e1), KIR3DL2(CD158k), ILT2/LIR-1(CD85J), LAG-3(CD223) 등과 같은)에 대한 리간드로서 역할을 함으로써 NK 세포에 의한 사멸화로부터의 보호를 제공하는 포유류(예를 들어 인간) 단백질 수용체 또는 이의 일부, 재조합 또는 합성 수용체 또는 이의 일부 등을 지칭한다. NK 세포 저해 수용체는 HLA-특이적 또는 비-HLA-특이적일 수 있으며, 이와 같이 NK 세포 유인 수용체는 HLA 유래 폴리펩타이드와 비-HLA 유래 폴리펩타이드를 둘 다 포함한다.
유용한 NK 세포 유인 수용체의 비제한적인 예는 예를 들어 HLA 부류 I 단백질 및 이의 단편(예를 들어 HLA 부류 1a 단백질(예를 들어 HLA-A, -B, -C) 및 이의 단편, HLA 부류 1b 단백질(HLA-E, -F, -G, -H) 및 이의 단편), 합성 HLA 부류 I 단백질 융합(예를 들어 HLA 부류 1a 융합, HLA 부류 1b 융합, HLA 부류 1a/1b 융합 등 포함), CD47, PD-L1(CD274), PD-L2(CD273), PVR(CD155), IL-37, Gal-9, PtdSer, HMGB1, CEACAM1, HLA-E, HLA-G, HLA-C1, HLA-C2, HLA-A-Bw4, HLA-B-Bw4, HLA-A*03, HLA-A*11, MHC-I 단백질, MHC-2 단백질, CD80 및 CD86(CTLA-4), LSECtin(LAG3), CD112(TIGIT), CXADR(JAML/AMICA1), HVEM(BTLA) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유용한 HLA 유전자, 대립유전자, 및 이의 단백질은 예를 들어 문헌[Marsh et al. (2010) Tissue Antigens 75:291-455]에 기술된 것을 포함하며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 경우, 유용한 NK 세포 유인 수용체는 예를 들어 본원에 기술된 예시적인 NK 세포 유인 수용체 단백질의 부분 또는 단편만 포함할 수 있거나, 2개 이상의 단백질 및/또는 단백질 단편의 융합, 예를 들어 본원에 기술된 2개 이상의 예시적인 NK 세포 유인 수용체 단백질 및/또는 이의 단편의 융합을 포함할 수 있다.
일부 경우, 유용한 NK 세포 유인 수용체는 예를 들어 HLA-E, HLA-F, HLA-G 또는 HLA-H 중 하나 이상 또는 이의 하나 이상의 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 HLA 부류 1b 융합 단백질을 포함할 수 있다. 유용한 HLA 부류 1b 융합 단백질은 펩타이드 항원, 예를 들어 절단 시 융합 단백질의 펩타이드 결합 틈(binding cleft)을 차지할 수 있는 선택적으로 절단 가능한 펩타이드 항원을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. HLA 부류 1b 융합 단백질에 포함될 수 있는 B2M 및/또는 HLA 부류 Ib 단백질의 유용한 부분은 예를 들어 세포외 도메인, 막관통 도메인, 세포질 도메인, 신호 펩타이드, 신호 서열, 알파1 도메인, 알파2 도메인, 알파3 도메인, 알파 사슬 등을 포함하지만 본질적으로 이로 제한되지 않는다. 일부 경우, HLA 부류 1b 융합 단백질은 하나 이상의 비-HLA 및/또는 비-B2M 부분(즉, HLA 단백질 및/또는 B2M 단백질로부터 유래되지 않는 부분), 예를 들어 글리신 링커, 글리신-세린 링커 등과 같은 합성 링커와 같은 하나 이상의 링커 부분을 포함할 수 있다.
하기는 다양한 NK 세포 유인 수용체에서 전체적으로 또는 부분적으로 단독으로 또는 조합되어 유용한 단백질의 비제한적인 예로서 제공된다. 예시적인 인간 B2M 서열(UniProtKB ID: P61769; NCBI RefSeq: NP_004039.1)은 서열 번호 032이다.
예시적인 인간 HLA-E 서열 (UniProtKB ID: P13747; NCBI RefSeq: NP_005507.3)은 서열 번호 033이다.
예시적인 인간 HLA-G 서열 (UniProtKB ID: P17693; NCBI RefSeq: NP_002118.1)은 서열 번호 034이다.
일부 경우, 유용한 B2M-HLA-E 융합은 선택적으로 예를 들어 서열 번호 035와 같으나 이로 제한되지 않는 HLA-G 신호 서열과 함께 예를 들어 GS-링커를 통해 HLA-E 단편에 융합된 예를 들어 전체-길이 또는 부분-길이 B2M을 포함한다.
일부 경우, 유용한 B2M-HLA-E 융합은 신호 서열(예를 들어 선택적으로 B2M 신호 서열)을, 선택적으로 서열 번호 036과 같으나 이로 제한되지 않는 HLA-E 단편에 링커를 통해 접합된 전체-길이 또는 부분-길이 B2M 서열에 링커를 통해 접합된 절단 가능한 HLA-G 펩타이드(이의 코딩 서열은 본원에서 "B2M-HLA-E 융합"으로 지칭됨)와 함께 포함할 수 있다.
쉽게 명백하게 될 바와 같이, 다른 구성요소 또는 치환 구성요소, 예컨대 링커, 신호 서열, 펩타이드 항원 서열 등과 함께 또는 없이 HLA 부류 I 단백질 서열의 전체-길이 또는 부분-길이, 뿐만 아니라 전체-길이 또는 부분-길이 B2M 서열의 다른 배열은 HLA 부류 I, 부류 1b, HLA-E-B2M 및 HLA-E/G-B2M 융합 등에서 만들어지고 이용될 수 있다. 일부 경우, 유용한 단백질, 융합, 서열, 이의 일부 등은 미국 특허 출원 공보 US 20140134195A1호에 기술된 것을 포함할 수 있으며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
예시적인 인간 CD47(hCD47) 서열은 서열 번호 037이다.
예시적인 절두된 hCD47 서열은 서열 번호 038이다.
일부 경우, 쉽게 이해하게 될 바와 같이, 아미노산 및 핵산 서열, 예컨대 비제한적으로, 본원에 기술된 서열을 포함한 유용한 서열은 기술된 바와 같이 이용될 수 있거나 다양할 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 치환, 결실, 삽입 및/또는 절두 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열, 예컨대 비제한적으로, 본원에 기술된 아미노산 서열은 적어도 1개, 1개, 적어도 2개, 2개 이하, 적어도 3개, 3개 이하, 적어도 4개, 4개 이하, 적어도 5개, 5개 이하, 적어도 6개, 6개 이하, 적어도 7개, 7개 이하, 적어도 8개, 8개 이하, 적어도 9개, 9개 이하, 적어도 10개, 10개 이하, 또는 10개 초과의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우, 핵산 서열은 예를 들어 코돈 최적화된 서열과 같은 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 대체 서열을 가질 수 있다. 일부 경우, 핵산 서열의 하나 이상의 염기 또는 하나 이상의 코돈은 예를 들어 생성된 인코딩된 폴리펩타이드 내 적어도 1개, 1개, 적어도 2개, 2개 이하, 적어도 3개, 3개 이하, 적어도 4개, 4개 이하, 적어도 5개, 5개 이하, 적어도 6개, 6개 이하, 적어도 7개, 7개 이하, 적어도 8개, 8개 이하, 적어도 9개, 9개 이하, 적어도 10개, 10개 이하, 또는 10개 초과의 아미노산 치환과 같은 하나 이상의 치환을 도입하도록 변형될 수 있다. 일부 경우, 아미노산 및 핵산 서열, 예컨대 비제한적으로, 본원에 기술된 이러한 서열을 포함하는 유용한 서열은 본원에 기술된 서열과 100%의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 일부 경우, 아미노산 및 핵산 서열, 예컨대 비제한적으로, 본원에 기술된 이러한 서열을 포함하는 유용한 서열은 예를 들어 본원에 기술된 아미노산 또는 핵산 서열을 포함하지만 이로 제한되지 않는 서열과 예를 들어 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 89%, 적어도 88%, 적어도 87%, 적어도 86%, 적어도 85%, 적어도 84%, 적어도 83%, 적어도 82%, 적어도 81%, 적어도 80%, 적어도 79%, 적어도 78%, 적어도 77%, 적어도 76%, 적어도 75%, 적어도 74%, 적어도 73%, 적어도 72%, 적어도 71%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 35% 또는 적어도 30%의 서열 동일성을 포함하여 본원에 기술된 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
이식유전자 상에 존재하는 유전자 생성물을 인코딩하는 유용한 핵산은 다양할 것이고, 예를 들어 숙주 세포 또는 유기체에서 결함 유전자의 교정, 세포에서 이종성 유전자 생성물의 인코딩 및/또는 발현, 세포에서 내인성 유전자 생성물의 하나 이상의 카피의 인코딩 및/또는 발현, 세포에서 유전자 또는 유전자 생성물의 발현의 저해 등을 포함하는 다양한 기능을 제공할 수 있다. 유용한 핵산은 예를 들어 발현 카세트, 재조합 mRNA, 재조합 벡터 게놈(예를 들어 재조합 바이러스 게놈과 같은), 재조합 플라스미드, 미니서클 플라스미드, 미니유전자, 마이크로유전자, 인공 염색체, 간섭 핵산(예를 들어 siRNA, shRNA 등) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
예를 들어 기능적으로 통합된 이식유전자의 유용한 유전자 생성물은 예를 들어 하나 이상의 단백질 및/또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 비코딩 핵산을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 벡터의 이식유전자 또는 코딩 영역의 유전자 생성물은 예를 들어 뉴클레아제, DNA 염기 편집자, RNA 편집자 등과 같은 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물을 인코딩하는 서열은 단독으로 또는 다른 페이로드 요소와 함께, 예를 들어 마이크로RNA(즉, miRNA), shRNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, lncRNA, 가이드 RNA(gRNA, sgRNA, 등) 등과 같은 비코딩 핵산을 포함할 수 있다.
일부 경우, 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단은 표적 유전자위에서 편집될 수 있다. 예를 들어 간-연관 유전자 및/또는 이의 조절 요소를 포함하는 유전자위, 면역 관련 유전자 및/또는 이의 조절 요소를 포함하는 유전자위 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본질적으로 임의의 유전자위가 표적화될 수 있다. 표적 유전자위에 도입된 편집물은 다양할 수 있으며, 여기서 유용한 편집물은 예를 들어 결실, 삽입, 치환, 프레임시프트 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
유용한 결실의 비제한적인 예는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 염기의 결실; 유전자의 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 기능적 도메인 및/또는 이의 일부의 결실; 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 엑손 및/또는 이의 일부의 결실, 유전자의 모두, 1개의 엑손을 제외한 모두, 2개의 엑손을 제외한 모두 또는 3개의엑손을 제외한 모두의 결실; 유전자의 조절 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서 등)의 결실 등을 포함한다. 유용한 삽입의 비제한적인 예는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 염기의 삽입; 유전자의 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 기능적 도메인 및/또는 이의 일부의 삽입; 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 엑손 및/또는 이의 일부의 삽입, 유전자의 모두, 1개의 엑손을 제외한 모두, 2개의 엑손을 제외한 모두 또는 3개의엑손을 제외한 모두의 삽입; 유전자의 조절 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서 등)의 삽입 등을 포함한다. 도입되는 결실 및/또는 삽입의 크기는 다양할 것이고, 예를 들어 1 내지 400개, 1 내지 350개, 1 내지 300개, 1 내지 250개, 1 내지 200개, 1 내지 150개, 1 내지 100개, 1 내지 50개, 10 내지 400개, 10 내지 350개, 10 내지 300개, 10 내지 250개, 10 내지 200개, 10 내지 150개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 25 내지 400개, 25 내지 350개, 25 내지 300개, 25 내지 250개, 25 내지 200개, 25 내지 150개, 25 내지 100개, 25 내지 50개, 50 내지 400개, 50 내지 350개, 50 내지 300개, 50 내지 250개, 50 내지 200개, 50 내지 150개, 50 내지 100개, 100 내지 400개, 100 내지 350개, 100 내지 300개, 100 내지 250개, 100 내지 200개, 100 내지 500개, 200 내지 500개, 300 내지 500개, 400 내지 500개, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 500개 이하, 400개 이하, 350개 이하, 300개 이하, 250개 이하, 200개 이하, 150개 이하, 100개 이하 또는 50개 이하의 염기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 1개 염기 내지 500개 이상의 염기 범위일 수 있다.
유용한 치환의 비제한적인 예는 미성숙(premature) 정지 코돈을 도입하는 치환; 정지 코돈을 절제하는 치환; 아미노산 변화를 초래하는 치환 등을 포함한다. 핵산 수준에서 하나 또는 다수의 치환(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개 염기의 치환)은 원하는 바와 같이 폴리펩타이드 수준에서 아미노산 치환에 본질적으로 임의의 아미노산을 도입하는 데 이용될 수 있다.
일부 경우, 유용한 편집물은 예를 들어 하나 이상의 면역-관련 유전자, 또는 이러한 유전자의 인코딩된 생성물, 예컨대 면역-관련 단백질과 같으나 이로 제한되지 않는 내인성 유전자의 모두 또는 일부를 절제하거나 결실시킬 수 있거나 다르게는 비기능적인 하나 이상의 내인성 유전자로 되게 할 수 있다. 유전자 및/또는 인코딩된 생성물을 비기능적으로 되게 하는 유전자 또는 이의 일부의 이러한 결실은 녹아웃으로 지칭될 수 있다. 일부 경우, 유전자 또는 이의 유전자 생성물은 예를 들어 프레임시프트를 야기하거나 잘못 접힌 또는 다르게는 비기능성 단백질을 생성하는 삽입의 도입을 통해 비기능성으로 될 수 있다.
일부 경우, 유용한 편집물은 예를 들어 단일유전자 질환의 기능장애 유전자를 포함한 기능장애 유전자를 교정할 수 있다. 일부 경우, 단일유전자 질환은 간-연관 단일유전자 질환(즉, 간-연관이거나 간세포-연관 유전자인 기능장애 유전자로부터 비롯되는 단일유전자 질환)이다. 일부 경우, 단일유전자 질환은 비-간-연관 단일유전자 질환(즉, 간-연관이거나 간세포-연관 유전자가 아닌 기능장애 유전자로부터 비롯되는 단일유전자 질환)이다. 일부 경우, 편집물은 결함성 내인성 유전자위의 교정적 편집물이다. 일부 경우, 편집물은 결함성 내인성 유전자위의 교정적 편집물이 아니다.
일부 경우, 편집물은 이러한 편집물이 간세포 및/또는 간 기능과 연관되지 않은 유전자위에 있도록 비-간세포 및/또는 비-간세포 연관 유전자위 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 간 대사(예를 들어 간세포 대사), 암모니아 대사(예를 들어 요소 회로 포함), 아미노산 대사, 아미노산 생합성, 아미노산 이화작용, 해독, 간(예를 들어 간세포) 단백질(예를 들어 알부민, 피브리노겐, 프로트롬빈, 응고 인자(예를 들어 인자 V, VII, IX, X, XI 및 XII), 단백질 C, 단백질 S, 항트롬빈, 지질단백질, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 보체 단백질, 간세포 프로테옴 및/또는 세크레톰의 단백질(예를 들어 문헌[Franko et al. Nutrients. (2019) 11(8):1795]에 기술된 바와 같음; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨) 포함)의 생합성 등과 같은 간세포 기능 및/또는 간에서 주로 수행되는 기능과 연관된 유전자의 코딩 조절자 영역(예를 들어 엑손) 또는 비코딩 조절자 영역(예를 들어 인트론, 프로모터, 인핸서 등)을 포함함을 의미한다.
일부 경우, 다수의 유전자 편집물은 단일 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 세포는 예를 들어 세포가 2, 3, 4 또는 5개의 이러한 편집물을 포함하는 경우를 포함하여 하나 초과의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어 단일 유전자 내 다수의 편집물, 단일 단백질의 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 사슬 내 편집물, 계열 또는 경로의 2개 이상의 상이한 단백질 내 편집물, 2개 이상의 기능적으로-관련된 단백질(예를 들어 2개 이상의 면역-관련 단백질, 2개 이상의 간-연관 단백질 등) 내 편집물 등을 포함한 편집물의 이러한 유용한 조합이 도입될 수 있다.
다수의 편집물이 도입되고/되거나 세포가 예를 들어 내인성 유전자위에서 편집물의 도입 및 이식유전자의 기능적 통합, 또는 다수의 내인성 유전자위에서 다수의 편집물의 도입 또는 이들의 조합을 통하는 것과 같은 다수의 방식으로 유전적으로 변형되는 경우; 이러한 디수의 편집물/변형은 동시에 그리고/또는 임의의 편리하고 적절한 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 세포 집단은 2개의 상이한 유전적 변형을 만들기 위해 시약과 동시에 또는 본질적으로 동시에 접촉될 수 있다. 일부 경우, 세포 집단은 제1 변형을 만들기 위해 제1 시약 또는 시약 세트와 접촉되고, 후속적으로 제2 변형을 만들기 위해 제2 시약 또는 시약 세트와 접촉될 것이다. 일부 경우, 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 예를 들어 단리, 정제, 농화, 세포 배양, 확장, 분석, 동결보존 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 개입 작용이 수행될 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 단리, 정제, 농화, 세포 배양, 확장, 분석, 동결보존 등과 같은 어떠한 개입 작용도 수행되지 않는다.
예를 들어 이러한 제제를 인코딩하는 편집 시약 또는 핵산의 형질주입, 편집 시약의 형질도입, 편집 시약의 핵주입 및/또는 전기천공을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 세포 집단을 하나 이상의 편집 시약과 접촉시키는 다양하고 편리한 방법이 이용될 수 있다. 일부 경우, 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 일부 경우, 벡터의 구성요소는 핵산, 단백질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어 지질 나노입자(LNP) 벡터를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 편리한 바이러스 또는 비바이러스 벡터가 이용될 수 있다.
벡터는 원하는 편집을 수행하는 데 필요한 모든 또는 모든 것보다는 적은 구성요소를 함유하도록 구성될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 벡터는 표적화된 유전자위에서 편집을 수행하기에 충분한 모든 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 경우, 벡터는 편집을 수행하는 데 필요한 모든 것보다는 적은 구성요소를 포함할 수 있으며, 나머지 구성요소는 다른 수단, 예를 들어 또 다른 상이한 벡터, 형질도입, 형질주입 등에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우, 표적 시스템의 구성요소, 예를 들어 핵산 및 단백질 구성요소가 전달 벡터와 사전-복합체화되는 경우를 포함하여 이러한 구성요소는 전달 전에 사전-복합체화될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, 편집 시스템의 핵산(예를 들어 gRNA 등) 및 단백질(예를 들어 뉴클레아제(들) 또는 염기 편집 단백질(들) 등) 편집 시약은 편집을 위한 세포 집단에 전달하기 위해 리보핵단백질(RNP)과 복합체화될 수 있다.
임의의 편리하고 적절한 유전자 편집 시스템은 본원에 기술된 편집물 중 하나 이상을 도입하는 데 이용될 수 있다. 원하는 편집물의 부위-특이적 도입 방법은 다양할 것이며, 예를 들어 하나 이상의 부위-특이적 뉴클레아제(예를 들어 CRISPR/Cas9 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제, ZFN 등)의 사용을 통해 하나 이상의 부위-특이적 절단 사건을 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 부위-특이적 절단은 적용 가능한 경우 이중 및/또는 단일 가닥 절단부를 포함할 수 있다. 일부 경우, 부위-특이적 절단 이후, 예를 들어 치환, 삽입, 결실 등과 같은 원하는 편집물을 도입하기 위해 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 부위에서 특정 수선 사건이 이어진다. 이러한 특정 수선 방법은 예를 들어 수선을 가이드하기 위해 상동성 영역을 포함하는 핵산의 존재 하에 예를 들어 상동성 유도 수선(HDR)을 포함한 상동성 재조합을 포함할 수 있다. 일부 경우, 부위-특이적 절단은 예를 들어 비상동성 말단 접합(NHEJ)과 같은 부위-특이적 절단 후 세포 과정을 통해 예를 들어 특정 수선 사건을 이용하지 않으면서 유전자 교란 및/또는 녹아웃을 도입하는 데 이용될 수 있다. 일부 경우, 원하는 편집물의 부위-특이적 도입은 예를 들어 시토신 염기 편집제(CBE) 및 다에닌 염기 편집제(ABE) 시스템을 포함한 dCas9-데아미나제 융합 단백질 시스템과 같은 예를 들어 CRISPR 단백질-가이드 기반 편집 시스템과 같으나 이로 제한되지 않는, 이중 가닥 절단 사건을 도입하지 않는 염기 편집 시스템을 이용할 수 있다. 일부 경우, 유용한 염기 편집 시스템은 예를 들어 포스포디에스테르 핵산 백본의 절단 없이 단일 염기 변화를 도입한다.
다양한 편집 조성물이 이용될 수 있으며, 이러한 조성물은 예를 들어 이용되는 편집-시스템, 원하는 편집물의 유형, 표적화된 유전자위 또는 유전자위들의 서열을 기반으로 다양할 것이다. 유용한 편집 조성물은 예를 들어 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 gRNAs 또는 sgRNA 또는 gRNAs 또는 sgRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 예를 들어 CRISPR/Cas9 편집 조성물; 예를 들어 TALEN 뉴클레아제 또는 TALEN 뉴클레아제 쌍, 또는 TALEN 뉴클레아제 또는 TALEN 뉴클레아제 쌍을 인코딩하는 핵산을 포함하는 TALEN 편집 조성물; 예를 들어 ZFN 뉴클레아제 또는 ZFN 뉴클레아제 쌍, 또는 ZFN 뉴클레아제 또는 ZFN 뉴클레아제 쌍을 인코딩하는 핵산을 포함하는 ZFN 편집 조성물; 예를 들어 CRISPR-단백질-가이드-염기-편집 단백질, 또는 CRISPR-단백질-가이드-염기-편집 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 gRNAs 또는 sgRNA 또는 gRNAs 또는 sgRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 염기-편집 편집 조성물; 등을 포함할 수 있다.
CRISPR-Cas 기반 편집 조성물, 및 CRISPR-Cas 기반 편집 조성물의 이용 방법은 더 상세히 기술될 것이다. 그러나, 이러한 설명, 뿐만 아니라 조성물 및 방법은 이런 식으로 제한되지 않으며, 이러한 설명의 요소, 표적 및/또는 개념은 적절한 경우 다른 편집 시스템의 사용에 상응하게 적응되거나 적용될 수 있는 것으로 쉽게 이해될 것이다.
일부 경우, 유용한 편집 조성물은 예를 들어 Cas9 단백질과 같은 CRISPR-Cas 단백질, 또는 CRISPR-Cas 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 본원에 사용된 용어 "gRNA"는 일반적으로, 부적절하고/하거나 달리 언급되지 않는 한 2-구성요소 가이드 시스템(예를 들어 2개의 gRNA), 뿐만 아니라 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템 중 어느 하나를 포괄한다. 일부 경우, gRNA 또는 다수의 gRNA는 본원에 기술된 바와 같이 원하는 유전자위 또는 유전자위에 존재하는 유전자의 하나 이상의 엑손과 같은 이의 하나 이상의 요소를 표적화하도록 구성되고 이용될 수 있다. 예를 들어 일부 경우, gRNA 또는 다수의 gRNA는 예를 들어 B2M 유전자위의 하나 이상의 엑손(예를 들어 엑손 1, 엑손 2 또는 엑손 3 중 하나 이상)과 같은 B2M 유전자위 또는 이의 하나 이상의 요소를 표적화하도록 구성되고 이용될 수 있다.
일부 경우, 본 편집 방법은 천연 및 조작된 Cas9 뉴클레아제를 포함한 Cas9 뉴클레아제, 뿐만 아니라 이를 인코딩하는 핵산 서열의 사용을 포함할 수 있다.유용한 Cas9 뉴클레아제는 예를 들어 스트렙토콕커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 및 이의 변이체, 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 및 이의 변이체, 액티노마이세스 내슬룬디이(Actinomyces naeslundii) Cas9 및 이의 변이체를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, Cas9 뉴클레아제는 또한 국제공개 WO 2013/176772호 및 WO 2015/103153호에서 논의된 것 및 예를 들어 문헌[Makarova et al. (2011) Nature Reviews Microbiology 9:467-477], 문헌[Makarova et al. (2011) Biology Direct 6:38], 문헌[Haft et al. (2005) PLOS Computational Biology 1:e60] 및 문헌[Chylinski et al. (2013) RNA Biology 10:726-737]에서 검토된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 경우, 예를 들어 Cpf1 또는 Cpf1 변이체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 비-Cas9 CRISPR 뉴클레아제(또는 이의 조작된 변이체)가 이용될 수 있다.
Cas9 뉴클레아제는 유전자 편집의 CRISPR/Cas9 시스템에 사용되며, 변형된 Cas9 단백질(예를 들어 첨가된 기능성을 갖거나 갖지 않는 Cas9 닉카제 및 dCas9 단백질)은 다양한 편집 방법에 이용될 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템에서, 2개의 별개의 가이드 구성요소(즉, crRNA 및 tracrRNA) 또는 표적 서열을 함유하는 키메라 RNA(즉, "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA(sgRNA)"로서, 종합적으로 crRNA 및 tracrRNA를 함유함)는 Cas9 뉴클레아제를 가이드하여, gRNA 또는 sgRNA에 의해 정의된 특정 표적 서열에서 DNA를 절단한다. 이용되는 경우, HDR의 표적화 및 대체의 특이성, 효율 및 다용도성(versatility)은 다양한 상동성-유도 수선 전략과 CRISPR 뉴클레아제의 조합된 사용을 통해 크게 향상된다(예를 들어 문헌[Gratz et al. (2014) Genetics. 196(4)961-971]; 문헌[Chu et al. (2015) Nature. 33:543-548]; 문헌[Hisano et al. (2015) Scientific Reports 5: 8841]; 문헌[Farboud & Meyer (2015) Genetics, 199:959-971]; 문헌[Merkert & Martin (2016) Stem Cell Research 16(2):377-386]을 참조하며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
CRISPR 시스템은 부분적으로는 숙주 게놈 내의 요소를 표적화하는 필요한 서열의 작은 크기 및 높은 빈도때문에 유전자 편집에서 상당한 다용도성을 제공한다. CRISPR 가이드 Cas9 뉴클레아제는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 존재를 필요로 하며, 이의 서열은 Cas9가 유래된 박테리아 종에 의존하지만(예를 들어 스트렙토콕커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 경우 PAM 서열은 "NGG"임), 이러한 서열은 다양한 표적 핵산 전반에 걸쳐 보편적이다. 표적 서열의 바로 다운스트림에 있는 PAM 서열은 가이드 RNA의 일부가 아니지만, DNA 가닥을 절단하는 데 필수적이다. 신규 PAM 인식을 갖는 합성 Cas9 뉴클레아제가 생성되었으며, 이는 표적화의 다용도성을 추가로 증가시키며, 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 표적 핵산의 단지 하나의 가닥을 절단하는 Cas9 닉카제(예를 들어 Cas9(D10A) 등), 뿐만 아니라 부착된 융합 단백질에 의해 추가되는 부가적인 효소 활성을 갖는 엔도뉴클레아제 결핍(즉, "데드(dead)") dCas9 변이체 등이 또한 개발되었다.
일부 실시형태에서, 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 면역-관련 유전자위는 편집을 위해 표적화되어 예를 들어 편집된 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 저면역원성으로 되게 할 수 있다. 예를 들어 일부 경우, HLA 부류 I 단백질 또는 관련 단백질(예를 들어 HLA 부류 1a 또는 관련 단백질)을 인코딩하는 하나 이상의 유전자위, HLA 부류 II 단백질 또는 관련 단백질(예를 들어 HLA 부류 II 유전자의 발현을 야기하는 보조활성화제, 전사 인자 및/또는 "HLA-D" 단백질 등)을 인코딩하는 하나 이상의 유전자위 또는 이들의 조합이 표적화될 수 있다. HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 단백질에 이러한 교란을 도입함으로써, 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 본원에 제시된 바와 같이 저면역원성으로 될 수 있다. 예를 들어, 이러한 교란은 예를 들어 세포독성 T 림프구(CTL)와 같은 예를 들어 림프구와 같은 면역 세포에 의한 편집된 간세포의 감소된 사멸화를 초래할 수 있다. 표적화에 유용한 유전자위는 예를 들어 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, Β2Μ, CIITA, NLRC5, RFX5, RFXANK, RFXAP 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 경우, 원하는 편집물은 예를 들어 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 교란을 초래하는 하나 이상의 편집물을 도입함으로써 그리고/또는 예를 들어 B2M과 같은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 의해 공유되는 구성요소의 하나 이상의 편집물을 도입함으로써 특정 부류의 모든 유전자를 교란시킬 수 있다. 유사한 전략은 예를 들어 HLA 부류 II 단백질과 같은 다른 표적 및 유전자위에 대해 적응되고 이용될 수 있다. 유용한 HLA 유전자, 대립유전자, 유전자위 및 이의 단백질은 예를 들어 문헌[Marsh et al. (2010) Tissue Antigens 75:291-455]에 기술된 것을 포함하며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우, 본원에 기술된 바와 같은 유용한 CRISPR Cas9-기반 B2M 표적화 서열 및 B2M 유전자위를 편집하는 데 이용될 수 있는 상응하는 PAM 서열은 예를 들어, 서열 GGCCACGGAGCGAGACATCT(서열 번호 039)(PAM, CGG)를 갖는 B2M 엑손 1 표적화 서열 "B2M_Ex1_7"; 서열 CGCGAGCACAGCTAAGGCCA(서열 번호 040)(PAM, CGG)를 갖는 B2M 엑손 1 표적화 서열 "B2M_Ex1_3"; 서열 AAGTCAACTTCAATGTCGGA(서열 번호 041)(PAM, TGG)를 갖는 B2M 엑손 2 표적화 서열 "B2M_Ex2_4" 등을 포함한다.
일부 경우, 편집 조성물은 예를 들어 B2M, HLA 부류 I 및/또는 II 유전자 또는 단백질을 발현을 야기하는 전사 인자, 및/또는 HLA 부류 I 및/또는 II 유전자 또는 단백질의 발현을 야기하는 보조활성화제와 같으나 이로 제한되지 않는 하나 이상의 HLA 부류 I 단백질, 하나 이상의 HLA 부류 II 단백질, 및/또는 하나 이상의 연관 단백질의 생산 및/또는 기능에서 교란을 초래하는 HLA 부류 I-표적화 조성물 및/또는 HLA 부류 II-표적화 조성물일 수 있다.
이러한 편집 조성물은, 원하는 편집물을 생성하기에 충분한 조건, 예를 들어 세포의 도입, 전달, 형질주입, 형질도입, 표적화, 효소 활성 및/또는 수선(적용 가능한 경우), 뿐만 아니라 생존 및 필요한 생물학적 활성에 충분한 경우를 포함하는 이러한 조건 하에, 세포 집단과 접촉될 수 있다. 원하는 편집물을 생성하기에 충분한 조건은 예를 들어 편집 반응 등에 도움이 되는 적합한 배양 배지에서 적합한 환경적 조건(예를 들어 온도, 기체 교환 등)에서의 유지를 포함하여 예를 들어 적합한 배양 조건을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 이에 더하여, 편집 반응은 편집 반응이 일어나고 원하는 완료 수준에 도달하기에 충분한 양의 시간 동안 수행될 수 있으며, 이러한 충분한 양의 시간은 다양할 것이다. 또한 일부 경우, 편집 시약에의 노출 시간은 예를 들어 편집 반응 또는 이의 구성요소가 세포 집단에 예를 들어 저하된 세포 생존력, 증가된 세포 유약성 등과 같은 하나 이상의 유해 효과를 가질 수 있는 경우 최소화될 수 있다.
일부 경우, 유전자 편집 방법은 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)의 사용을 포함할 수 있다. ZFN은 아연-핑거 단백질(ZFP)에 융합된 서열-독립적 Fokl 뉴클레아제 도메인으로 구성된다. ZFP는 이의 서열 특이성을 변화시키기 위해 변경될 수 있다. 표적화된 dsDNA의 절단은 2개의 ZFN(좌측 및 우측으로 지정됨)을 반대 가닥 상의 인접한 절반(half)-부위에 올바른 배향 및 간격으로 결합시켜, Fokl 이량체를 형성하는 것을 수반한다. 이량체화는 ZFN 특이성을 상당히 증가시킨다. 3개 또는 4개의 핑거 ZFP는 ZFN당 약 9개 또는 12개의 염기, 또는 ZFN 쌍에 대해 약 18개 또는 24개의 염기를 표적화한다. 상동성 재조합의 표적화 및 대체의 특이성, 효율 및 다용도성은 다양한 상동성-유도 수선 전략과 ZFN의 조합된 사용을 통해 크게 향상된다(예를 들어 문헌[Urnov et al. (2005) Nature. 435(7042):646-5]; 문헌[Beumer et al (2006) Genetics. 172(4):2391-2403]; 문헌[Meng et al (2008) Nat Biotechnol. 26(6):695-701]; 문헌[Perez et al. (2008) Nat Biotechnol. 26(7):808-816]; 문헌[Hockemeyer et al. (2009) Nat Biotechnol. 27(9):851-7]을 참조하며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨). 일반적으로, 하나의 ZFN은 조립 방법에 따라 125 내지 500 bp의 랜덤 게놈 서열마다 발견될 수 있다. 적절한 ZFN 표적화 부위를 식별하는 방법은 예를 들어 문헌[Cradick et al. (2011) BMC Bioinformatics. 12:152]에 기술된 바와 같은 예를 들어 컴퓨터-매개 방법을 포함하며, 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우, 유전자 편집 방법은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)의 사용을 포함할 수 있다. 원칙적으로는 ZFN 뉴클레아제와 유사하게, TALEN은, ZNF와 달리 단일 뉴클레오타이드를 개별적으로 인식하는 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) 단백질에 융합된 서열-독립적 Fokl 뉴클레아제 도메인을 활용한다. TALE는 일반적으로 DNA-결합 탠덤 반복부의 특징적인 중심 도메인, 핵 위치화 신호(nuclear localization signal), 및 C-말단 전사 활성화 도메인을 함유한다. 전형적인 반복부는 33개 내지 35개 아미노산 길이이고, 위치 12 및 13에 "반복부 가변 2-잔기"(RVD: repeat variable di-residue)로 알려진 2개의 초가변 아미노산 잔기를 함유한다. RVD는 하나의 특정 DNA 염기쌍을 인식할 수 있고, 순차적인 반복부는 연속 DNA 서열과 매칭된다. 표적 DNA 특이성은 RVD의 단순 코드를 기반으로 하며, 따라서 이는 표적 DNA 서열의 예측을 가능하게 한다. 네이티브(native) TALE 또는 조작된/변형된 TALE는 원하는 표적화에 따라 TALEN에 사용될 수 있다. TALEN은 거의 임의의 서열 스트레치에 대해 설계될 수 있다. DNA 인식의 각각의 5' 말단에 티미딘이 존재하는 것이 필요할 뿐이다. 상동성 재조합의 표적화 및 대체의 특이성, 효율 및 다용도성은 다양한 상동성-유도 수선 전략과 TALEN의 조합된 사용을 통해 크게 향상된다(예를 들어 문헌[Zu et al. (2013) Nature Methods. 10:329-331]; 문헌[Cui et al. (2015) Scientific Reports 5:10482]; 문헌[Liu et al. (2012) J. Genet. Genomics. 39:209-215], 문헌[Bedell et al. (2012) Nature. 491:114-118], 문헌[Wang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:530-532]; 문헌[Ding et al. (2013) Cee Stem Cell. 12:238-251]; 문헌[Wefers et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 110:3782-3787]을 참조하며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨).
일부 경우, 유전자 편집 방법은 예를 들어 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 뉴클레오염기 편집제 및 gRNA 등을 포함하는 융합 단백질을 이용하는 염기 편집제 시스템을 포함하지만 이로 제한되지 않는 염기 편집제 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 염기 편집은 일반적으로 HDR 및/또는 NHEJ에 의존하지 않을 것이며, 일반적으로 dsDNA의 백본 둘 다 상에서 포스포디에스테르 결합의 절단을 초래하지 않거나 필요로 하지 않을 것이다. 따라서, 염기 편집은 일부 경우, 예를 들어 dCas9 또는 Cas9 닉카제와 같은 예를 들어 뉴클레아제-결핍 또는 뉴클레아제-결함 Cas 단백질과 같이 이중-가닥 절단부를 야기하지 않는 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드(즉, "프로그램 가능한") DNA 결합 단백질을 이용할 수 있다. 염기 편집제 인코딩 핵산을 포함하는 염기 편집제 및 염기 편집 시스템의 유용한 예는 BE1, BE2, BE3(Komor et al., 2016); 표적-AID(Nishida et al., 2016); SaBE3, BE3 PAM 변이체, BE3 편집창 변이체(Kim et al., 2017); HF-BE3(Rees et al., 2017); BE4 및 BE4-Gam; AID, CDA1 및 APOBEC3G BE3 변이체(Komor et al., 2017); BE4max, ArcBe4max, ABEmax(Koblan et al., 2018); 아데닌 염기 편집제(ABE7.10)(Gaudelli et al., 2017); ABE8(Richter et al., 2020); ABE8e(Gaudelli et al., 2020); A&C-BEmax(Zhang et al., 2020); SPACE(Grunewald et al., 2020) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않으며; 전술한 참조문헌은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
유용한 염기 편집제 시스템 및 이의 구성요소의 비제한적인 예는 예를 들어 국제공개 WO 2020236936A1호, WO2020231863A1호, WO 2020168135A1호, WO 2020168122A1호, WO 2020168088A1호, WO 2020168132A9호, WO 2020168133A1호, WO 2020168075A9호, WO 2020168051A9호, WO 2020160514A1호, WO 2020160517A1호, WO 2020150534A9호, WO 2020051562A3호, WO 2020051562A3호, WO 2020028823A1호, WO 2019217941A1호, WO 2019217942A1호, 및 WO 2019217943A1호; 및 미국 특허 출원 공보 US 20200399626A1호에 기술된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않으며; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 경우, 원하는 편집물의 존재는 예를 들어 편집물이 표적 유전자위에 존재하는지(또는 원하는 결실이 부재하는지)의 여부를 시험하기 위한 검정에 의해, 교란을 위해 표적화된 유전자위에서 인코딩된 유전자 생성물이 부재하는지, 도입된 서열에 의해 인코딩된 유전자 생성물이 존재하는지의 여부를 시험하기 위한 검정 등에 의해 확증될 수 있다. 이러한 검정을 수행하기 위한 유용한 방법은 예를 들어 유전자위 및/또는 유전자위에서 인코딩된 RNA의 PCR(예를 들어 PCR, qPCR, rt-PCR 등)을 기반으로 하는 방법, 유전자위에서 인코딩된 단백질에 대한 항체로 프로브된 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 기반으로 하는 방법, 유세포 측정법 기반 방법, 시퀀싱(예를 들어 단일 세포 시퀀싱) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 이식유전자, 발현 카세트, 편집 조성물, 벡터 등의 다른 유용한 구성요소는 프로모터 서열(예를 들어 구성적(constitutive), 조직-특이적 등), 신호 펩타이드 서열, 폴리(A) 서열, 종결제, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 인설레이터, 바운더리 구성요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및/또는 유전자위 조절 영역을 포함할 수 있다. 추가로, 다수의 유전자 생성물은 예를 들어 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리된 하나의 오픈 리딩 프레임에서 예를 들어 개별 구성요소(이식유전자)를 연결함으로써 하나의 핵산으로부터 발현될 수 있다.
유용한 프로모터의 예는 예를 들어 바이러스 시미안 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 후기), 사이토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어 극초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), MND(골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실됨, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환됨), 라우스 육종 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스(HSV), 비장 병소-형성 바이러스(SFFV) 프로모터 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 하나 이상의 유도 인자가 존재할 때만 바이러스 게놈의 전부 또는 부분의 전사가 일어나도록 유도될 수 있다. 유도 인자는 하나 이상의 화학적 화합물 또는 숙주 세포가 배양되는 생리학적 조건, 예를 들어 온도 또는 pH를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 경우, 프로모터는 구성적일 수 있다. 일부 경우, 프로모터는 원하는 세포-유형 또는 조직에서 우선적인 발현을 야기할 수 있으며, 예를 들어 프로모터는 세포-유형 또는 조직 특이적일 수 있다.
일부 경우, 이식유전자, 발현 카세트, 벡터 등은 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 단백질의 N-말단에 위치한 짧은 펩타이드이다. 단백질 위치화에 기능하는 신호 펩타이드는 회합된 단백질을 분비 경로로 안내하고 단백질의 분비를 구동하는 데 유용하다.
레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터는 5' LTR 및 3' LTR 및 이들의 요소를 포함하는 시스-작용 요소, 예컨대 프로모터, 긴 말단 반복부(LTR) 및/또는 이들의 요소, 중심 폴리퓨린관(cPPT) 요소, DNA 플랩(FLAP) 요소, 외수송(export) 요소(예를 들어 rev 반응 요소(RRE), B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 등), 전사후 조절 요소(예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE), B형 간염 바이러스 조절 요소(HPRE) 등), 폴리아데닐화 부위, 전사 종결 신호, 인설레이터 요소(예를 들어 β-글로빈 인설레이터, 예컨대 닭 HS4) 등을 포함한 다양한 요소를 포함할 수 있다(또는 적절한 경우 원하는 바에 따라 배제할 수 있음). 다양한 벡터에 존재하거나 부재할 수 있는 다른 요소는 인핸서, 비번역 영역(UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 부가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어 LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자가-절단 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그, 상동성 유도 수선(HDR)에 유용한 상동성 영역 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
유용한 LTR은 예를 들어 U3, R 및/또는 U5 영역, 및 이의 일부를 함유하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. LTR은 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제를 위한 기능을 제공한다. LTR은 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 서열을 포함한 다수의 조절 신호를 함유할 수 있다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유할 수 있다. U5 영역은 폴리아데닐화 서열을 함유할 수 있다. R(반복) 영역은 일반적으로 U3 및 U5 영역 측면에 있다. U3, R 및 U5 영역으로 이루어진 LTR은 바이러스 게놈의 5' 말단과 3' 말단 둘 다에 나타날 수 있다. 바이러스 게놈은 입자(예를 들어 Psi 부위)로의 바이러스 RNA의 효율적인 패키징을 위한 게놈(예를 들어 tRNA 프라이머 결합 부위)의 역전사 등에서 기능하는 5' LTR에 인접한 서열을 포함할 수 있다.
유용한 LTR은 변형된 5′ LTR 및/또는 3′ LTR을 포함한다. 3' LTR의 변형은 종종 바이러스 복제-결함을 일으켜 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 향상시키도록 만들어진다. 본원에 사용된 용어 "복제-결함"은 감염성 비리온이 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 할 수 없는 바이러스(예를 들어 복제-결함 렌티바이러스 자손)를 지칭한다. 용어 "복제-적격"은 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온을 생산할 수 있도록 복제될 수 있는 야생형 바이러스 또는 돌연변이체 바이러스(예를 들어 복제-적격 렌티바이러스 자손)를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 자가-불활성화될 수 있다. 벡터에 관한 용어 "자가-불활성화"(SIN)는 예를 들어 U3 영역을 포함하는 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 (예를 들어 결실 및/또는 치환에 의해) 변형되어 1차 라운드의 바이러스 복제를 넘어서는 바이러스 전사를 방지하는, 복제-결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 추가의 실시형태에서, 3' LTR은 U5 영역이 예를 들어 이종성 또는 합성 폴리(A) 서열, 하나 이상의 인설레이터 요소, 및/또는 유도성 프로모터로 대체되도록 변형될 수 있다. LTR, 예를 들어 3' LTR 또는 5' LTR이 변형된 LTR 또는 LTR에 대한 변형, 예컨대 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' LTR과 5' LTR 둘 다에 대한 변형을 포함할 수 있다는 참조는 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함할 수 있다. 용어 "TAR"은 렌티바이러스(예를 들어 HIV) LTR의 R 영역에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성화제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어 5' LTR의 U3 영역이 이종성 프로모터로 대체되는 것을 포함하여 TAR 요소를 포함하지 않을 수 있다.
일부 경우, 벡터는 위형(pseudotyped) 벡터일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "위형" 또는 "위형화"는 바람직한 특징을 갖는 또 다른 바이러스의 단백질로 치환된 하나 이상의 바이러스 외피 단백질을 갖는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G로 위형화된다. 일부 실시형태에서, VSV-G 외피 당단백질로 위형화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생산하는 패키징 세포가 이용될 수 있다.
바이러스 벡터와 비바이러스 벡터는 둘 다 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 유전적 요소, 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 유전적 요소, 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함하는 구조적 및 기능적 유전적 요소, 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 하이브리드 벡터가 LTR 또는 레트로바이러스 서열, 예를 들어 렌티바이러스 서열 및 비-레트로바이러스 서열, 예를 들어 비-렌티바이러스 바이러스 서열을 둘 다 함유하는 다른 핵산을 포함하는 것을 포함하여 하이브리드 벡터가 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스 서열, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
세포 집단, 및/또는 이의 간세포 및/또는 간세포 선조세포는 유효량의 세포의 투여가 원하는 치료 효과를 가질 병태에 대해 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 일부 경우, 원하는 치료 효과는 예를 들어 간세포 대사, 해독, 간세포 단백질(예를 들어 알부민, 피브리노겐, 프로트롬빈, 응고 인자(예를 들어 인자 V, VII, IX, X, XI 및 XII), 단백질 C, 단백질 S, 항트롬빈, 지질단백질, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 보체 단백질, 간세포 프로테옴 및/또는 세크레톰의 단백질(예를 들어 문헌[Franko et al. Nutrients. (2019) 11(8):1795]에 기재된 것과 같음; 이의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨))의 합성 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 투여된 간세포의 하나 이상의 내인성 기능(예를 들어 건강한 간세포의 내인성 기능(들), 저면역원성 간세포의 내인성 간세포 기능(들) 등)의 결과일 것이다. 일부 경우, 원하는 치료 효과는 투여된 간세포의 하나 이상의 이종성 기능, 예를 들어 기능적으로 통합된 이식유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 이종성 기능의 결과일 것이다. 일부 경우, 대상체의 병태가 혈우병(예를 들어 A형 혈우병 또는 B형 혈우병)이고 방법이 혈우병(예를 들어 인자 VIII, 인자 IX 등)을 치료하기 위한 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 인간 간세포를 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 경우, 방법은 예를 들어 대상체에서 응고를 조절하기에 효과적인 양으로 항응고제(예를 들어 와파린, 리바록사반(rivaroxaban), 다비가트란(dabigatran), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban) 등)를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 응고를 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 간세포 및/또는 이의 선조세포를 포함한 세포 집단은 임의의 간 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 간세포의 도입에 의한 환자의 간 조직을 재구성은 대상체의 간을 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포로 재증식시킴으로써 임의의 간 병태(들)(예를 들어 급성 간부전, 만성 간 질환 및/또는 대사성 또는 단일유전자 질환)에 대한 영구 치료를 포함하여 이러한 병태가 있는 환자를 위한 잠재적인 치료 옵션이다. 간세포 재구성은 예를 들어 유전자 치료법을 위해 유전적으로 변형된 간세포를 도입하기 위해 또는 질환, 물리적 또는 화학적 손상 또는 악성 종양의 결과로 손실된 간세포를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 이에 더하여, 확장된 인간 간세포는 인공 간 보조 장치를 이식(populate)하는 데 사용될 수 있다.
다양한 목적을 위한 간세포를 확장시키는 것을 포함한 생산 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우, 본 방법은 예를 들어 동소 간 이식을 포함한 이식에 적합한 인간 간세포를 포함하여 이를 필요로 하는 대상체로의 이식에 적합한 인간 간세포의 생산 및/또는 확장을 제공한다. 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 인간 간세포를 포함한 간세포는 이식 또는 주입 전에 정제, 동결보존 및/또는 광범위하게 특징화될 수 있다. 다른 용도 중에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 간세포는 하나 이상의 중증 간 질환이 있는 환자에게 주문형 치료법을 제공할 수 있다.
일부 경우, 원하는 치료 효과는 통합된 이식유전자에 의해 인코딩된 유전자 생성물에 의해 부여되는 투여된 간세포의 하나 이상의 이종성 기능의 결과일 것이다. 이에, 이종성 유전자 생성물, 예컨대 분비된 이종성 유전자 생성물의 전달을 통해 치료될 수 있는 본질적으로 임의의 병태는 본원에 기술된 바와 같이 생성된 유전적으로 변형된 간세포를 사용하여 치료될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 결핍증을 초래하는 단일유전자 질환은 단백질을 인코딩하는 통합된 이식유전자를 함유하도록 유전적으로 변형된 유효량의 간세포의 투여를 통해 이로써 단백질의 결핍증을 감소시킴으로써 치료될 수 있다.
단일유전자 병태를 치료하기에 유용한 이식유전자는 예를 들어 구리-수송 ATPase 2(ATP7B), 유전성 혈색소침착증 단백질(HFE), 헤모주벨린, 헵시딘(HAMP), 트랜스페린 수용체 단백질 2(TFR2), 용질 담체 계열 40 구성원 1(SLC40A1), 인자 IX, 인자 VIII, 폰빌레브란트 인자, 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1), N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC), 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA), 페닐알라닌 하이드록실라제 효소(PAH), 아르기나제(ARG1을 포함한 ARG), 알파-1 항트립신(AAT), 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH), 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL: 아르기니노숙시네이트 리아제), 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS1을 포함한 ASS), 오르니틴 트랜스로카제(ORNT1), 시트린, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1), 트랜스티레틴(TTR), 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼라제(AGXT), 보체 인자 H(CFH) 등 및 이들의 조합의 전체-길이 및 변형된 형태를 인코딩하는 이식유전자를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 경우, 치료되는 질환은 예를 들어 이식유전자의 유전자 생성물이 간-연관 단백질인 경우를 포함하여 간 질환 및/또는 간-연관 단일유전자 질환이다. 일부 경우, 치료되는 질환은 예를 들어 이식유전자의 유전자 생성물이 간-연관 단백질이 아닌 경우를 포함하여 간 질환 및/또는 간-연관 단일유전자 질환이다. 일부 경우, 치료되는 단일유전자 질환은 예를 들어 통합된 이식유전자의 유전자 생성물이 간-연관 단백질이 아닌 경우를 포함하여 간-연관 단일유전자 질환이 아니다. 일부 경우, 치료되는 질환은 예를 들어 통합된 이식유전자의 유전자 생성물이 간-연관 단백질이 아닌 경우를 포함하여 간 질환이 아니다.
본원에 기술된 바와 같은 간세포 및/또는 간세포 선조세포를 포함하는 세포 집단 및 본원에 기술된 바와 같은 이러한 세포를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 대상체 및 대상체의 임의의 부분, 기관 또는 조직에 투여될 수 있다. 투여 수단의 비제한적인 예는 간문맥 주입, 제대 정맥 주입, 직접 비장 캡슐 주사, 비장 동맥 주입, 망낭 주입 및/또는 복강내 주사(주입, 이식)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 복강내 공간 및/또는 망낭 주입에 의해 이식되는 캡슐화된 간세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 간세포로 시딩 및/또는 재증식되고 이를 필요로 하는 대상체에게 외과적으로 이식되는, 예를 들어 합성 스캐폴드, 탈세포화된 간 등을 포함하는 무세포화된/탈세포화된 스캐폴드를 포함한다.
대상체(환자)에 대한 투여(이식)에 더하여 또는 이에 대한 대안으로서, 본원에 기술된 바와 같은 간세포는 또한 간 질환이 있는 대상체를 치료하는 데 유용한 장치 또는 조성물에 간세포를 공급하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 간세포가 사용될 수 있는 이러한 장치 또는 조성물의 비제한적인 예는 생체인공 간(BAL)(급성 간부전을 앓고 있는 대상체를 위한 체외 보조 장치) 및/또는 탈세포화된 간(대상체에서 간 기능을 제공하기 위한 재세포화 기관 스캐폴드)을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Shaheen et al. (2019) Nat Biomed Eng. doi: 10.1038/s41551-019-0460-x]; 문헌[Glorioso et al. (2015) J Hepatol 63(2):388-98]을 참조한다.
일부 경우, 본원에 기술된 바와 같은 치료를 받고 있는 대상체는 면역억제제를 받지 않을 수 있으며, 예를 들어 대상체는 치료법의 시점에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 간세포의 투여 전에, 동안에 그리고/또는 후에 면역억제되지 않을 수 있고/있거나 면역학적으로 정상일 수 있다. 예를 들어, 이러한 대상체는 면역억제, 면역억제제, 및/또는 특정 면역억제 치료법에 대한 하나 이상의 금기를 가질 수 있거나, 상이한 이유로 면역억제제를 투여받지 않을 수 있다. 일부 경우, 면역억제되지 않은 대상체 및/또는 면역억제에 대한 금기를 갖는 대상체는 집단 중 모든 또는 본질적으로 모든 부분을 포함하여 실질적인 부분이 저면역원성 간세포인 세포 집단을 투여받을 수 있다.
면역억제에 대한 금기의 비제한적인 예는 간 질환 또는 병태, 섬유증, 간경변, 신장 질환 또는 병태, 혈관 질환 또는 병태, 대상 포진(shingles) 및/또는 수두의 이력, 감염(예를 들어 결핵, BK 폴리오마바이러스, 단순 포진, 진균류, 기생충(예를 들어 회충 스트롱길로이데스(Strongyloides)), 대상 포진 바이러스, 홍역 등), 감염성 병원체(예를 들어 홍역, 수두 등)에의 노출, 암, 악성 종양, 당뇨병, 고콜레스테롤, 고혈압, 고트리글리세라이드혈증(high blood triglyceride), 용혈성 요독 증후군, 빈혈, 저하된 혈액 혈소판, 낮은 WBC 계수, 심낭 삼출액, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 폐부종, 간질성 폐렴, 구내염, 구내염, 급성 신부전, 신장 동맥 폐색(예를 들어 신장 동맥 혈전증), 가시적 부종, 복수, 단백뇨, 손상된 상처 치유, 임신, 수유 및 모유 양육, 악성 림프종, 혈전증(예를 들어 간 이식후 혈전증), 심장 이식, 호르몬 결핍증의 내분비 장애(예를 들어 갑상선 호르몬 결핍증, 시상하부 부전, 뇌하수체 부전), 낮은 혈중 칼륨, 정신 장애, 근병증, 녹내장, 백내장, 궤양, 위염, 게실염, 장관 문합술, 건 파열, 골다공증, 낮은 골 석회화 또는 밀도, 발작, 아르기니노숙시네이트 리아제(아르기니노숙시네이트 리아제) 결핍증, 카르바모일 포스페이트 신서타제 결핍증, 시트룰린혈증, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 결핍증, 아르기나제 결핍증, 상승된 크레아틴 키나제, 질환 또는 병으로 인한 골 골절, 골괴사, 근 소모, 고암모니아혈증(예를 들어 N-아세틸글루타메이트 신타제 결핍증과 연관된 바와 같음), 면역억제제(예를 들어 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니손, 부데노시드, 프레드니솔론), 야누스 키나제 저해제(예를 들어 토파시티닙(tofacitinib)), 칼시뉴린 저해제(예를 들어 사이클로스포린, 나크롤리무스(tacrolimus)), mTOR 저해제(예를 들어 시롤리무스(sirolimus), 에베롤리무스(everolimus)), IMDH 저해제(예를 들어 아자티오프린(azathioprine), 레플루노마이드(leflunomide), 미코페놀레이트, 면역억제제 생물학제제(예를 들어 아바타셉트(abatacept)(Orencia), 아달리무맙(adalimumab)(Humira), 아나킨라(anakinra)(Kineret), 세르톨리주맙(certolizumab)(Cimzia), 에타네르셉트(etanercept)(Enbrel), 골리무맙(golimumab)(Simponi), 인플릭시맙(infliximab)(Remicade), 익세키주맙(ixekizumab)(Taltz), 나탈리주맙(natalizumab)(Tysabri), 리툭시맙(rituximab)(Rituxan), 세쿠키누맙(secukinumab)(Cosentyx), 토실리주맙(tocilizumab)(Actemra), 우스테키누맙(ustekinumab)(Stelara), 베돌리주맙(vedolizumab)(Entyvio), 바실릭시맙(basiliximab)(Simulect), 다클리주맙(daclizumab)(Zinbryta)) 등)에 대한 알레르기 등을 포함한다. 예를 들어 특정 면역억제제에 대한 다른 금기는 라벨 정보, 약물 및 약물 상호작용 데이터베이스, 약물 제조업체, 및/또는 예를 들어 미국 식품의약국(FDA)과 같은 관련 규제 기관으로부터 쉽게 확인 가능하다.
일부 경우, 투여된 세포 집단은 예를 들어 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 저면역원성 간세포를 포함하여 80% 이상의 저면역원성 간세포일 수 있다. 일부 경우, 하나 이상의 면역억제제를 이용한 치료에 대한 하나 이상의 금기를 갖는 대상체는 예를 들어 이러한 저면역원성 간세포가 본원에 기술된 바와 같은 적어도 3개을 비롯하여 2개 이상을 비롯하여 1개 이상의 유전적 변형을 포함하는 경우를 포함하여, 80% 이상의 저면역원성 간세포를 갖는 세포 집단을 투여받을 수 있다.
대상체에서 본원에 기술된 방법 및/또는 세포 집단을 사용하여 치료될 수 있는 면역억제에 대한 하나 이상의 금기와 함께 또는 없이 포함하는 질환 및 장애는 1형 크리글러-나자르 증후군; 가족성 고콜레스테롤혈증; 인자 VII 결핍증; I형 글리코겐 축적 질환; 영아 레프섬 질환; 2형 진행성 가족성 간내 담즙정체; 1형 유전성 티로신혈증; 및 다양한 요소 회로 결함; 급성 약물-유도 간부전을 갖는 청소년 및 성인 환자를 포함한 급성 간부전; 바이러스-유도 급성 간부전; 특발성 급성 간부전; 버섯-독성-유도 급성 간부전; 수술후 급성 간부전; 임신의 급성 지방간에 의해 유도되는 급성 간부전; 간경변 및/또는 섬유증을 포함한 만성 간 질환; 하기 급성 사건 중 하나에 의해 야기되는 급성-진행-만성 간 질환: 알코올 소모, 약물 복용 및/또는 B형 간염 악화를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 따라서, 환자는 이러한 간 병태 또는 다른 간 병태 중 하나 이상을 가질 수 있다.
일부 경우, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 질환 및 장애는 간세포-특이적(간세포-고유) 기능장애를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능장애 및 질환 및/또는 장애의 병인은 대상체 내에 존재하는 내인성 간세포의 기능장애로 인한 것일 수 있거나 주로 이에 기인할 수 있다. 일부 경우, 간세포-특이적 기능장애는 유전적이거나 대상체에 의해 유전될 수 있다. 일부 경우, 질환 또는 장애의 병인은 간세포 이외의 세포 유형을 실질적으로 수반하지 않는다. 일부 경우, 질환 또는 장애는 저하된 간 기능, 간 질환(급성 또는 만성), 또는 내인성 간세포로부터 유래되는 다른 불리한 병태를 초래한다. 이에, 일부 경우, 예를 들어 질환이 내인성 간세포 집단에 고유한 경우, 효과적인 치료는 본원에 기술된 바와 같은 간세포로의 대체, 보충, 이식 또는 재증식(repopulation)을 포함할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 간세포-고유 질환/장애에서 내인성 간세포의 대체 및/또는 보충은 이식된 간세포에 부정적인 영향을 미치는 질환/장애 없이 상당한 임상적 향상을 초래할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 간세포 기능에 영향을 미치는 유전적 장애를 갖는 경우(예를 들어 간세포 내 아미노산 대사, 예컨대 고티로신혈증), 동종이계 이식된 간세포는 본질적으로 대상체 내의 질환/장애의 존재에 의해 영향을 받지 않을 수 있다. 따라서, 이식된 간세포는 대상체 내에서 실질적으로 생착, 생존, 확장 및/또는 재증식되어 상당한 긍정적인 임상 성과를 초래할 수 있다.
간세포-특이적(간세포-고유) 기능장애를 특징으로 하는 질환 및 장애는 간세포 특이적이지 않고 간세포 외인성 인자를 수반하는 병인을 갖는 질환 및 장애와 대조될 수 있다. 간세포 외인성 인자 및/또는 병인을 갖는 질환의 예는 예를 들어 알코올성 지방간염, 알코올성 간 질환(ALD), 간 지방증/비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 간세포 외인성 질환은 외부적이거나 내인성 간세포의 외부로부터 유래되는 간 유해물, 예컨대 알코올, 식이요법, 감염 등을 수반한다. 일부 경우, 본원에 기술된 방법에 따라 치료되는 질환 및 장애는 간세포-특이적(간세포-고유) 기능장애가 아닌 질환 및 장애를 포함할 수 있다.
간세포-고유 질환 및 간세포-관련 질환의 예는 간-관련 효소 결핍증, 간세포-관련 수송 질환 등을 포함한다. 이러한 간-관련 결핍증은 후천성 또는 유전성 질환일 수 있으며, 대사 질환(예를 들어 간-기반 대사 장애)을 포함할 수 있다. 유전성 간-기반 대사 장애는 예를 들어 문헌[Ishak, Clin Liver Dis (2002) 6:455-479]에 기술된 질환과 같으나 이로 제한되지 않는 "간의 유전성 대사 질환"으로 지칭될 수 있다. 간-관련 결핍증은 일부 경우 급성 및/또는 만성 간 질환을 초래할 수 있으며, 예를 들어 급성 및/또는 만성 간 질환이 치료되지 않고 방치되거나 불충분하게 치료된 경우 결핍의 결과인 경우를 포함한다. 유전성 간-관련 효소 결핍증, 간세포-관련 수송 질환 등의 비제한적인 예는 1형 크리글러-나자르 증후군; 가족성 고콜레스테롤혈증, 인자 VII 결핍증, 1형 글리코겐 축적 질환, 영아 레프섬 질환, 2형 진행성 가족성 간내 담즙정체, 유전성 티로신혈증(예를 들어 1형 유전성 티로신혈증), 유전적 요소 회로 결함, 페닐케톤뇨증(PKU), 유전성 혈색소증, 알파-I 항트립신 결핍증(AATD), 윌슨 질환 등을 포함한다. 적어도 일부 간 표현형, 병리 및/또는 간-관련 증상(들)을 갖는 대사 질환을 포함하는 간의 유전성 대사 질환의 비제한적인 예는 5-베타-환원효소 결핍증, AACT 결핍증, 아르스코그 증후군, 아베타지질단백혈증, 부신백질이영양증, 알퍼스 질환, 알퍼스 증후군, 알파-1-항트립신 결핍증, 항트롬빈 III 결핍증, 아르기나제 결핍증, 아르지닌숙신산뇨, 동맥간 이형성증, 자가면역 림프증식성 증후군, 양성 재발성 담즙정체, 베타 지중해빈혈, 블룸 증후군, 버드-키아리 증후군, 탄수화물-결핍 당단백질 증후군, 세라미다제 결핍증, 세로이드 리포푸신증, 콜레스테롤 에스테르 축적 질환, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 만성 육아종, 만성 C형 간염, 크리글러-나자르 증후군, 낭포성 섬유증, 시스틴증, 진성 당뇨병, 듀빈-존슨 증후군, 풍토성 티롤산 간경변, 적혈구 조혈 프로토포르피린증, 파브리 질환, 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 지방간염, 피브리노겐 축적 질환, 갈락토스혈증, 강글리오시드증, 고셔 질환, 유전적 혈색소침착증, 1a형 글리코겐증, 2형 글리코겐증, 3형 글리코겐증, 4형 글리코겐증, 육아종성 질환, 간 가족성 아밀로이드증, 유전성 과당 불내증, 유전성 구상적혈구증, 헤르만스키-푸들락 증후군, 호모시스틴뇨증, 고옥소산뇨증, 저베타지질단백혈증, 저섬유소원혈증, 임신의 간내 담즙정체, 라포라 질환, 리포아미드 탈수소효소 결핍증, 리포단백질 장애, 모리악 증후군, 이색성 백질영양증, 미토콘드리아 세포병증, 나바호족 신경간병증, 니만-픽 질환, 비증후군성 담관 결핍, 북미 인디언 소아 간경변, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증, 부분 지방이영양증, 피어슨 증후군, 지연성 피부 포르피린증, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 1형 진행성 가족성 간내 담즙정체, 2형 진행성 가족성 간내 담즙정체, 단백질 C 결핍증, 슈와흐만 증후군, 탕헤르 질환, 혈소판감소성 자반병, 총지방이영양증, 1형 글리코겐증, 티롤산 간경변, 티로신혈증, 요소 회로 장애, 정맥폐쇄성 질환, 윌슨 질환, 월만 질환, X-연관 고-IgM 증후군, 및 젤위거 증후군을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 따른 대상체의 치료는 예를 들어 연장된 생존, 지연된 질환 진행(예를 들어 지연된 간부전), 간부전의 예방, 간 기능 향상 및/또는 정상화, 아미노산 수준의 향상 및/또는 정상화, 암모니아 수준의 향상 및/또는 정상화, 알부민 수준 향상 및/또는 정상화, 빌리루빈 향상 및/또는 정상화, 표현형 번성 실패로부터의 회복, 무기력 감소, 둔감 감소, 발작 감소, 황달 감소, 혈청 포도당 향상 및/또는 정상화, INR 향상 및/또는 정상화, 소변 검사 결과 향상 및/또는 정상화 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 임상적 이점 및/또는 측정 가능한 성과를 초래할 수 있다.
예를 들어 일부 경우, 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포의 투여는 예를 들어 치료 표준에 따라 치료되고/되거나 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 조작되지 않은 간세포 및/또는 간세포 선조세포가 투여된 대상체와 비교하여, 간부전을 초래하는 간 질환 및/또는 병태를 갖는 대상체의 생존을 적어도 5% 증가시킨다. 이러한 대상체에서 관찰된 증강된 생존 수준은 다양할 수 있으며, 예를 들어 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60% 또는 그 이상의 생존 증가를 포함하지만 이로 제한되지 않는 적어도 5% 내지 60% 또는 그 이상의 증가 범위일 수 있다. 일부 경우, 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 간세포 선조세포가 투여된 대상체는 예를 들어 간부전 및/또는 이에 기인하는 임의의 증상(들)과 같으나 이로 제한되지 않는 질환 진행 및/또는 하나 이상의 질환 증상의 발병의 지연을 경험할 수 있다. 질환 진행 및/또는 증상 발병의 이러한 지연은 예를 들어 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 1년 또는 그 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 수일, 수주, 수개월 또는 수년 또는 그 이상 동안 지속될 수 있다. 환자에게 투여된 본원에 기술된 간세포는 시간이 경과함에 따라 환자에게 유익한 치료 반응을 발휘한다.
치료될 수 있는 간 병태의 비제한적인 예는 급성 간헐성 포르피린증, 급성 간부전, 알라질 증후군, 알코올성 지방간 질환, 알코올성 간염, 알코올성 간경변, 알코올성 간 질환, 알파 1-항트립신 결핍증, 아메바성 간 농양, 자가면역 간염, 담즙성 간경변, 버드-키아리 증후군, 화학적 및 약물 유도 간 손상, 담즙정체, 만성 간염, 만성 B형 간염, 만성 C형 간염, 만성 D형 간염, 말기 간 질환, 적혈구 조혈 프로토포르피린증, 근막증, 지방간 질환, 국소 결절 증식증, 간성 에키노코쿠스증, 간성 뇌병증, 간경색, 간기능 부전, 간 포르피린증, 간 결핵, 간정맥-폐색 질환, 간염, 간세포 암종, 간 적혈구 조혈 포르피린증, 간렌즈핵 변성, 간비대, 간폐 증후군, 간신 증후군, 유전성 코프로포르피린증, 간 농양, 간세포 선종, 간경변, 간부전, 간 신생물, 다량의 간괴사, 비알코올성 지방간 질환, 기생충성 간 질환, 간자반병, 지연성 피부 포르피린증, 문맥압항진증, 화농성 간농양, 라이 증후군, 혼합 포르피린증, 바이러스성 간염, 바이러스성 A형 간염, 바이러스성 B형 간염, 바이러스성 C형 간염, 바이러스성 D형 간염, 바이러스성 E형 간염 및 젤위거 증후군 등을 포함한다. 일부 경우, 대상체는 섬유증 또는 섬유증 병태에 대해 치료될 수 있다. 일부 경우, 대상체는 간경변 또는 간경변 병태에 대해 치료될 수 있다.
유전적 병태의 비제한적인 예는 1p36 결실 증후군, 1q21.1 결실 증후군, 2q37 결실 증후군, 5q 결실 증후군, 5,10-메테닐테트라하이드로폴레이트 신서타제 결핍증, 17q12 마이크로결실 증후군, 17q12 마이크로중복 증후군, 18p 결실 증후군, 21-하이드록실라제 결핍증, 알파 1-항트립신 결핍증, AAA 증후군(이완불능-애디슨니아니즘(addisonianism)-무루증 증후군), 아르스코그-스코트 증후군, ABCD 증후군, 무세룰로플라스민혈증, 무수족증, II형 연골무형성, 연골무형성증, 급성 간헐성 포르피린증, 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍증, 부신백질이영양증, 알라질 증후군, 어덜트(ADULT) 증후군, 에카디-구티어 증후군, 백색증, 알렉산더 질환, 알피 증후군, 알캅톤뇨증, 알포트 증후군, 소아기 교대성 편마비, 근위축성 측삭 경화증-전측두엽 치매, 알스트롬 증후군, 알츠하이머 질환, 법랑질 형성부전증, 아미노레불린산 탈수효소 결핍증 포르피린증, 안드로겐 둔감성 증후군, 안젤만 증후군, 아페르트 증후군, 관절굽읍증-신장 기능장애-담즙정체 증후군, 모세혈관 확장성 운동실조, 악센펠트 증후군, 베어-스티븐슨 커티스 기라타 증후군, 베크위트-위드만 증후군, 벤자민 증후군, 비오티니다제 결핍증, 비욘스타드 증후군, 블룸 증후군, 버트-호그-두브 증후군, 브로디 근병증, 브루너 증후군, 카다실(CADASIL) 증후군, 묘안 증후군, 크라실(CRASIL) 증후군, 만성 육아종성 장애, 굴지 형성이상, 카나반 질환, 카펜터 증후군, CDKL5 결핍증 장애, 대뇌 이형성증-신경병증-어린선-각질피부증 증후군(CEDNIK), 낭포성 섬유증, 샤르코-마리-투스 질환, 차지(CHARGE) 증후군, 체디아크-히가시 증후군, 연골형성이상증, 그레베형, 쇄골두개 이형성증, 코케인 증후군, 코핀-로리 증후군, 코헨 증후군, 콜라겐병증, II형 및 XI형, 선천성 무통무한증(CIPA: congenital insensitivity to pain with anhidrosis), 선천성 근이영양증, 코넬리아 드 랑게 증후군(CDLS), 카우덴 증후군, CPO 결핍증(코프로포르피린증), 두개-렌즈선조체-봉합선 이형성증(cranio-lenticulo-sutural dysplasia), 크라이 두챗, 크론 질환, 크로우존 증후군, 크로우존데르모골격 증후군(Crouzonodermoskeletal syndrome)(흑색가시세포증을 동반한 크로우존 증후군), 큐라리노 증후군, 다리에 질환, 덴트 질환(유전성 고칼슘뇨증), 데니스-드래쉬 증후군, 드 그루시 증후군, 다운 증후군, 디죠지 증후군, 원위부 유전성 운동 신경병증, 다발성 유형, 원위부 근이영양증, 뒤센 근이영양증, 드라베 증후군, 에드워드 증후군, 엘러스-단로스 증후군, 엠마누엘 증후군, 에머리-드레이푸스 증후군, 수포성 표피박리증, 적혈구 조혈 프로토포르피린증, 판코니 빈혈(FA), 파브리 질환, 인자 V 라이덴 혈전성향증, 치명적 가족성 불면증, 가족성 샘종 폴립증, 가족성 자율신경실조증, 가족성 크로이츠펠트-야콥 질환, 페인골드 증후군, FG 증후군, 유약 X 증후군, 프리드리히 운동실조증, G6PD 결핍증, 갈락토스혈증, 고셔 질환, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군, 길레스피 증후군, 글루타르산뇨, 1형 및 2형, 그라실레(GRACILE) 증후군, 그리셀리 증후군, 헤일리-헤일리 질환, 할리퀸형 어린선, 1형 혈색소침착증, 2A형 혈색소침착증, 2B형 혈색소침착증, 3형 혈색소침착증, 4형 혈색소침착증, 5형 혈색소침착증, A형 혈우병, B형 혈우병, 간 적혈구 조혈 포르피린증, 유전성 코프로포르피린증, 유전성 출혈 모세혈관확장증(오슬러-베버-렌두 증후군), 유전성 봉입체 근병증, 유전성 다발성 외골종, 유전성 강직성 하반신마비(영아-발병 상행성 유전성 강직성 하반신마비), 헤르만스키-푸들라크 증후군, 압박 마비 유전성 신경병증(HNPP: hereditary neuropathy with liability to pressure palsies), 이소성(heterotaxy), 호모시스틴뇨증, 헌팅턴 질환, 헌터 증후군, 헐러 증후군, 허친슨-길포드 조로증 증후군, 고라이신혈증, 고옥살산뇨, 원발성, 고페닐알라닌혈증, 저알파지질단백혈증(탕헤르 질환), 저연골형성증, 연골형성저하증, 면역결핍증-동원체 불안정-안면 이상 증후군(ICF 증후군), 색소 실조증, 이스키오파텔라 이형성증(ischiopatellar dysplasia), 쌍중심절 15, 잭슨-바이스 증후군, 야콥센 증후군, 주버트 증후군, 청소년 원발성 측삭 경화증(JPLS), 켈로이드 장애, KIF1A-연관 신경학적 장애, 클리프스트라 증후군, 니스트 이형성증, 코사키 과성장 증후군, 크라베 질환, 쿠로프-라켑 증후군, LCAT 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 리-프라우메니 증후군, 지대형 근이영양증, 린치 증후군, 지질단백질 리파제 결핍증, 악성 고열증, 단풍당밀뇨 질환, 마판 증후군, 마로토-라미 증후군, 맥쿤-알브라이트 증후군, 맥러드 증후군, 메드닉(MEDNIK) 증후군, 지중해열, 가족성, 멘케스 질환, 메트헤모글로빈혈증, 메틸말론산혈증, 마이크로 증후군, 소두증, 밀러-디커 증후군, 모르키오 증후군, 모와트-윌슨 증후군, 뮨케 증후군, 1형 다발성 내분비 샘종양(웨르마 증후군), 2형 다발성 내분비 샘종양, 근이영양증, 근이영양증, 뒤센 및 베커 유형, 미오스타틴-관련 근육 비대, 근긴장성 이영양증, 나토위츠 증후군, I형 신경섬유종증, II형 신경섬유종증, 니만-픽 질환, 비케톤성 고글리신혈증, 비증후군성 난청, 누난 증후군, 노만-로버츠 증후군, 오그덴 증후군, 오멘 증후군, 불완전 골형성, 판토테네이트 키나제-연관 신경변성, 파타우 증후군(3염색체성 13), PCC 결핍증(프로피온산혈증), 지연성 피부 포르피린증(PCT), 펜드레드 증후군, 포이츠-예거 증후군, 파이퍼 증후군, 펠란-맥더미드 증후군, 페닐케톤뇨증, 피페콜린산혈증, 피트-홉킨스 증후군, 다낭성 신장 질환, 다낭성 난소 증후군(PCOS), 포르피린증, 프라더-윌리 증후군, 원발성 섬모 이운동증(PCD), 원발성 폐 고혈압, 단백질 C 결핍증, 단백질 S 결핍증, 근위부 18q 결실 증후군, 거짓-고셔 질환, 탄력섬유 거짓황색종, 망막 색소변성증, 레트 증후군, 로버츠 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군(RSTS), 샌드호프 질환, 산필리포 증후군, 슈발트-암펠 증후군, 쉐그렌-라슨 증후군, 선천 척추뼈끝 형성이상(SED), 쉬프린첸-골드베르그 증후군, 겸상 세포 빈혈, 시더리우스 X-연관 정신 지체 증후군, 철적모구 빈혈, 슬라이 증후군, 스미스-렘리-오피츠 증후군, 스미스-마제니스 증후군, 스나이더-로빈슨 증후군, 척수 근육 위축, 척수소뇌성 운동실조증(1형 내지 29형), SSB 증후군(SADDAN), 스타드가르트 질환(황반 변성), 스티클러 증후군(다수의 형태), 스트루드위크 증후군(척추뼈끝 형성이상, 스트루드위크형), 테이-삭 질환, 테트라하이드로비오테린 결핍증, 치사성 이형성증, 트리처 콜린스 증후군, 복합 결절성 경화증(TSC), 터너 증후군, 어셔 증후군, 발문상 포르피린증, 본 히펠-린다우 질환, 폰빌레브란트 질환, 바르덴부르크 증후군, 워랜키 증후군 2, 바이센바처-쯔바이뮐러 증후군, 윌리암스 증후군, 윌슨 질환, 우드하우스-사카티 증후군, 월프-허쉬호른 증후군, 색소성 건피증, X-연관 지적 장애 및 거대고환증(유약 X 증후군), X-연관 척추-숨뇌 근육 위축(척추 및 숨뇌 근육 위축), Xp11.2 중복 증후군, X-연관 중증 복합 면역결핍증(X-SCID), X-연관 철적모구 빈혈(XLSA), 47,XXX(삼중 X 증후군), XXXX 증후군(48, XXXX), XXXXX 증후군(49,XXXXX), XXXXY 증후군(49,XXXXY), XYY 증후군(47,XYY), XXYY 증후군(48,XXYY), XYYY 증후군(48,XYYY), XXXY 증후군(48,XXXY), XYYYY 증후군(49,XYYYY) 및 젤위거 증후군을 포함한다.
유전적 병태는 많은 리소좀 축적 질환을 포함한다. 리소좀 축적 질환의 비제한적인 예는 강글리오시드증(예를 들어 GM2 강글리오시드증(A형, O형, AB형) 및 1형, 2형 및 3형 GM1 강글리오시드증 포함); 니만-픽 질환 A, B 및 C; 1형, 2형 및 3형 고셔 질환; 파브리 질환; 이염성 백질이영양증; 구형체 백질이영양증; 다발성 설파타제 결핍증; 알파 만노사이드축적증; 쉰들러 질환; 아스파르틸글루코사민뇨; 푸코사이드축적증; 헐러 증후군; 샤이에 증후군; 헐러-샤이에 증후군; 헌터 증후군; 산필리포 증후군 A, B, C 및 D; 모르키오 증후군 A 및 B; 마로토-라미 증후군; 슬라이 증후군; 신경 세로이드 리포푸신증; 갈락토시알리도시스; 영아 시알산 축적 질환; 살라 질환; 시알루리아; 시알리도시스 I 및 II; I-세포 질환; 거짓-헐러-다발이영양증; 뮤코지질증 IV; 리소소말산 리파제 결핍증; 폼페 질환; 다논 질환; 시스틴증 등을 포함한다. 유전적 리소좀 축적 질환에서의 원인 돌연변이, 및 개별 리소좀 축적 질환과 연관된 유전자와 결핍 효소가 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Rajkumar & Dumpa. (2021) In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing(www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/books/NBK563270/에서 입수 가능함)]에 기술되었다.
유전적 병태는 많은 요소 회로 장애(UCD)를 포함한다. UCD의 비제한적인 예는 N-아세틸글루타메이트 신타제 결핍증(NAGS 결핍증), 카르바모일포스페이트 신서타제 I 결핍증(CPS1 결핍증: carbamoylphosphate synthetase I deficiency), 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증(OTC 결핍증), I형 시트룰린혈증(citrullinemia type I)(ASS1 결핍증), 아르기노숙신산뇨증(argininosuccinic aciduria)(ASL 결핍증), 아르기나제 결핍증(고아르기닌혈증(hyperargininemia), ARG1 결핍증), 오르니틴 트랜스로카제 결핍증(ORNT1 결핍증, 고오르니틴혈증-고암모니아혈증-호모시트룰린혈증 증후군) 및 시트린 결핍증을 포함한다.
본원에 기술된 치료는 만성적(즉, 연속적) 또는 비-만성적(즉, 비-연속적)으로 수행될 수 있고, 만성적(즉, 연속적) 또는 비-만성적(즉, 비-연속적)인 하나 이상의 제제의 투여를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따른 하나 이상의 제제의 만성 투여는 예를 들어 대상체가 예를 들어 만성 간 병태(예를 들어 만성 간 질환, 간경변, 알코올성 간 질환, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD/NASH), 만성 바이러스 간염 등), 만성 유전적 간 병태(알파-1 항트립신 결핍증, 유전성 혈색소침착증, 윌슨 질환 등), 만성 간-관련 자가면역 병태(예를 들어 원발성 쓸개 간경변(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC), 자가면역 간염(AIH) 등) 등을 포함한 만성 병태를 갖는 경우를 포함하여 다양한 경우에 이용될 수 있다. 만성 병태에 대한 하나 이상의 제제의 투여는 다수의 개월, 1년 이상, 다수의 햇수 등 동안 제제의 투여를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 이러한 만성 투여는 예를 들어 매일, 매일 2회, 매주, 매주 2회, 매달, 매달 2회 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 편리하고 적절한 투여 일정으로 수행될 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 유전적 병태의 교정 또는 다른 지속적인 유전자 치료법의 경우, 만성 병태는 단일 또는 수회(예를 들어 2, 3, 4 또는 5회) 치료에 의해 치료될 수 있다. 하나 이상의 제제의 비만성(non-chronic) 투여는 예를 들어 몇 주, 1주, 며칠을 포함한 몇 개월 이하 동안의 투여, 제한된 횟수의 용량(예를 들어 10회 미만 용량, 예를 들어 1회 용량을 포함하여 9회 이하 용량, 8회 이하 용량, 7회 이하 용량 등)을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
치료 세포의 조성물의 유효량은 적어도 특정 사용 방법, 치료를 받는 대상체, 고통의 중증도, 치료 조성물의 투여 방식, 및 치료제의 작용 기전에 의존할 것이다. 조성물의 "치료적 유효량"은 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 명시된 시약, 예를 들어 치료적 세포의 양이다.
일부 경우, 대상체에게 투여되는 유전적으로 변형된 간세포의 양은 예를 들어 적어도 1000만, 적어도 2500만, 적어도 5000만, 적어도 7500만, 적어도 1억, 적어도 2억 5000만, 적어도 5억, 적어도 7억 5000만, 적어도 10억, 적어도 20억, 적어도 30억, 적어도 40억, 적어도 50억, 적어도 60억, 적어도 70억, 적어도 80억, 적어도 90억, 적어도 100억, 적어도 150억, 적어도 200억, 적어도 300억, 적어도 400억, 적어도 500억, 적어도 600억, 적어도 700억, 적어도 800억, 적어도 900억, 또는 적어도 1000억개의 간세포를 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 간세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 단회 용량 또는 다회 용량으로 전달될 수 있다.
임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도는 다양할 수 있으며, 조성물(들)의 세포의 활성, 조성물의 세포의 작용 안정성과 길이, 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이요법, 투여 방식과 시간, 공동투여되는 약물 조합(들), 및 치료를 받는 숙주의 병태의 중증도를 포함하는 여러 가지 인자에 의존할 것이다.
치료법의 상기 나열된 예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며 본질적으로 기술된 바와 같이 식별된 대상체에서 원하는 치료 성과를 초래하는 임의의 적절한 치료법이 이용될 수 있다.
키트 및 시스템
본 개시내용의 양태는 또한 키트 및 시스템, 그리고 일부 경우 이와 함께 또는 그 안에서 사용하기 위한 장치를 포함한다. 키트 및/또는 시스템은 예를 들어 본 개시내용의 조성물 및 방법에 관하여 상기 기술된 임의의 구성요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트 및/또는 시스템은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 것으로 될 수 있다. 인코딩된 요소는 별개로, 예를 들어 별개의 폴리펩타이드-인코딩 폴리뉴클레오타이드로서 제공될 수 있거나, 적절한 경우 예를 들어 2개 이상의 별개의 폴리펩타이드 또는 비코딩 핵산을 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오타이드로서 조합될 수 있다. 이에, 다수의 인코딩된 구성요소는 예를 들어 이러한 다수의 인코딩된 구성요소가 공유된(예를 들어 단일 또는 단일 세트의) 또는 별개의(예를 들어 개별적인 또는 별개 세트의) 조절 요소의 제어 하에 있는 것을 포함하여 단일 또는 다수의 벡터 상에 제공될 수 있다. 제제는 개별 용기에 있을 수 있거나, 임의의 기술된 또는 적절한 조합에 따라 공유 용기로 조합될 수 있다. 유용한 용기는 바이알, 튜브, 주사기, 병, 백, 앰플, 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 키트는 장치를 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우, 본 개시내용의 키트 및/또는 시스템은 예를 들어 세포의 유전적 변형을 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어 하나 이상의 유전자 편집 조성물, 하나 이상의 이식유전자 시약, 및/또는 등과 같은 하나 이상의 변형 시약을 포함할 수 있다.
일부 경우, 키트 및/또는 시스템은 예를 들어 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 벡터와 같은 벡터를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 통합 또는 비통합될 수 있다. 일부 경우, 이용되는 벡터는 통합 벡터일 수 있으며, 통합 벡터는 간세포 또는 이의 선조세포 내로의 이식유전자의 기능적 통합에 충분하다. 일부 경우, 키트 및/또는 시스템은 편집 조성물을 포함할 수 있으며, 예를 들어 편집 조성물은 간세포 또는 이의 선조세포에서 HLA 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분하다. 일부 경우, 키트 및/또는 시스템은 예를 들어 키트 및/또는 시스템의 구성요소, 예컨대 용기, 설계 요소, 설명서, 인터넷-접근 가능한 매체에 대한 명령어 등 및/또는 이들의 조합의 특정 구성을 통해 간세포 또는 선조세포를 변형하도록 구성될 수 있다. 이러한 특정 구성은 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 이의 선조세포를 생성하기 위해 그리고 생산된 유전적으로 변형된 세포를 예를 들어 생물반응기에서 확장시키기 위해 키트의 구성요소, 예컨대 키트에 제공되는 하나 이상의 변형 시약을 이용하도록 사용자를 안내할 수 있다. 일부 경우, 키트는 예를 들어 세포가 예를 들어 생체내 생물반응기에서 확장될 수 있는 시설로 운송하기 위해 유전적으로 변형된 세포의 보존 및/또는 제조를 위한 구성요소 및/또는 설명서를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 예를 들어 벡터가 HLA 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분한 것을 포함하여 예를 들어 LNP와 같은 비바이러스 벡터를 포함하는 편집 조성물을 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 유전적으로 변형된 간세포 및/또는 이의 선조세포의 동결보존이 유전적으로 변형된 간세포의 확장 전에 그리고/또는 후에 수행되는 것을 포함하여 이러한 동결보존을 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
상기 구성요소에 더하여, 키트 및/또는 시스템은 (특정 실시형태에서) 방법을 실시하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 설명서는 여러 가지 형태로 키트에 존재하고/하거나 시스템에 제공될 수 있으며, 이들 중 하나 이상이 키트에 존재하고/하거나 시스템에 제공될 수 있다. 이러한 설명서가 존재할 수 있는 하나의 형태는 키트 및/또는 시스템의 패키징, 패키지 삽입물 등에 적합한 매체 또는 기재(substrate) 상에 프린트된 정보, 예를 들어 정보가 프린팅되어 있는 종이 조각 또는 조각들로서 존재할 수 있다. 이러한 설명서의 더욱 다른 형태는 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, 컴팩트 디스크(CD), 플래쉬 드라이브 등이다. 존재할 수 있는 이러한 설명서의 더욱 다른 형태는, 제거된 사이트의 정보에 인터넷을 통해 접근하는 데 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다.
첨부된 청구범위에도 불구하고, 본 개시내용은 하기 실시형태에 의해서도 정의된다.
1. 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포를 생성하는 방법으로서,
인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는 세포 집단을, 간세포 또는 이의 선조세포에서 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분한 조건 하에, 편집 조성물과 접촉시키는 단계; 및
세포 집단을, 간세포 또는 이의 선조세포에 의한 이식유전자의 발현에 충분한 조건 하에, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자와 접촉시켜,
이로써 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 편집 조성물은 베타-2-마이크로글로불린(B2M)-편집 조성물인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 인간 간세포 또는 이의 선조세포는 1차 인간 간세포인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 한 실시형태에 있어서, 생성된 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생물반응기 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
5. 실시형태 4에 있어서, 생물반응기는 생체내 생물반응기이고, 생체내 생물반응기는 저면역원성 간세포의 확장된 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지되며, 선택적으로 생체내 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 한 실시형태에 있어서, 생물반응기에서 인간 간세포 또는 이의 선조세포를 확장시키는 단계 및 확장 후 생물반응기로부터 세포를 추출하여 인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
7. 실시형태 6에 있어서, 생물반응기에서 확장된 인간 간세포 또는 이의 선조세포는 1차 인간 간세포인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포 집단은 편집 조성물 및 이식유전자와 동시에 접촉되는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
9. 실시형태 1 내지 7 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포 집단은 이식유전자와 접촉되기 전에 편집 조성물과 접촉되고, 선택적으로 세포 집단의 간세포 또는 이의 선조세포는 편집 조성물 및 이식유전자과 접촉되는 사이에 확장되는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
10. 실시형태 1 내지 7 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포 집단은 편집 조성물과 접촉되기 전에 이식유전자와 접촉되고, 선택적으로 세포 집단의 간세포 또는 이의 선조세포는 이식유전자 및 편집 조성물과 접촉되는 사이에 확장되는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포 집단을 이식유전자와 접촉시키는 단계는 세포 집단을 이식유전자를 포함하는 통합 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 통합 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 한 실시형태에 있어서, 편집 조성물은 CRISPR-Cas 단백질 또는 CRISPR-Cas 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 한 실시형태에 있어서, 편집 조성물과 접촉시키는 단계는 세포 집단을, 간세포 또는 선조세포의 B2M 유전자위를 교란시키기에 충분한 시약을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로 벡터는 비바이러스 벡터이고, 선택적으로 비바이러스 벡터는 지질 나노입자(LNP)인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
15. 실시형태 14에 있어서, 벡터는
Cas9 단백질 및 B2M 유전자위를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하거나; 또는
Cas9 단백질 및 gRNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP)을 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 한 실시형태에 있어서, 방법은 세포 집단을, 간세포 또는 선조세포에서 HLA 부류 II 결핍증을 생성하기에 충분한 조건 하에, HLA 부류 II-표적화 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
17. 실시형태 16에 있어서, HLA 부류 II-표적화 조성물은, 충분한 조건 하에 HLA 부류 II 유전자의 발현을 야기하는 전사 인자 또는 보조활성화제(coactivator)를 인코딩하는 유전자위를 편집하는 편집 조성물을 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
18. 실시형태 17에 있어서, HLA 부류 II-표적화 조성물은 부류 II, 주요 조직적합성 복합체, CIITA 유전자위를 편집하는 트랜스활성화제(transactivator)(CIITA)-편집 조성물을 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
19. 실시형태 18에 있어서, CIITA-편집 조성물은 CRISPR-Cas 단백질 또는 CRISPR-Cas 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 CIITA 유전자위를 표적화하는 gRNA 또는 gRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
20. 실시형태 17 내지 19 중 어느 한 실시형태에 있어서, 편집 조성물과 접촉시키는 단계는 세포 집단을, 전사 인자 또는 보조활성화제를 인코딩하는 유전자위를 교란시키기에 충분한 시약을 포함하는 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며, 선택적으로 벡터는 비바이러스 벡터이고, 선택적으로 비바이러스 벡터는 지질 나노입자(LNP)인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
21. 실시형태 20에 있어서, 벡터는
Cas9 단백질 및 유전자위를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하거나; 또는
Cas9 단백질 및 gRNA를 포함하는 RNP를 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 한 실시형태에 있어서, 생성된 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
23. 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서,
유효량의 저면역원성 간세포 또는 선조세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 저면역원성 간세포 또는 선조세포는 각각 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하고, 선택적으로 병태는 간 병태인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 대상체는 면역억제에 대해 금기(contraindication)를 갖는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
25. 실시형태 23 또는 24에 있어서, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포는 실시형태 1 내지 22 중 어느 한 실시형태의 방법에 따라 생성되는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
26. 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류로서, 세포 집단은 복수의 저면역원성 인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하며, 복수의 간세포 또는 선조세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
27. 실시형태 26에 있어서, 생착된 세포 집단은 비인간 포유류에 대해 동종이계 또는 이종성 세포 집단인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
28. 실시형태 26 또는 27에 있어서, 비인간 포유류는 생체내 생물반응기이고, 선택적으로 생체내 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
29. 실시형태 26 내지 28 중 어느 한 실시형태에 있어서, 저면역원성 인간 간세포 또는 이의 선조세포는 1차 인간 간세포인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
30. 실시형태 26 내지 29 중 어느 한 실시형태에 있어서, HLA 부류 I 결핍증은 B2M 결핍증을 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
31. 실시형태 26 내지 30 중 어느 한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
32. 실시형태 26 내지 31 중 어느 한 실시형태에 있어서, 복수의 간세포 또는 선조세포의 각각은 HLA 부류 II 결핍증을 추가로 포함하며, 선택적으로 HLA 부류 II 결핍증은 HLA 부류 II 유전자의 발현을 야기하는 전사 인자 또는 보조활성화제에서의 결핍증을 포함하고, 선택적으로 전사 인자 또는 보조활성화제는 CIITA인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
33. 실시형태 26 내지 32 중 어느 한 실시형태의 비인간 포유류로부터 단리된 저면역원성 인간 간세포 또는 이의 선조세포의 확장된 집단을 포함하는 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
34. 실시형태 33에 있어서, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단은 동결보존되는, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
35. 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단으로서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
36. 실시형태 35에 있어서, HLA 부류 I 결핍증은 B2M 결핍증을 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
37. 실시형태 35 또는 36에 있어서, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
38. 실시형태 35 내지 37 중 어느 한 실시형태에 있어서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 II 결핍증을 추가로 포함하며, 선택적으로 HLA 부류 II 결핍증은 HLA 부류 II 유전자의 발현을 야기하는 전사 인자 또는 보조활성화제에서의 결핍증을 포함하고, 선택적으로 전사 인자 또는 보조활성화제는 CIITA인, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
39. 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법으로서,
인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는 세포 집단을, 이식유전자의 기능적 통합에 충분한 조건 하에, 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 통합 벡터와 접촉시켜, 통합된 이식유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포를 생산하는 단계; 및
유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포를 생체내 생물반응기 내로 이식하고, 생체내 반응기를 유전적으로 변형된 간세포 또는 선조세포의 확장에 충분한 조건 하에 유지시켜, 유전자 생성물을 발현하는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계로서, 선택적으로 생체내 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
40. 실시형태 39에 있어서, 인간 간세포 또는 이의 선조세포는 1차 인간 간세포인, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
41. 실시형태 39 또는 40에 있어서, 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
42. 실시형태 39 내지 41 중 어느 한 실시형태에 있어서, 이식유전자는 구리-수송 ATPase 2(ATP7B: copper-transporting ATPase 2), 유전성 혈색소침착증 단백질(HFE: hereditary hemochromatosis protein), 헤모주벨린(hemojuvelin), 헵시딘(HAMP: hepcidin), 트랜스페린 수용체 단백질 2(TFR2: transferrin receptor protein 2), 용질 담체 계열 40 구성원 1(SLC40A1: solute carrier family 40 member 1), 인자 IX, 인자 VIII, 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1: carbamoyl-phosphate synthase), N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS: N-acetylglutamate synthase), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC: ornithine transcarbamylase), 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA: alpha-galactosidase A gene), 페닐알라닌 하이드록실라제 효소(PAH: phenylalanine hydroxylase enzyme), 아르기나제(ARG: arginase), 알파-1 항트립신(AAT: alpha-1 antitrypsin), 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH: fumarylacetoacetate hydrolase), 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL: argininosuccinate lyase), 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS: argininosuccinate synthase), 오르니틴 트랜스로카제(ORNT1: ornithine translocase), 시트린(citrin), UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1: UDP-glucuronosyltransferase 1A1), 트랜스티레틴(TTR: transthyretin), 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼라제(AGXT: serine-pyruvate aminotransferase), 보체 인자 H(CFH: complement factor H) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 생성물을 인코딩하는, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
43. 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서,
유효량의 실시형태 39 내지 42 중 어느 한 실시형태의 방법에 따라 생성된 유전적으로 변형된 인간 간세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
44. 실시형태 43에 있어서, 병태는 간 병태인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
45. 실시형태 43 또는 44에 있어서, 병태는 유전적 질환, 선택적으로 단일유전자 질환인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
46. 실시형태 45에 있어서, 병태는 인자 VIII 결핍증이고 이식유전자는 인자 VIII을 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
47. 실시형태 46에 있어서, 병태는 A형 혈우병인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
48. 실시형태 45에 있어서, 병태는 인자 IX 결핍증이고 이식유전자는 인자 IX를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
49. 실시형태 48에 있어서, 이식유전자는 파두아 변이체(Padua variant) 인자 IX를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
50. 실시형태 48 또는 49에 있어서, 병태는 B형 혈우병인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
51. 실시형태 46 내지 50 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체에서 응고를 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
52. 실시형태 43에 있어서, 병태는 요소 회로 장애(UCD)이고 이식유전자는 하나 이상의 요소 회로 폴리펩타이드를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
53a. 실시형태 52에 있어서, 이식유전자는 질소 배설물의 대사에 있어서 속도-제한적인 하나 이상의 요소 회로 폴리펩타이드를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
53b. 실시형태 43에 있어서, 병태는 리소좀 축적 질환, 선택적으로 파브리 질환이고, 이식유전자는 리소좀 축적 질환과 연관된 효소, 선택적인 알파-갈락토시다제 A 폴리펩타이드를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
54. 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류로서, 세포 집단은 복수의 유전적으로 변형된 인간 간세포를 포함하며, 복수의 간세포의 각각은 유전자 생성물을 인코딩하는 기능적으로 통합된 이식유전자를 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
55. 실시형태 54에 있어서, 생착된 세포 집단은 생체내 확장된 세포 집단이고, 비인간 포유류는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 간세포 자손을 추가로 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
56. 실시형태 54 또는 55에 있어서, 유전적으로 변형된 인간 간세포는 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 추가로 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
57. 실시형태 56에 있어서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 II 결핍증을 추가로 포함하며, 선택적으로 HLA 부류 II 결핍증은 HLA 부류 II 유전자의 발현을 야기하는 전사 인자 또는 보조활성화제에서의 결핍증을 포함하고, 선택적으로 전사 인자 또는 보조활성화제는 CIITA인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
58. 실시형태 54 내지 57 중 어느 한 실시형태에 있어서, 이식유전자는 구리-수송 ATPase 2(ATP7B), 유전성 혈색소침착증 단백질(HFE), 헤모주벨린, 헵시딘(HAMP), 트랜스페린 수용체 단백질 2(TFR2), 용질 담체 계열 40 구성원 1(SLC40A1), 인자 IX, 인자 VIII, 폰빌레브란트 인자, 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1), N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC), 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA), 페닐알라닌 하이드록실라제 효소(PAH), 아르기나제(ARG), 알파-1 항트립신(AAT), 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH), 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL), 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS), 오르니틴 트랜스로카제(ORNT1), 시트린, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1), 트랜스티레틴(TTR), 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼라제(AGXT), 보체 인자 H(CFH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 생성물을 인코딩하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
59. 실시형태 54 내지 58 중 어느 한 실시형태에 있어서, 비인간 포유류는 생체내 생물반응기인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
60. 실시형태 59에 있어서, 생체내 생물반응기는 설치류인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
61. 실시형태 59에 있어서, 설치류 생체내 생물반응기는 래트 생체내 생물반응기인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
62. 실시형태 59에 있어서, 생체내 생물반응기는 돼지인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
63. 실시형태 60 내지 62 중 어느 한 실시형태에 있어서, 설치류 생체내 생물반응기는 인터류킨 2 수용체 하위단위 감마(IL2rg), 재조합 활성화 유전자 1(RAG1), 재조합 활성화 유전자 2(RAG2) 또는 이들의 조합에 대해 결핍인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
64. 실시형태 60 내지 63 중 어느 한 실시형태에 있어서, 설치류 생체내 생물반응기는 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH)에 대해 결핍인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
65. 실시형태 54 내지 62 중 어느 한 실시형태에 있어서, 이의 유전적으로 변형된 인간 간세포는 변형된 1차 인간 간세포인, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
66. 실시형태 54 내지 65 중 어느 한 실시형태의 비인간 포유류로부터 단리된 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 포함하는 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
67. 실시형태 66에 있어서, 간세포의 집단은 동결보존되는, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
68. 실시형태 66 또는 67에 있어서, 집단은 1억 내지 200억개의 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
69. 실시형태 66 내지 68 중 어느 한 실시형태에 있어서, 간세포 또는 이의 선조세포는 용기에 존재하고, 선택적으로 용기는 배양 용기, 튜브, 플라스크, 바이알, 크라이오바이알(cryovial) 또는 크라이오백(cryo-bag)인, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
70. 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단으로서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
71. 실시형태 70에 있어서, 1억 내지 200억개의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
72. 실시형태 70 또는 실시형태 71에 있어서, 세포 집단은 용기에 존재하고, 선택적으로 용기는 배양 용기, 튜브, 플라스크, 바이알, 크라이오바이알 또는 크라이오백인, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단.
73. 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법으로서,
(1a) 인간 간세포를 유전적으로 변형시키고, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 하나 이상의 생체내 생물반응기에서 확장시켜, 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계, 또는
(1b) 하나 이상의 생체내 생물반응기로부터 수득되는 확장된 인간 간세포를 유전적으로 변형시켜, 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 1a 또는 1b의 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 복수의 간세포 세포 치료법 용량으로 분취하는 단계를 포함하는, 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법.
74. 실시형태 73에 있어서, 복수는 각각 적어도 10억개 간세포의 적어도 10개 용량, 선택적으로 적어도 100억개 간세포의 적어도 10개 용량, 선택적으로 적어도 10억개 세포의 적어도 100개 용량을 포함하는, 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법.
75. 실시형태 73 또는 74에 있어서, 인간 간세포는 단일 인간 간으로부터 유래되는, 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법.
76. 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법으로서,
실시형태 73 내지 75 중 어느 한 실시형태에 따른 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 단계; 및
복수의 용량의 하나 이상을 각각의 대상체에게 투여하여, 병태에 대해 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법.
77. 실시형태 76에 있어서, 복수의 대상체는 적어도 10명의 대상체, 선택적으로 적어도 100명의 대상체를 포함하는, 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법.
78. 실시형태 76 또는 77에 있어서, 복수의 대상체의 각각은 동일한 병태에 대해 치료되는, 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법.
79. 실시형태 76 또는 77에 있어서, 복수의 대상체 중 2명 이상의 대상체는 상이한 병태에 대해 치료되는, 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법.
80. 키트 또는 시스템으로서,
하나 이상의 변형 시약(modifying reagent)으로서:
유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 벡터로서, 간세포 또는 이의 선조세포 내로의 이식유전자의 기능적 통합에 충분한 벡터; 및/또는
간세포 또는 이의 선조세포에서 HLA 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분한 편집 조성물을 포함하는, 하나 이상의 변형 시약; 및
선택적으로, 하나 이상의 변형 시약을 사용하여 간세포 또는 이의 선조세포를 변형시켜 유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포를 생성하고, 유전적으로 변형된 세포를 생물반응기에서 확장시키기 위한 설명서를 포함하는, 키트 또는 시스템.
81. 실시형태 80에 있어서, 벡터는 간세포 또는 이의 선조세포 내로의 이식유전자의 기능적 통합에 충분한 통합 벡터인, 키트 또는 시스템.
82. 실시형태 80 또는 81에 있어서, 편집 조성물은 HLA 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분한 비바이러스 벡터, 선택적으로 LNP를 포함하는, 키트 또는 시스템.
83. 실시형태 80 내지 82 중 어느 한 실시형태에 있어서, 유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포의 동결보존을 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함하는, 키트 또는 시스템.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며; 이들은 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)]; 문헌[Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)]; 및 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]과 같은 표준 교재에서 확인될 수 있으며, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 본 개시내용에서 지칭된 시약, 항체, 세포, 조직 샘플 등은 본원에서 확인된 벤더와 같지만 이로 제한되지 않는 상업적 벤더로부터 입수 가능하다.
실시예 1: 유니버셜 인간 간세포의 생성
1차 인간 간세포(PHH)를 (1) 인간 백혈구 항원(HLA) 부류 I이 결핍되어 이로써 생체내에서 세포독성 T 세포(CTL)에 의한 인식을 차단하도록, 그리고 (2) NK 세포에 대한 유인 수용체를 발현하여 이로써 생체내에서 자연 살해(NK) 세포에 의한 사멸화를 저해하도록 생체외 조작함으로써 유니버셜 인간 간세포를 생성하였다. 베타-2-마이크로글로불린(B2M)의 CRISPR/Cas9 표적화된 녹아웃에 의해 HLA 부류 I 결핍증을 달성하였고, CD47 또는 B2M-HLA-E 융합 작제물을 인코딩하는 이식유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 의해 NK 세포 유인 수용체 발현을 달성하였다.
형질주입 또는 핵주입에 의해 세포에 전달되는 리보핵단백질(RNP)을 함유하는 합성의 화학적으로 변형된 gRNA(Synthego) 및 Cas9의 생산을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 유전자 편집 시약을 PHH에 전달하기 위한 다양한 방법을 이용하고 평가하였다. 예를 들어, CRISPRMAX™ Cas9 시스템(ThermoFishser Scientific)을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 RNP 형질주입을 수행하였다. 약술하자면, TrueCut™ Cas9 단백질 v2(ThermoFisher Scientific) 및 합성의 화학적으로 변형된 sgRNA(Synthego)를 RNP로 복합체화한 다음, 신선하게 해동된 PHH에 CRISPRMAX™ 시약과 함께 직접적으로 첨가한 다음, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 요동시켰다. Lonza 4D-Nucleofector™ X 단위 상에서 P3 1차 세포 4D-핵주입기 키트를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 RNP 핵주입을 수행하였다.
본 실시예에 사용된 B2M 유전자위의 엑손 1을 표적화하는 예시적인 gRNA 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
대조군으로서, 상기 기술된 것과 동일한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하지만 하기 서열을 갖는 AAVS1-표적화 gRNA를 이용하여 무관한 세이프 하버(safe harbor) 유전자위 AAVS1을 표적화하였다:
Figure pct00002
편집 후, 핵주입 또는 형질주입 프로토콜을 받은 세포를, CD47 또는 B2M-HLA-E 융합 이식유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터(LVV)로 37℃에서 2시간 동안 요동시키면서 형질도입하였다. 이용되는 이식유전자의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00003
LVV의 첨가 없이 2시간 동안 요동시키면서 음성 대조군 모의(mock)-형질도입을 또한 수행하여, LVV 형질도입의 부재 하에 B2M 또는 대조군 유전자위 편집의 감정을 가능하게 하였다.
표적화된 B2M 유전자위, 또는 AAVS1 대조군 유전자위에서의 편집 효율을 감정하였다. 약술하자면, 게놈 DNA(gDNA)를 세포 샘플로부터 추출하고, 관심 영역을 PCR 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 Sanger 방법에 의해 시퀀싱하고, 생성된 판독물을 분해에 의한 인델 추적(TIDE: Tracking of Indels by Decomposition) 분석을 받게 하였다. 표적화된 편집 또는 대조군 편집을 받은 세포에서 B2M 및/또는 발현된 이식유전자의 생성된 단백질 발현 수준을, 항-HLA-ABC, 항-HLA-E, 및/또는 항-CD47 특이적 항체를 사용한 유세포 측정법에 의해 평가하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 인델(좌측 y-축, 검정색 막대) 또는 녹아웃(KO) 점수(좌측 y-축, 회색 막대)에 의해 측정된 80% 이상의 편집 효율을 B2M 표적 유전자위와 AAVS1 대조군 유전자위 둘 다에서 각각 관찰하였다. B2M 엑손 1 표적화 시약 단독("B2Mex1-7 RNP 단독") 또는 대조군 유전자위 표적화 시약 단독("AAVS1 RNP 단독")을 이용한 편집 효율은 NK 세포 유인 수용체 LVV 형질도입, 즉, B2M-HLA-E 융합("B2Mex1-7 HLA-E"; "AAVS1 HLA-E") 또는 CD47("B2Mex1-7 CD47"; "AAVS1 CD47")이 포함되었을 때 관찰된 효율과 유사하였다. 더욱이, 유세포 측정법에 의해 측정된 바와 같은 B2M 음성 세포("B2M-")의 백분율(우측 y-축, 적색 점)은, B2M 편집된 샘플("B2Mex1-7 HLA-E", "B2Mex1-7 CD47" 및 "B2Mex1-7 RNP 단독") 내 적어도 80%의 세포가 B2M 단백질을 발현하지 않았음을 나타내었다. 비교에서, AAVS1 대조군 샘플("AAVS1 HLA-E", "AAVS1 CD47" 및 "AAVS1 RNP 단독") 내 샘플 중 30% 미만, 일부 경우 20% 미만은 B2M 음성이었다. 이들 데이터는 기술된 편집 과정을 통한 B2M 음성 PHH의 성공적인 생산을 실증하며, 이는 게놈 수준과 단백질 수준 둘 다에서 B2M KO의 높은 편집 효율 및 특이성을 달성한다.
B2M KO에 더하여, 도입된 NK 유인 수용체 이식유전자, CD47 및 HLA-E의 발현을 또한, 처리된 PHH에서 평가하였다. 전술된 군("B2Mex1-7 HLA-E"; "B2Mex1-7 CD47"; "B2Mex1-7 RNP 단독"; "AAVS1 HLA-E"; "AAVS1 CD47"; "AAVS1 RNP 단독")에서 B2M 음성, 뿐만 아니라 HLA-E 또는 CD47 발현 둘 다의 유세포 측정법 분석의 결과를 도 2에 제공한다. 제시된 바와 같이, B2M에 대해 음성이고 동시에 유인 수용체 발현에 대해 양성인 세포("%B2M-/HLA-E" 또는 "%B2M-/CD47+")의 높은 수준은, B2M 표적화된 편집과 유인 수용체 형질도입 둘 다를 받은 군에서 관찰되었다. 상응하게는, B2M 음성의 낮은 수준은 대조군 편집 반응("AAVS1 HLA-E"; "AAVS1 CD47"; "AAVS1 RNP 단독")에서 관찰되었고, 유인 수용체는 LVV로 처리되지 않은 반응("B2Mex1-7 RNP 단독"; "AAVS1 RNP 단독")에서 본질적으로 부재하였다. 이들 데이터는, 둘 다 B2M 음성이고 2개의 상이한 NK 세포 유인 수용체 중 하나를 발현하는 PHH의 성공적이고 효율적인 생산을 실증한다.
이에 더하여, 이들 데이터는 전술된 접근법이 NK 세포 유인 수용체를 발현하는 한편 HLA 부류 I이 결핍된 이중-조작된 PHH를 50%, 일부 경우 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80% 초과하는 PHH 집단을 초래함을 실증한다. 이러한 백분율은 제한적인 것으로 여겨지지 않으며, 이에, 80% 초과의 이중-조작된 간세포를 갖는 집단은 본원에 기술된 이들 및 다른 방법을 통해 쉽게 달성될 수 있다.
실시예 2: 이중-조작된 1차 인간 간세포는 저면역원성이다
B2M KO를 갖고 CD47 또는 B2M-HLA-E 융합 이식유전자를 발현하는 이중-조작된 PHH를 본질적으로 전술된 바와 같이 생산하였다. 이중 조작된 세포를 다양한 면역 세포 조성물과 다양한 비율로 혼합하고, 생존 검정을 수행하였다. 약술하자면, 조작된 세포를 사이토카인 자극에 의해 활성화되고 강한 이펙터 기능을 갖는 세포독성 T 림프구(CTL) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한 면역 세포와 혼합하고, 이중 조작된 세포의 생존(즉, 생존력)을 시간 경과에 따라 평가하였다.
예를 들어, 2:1 면역-대-표적-세포 공동배양물에서의 생존을 4개의 상이한 표적 세포군에 대해 감정하였다: (1) 이중-조작된 B2M 엑손 1 KO + B2M-HLA-E 이식유전자 세포, (2) 이중-조작된 B2M 엑손 1 KO + CD47 이식유전자 세포, (3) 단일 조작된 B2M 엑손 1 KO RNP 단독 세포, 및 (4) AAVS1 RNP 단독 대조군 세포. 면역 세포는 주로 CTL로 이루어진 이펙터 세포의 혼합물을 포함하였고, 생존을 정량적 이미지화-기반 세포 생존력 검정에 의해 72시간에 걸쳐 감정하였다. 실질적인 생존 증가는 대조군(4)과 비교하여 모든 시점(24시간, 48시간 및 72시간)에 걸쳐 모든 B2M 녹아웃(B2M-; 군 1, 2, 3) PHH에서 관찰되었다.
또 다른 예에서, 면역 세포 혼합물이 주로 NK 세포를 함유하는 경우 2:1 면역-대-표적-세포 공동배양물에서의 생존을 4개의 상이한 표적 세포군에 대해 감정하였다: (1) 이중-조작된 B2M 엑손 1 KO + B2M-HLA-E 이식유전자 세포, (2) 이중-조작된 B2M 엑손 1 KO + CD47 이식유전자 세포, (3) 단일 조작된 B2M 엑손 1 KO RNP 단독 세포, 및 (4) AAVS1 RNP 단독 대조군 세포. 이중-조작된 군 (1)과 (2) 둘 다 대조군(4)과 비교하여 24시간, 48시간 및 72시간 시점에 걸쳐 증가된 수준의 생존을 보여주었으며; 한편, 단일-조작된 군(3)은 B2M 녹아웃에 의해 야기되는 NK 세포에 의한 증가된 "자가 인식 상실(missing-self recognition)"으로 인해 대조군과 비교하여 생존의 저하를 보여주었다.
이들 데이터는, B2M 음성이고 NK 세포 유인 수용체 이식유전자를 발현하도록 이중 조작된 PHH가 비-조작된 세포 및 B2M KO로만 조작된 세포에서 관찰된 면역 세포 사멸화의 수준과 비교하여 감소된 면역 세포 사멸화를 받음을 보여준다. 종합적으로, 이들 검정은, PHH로의 HLA 부류 I 결핍증 및 NK 세포 유인 수용체 발현의 조작이, 활성화된 CTL 및 NK 세포 하위집단을 함유하는 집단을 포함하여 활성화된 면역 이펙터 세포 집단의 존재 하에 증가된 생존을 보여주는 저면역원성 PHH를 생성함을 실증한다.
실시예 3: 저면역원성 조작된 1차 인간 간세포를 이용한 간 재증식
조작된 PHH를, 본질적으로 전술된 바와 같이 LVV 이식유전자 형질도입과 함께 또는 없이 RNP 형질주입 또는 핵주입을 통한 B2M의 CRISPR/Cas9 KO에 의해 생성하였다. 조작된 세포의 4개의 상이한 군, (1) 형질주입을 통한 Cas9 B2M KO RNP, (2) 형질주입 + LVV를 통한 Cas9 B2M KO RNP, (3) 핵주입을 통한 Cas9 B2M KO RNP, 및 (4) 핵주입 +LVV를 통한 Cas9 B2M KO RNP를 동물당 5x105개 생 세포로 비장내 주사를 통해 수용자 FRGN 마우스 내로 별개로 이식하였다. 동물에게 NTBC를 사이클링(cycling)시켜, 선택적 압력을 도입하고 이식된 세포의 생착을 촉진하였다. 이식된 조작 PHH 생착 및 확장을 위한 대리로서의 인간 알부민 수준(hALB)을 이식후 2주, 4주 및 8주째에 감정하였다.
hALB의 수준은 모든 3개의 시점에 걸쳐 모든 군에서 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 모든 군 (1) 내지 (4)의 조작된 세포가 수용자 동물에서 생착되고 확장할 수 있었음을 나타내었다. 더욱이, hALB 수준은 RNP 전달의 형질주입 방식과 핵주입 방식 사이에서 상응하는 시점에서 필적할 만하였고, 이는 편집 구성요소의 어느 한 전달 방법이 간 생착 및 재증식을 할 수 있는 기능적으로 조작된 PHH를 생성하는 데 성공적으로 이용될 수 있음을 나타내었다. 이에 더하여, 입력 집단 내에서 원하는 조작된 특징(즉, B2M KO, HLA-E 이식유전자 발현, 또는 KO와 이식유전자 발현 둘 다)을 갖는 세포, 즉, FRGN 생물반응기 내로의 이식에 사용되는 생체외 조작된 PHH의 표시를 출력 집단, 즉, 생체내 확장 후 재증식된 FRGN 생물반응기로부터 정제된 간세포와 비교하였다. 도 3a 내지 도 3d는 DNA 분석에 의해 측정된 바와 같은 B2M KO(도 3a), 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 B2M KO(도 3b), 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 HLA-E 이식유전자 발현(도 3c), 및 유세포 측정법 분석에 의해 측정된 바와 같은 이중 변형(즉, B2M KO와 이식유전자 발현 둘 다)(도 3d)을 갖는 입력 및 출력 집단으로부터의 원하는 조작된 세포(형질주입 또는 핵주입을 사용하여 생성됨)의 백분율을 제공한다. 비처리-대조군(NTC) 동물(즉, 비변형된 PHH가 이식된 동물)로부터의 샘플이 또한 병행하여 감정되었다. 제시된 바와 같이, 이들 비교는 입력 집단과 출력 집단 사이의 원하는 조작된 세포의 놀랍게도 유사한 표시를 보여주었으며, 이는 조작된 간세포와 비변형 간세포 사이의 필적할 만한 생착, 확장 및 재증식 동역학(kinetics)을 나타낸다. 이에 더하여, 연구 종료(이식후 24주) 시, 조작된 PHH가 이식된 숙주 FRGN 간은, 비변형 PHH(FAH에 대한 간 면역 조직화학 및 hAlb ELISA에 의해 측정된 바와 같음)를 보여준 NTC 동물과 비교하여 유사한 수준의 재증식 및 인간화를 보여주었다. 예를 들어, 조작된 세포가 이식된 2 가지의 대표적인 동물은 대표적인 NTC 동물에서 관찰된 바와 같은 90.81% FAH+ 세포 및 11,607 μg/mL hAlb와 비교하여 89.76% 및 89.54%의 FAH+ 세포와의 재증식 및 12,489 μg/mL 및 11,615 μg/mL의 hAlb 수준을 보여주었다.
종합적으로, 이들 데이터는, 일반적으로 저면역원성 PHH, 뿐만 아니라 본원에 기술된 방법에 따라 게놈 편집물 및/또는 통합된 이식유전자로 조작된 PHH가 기능적이며 수용자 간을 재증식시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 재증식은 비편집/비변형 세포와 필적할 만한 동역학으로 발생하는 것으로 관찰되었으며, 이러한 방식으로 조작된 간세포 및 이의 자손은 숙주 간에서 지속될 것임을 나타낸다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이 유니버셜 간세포, 및 일반적으로 임의의 편집물 또는 이식유전자로 조작된 간세포는 예를 들어 생체내 생물반응기에 이식되고 성공적으로 확장되며, 치료 목적 등을 위해 대상체 내로 이식될 수 있다.
실시예 4: 이식유전자-조작된 PHH는 생체내에서 생리학적으로 관련된 양의 치료적 이식유전자를 생착시키고, 확장시키고, 생산한다
생체내 FRG 래트 확장된 인간 간세포(huFRG)를 단리하고, 동결보존하였다. 동결보존을 위해, 간세포 세포 현탁액을 용기 내로 분취하고, 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 저온 조건 하에 동결보존 배지에 부드럽게 재현탁시켜, 예를 들어 mL당 1000만개의 생 세포와 같이 원하는 최종 농도에 도달하게 하였고, 재현탁된 세포를 4℃ 내지 8℃에서 유지시켰다. 동결보존용으로 제조된 간세포를 냉동 용기 내로 분취하고, 속도 제어된 냉동기를 사용하여 냉동시켰다. 속도 제어 냉동을 완료한 후, 동결보존된 간세포를 저장용 기상 액체 질소로 옮겼다. 동결보존된 huFRG 간세포를 해동시키고, 인간 인자 IX(즉, F9 또는 FIX) 또는 마커/대조군으로서 반딧불이 루시퍼라제(즉, Luc)를 인코딩하는 발현 카세트와 함께 렌티바이러스 벡터를 통해 형질도입하였다.
이 실시예에 이용되는 렌티바이러스 벡터(LakePharma/Curia) F9 발현 작제물은 3'LTR(서열 번호 004)에 작동 가능하게 연결된 F9 파두아 변이체 폴리펩타이드(서열 번호 003)를 인코딩하는 F9 코딩 서열(서열 번호 002)에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터(서열 번호 001)를 포함하였다.
이 실시예에 이용된 렌티바이러스 벡터(Imanis LV050L) Luc 발현 작제물은 3'LTR(서열 번호 004)에 작동 가능하게 연결된 Luc 폴리펩타이드(서열 번호 007)를 인코딩하는 Luc 코딩 서열(서열 번호 006) 및 EmGFP 폴리펩타이드(서열 번호 009)를 인코딩하는 EmGFP 코딩 서열(SEQ IDNO:008)에 작동 가능하게 연결된 SFFV 프로모터(서열 번호 005)를 포함하였다.
형질도입 후, 형질도입된 huFRG 간세포를 비장내 주사를 통해 FRGN 수용자 마우스 내로 이식하고, 마우스를 이식된 huFRG 간세포의 생착 및 확장에 충분한 조건 하에 유지시켰다. F9-인코딩 렌티바이러스 벡터(이하, "LV-F9 마우스") 또는 루시퍼라제-인코딩 렌티바이러스 벡터(이하, "LV-Luc 마우스")가 이식된 마우스를 후속적으로, 숙주 마우스 간 내의 이식된 세포의 확장 동안 다양한 시점에서 IVIS 살아 있는 동물 생물발광 이미지화 시스템(PerkinElmer, 미국 메사추세스주 월썸 소재)을 사용하여 루시퍼라제 생물발광에 대해 검정하였다. 도 4는 이식 후 제57일 내지 제60일, 제85일 및 제97일에 LV-F9 및 LV-Luc 마우스의 대표적인 IVIS 이미지를 제공하며, 이는 이후의 시점에서 강도가 증가하는 LV-Luc 마우스에서 실질적인 생물발광을 보여준다. 이 검정에서, LV-F9 마우스는 유용한 음성 대조군으로서 역할을 하는데, LV-F9 벡터가 루시퍼라제를 인코딩하지 않고 따라서 LV-F9 마우스에서 어떠한 생물발광도 검출될 것으로 예상되지 않기 때문이다.
IVIS 상에서 측정된 생물발광을 정량화하였고, 도 5는 이식 후 제57일 또는 제60일, 제85일 및 제97일에 개별 LV-F9 및 LV-Luc 마우스의 이러한 정량화(초당 광자; p/s의 총 플럭스로서 측정됨)를 제공한다. 정량화는 전술된 정성적 관찰, 즉, LV-Luc 동물이 예를 들어 LV-F9 동물과 비교하여 실질적인 생물발광을 나타내었고, 생물발광 강도는 초기, 제57일 또는 제60일 시점과 비교하여 이후의 시점에서 더 컸음을 확인시켜 준다. 종합적으로, 이들 발견은, 숙주 마우스에서 형질도입된 huFRG 간세포의 효과적인 생착, 및 도입된 이식유전자, 이러한 경우 루시퍼라제가 이식 후 적어도 수개월 동안 생착된 간세포 및/또는 이의 자손으로부터 성공적으로 그리고 지속적으로 발현되었음을 실증한다.
상기와 유사한 방법을 이용하여, huFRG 간세포를, 정상 생리학적 수준(문헌[Lozier. Blood (2012) 120(23):4452-4453] 참조)보다 8배(8x) 높은 응고 활성을 나타내는 R384L 치환(야생형 UniProt P00740; RefSeq NP_000124.1; 서열 번호 010과 비교하여)에 상응하는 인간 F9, 즉, "R338L" 치환(문헌[Simioni, et al. N Engl J Med 2009;361:1671-5])의 파두아 변이체를 인코딩하는 발현 카세트를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 500,000개의 형질도입된 huFRG 간세포를 비장내 주사를 통해 FRGN 수용자 마우스 내로 이식하고, 마우스를 이식된 huFRG 간세포의 생착 및 확장에 충분한 조건 하에 유지시켰다. 인간 알부민 및 인간 F9 수준을 이식 후 다양한 시점에서 LV-F9 마우스로부터 수집된 혈액 시료에서 측정하였다. LV-Luc로 형질도입된 huFRG 간세포가 이식된 마우스를 대조군으로서 이용하고, 상응하는 인간 알부민 및 인간 F9 측정을 LV-Luc 대조군 동물로부터 수집하였다.
도 6은 이식 후 14일, 28일, 47일 및 98일에 수집된 LV-F9 및 LV-Luc 마우스로부터의 말초 혈액 샘플에서 측정된 바와 같은 이종성 인간 알부민(밀리리터당 마이크로그램, 로그 스케일)의 수준을 제공한다. 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 인간 알부민의 수준은 코호트 둘 다에서 꾸준하게 증가하였으며, 이는 각각의 숙주 간에서 LV-F9 및 LV-Luc huFRG 조작된 간세포의 유사한 수준의 생착 및 확장을 나타내었다. 이에 더하여, 인간 알부민 수준은 궁극적으로, 98일까지 적어도 70% 내지 80% 인간화와 일관되는 수준에 도달하였으며, 이는 생체외 조작된 간세포의 강력한 생체내 생착 및 확장을 나타내었다.
도 7은 이식 후 14일, 28일, 47일 및 98일에 수집된 LV-F9 및 LV-Luc 마우스로부터의 말초 혈액 샘플에서 측정된 바와 같은 이종성 인간 F9(밀리리터당 나노그램, 로그 스케일)의 수준을 제공한다. 검정의 검출 하한(LOD)은 수평 점선으로 표시된다. 임상 결핍증(예를 들어 단일유전자 질환에서 관찰된 바와 같음)에서 조작된 huFRG 간세포의 치료 잠재성을 평가하기 위한 대용물로서, (1) F9-결핍 인간 대상체에서 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준(즉, 정상 생리학적 수준의 5%, 250 ng/mL, "5% 정상 F9") 또는 (2) 인간 대상체에서 정상 생리학적 수준(즉, 정상 생리학적 수준의 100%, 5000 ng/mL, "100% 정상 F9")에 상응하는 F9 수준을 또한 수평 점선으로 나타낸다.
도 7에서 쉽게 알 수 있는 바와 같이, LV-F9 마우스는 적어도 이식후 평가된 제1 시점(즉, 14일)만큼 초기에 원하는 치료 효과에 필요한 것을 능가하는 인간 F9 수준에 도달하였다. 더욱이, LV-F9 마우스는 이식후 적어도 제28일까지 정상 생리학적 수준의 100%를 초과하는 인간 F9 수준에 도달하였다. 이러한 마우스는 모든 이후 시점에서 초(super)-생리학적 수준의 인간 F9를 계속 나타내었다.
종합적으로, 이들 발견은 인간 F9를 발현하도록 생체외에서 조작된 huFRG 간세포가 수용자 말초 혈액에서 검출 가능한 수준의 인간 F9를 쉽게 생착시키고, 확장시키고 생산함을 실증한다. 더욱이, 이식된 마우스는 인간 F9-결핍증에서 치료적 효능에 충분한 수준에 상응하는, 말초 혈액 내 인간 F9의 수준에 빠르게 도달하였다. 이에 더하여, 정상 인간 생리학적 F9 수준의 100%에 상응하고 심지어 이를 초과하는 수준은 마지막 측정 시점을 통해 달성되고 지속되었다.
LV-Luc 마우스 내로 이식된 HuFRG 간세포는 인자 IX를 인코딩하는 내인성 인간 유전자를 함유한다. 따라서, 이들 세포가 LV-F9 huFRG 간세포와 같은 이종성 F9 이식유전자를 보유하지 않더라도, Luc 간세포는 내인성 유전자위로부터 인간 F9를 발현한다. LV-Luc 마우스로부터 수집된 말초 혈액 내 인간 F9의 초기(즉, 이식후 제14일 및 제28일) 수준이 LOD(예를 들어 도 7 참조)에 있거나 이보다 낮은 수준에 있는 한편, 인간 F9 수준은 결국 숙주 간(인간 알부민 수준을 측정함으로써 확인된 바와 같음) 내에서 huFRG 세포의 실질적인 확장 후 이후의 시점(예를 들어 도 7, LV-F9 d47 및 d98 참조)에서 상당한 수준에 도달하였다. LV-Luc 마우스에서의 이러한 인간 F9 생산과 비교하여, LV-F9 마우스에서의 인간 F9 생산은 각각의 시점에서 실질적으로 더 높았으며, 이는 측정된 최종 시점에서 치료적 및 생리학적 수준, 뿐만 아니라 전반적인 더 큰 수준의 더 빠른 달성을 나타내었다. 예를 들어, LV-F9 마우스가 제28일까지 F9의 정상 생리학적 수준의 100%에 도달하였으며, 한편 LV-Luc 마우스는 제98일 시점까지 정상 생리학적 수준의 100%에 도달하지 않았다. 이에, 이들 데이터는 F9 이식유전자의 존재가 치료 효과의 개시와 약효 둘 다에서 상당한 이점을 제공함을 나타낸다.
도 8은 제47일 시점에 각각의 동물에서 측정된 인간 F9 수준 대 각각의 동물에서의 상응하는 인간 알부민 수준의 플롯을 제공한다. 0.1%, 1% 및 5% 생착, 뿐만 아니라 5% 및 100%의 정상 생리학적 인간 F9에 대한 참조 수준은 수직 점선 및 수평 점선으로 각각 제시된다. 모든 경우, 실질적으로 유사한 수준의 생착을 갖는 마우스를 비교하였을 때, 파두아 F9 이식유전자로 생체외에서 조작된 huFRG 간세포를 받은 마우스가 상응하는 LV-Luc 마우스와 비교하여 말초 혈액에서 더 높은 인간 F9 수준을 가졌다. 이에, 데이터는 추가로, 예를 들어 내인성 유전자위로부터 F9를 발현하는 세포와 비교하여 F9 이식유전자를 받은 세포에서 F9 발현의 세포당 더 높은 수준을 뒷받침한다. 더욱이, 이러한 분석은 인간 F9 이식유전자를 발현하도록 생체외에서 조작된 1% 미만의 huFRG 간세포의 생착, 심지어 0.2%만큼 낮은 생착은 말초 혈액에서 치료적 농도의 인간 F9와 심지어 정상 생리학적 농도의 인간 F9를 둘 다 달성하기에 충분함을 실증한다.
도 9는 제96일 시점의 동물에 대한 도 8에 상응하는 플롯을 제공한다. LV-Luc 동물 및 LV-F9 동물에서의 유사한 수준의 생착(x-축의 모든 데이터점 상의 실질적으로 유사한 위치로 표시됨)에도 불구하고, LV-F9 동물의 말초 혈액은 LV-Luc 동물로부터의 말초 혈액과 비교하여 약 60배(60x) 더 많은 인간 F9를 함유하였다. 파두아 변이체의 이러한 높은 수준의 발현 및 증강된 응고 활성을 고려하여, LV-F9 마우스는 LV-Luc 대조군 동물보다 490배(490x) 더 큰 이론적 응고 활성을 나타낸다.
종합적으로, 이들 데이터는 숙주 간 내에서 치료적 이식유전자를 함유하고 발현하도록 조작된 인간 간세포의 성공적인 생착 및 확장을 실증한다. 더욱이, 이들 데이터는 이식유전자(이식유전자의 정체성과 상관없이)를 보유하는 조작된 간세포의 생착 및 확장이 이식유전자를 보유하지 않는 대조군 세포에서 관찰된 생착 및 확장과 적어도 필적할 만함을 실증한다. 더욱이, 이식유전자 조작된 간세포(예를 들어 비조작 세포에서의 관련 내인성 인자의 상응하는 발현과 비교하여)로부터의 치료 인자의 관찰된 높은 수준의 발현을 감안하여, 본원에 기술된 바와 같이 이러한 조작된 간세포의 생착 및 확장은 수개월을 포함하여 시간 경과에 따라 증가하고 지속되는 이식유전자 발현 생성물의 치료적 관련 수준의 빠른 달성을 제공한다.
실시예 5: B형 혈우병에 대한 인자 IX 조작된 인간 간세포의 생성 및 확장
하기 발현 작제물을 인간 간세포 내로 도입되어 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 B형 혈우병과 같은 인자 IX 결핍증을 갖는 인간 대상체 내로 이식되는 조작된 간세포에 의한 치료적 이식유전자 생성물의 발현을 용이하게 하도록 설계하였다.
이 실시예에 이용된 F9 발현 작제물은 예를 들어 폴리아데닐화 신호(폴리A)를 포함한 적합한 3' 서열에 작동 가능하게 연결된 예를 들어 전체-길이 F9 폴리펩타이드(서열 번호 010)를 인코딩하는 전체-길이 F9 코딩 서열(서열 번호 011), F9 파두아 변이체 폴리펩타이드(서열 번호 003)를 인코딩하는 파두아 변이체 F9 코딩 서열(서열 번호 002) 등과 같이 예를 들어 F9 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터(서열 번호 001)와 같은 적합한 프로모터를 포함한다.
쉽게 이해하게 될 바와 같이, 일부 경우, 예를 들어 전술된 프로모터를 또 다른 적절한 프로모터로 교환, 이식유전자 코딩 서열을 동일한 이식유전자 또는 이식유전자의 변이체를 인코딩하는 또 다른 코딩 서열로 교환, 이식유전자의 3' 서열을 또 다른 3' 서열(예를 들어 교대 폴리A 또는 다른 3' 구성요소를 포함함)로 교환 등을 포함하는 치환이 전술된 작제물에 이루어질 수 있다. 발현 작제물을 간세포 내로의 형질도입에 적합한 렌티바이러스 벡터에 도입한다.
신선하게 단리된 인간 간세포 또는 최근 해동된 동결보존된 세포를 전술된 발현 작제물 중 하나로 형질도입한다. 유용한 신선하게 단리된 인간 간세포는 사체 공여자 간 조직으로부터 단리된 것, 뿐만 아니라 생체내 생물반응기에서 확장되고 이로부터 단리된 것을 포함한다. 유용한 동결보존된 간세포는 사체 공여자 간 조직으로부터의 단리 후 동결보존된 것, 뿐만 아니라 생체내 생물반응기에서의 확장 및 이로부터의 단리 후 동결보존된 것을 포함한다. 이에, 형질도입을 예를 들어 설치류 생물반응기와 같은 생체내 생물반응기에서 인간 간세포의 확장 전에 또는 후에 수행한다.
상기 작제물 중 임의의 작제물로 형질도입된 인간 간세포는 다르게는 변형되지 않을 수 있으며, 여기서 예를 들어 상기 작제물의 도입은 수행된 유일한 유전적 변형이다. 대안적으로, 상기 작제물 중 임의의 작제물로 형질도입된 인간 간세포는 부가적인 유전적 변형을 포함하도록 변형될 수 있고, 예를 들어 HLA 부류 I 유전자위(예컨대 B2M 유전자위)의 교란 및 NK 세포 유인 수용체 이식유전자(예를 들어 CD47, HLA-E 또는 B2M-HLA-E 융합 이식유전자와 같음)의 도입에 의해 저면역으로 된 간세포를 포함하여 예를 들어 저면역일 수 있다. 저면역력을 유도하는 시약(예를 들어 B2M 편집 조성물 및 NK 세포 유인 수용체 이식유전자)과 인간 간세포의 접촉을 상기 식별된 발현 작제물을 이용한 형질도입 전에, 동안에 또는 후에 수행한다.
형질도입이 간세포 확장 전에 수행되는 경우, 형질도입된 간세포를 비장내 또는 간문맥 주사를 통해 하나 이상의 수용자 설치류 생물반응기(예컨대 FRG 래트, FRGN 마우스 등과 같음) 내로 도입하고, 설치류(들)를 이식되는 조작된 간세포의 생착 및 확장에 충분한 조건 하에 유지시킨다. 생물반응기(들)에서의 확장 후, 생물반응기 간(들)을 수합하고 관류시켜, 조작된 인간 간세포의 확장된 집단을 회수한다. 회수된 조작된 인간 간세포를 농화, 정제 및/또는 단리 과정을 통해 가공한다. 생성된 가공된 세포 집단을 후속적으로 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위해 제조하거나 이후의 전달을 위해 동결보존한다.
간세포 확장 후 형질도입을 수행하는 경우, 확장된 간세포를 하나 이상의 설치류 생물반응기로부터 회수하고, 원하는 간세포의 (임의의 편리한 시점에서의 동결보존과 함께 또는 없이) 농화, 단리, 정제 및/또는 단리를 위해 추가 가공 전에 또는 후에 상기 식별된 작제물 중 하나로 형질도입한다. 생성된 형질도입되고 가공된 세포 집단을 후속적으로, 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위해 제조하거나 이후의 전달을 위해 동결보존한다.
제조된 조작된 간세포의 집단을 적합한 전달 매질에서 용량 제형으로 제형화한다. 제조된 용량 제형을 예를 들어 비장내 또는 간문맥 주사 또는 주입을 통하는 것과 같이 의학적으로 적절한 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여, 인자 IX 결핍증 및 B형 혈우병에 대해 대상체를 치료한다.
실시예 6: A형 혈우병에 대한 인자 VIII 조작된 인간 간세포의 생성 및 확장
외인성 인자 VIII(F8) 이식유전자를 1차 인간 간세포 내로 도입하여, 예를 들어 이식유전자 형질도입 전에 또는 후에 생체내 생물반응기에서 확장되는 F8-조작된 간세포를 생성하기 위한 LVV 접근법을 사용하는 실현 가능성을 평가하였다. 초기 시험으로서, 1차 인간 간세포를 생체외에서 다양한 감염 다중도(MOI)에서 인간 F8(상응하는 임상 작제물에 대한 최적화되지 않은 대리물)을 과발현하는 상업적으로 입수 가능한 LVV로 형질도입하고, 세포를 시험관내에서 유지시켰다. 대조군으로서, 형질도입되지 않은(즉, 비처리 대조군, NTC) 1차 인간 간세포를 동일한 시험관내 배양 조건 하에 유지시켰다. 상층액을 배양 제4일, 제5일 및 제6일에 MOI 2 형질도입된 샘플, MOI 7 형질도입된 샘플 및 NTC 샘플로부터 수집하고, 상업적으로 입수 가능한 키트(Chromogenix Coatest SP4 인자 VIII 키트; DiaPharma, 미국 오하이오주 웨스트체스터 소재)를 사용하여 F8 활성을 측정하였다. 배양 제6일에 상층액 수집 후, 세포를 수집하고 용해시켰고, F8 활성 검정을 또한 세포 용해물에서 수행하였다.
MOI 2 샘플과 MOI 7 샘플 둘 다에서 F8 활성의 양은 제4일, 제5일 및 제6일 시점에 걸쳐 증가하는 활성을 보여주었다. 비교에서, NTC 샘플 내 F8 활성은 모든 3개 시점에서 기준선에 있었다. 제6일 시점에서, MOI 7 상층액 샘플에서 측정된 F8 활성은 NTC 기준선 수준보다 적어도 4배(4x) 더 컸다. 중요하게는, F8 활성의 검출은 내인성 F8이 조작된 세포에 의해 발현되고 분비됨을 보여준다. 인간 F8 활성은 제6일 세포 용해물에서 상응하게 높았다. 이들 데이터는 심지어 형질도입에 대한 최적화되지 않은 대리 F8-LVV를 사용하는 경우에도 상응하는 조작되지 않은 인간 간세포보다 실질적으로 더 큰 F8 활성을 나타내고 인간 F8을 과발현하는 조작된 인간 간세포를 생성하는 능력을 실증한다.
F8 과발현 인간 간세포를 생성하는 능력을 실증하였고, 하기 향상된 발현 작제물을 인간 간세포 내로 도입되어 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 A형 혈우병과 같은 인자 VIII 결핍증을 갖는 인간 대상체 내로 이식되는 조작된 간세포에 의한 치료적 이식유전자 생성물의 발현을 용이하게 하도록 설계하였다.
이 실시예에 이용되는 F8 발현 작제물은 예를 들어 폴리A 신호를 포함하는 적합한 3' 서열에 작동 가능하게 연결된 예를 들어 전체-길이 F8 폴리펩타이드(서열 번호 013)를 인코딩하는 전체-길이 F8 코딩 서열(서열 번호 012), BDDrFVIII 변이체 폴리펩타이드(서열 번호 015)를 인코딩하는 B-도메인-결실 F8(즉, BDDrFVIII) 코딩 서열(서열 번호 014), F8.Fc 폴리펩타이드(서열 번호 017)를 인코딩하는 FVIII-Fc 융합 단백질(즉, F8.Fc) 코딩 서열(서열 번호 016) 등과 같은 F8 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 예를 들어 MND 프로모터(서열 번호 001)와 같은 적합한 프로모터를 포함한다.
유용한 작제물은 예를 들어 다중 폴리펩타이드가 예를 들어 푸린.GSG.T2A(서열 번호 020) 또는 푸린.GSG.P2A(서열 번호 021)와 같이 푸린 및 글리신-세린-글리신 함유 2A 서열과 같은 2A-자가 절단 서열을 통해 vWF 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 F8 코딩 서열로부터 발현되는 경우를 포함하여, 예를 들어 F8 폴리펩타이드 및 폰빌레브란트 인자(vWF) 폴리펩타이드(예를 들어 vWF Fc 융합(즉, 서열 번호 018에 의해 인코딩되는 vWF.Fc 서열 번호 019)과 같음)와 같은 다중 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 포함한다. vWF 및 F8과 같은 다수의 폴리펩타이드가 이용되는 경우, 코딩 서열은 임의의 순서로 배열된다.
유용한 발현 카세트 배열은 예를 들어 하기를 포함한다:
[MND 프로모터]-[F8 전체-길이]-[폴리A],
[MND 프로모터]-[F8 (B 도메인 결실됨)]-[폴리A],
[MND 프로모터]-[F8.Fc]-[푸린.GSG.T2A]-[VWF.Fc]-[폴리A],
[MND 프로모터]-[VWF.Fc]-[푸린.GSG.T2A]-[F8.Fc]-[폴리A] 등.
쉽게 이해하게 될 바와 같이, 일부 경우, 예를 들어 전술된 프로모터를 또 다른 적절한 프로모터로 교환, 이식유전자 코딩 서열을 동일한 이식유전자 또는 이식유전자의 변이체를 인코딩하는 또 다른 코딩 서열로 교환, 이식유전자의 3' 서열을 또 다른 3' 서열(예를 들어 교대 폴리A 또는 다른 3' 구성요소를 포함함)로 교환 등을 포함하는 치환이 전술된 작제물에 이루어질 수 있다. 발현 작제물을 간세포 내로의 형질도입에 적합한 렌티바이러스 벡터에 도입한다.
간세포를 실시예 5에 본질적으로 기술된 바와 같이 제조하고, 확장시키고, 형질도입하여, 실시예 5에 기술된 작제물을 상기 작제물로 치환한다.
제조된 조작된 간세포의 집단을 적합한 전달 매질에서 용량 제형으로 제형화한다. 제조된 용량 제형을 예를 들어 비장내 또는 간문맥 주사 또는 주입을 통하는 것과 같이 의학적으로 적절한 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여, 인자VIII 결핍증 및 A형 혈우병에 대해 대상체를 치료한다.
실시예 7: 요소 회로 장애(UCD)에 대한 요소 회로 유전자로 조작된 인간 간세포의 생성 및 확장
하기 발현 작제물을 인간 간세포 내로 도입되어 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대 UCD를 갖는 인간 대상체 내로 이식되는 조작된 간세포에 의한 치료적 이식유전자 생성물(또는 다수의 이식유전자 생성물)의 발현을 용이하게 하도록 설계하였다.
이 실시예에서 이용되는 발현 작제물은 예를 들어 폴리A 신호를 포함하여 적합한 3' 서열에 작동 가능하게 연결된 질소 배출물의 대사에서 속도-제한적인 요소 회로 유전자와 같은 하나 이상의 요소 회로 유전자에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터(서열 번호 001)와 같은 적합한 프로모터를 포함한다.
요소 회로 유전자를 인코딩하는 유용한 서열은 예를 들어 하기를 포함한다:
예를 들어 CPS1 폴리펩타이드(서열 번호 023)를 인코딩하는 코돈-최적화된 CPS1 코딩 서열(서열 번호 022)과 같은 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1) 코딩 서열,
예를 들어 NAGS 폴리펩타이드(서열 번호 025)를 인코딩하는 코돈-최적화된 NAGS 코딩 서열(서열 번호 024)과 같은 N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS) 코딩 서열,
예를 들어 OTC 폴리펩타이드(서열 번호 027)를 인코딩하는 코돈-최적화된 OTC 코딩 서열(서열 번호 026)과 같은 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC) 코딩 서열 등.
유용한 작제물은 예를 들어 다중 폴리펩타이드가 예를 들어 푸린.GSG.T2A(서열 번호 020) 또는 푸린.GSG.P2A(서열 번호 021)와 같이 푸린 및 글리신-세린-글리신 함유 2A 서열과 같은 2A-자가 절단 서열을 통해 제2 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제1 코딩 서열로부터 발현되는 경우를 포함하여, 예를 들어 CPS1과 NAGS, CPS1과 OTC, NAGS와 OTC, 또는 CPS1, NAGS 및 OCT와 같은 다중 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 포함한다. 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 요소 회로 코딩 서열 및 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 요소 회로 코딩 서열과 같은 다중 폴리펩타이드가 이용되는 경우, 코딩 서열은 임의의 순서로 배열된다.
유용한 발현 카세트 배열은 예를 들어 하기를 포함한다:
[MND 프로모터]-[CPS1]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[NAGS]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[OTC]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[CPS1]-[폴리A]-[푸린.GSG.T2A]-[OTC]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[OTC]-[폴리A]-[푸린.GSG.T2A]-[CPS1]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[NAGS]-[폴리A]-[푸린.GSG.T2A]-[CPS1]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[CPS1]-[폴리A]-[푸린.GSG.T2A]-[NAGS]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[NAGS]-[폴리A]-[푸린.GSG.T2A]-[CPS1]-[푸린.GSG.P2A]-[OTC]-[폴리A]
쉽게 이해하게 될 바와 같이, 일부 경우, 예를 들어 전술된 프로모터를 또 다른 적절한 프로모터로 교환, 이식유전자 코딩 서열을 동일한 이식유전자 또는 이식유전자의 변이체를 인코딩하는 또 다른 코딩 서열로 교환, 이식유전자의 3' 서열을 또 다른 3' 서열(예를 들어 교대 폴리A 또는 다른 3' 구성요소를 포함함)로 교환 등을 포함하는 치환이 전술된 작제물에 이루어질 수 있다. 발현 작제물을 간세포 내로의 형질도입에 적합한 렌티바이러스 벡터에 도입한다.
간세포를 실시예 5에 본질적으로 기술된 바와 같이 제조하고, 확장시키고, 형질도입하여, 실시예 5에 기술된 작제물을 상기 작제물로 치환한다.
제조된 조작된 간세포의 집단을 적합한 전달 매질에서 용량 제형으로 제형화한다. 제조된 용량 제형을 예를 들어 비장내 또는 간문맥 주사 또는 주입을 통하는 것과 같이 의학적으로 적절한 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여, 요소 회로 장애에 대해 대상체를 치료한다.
실시예 8: 파브리 질환에 대한 GLA 유전자 조작된 인간 간세포의 생성 및 확장
외인성 알파-갈락토시다제 A(GLA) 이식유전자를 1차 인간 간세포 내로 도입하여, 예를 들어 이식유전자 형질도입 전에 또는 후에 생체내 생물반응기에서 확장되는 GLA-조작된 간세포를 생성하기 위한 LVV 접근법을 사용하는 실현 가능성을 평가하였다. 초기 시험으로서, 1차 인간 간세포를 생체외에서 다양한 감염 다중도(MOI)에서 인간 GLA(상응하는 임상 작제물에 대한 최적화되지 않은 대리물)를 과발현하는 상업적으로 입수 가능한 LVV로 형질도입하고, 세포를 시험관내에서 유지시켰다. 대조군으로서, 형질도입되지 않은(즉, 비처리 대조군, NTC) 1차 인간 간세포를 동일한 시험관내 배양 조건 하에 유지시켰다. 세포를 배양 제5일에 MOI 2 형질도입된 샘플, MOI 12 형질도입된 샘플 및 NTC 샘플로부터 수집한 다음, 용해시키고 균질화하였다. 알파-Gal 절단 시 형광단(Ex/Em 360/445 nm에서 정량화될 수 있음)을 방출하는 특정 합성 기질을 이용하는 상업적으로 입수 가능한 검정(Abcam, 영국 캠브리지 소재)을 사용하여 알파 갈락토시다제(알파-Gal) 활성을 측정하였다. 전술된 키트에 포함된 양성 대조군 샘플을 또한 이용하였다.
모든 MOI 2 및 MOI 12 샘플에서 측정된 알파-Gal 활성의 양은 NTC에서 관찰된 활성의 최고 수준보다 적어도 5배(5x) 더 많았다. 더욱이, 최고 활성을 갖는 형질도입된 샘플 중 일부에서 측정된 알파-Gal 활성은 양성 대조군 샘플에서 관찰된 최고 활성보다 10배(10x) 이상이었다. 종합적으로, 이들 데이터는 심지어 형질도입에 대한 최적화되지 않은 대리 GLA-LVV를 사용하는 경우에도 상응하는 조작되지 않은 인간 간세포보다 실질적으로 더 큰 알파-Gal 활성을 나타내고 인간 GLA를 과발현하는 조작된 인간 간세포를 생성하는 능력을 실증한다.
F8 과발현 인간 간세포를 생성하는 능력을 실증하였고, 하기 향상된 발현 작제물을 인간 간세포 내로 도입되어 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 리소좀 축적 장애, 예컨대 파브리 질환을 갖는 인간 대상체 내로 이식되는 조작된 간세포에 의한 치료적 이식유전자 생성물의 발현을 용이하게 하도록 설계하였다.
이 실시예에 이용된 발현 작제물은 예를 들어 폴리A 신호를 포함한 적합한 3' 서열에 작동 가능하게 연결된 예를 들어 GLA(1) 폴리펩타이드(서열 번호 029)를 인코딩하는 GLA(1) 코딩 서열(서열 번호 028) 또는 GLA(2) 폴리펩타이드(서열 번호 029)를 인코딩하는 GLA(2) 코딩 서열(서열 번호 030) 등과 같이 예를 들어 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA)에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터(서열 번호 001)와 같은 적합한 프로모터를 포함한다.
유용한 발현 카세트 배열은 예를 들어 하기를 포함한다:
[MND 프로모터]-[GLA (1)]-[폴리A]
[MND 프로모터]-[GLA (2)]-[폴리A]
쉽게 이해하게 될 바와 같이, 일부 경우, 예를 들어 전술된 프로모터를 또 다른 적절한 프로모터로 교환, 이식유전자 코딩 서열을 동일한 이식유전자 또는 이식유전자의 변이체를 인코딩하는 또 다른 코딩 서열로 교환, 이식유전자의 3' 서열을 또 다른 3' 서열(예를 들어 교대 폴리A 또는 다른 3' 구성요소를 포함함)로 교환 등을 포함하는 치환이 전술된 작제물에 이루어질 수 있다. 발현 작제물을 간세포 내로의 형질도입에 적합한 렌티바이러스 벡터에 도입한다.
간세포를 실시예 5에 본질적으로 기술된 바와 같이 제조하고, 확장시키고, 형질도입하여, 실시예 5에 기술된 작제물을 상기 작제물로 치환한다.
제조된 조작된 간세포의 집단을 적합한 전달 매질에서 용량 제형으로 제형화한다. 제조된 용량 제형을 예를 들어 비장내 또는 간문맥 주사 또는 주입을 통하는 것과 같이 의학적으로 적절한 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여, 리소좀 축적 장애 및 파브리 질환에 대해 대상체를 치료한다.
전술한 발명이 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 다소 상세하게 설명되긴 하였지만, 특정한 변경 및 수정이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이에 이루어질 수 있다는 것은 본 발명의 교시의 측면에서 당업자에게 쉽게 명백하다.
이에, 전술한 내용은 단지 본 발명의 원리만 예시한다. 당업자는 본원에 명시적으로 기술되거나 제시되지는 않았지만, 본 발명의 원리를 구현하고 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되어 있는 다양한 배열을 고안될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 본원에 언급된 모든 실시예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 기술 발전에 기여한 발명자들의 개념을 이해하는 것을 보조하기 위한 것이며, 상기 구체적으로 언급된 실시예 및 조건에 대해 비제한적인 것으로 해석되어야 한다. 나아가, 본 발명의 원리, 양태 및 실시형태, 뿐만 아니라 이의 구체적인 실시예를 언급하는 모든 진술은 이의 구조적 및 기능적 균등물을 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 이러한 균등물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물을 둘 다, 즉 구조와 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소를 포함하는 것으로 의도된다. 나아가, 본원에 개시된 어떠한 것도 이러한 개시내용이 청구범위에 명시적으로 언급되어 있는지의 여부에 관계없이 대중의 전용인 것으로 의도되지 않는다.
따라서, 본 발명의 범위는 본원에 제시되고 설명된 예시적인 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그보다는, 본 발명의 범위 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구현된다. 청구범위에서, 35 U.S.C. § 112(f) 또는 35 U.S.C. §112(6)은 "~을 위한 수단"이라는 정확한 문구 또는 "~을 위한 단계"라는 정확한 문구가 청구범위의 이러한 제한의 시작부에 언급된 경우에만 청구범위의 제한을 위해 발동되는 것으로 명시적으로 정의되며; 이러한 정확한 문구가 청구범위의 제한에 사용되지 않는 경우, 35 U.S.C. § 112 (f) 또는 35 U.S.C. §112(6)은 발동되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Ambys Medicines, Inc. Heffner, Garrett Hickey, Raymond Holmes, Michael Juang, Charity Krey, Whitney Mikesell, Glen Vo, Karen Yi, Fei <120> GENETICALLY MODIFIED HEPATOCYTE POPULATIONS <130> AMBYS-001WO <150> US 63/141,769 <151> 2021-01-26 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 389 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, dl587rev primer-binding site substituted <400> 1 tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc 60 agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 120 aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 180 cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 240 gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 300 actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata 360 aaagagccca caacccctca ctcggcgcg 389 <210> 2 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> F9 coding sequence encoding an F9 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caagagtaga ggtctccaaa gtgctcatac ttggtagcgg gggactgtca 1320 atcggccaag caggcgagtt cgattactcc ggaagccaag cagttaaggc tatgaaagaa 1380 gagaacgtta aaactgtgct gatgaatcca aatatagcct ccgtgcagac caatgaggtg 1440 ggtctcaagc aagcagatac tgtttacttt cttccaatta ccccccaatt cgtaaccgaa 1500 gtcattaagg ccgagcagcc tgatggattg atcctgggta tgggcggaca gactgcactg 1560 aattgcggag tggagttgtt caaaaggggt gtgttgaagg aatatggagt taaggtactc 1620 ggcacctccg ttgagagcat catggcgacc gaggatagac agttgttctc tgataaactg 1680 aacgagatta atgagaagat cgccccctca ttcgccgtgg agtctatcga agatgcactg 1740 aaagccgctg atacgattgg ctatcctgta atgataagaa gcgcctacgc cctgggtggc 1800 ctggggtctg gcatctgccc taaccgagag acgctgatgg acctctccac aaaagccttc 1860 gccatgacta accagattct ggtagaaaaa tccgtcaccg gctggaagga aattgaatac 1920 gaagtagtaa gagacgctga tgacaattgc gtcacagtct gcaacatgga aaacgtcgat 1980 gcgatgggcg tgcacaccgg agattccgtc gttgtggcgc cagcacaaac actctccaat 2040 gctgagttcc agatgctcag aagaacaagc attaacgttg tgcgacatct tgggatagtt 2100 ggcgaatgta acatccaatt tgcactgcac ccaactagca tggaatactg cattatcgaa 2160 gtgaatgcgc ggctgagccg aagcagcgct ctcgccagca aagccacagg ctacccactt 2220 gccttcattg ccgcaaagat tgcactgggc attccactgc ctgagattaa gaatgtcgta 2280 agcgggaaga caagcgcctg ttttgaacct tccctggact atatggtgac taagattcct 2340 cggtgggacc ttgataggtt ccatgggacc tcatctagaa taggatcatc aatgaagtct 2400 gtgggtgaag tgatggctat cgggcggacc ttcgaagaga gttttcagaa agcacttcgg 2460 atgtgtcacc cctcaattga gggcttcacc ccccggttgc caatgaacaa ggagtggcca 2520 tcaaacctgg acctgagaaa agagctcagc gagcctagct caactagaat ctacgcaatc 2580 gccaaggcaa tcgacgataa catgtcattg gatgagatag agaagttgac atacatagac 2640 aaatggttcc tctacaaaat gcgagacatt ctgaatatgg agaaaacact gaagggactg 2700 aattctgaga gcatgacgga ggagacactt aagagagcaa aagagattgg gttcagcgat 2760 aagcaaattt caaagtgcct tggactgacc gaagcccaga cacgggagct gagactgaag 2820 aaaaatatac acccatgggt gaagcagatc gacaccctgg cggccgaata tcccagcgtt 2880 actaattacc tgtatgttac atataacggc caagagcatg acgtaaattt tgacgatcat 2940 ggaatgatgg 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tccgagcgtc acgatccttc cctttcgtaa gcaagaccct cggcgtagac 3840 tttattgacg tggccacgaa agttatgatt ggagagaatg tagacgagaa acacctcccc 3900 actcttgacc atccgatcat ccccgcggat tatgttgcca tcaaggcccc aatgttctct 3960 tggccgcgcc tgcgagacgc tgatcccatc ttgcgctgtg aaatggcaag cacaggcgaa 4020 gtagcatgct tcggcgaagg tattcatacc gcatttctga aggccatgct gagcaccggc 4080 ttcaagatcc cccagaaggg tatcctcatc ggcatccagc agtctttccg cccaagattc 4140 ctgggggtag cagaacaact tcataacgaa ggcttcaagc tgtttgcaac agaagcaacc 4200 tctgattggc tgaacgctaa taatgttcct gcgactccag tcgcctggcc cagccaggaa 4260 ggacaaaatc ccagcctgtc tagcatcaga aaactcatac gagatggctc tatcgacctt 4320 gttatcaacc tgcctaataa caacaccaaa tttgtccacg acaactacgt catcagaaga 4380 actgccgtgg atagcggtat ccccctgctg accaatttcc aggttaccaa gctctttgca 4440 gaagctgttc agaaatctcg caaggtggat agcaagtcac tgtttcacta tcgacaatat 4500 tcagcgggga aggctgcata g 4521 <210> 23 <211> 1506 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> codon-optimized carbamoyl-phosphate synthase 1 polypeptide <400> 23 Met Pro Gln Ile Ile Lys Met Thr Arg Ile Leu Thr Ala Phe Lys Val 1 5 10 15 Val Arg Thr Leu Lys Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asn Val Thr Ala His 20 25 30 Gln Lys Trp Lys Phe Ser Arg Pro Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Lys 35 40 45 Ala Gln Thr Ala His Ile Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly 50 55 60 Tyr Ser Phe Gly His Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn 65 70 75 80 Thr Gly Leu Gly Gly Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Asp Pro Ala Tyr Lys 85 90 95 Gly Gln Ile Leu Thr Met Ala Asn Pro Ile Ile Gly Asn Gly Gly Ala 100 105 110 Pro Asp Thr Thr Ala Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu 115 120 125 Ser Asn Gly Ile Lys Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys 130 135 140 Asp Tyr Asn His Trp Leu Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gln Trp Leu Gln 145 150 155 160 Glu Glu Lys Val Pro Ala Ile Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr 165 170 175 Lys Ile Ile Arg Asp Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys Ile Glu Phe Glu 180 185 190 Gly Gln Pro Val Asp Phe Val Asp Pro Asn Lys Gln Asn Leu Ile Ala 195 200 205 Glu Val Ser 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Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300 Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320 Asn Asp Glu <210> 38 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> truncated human CD47 sequence <400> 38 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Glu 290 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 39 ggccacggag cgagacatct 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 40 cgcgagcaca gctaaggcca 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 41 aagtcaactt caatgtcgga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 42 ggggccacta gggacaggat 20 <210> 43 <211> 972 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60 ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120 tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180 aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240 tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300 gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360 agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420 gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480 ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540 gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600 gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660 atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720 atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780 gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840 gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900 cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 960 aatgatgaat aa 972 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> truncated CD47 coding sequence <400> 45 atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60 ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120 tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180 aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240 tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300 gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360 agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420 gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480 ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540 gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600 gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660 atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720 atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780 gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840 gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggagt aa 882 <210> 46 <400> 46 000 <210> 47 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> B2M-HLA-E fusion coding sequence <400> 47 atgagccgat ccgtggcact ggctgtcctg gctctgctgt ctctgagtgg cctggaagca 60 gtgatggccc ctagaacact gttcctgggc ggaggcggct ccggaggagg agggtctgga 120 ggcgggggaa gtatccagcg gactcccaag attcaggtct acagcagaca ccctgccgaa 180 aacgggaaat ccaacttcct gaattgctat gtgtcaggct ttcatcccag cgacatcgag 240 gtcgatctgc tgaagaatgg cgagcggatt gaaaaagtgg agcactctga cctgtcattc 300 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gggagggcca tacccaggac acggagctcg tggagaccag gcctgcaggg 1200 gatggaacct tccagaagtg ggcagctgtg gtggtgcctt ctggagagga gcagagatac 1260 acgtgccatg tgcagcatga ggggctaccc gagcccgtca ccctgagatg gaagccggct 1320 tcccagccca ccatccccat cgtgggcatc attgctggcc tggttctcct tggatctgtg 1380 gtctctggag ctgtggttgc tgctgtgata tggaggaaga agagctcagg tggaaaagga 1440 gggagctact ctaaggctga gtggagcgac agtgcccagg ggtctgagtc tcacagcttg 1500 taa 1503

Claims (20)

  1. 저면역원성(hypoimmunogenic) 간세포 또는 이의 선조세포(progenitor)를 생성하는 방법으로서,
    인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는 세포 집단을, 간세포 또는 이의 선조세포에서 인간 백혈구 항원(HLA: human leukocyte antigen) 부류 I 결핍증을 생성하기에 충분한 조건 하에, 편집 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    세포 집단을, 간세포 또는 이의 선조세포에 의한 이식유전자의 발현에 충분한 조건 하에, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자와 접촉시켜,
    이로써 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 편집 조성물은 베타-2-마이크로글로불린(B2M)-편집 조성물인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성된 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생물반응기 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생물반응기는 생체내 생물반응기이고, 생체내 생물반응기는 저면역원성 간세포의 확장된(expanded) 집단을 생산하기에 충분한 조건 하에 유지되며, 선택적으로 생체내 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포의 집단을 생성하는 방법.
  6. 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서,
    유효량의 저면역원성 간세포 또는 선조세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 저면역원성 간세포 또는 선조세포는 각각 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하고, 선택적으로 병태는 간 병태인, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 저면역원성 간세포 또는 이의 선조세포는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
  8. 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류로서, 세포 집단은 복수의 저면역원성 인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하며, 복수의 간세포 또는 선조세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하고, 선택적으로 HLA 부류 I 결핍증은 B2M 결핍증을 포함하며, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
  9. 제8항의 비인간 포유류로부터 단리된 저면역원성 인간 간세포 또는 이의 선조세포의 확장된 집단을 포함하는, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
  10. 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단으로서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하며, 선택적으로 HLA 부류 I 결핍증은 B2M 결핍증을 포함하고, 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체는 CD47, B2M-HLA-E 융합, 또는 이들의 조합을 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는, 세포 집단.
  11. 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법으로서,
    인간 간세포 또는 이의 선조세포를 포함하는 세포 집단을, 이식유전자의 기능적 통합에 충분한 조건 하에, 유전자 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 통합 벡터와 접촉시켜, 통합된 이식유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포를 생산하는 단계; 및
    유전적으로 변형된 간세포 또는 이의 선조세포를 생체내 생물반응기 내로 이식하고, 생체내 반응기를 유전적으로 변형된 간세포 또는 선조세포의 확장에 충분한 조건 하에 유지시켜, 유전자 생성물을 발현하는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계로서, 선택적으로 생체내 생물반응기는 마우스, 래트 또는 돼지인, 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 이식유전자는 구리-수송 ATPase 2(ATP7B: copper-transporting ATPase 2), 유전성 혈색소침착증 단백질(HFE: hereditary hemochromatosis protein), 헤모주벨린(hemojuvelin), 헵시딘(HAMP: hepcidin), 트랜스페린 수용체 단백질 2(TFR2: transferrin receptor protein 2), 용질 담체 계열 40 구성원 1(SLC40A1: solute carrier family 40 member 1), 인자 IX, 인자 VIII, 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 카르바모일-포스페이트 신타제(CPS1: carbamoyl-phosphate synthase), N-아세틸글루타메이트 신타제(NAGS: N-acetylglutamate synthase), 오르니틴 트랜스카르바밀라제(OTC: ornithine transcarbamylase), 알파-갈락토시다제 A 유전자(GLA: alpha-galactosidase A gene), 페닐알라닌 하이드록실라제 효소(PAH: phenylalanine hydroxylase enzyme), 아르기나제(ARG: arginase), 알파-1 항트립신(AAT: alpha-1 antitrypsin), 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH: fumarylacetoacetate hydrolase), 아르기니노숙시네이트 리아제(ASL: argininosuccinate lyase), 아르기니노숙시네이트 신타제(ASS: argininosuccinate synthase), 오르니틴 트랜스로카제(ORNT1: ornithine translocase), 시트린(citrin), UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1: UDP-glucuronosyltransferase 1A1), 트랜스티레틴(TTR: transthyretin), 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼라제(AGXT: serine-pyruvate aminotransferase), 보체 인자 H(CFH: complement factor H) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 생성물을 인코딩하는, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 생성하는 방법.
  13. 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서,
    유효량의 제11항 또는 제12항의 방법에 따라 생성된 유전적으로 변형된 인간 간세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 병태는 간 병태 또는 유전적 질환이며, 선택적으로 유전적 질환은 단일유전자 질환(monogenic disease)이고, 선택적으로 병태는 인자 VIII 결핍증이고 이식유전자는 인자 VIII을 인코딩하거나; 병태는 인자 IX 결핍증이고 이식유전자는 인자 IX를 인코딩하거나; 병태는 요소 회로 장애(UCD: urea cycle disorder)이고 이식유전자는 하나 이상의 요소 회로 폴리펩타이드를 인코딩하거나; 병태는 리소좀 축적 질환이고 이식유전자는 리소좀 축적 질환과 연관된 효소를 인코딩하는, 병태에 대해 대상체를 치료하는 방법.
  15. 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류로서, 세포 집단은 복수의 유전적으로 변형된 인간 간세포를 포함하며, 복수의 간세포의 각각은 유전자 생성물을 인코딩하는 기능적으로 통합된 이식유전자를 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
  16. 제15항에 있어서, 생착된 세포 집단은 생체내 확장된 세포 집단이고, 비인간 포유류는 유전적으로 변형된 인간 간세포의 간세포 자손을 추가로 포함하는, 생착된 세포 집단을 포함하는 비인간 포유류.
  17. 제15항 또는 제16항의 비인간 포유류로부터 단리된 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 포함하는, 간세포 또는 이의 선조세포의 집단.
  18. 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는 세포 집단으로서, 복수의 간세포의 각각은 HLA 부류 I 결핍증, 및 적어도 하나의 NK 세포 유인 수용체를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는, 복수의 저면역원성 1차 인간 간세포를 포함하는, 세포 집단.
  19. 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법으로서,
    (1a) 인간 간세포를 유전적으로 변형시키고, 유전적으로 변형된 인간 간세포를 하나 이상의 생체내 생물반응기에서 확장시켜, 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계, 또는
    (1b) 하나 이상의 생체내 생물반응기로부터 수득되는 확장된 인간 간세포를 유전적으로 변형시켜, 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; 및
    (2) 1a 또는 1b의 유전적으로 변형된 인간 간세포의 확장된 집단을 복수의 간세포 세포 치료법 용량으로 분취하는 단계를 포함하는, 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 방법.
  20. 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법으로서,
    제19항에 따른 복수의 간세포 세포 치료법 용량을 생성하는 단계; 및
    복수의 용량의 하나 이상을 각각의 대상체에게 투여하여, 병태에 대해 대상체를 치료하는 단계로서, 선택적으로 인간 간세포는 단일 인간 간으로부터 유래되는 단계를 포함하는, 병태를 갖는 복수의 대상체를 치료하는 방법.
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