KR20220018495A - 영양요구성 선택 방법 - Google Patents

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KR20220018495A
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cell
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KR1020217040147A
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제임스 패터슨
매튜 포르테우스
볼커 윕킹
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옥설리틱 리미티드
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 영양요구성 세포의 집단 및 분화된 세포 집단을 생성하고, 영양요구성 분할을 사용하여 형질감염된 세포의 집단을 선택하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

영양요구성 선택 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 5월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/844,930 및 2019년 9월 24일에 출원된 62/904,725에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원으로 인용으로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출되고 있다. 1191573PCT_SEQLST.txt라는 이름의 서열 목록 파일은 2020년 4월 27일에 생성되었으며 크기는 66,244바이트이다. 서열 목록의 전자 형식 정보는 전체가 인용으로 본원에 통합된다.
발명의 분야
본 개시내용은 분화된 세포 집단을 생성하고 형질감염된 세포 집단을 선택하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
세포 요법은 유망한 치료법을 제공하는 것으로 나타났다. 그러나, 변형된 세포를 인간 숙주에 재도입하는 것은 면역 반응, 악성 형질전환, 또는 트랜스진(transgene)의 과잉생산 또는 제어 부족을 포함하는 위험을 수반한다.
유전 공학의 여러 접근법은 세포 신호전달, 증식 또는 아폽토시스와 같은 인간 세포의 기능을 제어할 수 있게 하며(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 예를 들어, 문헌[Bonifant, Challice L., et al. "Toxicity and management in CAR T-cell therapy." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016): 16011; Sockolosky, Jonathan T., et al. "Selective targeting of engineered T cells using orthogonal IL-2 cytokine-receptor complexes." Science 359.6379 (2018): 1037-1042; and Tey, Siok-Keen. "Adoptive T-cell therapy: adverse events and safety switches." Clinical & translational immunology 3.6 (2014): e17; each of which is hereby incorporated by reference in its entirety)] 참조), 세포 요법의 심각한 부작용도 제어할 수 있게 한다(Bonifant et al., 2016). 이들 발전에도 불구하고, 세포로의 유전자 인코딩된 제어 메커니즘의 도입에 의존하는 제어 시스템이 다수의 제한을 갖는다는 사실(Tey, 2014)로 인해 다른 적용은, 예를 들어, 재생 의학을 위한 조작된 만능성 세포의 사용과 같은 광범위한 적용을 얻지 못하였다(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277.; Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004; Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441] 참조).
발생할 수 있는 주요한 문제 중 두 가지는 "누출(leakiness)", 즉, 트리거의 부재하에서의 메커니즘의 낮은 수준의 활성(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608] 참조), 및 외부 제어로부터의 여러 회피 메커니즘으로 인한 메커니즘의 활성화시 전체 세포 집단의 제거 부족(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129; Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683; Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683; Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485] 참조)이다. 예를 들어, 바이러스 형질도입에 의해 도입된 트랜스진은 세포에 의한 발현으로부터 침묵될 수 있거나(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[
Figure pct00001
et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197] 참조), 세포는 효과기 메커니즘에 대한 내성이 발달할 수 있다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485] 참조). 또 다른 우려는 유전적 불안정성을 갖는 세포 유형, 예를 들어, 연장된 기간 동안 배양되는 세포주 또는 종양 세포주에서 트랜스진의 돌연변이이다(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233; D'Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894]). 또한, 일차 세포 집단은 종종 생체 외 배양에서 제한된 시간 동안만 이의 기능을 유지하며, 많은 유형이 클론 분리에 의해 정제될 수 없다.
따라서, 증식성 전구체로부터 유래된 세포 치료 제품의 경우, 환자에게 도입되기 전에 시험관내에서 분화된 비증식성 세포를 선택하는 방법에 대한 필요성이 오랫동안 느껴져 왔다. 일반적으로, 만능성 전구 세포로부터 분화된 세포 생성물의 생성은 원하는 분화된 관심 세포 집단을 선택할 수 없기 때문에 방해를 받았다.
발명의 개요
본 개시내용의 다양한 구체예는 (a) 유전자의 프로모터의 비필수 부분을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계; (b) 조직-특이적 프로모터 및 상기 유전자의 적어도 일부를 포함하는 작제물을 상동 재조합에 의해 이중대립유전자적으로 삽입하여 전구 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계로서, 유전자는 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는 단계; (c) 영양요구 인자와 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계; (d) 조직-특이적 프로모터와 관련된 조직 내로 전구 세포의 분화를 자극하는 단계로서, 유전자는 분화에 반응하여 발현되는 단계; 및 (e) 영양요구 인자를 제거하여 분화된 세포 집단을 생성하기 위한 분화된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 분화된 세포 집단을 생성시키는 방법을 제공한다. 프로모터 일부는 해당 영역의 단순 IN/DEL이 영양요구성을 초래하지 않도록 보장하기 위해 비필수적이다. 상동성 재조합에 의한 조직-특이적 프로모터의 삽입은 전구 세포에서 영양소-합성 유전자 발현의 손실을 초래하여 영양요구성을 발생시킬 것이다. 분화시, 영양소 합성 유전자 발현이 켜지고, 영양소가 제거되고 단지 분화된 세포만 살아남을 수 있다.
특정 구체예에서, 방법은 복수의 세포를 5-FOA와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 유전자는 UMPS 유전자이다. 특정 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 UMPS 유전자에 대한 프로모터를 대체한다. 특정 구체예에서, 영양요구 인자는 우라실의 공급원, 예를 들어 우리딘이다. 특정 구체예에서, 작제물은 분화에 반응하여 발현되는 치료 단백질 또는 치료 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 치료 단백질을 UMPS 유전자의 적어도 일부를 갖는 카세트로서 발현시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 작제물은 폴리시스트론성이다. 특정 구체예에서, 작제물은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 포함한다. 특정 구체예에서, UMPS 유전자의 적어도 일부는 상동성 아암(arm)이다. 특정 구체예에서, 복수의 전구 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포 및 심근세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 조직은 지방 조직, 부신, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 분화된 세포 집단은 면역 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포이다.
특정 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서; CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE-조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE-조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중(heavy) 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 방법의 특정 구체예에서, 작제물은 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅된다.
본 개시내용의 다양한 구체예는 (a) 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위를 인코딩하는 DNA 서열과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, DNA 서열은 영양요구 유도성 유전자 내로 넉인되어 전구 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되게 하며, miRNA 표적 부위에 결합하는 전구 세포-특이적 miRNA가 전구 세포에서 발현되는 단계; (b) 복수의 전구 세포를 영양요구 인자와 접촉시키는 단계; (c) 전구 세포의 분화를 자극하는 단계로서, 분화는 전구 세포-특이적 miRNA의 발현을 억제하고 유전자의 발현을 활성화시키는 단계; 및 (d) 영양요구 인자를 제거하여 분화된 세포를 선택하여 분화된 세포 집단을 생성시키는 단계를 포함하는, 분화된 세포 집단을 생성시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 방법은 복수의 세포를 5-FOA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)이고, 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위는 UMPS 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체에 존재한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위는 영양요구 유도성 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체의 3' 비번역 영역(UTR)에 있다. 특정 구체예에서, 영양요구 인자는 우라실의 공급원, 예를 들어 우리딘이다. 특정 구체예에서, 방법은 치료 인자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 작제물을 전구 세포의 유전체 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 치료 인자의 발현은 영양요구 유도성 유전자의 발현을 제어하는 프로모터와 동일한 프로모터에 의해 제어되고, 분화된 세포는 치료 인자를 발현한다. 특정 구체예에서, 방법은 영양요구 유도성 유전자와 프레임 내 카세트로서 치료 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 카세트는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위를 인코딩하는 DNA 서열은 영양요구 유도성 유전자를 표적화하는 상동성 아암을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 복수의 전구 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포, 심근세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 전구 세포의 분화 자극은 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직 유형 또는 세포의 분화된 세포를 생성한다. 특정 구체예에서, 분화된 세포 집단은 면역 세포를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용의 다양한 구체예는 대상체의 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 분화된 세포의 정제된 집단을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 다양한 구체예는 분화시 영양요구 인자를 생성함으로써 영양요구성을 완화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃(knockout)에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 영양요구 유발성 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 작제물을 조직-특이적 유전자좌에 삽입하는 단계를 포함하며, 여기서 조직-특이적 유전자의 발현은 중단되지 않으며, 이에 의해 조직-특이적 유전자좌와 관련된 조직으로의 전구 세포의 분화시 영양요구 인자를 생성한다.
특정 구체예에서, 전구 세포는 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 유전자는 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)이다. 특정 구체예에서, 작제물은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 조직-특이적 유전자좌는 인슐린 유전자좌이다. 특정 구체예는 복수의 영양요구성 전구 세포를 면역 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 면역 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 조직-특이적 유전자는 삽입 단계 동안 대체되지 않는다. 특정 구체예에서, 방법은 전구 세포의 분화시 인슐린을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 방법의 특정 구체예에서, 유전자는 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅된다.
본 개시내용의 다양한 구체예는 플라스미드 통합 또는 에피솜 발현을 갖는, 즉, 적어도 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 복수의 세포에 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃을 제공하는, 즉 자가요구성 인자를 필요로 하는 복수의 세포를 발생시키는 단계로서, 여기서 복수의 세포는 영양요구 인자를 복수의 세포에 제공하는 배지에서 성장시키는 단계; (b) 복수의 세포를 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 전달 시스템으로 형질감염시키는 단계로서, 여기서 전달 시스템은 영양요구 인자를 발현하는 단계; 및 (c) 배지를 제거하여 플라스미드 통합 또는 에피솜 발현을 갖는 세포, 즉 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 전달 시스템은 적어도 하나의 트랜스진을 발현한다. 특정 구체예에서, 유전자는 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 방법의 특정 구체예에서, 유전자는 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅된다.
본 개시내용의 다양한 구체예는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 물질을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 영양요구 유도성 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 전구 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 분화된 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 이중대립유전자 표적화는 예를 들어, 오픈 리딩 프레임 또는 조절 서열을 방해하거나 단백질 또는 뉴클레오티드 억제 또는 분해를 위한 표적 서열을 도입함으로써 영양요구 유도성 유전자를 넉아웃 또는 넉다운시킬 수 있다. 영양요구 유도성 유전자가 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 구체예에서, 유전자의 넉아웃 또는 넉다운은 각각의 독립적인 기능성 도메인에 대해 전구 세포가 영양요구성이 되게 한다. 전구 세포에서 영양요구성을 유도할 때, 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물은 세포내에 도입될 수 있으며, 제1 상동성 재조합 작제물은 제1 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제1의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 제2 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제2의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 전구 세포는 영양요구 인자의 존재 하에 성장할 수 있으며, 세포의 분화가 자극되어 제1 및 제2 조직-특이적 프로모터를 발현하는 분화된 세포(예를 들어, 세포 유형 또는 조직)를 생성할 수 있으며, 그 결과 제1 및 제2 상동성 재조합 작제물이 분화된 세포에서 발현되게 한다. 이러한 방식으로 영양요구 인자를 제거하면 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인이 결여된 세포가 제거되고, 기능적으로 통합된 두 도메인 모두를 갖는 세포가 선택된다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 2개 이상의 독립적인 기능성 도메인, 예를 들어, 3, 4, 또는 5개의 독립적인 기능성 도메인, 또는 5개 초과의 독립적인 기능성 도메인을 가지며, 영양요구성 세포에서 각각의 독립적인 기능성 도메인을 재발현하는 것은 영양요구성을 완화하는데 필요하며, 이에 의해 요망되는 분화된 세포 유형 또는 조직에서 발현된 다양한 조직-특이적 프로모터의 조절 하에 있는 다양한 독립적인 기능성 도메인을 발현하는 2, 3, 4, 5개 이상의 상동성 재조합 작제물로 세포를 변형시킴으로써 2, 3, 4, 5개 이상의 조직-특이적 프로모터를 발현하는 세포의 선택을 가능하게 한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 세포를 5-FOA와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 세이프 하버 유전자좌, 예를 들어 CCR5에 삽입된다.
일부 구체예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다.
일부 구체예에서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 치료 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 예를 들어 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 코딩 서열 및 치료 인자를 인코딩하는 코딩 서열을 분리하는 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 갖는 폴리시스트론일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 예시적인 전구 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포 및 심근세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 분화된 세포 유형 또는 조직의 예는 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 및 혈관을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 분화된 세포는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 조직-특이적 프로모터의 예는 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서; CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE-조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE-조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 변형된 세포의 영양요구성은 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 메신저 RNA의 분해를 위한 조건 또는 독립적인 기능성 도메인의 탈안정화를 위한 조건을 촉발함으로써 추가로 조절될 수 있다. 조건은 예를 들어, 탈안정화 도메인을 안정화시키는 리간드가 존재하는 조건, 또는 리간드가 부재하여 독립적인 기능성 도메인의 탈안정화 및 분해를 유도하는 조건일 수 있다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 분화된 세포 집단은 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 치료 인자를 수반하는 면역 세포이고, 대상체는 치료 인자를 필요로 하거나 필요로 하는 것으로 의심된다.
영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 유전자는 적어도 제1의 독립적인 기능성 도메인 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 단계, 및 제1의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제1 작제물을 영양요구성 전구 세포의 유전체내에 제1 조직-특이적 유전자좌에 삽입하고, 및 제2의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제2 작제물을 제2 조직-특이적 유전자좌에 삽입하는 단계를 포함하는, 영양요구성을 완화시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 유전자좌에서 조직-특이적 유전자의 발현은 방해되지 않는다. 따라서, 영양요구성은 이에 의해 전구 세포가 제1 및 제2 유전자좌에서 제1 및 제2 조직-특이적 유전자를 발현하는 세포 유형 또는 조직으로 분화될 때 완화된다.
2개 초과의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 이용이 고려된다. 예를 들어, 영양요구 유도성 유전자는 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인을 포함할 수 있어 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인 각각의 재발현은 영양요구성을 완화시키는데 필요하다. 각각의 독립적인 기능성 도메인이 각각의 조직-특이적 유전자좌에서 영양요구성 전구 세포의 유전체에 삽입되는 경우, 통합된 각각의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 제1, 제2, 제3, 제4 및/또는 제5 조직-특이적 유전자좌 각각에 상응하는 조직-특이적 프로모터를 발현하는 세포만이 영양요구 인자의 제거에서 살아남을 것이다.
일부 구체예에서, 전구 세포는 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)이다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
일부 구체예에서, 작제물 중 하나 이상은 예를 들어, 치료 인자를 추가로 인코딩하고 작제물(들)의 시스트론의 발현을 조절하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 추가로 포함하는 폴리시스트론이다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 유전자좌는 인슐린 유전자좌이다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 영양요구성 전구 세포를 면역 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 유전자는 삽입 단계 동안 대체되지 않는다.
일부 구체예에서, 분화된 세포는 인슐린을 생성한다.
일부 구체예에서, 작제물 중 하나 이상은 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한 적어도 제1 외인성 유전자 및 제2 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 방법은 복수의 세포에 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운을 제공하여 복수의 세포에서 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 것을 포함할 수 있다. 세포는 영양요구 인자를 제공하는 배지에서 성장할 수 있으며, 제1 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전달 시스템, 및 제2 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전달 시스템으로 형질감염될 수 있다. 영양요구 인자가 결여된 배지로 배지를 교체하면, 제1 및 제2 외인성 유전자 둘 모두를 기능적으로 통합시키지 않은 세포는 영양요구성을 유지할 것이며, 배양물에서 지속되지 못할 것이며, 이에 의해 제1 및 제2 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택할 수 있다.
설명된 방법은 각각의 독립적인 기능성 도메인의 재발현이 변형된 세포에서 영양요구성을 완화시키는데 필요하도록 추가의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 영양요구 유도성 유전자, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 영양요구 유도성 유전자의 사용을 추가로 고려한다.
일부 구체예에서, 방법은 영양요구 유도성 유전자의 각 기능성 도메인에 상응하는 전달 시스템으로 복수의 세포를 형질감염시키는 것을 포함하며, 여기서 각 전달 시스템은 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 전달 시스템 중 하나 이상은 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 나노입자를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
또한, (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계; (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 인슐린-의존적 발현 제어 서열 또는 인슐린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 Nkx6.1-의존적 발현 제어 서열 또는 Nkx6.1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 독립적 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 인슐린과 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는 단계; (c) 우리딘과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계; (d) 복수의 전구 세포의 성숙한 베타 세포로의 분화를 자극하는 단계; 및 (e) 우리딘을 제거함으로써 인슐린 및 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 성숙한 베타 세포를 선택하여, 성숙한 인간 베타 세포의 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 성숙한 인간 베타 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성된 성숙한 인간 베타 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 유형 1 당뇨병을 완화시키는 방법이 또한 제공된다.
또한, 시험관내 분화된 전구 세포 진답으로부터 선택된 성숙한 인간 베타 세포가 제공되며, 성숙한 인간 베타 세포는 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함한다. 영양요구 유도성 유전자는 UMPS일 수 있으며, 영양요구 인자는 우리딘일 수 있으며, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택될 수 있으며, 하나 이상의 트랜스진은 인슐린-의존적 발현 제어 서열 또는 인슐린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 Nkx6.1-의존적 발현 제어 서열 또는 Nkx6.1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또한, (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계; (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 TBX5-의존적 발현 제어 서열 또는 TBX5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 NKX2-5-의존적 발현 제어 서열 또는 NKX2-5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, TBX5 및 NKX2-5 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는 단계; (c) 우리딘과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계; (d) 복수의 전구 세포의 심근세포로의 분화를 자극하는 단계; 및 (e) 우리딘을 제거함으로써 TBX5 및 NKX2-5 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 심근세포의 하위 집단을 선택하여, 인간 심근세포의 하위-집단을 생성하는 단계를 포함하는, 인간 심근세포의 하위집단을 생성하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, TBX5 및 NKX2-5 둘 모두를 발현하는 세포는 심실 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타낸다.
일부 구체예에서, TBX5를 발현하나, NKX2-5는 발현하지 않는 세포는 결절성 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타낸다.
일부 구체예에서, TBX5를 발현하지 않으나, NKX2-5는 발현하는 세포는 심방 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타낸다.
일부 구체예에서, TBX5도 NKX2-5도 발현하지 않는 세포는 내피 세포를 나타낸다.
본 개시내용은 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함하는 시험관내 분화된 심근세포의 집단으로부터 선택되는 심근세포를 추가로 제공한다. 영양요구 유도성 유전자는 UMPS일 수 있으며, 영양요구 인자는 우리딘일 수 있으며, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택될 수 있으며, 하나 이상의 트랜스진은 TBX5-의존적 발현 제어 서열 또는 TBX5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 NKX2-5-의존적 발현 제어 서열 또는 NKX2-5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 심근세포는 제1 심장장 계통 세포, 심실 심근세포, 심장외막 계통 세포, 결절 심근세포, 제2 심장장 계통 세포 및 심방 심근세포로 구성된 군으로부터 선택되는 심근세포의 하위집단에 속한다.
본 개시내용은 또한 시험관내 약물 시험 방법에서 본원에 기재된 심근세포의 용도를 제공한다.
또한, (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대한 영양요구성이 되게 하는 단계; (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동 가능하게 연결된 FOXP3-의존적 발현 제어 서열 또는 FOXP3을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 세포 순수성(
Figure pct00002
)-관련 프로모터의 발현 제어 서열 또는 세포 순수성-관련 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 및 FOXP3 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는 단계; (c) 우리딘과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계; (d) 복수의 전구 세포의 안정한 T reg 세포로의 분화를 자극하는 단계; 및 (e) 우리딘을 제거함으로써 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 및 FOXP3 둘 모두를 발현하는 안정한 T reg 세포를 선택하여 안정한 T reg 세포의 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 안정한 T reg 세포의 집단을 생성하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구체예에서, 세포 순수성-관련 프로모터는 PTPRC 또는 CCR7과 관련된 프로모터이다.
또한, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 안정한 T reg 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 완화시키는 방법으로서, 질병, 장애 또는 질환은 면역 질환 또는 암을 포함하는 방법이 제공된다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법에서 본원의 방법에 의해 생성된 안정한 T reg 세포의 용도를 제공하며, 여기서 질병, 장애 또는 질환은 면역 질환 또는 암을 포함한다.
또한, 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구를 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함하는 T reg 세포의 집단으로부터 선택되는 안정한 T reg 세포의 집단이 제공된다. 일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 UMPS이고, 영양요구 인자는 우리딘이고, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되고, 하나 이상의 트랜스진은 FOXP3-의존적 발현 제어 서열 또는 FOXP3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 또는 세포 순수성-관련 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 선택적으로 세포 순수성-관련 프로모터는 PTPRC 또는 CCR7과 관련된 프로모터이다.
제1 및 제2 발현 카세트가 혼입된 세포 집단을 생성하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 방법은 (a) 우리딘의 존재하에 우리딘에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작되는 복수의 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물과 복수의 세포를 접촉시키는 단계; 및 (c) 복수의 세포로부터 우리딘을 제거하여 제1 및 제2 발현 카세트가 혼입된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 발현 작제물은 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 제2 발현 작제물은 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트 및 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 발현 카세트를 포함할 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 발현 작제물은 4개의 발현 카세트, UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트, 및 하나 이상의 페이로드를 인코딩하는 나머지 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 추가적인 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 작제물 및/또는 추가적인 발현 작제물을 도입하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 발현 작제물은 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물이다. 일부 구체예에서, 제2 발현 작제물은 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물이다. 특정 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌의 예는 CCR5이다.
우리딘에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포는 UMPS 넉아웃 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 UMPS 넉다운 세포가 되도록 유전자 조작된다.
일부 구체예에서, 복수의 세포는 전구 세포, 예를 들어 만능성 줄기 세포로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다.
일부 구체예에서, UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 이러한 구체예에서, UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 항시적으로 발현되어, 제1 및 제2 발현 작제물이 안정적으로 혼입된 세포가 우리딘의 부재 하에 생존할 수 있게 한다.
일부 구체예에서, UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 시험관내에서 요망되는 세포 유형으로 세포를 분화시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 거핵구-특이적 프로모터이며, 요망되는 세포 유형은 거핵구이다.
일부 구체예에서, 세포를 요망되는 세포 유형으로 분화시키는 것은 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 페이로드와 제2 페이로드의 발현으로 이어지며, 이는 요망되는 세포 유형에 상응하는 즉, 요망되는 세포 유형에서 상향조절되는 조직-특이적 프로모터(들)를 가질 수 있다.
또한, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 세포 집단이 본원에 제공된다.
또한, 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 포함하는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 세포의 유전체 내에 안정하게 통합되며, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각은 영양요구 유도성 유전자의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
조작된 세포의 일부 구체예에서, 제1 및 제2 발현 작제물은 상동성 재조합에 의해 세포의 유전체 내로 통합된다.
또한 (a) 영양요구 인자의 존재하에 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포를 배양하는 단계; (b) 세포를 거핵구로 분화시키는 단계; 및 (c) 영양요구 인자를 제거하는 단계를 포함하는 시험관내 거핵구를 생성시키는 방법이 제공된다.
시험관내 혈소판을 생성하는 방법은 전구 세포, 예를 들어 만능성 줄기(PS) 세포를 포함하는 복수의 세포로 출발하는 것을 포함할 수 있다. PS 세포를 포함하는 복수의 세포는 UMPS 넉아웃 세포를 포함할 수 있다. 영양요구 유도성 유전자가 UMPS인 방법 및/또는 세포는 영양요구 인자로서 우리딘의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 우리딘을 제거하면 UMPS의 제1 및/또는 제2의 독립적인 기능성 도메인이 결여된 증식 세포가 치사되거나 증식에 실패하게 된다.
일부 구체예에서, 분화된 거핵구는 혈소판을 생성한다. 분화된 거핵구는 시험관 내에서 혈소판을 생성할 수 있다. 혈소판은 영양요구 인자, 예를 들어 우리딘을 제거한 후에도 지속된다. 일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 혈소판 집단이 생성된다. 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 유핵 세포, 증식 세포, 거핵구, 만능성 세포 및/또는 기타 세포 유형이 없을 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 방법에 의해 생성된 실질적으로 순수한 혈소판 집단을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다.
또한, 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포로부터 시험관내에서 생성된 실질적으로 순수한 혈소판 집단이 제공된다.
(a) 영양요구 인자의 존재하에 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포를 배양하는 단계로서, 복수의 세포가 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃을 갖는 단계; (b) 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물과 복수의 세포를 접촉시키는 단계; 및 (c) 복수의 세포로부터 영양요구 인자를 회수하는 단계를 포함하는 조작된 혈소판 집단을 생성하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구체예에서, 제1 발현 작제물은 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 영양요구 유도성 유전자의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 발현 작제물은 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트 및 영양요구 유도성 유전자의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 발현 카세트를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 발현 작제물, 제2 발현 작제물, 또는 제1 및 제2 발현 작제물은 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물(들)일 수 있다. 특정 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 CCR5일 수 있다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 UMPS이며, 영양요구 인자는 우리딘이다. 따라서, 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 UMPS 독립적인 기능성 도메인 OPRT 및 ODC로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 세포는 전구 세포, 예를 들어 만능성 줄기 세포로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있다.
일부 구체예에서, 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있다.
조작된 혈소판 집단을 생성하는 방법의 일부 구체예는 요망되는 세포 유형으로 세포를 시험관내 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 예를 들어 거핵구-특이적 프로모터일 수 있으며, 요망되는 세포 유형은 거핵구일 수 있다. 세포의 요망되는 세포 유형으로의 분화는 제1, 제2 또는 제1 페이로드와 제2 페이로드의 발현으로 이어질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 거핵구는 혈소판을 생성한다.
일부 구체예에서, 혈소판은 제1, 제2 또는 제1 및 제2 페이로드로 로딩된다.
일부 구체예에서, 시험관내 세포 분화는 영양요구 인자의 존재하에 수행된다. 일부 구체예에서, 분화된 혈소판은 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 발현하지 않는다.
일부 구체예에서, 세포는 세포를 5-FOA와 추가로 배양함으로써 선택될 수 있다. 5-FOA의 존재는 영양요구 인자, 예를 들어 우리딘의 존재하에 임의의 잔류 비편집 세포, 예를 들어 임의의 잔류 PS 세포를 제거할 수 있다.
조작된 혈소판 집단을 생성하는 일부 구체예는 세포 분화 후 영양요구 인자를 제거하는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 나머지 유핵의 증식된 세포는 영양요구 인자의 제거시 죽거나 증식에 실패한다.
또한, UMPS의 넉아웃, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공되며, 여기서 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 세포의 유전체 내에 안정하게 통합되며, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각은 OPRT 및 ODC로부터 선택된 UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 및 제2 발현 작제물은 상동성 재조합에 의해 세포의 유전체로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각은 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암을 포함한다. 특정 유전자좌는 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 CCR5일 수 있고, 상동성 아암은 CCR5 유전자좌를 표적화할 수 있다.
일부 구체예에서, 조작된 세포는 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트를 포함하는 제1 발현 작제물을 포함한다.
일부 구체예에서, 조작된 세포는 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트를 포함하는 제2 발현 작제물을 포함한다.
일부 구체예에서, 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트는 안티센스 RNA, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA 모방체, 항-miR, 합성 mRNA 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 조작된 세포는 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 작제물 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 작제물을 포함한다.
조작된 세포는 전구 세포, 예를 들어 만능성 줄기 세포로부터 유래되거나 분화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조작된 세포는 시험관내에서 배양된 전구 세포, 예를 들어 만능성 줄기 세포로부터 유래되거나 분화될 수 있다.
또한 조작된 혈소판을 생성하는 방법에 사용하기 위한 조작된 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 조작된 혈소판은 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 및 제2페이로드로 로딩될 수 있다.
또한 UMPS 넉아웃 세포가 되도록 조작된 세포로부터 시험관내에서 제조된 실질적으로 순수한 혈소판 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 유핵 세포 또는 증식 세포가 없거나 실질적으로 없을 수 있어, 임의의 나머지 유핵 또는 증식 세포는 노화, 사멸, 비기능성, 비증식성, 비생존성이고/거나 효과적으로 존재하지 않을 정도로 충분히 적은 수로 존재한다.
일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 대상체에게 혈소판을 투여하는 것을 포함하는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료용 페이로드를 전달하는 방법에 사용될 수 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 인용으로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 인용으로 본원에 포함된다.
도 1은 PS 세포-유래된 조작된 거핵구에 사용하기 위한 발현 벡터를 최적화하기 위해 분할 영양요구성 선택을 사용하는 예시적인 과정의 개략도이다.
도 2는 시험관내에서 거핵구(MK)로 분화된 UMPS 넉아웃(KO) 만능성 줄기(PS) 세포로부터 생체내 적용을 위한 혈소판을 생성하기 위해 우리딘 영양요구성 기반 선택 방법을 사용하는 예시적인 과정의 개략도이다.
도 3은 시험관내에서 만능성 줄기(PS) 세포로부터 조작된 혈소판을 생성하기 위해 분할 영양요구성을 이용하는 예시적인 과정의 개략도이다.
상세한 설명
I. 도입
최근의 발전은 인간 세포의 유전체의 정확한 변형을 가능하게 한다. 이러한 유전 공학은 광범위한 적용을 가능하게 하지만, 세포 거동을 조절하기 위한 새로운 방법이 또한 필요하다. 세포에 대한 대안적 제어 시스템은 대사에서 유전자를 표적화하여 조작될 수 있는 영양요구성이다. 대사의 중심 유전자의 파괴에 의한 영양요구성 유전자 조작의 본원에 기재된 접근법은 인간 세포에 대해 탐구되지 않은 세포 기능에 대한 외부 제어 메커니즘을 생성시키는 대안적인 패러다임이다.
영양요구성은, 예를 들어, 조작된 유전자 회로의 도입에 의해 비천연 물질을 향해(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Kato, Y. (2015) An engineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid: a novel biological containment system. PeerJ 3, e1247] 참조) 또는 박테리아 유전자의 넉아웃에 의해 피리미딘을 향해(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789] 참조) 미생물에서 이전에 조작된 적이 있다. 후자의 개념은 복잡한 발현 카세트의 도입 대신 유전자의 넉아웃에 의존하여 세포를 유전적 변형의 역전 또는 내성 메커니즘의 발달로부터 방해하고 따라서 대안적 시스템의 상기 난제를 해결하기 때문에 매력적이다. 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드가 DNA 및 RNA 합성, 에너지 전달, 신호 전달 및 단백질 변형을 포함하는 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 한다는 사실(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[van Kuilenburg, A.B.P. and Meinsma, R. (2016). Biochem. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1862, 1504-1512] 참조)은 이들의 합성 경로를 이론적으로 매력적인 표적으로 만든다.
인간 세포는 외부 공급원 또는 공생 유기체로부터 획득해야 하는 아미노산과 같은 특정 화합물에 대해 자연적으로 영양요구성이다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Murray, P.J. (2016). Nat. Immunol. 17, 132-139] 참조). 추가로, 영양요구성은, 예를 들어, 세포가 영양요구성인 대사물의 차별적 공급 또는 고갈에 의해 면역 세포의 기능을 조절하는 천연 메커니즘이다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Grohmann et al., (2017). Cytokine Growth Factor Rev. 35, 37-45] 참조). 세포 영양요구성은 또한, 예를 들어, 아르기닌을 제거함으로써 종양 성장을 억제하는 대식세포의 경우 악성 성장에 대한 방어 메커니즘에서 중요한 역할을 한다(Murray, 2016). 또한, 여러 악성 세포 유형은 특정 대사물에 대해 영양요구성인 것으로 나타났으며(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Fung, M.K.L. and Chan, G.C.F. (2017). J. Hematol. Oncol. 10, 144] 참조), 이는 백혈병 환자의 치료를 위한 아스파라긴의 치료적 고갈에 의해 이용된다(문헌[Hill et al., (1967). JAMA 202, 882] 참조).
미생물에 대한 이전에 개발된 봉쇄 전략에 더하여, Cas9 리보핵단백질(RNP)/rAAV6에 기반한 유전자 편집을 사용하는 본원에 기재된 접근법은 일차 및 치료적 관련 인간 세포 유형의 매우 효율적인 조작을 가능하게 한다. 영양요구성 및 5-FOA에 대한 내성은 UMPS 유전자의 완전한 파괴를 갖는 모든 세포에 내재되어 있지만, 개념 증명을 제시하기 위해, 선택 마커의 표적화된 통합에 의한 이중-대립유전자 넉아웃으로 집단의 확인이 촉진되었다. 대사 영양요구성의 확립과 함께 일차 인간 세포의 효율적인 표적화된 변형을 가능하게 하는 방법의 최근 개발(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Bak, Rasmus O., et al. CRISPR/Cas9 and AAV6." Elife 6 (2017): e27873; Bak, Rasmus O., et al. "Correction: Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6." Elife 7 (2018): e43690; Bak, Rasmus O., Daniel P. Dever, and Matthew H. Porteus. "CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells." Nature protocols 13.2 (2018): 358; and Porteus, Matthew H., and David Baltimore. "Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells." Science 300.5620 (2003): 763-763])은, 예를 들어, 특정 효과기 기능 및 감소된 면역원성을 갖는 줄기 세포 또는 줄기 세포 유래 조직 또는 기타 자가 체세포의 사용에서 인간 세포의 사용이 필요한 환경에서 치료적 접근법의 추가 개발을 위한 토대를 마련한다. 특히, 신속한 임상 번역을 촉진하는 작제물 및 시약, 예를 들어, 면역원성을 피하는 표적화 작제물의 선택 마커 tNGFR 및 tEGFR, 및 FDA 승인 프로드러그를 사용하여 생체 내 모델에서 공급되는 우리딘이 사용되었다.
세포 기능을 제어하기 위한 조작된 메커니즘은 조절 메커니즘을 매개하는 단백질을 발현하는 세포의 완전히 순수한 집단을 선택하는 추가 난제를 갖는다. 세포독성제에 내성을 부여하여 조작된 세포를 선택할 가능성은 무독성 물질을 사용하여 제어될 수 있는 매우 순수한 세포 집단의 생성을 가능하게 하여 효율을 크게 증가시킬 수 있고 중요한 대사 경로의 기능에 중요한 유전자의 제거는 세포가 회피 메커니즘이 발달하는 것을 방지하므로 특히 매력적이다. 따라서, 이러한 방법은 유전적 불안정성 및 악성 형질전환의 위험이 작용하고, 격리로부터 회피하는 세포의 적은 수조차도, 예를 들어, 체세포 또는 만능성 줄기 세포의 사용에서 재앙적 영향을 미칠 수 있는 환경에서 기존의 제어 메커니즘에 비해 여러 이점을 제공한다.
이러한 개념은 미생물에 대해 탐구되었으며(Steidler et al., 2003), 효모 유전학자에 의해 거의 보편적인 연구 도구로 광범위하게 사용되었다. 이는 복잡한 제어 메커니즘의 도입 대신 유전자의 넉아웃에 의해 생성되고, 영양요구성이 세포의 내인성 대사의 일부인 무독성 화합물을 향하는 경우 포유동물 세포에서 특히 강력할 것이다. 이는 대사 경로에서 필수 유전자의 파괴에 의해 달성될 수 있으며, 상기 경로의 생성물이 외부적으로 공급되고 환경으로부터 세포에 의해 흡수되는 경우에만 세포가 기능하도록 한다. 또한, 각각의 유전자가 또한 세포독성제의 활성화에도 관여하는 경우, 유전자 넉아웃(KO)은 세포가 상기 약물에 내성이 되도록 하여 변형되지 않은 세포의 고갈 및 세포 집단에서 조작된 세포의 정제를 가능하게 한다. 대사물의 공급에 의해 대사의 몇 가지 단일유전자 선천 오류가 치료될 수 있으며, 따라서 인간 영양요구성의 모델로 볼 수 있다.
특정 구체예에서, 영양요구성은 유전체 편집을 통해 새로운(de novo) 피리미딘 합성 경로에서 UMPS를 파괴함으로써 인간 세포에 도입된다. 이는 세포의 기능이 외인성 우리딘의 존재에 의존하게 만든다. 또한, 이는 5-플루오로오로트산을 5-FU로 대사하는 세포의 능력을 폐지하며, 이는 온전한 UMPS 대립유전자를 갖는 나머지 세포의 고갈을 가능하게 한다. 대사물을 사용하여 유전자 조작된 영양요구성에 의한 인간 세포의 기능에 영향을 미치고 다른 세포를 고갈시키는 능력은 제어 가능한 세포의 순수한 집단이 필요한 다양한 적용에 대한 상기 접근법의 개발을 제공한다.
영양요구성의 한 예는 UMPS 유전자의 돌연변이가 고용량의 우리딘을 이용한 보충에 의해 치료될 수 있는 기능장애를 유발하는 유전성 오로트산뇨증이다(Fallon et al., 1964). 이러한 개념을 관심 세포 유형으로 옮기면, 인간 세포에서 UMPS 유전자를 넉아웃시키기 위해 세포를 우리딘에 대해 영양요구성이고 5-플루오로오로트산(5-FOA)에 대해 내성으로 만드는 유전 공학이 사용되었다. UMPS-/- 세포주 및 일차 세포가 시험관 내에서 우리딘의 존재하에서만 생존하고 증식하며, UMPS 조작 세포 증식은 생체 내에서 우리딘의 보충 없이 억제되는 것이 본원에서 제시된다. 또한, 세포는 5-FOA의 존재하에서 배양함으로써 혼합 집단으로부터 선택될 수 있다.
특정 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 전구 세포에서 유전자의 발현을 조절하기 위해 UMPS 유전자좌 내로 삽입될 수 있으며, 여기서 삽입된 프로모터와 관련된 조직 유형으로 전구 세포의 분화는 UMPS 유전자의 발현을 발생시킨다.
II. 본 개시내용의 조성물
세포 선택 방법 및 트랜스진의 선택적 발현에 사용하기 위한 방법 및 조성물의 일부 구체예가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 잠재적으로 포함하거나 조직-특이적 프로모터를 포함하는 작제물을, 세포를 영양요구성으로 만들고, 분화된 세포를 독립영양성(즉, 생존 및/또는 성장에 필요한 모든 영양소 또는 인자를 합성할 수 있음)으로 만들고, 트랜스진 발현을 통한 유전자 요법의 개선된 효능, 역가 및/또는 안전성을 제공할 수 있는 방식으로 세포에 전달하는 것을 포함한다.
특정 영양요구 유도성 유전자좌로의 작제물의 전달은, 예를 들어, 유전자의 파괴 또는 넉아웃 또는 유전자 활성의 하향조절을 통해 영양요구 세포를 생성시키는데, 이는 이제 성장 및 생식을 위해 영양요구 인자의 지속적인 투여에 의존한다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구 유도성 유전자좌를 표적화하는 뉴클레아제 시스템, 본원에 기재된 작제물을 삽입하기 위한 벡터, 키트, 및 영양요구성이고 도입된 작제물을 발현할 수 있는 변형된 세포를 생성시키기 위해 상기 시스템, 주형 또는 벡터를 사용하는 방법을 포함한다.
또한, 일부 구체예에서, 변형된 세포의 사용을 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 개시되며, 여기에는 변형된 세포의 성장 및 생식을 조절(증가, 감소 또는 중단)하고 트랜스진의 발현을 조절하고 치료 인자의 수준을 조절하기 위한 약학적 조성물, 치료 방법 및 영양요구 인자의 투여 방법이 포함된다.
일부 예에서, 원하는 유전자좌로의 작제물의 전달은 상동성 재조합과 같은 방법을 통해 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "상동성 재조합(HR)"은 상동성 특이적 복구 메커니즘을 통해 DNA에서 이중 가닥 파괴의 복구 동안 뉴클레오티드 서열의 삽입을 나타낸다. 이러한 과정은 이중 가닥 파괴를 복구하기 위한 주형으로서 파괴 영역의 뉴클레오티드 서열과 상동성을 갖는 "공여체" 분자 또는 "공여체 주형"을 사용한다. 이중 가닥 파괴의 존재는 공여체 서열의 통합을 촉진한다. 공여체 서열은 물리적으로 통합되거나, 상동성 재조합을 통한 파괴의 복구를 위한 주형으로 사용될 수 있으며, 이는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 도입을 발생시킨다. 이러한 과정은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템과 같은 메가뉴클레아제와 같은 이중 가닥 파괴를 생성시키는 다수의 상이한 유전자 편집 플랫폼에 의해 사용된다.
일부 구체예에서, 유전자는, 예를 들어, 다중 치료 인자의 발현을 위해 또는 합성 조절인자로서 작용하거나 특정 계통에 대해 변형된 세포를 편향시키는 작용을 하는(예를 들어, 제2 유전자좌로부터 전사 인자를 발현함에 의함) 제2 유전자의 도입을 위해 2개 이상의 유전자좌로 전달된다. 일부 구체예에서, 유전자는 2개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌에 전달된다. 예를 들어, 상이한 유전자 또는 동일한 유전자의 제2 복사체는 제2 영양요구 유도성 유전자좌로 전달된다.
일부 구체예에서, 세포는 영양요구 인자를 생성하는 능력을 더이상 갖지 않으므로 세포는 영양요구성이다. 본원에서 사용되는 "세포", "변형된 세포" 또는 "변형된 숙주 세포"는 동일한 세포로부터 유래된 세포 집단을 나타내며, 집단의 각각의 세포는 유사한 유전적 구성을 갖고 동일한 변형을 유지한다.
일부 구체예에서, 영양요구 인자는 1개 또는 2개 또는 그 초과의 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 비-유기 분자, 비-필수 아미노산, 또는 변경된 농도의 모이어티(정상 생리학적 농도에 비함), 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에서 영양요구 인자에 대한 모든 언급은 다수의 인자의 투여를 고려한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 영양요구 인자는 변형된 숙주 세포를 유지하기에 충분한 농도로 대상체에서 독성이 없거나 생체 이용 가능하지 않은 영양소 또는 효소이며, 본 출원 전체에 걸친 "영양요구 인자"에 대한 임의의 언급은 영양소 또는 효소에 대한 언급을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 예에서, 변형된 세포에 영양요구 인자가 지속적으로 공급되지 않는 경우, 세포는 증식을 중단하거나 사멸한다. 일부 예에서, 변형된 세포는 종양원성 형질전환을 포함하는 다른 세포 기반 요법과 관련된 위험을 감소시키는 안전 스위치를 제공한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 다수의 이점, 예를 들어, 렌티바이러스를 이용하는 것과 같은 무작위 통합보다는 동일한 유전자좌로 통합함으로 인한 일관된 결과 및 조건; 고유 프로모터 또는 인핸서를 갖는 영역 또는 침묵되는 영역이 회피되기 때문에 트랜스진의 일정한 발현; 푸아송 분포가 아닌 1 또는 2개의 복사체의 통합의 일관된 복사체 수; 및 종양원성 형질전환의 제한된 기회를 제공한다. 일부 예에서, 본 발명의 개시내용의 변형된 세포는 렌티벡터 또는 다른 바이러스 벡터에 의해 조작된 생성물보다 덜 불균일하다.
A. 치료 인자
하기 구체예는 영양요구 숙주 세포에서 치료 인자를 생성시킴으로써 치료될 질환을 제공한다.
예를 들어, 응고 장애는 응고 캐스케이드의 인자가 부재하거나 돌연변이로 인해 감소된 기능을 갖는 매우 흔한 유전 장애이다. 이들은 혈우병 A(인자 VIII 결핍), 혈우병 B(인자 IX 결핍) 또는 혈우병 C(인자 XI 결핍)를 포함한다.
알파-1 항트립신(A1AT) 결핍은 혈액 및 폐에서 부적절한 A1AT 수준을 발생시키는 알파 1-항트립신의 생성 결함으로 인해 발생하는 보통염색체 열성 질병이다. 이는 만성폐쇄폐병(COPD) 및 간 장애의 발병과 관련될 수 있다.
유형 I 당뇨병은 췌장 베타 세포의 면역 매개 파괴가 인슐린 생성의 현저한 결핍을 발생시키는 장애이다. 합병증은 허혈성 심장병(협심증 및 심근 경색), 뇌졸중 및 말초 혈관 질병, 당뇨 망막병증, 당뇨 신경병증 및 당뇨 신장병증을 포함하며, 이는 투석이 필요한 만성 신장 질병을 발생시킬 수 있다.
항체는 특정 유형의 세포(예를 들어, 암세포, 자가면역 질병의 특정 면역 세포, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), RSV, 독감, 에볼라, CMV 등과 같은 바이러스에 감염된 세포)를 매우 선택적으로 사멸시킬 뿐만 아니라 질병을 유발하는 표적 단백질의 중화 또는 청소에 사용되는 분비 단백질 생성물이다. 항체 요법은 종양학, 류머티즘학, 이식 및 안구 질병을 포함하는 많은 인간 질환에 널리 적용되었다. 일부 예에서, 본원에 개시된 조성물에 의해 인코딩되는 치료 인자는 암, 감염성 질병 및 자가면역 질병과 같은 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용되는 항체이다. 특정 구체예에서, 암은 대상체에서 종양의 성장 속도를 감소시키거나 종양의 크기를 감소시킴으로써 치료된다.
치료적 용도에 대해 FDA에 의해 승인된 모노클로날 항체는 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 아벨루맙(Avelumab), 두필루맙(Dupilumab), 두르발루맙(Durvalumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 브로달루맙(Brodalumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 올라라투맙(Olaratumab), 다라투무맙(Daratumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오빌톡사시맙(Obiltoxaximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 세쿠키누맙(Secukinumab), 메폴리주맙(Mepolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 이다루시주맙(Idarucizumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 실툭시맙(Siltuximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine), 페르투주맙(Pertuzumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오비노투주맙(Obinutuzumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 락시바쿠맙(Raxibacumab), 벨리무맙(Belimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 데노수맙(Denosumab), 데노수맙(Denosumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 베실레소맙(Besilesomab), 토실리주맙(Tocilizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 골리무맙(Golimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab), 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), 카투막소맙(Catumaxomab), 에쿨리주맙(Eculizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 베바시주맙(Bevacizumab), 오말리주맙(Omalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 에팔리주맙(Efalizumab), 이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan), 파놀레소맙(Fanolesomab), 아달리무맙(Adalimumab), 토시투모맙(Tositumomab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 젬투주맙 오조가미신(Gemtuzumab ozogamicin), 인플릭시맙(Infliximab), 팔리비주맙(Palivizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 리툭시맙(Rituximab), 보투무맙(Votumumab), 술레소맙(Sulesomab), 아르시투모맙(Arcitumomab), 이미시로맙(Imiciromab), 카프로맙(Capromab), 노페투모맙(Nofetumomab), 압식시맙(Abciximab), 사투모맙(Satumomab) 및 무로모납-CD3(Muromonab-CD3)를 포함한다. 치료적 용도에 대해 FDA에 의해 승인된 이중특이적 항체는 블리나투모맙(Blinatumomab)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 HIV 또는 다른 감염성 질병을 예방하거나 치료하는 데 사용된다. HIV의 치료에서 사용하기 위한 항체는 인간 모노클로날 항체(mAb) VRC-HIVMAB060-00-AB(VRC01); mAb VRC-HIVMAB080-00-AB(VRC01LS); mAb VRC-HIVMAB075-00-AB(VRC07-523LS); mAb F105; mAb C2F5; mAb C2G12; mAb C4E10; 항체 UB-421(T-림프구 및 단핵구의 CD4 분자(도메인 1) 상의 HIV-1 수용체를 표적화함); Ccr5mab004(Ccr5에 대한 인간 모노클로날 IgG4 항체); mAb PGDM1400; mAb PGT121(HIV 외피 단백질의 V1V2(PGDM1400) 및 V3 글리칸-의존적(PGT121) 에피토프 영역을 표적화 하는 재조합 인간 IgG1 모노클로날 항체); KD-247(인간화된 모노클로날 항체); PRO 140(모노클로날 CCR5 항체); mAb 3BNC117; 및 PG9(항-HIV-1 gp120 모노클로날 항체)를 포함한다.
치료 RNA는 안티센스, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA 모방체/항-miRs 및 합성 mRNA를 포함하며, 이들 중 일부는 트랜스진에 의해 발현될 수 있다.
리소좀 축적 장애("LSD")는 효소 결핍의 결과로서 신체 세포에서의 다양한 독성 물질의 비정상적 축적을 특징으로 하는 유전적 대사 질병이다. 이들 장애는 전부 거의 50개에 달하며, 이들은 골격, 뇌, 피부, 심장 및 중추신경계를 포함하는 신체의 상이한 부분에 영향을 미친다. 일반적인 예로는 스핑고리피드증, 파버병(ASAH1 결핍), 크라베병(갈락토실세라미다제 또는 GALC 결핍), 갈락토시알리도시스, 강글리오시드증, 알파-갈락토시다제, 파브리병(α-갈락토시다제 결핍-GLA, 또는 아갈시다제 알파/베타), 쉰들러병(알파-NAGA 결핍), GM1 강글리오시드증, GM2 강글리오시드증(베타-헥소스아미니다제 결핍), 잔트호프병(헥소스아미니다제-B 결핍), 테이-삭스병(헥소스아미니다제-A 결핍), 고셔병 유형 1/2/3(글루코세레브로시다제 결핍-유전자 명칭: GBA), 월만병(LAL 결핍), 니만-픽병 유형 A/B(스핑고미엘린 포스포디에스테라제 1 결핍--SMPD1 또는 산 스핑고미엘리나제), 설파티도증(Sulfatidosis), 이염색 백색질장애, 헐러 증후군(알파-L 이두로니다제 결핍--IDUA), 헌터 증후군 또는 MPS2(이두로네이트-2-설파타제 결핍-이두르설파제 또는 IDS), 산필리포 증후군, 모르퀴오, 마로토-라미 증후군, 슬라이 증후군(β-글루쿠로니다제 결핍), 점액지질증, I-세포병, 지질증, = 신경 세로이드 리포푸스신증, 바텐병(트리펩티딜 펩티다제-1 결핍), 폼페(알글루코시다제 알파 결핍), 저인산증(아스포타제 알파 결핍), MPS1(라로니다제 결핍), MPS3A(헤파린 N-설파타제 결핍), MPS3B(알파-N-아세틸글루코사미니다제 결핍), MPS3C(헤파린-a-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제 결핍), MPS3D(N-아세틸글루코사민 6-설파타제 결핍), MPS4(엘로설파제 알파 결핍), MPS6(글라설페이트 결핍), MPS7(B-글루코로니다제 결핍), 페닐케톤뇨증(페닐알라닌 하이드록실라제 결핍) 및 MLD(아릴설파타제 A 결핍)를 포함한다. 집합적으로, LSD는 7000명의 출생 중 약 1명의 인구에서의 발생률을 가지며, 조기 사망을 포함하는 심각한 영향을 미친다. 이들 질병 중 일부에 대한 가능한 치료법에 대한 임상 시험이 진행 중이지만, 현재 많은 LSD에 대해 승인된 치료법이 없다. 전부는 아닌 일부 LSD에 대한 현재의 치료 옵션은 효소 대체 요법(ERT)을 포함한다. ERT는 신체에 부족하거나 부재하는 효소를 대체하는 의학적 치료법이다. 일부 예에서, 이는 환자에게 효소를 함유하는 용액의 정맥내(IV) 주입을 제공함으로써 수행된다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법의 구체예를 사용하여 선택된 세포와 같은 본원에 개시된 조성물을 사용하여 개별 효소 대체 요법을 제공하는 것을 포함하는 LSD의 치료를 필요로 하는 개체에서 LSD를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구 유도성 유전자좌에 통합된 효소를 인코딩하는 작제물을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포를 포함하며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 개체에서 결핍된 효소를 발현하고 이에 의해 개체에서 LSD를 치료할 수 있다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 표 2의 유전자 내에 있거나 표 2의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 비오틴이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 아스파라긴 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아스파라긴이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 아스파테이트 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아스파테이트이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 알라닌 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 알라닌이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 시스타티오닌 베타 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 시스테인이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 시스타티오닌 감마-리아제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 시스테인이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 글루타민 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 글루타민이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 세린 하이드록시메틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린 또는 글리신이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 글리신 신타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 글리신이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 포스포세린 트랜스아미나제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 포스포세린 포스파타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 세린이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 페닐알라닌 하이드록실라제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 티로신이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 아르기니노숙시네이트 신세타제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아르기닌이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 아르기니노숙시네이트 리아제를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 아르기닌이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 디하이드로폴레이트 환원효소를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물을 사용하여 개별 단백질 대체 요법을 제공하는 것을 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 본원에 개시된다. 일부 예에서, 상기 방법은 영양요구 유도성 유전자좌에 통합된 단백질을 인코딩하는 작제물을 포함하는 생체 외 변형된 숙주 세포를 포함하며, 상기 변형된 숙주 세포는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이고 개체에서 결핍된 단백질을 발현하고 이에 의해 개체에서 질병 또는 장애를 치료할 수 있다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 표 2의 유전자 내에 있거나 표 2의 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 우리딘이다. 일부 예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 홀로카르복실라제 신세타제(HLCS)를 인코딩하는 유전자 내에 있다. 일부 예에서, 영양요구 인자는 비오틴이다. 일부 예에서, 질병은 프리드리히 운동실조이고, 단백질은 프라탁신이다. 일부 예에서, 질병은 유전성 혈관부종이고, 단백질은 C1 에스테라제 억제제(예를 들어, HAEGAARDA® 피하 주사)이다. 일부 예에서, 질병은 척추 근육 위축이고, 단백질은 SMN1이다.
B. 영양요구성 세포 집단
일부 구체예에서, 영양요구성이 되도록 유전자 조작되는 세포, 바람직하게는 인간 세포를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 영양요구성은 영양요구 유도성 유전자 또는 일부 경우에, 영양요구 인자 및/또는 영양요구 유도성 유전자좌에서 치료 인자를 인코딩하는 작제물의 삽입을 통해 유도될 수 있으며, 치료 인자를 발현할 수 있다. 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내 변형된 동물 세포, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포가 고려된다. 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 래트와 같은 상업적으로 관련된 포유동물을 포함하는 포유동물; 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류의 세포가 또한 포함된다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 영양요구 유도성 유전자좌 내에 삽입된다. 예를 들어, 영양요구 인자, 재발현된 영양요구 유도성 유전자 및/또는 치료 인자는 전구 세포가 조직-특이적 프로모터와 관련된 조직으로 분화될 때에만 발현된다.
일부 구체예에서, 전구 세포는 배아 줄기 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 만능성 줄기 세포, 유도 만능성 줄기(iPS) 세포, 체세포 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 간질 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 섬유모세포, NK 세포, B 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 예를 들어, 세포는 CAR을 발현하도록 조작되어 CAR-T 세포를 생성할 수 있다.
대상체에 투여되는 경우 변형된 세포의 면역 거부를 방지하기 위해, 변형될 세포는 바람직하게는 대상체 자신의 세포로부터 유래된다. 따라서, 바람직하게는 포유동물 세포는 변형된 세포로 치료할 대상체로부터 유래된다. 일부 예에서, 포유동물 세포는 자가 세포이다. 일부 예에서, 포유동물 세포는 동종이형 세포이다. 일부 예에서, 변형된 T 세포는, 예를 들어, T 세포 수용체 유전자좌를 비활성화시킴으로써 이식편대숙주병을 예방하도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 세포는, 예를 들어, 세포의 표면에서 MHC 클래스 I을 제거하기 위해 B2M을 결실시키거나, B2M를 결실시킨 후 HLA-G-B2M 융합체를 표면에 다시 첨가하여 표면에 MHC 클래스 I을 갖지 않는 세포의 NK 세포 거부를 방지함으로써 면역 불활성이 되도록 추가로 변형될 수 있다.
세포주는 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 U.S. 8,945,862호에 제시된 바와 같이 하기 기술을 사용하여 유지되고 분화된 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다. 또한, 세포주는 각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 WO 2003/046141호 또는 문헌[Chung et al. (Cell Stem Cell, February 2008, Vol. 2, pages 113-117)]에 개시된 기술에 의해 제조된 줄기 세포를 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포는 상피, 연골, 뼈, 평활근, 가로무늬근, 신경 상피, 중층 편평 상피 및 신경절 중 임의의 것의 재생 의료 치료에서 사용하기 위해 대상체로부터 분리된 줄기 세포일 수 있다. 파킨슨병 및 소아 발병 당뇨병과 같은 하나 또는 몇 가지 세포 유형의 사멸 또는 기능 장애로부터 발생하는 질병은 또한 일반적으로 줄기 세포를 사용하여 치료된다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Thomson et al., Science, 282:1145-1147, 1998]을 참조한다).
일부 구체예에서, 세포는 대상체로부터 수확되고, 특정 세포 유형을 선택하고, 선택적으로 세포를 확장하고, 선택적으로 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있고, 영양요구 유도성 유전자좌에 통합된 작제물을 함유하는 세포를 선택하는 것을 선택적으로 포함할 수 있는 본원에 개시된 방법에 따라 변형된다.
C. 작제물
변형된 숙주 세포의 유전체에 의해 인코딩된 치료적 실체는 분자 트래피킹, 세포 사멸 유도, 추가 세포 모집 또는 세포 성장과 같은 치료 효과를 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 효과는 치료 단백질의 발현이다. 일부 구체예에서, 치료 효과는 종양 세포의 세포 사멸을 포함하는 유도된 세포 사멸이다.
일부 구체예에서, 뉴클레아제 시스템은 DNA를 절단하는데 사용된 후, 상동성 특이적 복구 메카니즘은 DNA 파괴의 복구 동안 작제물을 삽입하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 작제물 주형은 파괴 영역의 뉴클레오티드 서열에 상동인 영역을 포함하여, 공여체 주형은 파괴부에 인접한 영역에 하이브리드화되며, 파괴 복구를 위한 주형으로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 작제물은 영양요구 유도성 유전자좌의 단편 또는 이의 상보체에 상동성인 뉴클레오티드 서열에 의해 양 쪽이 측접된다. 일부 예에서, 작제물은 단일 가닥, 이중 가닥, 플라스미드 또는 DNA 단편이다. 일부 예에서, 플라스미드는 프로모터 및 선택적으로 3' UTR을 포함하여 복제에 필요한 요소를 포함한다.
(a) 영양요구 유도성 유전자좌의 단편에 상동성이거나 상기 영양요구 유도성 유전자좌의 상보체에 상동성인 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로서, 레트로바이러스, 렌티바이러스(통합 적격 및 통합 결함 렌티바이러스 벡터 둘 모두), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있는 벡터가 추가로 본원에 개시된다. 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 복제에 필요한 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 표적화 작제물은 (1) 바이러스를 생성하기 위해 바이러스 벡터 백본, 예를 들어 AAV 백본; (2) 표적 부위에 대해 적어도 200 bp 상동성이지만, 이상적으로는 상기 부위에 대한 높은 수준의 재현 가능한 표적화를 보장하기 위해 각각의 측면에서 400 bp 상동성인 아암(예를 들어, 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 56:163-190 (2016)] 참조); (3) 잠재적으로, 치료 인자를 인코딩하고 치료 인자를 발현할 수 있는 트랜스진; (4) 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열; 및 선택적으로 (5) 변형된 숙주 세포의 농축 및/또는 모니터링을 가능하게 하는 추가 마커 유전자를 포함한다.
적합한 마커 유전자는 당 분야에 공지되어 있으며, Myc, HA, FLAG, GFP, 트렁케이션된 NGFR, 트렁케이션된 EGFR, 트렁케이션된 CD20, 트렁케이션된 CD19, 뿐만 아니라 항생제 내성 유전자를 포함한다.
당 분야에 공지된 임의의 AAV가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 일차 AAV 혈청형은 AAV6이다.
임의의 상기 구체예에서, 작제물 또는 벡터는 영양요구 유도성 유전자좌의 단편, 선택적으로 하기 표 2의 임의의 유전자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 영양요구 유도성 유전자좌의 적어도 200, 250, 300, 350 또는 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85, 88, 90, 92, 95, 98 또는 99% 동일하고; 최대 400개의 뉴클레오티드는 일반적으로 정확한 재조합을 보장하기에 충분하다. 예를 들어, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 200개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 250개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 300개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 350개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 88% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 92% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 95% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 98% 동일하거나, 적어도 400개의 연속 뉴클레오티드와 적어도 99% 동일한 상기 파라미터의 임의의 조합이 구상된다.
본원의 개시내용은 또한 cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 영양요구 유도성 유전자좌에 대한 작제물의 통합을 표적화하기 위한 시스템을 고려한다.
본원의 개시내용은 상기 공여체 주형 또는 벡터 및 상기 영양요구 유도성 유전자좌에 특이적인 엔도뉴클레아제를 포함하는 영양요구 유도성 유전자좌에 대한 작제물의 통합을 표적화하기 위한 시스템을 추가로 고려한다. 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, ZFN, TALEN 또는 메가뉴클레아제일 수 있다.
삽입된 작제물은 또한 급성 독성으로 인해 세포의 신속한 제거가 필요할 수 있는 상황에서 유전자좌로의 표준 자살 유전자(예를 들어, iCasp9)와 같은 다른 안전 스위치를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하기 위해 선택된 분화된 세포는 시험관내 분화시 자가영양성이며, 그러나, 후에 (예를 들어, 치료학적 적용을 위해 대상체에 이식하기 전) 본원에 기술된 바와 같이 조건부 탈안정화 도메인 또는 리보자임과 같은 조건부 안전 스위치를 삽입함으로써 영양요구성이 될 수 있어, 영양요구 인자의 제거에 의해 신체에 이식된 임의의 조작된 세포가 제거될 수 있다. 이는 조작된 세포가 암세포로 형질전환된 경우 특히 중요하다.
일부 예에서, 공여체 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 선택적으로 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 발현 제어 서열은 프로모터 또는 인핸서, 유도성 프로모터, 항시성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 발현 제어 서열, 전사 후 조절 서열 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
D. 뉴클레아제 시스템
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 영양요구 유도성 유전자좌를 표적화하는 뉴클레아제 시스템을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 (a) 상기 영양요구 유도성 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 (b) 상기 엔도뉴클레아제를 발현시키기 위한 벡터 시스템을 포함하여 상기 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 고려한다. 일 예로서, 엔도뉴클레아제는 (i) 영양요구 유도성 유전자좌에 결합하는 전사 활성화제 유사 효과기(TALE) DNA 결합 도메인으로서, TALE DNA 결합 단백질이 복수의 TALE 반복 단위를 포함하고, 각각의 TALE 반복 유닛이 영양요구 유도성 유전자좌에서 표적 서열의 뉴클레오티드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는, TALE DNA 결합 도메인, 및 (ii) DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질인 TALEN이다.
또한, (a) Cas(예를 들어, Cas9) 또는 Cpf1 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 및 (b) 상기 영양요구 유도성 유전자좌에 특이적으로 하이브리드화되는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 상기 영양요구 유도성 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템이 본원에 개시된다. 자연적으로, Cas9 시스템은 cas9 폴리펩티드, crRNA 및 전이활성 crRNA(tracrRNA)로 구성된다. 본원에서 사용되는 "cas9 폴리펩티드"는 천연 발생 cas9 폴리펩티드 또는 DNA의 적어도 하나의 가닥을 절단하는 능력을 보유하는 변형된 cas9 폴리펩티드를 나타낸다. 변형된 cas9 폴리펩티드는, 예를 들어, 천연 발생 Cas9 폴리펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일할 수 있다. 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 폴리펩티드가 사용될 수 있으며; S. 피오게네스(S. pyogenes)는 일반적으로 상업적으로 판매된다. cas9 폴리펩티드는 일반적으로 이중 가닥 파괴를 생성하지만, HNH 또는 RuvC 도메인에 불활성화 돌연변이를 도입시킴으로써 DNA의 단일 가닥만 절단(즉, "단일 가닥 파괴"를 생성)하는 닉카제로 전환될 수 있다. 유사하게, 천연 발생 tracrRNA 및 crRNA는 계속 하이브리드화하고 원하는 DNA를 표적화하는 능력 및 cas9에 결합하는 능력을 유지하는 한 변형될 수 있다. 가이드 RNA는 2개의 RNA가, 예를 들어, 인공 루프와 함께 융합된 키메라 RNA일 수 있거나, 가이드 RNA는 2개의 하이브리드화된 RNA를 포함할 수 있다. 메가뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템은, 예를 들어, 오버행을 포함하는 절단된 말단을 생성하기 위해 영양요구 유도성 유전자좌 내에서 이중 가닥 파괴 또는 하나 이상의 단일 가닥 파괴를 생성할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 뉴클레아제 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 작제물을 추가로 포함한다.
예를 들어, 유전자 넉아웃 또는 유전자의 발현이 하향조절되도록 하는 핵산 편집을 위한 다양한 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제 또는 이들의 조합과 같은 다양한 뉴클레아제 시스템이 핵산을 편집하는 데 사용되는 것으로 당 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 개시에서 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 전형적으로 연장되거나 융합된 DNA 인지 서열을 갖는 천연 발생 제한 효소의 변형된 버전이다.
CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 WO 2013/176772호, WO 2014/093635호 및 WO 2014/089290호에 상세히 기재되어 있다. T 세포에서의 이의 사용은 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 WO 2014/191518호에서 제안되어 있다. T 세포의 CRISPR 조작은 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 EP 3004349호에 논의되어 있다.
돌연변이체(넉아웃, 넉인 또는 유전자 대체) 세포주의 생성을 위한 시간 제한 요인은 CRISPR/Cas9 플랫폼의 개발 전의 클론 스크리닝 및 선택이었다. 본원에서 사용되는 용어 "CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템"은 Cas9에 대한 결합 부위를 갖는 가이드 RNA(gRNA)(또한, "단일 가이드 RNA"(sgRNA)) 서열 및 변형될 영역에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 유전 공학 도구를 나타낸다. Cas9은 gRNA에 결합하여 표적 영역에 결합하고 이를 절단하는 리보핵단백질을 형성한다. 특정 구체예에서, gRNA/sgRNA는 2018년 5월 10일 출원된 U.S. 62/669,848에 기술된 것으로부터 선택된다.
프로토스페이서-인접 모티프(RAM)을 포함하는 gRNA 서열이 하기 표 1에 제공된다:
표 1. gRNA 서열
Figure pct00003
CRISPR/Cas9 플랫폼(유형 II CRISPR/Cas 시스템임) 외에도, 유형 I CRISPR/Cas 시스템, 유형 III CRISPR/Cas 시스템 및 유형 V CRISPR/Cas 시스템을 포함하는 대안적 시스템이 존재한다. 몇 가지 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9(StCas9), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9(CjCas9) 및 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea) Cas9(NcCas9)를 포함하는 다양한 CRISPR/Cas9 시스템이 개시되었다. Cas 시스템에 대한 대안은 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1(FnCpf1), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1(AsCpf1) 및 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 Cpf1(LbCpf1) 시스템을 포함한다. 상기 CRISPR 시스템 중 임의의 것이 본원에 개시된 세포주를 생성하는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 CRISPR 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 예를 들어, S. 피오게네스 CRISPR/Cas9 시스템일 수 있다.
E. 영양요구 인자
일부 구체예에서, 단일 유전자의 파괴는 원하는 영양요구성을 유발한다. 대안적 구체예에서, 다중 유전자의 파괴는 원하는 영양요구성을 생성한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 영양요구 인자를 생성하기 위한 경로의 상류에 있는 단백질을 포함하는 영양요구 인자를 생성하는 단백질을 인코딩하는 유전자이다.
본원에 기재된 일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자(및 상응하는 영양요구 인자는 우라실임) 또는 홀로카르복실라제 신세타제를 인코딩하는 유전자(및 상응하는 영양요구 인자는 비오틴임)이다. 일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 표 2의 하기 유전자로부터 선택된다. 표 2의 유전자는 사카로마이세스 유전체 데이터베이스(SGD)의 효모 표현형 온톨로지 데이터베이스로부터의 "화학(Chemical)" 데이터와 함께 다운로드된 "영양요구성(Auxotrophy)"으로 주석이 달린 표현형을 갖는 S. 세레비지에 유전자를 선택함으로써 대조되었다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Cherry et al. 2012, Nucleic Acids Res. 40:D700-D705] 참조). 이들 유전자는 YeastMine® 데이터베이스 또는, 대안적 구체예에서, 사카로마이세스 유전체 데이터베이스(SGD)를 사용하여 인간 동족체로 전환되었다. 유전자는 ENSEMBL 데이터베이스(www.ensembl.org)에서 발견되는 ENSEMBL 유전자 기호 및 ENSG 식별자로 확인된다. ENSG 식별자의 처음 5개의 0(예를 들어, ENSG00000)이 제거되었다.
표 2. 영양요구 유도성 유전자좌
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CCBL1은 또한 KYAT1으로 언급될 수 있다. CCBL2는 또한 KYAT3으로 언급될 수 있다. DHFRL1은 또한 DHFR2로 언급될 수 있다. PYCRL은 또한 PYCR3로 언급될 수 있다. HRSP12는 또한 RIDA로 언급될 수 있다.
영양요구 인자는 1개 또는 2개 또는 그 초과의 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 비-유기 분자, 비-필수 아미노산, 또는 변경된 농도의 모이어티(정상 생리학적 농도에 비함), 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에서 영양요구 인자에 대한 모든 언급은 다수의 인자의 투여를 고려한다. 임의의 인자는 대상체에게 독성이 없고, 변형된 숙주 세포의 성장 및 생식을 유지하기 위해 미처리된 대상체에서 생물학적으로 이용 가능하지 않거나 충분한 농도로 존재하지 않는 한 적합하다.
예를 들어, 영양요구 인자는 증식에 필요한 물질이거나 변형된 숙주 세포의 대사에서 보조인자로 기능하는 영양소일 수 있다. 다양한 영양요구 인자가 표 2에 개시되어 있다. 특정 구체예에서, 영양요구 인자는 비오틴, 알라닌, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 세린, 우리딘, 발린 및 콜레스테롤로부터 선택된다. 비타민 B7으로도 공지된 비오틴은 세포 성장에 필요하다. 일부 예에서, 발린은 조혈 줄기 세포의 증식 및 유지에 필요하다. 일부 예에서, 본원에 개시된 조성물은 발린 보충에 대한 필요성을 완화하고 이에 의해 발린이 변형되지 않은 세포에 비해 식이에서 제거되는 경우 이들 세포에 선택적 이점을 제공하는 HSC에서 효소를 발현시키는 데 사용된다.
A. 작제물의 삽입
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 표 2에 개시된 것들로부터 선택된 표적 유전자, 또는 그 유전자의 발현을 제어하는 영역 내에 있다. 일부 구체예에서, 표적 유전자는 UMPS(우리딘에 대한 영양요구성 세포주 생성) 및 홀로카르복실라제 신세타제(비오틴에 대한 영양요구성 세포주 생성)로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 영양요구 인자는 비오틴, 알라닌, 아스파르테이트, 아스파라긴, 글루타메이트, 세린, 우리딘 및 콜레스테롤로부터 선택된다.
본원에 기재된 세포를 생성하기 위해 상기 뉴클레아제 시스템을 사용하는 방법으로서, 세포에 (a) 영양요구 유도성 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 이를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제 시스템, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 예컨대 ZFN 또는 TALEN, 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR/Cas9의 성분, 및 (b) 본원에 기재된 바와 같은 작제물 또는 벡터를 도입시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 추가로 기재된다. 각각의 성분은 세포에 직접 도입될 수 있거나, 상기 하나 이상의 뉴클레아제 시스템의 성분을 인코딩하는 핵산을 도입함으로써 세포에서 발현될 수 있다. 상기 방법은 또한 제2 뉴클레아제 시스템, 예를 들어, 제2 유전자좌에서 DNA를 표적화하고 절단하는 제2 메가뉴클레아제 또는 제2 CRISPR/Cas 뉴클레아제, 또는 제2 유전자좌에서 DNA를 표적화하는 제2 가이드 RNA, 또는 상기 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산, 및 (b) 제2 작제물 또는 벡터를 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 제2 작제물 또는 벡터는 상이한 트랜스진 또는 동일한 트랜스진의 제2 복사체를 함유할 수 있으며, 이는 이후 상기 방법에 따라 제2 유전자좌에 통합될 것이다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 생체 외 숙주 세포에서 영양요구 유도성 유전자좌에 대한 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 함유하는 작제물의 통합을 표적화할 것이다.
상기 방법은 (a) 선택적으로 상기 세포를 확장한 후 또는 선택적으로 상기 세포를 확장하기 전에 작제물 또는 벡터를 세포에 도입하는 단계, 및 (b) 선택적으로 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 (a) Cas9 폴리펩티드 또는 상기 Cas9 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, (b) 영양요구 유도성 유전자좌에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산, 및 (c) 본원에 기재된 바와 같은 작제물 또는 벡터를 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는 변형된 포유동물 세포를 생성시키는 방법을 고려한다. 상기 방법은 또한 (a) 제2 영양요구 유도성 유전자좌에 특이적인 제2 가이드 RNA 및 (b) 제2 작제물 또는 벡터를 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 가이드 RNA는 키메라 RNA 또는 2개의 하이브리드화된 RNA일 수 있다.
임의의 이들 방법에서, 뉴클레아제는 영양요구 유도성 유전자좌 내에서 하나 이상의 단일 가닥 파괴, 또는 영양요구 유도성 유전자좌 내에서 이중 가닥 파괴를 생성시킬 수 있다. 이들 방법에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 상기 작제물 또는 벡터와의 상동성 재조합에 의해 변형되어 유전자좌에 작제물의 삽입을 발생시킨다.
상기 방법은 (c) 영양요구 유도성 유전자좌에 통합된 트랜스진을 함유하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택 단계는 (i) 생존을 위해 영양요구 인자를 필요로 하는 세포를 선택하고, 선택적으로 (ii) 영양요구 유도성 유전자좌에 통합된 트랜스진을 포함하는 세포를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자좌는 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자이고, 세포는 이들을 5-FOA와 접촉시킴으로써 선택된다. UMPS 유전자는 5-FOA를 5-FUMP로 대사하는데 필요하며, 이는 RNA/DNA로의 이의 혼입으로 인해 세포에 대해 독성이다. 따라서, UMPS 유전자가 파괴된 세포는 5-FOA 처리에서 생존할 것이다. 모든 세포가 트랜스진을 함유할 수 있는 것은 아니지만, 결과로서 발생되는 세포는 모두 영양요구성일 것이다. 트랜스진에 대한 후속 양성 선택은 영양요구성이고 트랜스진을 또한 발현할 수 있는 변형된 숙주 세포만 분리할 것이다.
일부 구체예에서, 본 개시내용은 (a) 세포의 푸울(pool)을 획득하는 단계, (b) 뉴클레아제를 사용하여 예를 들어, 유전자를 넉아웃시키거나 이의 발현을 하향조절함으로써 영양요구 유도성 유전자좌에 작제물을 도입하는 단계, 및 (c) 영양요구성에 대해 스크리닝하는 단계, 및 (d) 트랜스진의 존재에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 변형된 인간 숙주 세포를 생성시키는 방법을 제공한다.
스크리닝 단계는 표 2에 개시된 영양요구 인자 중 하나와 함께 또는 없이 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다.
기능성 또는 치료 인자, 항체 및 세포 표면 수용체를 발현할 수 있는 큰 트랜스진을 포함하여 트랜스진을 포함하는 작제물의 삽입을 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Bak and Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18; 20(3): 750-756(EGFR의 통합); Kanojia et al., Stem Cells. 2015 Oct;33(10):2985-94(항-Her2 항체의 발현); Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117(CAR의 부위 특이적 통합); O'Connell et al., 2010 PLoS ONE 5(8): e12009(인간 IL-7의 발현); Tuszynski et al., Nat Med. 2005 May;11(5):551-5(섬유모세포에서의 NGF의 발현); Sessa et al., Lancet. 2016 Jul 30;388(10043):476-87(MLD를 치료하기 위한 생체 외 유전자 요법에서의 아릴설파타제 A의 발현); Rocca et al., Science Translational Medicine 25 Oct 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347(프라탁신의 발현); Bak and Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Issue 3, 18 July 2017, Pages 750-756(단일 유전자좌로의 큰 트랜스진 카세트 통합), Dever et al., Nature 17 November 2016: 539, 384-389(변형된 세포를 선택하고 농축시키기 위한 조혈 줄기 세포(HSC) 및 HSPC로 tNGFR 첨가)] 참조).
B. 유전자 발현 조절
일부 예에서, 트랜스진은 유전자의 내인성 프로모터, 또는 이종성 항시성 또는 유도성 프로모터, 인핸서, 조직-특이적 프로모터, 또는 전사 후 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 제어 서열에 선택적으로 연결된다. 예를 들어, 트랜스진 발현을 유도하기 위해 조직-특이적 프로모터(전사 표적화)를 사용하거나, 특정 조직에서의 발현을 피하기 위해(전사 후 표적화) RNA에 조절 서열(마이크로RNA(miRNA) 표적 부위)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 발현 제어 서열은 정상 개체에서와 동일한 발현 패턴(생리학적 발현)에 따라 치료 트랜스진을 발현하는 기능을 한다(프로모터 및 조절 서열에 대한 참조를 위해 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Toscano et al., Gene Therapy (2011) 18, 117-127 (2011)] 참조).
항시성 포유동물 프로모터는 다음 유전자에 대한 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스페라제(HPTR), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, α-액틴 프로모터 및 기타 항시성 프로모터. 진핵생물 세포에서 항시적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는, 예를 들어, 원숭이 바이러스, 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스로부터의 프로모터, 몰로니 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복(LTR), 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터/인핸서, EF1a(신장 인자 1a), SV40(원숭이 바이러스 40), 닭 β-액틴 및 CAG(CMV, 닭 β-액틴, 토끼 β-글로빈), 유비퀴틴 C 및 PGK를 포함하는 일반적으로 사용되는 프로모터는 모두 대부분의 세포 유형에서 항시적으로 활성인 높은 수준의 유전자 발현을 제공한다. 다른 항시성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
유도성 프로모터는 유도제의 존재하에서 활성화된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재하에서 전사 및 번역을 증가시키기 위해 활성화된다. 다른 유도성 프로모터는 알콜-조절, 테트라사이클린-조절, 스테로이드-조절, 금속-조절, 영양소-조절 프로모터, 및 온도-조절 프로모터를 포함한다.
특정 구체예에서, 프로모터는 조직-특이적이다. 예를 들어, 프로모터는 세포의 관련 조직으로의 분화에 의해 활성화될 수 있다. 간-특이적 표적화의 경우, 천연 및 키메라 프로모터 및 인핸서는 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 통합되어 간세포에 대한 인자 VIIa, 인자 VIII 또는 인자 IX의 발현을 표적화하였다. 알부민 및 인간 α1 항트립신(hAAT)과 같은 간-특이적 유전자로부터의 프로모터 영역은 천연 프로모터의 좋은 예이다. 대안적으로, 키메라 프로모터는 특이성 및/또는 벡터 효율을 증가시키기 위해 개발되었다. 좋은 예는 간-특이적 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 조합의 4개의 복사체를 갖는 (ApoE)4/hAAT 키메라 프로모터/인핸서 및 hAAT 프로모터의 1개의 복사체 및 α(1)-마이크로글로불린 인핸서의 2개의 복사체로 구성되는 DC172 키메라 프로모터이다.
근육-특이적 표적화의 경우: 천연(크레아틴 키나제 프로모터-MCK, 데스민) 및 합성(α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7)) 프로모터가 효율적이고 특이적인 근육 발현을 달성하기 위해 바이러스 및 비-바이러스 벡터에 포함되었다.
내피-특이적 표적화의 경우, 천연(vWF, FLT-1 및 ICAM-2) 및 합성 프로모터 둘 모두가 내피 특이적 발현을 유도하기 위해 사용되었다.
골수 세포 표적화의 경우, 과립구 분화 동안 고도로 발현되는 골수 전사 인자 CAAT 상자 인핸서-결합 패밀리 단백질(C/EBP) 및 PU.1에 대한 결합 부위를 함유하는 합성 키메라 프로모터가 주로 골수 세포에서 트랜스진 발현을 지시하는 것으로 보고되었다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Santilli et al., Mol Ther. 2011 Jan;19(1):122-32] 참조). CD68은 골수성 표적화에도 사용될 수 있다.
유전적 질병의 유전자 요법을 위한 조직-특이적 프로모터 및 벡터의 예는 표 3에 제시된다.
표 3. 조직-특이적 프로모터
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 구체예에서, 본원에 기술된 작제물의 트랜스진 발현을 조절하는데 사용하기 위한 프로모터는 T reg 유사 세포에 특이적인 프로모터를 포함한다. 안정한 T reg 세포 집단의 발현 프로파일은 파세리니(Passerini) 등에 의해 기술되었으며, 이들은 FOXP3 발현을 도입함으로써 통상적인 CD4+ T 세포가 완전히 기능성인 T reg-유사 세포로 전환될 수 있음을 보여주었다. (그 기재내용은 그 전체가 본원에 인용으로 포함하는 문헌 [Passerini, Laura, et al. "CD4+ T cells from IPEX patients convert into functional and stable regulatory T cells by FOXP3 gene transfer." Science translational medicine 5.215 (2013): 215ra174-215ra174] 참조). 따라서, 일부 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 작제물은 예를 들어, FOXP3 프로모터를 사용하여 FOXP3 (ENSG00000049768)의 발현 제어 서열에 의해 조절될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 작제물의 트랜스진 발현을 조절하는 데 사용하기 위한 프로모터는 세포 순수성-관련 프로모터(예를 들어, CD45RA/RO[ENSG00000081237] 또는 CCR7[ENSG00000126353])에 특이적인 프로모터를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 작제물은 CD45 수용체 A 또는 O, 또는 CCR7의 발현 제어 서열 또는 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
유전적 질병의 유전자 요법을 위한 생리학적으로 조절된 프로모터 및 벡터의 예는 표 4에 제시된다.
표 4. 생리학적으로 조절된 벡터
Figure pct00010
조직-특이적 및/또는 생리학적 조절 발현은 또한 트랜스진의 mRNA 안정성 및/또는 번역 효율(전사 후 표적화)을 변형시킴으로써 추구될 수 있다. 대안적으로, 발현된 mRNA로의 miRNA 표적 인지 부위(miRT)의 통합은 특정 조직 또는 세포 유형에서 트랜스진 발현(탈표적화)을 차단하기 위해 내인성 숙주 세포 조직(machinery)을 동원하는 데 사용되었다. miRNA는 miRT로 언급되는 특정 mRNA의 3' UTR 영역에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 약 22개의 뉴클레오티드인 비코딩 RNA이다. 특정 miRT에 대한 miRNA의 결합은 번역 감쇠/불활성화 및/또는 분해를 촉진한다. miRNA를 통한 발현의 조절은 각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Geisler and Fechner, World J Exp Med. 2016 May 20, 6(2): 37-54; Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009 Aug, 10(8):578-85; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 Nov, 80(5):393-403]에 기재되어 있다. 특정 miRNA 세포 유형에 의해 인지되는 miRT-벡터를 조작하는 것은 원하지 않는 세포 유형에서 치료 유전자의 발현을 넉다운하기 위한 효과적인 방식인 것으로 나타났다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Toscano et al., 상기] 참조).
넉아웃 영양요구 유도성 유전자를 발현하여 세포 분화 또는 플라스미드 형질도입시 영양요구성을 구제하는 트랜스진은 조건부 탈안정화 도메인으로 태깅될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 탈안정화 도메인은 이의 펩티드, 단백질 또는 분획을 나타내며, 이는 관련되는 유전자 생성물에 탈안정화 특성을 부여한다. 탈안정화 도메인은 공지되어 있다(예를 들어, 그 기재내용이 전체로 본원에 인용으로서 포함되는 WO 2018/160993 참조). WO 2018/160993에 기술된 바와 같이, 조건부 탈안정화 도메인은 자극 또는 리간드의 존재 또는 부재에 기초하여 연관된 유전자 생성물의 안정성 또는 불안정성을 유도하기 위해 활성화될 수 있다. 현재 맥락에서, 탈안정화 도메인은 예를 들어, 재발현된 유전자를 제공하는 트랜스진의 통합 및 발현 시 탈안정화 도메인이 유전자에 부착되도록 재발현된 영양요구 유도성 유전자에 유전적으로 첨부될 수 있다. 유전자 및 탈안정화 도메인 조합은 시험관내 선택 과정 동안 "안정적"으로 유지될 것인데, 여기에서 전구체 또는 형질도입되지 않은 세포는 예를 들어, 탈안정화 도메인에 안정성 신호를 부여하는 리간드를 제공함으로써 제거된다. 그 후, 조합은 환자에의 도입 시 또는 그 전에 리간드를 제거함으로써 불안정하게 하고, 이에 의해 세포를 다시 영양요구성이 되게 할 수 있다. 이는 추가적인 기능성 안전 스위치의 추가 이점을 제공하며, 이에 의해 본원에 기재된 영양요구 선택 방법을 사용하여 생성된 세포는 일부 경우에 재발현되는 영양요구 유도성 유전자를 조건부로 탈안정화시키고, 다른 경우에는 재발현되는 영양요구 유도성 유전자를 안정화시킬 수 있다. 자가-절단 리보뉴클레오티드 요소인 리보자임은 영양요구 유도성 유전자를 인코딩하는 트랜스진의 RNA 전사의 자가-파괴를 촉발하기 위해 리보자임을 인코딩함으로써 유사하게 작용하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 영양요구 유도성 유전자는 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치 중 적어도 하나에 의해 조건부로 만들어질 수 있다.
III. 본 개시내용의 방법
A. 단일 영양요구성 시스템
본 개시내용은 분화된 세포 집단을 생성하기 위해 본원에 기재된 작제물을 사용하는 방법을 제공한다. 제공된 방법은 특정 세포 유형의 순수 및/또는 농축된 집단을 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 세포 유형의 순수하고 농축된 집단을 생성하는 것은 치료 및 진단 응용 분야에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 분화된 전구 세포로부터 유래된 글루코스 반응성 성숙 베타 세포의 순수하거나 농축된 집단은 당뇨병 치료에 유용할 수 있다.
기재된 방법에 의해 생성된 분화된 세포는 전구 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 전구 세포는 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 골아세포 및 심근세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 세포에서 재조합 또는 상동성 재조합을 유도하기 위해 복수의 전구 세포를 뉴클레아제 시스템과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, CRISPR/Cas는 상동성 재조합을 유도하기 위해 배치된 뉴클레아제 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 영양요구 유도성 유전자의 프로모터의 불필요한 부분을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비필수 부분"은 뉴클레아제에 의해 파괴될 때 및/또는 트랜스진 삽입에 의해 중단될 때 프로모터가 전사를 포함하는 내인성 세포 자극 및 다른 인자에 반응성 및 기능성을 유지하는 유전자의 프로모터 부분을 나타낸다. 뉴클레아제 시스템이 영양요구 유도성 유전자의 프로모터의 비필수 부분을 표적화하면, 작제물이 세포의 유전체 내로 삽입되도록 작제물은 뉴클레아제에 의해 표적화된 부위에서 상동성 재조합을 유도하도록 삽입될 수 있다. 작제물은 이중대립유전자적으로 삽입될 수 있어 동형 넉-인 세포를 생성시킬 수 있다. 상동성 재조합에 대해 표적화될 수 있는 영양요구성 유발 유전자좌는 표 2에 제공된다. (예를 들어, 이중대립유전자적으로) 삽입된 작제물은 조직-특이적 프로모터의 전부 또는 일부 및 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는 유전작의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 생성된 세포는 영양요구 유도성 유전자좌에 상응하는 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 될 것이다.
세포는 영양요구 인자와 접촉함으로써 증식될 수 있다. 영양요구 유도성 유전자 또는 이의 일부를 발현하는 트랜스진 작제물을 갖는 세포만이 영양요구 인자의 제거에서 생존할 것이다. 뉴클레아제 및/또는 재조합 단계의 실패로 인해 영양요구성이 되지 않은 집단의 세포가 일부 구체예에서 생존할 것이다. 영양요구 유도성 유전자좌가 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)를 인코딩하는 유전자인 구체예에서, 세포는 이들을 5-FOA와 접촉시킴으로써 선택될 수 있다. UMPS 유전자는 5-FOA를 5-FUMP로 대사하는 데 필요하며, 이는 RNA/DNA로의 이의 통합으로 인해 세포에 대해 독성이다. 따라서, UMPS 유전자가 파괴된 세포는 5-FOA 처리에서 생존할 것이다. 모든 세포가 트랜스진을 함유하는 것은 아니지만, 생성된 세포는 모두 영양요구성일 것이다. 트랜스진에 대한 후속 양성 선택은 영양요구성이고 트랜스진을 또한 발현할 수 있는 변형된 숙주 세포만 분리할 것이다.
본원에 기재된 방법은 조직-특이적 프로모터와 관련된 조직으로의 전구 세포의 분화를 자극하는 데 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 트랜스진 작제물은 원하는 분화된 세포 또는 조직 유형에서 특이적으로 발현되는 내인성 조직-특이적 인자에 의해 조절될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에 기재된 작제물은 요망되는 세포 운명, 세포 유형 또는 조직 유형으로의 세포 분화에 반응하여 발현된다. 이러한 방식으로, 방법은 예를 들어 요망되는 세포 유형으로 분화된 시험관내 분화된 세포 집단을 선택하는 데 사용될 수 있다. 분화된 세포 집단을 생성하기 위해 본원에 기재된 작제물을 사용하는 방법은 영양요구 인자를 제거함으로써 분화된 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 트랜스진의 조직-특이적 프로모터는 UMPS 유전자 또는 다른 영양요구 유도성 유전자 표적에 대한 프로모터를 대체한다.
일부 구체예에서, 트랜스진이 삽입된 작제물은 치료 인자 또는 치료 인자를 인코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 치료 인자는 표적화된 영양요구 유도성 유전자 또는 이의 일부를 갖는 카세트로서 발현될 수 있다. 치료 인자를 포함하는 작제물의 발현은 예를 들어, 2개 이상의 발현된 성분 사이에 링커를 갖는 폴리시스트론 작제물을 생성함으로써 최적화될 수 있으며, 여기서 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열( P2A) 등이다. 예시적인 링커 서열은 SEQ ID NO: 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 제공된다.
일부 구체예에서 재발현된 영양요구 유도성 유전자 또는 다른 트랜스진의 발현은 EF1a(SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 32)와 같은 진핵생물 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 바이시스트론 또는 멀티시스트론 작제물은 기재된 바와 같이 링커로 작제물의 발현된 성분을 분리하거나 SEQ ID NO: 33의 것과 같은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 제조될 수 있다.
종결 및 폴리아데닐화 신호 서열을 사용하여 본원에 기재된 트랜스진 작제물로부터 생성된 전사체를 종결 및 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 전사는 SEQ ID NO: 39 또는 40의 것과 같은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리-아데닐화 신호 서열을 사용하여 종결되고 안정화된다.
표적화된 영양요구 유도성 유전자좌에서 상동성 재조합을 지시하기 위해, 영양요구 유도성 유전자좌의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 작제물의 일부는 내인성 서열에 상보적인 상동성 아암으로 작용하여 하이브리드화하고 상동성 재조합을 개시할 것이다. 일부 구체예에서, 표적화된 영양요구 유도성 유전자좌에서 지시된 상동성 재조합은 유전자의 발현이 중단되지 않도록 작제물을 영양요구 유도성 유전자좌에 삽입하는 것을 수반한다. 예를 들어, 영양요구 유도성 유전자의 프로모터의 비필수적인 부분을 표적화하는 상동성 재조합 작제물은 영양요구 유도성 유전자와 함께 프레임 내 삽입될 수 있고, 그 결과 예를 들어, 조직-특이적 프로모터를 포함하는 작제물의 삽입이 이루어지는데, 영양요구 유도성 유전자의 오픈 리딩 프레임은 그대로 유지한다.
본원에 기술된 방법은 특정 조직으로 분화된 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 조직은 지방 조직, 부신, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 면역 세포이고, 면역 세포는, 예를 들어 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포로 분화될 수 있다.
본원에 기술된 작제물 및 방법에 사용될 수 있는 조직-특이적 프로모터는 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서; CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE-조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE-조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 작제물은 조건부 탈안정화 도메인으로 발현된 유전자 생성물을 태깅하거나 작제물의 전사된 메시지에 리보자임 스위치를 삽입하여, 유전자 생성물의 조건부 탈안정화 또는 RNA 메시지의 파괴를 유도한다.
본원에 기재된 분화된 세포 집단을 선택하는 방법의 일부 구체예는 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위를 인코딩하는 DNA 서열을 영양요구 유도성 유전자에 넉-인시키도록 설계된 작제물과 전구 세포를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 영양요구 유도성 유전자에 넉인(knocked-into)되는 miRNA 표적 부위는 영양요구 유도성 유전자에 상응하는 영양요구 인자에 대해 전구 세포가 영양요구성이 되도록 한다(예를 들어, 표 2 참조). 비-전구 세포 운명으로의 전구 세포의 분화는 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA가 더 이상 발현되지 않도록 함으로써 영양요구 유도성 유전자의 miRNA 매개 억제를 완화하고 영양요구 인자의 제거시 세포의 생존을 가능하게 한다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 선택된 분화된 세포 집단은 요망되는 세포 유형의 정제되거나 농축된 집단일 수 있다. 분화된 세포는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 세포 유형이 필요한 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 설명된 바와 같은 분화된 면역 세포는 면역요법을 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 투여될 수 있거나, 설명된 바와 같은 분화된 성숙 베타 세포는 인슐린 장애가 있는 환자를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 따라서, 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하고; 조직-특이적 유전자좌에 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 작제물을 삽입하는 방법이 본원에 제공되며, 여기에서 조직-특이적 유전자의 발현은 중단되지 않으며, 이에 의해 조직-특이적 유전자좌와 관련된 조직으로의 전구 세포의 분화시 영양요구 인자 또는 재발현된 영양요구 유도성 유전자를 생성한다. 전구 세포는 예를 들어, iPSC 또는 배아 줄기 세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 내에 도입된 영양요구 유도성 유전자 또는 다른 유전자 작제물은 플라스미드 통합을 통해 또는 에피솜 발현을 통해 이루어질 수 있다. 선택적 증식 및 분화를 위한 세포 내로 본원에 기재된 작제물의 도입은 예를 들어 DNA 플라스미드, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 또는 나노입자 전달 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
B. 영양요구성 분할 시스템
본원에 기재된 방법을 사용하여 영양요구성이된 세포 및 세포 집단은 생체내 또는 시험관내에서 적어도 2개의 구별되는 방법에 의해 유지될 수 있다(즉, 생존가능 및/또는 증식 상태로 유지될 수 있다): 1) 영양요구 인자를 세포에 제공함으로써; 또는 2) 세포 내에서 넉아웃되거나 하향조절된 영양요구 유전자를 발현시켜 영양요구성을 구제함으로써. 예를 들어, 본원에 기술된 UMPS -/- 세포의 경우, 세포는 우리딘을 제공하거나 UMPS 트랜스진을 발현함으로써 (즉, UMPS 재발현) 유지될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 영양요구 유전자의 재발현은 영양요구 인자가 제거되거나 철회될 때 세포 집단에서 성공적으로 형질감염된 세포의 선택을 허용한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조직-특이적 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열의 조절하에 영양요구 유전자의 재발현을 배치하는 것은 성공적으로 형질감염된 세포의 선택을 가능하게 하고 추가로 원하는 분화된 세포 집단(즉, 선택된 조직-특이적 프로모터(들)에 대해 특이적인 인자(들)를 발현하는 세포)의 선택을 가능하게 한다. 본원에 기재된 방법의 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 적어도 하나의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 2개 이상의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 3개 이상의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 4개 이상의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 5개 이상의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포는 6개 이상의 조직-특이적 인자의 발현에 의해 표시된다. 원하는 분화된 세포에 대한 선택의 특이성은 하나 초과의 조직-특이적 인자를 선택함으로써 증가될 수 있다. 즉, 원하는 분화된 세포 집단을 나타내는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 조직-특이적 인자를 발현하는 세포만을 세포 집단으로부터 선택하면 선택 방법의 특이성이 향상되며, 원하는 분화된 세포의 선별된 집단의 순도를 증가시킨다.
일부 구체예에서, 원하는 분화된 세포 집단을 나타내는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 조직-특이적 인자를 발현하는 세포만을 세포 집단으로부터 선택하는 것은 영양요구 유전자를 2개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌, 3개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌, 4개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌, 5개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌 또는 6개 이상의 영양요구 유도성 유전자좌에 전달(즉, 영양요구 유전자를 재발현)하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 초과의 재발현된 영양요구 유전자를 갖는 하나 초과의 영양요구 유도성 유전자좌를 대체하거나 파괴하는 것은 바람직하지 않거나 유익하지 않지만, 요망되는 분화된 세포 집단을 나타내는 하나 초과의 조직-특이적 인자를 선택하는 것은 여전히 바람직하다. 이러한 상황에서, 하나 초과의 독립적인 기능성 도메인 또는 서브유닛을 갖는 영양요구 유전자는 "영양요구성 분할"을 도입하고 원하는 분화된 세포 집단을 나타내는 하나 초과의 조직-특이적 인자에 대한 선택을 가능하게 하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 영양요구 유전자는 제1의 독립적인 기능성 도메인 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 가질 수 있다. 영양요구 유전자의 재발현은 영양요구 유전자를 전체 기능성 유전자로 발현함으로써 달성될 수 있거나, 제1 발현 제어 서열의 제어 하의 제1의 독립적인 기능성 도메인 및 제2 발현 제어 서열의 제어 하의 제2의 독립적인 기능성 도메인으로 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인의 발현을 분할함으로써 달성될 수 있다. 제1의 독립적인 기능성 도메인은 제1 유전자좌에 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 제2 유전자좌에 전달될 수 있다. 제1 유전자좌는 영양요구 유도성 유전자좌일 수 있다. 제2 유전자좌는 예를 들어, CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 일부 구체예에서, CCR5 유전자좌는 CCR5 상동성 아암을 사용하여 표적화되며, 여기서 상동성 아암은 좌측 및 우측 상동성 아암으로 정의된다. 예시적인 CCR5 좌측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 11로 정의된다. 대안적인 CCR5 좌측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 제공된다. 예시적인 CCR5 우측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 12로 정의된다. 대안적인 CCR5 우측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 15로 제공된다. 대안적으로, 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인 둘 모두는 예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12의 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 사용하여 CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌로 전달될 수 있다.
CCR5에 대한 좌측 및 우측 상동성 아암은 표적 CCR5 유전자좌에 대해 높은 수준의 재현 가능한 표적화를 보장하기 위해 각 측면(좌측 및 우측)에서 적어도 200 bp, 이상적으로는 400 bp의 상기 유전자좌에 대한 상동성을 가져야 한다. 본원에 기재된 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암(즉, SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14 및 15)은 단지 예로서 제공된다. 효과적인 상동성 아암은 표적 유전자좌 위치에 대해 작제물의 좌측(5')을 표적화시키는 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500 또는 약 600개의 뉴클레오티드, 및 표적 유전자좌 위치에 대해 작제물의 우측(3')을 표적화시키는 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500 또는 약 600개의 뉴클레오티드를 사용하여 CCR5 유전자좌를 표적화하도록 설계될 수 있다. 임의의 다른 비-CCR5 유전자좌는 유사한 방식으로 상동성 재조합을 위해 표적화될 수 있다.
제1 발현 제어 서열은 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제1 전사 인자에 의해 조절되는 제1 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 마찬가지로, 제2 발현 제어 서열은 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제2 전사 인자에 의해 조절되는 제2 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 방식으로, 단일의 영양요구 유도성 유전자보다는 더 많이 넉아웃시키거나 하향조절할 필요 없이 원하는 분화된 세포 집단의 특이성을 개선하기 위해 다중 조직-특이적 인자가 선택될 수 있다. 따라서, 이러한 조작된 세포의 영양요구성은 "분할"이라고 불리는데, 이는 영양요구성 인자의 제거 또는 철회에서 살아남기 위해 영양요구 유전자의 독립적인 기능성 도메인 각각의 재발현을 필요로 한다. 이는 다중 트랜스진 통합을 선택하기 위해 하나의 영양요구 인자의 사용을 허용한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 인간 UMPS(ENSG00000114491)이고 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(오로트산 포스포리보실트랜스페라제 또는 OPRT)를 포함하고 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(OMPdecase 또는 ODC)를 포함한다. 인간 UMPS에서 OPRT와 ODC는 동일한 유전자 내에서 별도의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 반면, 두 도메인은 다른 유기체에서 별도의 유전자에 의해 발현된다. 따라서, 인간 UMPS-/- 세포에서, UMPS 활성은 UMPS cDNA의 재발현(예를 들어, SEQ ID NO: 1 는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열 사용) 또는 OPRT 활성(예를 들어, SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열 사용) 및 ODC 활성(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열 사용)의 개별 발현에 의해 대체될 수 있다. 우리딘의 부재 하에, 인간 UMPS -/- 세포는 OPRT 및 ODC 활성의 발현 없이는 생존할 수 없으며, 이는 세포의 유지 및 생존을 위해 OPRT 및 ODC 활성 둘 모두를 발현하는 트랜스진 둘 모두가 존재해야 하는 조건을 확립한다. 이 예에서 OPRT 및 ODC 독립적인 기능성 도메인을 별도의 발현 제어 서열의 제어 하에 두는 것은 원하는 분화된 세포 집단을 선택하기 위해 하나 초과의 계통 특이적 유전자를 사용할 수 있게 한다. 예를 들어, OPRT는 제1 유전자좌에 전달될 수 있고, ODC는 제2 유전자좌에 전달될 수 있다. 제1 유전자좌는 영양요구 유도성 유전자좌일 수 있다. 제2 유전자좌는 예를 들어, CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 유전자좌는 CCR5 상동성 아암을 사용하여 표적화되며, 여기서 상동성 아암은 좌측 및 우측 상동성 아암으로 정의된다. 예시적인 CCR5 좌측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 11로 정의된다. 예시적인 CCR5 우측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 12로 정의된다. 대안적으로, OPRT 및 ODC 둘 모두는 예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12의 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 사용하여 CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌에 전달될 수 있다. OPRT는 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제1 전사 인자에 의해 조절되는 제1 발현 제어 서열의 발현 제어 하에 있을 수 있다. 마찬가지로, ODC는 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제2 전사 인자에 의해 조절되는 제2 발현 제어 서열의 발현 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, OPRT 및 ODC 서열은 이들의 각각의 제1 및 제2 발현 제어 서열에 독립적으로 연결된다.
일부 구체예에서, 영양요구 유전자는 인간 CAD(카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제)(ENSG00000084774)이다. 인간 CAD는 피리미딘 생합성 경로에서 처음 3가지 효소 활성을 나타내는 3개의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 단백질을 인코딩한다. 영양요구 유전자가 인간 CAD인 일부 구체예에서, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다. 우리딘의 부재하에 CAD 활성이 억제된 인간 세포는 생존하지 않을 것이며(그 내용이 전체가 인용으로 포함되는 문헌 [Swyryd, Elizabeth A., Sally S. Seaver, and George R. Stark. "N-(phosphonacetyl)-L-aspartate, a potent transition state analog inhibitor of aspartate transcarbamylase, blocks proliferation of mammalian cells in culture." Journal of Biological Chemistry 249.21 (1974): 6945-6950] 참조), 이는 세포의 유지 및 생존을 위해 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제 각각을 발현하는 트랜스진이 존재한다는 조건을 확립시킨다. 이 예에서, 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제 독립적인 기능성 도메인을 별도의 발현 제어 서열의 제어 하에 두는 것은 원하는 분화된 세포 집단을 선택하기 위해 더 많은 3개의 계통 특이적 유전자를 사용할 수 있게 한다. 예를 들어, 카르바모일-포스페이트 신세타제 2는 제1 유전자좌로 전달될 수 있고, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제는 제2 유전자좌로 전달될 수 있으며, 디하이드로오로타제는 제3 유전자좌로 전달될 수 있다. 제1 유전자좌는 영양요구 유도성 유전자좌일 수 있다. 제2 및/또는 제3 유전자좌는 예를 들어, CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌일 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 유전자좌는 CCR5 상동성 아암을 사용하여 표적화되며, 여기서 상동성 아암은 좌측 및 우측 상동성 아암으로 정의된다. 예시적인 CCR5 좌측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 12로 정의된다. 예시적인 CCR5 우측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 11로 정의된다. 대안적으로, 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제는 각각 개별적으로 예를 들어, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12의 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 사용하여 CCR5와 같은 세이프 하버 유전자좌로 각각 전달될 수 있다. 카르바모일-포스페이트 신세타제 2는 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제1 전사 인자에 의해 조절되는 제1 발현 제어 서열의 발현 제어 하에 있을 수 있다. 마찬가지로, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제는 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제2 전사 인자에 의해 조절되는 제2 발현 제어 서열의 발현 제어 하에 있을 수 있다. 디하이드로오로타제는 예를 들어, 원하는 분화된 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 제3 전사 인자에 의해 조절되는 제3 발현 제어 서열의 발현 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제 서열은 이들의 각각의 제1, 제2 및 제3 발현 제어 서열에 독립적으로 연결된다.
하나 초과의 다중-도메인 영양요구 유전자의 넉아웃 또는 하향조절이 본원에서 추가로 고려된다. 예를 들어, 세포 집단에서 UMPS 및 CAD 유전자 둘 모두의 기능의 넉아웃 또는 넉다운은 세포 집단에서 5가지 상이한 유전자 변형, 예를 들어 트랜스진 삽입에 대한 선택을 가능하게 할 것이다. 영양요구 인자로서 우리딘의 부재하에, UMPS 및 CAD 유전자 둘 모두가 결여된 세포는 각각 독립적인 기능성 도메인 OPRT, ODC, 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제의 효소 활성을 필요로 할 것이며, 이는 5개의 독립적인 기능성 도메인 각각을 독립적으로 재발현할 수 있는 5개의 상이한 유전자 조작 또는 트랜스진 삽입의 선택을 가능하게 한다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 초과의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유전자는 세포 불린(Boolean) 스위치의 설계에 통합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 불린 스위치는 하나 이상의 입력에 기초하여 논리 연산을 수행하도록 설계되고 출력을 생성하는 회로를 지칭한다. 불린 스위치에 의해 수행되는 논리 연산에는 AND, OR, NOR, NAND, NOT, IMPLY, NIMPLY, XOR 및 XNOR가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, OR은 임의의 하나 이상의 입력이 출력을 생성하는 데 필요한 시나리오를 나타내며; AND는 모든 입력이 출력을 생성하는 데 필요한 시나리오를 나타내며; NOT 게이트는 입력을 반전시키는 기능을 하는 인버터이다. 여러 논리 연산으로 구성된 복합 불린 스위치가 또한 생성될 수 있다. 간단한 AND 게이트 불린 스위치의 예는 OPRT를 발현하는 제1 트랜스진 및 ODC를 발현하는 제2 트랜스진을 통합한 인간 UMPS-/- 세포를 포함할 수 있어, 세포에서 OPRT 활성 AND ODC 활성 둘 모두가 존재하면 우리딘 부재하의 세포 생존율 출력을 발생시킨다. 일부 구체예에서, 영양요구 인자의 제공 OR 제1의 독립적인 기능성 도메인 AND 제2의 독립적인 기능성 도메인의 재발현은 세포 출력을 생성하기 위해 하나 이상의 논리적 조건의 충족을 필요로 하는 복합 불린 스위치를 포함한다. 하나 이상의 불린 스위치(AND, OR, NOR, NAND, NOT, IMPLY, NIMPLY, XOR 및 XNOR)에 만족스러운 논리적 조건은 예를 들어, 영양요구 인자의 존재/부재, 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인의 존재/부재, 하나 이상의 조직-특이적 인자의 존재/부재, 및/또는 하나 이상의 영양요구 인자, 독립적인 기능성 도메인 또는 조직-특이적 인자의 존재/부재의 농도/상대적 수준/기간을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 영양요구 유도성 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 전구 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 분화된 세포 집단을 생성하는 방법을 포함한다. 이중대립유전자 표적화는 예를 들어, 오픈 리딩 프레임 또는 조절 서열을 방해하거나 단백질 또는 뉴클레오티드 억제 또는 분해를 위한 표적 서열을 도입함으로써 영양요구 유도성 유전자를 넉아웃 또는 넉다운시킬 수 있다. 영양요구 유도성 유전자가 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 구체예에서, 유전자의 넉아웃 또는 넉다운은 각각의 독립적 기능 도메인에 대해 전구 세포가 영양요구성이 되게 한다. 전구 세포에서 영양요구성이 유도될 때, 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물은 세포 내로 도입될 수 있으며, 제1 상동성 재조합 작제물은 제1 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제1의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 제2 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제2의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 전구 세포는 영양요구 인자의 존재 하에 성장할 수 있으며, 세포의 분화가 자극되어 제1 및 제2 조직-특이적 프로모터를 발현하는 분화된 세포(예를 들어, 세포 유형 또는 조직)를 생성할 수 있으며, 그 결과 제1 및 제2 상동성 재조합 작제물이 분화된 세포에서 발현되게 한다. 이러한 방식으로 영양요구 인자의 제거는 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인이 결여된 세포를 제거하고, 기능적으로 통합된 두 도메인 모두를 갖는 세포를 선택한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 2개 이상의 독립적인 기능성 도메인, 예를 들어, 3, 4, 또는 5개의 독립적인 기능성 도메인, 또는 5개 초과의 독립적인 기능성 도메인을 가지며, 영양요구성 세포에서 각각의 독립적인 기능성 도메인을 재발현하는 것은 영양요구성을 완화하는 데 필요하며, 이에 의해 요망되는 분화 세포 유형 또는 조직에서 발현된 다양한 조직-특이적 프로모터의 조절 하에 있는 다양한 독립적인 기능성 도메인을 발현하는 2, 3, 4, 5개 이상의 상동성 재조합 작제물로 세포를 변형시킴으로써 2, 3, 4, 5개 이상의 조직-특이적 프로모터를 발현하는 세포의 선택을 가능하게 한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
방법은 세포를 5-FOA와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 세이프 하버 유전자좌, 예를 들어 CCR5에 삽입될 수 있다. 일부 구체예에서, CCR5 유전자좌는 상동성 아암을 사용하여 표적화될 수 있으며, 여기서 상동성 아암은 좌측 및 우측 상동성 아암으로 정의된다. 예시적인 CCR5 좌측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 11로 정의된다. 예시적인 CCR5 우측 상동성 아암은 SEQ ID NO: 12로 정의된다.
영양요구 인자는 우리딘일 수 있다.
일부 구체예에서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 치료 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 예를 들어 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 코딩 서열 및 치료 인자를 인코딩하는 코딩 서열을 분리하는 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 갖는 폴리시스트론일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 예시적인 전구 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포 및 심근세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 분화된 세포 유형 또는 조직의 예는 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 및 혈관을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 분화된 세포는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 조직-특이적 프로모터의 예는 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서; CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE-조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE-조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상은 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 변형된 세포의 영양요구성은 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 메신저 RNA의 분해를 위한 조건 또는 독립적인 기능성 도메인의 탈안정화를 위한 조건을 촉발함으로써 추가로 조절될 수 있다. 조건은 예를 들어, 탈안정화 도메인을 안정화시키는 리간드가 존재하는 조건, 또는 리간드가 부재하여 독립적인 기능성 도메인의 탈안정화 및 분해를 유도하는 조건일 수 있다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포의 분화된 세포 집단은 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 치료 인자를 보유하는 면역 세포이고, 대상체는 치료 인자를 필요로 하거나 필요로 하는 것으로 의심된다.
영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하는 단계로서, 유전자는 적어도 제1의 독립적인 기능성 도메인 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 단계, 및 제1의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제1 작제물을 영양요구성 전구 세포의 유전체 내 제1 조직-특이적 유전자좌에 삽입하는 단계, 및 제2의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제2 작제물을 제2 조직-특이적 유전자좌에 삽입하는 단계를 포함하는, 영양요구성을 완화시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 유전자좌에서 조직-특이적 유전자의 발현은 방해받지 않는다. 따라서, 영양요구성은 이에 의해 전구 세포가 제1 및 제2 유전자좌에서 제1 및 제2 조직-특이적 유전자를 발현하는 세포 유형 또는 조직으로 분화될 때 완화된다.
2개 초과의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 이용이 고려된다. 예를 들어, 영양요구 유도성 유전자는 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인을 포함할 수 있어 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인 각각의 재발현은 영양요구성을 완화시키는데 필요하다. 각각의 독립적인 기능성 도메인이 각각의 조직-특이적 유전자좌에서 영양요구성 전구 세포의 유전체에 삽입되는 경우, 통합된 각각의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 제1, 제2, 제3, 제4 및/또는 제5 조직-특이적 유전자좌 각각에 상응하는 조직-특이적 프로모터를 발현하는 세포만이 영양요구 인자의 제거에서 살아남을 것이다.
일부 구체예에서, 전구 세포는 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)이다.
영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)일 수 있으며, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)일 수 있고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
작제물 중 하나 이상은 예를 들어, 치료 인자를 추가로 인코딩하고 작제물(들)의 시스트론의 발현을 조절하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 추가로 포함하는 폴리시스트론일 수 있다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 유전자좌는 인슐린 유전자좌이다.
일부 구체예에서, 분화된 세포는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다.
일부 구체예에서, 조직-특이적 유전자는 삽입 단계 동안 대체되지 않는다.
일부 구체예에서, 분화된 세포는 인슐린을 생성한다.
작제물 중 하나 이상은 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
또한, 적어도 2개의 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 방법은 복수의 세포에 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운을 제공하여 복수의 세포에서 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 것을 포함할 수 있다. 세포는 영양요구 인자를 제공하는 배지에서 성장할 수 있으며, 제1 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전달 시스템, 및 제2 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전달 시스템으로 형질감염될 수 있다. 영양요구 인자가 결여된 배지로의 배지 교체시, 제1 및 제2 외인성 유전자 둘 모두를 기능적으로 통합하지 않은 세포는 영양요구성을 유지할 것이며, 배양물에서 지속되지 않을 것이며, 이에 의해 제1 및 제2 전달 시스템을 기능적으로 통합된 세포를 선택한다.
설명된 방법은 각각의 독립적인 기능성 도메인의 재발현이 변형된 세포에서 영양요구성을 완화시키는데 필요하도록 추가의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 영양요구 유도성 유전자, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 독립적인 기능성 도메인을 갖는 영양요구 유도성 유전자의 사용을 추가로 고려한다.
방법은 영양요구 유도성 유전자의 각 기능성 도메인에 상응하는 전달 시스템으로 복수의 세포를 형질감염시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 각 전달 시스템은 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전달 시스템 중 하나 이상은 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 나노입자일 수 있다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함한다.
일부 구체예에서, 영양요구 유도성 유전자는 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함한다.
성숙한 베타 세포의 선택 방법
또한, 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 것을 포함하는 성숙한 인간 베타 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 방법은 비-CRISPR-기반 방법론을 사용하여 인간 UMPS 유전자를 넉다운 또는 다르게는 넉아웃시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 제1 상동성 재조합 작제물은 인슐린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(ENSG00000254647, 또는 이의 일부) 또는 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 인슐린 의존적 발현 제어 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 Nkx6.1-의존적 발현 제어 서열 또는 Nkx6.1(ENSG00000163623, 또는 이의 일부)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 인슐린 및 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 세포에서만 발현된다. 비-상동성 재조합-기반 트랜스진 삽입이 또한 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 고려된다. 세포는 재조합 작제물이 세포 내로 도입될 때까지 그리고 그 이후까지 우리딘의 존재 하에 성장할 수 있다. 우리딘의 존재하에, 세포는 예를 들어, 각각의 개시내용이 그 전체가 본원에 인용으로 통합되는 문헌 [Ma, Haiting, et al. "Establishment of human pluripotent stem cell-derived pancreatic β-like cells in the mouse pancreas." Proceedings of the National Academy of Sciences 115.15 (2018): 3924-3929; Pagliuca, Felicia W., et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro." Cell 159.2 (2014): 428-439; and/or Rezania, Alireza, et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells." Nature biotechnology 32.11 (2014): 1121]에 기술된 방법을 사용하여 성숙한 베타 세포로 자극될 수 있다. 방법은 우리딘을 제거함으로써 인슐린과 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 성숙한 베타 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 상황에서 우리딘 철수 또는 제거는 인슐린과 Nkx6.1을 모두 발현하지 않는 세포의 증식 또는 생존을 억제할 것이다.
일부 구체예에서, 독립적인 기능성 도메인 트랜스진(들)이 삽입된 영양요구성 분할 작제물 중 하나 이상은 치료 인자 또는 치료 인자를 인코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 치료 인자는 표적화된 영양요구 유도성 유전자 또는 이의 일부를 갖는 카세트로서 발현될 수 있다. 치료 인자를 포함하는 작제물의 발현은 예를 들어, 2개 이상의 발현된 성분 사이에 링커를 갖는 폴리시스트론 작제물을 생성함으로써 최적화될 수 있으며, 여기서 링커는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A) 등이다. 예시적인 링커 서열은 SEQ ID NO: 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 제공된다.
일부 구체예에서 재발현된 영양요구 유도성 유전자(들)(이의 독립적인 기능성 도메인) 또는 다른 트랜스진의 발현은 EF1a(SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 32)와 같은 진핵생물 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 바이시스트론 또는 멀티시스트론 작제물은 기재된 바와 같이 링커로 작제물의 발현된 성분을 분리하거나 SEQ ID NO: 33의 것과 같은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 제조될 수 있다.
종결 및 폴리아데닐화 신호 서열을 사용하여 본원에 기재된 작제물로부터 생성된 전사체를 종결 및 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 전사는 SEQ ID NO: 39 또는 40의 것과 같은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리-아데닐화 신호 서열을 사용하여 종결되고 안정화된다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 유형 1 당뇨병을 완화하는데 유용하다. 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 성숙한 인간 베타 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
시험관내 분화된 전구 세포의 집단으로부터 선택된 성숙한 인간 베타 세포 또한 제공된다. 성숙한 인간 베타 세포는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립 유전자 변형을 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시킬 수 있다. 성숙한 인간 베타 세포는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 또는 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인을 추가로 포함할 수 있어, 세포는 영양요구 인자의 제거시 트랜스진의 성공적인 통합후 생존할 수 있다. 일부 구체예에서, 성숙한 인간 베타 세포는 영양요구 유도성 유전자 UMPS의 유전자 조작을 갖는다. 따라서, 영양요구 인자는 우리딘일 수 있으며, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택될 수 있으며, 하나 이상의 트랜스진은 인슐린 또는 인슐린-의존적 발현 조절 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 Nkx6.1 또는 Nkx6.1-의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. OPRT 및 ODC 독립적인 기능성 도메인이 각각 경우에 따라 인슐린 및 Nkx6.1의 발현에 작동 가능하게 연결된 경우, 인슐린과 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 세포는 또한 OPRT 및 ODC를 발현할 것이며, 영양요구 유도성 유전자를 효과적으로 재발현시켜, 배양 배지에서 우리딘을 제거한 후에도 생존 가능한 채 유지된다.
분화된 거핵구의 선택 방법
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 조작된 거핵구 및/또는 조작된 혈소판을 생성하는데 유용하다. 조작된 거핵구 및/또는 조작된 혈소판은 페이로드, 예를 들어, 관심 단백질을 발현할 수 있으며, 이는 치료학적 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 선택 방법에 따라 조작되고 생성된 거핵구는 페이로드를 발현할 수 있으며, 이는 후속적으로 거핵구로부터 생성된 혈소판으로 로딩된다. 유사하게는, 본원에 기재된 선택 방법에 따라 조작되고 생성된 혈소판은 예를 들어, 페이로드의 치료학적 효과를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 치료 페이로드로 로딩될 수 있다.
일부 구체예에서, 조작된 거핵구 및/또는 조작된 혈소판은 제1 페이로드 및 제2 페이로드를 발현한다. 제1 및/또는 제2 페이로드(들)는 치료학적, 예를 들어 치료 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 선택 방법에 따라 조작되고 생성된 거핵구는 제1 및/또는 제2 페이로드를 발현할 수 있으며, 이는 후속적으로 거핵구로부터 생성된 혈소판으로 로딩된다. 유사하게는, 본원에 기재된 선택 방법에 따라 조작되고 생성된 혈소판은 예를 들어, 페이로드(들)의 치료 효과를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 제1 및/또는 제2 치료 페이로드(들)로 로딩될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 페이로드는 예를 들어, 내용 그 전체가 본원에 인용으로 포함되는 문헌 [Du, Lily M., et al. "Platelet-targeted gene therapy with human factor VIII establishes haemostasis in dogs with haemophilia A." Nature communications 4.1 (2013): 1-11]에 기술된 바와 같은 혈우병을 위한 치료제로서 인자 VIII를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 페이로드는 예를 들어, 내용이 그 전체가 본원에 인용으로 포함되는 문헌 [Zhang, Xudong, et al. "Engineering PD-1-presenting platelets for cancer immunotherapy." Nano letters 18.9 (2018): 5716-5725]에 기술된 바와 같이 PD-L1-발현 종양 세포에 대한 조작된 혈소판을 표적화하는 PD-1 또는 항-PD-L1을 포함할 수 있다.
거핵구-특이적 프로모터의 사용은 거핵구 및/또는 혈소판에서 페이로드(들)의 세포-유형-특이적 발현을 허용한다. 거핵구-특이적 프로모터의 예는 예를 들어, 인간 PGK, Pf4, GP1BA, GP6 또는 GP9 프로모터(예를 들어, 그 전체가 인용으로 본원에 포함된 문헌 [Latorre-Rey, L. J., et al. "Targeting expression to megakaryocytes and platelets by lineage-specific lentiviral vectors." Journal of Thrombosis and Haemostasis 15.2 (2017): 341-355]참조) 뿐만 아니라 CD68L 프로모터, 당단백질 Ibα 프로모터 및 인테그린 αIIb 프로모터를 포함한다(표 3 및 4 참조).
본원에 제공된 선택 방법은 조작된 거핵구 및 혈소판 집단의 정제 및/또는 농축을 가능하게 한다. 예를 들어, 도 1은 PS 세포-유래된 조작된 거핵구에서 사용하기 위한 발현 벡터를 최적화하기 위해 영양요구 분할 선택을 사용하는 예시적인 과정의 개략도를 보여준다. 만능성 줄기("PS") 세포와 같은 전구 세포는 예를 들어, CRISPR-기반 또는 다른 유전자 조작 시스템을 사용하여 UMPS 넉아웃("KO UMPS")이 되도록 조작된다. UMPS 넉아웃 세포는 생존 및 성장을 촉진하기 위해 우리딘에서 배양되며, 공여체 벡터/발현 작제물을 예를 들어, 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 CCR5에 삽입하기 위해 상동성 재조합(HR) 공여체 벡터(또한, 제1 및 제2 발현 작제물로서 본원에 언급됨), 가이드 RNA("gRNA") 및 Cas9로 형질감염, 예를 들어, 전기천공되어 생존 및/또는 성장을 위한 우리딘을 필요로 하는 이중 녹-인(KI) 세포를 생성한다. HR 공여체 벡터/발현 작제물은 거핵구-특이적 프로모터에 의해 구동되는 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 거핵구-특이적 프로모터에 의해 구동되는 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함한다(도 1에서 각각 "페이로드1" 및 "페이로드2"로서 도 1에 묘사됨, 각각 "프로모터"에 의해 구동됨). HR 공여체 벡터/발현 작제물은 각각 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인 및 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 제2 발현 카세트를 함유하여, UMPS는 거핵구-특이적 프로모터의 발현을 유도하기에 충분한 조건 하에 이중 KI를 보유하는 세포에서 페이로드1 및 페이로드2와 함께 기능적으로 재발현될 수 있다. UMPS 독립적인 기능성 도메인은 예를 들어, UMPS 독립적인 기능성 도메인이 항시적으로 발현되도록 EF1a와 같은 항시적 포유동물 프로모터의 전사 조절 제어 하에 있을 수 있다. HR 공여체 벡터/발현 작제물(즉, 페이로드1, 페이로드2, UMPS 제1의 독립적인 기능성 도메인 및/또는 UMPS 제2의 독립적인 기능성 도메인)로부터 발현된 폴리펩티드의 기능성이 평가될 수 있다. HR 공여체 벡터/발현 작제물로부터 발현된 폴리펩티드의 기능을 평가하는 예는 공여체 벡터/발현 작제물에 상응하는 DNA를 검출하거나(예를 들어, PCR), 공여체 벡터 전사에 상응하는 RNA를 검출하거나(예를 들어, rtPCR), 공여체 벡터 발현에 상응하는 단백질을 검출하거나(예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역세포학, 세포 분류 등), 공여체 벡터의 기능적 발현의 증거에 대한 세포 형태 및/또는 기능을 분석하는 것을 포함한다. 그 후, 최적화된 발현 카세트(예를 들어, 페이로드1 단독, 페이로드2 단독 또는 페이로드1과 페이로드 2)가 생성될 수 있으며, 조직-특이적 프로모터, 예를 들어 거핵구-특이적 프로모터의 제어 하에 페이로드를 안정하게 발현하는 세포주의 생성에 사용될 수 있다.
추가로, 도 2는 시험관내에서 거핵구(MK)로 분화된 UMPS 넉아웃(KO) 만능성 줄기(PS) 세포로부터 생체내 적용을 위한 혈소판을 생성하기 위해 우리딘 영양요구성 기반 선택 방법을 사용하는 예시적인 과정의 개략도를 보여준다. 도 2에 묘사된 예시적인 과정의 일 구체예에서, 유핵 및/또는 증식 세포(예를 들어, 잔류 PS 세포 및/또는 증식성 거핵구)는 우리딘이 배양 조건으로부터 제거될 경우 분화 후 치사되거나 증식에 실패한다. 거핵구로부터 생성된 혈소판은 배양 중에 지속된다. 혈소판은 생체 내 적용의 하류에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 증식 세포가 없거나 실질적으로 없는 실질적으로 순수한 혈소판 집단을 생성한다. 대상체에 투여시, 거핵구에 의해 생성된 혈소판은 기능을 유지하는 반면, 임의의 잔류 PS 또는 거핵구 또는 다른 유핵 또는 증식성 세포는 우리딘에 대한 이들의 영양요구성으로 인해 생체내 치사되거나 증식 실패한다. 일부 구체예에서, 생체내 내인성 우리딘 수준은 대상체에 투여 후 임의의 잔류 PS 또는 거핵구 또는 다른 유핵 또는 증식성 세포의 생존력을 유지하기에 불충분하다. 일부 구체예에서, 세포의 영양요구 성질은 단지 비핵화된 비증식성의 혈소판만이 지속되도록 허용한다.
도 3은 만능성 줄기(PS) 세포로부터 시험관내 조작된 혈소판을 생성하기 위해 영양요구 분할을 이용하는 또 다른 구체예의 개략도를 보여준다. 만능성 줄기("PS") 세포는 예를 들어, CRISPR-기반 또는 다른 유전자 조작 시스템을 사용하여 UMPS 넉아웃("KO UMPS")이 되도록 조작된다. UMPS 넉아웃 세포는 생존 및 성장을 촉진하기 위해 우리딘에서 배양되며, 공여체 벡터를 예를 들어, 세이프 하버 유전자좌, 예컨대 CCR5에 삽입하기 위해 상동성 재조합(HR) 공여체 벡터(예를 들어, 발현 작제물), 가이드 RNA("gRNA") 및 Cas9로 형질감염시켜, 예를 들어, 전기천공시켜 생존 및/또는 성장을 위해 우리딘을 필요로 하는 이중 녹-인(KI) 세포를 생성한다. 제1 HR 공여체 벡터/발현 작제물은 거핵구-특이적 프로모터에 의해 구동되는 제1 페이로드("페이로드1")를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다. 제2 HR 공여체 벡터/발현 작제물은 거핵구-특이적 프로모터("프로모터")에 의해 구동되는 제2 페이로드("페이로드2")를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 제3 발현 카세트 및 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 발현 카세트를 포함하여, UMPS는 거핵구 특이적 프로모터의 발현을 구동하기에 충분한 조건하에서 이중 KI를 보유하는 세포에서 제1 및 제2 페이로드와 함께 기능적으로 재발현될 수 있다. 일부 구체예에서, UMPS 독립적인 기능성 도메인은 예를 들어, UMPS 독립적인 기능성 도메인이 항시적으로 발현되도록 EF1a와 같은 항시적 포유동물 프로모터의 전사 조절 제어 하에 있을 수 있다. 이중 넉-인 세포는 이중 넉-인 세포의 생존을 보장하기 위해 우리딘의 존재하에 시험관 내에서 거핵구(MK)로 분화된다. UMPS 발현, 예를 들어 OPRT 및 ODC 독립적인 기능성 도메인의 발현은 분화된 세포에서 손실된다. 5-FOA 선택은 잔류 만능성 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 거핵구에 의해 생성된 혈소판은 발현된 페이로드 폴리펩티드로 로딩된다. 일부 구체예에서, 거핵구에 의해 생성된 혈소판은 우리딘 제거 후에도 지속되는 반면, 임의의 잔류 PS 세포 또는 거핵구와 같은 유핵 또는 증식 세포는 우리딘 제거 후 치사되거나 증식에 실패한다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성되고 선택된 거핵구는 조작된 거핵구일 수 있다. 조작된 거핵구는 예를 들어, 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 페이로드는 예를 들어, 치료학적 RNA, 예컨대 안티센스 RNA, siRNA, 앱타퍼, 마이크로RNA 모방체/항-miR 및 합성 mRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 페이로드는 예를 들어, 페이로드 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 페이로드 폴리펩티드 서열은 예를 들어, 생체내 전달될 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 기능적으로 성숙한 혈소판의 실질적으로 순수한 집단을 생성할 수 있다. 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 유핵 및/또는 증식 세포가 없거나 실질적으로 없을 수 있다. 본 개시내용에 따른 실질적으로 순수한 혈소판 집단은 대상체에 투여될 수 있다. 대상체에의 투여 시, 임의의 잔여 증식성 및/또는 유핵 세포, 예컨대 잔여 비분화된 세포, 잔여 전구체/만능성 줄기 세포, 또는 유핵 또는 증식을 유지하는 잔여 거핵구는 기능성 UMPS 또는 기타 영양요구 유도성 유전자의 결여로 인해 생체내에서 치사될 것이다. 일부 구체예에서, 우리딘 또는 기타 영양요구 인자의 생체내 내인성 수준은 우리딘 또는 다른 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되도록 조작된 세포를 유지하기에 불충분하다. 따라서, 본 설명의 방법에 따라 생성된 세포 집단의 투여는 실행불가능하며, 대상체에 투여시 생존할 수 없고/거나 증식할 수 없다.
C. 치료 방법
질병, 장애 또는 질환의 치료를 위해 본 개시내용에 기재된 세포의 용도가 또한 포함된다.
특정 구체예는 암, 파킨슨병, 이식편대숙주병(GvHD), 자가면역 질환, 과다증식성 장애 또는 질환, 악성 형질전환, 간 질환, 유전된 유전자 결함을 포함하는 유전병, 소아 발병 당뇨병 및 안구 구획 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 질병, 장애 또는 질환은 근육계, 골격계, 순환계, 신경계, 림프계, 호흡기 내분비계, 소화계, 배설계 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택되는 신체의 적어도 하나의 계통에 영향을 미친다. 대상체에서 하나 초과의 세포 유형에 영향을 미치는 질환은 상이한 영양요구 인자에 의해 활성화된 각 세포주와 함께 본 개시내용에 기재된 세포의 하나 초과의 구체예로 치료될 수 있다.
특정 구체예는 세포주를 재생성으로 제공한다. 본 개시내용의 양태에서, 대상체는 하나 초과의 세포 및/또는 하나 이상의 영양요구 인자와 접촉될 수 있다. 특정 구체예는 영양요구 인자, 예를 들어 영양소 또는 효소의 국소 방출을 제공한다. 대안적인 구체예는 전신 전달을 제공한다. 예를 들어, 국소화된 방출은 생체적합성 장치의 사용을 통해 영향을 받는다. 본 개시내용의 양태에서, 생체적합성 장치는 대상체에서 세포주의 확산을 제한할 수 있다. 방법의 특정 구체예는 대상체에서 변형된 숙주 세포의 치료 효과를 고갈시키거나 변형된 숙주 세포에서 세포 치사를 유도하기 위해 영양요구 인자를 제거하는 것을 제공한다. 본 방법의 특정 구체예는 분자 트래피킹, 세포 치사 유도, 세포 치사 및 추가 세포 동원으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 치료 효과를 제공한다. 본 방법의 특정 구체예는 비변형된 숙주 세포가 변형된 숙주 세포로 대상체를 처리하기 전에 동일한 대상체로부터 유래된다는 것을 제공한다.
본 개시내용은 선택적으로 용기 또는 바이알에, 상기 조성물 또는 이러한 조성물의 성분을 포함하는 키트를 고려한다.
본원에 기술된 방법은 특정 조직으로 분화된 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 조직은 지방 조직, 부신, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 면역 세포이고, 면역 세포는 예를 들어 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포로 분화될 수 있다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포의 분화된 세포 집단은 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 분화된 세포는 치료 인자를 수반하는 면역 세포이고, 대상체는 치료 인자를 필요로 하거나 필요로 하는 것으로 의심된다.
예로서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 유형 1 당뇨병을 완화시키는 데 유용하다. 상기 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 성숙한 인간 베타 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
D. 약물 스크리닝 방법
치료 방법에 추가하여, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 분화된 세포 집단은 시험관내 약물 스크리닝에 유용할 수 있다. 분화된 세포 집단을 제조하기 위한 공지된 방법은 전구 세포를 원하는 분화된 세포 또는 조직 유형으로 분화시키는 부적절한 방법 및/또는 전구 세포 집단으로부터 분화된 세포를 선택하는 부적절한 방법에 의해 방해를 받는다. (예를 들어, 개시내용이 그 전체가 본원에 인용으로 포함되는 문헌 [Goversen, Birgit, et al. "The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1." Pharmacology & therapeutics 183 (2018): 127-136] 참조) 따라서, 시험관내 분화된 전구 세포 집단으로부터 분화된 세포 집단을 선택하는 방법은 시험관내 약물 스크리닝 방법론의 효율성 및 효능을 개선하는 데 사용될 수 있다. 후보 약물 또는 약물 라이브러리는 효능, 내약성, 독성, 투여량, 생체이용률, 흡수, 반감기, 분자 상호작용, 부작용, 대사 효과, 유전자 효과, 생리학적 효과, 전기생리학적 효과, 또는 관심 세포 유형에의 약물 노출의 기타 결과를 결정하기 위해 분화된 세포 집단에 적용될 수 있다. 일 구체예에서, 예를 들어, 후보 약물(들) 또는 약물 라이브러리는 특정화된 세포 아형에서 약물 결과를 결정하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하기 위해 분화되고 선택된 iPSC-유래된 심근세포 또는 심근세포 하위집단에 투여될 수 있다. 예를 들어, 설명된 분화 방법은 이 하위집단에서 약물의 시험관내 테스트를 위해 심실 심근세포로 추가 분화될 수 있는 첫 번째 심장장 계통 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 분화 방법을 사용하여 이 하위집단에서 시험관내 약물 시험을 위해 결절 심근세포로 추가로 분화될 수 있는 심장외 계통 세포를 선택할 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 분화 방법을 사용하여 이 하위집단에서 시험관내 약물 시험을 위해 심방 심근세포로 추가로 분화될 수 있는 두 번째 심장장 계통 세포를 선택할 수 있다. 또 다른 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 분화 방법은 이러한 하위집단에서 시험관내 약물 시험을 위한 것일 수 있는 내피 세포를 선택하는데 사용될 수 있다.
IV. 약학적 조성물
일부 구체예에서, 변형된 세포의 사용을 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 개시되며, 여기에는 변형된 세포의 성장 및 생식을 조절(증가, 감소 또는 중단)하고 트랜스진에 의한 치료 인자의 발현을 제어하기 위한 영양요구 인자의 약학적 조성물, 치료 방법 및 투여 방법이 포함된다. 추가로, 본원에 기재된 방법, 조성물 및 키트는 또한 형질감염된 세포의 선택 및 분화된 세포 집단의 생성을 위해 사용될 수 있다.
변형된 포유동물 숙주 세포는 영양요구 인자와 별도로 또는 영양요구 인자와 조합하여 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 제공된 약학적 조성물의 설명은 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 동물에 투여하기에 적합하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유동물, 예를 들어, 상업적으로 관련된 포유동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 래트, 조류, 예를 들어, 상업적으로 관련된 조류, 예를 들어, 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상체에 투여된다.
일부 예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 (i) 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도 및 니치(niche) 환경이 대상체에 존재하지 않도록 영양소, 효소, 변경된 pH, 변경된 온도, 모이어티의 변경된 농도 및/또는 니치(niche) 환경에 대해 영양요구성인 세포주를 생성시키고; (ii) 대상체를 단계 (i)의 생성된 영양요구 세포주와 접촉시키고; (iii) 영양요구 인자가 영양요구 시스템 또는 요소를 활성화시켜 대상체에 대해 세포주의 성장 및/또는 하나 이상의 치료적 실체의 발현을 발생시키도록 (ii)의 대상체와 영양소, 효소, pH 및/또는 온도를 변경시키는 모이어티, 및 대상체의 세포 니치 환경으로부터 선택되는 영양요구 인자를 접촉시키는 것을 포함하는 대상체의 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법에서 사용된다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 또한 (a) 본 개시내용에 따른 변형된 숙주 세포를 대상체에 투여하고, (b) 변형된 숙주 세포의 성장을 촉진하기에 충분한 양으로 영양요구 인자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
영양소 영양요구 인자를 포함하는 조성물은 또한 본 개시내용의 변형된 세포를 포함하는 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있다.
줄기 세포를 포함하는 현재의 많은 약학적 조성물은 환자에게 암을 유발할 가능성이 있으며; 따라서 세포 집단은 분화되어야 한다. 본원에 기재된 방법은 환자에게 투여하기 위한 임의의 줄기 세포를 함유하지 않은 순수하게 분화된 세포 집단을 제공한다.
V. 제형
변형된 숙주 세포는 치료 인자를 인코딩하는 트랜스진을 갖는 작제물을 영양요구 유도성 유전자좌에 삽입하도록 유전자 조작된다. 원하는 유전자좌를 표적화하는 Cas9 단백질/gRNA 리보핵단백질 복합체(Cas9 RNP)의 전달은 리포솜 매개 형질감염, 전기천공 또는 핵 국소화에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 전기천공 후 혈청 함유 배지와 접촉된다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 전기천공 후 감소된 혈청을 함유하거나 혈청을 함유하지 않는 배지와 접촉된다.
본 개시내용의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 (1) 안정성을 증가시키고/시키거나; (2) 생체분포(예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 세포주 표적화)를 변경시키고/시키거나; (3) 인코딩된 치료 인자의 방출 프로파일을 변경시키고/시키거나; (4) 영양요구 인자의 흡수를 개선시키기 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 개시내용의 제형은 염수, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 펩티드, 단백질 및 이들의 조합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 약학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 나타낸다. 본 발명의 개시내용의 약학적 조성물은 멸균 약학적 조성물일 수 있다.
일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "활성 성분"은 일반적으로 (a) 영양요구 유도성 유전자좌에 삽입된 치료 인자를 발현할 수 있는 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포 또는 작제물, 또는 (b) 상응하는 영양요구 인자, 또는 (c) 영양요구 유도성 유전자좌 내의 절단을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템을 나타낸다.
본원에 기재된 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자 및 약학적 조성물의 제형은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 분화된 세포 집단은 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 개시에 따른 약학적 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조되고/되거나, 패키징되고/되거나, 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양을 나타낸다.
본 발명의 개시에 따른 약학적 조성물 중 활성 성분(예를 들어, 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자), 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및/또는 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 99%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들어, 0.5 내지 50%, 1 내지 30%, 5 내지 80%, 또는 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
A. 부형제 및 희석제
일부 구체예에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 구체예에서, 부형제는 인간 용도 및 수의학적 용도로 승인된 것이다. 일부 구체예에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인될 수 있다. 일부 구체예에서, 부형제는 약학적 등급일 수 있다. 일부 구체예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족할 수 있다.
본원에서 사용되는 부형제는 원하는 특정 투여 형태에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006] 참조). 임의의 통상적인 부형제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 유해한 방식으로 약학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 상호작용하는 것과 같이 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는 통상적인 부형제 매질의 사용이 본 발명의 개시내용의 범위 내에서 고려될 수 있다.
예시적인 희석제는 칼슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 설탕 등, 및/또는 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
B. 비활성 성분
일부 구체예에서, 제형은 적어도 하나의 비활성 성분을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비활성 성분"은 제형에 포함된 약학적 조성물의 활성 성분의 활성에 기여하지 않는 하나 이상의 제제를 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용의 제형에서 사용될 수 있는 비활성 성분의 전부 또는 일부는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인될 수 있거나, 비활성 성분은 FDA에 의해 승인되지 않을 수 있다.
C. 약학적으로 허용되는 염
영양요구 인자는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환(예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴에 의함)시켜 변형되도록 하는 개시된 화합물의 유도체를 나타낸다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대표적 산 부가염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실 설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발러레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 본 발명의 개시내용의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다.
VI. 투약 및 투여
상기 기재된 약학적 조성물에 포함된 본 발명의 개시내용의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 임의의 전달 경로, 전신 전달 또는 국소 전달에 의해 투여될 수 있으며, 이는 치료적으로 효과적인 결과를 발생시킨다. 이들은 장내(장으로), 위장, 경막외(경질막으로), 경구(입을 통해), 경피, 뇌내(대뇌로), 뇌실내(뇌실로), 표피(피부 상의 적용), 피내(피부 자체로), 피하(피부 아래), 비강 투여(코를 통해), 정맥내(정맥으로), 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 동맥내(동맥으로), 근육내(근육으로), 심장내(심장으로), 골내 주입(골수로), 수막강내(척주관으로), 실질내(뇌 조직으로), 복강내(복막으로의 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(눈을 통해), 해면내 주사(병리 강으로), 강내(음경의 기저로), 질내 투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피(전신 분포를 위해 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 경질, 흡입법(코흡입), 설하, 구순하, 관장, 점안액(결막 위) 또는 귀물약, 귀(귀에 또는 귀를 통해), 협측(뺨쪽으로 향함), 결막, 피부, 치아(치아 또는 치아들로), 전기삼투, 자궁경내막, 부비동내, 기관내, 체외, 혈액투석, 침윤, 사이질, 복강내, 양막내, 관절내, 담도내, 기관지내, 활액낭내, 연골내(연골 내), 미추내(말총 내), 수조내(소뇌연수조 내), 각막내(각막 내), 덴탈 인트라코르날(dental intracornal), 관상동맥내(관상동맥 내), 해면체내(음경의 음경해면체의 확장 가능한 공간 내), 층판내(디스크 내), 관내(샘의 관 내), 십이지장내(십이지장 내), 경막내(경막 내 또는 아래), 표피내(표피로), 식도내(식도로), 위내(위 내), 치은내(치은 내), 회장내(소장의 원위 부분 내), 병변내(국소 병변 내 또는 직접 도입), 관내(관의 내강 내), 림프내(림프 내), 척수내(뼈의 골수강 내), 수막내(수막 내), 심근내(심근 내), 안구내(안구 내), 난소내(난소 내), 심낭내(심낭막 내), 흉강내(흉막 내), 전립선내(전립선 내), 폐내(폐 또는 이의 기관지 내), 부비동내(비강 또는 안와주위 부비동 내), 척주내(척주 내), 활액내(관절의 활액강 내), 건내(건 내), 고환내(고환 내), 수막강내(임의의 수준의 뇌척수 축에서 뇌척수액 내), 흉곽내(흉곽 내), 세뇨관내(장기의 세뇨관 내), 종양내(종양 내), 고실내(중이 내), 혈관내(혈관 또는 혈관들 내), 심실내(심실 내), 이온삼투요법(용해성 염의 이온이 신체 조직으로 이동하는 전류에 의함), 관류(개방 상처 또는 체강을 씻거나 플러싱함), 후두(후두에 직접), 비위(코를 통해 위까지), 폐쇄 드레싱 기술(국소 경로 투여 후 해당 부위를 막는 드레싱으로 덮음), 안구(외부 눈에), 입인두(입 및 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경질막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기(국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강으로 흡입함에 의한 기도 내), 눈뒤(교뇌 뒤 또는 안구 뒤), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 경태반(태반을 통하거나 가로지름), 경기관(기관 벽을 통함), 경고실(고실을 가로지르거나 통함), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미추 차단, 진단, 신경 차단, 담도 관류, 심장 관류, 광분반술, 및 척추를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
A. 비경구 및 주사 투여
일부 구체예에서, 본원에 기재된 세포는 비경구로 투여될 수 있다.
주사용 제조물, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제조물은, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 및/또는 용매 중의 멸균 주사 용액, 현탁액 및/또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 용매 또는 현탁 매질로서 멸균 고정유가 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 부드러운 고정유가 사용될 수 있다. 주사제의 제조에서 지방산, 예를 들어, 올레산이 사용될 수 있다.
주사용 제형은, 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과 및/또는 사용 전에 멸균수 또는 기타 멸균 주사용 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균제를 혼입시킴에 의해 멸균될 수 있다.
활성 성분의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 활성 성분의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이는 불량한 수 용해도를 갖는 결정성 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 활성 성분의 흡수 속도는 용해 속도에 좌우되며, 이는 차례로 결정 크기 및 결정 형태에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여되는 약물 형태의 지연 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다. 주사 가능한 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생물분해성 중합체에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성시킴으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생물분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(언하이드라이드)를 포함한다. 데포 주사 가능 제형은 약물을 신체 조직과 양립되는 리포솜 또는 마이크로에멀젼에 포획하여 제조된다.
B. 데포 투여
본원에 기재된 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 발명의 개시내용의 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 연장된 방출을 위해 데포에서 제형화된다. 일반적으로, 특정 기관 또는 조직("표적 조직")이 투여를 위해 표적화된다. 일부 구체예에서, 국소화된 방출은 생체적합성 장치의 사용을 통해 영향을 받는다. 예를 들어, 생체적합성 장치는 대상체에서 세포주의 확산을 제한할 수 있다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본 발명의 개시내용의 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 표적 조직 내에 또는 그 부근에서 공간적으로 보유된다. 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물이 표적 조직에서 실질적으로 유지되도록(이는 조성물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 초과가 표적 조직에 유지됨을 의미함) 하는 조건하에서 표적 조직(하나 이상의 표적 세포를 포함함)과 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 접촉시킴으로써 포유동물 대상체의 표적 조직에 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 대상체에 투여되는 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과는 투여 후 일정 기간 동안 존재한다.
본 발명의 개시내용의 특정 양태는 표적 조직을 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물이 상기 표적 조직에서 실질적으로 유지되도록 하는 조건하에서 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물과 접촉시킴으로써 포유동물 대상체의 표적 조직에 본 발명의 개시내용의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 관심 효과가 적어도 하나의 표적 세포에서 생성되도록 하는 충분한 활성 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 세포 침투제를 포함하지만, 약학적으로 허용되는 부형제를 갖거나 갖지 않는 "네이키드" 제형(예를 들어, 세포 침투제 또는 다른 제제가 없음)이 또한 고려된다.
C. 용량 및 요법
본 발명의 개시는 본 발명의 개시에 따른 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 세포 또는 영양요구 인자를 포함하는 약학적 조성물 및 본 발명의 개시내용의 조성물은 질병, 장애 및/또는 질환을 예방하거나, 치료하거나, 관리하거나, 진단하는 데 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 대상체에 투여될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 및 전반적 상태, 질병의 중증도, 특정 조성물, 이의 투여 방식, 이의 활성 방식 등에 따라 대상체마다 다양할 것이다. 대상체는 인간, 포유동물 또는 동물일 수 있다. 임의의 특정 개체에 대한 특정 치료적 유효, 예방적 유효 또는 적절한 진단 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 페이로드의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이; 영양요구 인자의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자와 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 좌우될 것이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 세포 또는 영양요구 인자 약학적 조성물은 원하는 치료적, 진단적 또는 예방적 효과를 획득하기 위해 하루에 1회 이상 하루에 대상체 체중 기준으로 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.005 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg를 전달하기에 충분한 투여량 수준으로 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 세포 또는 영양요구 인자 약학적 조성물은 약 10 내지 약 600 μl/부위, 50 내지 약 500 μl/부위, 100 내지 약 400 μl/부위, 120 내지 약 300 μl/부위, 140 내지 약 200 μl/부위, 약 160 μl/부위로 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자는 50 μl/부위 및/또는 150 μl/부위로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자의 원하는 투여량은 단지 1회, 하루에 3회, 하루에 2회, 하루에 1회, 격일, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다 또는 4주마다 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 원하는 투여량은 다중 투여(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14회 이상의 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
본 개시내용의 세포의 원하는 투여량은 1회 또는 다수의 횟수로 투여될 수 있다. 영양요구 인자는 일정 기간 동안 설정된 빈도로 정기적으로, 또는 "지속적인 흐름"으로 지속적으로 투여된다. 24시간 기간 동안 제공되거나 처방되는 양인 전체 1일 용량은 이들 방법 중 임의의 방법에 의해 또는 이들 방법의 조합으로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체로의 본 개시내용의 세포(들) 또는 영양요구 인자의 전달은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 10년 초과 동안 치료적 효과를 제공한다.
본 개시내용의 세포는 순차적으로 또는 동시에 하나 이상의 다른 치료적, 예방적, 연구 또는 진단 제제 또는 의료 절차와 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 각각의 제제는 그 제제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 일정으로 투여될 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 개시는 생체이용률을 개선시키고/시키거나, 대사를 감소시키고/시키거나 변형시키고/시키거나, 배출을 억제하고/하거나, 신체 내의 분포를 변형시킬 수 있는 제제와 조합된 약학적, 예방적, 연구 또는 진단 조성물의 전달을 포함한다.
예를 들어, 본 개시내용의 세포 또는 영양요구 인자는 치료에 대해 표적화된 영역에서 생체이용률을 증가시키기 위해 대상체에서의 확산을 제한하는 생체적합성 장치로서 투여된다. 본 개시내용의 세포(들) 또는 영양요구 인자는 또한 국소 전달에 의해 투여될 수 있다.
용어 "컨디셔닝 요법"은 환자가 줄기 세포 이식 전에 받는 요법 과정을 나타낸다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식 전, 환자는 줄기 세포가 동일한 환자에서 유래한 경우에도 줄기 세포 이식 거부를 방지하기 위해 골수절제 요법, 비-골수절제 요법 또는 감소된 강도 컨디셔닝을 받을 수 있다. 컨디셔닝 요법은 세포독성제의 투여를 포함할 수 있다. 컨디셔닝 요법은 또한 면역억제, 항체 및 방사선조사를 포함할 수 있다. 다른 가능한 컨디셔닝 요법은 항체 매개 컨디셔닝(예를 들어, 문헌[Czechowicz et al., 318(5854) Science 1296-9 (2007); Palchaudari et al., 34(7) Nature Biotechnology 738-745 (2016); Chhabra et al., 10:8(351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)] 참조) 및 CAR-T 매개 컨디셔닝(예를 들어, 각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Arai et al., 26(5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018)] 참조)을 포함한다. 컨디셔닝은 조작된 HSC로부터 유래된 미세아교세포가 관심 단백질을 전달하기 위해 이동하기 위해 뇌에 공간을 만드는 데 사용되어야 한다(ALD 및 MLD에 대한 최근의 유전자 요법 시험). 컨디셔닝 요법은 또한 이식된 세포가 체내에서 생착 및 증식하는 장소를 갖는 것을 가능하게 하도록 니치 "공간"을 생성하도록 설계된다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식에서, 컨디셔닝 요법은 이식된 조혈 줄기 세포가 생착될 골수에 니치 공간을 만든다. 컨디셔닝 요법 없이, 이식된 조혈 줄기 세포는 생착될 수 없다. 일부 구체예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 T 세포이다. 조작된 영양요구 T 세포는 살아 있는 약물로서 작용하는 CAR T 세포로 사용될 수 있고, 조혈 줄기 세포 이식을 위해 환자를 컨디셔닝하기 위해 영양요구 인자와 함께 환자에 투여될 수 있다. 공여체 조혈 줄기 세포의 전달 전에, 영양요구 인자는 제거될 수 있으며, 이는 조작된 영양요구 T 세포의 제거를 발생시킨다. 일부 구체예에서, 세포주는 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 동종이형 T 세포이다. 조작된 영양요구 동종이형 T 세포는 치료 효과를 제공하기 위해 영양요구 인자와 함께 환자에 투여될 수 있다. 환자가 이식편대숙주병(GvHD) 발생시, 영양요구 인자는 제거될 수 있고, 이는 동종반응성이 된 조작된 영양요구 동종이형 T 세포의 제거를 발생시킨다.
질병, 장애 또는 질환의 치료를 위해 본 개시내용에 기재된 세포의 용도가 또한 본 개시내용에 포함된다.
특정 구체예는 암, 파킨슨병, 이식편대숙주병(GvHD), 자가면역 질환, 과다증식성 장애 또는 질환, 악성 형질전환, 간 질환, 유전된 유전자 결함을 포함하는 유전병, 소아 발병 당뇨병 및 안구 구획 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 질병, 장애 또는 질환은 근육계, 골격계, 순환계, 신경계, 림프계, 호흡기 내분비계, 소화계, 배설계 및 생싱계로 구성된 군으로부터 선택되는 신체의 적어도 하나의 계통에 영향을 미친다. 대상체에서 하나 초과의 세포 유형에 영향을 미치는 질환은 상이한 영양요구 인자에 의해 활성화된 각 세포주와 함께 본 개시내용에 기재된 세포의 하나 초과의 구체예로 치료될 수 있다.
특정 구체예는 세포주를 재생성으로 제공한다. 본 개시내용의 양태에서, 대상체는 하나 초과의 세포 및/또는 하나 이상의 영양요구 인자와 접촉될 수 있다. 특정 구체예는 영양요구 인자, 예를 들어 영양소 또는 효소의 국소 방출을 제공한다. 대안적인 구체예는 전신 전달을 제공한다. 예를 들어, 국소화된 방출은 생체적합성 장치의 사용을 통해 영향을 받는다. 본 개시내용의 양태에서, 생체적합성 장치는 대상체에서 세포주의 확산을 제한할 수 있다. 방법의 특정 구체예는 대상체에서 변형된 숙주 세포의 치료 효과를 고갈시키거나 변형된 숙주 세포에서 세포 치사를 유도하기 위해 영양요구 인자를 제거하는 것을 제공한다. 본 방법의 특정 구체예는 분자 트래피킹, 세포 치사 유도, 세포 치사 및 추가 세포 동원으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 치료 효과를 제공한다. 본 방법의 특정 구체예는 비변형된 숙주 세포가 변형된 숙주 세포로 대상체를 처리하기 전에 동일한 대상체로부터 유래된다는 것을 제공한다.
본 개시내용은 선택적으로 용기 또는 바이알에, 상기 조성물 또는 이러한 조성물의 성분을 포함하는 키트를 고려한다.
VII. 정의
숫자값 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
용어 "활성 성분"은 일반적으로 치료 효과를 발휘하는 데 관여하는 조성물의 성분을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이는 일반적으로 (a) 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진을 포함하는 변형된 숙주 세포 또는 작제물, (b) 본원에 기재된 바와 같은 상응하는 영양요구 인자, 또는 (c) 영양요구 유도성 유전자좌 내에서 절단을 표적화하기 위한 뉴클레아제 시스템을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 농도"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체에서 영양요구 인자의 농도와 비교하여 영양요구 인자의 농도 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 pH"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체의 pH와 비교하여 대상체에서 유도된 pH의 변화를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변경된 온도"는 본원에 기재된 약학적 조성물의 투여 전의 대상체의 온도와 비교하여 대상체에서 유도된 온도의 변화를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "영양요구성" 또는 "영양요구"는 세포의 성장 및 생식을 유지하기 위해 영양요구 인자의 외인성 투여를 필요로 하는 세포의 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "영양요구 유도성 유전자좌" 또는 "영양요구 유도성 유전자"는 파괴되는 경우 세포가 영양요구성이 되도록 하는 세포 내의 염색체의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 세포는 영양요구 인자의 합성, 재활용 또는 구제에 관여하는 효소를 인코딩하는 유전자를 파괴하거나(직접적으로 또는 영양요구 인자를 제조하는 데 사용되는 중간체 합성을 통해 업스트림으로), 영양요구 유도성 유전자의 오픈 리딩 프레임을 파괴하지 않으면서 유전자의 발현을 조절하는 발현 제어 서열을 파괴함으로써 영양요구성이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생체이용률"은 대상체에 투여된 제공된 양의 변형된 숙주 세포 또는 영양요구 인자의 전신 이용 가능성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "Cas9"은 유전체 편집에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제인 CRISPR-관련 단백질 9를 나타낸다.
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 의미하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 예를 들어, X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다.
용어 "컨디셔닝 요법"은 환자가 줄기 세포 이식 전에 받는 요법 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "연속 흐름"은 단일 경로/단일 접촉 지점에서 일정 기간 동안 연속적으로, 즉, 연속 투여 사건으로 투여되는 치료제의 용량을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR"은 침입 세포의 RNA 뉴클레오티드를 절단하는 효소를 배치하는 DNA의 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템"은 Cas9에 대한 결합 부위를 갖는 가이드 RNA(gRNA) 서열 및 표적 DNA에서 절단될 부위에 특이적인 표적화 서열을 포함하는 유전 공학 도구를 나타낸다. Cas9은 gRNA에 결합하여 표적 부위에 결합하고 이를 절단하는 리보핵단백질 복합체를 형성한다.
세포와 관련하여 사용되는 경우 용어 "확장"은 자손의 생성을 통해 세포의 수를 증가시키는 것을 나타낸다.
용어 "발현 제어 서열"은 관심 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하거나 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예로는 프로모터, 인핸서, 전사 인자 결합 부위, miRNA 결합 부위, 등을 포함한다.
용어 "상동성 재조합(HR)"은 상동성 특이적 복구 메커니즘을 통해 DNA에서 파괴의 복구 동안 뉴클레오티드 서열의 삽입을 나타낸다. 이러한 과정은 파괴를 복구하기 위한 주형으로서 파괴 영역의 뉴클레오티드 서열과 상동성을 갖는 "공여체" 분자 또는 "공여체 주형"을 사용한다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 유전체의 단일 염기 변화 또는 큰 DNA 서열의 삽입일 수 있다. 공여체 주형은 예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드 페이로드를 인코딩하는 발현 작제물의 하나 이상의 기능성 성분을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 "상동성 재조합 공여체 벡터" (및 유사 용어)는 상동성 재조합을 통해 세포의 유전체에 통합되거나 통합되도록 설계된 공여체 분자 또는 공여체 주형 핵산 분자를 나타낸다. 발현 작제물은 폴리시스트론성일 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 작제물 및/또는 발현 작제물 내의 발현 카세트는 하나 이상의 링커 서열, 예를 들어 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A), T2A(종합적으로 "2A 서열 ") 등을 포함한다.
용어 "발현 작제물"은 진핵 세포에서의 발현에 필요한 서열 요소, 예를 들어, 프로모터 서열 및 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 발현 작제물은 하나 이상의 "발현 카세트"를 포함하고, 각각의 발현 카세트는 독립적인 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 독립적인 프로모터를 포함한다. 본원에 언급된 코딩 서열은 예를 들어, DNA, RNA 또는 폴리펩티드 페이로드를 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "페이로드"는 생체분자, 예를 들어, DNA, RNA, 또는 폴리펩타이드 생체분자를 지칭한다. 예를 들어, 페이로드는 치료학적 생체분자일 수 있다. 페이로드는 예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA 모방체, 안티-miR, 합성 mRNA, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 페이로드는 요망되는 세포 기능을 달성하기 위해 세포 내에서 작용한다. 일부 구체예에서, 페이로드는 요망되는 세포 기능을 달성하기 위해 세포의 표면에서 작용한다. 일부 구체예에서, 페이로드는 요망되는 세포 기능을 달성하기 위해 세포 외부에서 작용한다. 일부 구체예에서, 페이로드는 요망되는 세포 기능을 달성하기 위해 세포 내에서 작용한다. 일부 구체예에서, 페이로드는 요망되는 세포 기능을 달성하기 위해 세포 외에서 작용한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전구 세포"는 예를 들어, 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 만능성 줄기(PS) 세포(PSC), 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포(HSC), 체세포 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 분화된 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 기질 세포, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 전구 세포, 지방 줄기 세포, 각질세포, 조골세포, 골격 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 심근세포, 섬유아세포, NK 세포, B-세포, T 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 나타낸다.
2개 이상의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "상동성의" 또는 "상동성"은 생리학적 조건하에서 세포에서 2개의 뉴클레오티드 서열이 함께 특이적으로 결합하기에 충분한 염기쌍 형성 또는 하이브리드화의 정도를 나타낸다. 상동성은 또한 상보적 서열, 예를 들어, 특정된 수의 염기에 대해 적어도 70% 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 상보적 서열과 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 겪게 될 뉴클레오티드의 백분율을 계산하여 기재될 수 있다. 예를 들어, 공여체 주형과 관련하여 상동성은 200-400개 이상의 염기일 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열과 관련하여 상동성은 15-20개 이상의 염기일 수 있다.
용어 "독립적인 기능성 도메인"은 각각 전체 단백질에 기능을 기여하는 단백질의 개별 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 자연의 특정 단백질은 단백질의 나머지 부분과 구조적으로 및 기능적으로 구별되는 효소 또는 촉매 도메인을 포함한다. 이러한 효소 또는 촉매 도메인은 단백질 서열의 나머지로부터 별도로 그리고 독립적으로 발현될 때 정상적인 세포 또는 생리학적 조건 하에서 효소 또는 촉매 활성을 유지하는 경우 독립적인 기능성 도메인으로 간주될 수 있다. "독립적인 기능성 도메인"은 또한 각각 전체 단백질에 기능을 부여하는 단백질의 개별 서브유닛을 지칭한다. 독립적인 기능성 도메인은 단일 유전자로부터 발현되지만 그것이 유래하는 유전자/단백질의 전체 기능의 구성요소이거나 이로부터 분리될 수 있는 독립적인 기능을 갖는 단백질의 개별 도메인, 서브유닛 또는 단편일 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 신호 서열, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 나타내며, 상기 발현 제어 서열은 제2 핵산 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물이 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환(예를 들어, 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴에 의함)시켜 변형되도록 하는 개시된 화합물의 유도체를 나타낸다. 본원에서 화합물 또는 성분에 대한 모든 언급은 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재생성"은 대상체의 기관 또는 시스템의 재생 또는 복원을 나타낸다.
예를 들어, "영양요구 유도성 유전자의 재발현"의 문맥에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재발현"은 세포에서 유전자, 예를 들어 영양요구 유도성 유전자의 발현을 대체, 구제, 보충 또는 증대시키는 트랜스진의 발현을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조직-특이적 인자"는 특정 조직의 분화된 세포에서 독특하게 또는 차등적으로 발현되는 유전자 또는 단백질 또는 유전자 또는 단백질의 조합물을 지칭한다. 일부 경우에, 조직-특이적 인자는 특정의 요망되는 세포 운명의 중간체인 세포 유형에서 독특하게 또는 차등적으로 발현되는 유전자 또는 단백질이다. 따라서, 세포 또는 조직 내 조직-특이적 인자의 특정 조합 또는 특정 조직-특이적 인자의 존재는 요망되는 세포 운명 또는 조직 유형에 따라 분화되는 것으로서 세포 또는 조직을 식별할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조직-특이적 프로모터"는 특정 조직 또는 세포 유형에서 유전자의 발현을 유도하는 뉴클레오티드 조절 서열을 지칭한다. 다양한 예시적인 조직-특이적 프로모터가 표 3에 제공된다. 일부 경우에, 특정 조직 또는 세포 유형에서 조직-특이적 인자의 존재는 상응하는 조직-특이적 프로모터에 의해 조절되는 표적 유전자의 발현을 유도한다.
용어 "치료 인자"는 대상체의 질병, 장애 또는 질환의 증상을 치료하고/하거나 완화시키는 삽입된 트랜스진에 의해 인코딩된 단백질을 나타낸다.
용어 "치료량"은 질병, 장애 또는 질환의 증상의 완화 또는 개선을 의미하는 "치료 효과"를 발휘하기에 충분한 치료 인자의 양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 별개의 양을 나타낸다.
본 개시내용의 하나 이상의 구체예의 세부 사항은 하기 첨부된 설명에 기재되어 있다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재된다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명으로부터 명백할 것이다. 설명에서 단수 형태는 또한 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상반되는 경우 현재 설명이 우선할 것이다.
본 개시내용은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
실시예 1. 줄기 세포의 배양
UMPS/우리딘 영양요구성을 인간 만능성 세포에서 조작하였다. 본원의 개시내용의 주제인 변형된 숙주 세포는 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 U.S. 8,945,862호에 제시된 바와 같이 하기 기술을 사용하여 유지되고 분화된 줄기 세포를 포함할 수 있다.
미분화 hESC(WICELL®로부터의 H9 계통, 35 내지 45 계대)를 비활성화된 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 영양세포층에서 성장시켰다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401]). 세포를 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에서 방사선 조사된 저 계대 MEF 영양세포층에서 미분화 단계에서 유지시켰다. 배지를 매일 변경하였다. 배지는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/F-12, 20% 넉아웃 혈청 대체물, 0.1 mM 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 4 ng/ml rhFGF-2(R&D Systems Inc., Minneapolis)로 구성된다. 미분화 hESC를 DMEM/F12에서 1 mg/ml 콜라게나제 유형 IV으로 처리하고, 계대일에 기계적으로 긁어내었다. 분화 전, hESC를 다음과 같이 MEF에서 제조된 컨디셔닝된 배지(CM)에서 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅 플레이트에 시딩하였다(전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Nat Biotechnol, 2001. 19(10): p. 971-4]). MEF 세포를 수확하고, 50 Gy로 방사선 조사하고, 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)가 없는 hES 배지로 배양하였다. CM을 매일 수집하고, hES 세포를 공급하기 전에 추가 4 ng/ml의 bFGF를 보충하였다.
실시예 2. 영양요구성 세포 내로의 작제물 삽입
UMPS 유전자좌는 Cas9 RNP의 전기천공에 의해 hESC에서 파괴하여 조직-특이적 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열을 유전체 유전자좌에 삽입하였다. 프로모터는 내피 조직과의 상호작용으로 인해 전사를 착수하기 시작할 것이다. 유전자 편집을 위해, hESC를 전기천공 전 24시간 동안 10 μm ROCK 억제제(Y-27632)로 처리하였다. 70-80% 컨플루언스(confluence)의 세포를 ACCUTASE® 용액(Life Technologies)으로 수확하였다. 150 μg/mL의 SpCas9 농도(Integrated DNA Technologies) 및 1:3의 Cas9:sgRNA 몰비로 반응 당 500,000개의 세포를 사용하였고, 전기천공을 4D NUCLEOFECTOR 시스템(Lonza)에서 16웰 NUCLEOCUVETTE™ 스트립 내의 P3 일차 세포 용액(Lonza)에서 수행하였다. 전기천공 직후, 세포를 10 μM Y-27632와 함께 500 μl의 mTeSR™ 배지(STEMCELL Technologies)를 함유하는 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅된 24웰 플레이트의 하나의 웰로 옮겼다. 배지를 편집 24시간 후에 변경하였고, Y-27632를 48시간 후에 제거하였다.
실시예 3. 인간 배아 줄기 세포(ESC)-내피 세포(EC)의 시험관 내 분화
hESC 분화를 유도하기 위해, 미분화 hESC를 이전에 기재된 바와 같이 현탁 배아체(EB)의 형성을 위한 초저 부착 플레이트에서 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 및 15% 규명 소 태아 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, Utah), 0.1 mM 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 450 μM 모노티오글리세롤(Sigma, St. Louis, Mo.), 50 U/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 분화 배지에서 배양하였다(각각의 전체내용이 인용으로서 본원에 포함되는 문헌[Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4391-6 및 Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401] 참조). 간단히, 조건부 배지를 갖는 MATRIGEL® 단백질 혼합물(Corning, Inc.) 코팅 플레이트에서 배양된 hESC를 37℃에서 15분 동안 2 mg/ml 디스파제(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)로 처리하여 콜로니를 느슨하게 하였다. 이후, 콜로니를 긁어내어, 배아체 형성을 위한 초저 부착 플레이트(Corning Incorporated, Corning, N.Y.)로 옮겼다.
실시예 4. 순수한 분화된 세포 집단의 선택
세포를 5-FOA 및 우리딘 공급원에서 성장시켰다. 5-FOA를 분화 시작 전에 제거하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 분화가 수행되면, 우리딘은 배지로부터 제거된다. 삽입된 조직-특이적 프로모터의 조절 하에 UMPS를 발현하지 않는 세포는 치사하며, 이에 의해 순수한 분화된 세포 집단이 남게 된다.
실시예 5. UMPS-/-배경에서 UMPS를 재발현하는 세포 선택
본원에서 기술된 바와 같은 이중대립유전자적으로 넉아웃된 UMPS 유전자를 갖는 세포 집단에의 UMPS를 발현하는 작제물의 삽입은 원칙적으로 본원에 기술된 방법을 이용하여 선택을 입증한다. DNA 벡터를 통해 전달된 항시성 프로모터(EF1a)의 조절 하에 2A 링커 서열에 의해 분리된 mCherry 및 UMPS를 발현하는 작제물(SEQ ID NO: 42)은 상동성 재조합 아암을 사용하여 표적화된 CCR5 유전자좌 내로 전기천공에 의해 삽입되었다. 세포를 우리딘의 존재하에 성장시켜 임의의 선택압을 완화시키고, 그 후 우리딘을 제거하여 UMPS를 성공적으로 재발현하는 세포에 대해 선택하였다. 세포를 유세포 분석기를 사용하여 mCherry의 발현에 의해 분류하였다. 배양 14일 후, % mCherry+ 세포는 우리딘의 존재하에 약 20%였으며; %mCherry+ 세포는 우리딘의 부재하에 약 90%였다. 따라서, UMPS 넉아웃 세포에서 UMPS의 재발현은 영양요구성-기반 세포 선택을 입증한다.
실시예 6. 영양요구성 분할
UMPS의 독립적인 기능성 도메인, 즉 OPRT 및 ODC는 2개의 별도 벡터를 사용하여 실시예 2에 따라 UMPS 넉아웃 세포 내에 재도입하였다. OPRT 및 mCherry를 수반하는 제1의 상동성 재조합 공여체 벡터(SEQ ID NO: 43)는 ORT를 인코딩하는 서열 (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 인코딩함), 2A 링커 (SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, 또는 SEQ ID NO: 23, 각각 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 및 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 인코딩함), 및 mCherry 형광 단백질을 인코딩하는 서열(SEQ ID NO: 34 또는 SEQ ID NO: 35, 각각 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 인코딩함)을 포함한다. ODC 및 CD19를 수반하는 상동성 재조합 공여체 벡터 (SEQ ID NO: 44)는 tCD19 (SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 인코딩함), 2A 링커 및 ODC를 인코딩하는 서열(SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 인코딩함)을 포함한다. OPRT 및 ODC 작제물의 발현은 진핵생물 프로모터 예컨대, EF1a (SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 32)에 의해 구동될 수 있다. 상동성 재조합 벡터는 세이프 하버 유전자좌 CCR5 내로의 통합을 위한 공동-표적화된다(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 SEQ ID NO: 11-15로부터 선택되는 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암). 상동성 재조합 벡터는 종결 신호 예컨대, bGH-PolyA 종결 신호 (SEQ ID NO: 39 또는 SEQ ID NO: 40)를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 우리딘의 존재 및 부재 하에 배양하였으며, CD19 및 mCherry 둘 모두를 발현하는 세포 (CD19+/mCherry+)의 퍼센트는 시간에 따른 유세포분석에 의해 측정하였다. 16일째의 결과는 표 5에 제공된다.
표 5. UMPS 분할은 이중 트랜스진 통합의 선택을 허용한다
Figure pct00011
표 5에 도시된 바와 같이, 우리딘의 제거는 UMPS 넉아웃 세포의 배양시 CD19+/mCherry+ 세포를 풍부화시키며, 이는 우리딘의 부재가 UMPS 기능을 함께 대체하는 이중 트랜스진을 발현하는 세포에 대한 선택 압력을 가함을 나타낸다.
실시예 7. 성숙한 베타 세포의 선택을 위한 영양요구성 분할 시스템
성숙한 베타 세포는 하나 이상의 조직- 또는 세포-유형 특이적 인자의 발현에 의해 표지된다. 예를 들어, 인슐린("INS," ENSG00000254647)과 NKX6.1(ENSG00000163623)의 공동-발현은 성숙한 줄기-세포-유래 베타 세포를 지시한다(예를 들어, 각각의 개시 내용의 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Ma, Haiting, et al. "Establishment of human pluripotent stem cell-derived pancreatic β-like cells in the mouse pancreas." Proceedings of the National Academy of Sciences 115.15 (2018): 3924-3929; Pagliuca, Felicia W., et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro." Cell 159.2 (2014): 428-439; 및 Rezania, Alireza, et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells." Nature biotechnology 32.11 (2014): 1121] 참조). Rezania 등의 문헌에 따르면, "PDX1(췌장 호메오도메인 전사 인자[ENSG00000139515]) 및 NKX6.1(호메오박스 전사 인자)는 만능성 췌장 전구 세포에서 공동-발현되는데, 이는 모든 성인 췌장 내배엽 세포를 생성시키고", 이들의 공동-발현은 베타 세포로 제한된다. NEUROD1(ENSG00000162992), NKX2.2(ENSG00000125820), 및 MAFA(ENSG00000182759)는 성숙한 베타 세포에서 발현이 제한되거나 차등 발현되는 추가 유전자를 나타낸다(예를 들어, 개시 내용의 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Nishimura, Wataru, Satoru Takahashi, and Kazuki Yasuda. "MafA is critical for maintenance of the mature beta cell phenotype in mice." Diabetologia 58.3 (2015): 566-574] 참조). Rezania 등 및 Pagliuca 등의 문헌에는 각각의 분화 단계에 대한 발현 프로파일로 인간 만능성 줄기 세포로부터 성숙한 베타 세포를 제조하기 위한 다단계 분화 절차가 더욱 상세히 설명되어 있고, 이에 따라 분화된 세포가 생체내에서 당뇨병을 역전시킨다는 것을 보여주었다.
이제 구체적으로, 성숙한 베타 세포는, 예를 들어, UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, 인슐린 또는 인슐린-의존적 트랜스진을 발현하는 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화된 인간 세포 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있다는 것이 고려되고, 여기서 트랜스진은 내인성 인슐린 발현 제어 서열에 의해 조절되고 UMPS를 추가로 포함한다. 인슐린 유전자는 mCherry 및 UMPS(SEQ ID NO:41)를 보유하는 상동성 재조합 벡터를 사용하여 상동성 재조합에 대해 표적화될 수 있으며, 여기서 벡터는 SEQ ID NO:16 및/또는 SEQ ID NO:17을 포함하는 좌측 상동성 아암 및 SEQ ID NO:18을 포함하는 우측 상동성 아암을 포함한다. SEQ ID NO:16 및 SEQ ID NO:18의 좌측 및 우측 상동성 아암은 각각 SEQ ID NO:17의 인슐린 코딩 서열 부분의 상류에 있는 인슐린 코딩 서열내 위치를 표적화하는 뉴클레아제 시스템에 의존한다. 인슐린 유전자좌에 삽입된 트랜스진은, 예를 들어, IRES-구동 mCherry 리포터를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 IRES는 SEQ ID NO:33 또는 유사 서열을 포함하고, mCherry는 SEQ ID NO:34 또는 SEQ ID NO:35를 포함한다. 리포터 단백질의 발현은 UMPS를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 인코딩하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2)을 제공함으로써 UMPS 발현에 연결될 수 있다. UMPS 코딩 서열은, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T2A 링커를 사용하여 리포터로부터 분리될 수 있다. 따라서, INS-mCherry-UMPS 작제물은 내인성 인슐린 조절성 제어 서열 하에 인슐린, mCherry, 및 UMPS를 발현하는 삼중시스트론 작제물을 포함한다. 삼중시스트론성 카세트의 발현은 UMPS 코딩 서열 이후에 bGH-PolyA 종결 신호(SEQ ID NO: 39 또는 SEQ ID NO: 40)와 같은 종결 신호를 포함함으로써 종결될 수 있다.
내인성 인슐린 발현 조절 서열의 조절 하에 우리딘-영양요구성 세포로의 INS-mCherry-UMPS 트랜스진 삽입은 인슐린을 발현하는 세포, 즉, 성숙한 베타 세포에서만 UMPS의 재발현을 가능하게 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 단일 영양요구성 선택을 이용하여 세포의 집단으로부터 성숙한 베타 세포를 선택하는 방법을 포함하며, 여기서 "단일"은 하나의 영양요구성-유도 유전자(즉, UMPS)의 사용을 지칭한다.
본원에 기재된 방법은 영양요구성 분할을 이용하는 이중-특이적 선택 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 성숙한 베타 세포는, 예를 들어, UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, 인슐린 또는 인슐린-의존적 트랜스진을 발현하는 제1 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화된 인간 세포의 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있고, 여기서 트랜스진은 내인성 인슐린 발현 제어 서열에 의해 조절되고, 제1 UMPS 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, ODC)을 추가로 포함한다. 예를 들어, ODC만을 발현하는 세포는 우리딘에 대해 영양요구성으로 남을 것이다. 따라서, 예를 들어, OPRT를 발현하는 제2 트랜스진은 영양요구성을 완화하고 우리딘의 제거를 허용하도록 발현되어야 한다. 제2 트랜스진의 발현은 제2 성숙한 베타 세포-특이적 인자, 예를 들어, NKX6.1에 고유한 내인성 발현 제어 서열의 조절 하에 있을 수 있다. 따라서, 시험관내 분화 세포의 집단으로부터 영양요구성 인자 우리딘의 제거 시, 인슐린과 NKX6.1 둘 모두를 발현하는 세포들만이 생존할 것이며, 이에 의해 성숙한 베타 세포를 선택할 것이다.
유사하게는, 구체적으로, 성숙한 베타 세포는, 예를 들어, UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, 제1 UMPS 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, ODC)을 포함하는 인슐린 또는 인슐린-의존적 트랜스진 및 제2 UMPS 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, OPRT)을 포함하는 MAFA 또는 MAFA-의존적 트랜스진을 발현하는 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화된 인간 세포의 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있는 것이 고려된다. 시험관내 분화 세포 집단으로부터 영양요구성 인자 우리딘의 제거 시, 인슐린과 MAFA 둘 모두를 발현하는 세포들만이 생존할 것이며, 이에 의해 성숙한 베타 세포를 선택할 것이다.
본원에 기재된 단일 및 이중-특이적 선택 방법을 이용하여 선택되고 농축된 세포는, 예를 들어, 유형 1 당뇨병을 갖는 대상체를 포함하여 글루코스-민감성 성숙한 인슐린-생성 베타 세포를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 완화시키기 위해 생체내에서 투여될 수 있다는 것이 고려된다.
본원에 제공된 바와 같은 성숙한 베타 세포를 선택하는 방법은 하기 표 6에 요약되어 있다. 표 6에 제시된 바와 같이, UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 하나 이상의 베타 세포-특이적 인자 및/또는 하나 이상의 베타 세포-특이적 프로모터는, 우리딘 제거 시, 베타 세포-특이적 유전자를 발현하는 세포만이, 및 이에 따라 성숙한 베타 세포만이 생존하고/생존하거나 증식하도록, 영양요구성 유전자를 재발현하기 위해 참여될 수 있다.
표 6. 영양요구성 선택 방법 및 영양요구성 분할 선택 방법을 이용한
분화된 세포의 선택 방법
Figure pct00012
단일 영양요구성 선택의 맥락에서, UMPS의 재발현은 성숙한 베타 세포로 분화된 세포를 선택하기 위해 인슐린, NEUROD1, NKX2.2, 및/또는 MAFA의 세포 발현에 의해 조절될 수 있다.
이중-특이적 영양요구성 선택의 맥락에서, ODC 및 OPRT의 재발현은 성숙한 베타 세포로 분화된 세포를 선택하기 위해 각각 인슐린 및 NKX6.1; 각각 인슐린 및 NEUROD1; 각각 인슐린 및 NKX2.2; 각각 인슐린 및 MAFA; 또는 각각 인슐린 및 PDX1의 세포 발현에 의해 조절될 수 있다. 대안적으로, OPRT 및 ODC의 재발현은 성숙한 베타 세포로 분화된 세포를 선택하기 위해 각각 인슐린 및 NKX6.1; 각각 인슐린 및 NEUROD1; 각각 인슐린 및 NKX2.2; 각각 인슐린 및 MAFA; 또는 각각 인슐린 및 PDX1의 세포 발현에 의해 조절될 수 있다.
개념의 증명으로서, UMPS 넉아웃 세포를, 예를 들어, 본원에서 논의되고 포함된 문헌[Ma et al. (2018), Pagliuca et al. (2014), 및/또는 Rezania et al. (2014)]에 기재된 바와 같은 적절한 방법을 이용하여 인슐린을 발현하도록 조작하고, 췌장 전구 세포로 분화시켰다. UMPS 유전자를 본원에 기재된 방법에 따라 H9 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 넉아웃시켰다. 항시성 프로모터의 조절 하에 GFP-루시페라제 발현 작제물을 상동성 재조합에 의해 HBB 유전자좌로 통합하였다(예를 들어, 내용의 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Dever, Daniel P., et al. "CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells." Nature 539.7629 (2016): 384-389] 참조). 인슐린, mCherry, 및 UMPS가 모두 변형된 인슐린 유전자좌로부터 발현되도록 인슐린의 N-말단 부분의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 mCherry-UMPS 발현 카세트를 보유하는 제2 상동성 재조합 도너 벡터(상술된 INS-mCherry-UMPS 작제물)을 프레임 내 인슐린 유전자좌로 통합하였다. GFP 발현을 구성적으로 발현될 세포에서 확인하였다. 세포를 분화 프로토콜에 적용하여, 배양 시작 후 1 일에 hESC 분화의 스테이지 1을 개시하여 최종 내배엽 세포가 생산되었다. 3 일에 스테이지 2를 개시하여 최종 내배엽 세포가 원시 소화관 세포로 분화되었다. 6 일에 스테이지 3을 개시하여 원시 내장관 세포가 후부 전장 세포로 분화되었다. 9 일에 스테이지 4를 개시하여 대략 14 일에 후부 전장 세포가 췌장 전구 세포로 분화되었다. 세포를 모니터링하고, 이후 25 일까지 mCherry 및 UMPS 발현에 대하여 평가하였다. 우리딘의 연속 존재에서 18 일까지, 또는 배양 기간의 종료까지, 또는 단지 12 일까지(스테이지 4 동안) 세포로 분화 프로토콜을 수행하였다. mCherry 및 UMPS 발현을 평가하였다. 형광 이미지에 기초한 역치를 사용하여 UMPS 발현 세포(주어진 UMPS 발현이 mCherry에 커플링됨)를 확인하기 위해 mCherry 온 vs. 오프 역치를 지정하였다. GFP 발현은 유비쿼터스 프로모터에서 유래되었기 때문에, 세포의 분화 상태와 무관한 것으로 밝혀졌다. 역치화된 mCherry-오프 세포는 비분화된 것으로 간주될 수 있는 반면, mCherry-온 세포는 베타 세포로 분화되는 것으로 간주될 수 있다(mCherry 및 UMPS 발현은 인슐린 프로모터에 의해 구동됨, 베타 세포-특이적 유전자).
본 실험에서, 우리딘 제거(12 일)는 UMPS를 발현하지 않는(따라서 mCherry를 발현하지 않는) 세포에서 세포 성장(및 유전자 발현)을 억제할 것이다. 따라서, 우리딘이 존재할 때 mCherry 음성 세포에서의 GFP 발현은 우리딘이 부재일 때 mCherry 음성 세포에서의 GFP 발현보다 더 높을 것으로 예상되었다. 따라서, 우리딘-제거 조건에서 우리딘 중 [평균 GFP(mCherry-오프)/평균 GFP(mCherry-온)]의 비율을 우리딘-연속 조건에서 [평균 GFP(mCherry-오프)/평균 GFP(mCherry-온)]의 비율과 비교하였다. 결과는 표 7에 나타나 있으며, 여기서 "영양요구성 메트릭"을 우리딘-제거 조건에서의 평균 GFP 비율을 우리딘-연속 조건에서의 평균 GFP로 나누어 계산하였다: [(평균 GFP(mCherry-오프)/평균 GFP(mCherry-온)) 우리딘-제거-조건]/[(평균 GFP(mCherry-오프)/평균 GFP(mCherry-온)) 우리딘-연속 조건]. 상기 비율을 현미경 이미지로부터 여러 시야에 걸쳐 계산하였고, 결과는 우리딘 제거가 UMPS/mCherry 비-발현 및 이에 따른 비분화 세포에서 GFP 발현을 억제한다는 것을 입증하였다. 이는 계통 특이적 영양요구성이 분화된 세포를 선택하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
표 7. 우리딘-제거 조건 하에 비-인슐린(UMPS) 발현 세포에서
GFP 단백질 발현의 감소
Figure pct00013
이러한 방식으로 선택되고 농축된 세포는, 예를 들어, 타입 1 당뇨병을 갖는 대상체를 포함하여 글루코스-민감성 성숙한 인슐린-생성 베타 세포를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 완화시키기 위해 생체내에서 투여될 수 있다는 것이 고려된다. 성숙한 베타 세포의 분화와 함께 영양요구성 선택 방법의 이용은, 예를 들어, 필요한 대상체에게 투여하기 위해 시험관내-분화 성숙한 베타 세포의 순도, 양 및 효능을 개선할 수 있다.
실시예 8. 심근세포의 지정된 서브세트의 분화
실시예 6에서 성숙한 베타 세포의 분화를 위해 기재된 패러다임을 이용하여, 영양요구성 선택 방법을 이용하여 심근세포의 지정된 서브세트, 구체적으로 심실 심근세포로 분화된 세포를 선택할 수 있다.
TBX5(ENSG00000089225) 및 NKX2-5(ENSG00000183072) 유전자 발현으로 심실 근세포 세포를 표지하고, 이들의 차등 발현으로 인간 유도 만능성 줄기 세포-유래 심근세포의 적어도 4 개의 상이한 계통-특이적 하위집단을 확인하였다: TBX5-양성/NKX2-5-양성, TBX5-양성/NKX2-5-음성, TBX5-음성/NKX2-5-양성, 및 TBX5-음성/NKX2-5-음성(개시 내용의 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Zhang, Joe Z., et al. "A human iPSC double-reporter system enables purification of cardiac lineage subpopulations with distinct function and drug response profiles." Cell stem cell 24.5 (2019): 802-811] 참조). 구체적으로, TBX5-양성/NKX2-5-양성 세포는 심실 심근세포로의 분화에 유용한 제1 심장장 계통 세포에 가까운 계통를 나타내고; TBX5-양성/NKX2-5-음성 세포는 결절 심근세포로의 분화에 유용한 심외막 계통를 나타내고; TBX5-음성/NKX2-5-양성 세포는 심방 심근세포로의 분화에 유용한 제2 심장장 계통 세포와 유사한 하위집단을 나타내고; TBX5-음성/NKX2-5-음성 세포는 내피 세포 성질을 나타내는 하위집단을 나타낸다.
이제 구체적으로, 인간 iPSC로부터 유래된 심근세포의 하위집단을 포함하여 심근세포가 고려된다. 구체적으로, 결절 심근세포로의 분화에 유용한 심외막 계통 세포는 UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, TBX5 또는 TBX5-의존적 트랜스진을 발현하는 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화 인간 iPSC의 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있고, 여기서 트랜스진은 내인성 TBX5 발현 제어 서열에 의해 조절되고 UMPS를 추가로 포함한다. 내인성 TBX5 발현 제어 서열의 조절 하에 우리딘-영양요구성 세포로의 TBX5-UMPS 트랜스진 삽입은 TBX5를 발현하는 세포에서만 UMPS의 재발현을 가능하게 한다.
심방 심근세포로의 분화에 유용한 제2 심장장 계통 세포와 유사한 하위집단은 UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, NKX2-5 또는 NKX2-5-의존적 트랜스진을 발현하는 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화 인간 iPSC의 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있고, 여기서 트랜스진은 내인성 NKX2-5 발현 제어 서열에 의해 조절되고 UMPS를 추가로 포함한다. 내인성 NKX2-5 발현 제어 서열의 조절 하에 우리딘-영양요구성 세포로의 NKX2-5-UMPS 트랜스진 삽입은 NKX2-5를 발현하는 세포에서만 UMPS의 재발현을 가능하게 한다.
분할 영양요구성을 이용한 이중-특이적 선택 방법은 심실 근세포로 분화되는 세포의 하위집단을 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 심실 근세포는, 예를 들어, UMPS/우리딘 영양요구성 인간 iPSC로 시작하여, 예를 들어, TBX5 또는 TBX5-의존적 트랜스진을 발현하는 제1 트랜스진을 삽입함으로써 시험관내 분화된 인간 세포의 집단으로부터 특이적으로 선택될 수 있고, 여기서 트랜스진은 내인성 TBX5 발현 조절 서열에 의해 조절되고, 제1 UMPS 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, ODC)을 추가로 포함한다. ODC만을 발현하는 세포는 우리딘에 대해 영양요구성으로 남을 것이다. 따라서, 예를 들어, OPRT를 발현하는 제2 트랜스진은 영양요구성을 완화하고 우리딘의 제거를 허용하도록 발현되어야 한다. 제2 트랜스진의 발현은 제2 심실 심근세포-특이적 인자, 예를 들어, NKX2-5에 고유한 내인성 발현 제어 서열의 조절 하에 있을 수 있다. 따라서, 시험관내 분화 세포의 집단으로부터 영양요구성 인자 우리딘의 제거 시, TBX5와 NKX2-5 둘 모두를 발현하는 세포들만이 생존할 것이며, 이에 의해 심실 근세포를 선택할 것이다.
실시예 9. 안정한 T reg 세포 집단의 생성
안정한 T reg 세포 집단은 본원에 기재된 분할 영양요구성 시스템을 사용하는 선택 방법을 이용하여 생성될 수 있다. Passerini 등은 통상적인 CD4+ T 세포가 FOXP3 발현을 도입함으로써 완전히 기능적인 T reg-유사 세포로 전환될 수 있다는 것을 보여주었다. 더욱이, CD4+ T reg에서 FOXP3의 안정한 발현은 가소성과 대조적인 안정한 T reg 세포를 나타내는 것으로 밝혀졌다(개시 내용의 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Passerini, Laura, et al. "CD4+ T cells from IPEX patients convert into functional and stable regulatory T cells by FOXP3 gene transfer." Science translational medicine 5.215 (2013): 215ra174-215ra174] 참조).
이제 구체적으로, UMPS의 제1 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, ODC)은, 예를 들어, FOXP3 프로모터를 사용하여 FOXP3(ENSG00000049768)의 발현 조절 서열의 조절 하에 발현될 수 있고, UMPS의 제2 독립적인 기능성 도메인(예를 들어, OPRT)은 세포 순수성-관련 프로모터(예를 들어, 단백질 티로신 포스파타제 수용체 타입 C(PTPRC) [ENSG00000081237]: CD45RA 또는 CD45RO; 또는 CCR7 [ENSG00000126353])의 발현 제어 서열의 제어 하에 발현될 수 있다는 것이 고려된다. 순수성-관련 프로모터의 제어 하에 FOXP3 프로모터-ODC와 OPRT 둘 모두를 도입한 세포는 안정한 T reg 세포를 나타낼 것이다.
분할 영양요구성 선택 방법은 또한 CAR T 세포주를 선택하고 안정화시키고, 동종이계 세포를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 UMPS 유전자를 방해함으로써 분리되고 영양요구성이 되도록 조작될 수 있다. UMPS 유전자좌를 표적화하는 제1 상동성 재조합 도너 벡터는 내인성 UMPS 발현을 넉아웃시키고 UMPS의 제1 독립적인 기능성 도메인, 예를 들어, OPRT를 넉인시키도록 조작될 수 있다. 제1 상동성 재조합 도너 벡터는 UMPS의 제1 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 FOXP3 코딩 서열을 포함할 수 있다. FOXP3 코딩 서열 및 UMPS의 제1 독립적 기능성 도메인을 인코딩하는 서열은, 예를 들어, IRES 서열에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다. 단리된 T 세포는 추가로 내인성 TCR 알파(TCRA)를 인코딩하는, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 알파 상수(TRAC) 유전자좌를 표적화하는 제2 상동성 재조합 도너 벡터로 조작될 수 있다. 제2 상동성 재조합 도너 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 서열 및 UMPS의 제2 독립적인 기능성 도메인, 예를 들어, ODC를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. CAR 코딩 서열 및 UMPS의 제2 독립적 기능성 도메인을 인코딩하는 서열은, 예를 들어, IRES 서열에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다. 이중 넉인 세포는 기능적으로 UMPS를 재발현하고 우리딘의 부재에서 생존할 것이고, 반면에 단일 넉인 또는 비-넉인 세포는 우리딘의 부재에서 고갈되거나 증식하지 못할 것이다. 따라서, 분할 영양요구성 시스템은 CAR 발현, 내인성 TCR 넉아웃, FOXP3-양성 세포만이 생존하고/생존하거나 증식하는 것을 보장한다.
실시예 10. PS 세포-유래 조작된 거핵구에 사용하기 위한 발현 벡터를 최적화하기 위한 영양요구성 분할 선택
UMPS 넉아웃 세포를 생성하고 본원에 기재된 방법에 따라 우리딘-함유 배지에서 배양함으로써 넉아웃 세포를 선택함으로써 우리딘 영양요구성을 갖도록 본원에 기재된 방법에 따라 유도된 만능성 줄기 세포와 같은 전구 세포를 조작하였다(예를 들어, 실시예 1 참조).
UMPS 넉아웃 세포를 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터로 형질감염시켰다. 제1 상동성 재조합 도너 벡터는 1) EF1a와 같은 항시성 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 OPRT 코딩 서열(SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 인코딩하는, SEQ ID NO:4) 및 2) PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 제2 상동성 재조합 도너 벡터는 1) EF1a와 같은 항시성 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 ODC(SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 인코딩하는, SEQ ID NO:6) 및 2) PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터의 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유한다. 제1 및 제2 상동성 아암 벡터는 CCR5(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO:11 내지 15로부터 선택된 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 이용하여)와 같은 세이프 하버 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암을 가질 수 있다.
형질감염된 세포를 우리딘의 부재에서 배양하였다. 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터 둘 모두로 성공적으로 형질감염된 UMPS 넉아웃 세포는 우리딘 제거에서 생존한 반면, 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터 둘 모두를 성공적으로 발현하지 않은 세포는 사멸되었고, 이에 의해 UMPS의 독립적인 기능성 도메인 둘 모두를 발현하는 이중 넉인 세포를 선택하였다.
이중 넉인 세포를 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 페이로드(들)의 발현 및 기능에 대하여 평가하였다. 발현 수준은, 프로모터 또는 코딩 서열을 조절하거나, 링커, 또는 다른 전사 조절 서열을 도입함으로써 최적화될 수 있다. 요망되는 수준의 페이로드를 발현하는 이중 넉인 세포는 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터를 최적화시킨 것으로 확인되었다. 최적화된 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터를 사용하여 후속적으로 UMPS 독립적인 기능성 도메인이 결여된 최적화된 제1 및 제2 벡터를 설계하였다. 즉, 최적화된 제1 벡터는 PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터의 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, UMPS 독립적인 기능성 도메인 코딩 서열/프로모터가 결여되어 있었고; 최적화된 제2 벡터는 PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터의 발현 제어 서열의 전사 조절 하에 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, UMPS 독립적인 기능성 도메인 코딩 서열/프로모터가 결여되어 있었다. 최적화된 제1 및 제2 상동성 아암 벡터는 CCR5(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO:11 내지 15로부터 선택된 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 이용하여)와 같은 세이프 하버 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 아암을 포함하였다.
최적화된 제1 및 제2 벡터를 우리딘의 존재에서 배양된 UMPS 넉아웃 세포로 형질감염시켰다. 제1 및 제2 최적화된 벡터 둘 모두를 발현하는 클론을 선택하였다. 선택된 클론 집단은, 예를 들어, 거핵구로 및/또는 더 나아가 거핵구로부터 생성된 혈소판으로 분화될 수 있으며, 이에 따라 거핵구-특이적 프로모터는 페이로드(들)의 발현을 구동한다. 본원에 기재된 거핵구 및/또는 조작된 혈소판은 각각 그 전체가 인용에 의해 본원에 포함되는 문헌[Moreau, Thomas, et al. "Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming." Nature communications 7 (2016): 11208; Ito, Yukitaka, et al. "Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production." Cell 174.3 (2018): 636-648; 및/또는 Feng Q, et al. "Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells." Stem cell reports. 2014;3(5):817-831]에 기재된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이들 연구는 iPSC 및 혈소판의 임상적 규모 생산으로부터 불멸화된 거핵구 전구 세포주를 생성하기 위한 방법을 제공한다.
실시예 11. 거핵구의 생성
UMPS 넉아웃 세포를 생성하고 본원에 기재된 방법에 따라 우리딘-함유 배지에서 배양함으로써 넉아웃 세포를 선택함으로써 우리딘 영양요구성을 갖도록 본원에 기재된 방법에 따라 유도된 만능성 줄기 세포와 같은 전구 세포를 조작하였다(예를 들어, 실시예 1 참조).
UMPS 넉아웃 세포는 거핵구로 분화될 수 있다. 본원에 기재된 거핵구 및/또는 조작된 혈소판은, 예를 들어, 문헌[Moreau et al, Ito et al, 또는 Feng Q, et al]에 기재된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 거핵구로의 분화 시, 우리딘은 제거되고, 이에 따라 잔류 거핵구를 포함하는 증식성 세포는 사멸되고, 반면에 거핵구로부터 생성된 혈소판은 우리딘 대사 요구의 감소로 인해 지속되었다. 따라서, 예를 들어, 생체내 적용에 사용될 수 있는 인간 만능성 줄기 세포로부터 농축된 혈소판 집단이 생성되었다. 생체내 우리딘 수준은 UMPS 넉아웃 세포가 생존하거나 증식하지 못하게 할 만큼 충분히 낮았다.
실시예 12. 시험관내에서 조작된 혈소판의 생성을 위한 분할 영양요구성
UMPS 넉아웃 세포를 생성하고 본원에 기재된 방법에 따라 우리딘-함유 배지에서 배양함으로써 넉아웃 세포를 선택함으로써 우리딘 영양요구성을 갖도록 본원에 기재된 방법에 따라 유도된 만능성 줄기 세포와 같은 전구 세포를 조작하였다(예를 들어, 실시예 1 참조).
UMPS 넉아웃 세포를 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터로 형질감염시켰다. 제1 상동성 재조합 도너 벡터는 1) EF1a와 같은 항시성 프로모터의 발현 조절 서열의 전사 조절 하에 OPRT 코딩 서열(SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 인코딩하는, SEQ ID NO:4) 및 2) PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터의 발현 조절 서열의 전사 조절 하에 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하였다. 제2 상동성 재조합 도너 벡터는 1) EF1a와 같은 항시성 프로모터의 발현 조절 서열의 전사 조절 하에 ODC(SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 인코딩하는, SEQ ID NO:6) 및 2) PF4와 같은 거핵구-특이적 프로모터의 발현 조절 서열의 전사 조절 하에 제2 페이로드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하였다. 제1 및 제2 상동성 아암 벡터는 CCR5(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO:11 내지 15로부터 선택된 CCR5 좌측 및 우측 상동성 아암을 이용하여)와 같은 세이프 하버 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암을 가질 수 있다.
형질감염된 세포를 우리딘의 부재에서 배양하였다. 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터 둘 모두로 성공적으로 형질감염된 UMPS 넉아웃 세포는 우리딘 제거에서 생존한 반면, 제1 및 제2 상동성 재조합 도너 벡터 둘 모두를 성공적으로 발현하지 않은 세포는 사멸되었고, 이에 의해 UMPS의 독립적인 기능성 도메인 둘 모두를 발현하는 이중 넉인 세포를 선택하였다.
이중 넉인 세포를, 예를 들어, 문헌[Moreau et al, Ito, Y., et al, 또는 Feng, Q., et al]에 기재된 기술을 사용하여 시험관내에서 거핵구로 분화시켰다. 분화된 세포는 사용하여 UMPS의 EF1a-구동 OPRT/ODC 독립적인 기능성 도메인의 발현을 중지시켰다. 5-FOA 선택을 이용하여 임의의 잔류 만능성 세포를 제거하였다. 나머지 거핵구는 다운스트림 치료 적용에서 사용될 수 있는 혈소판을 생성하였다. 우리딘은 제거되고, 임의의 나머지 유핵화, 증식하는 거핵구 또는 다른 증식하는 세포는 사멸되어, 시험관내에서 전구 세포로부터 유래된 순수한 혈소판 집단을 남겼다.
등가물 및 범위
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 개시에 따른 구체적인 구현예에 대한 다수 등가물들을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 본 개시의 범위는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 기재된 바와 같다.
청구범위에서 부정관사 및 정관사와 같은 관사는 상반되게 나타내거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹 중 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 상반되게 나타내거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 전체가 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련이 있는 경우 만족된 것으로 간주된다. 본 개시는 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련이 있는 구현예를 포함한다. 본 개시는 하나 초과 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련이 있는 구현예를 포함한다.
또한, 용어 "~을 포함하는"은 개방형인 것으로 의도되고, 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용하지만 요구하지 않는다는 점이 주지된다. 용어 "~을 포함하는"이 본원에서 사용되는 경우, 이에 따라 용어 "~로 구성된"이 또한 포괄되고 개시된다.
범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 나타내거나 문맥 및 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 본 개시의 상이한 구현예에서 명시된 범위 내에서 임의의 특정 값 또는 하위범위, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 범위의 하한 단위의 10분의 1까지를 가정할 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 선행 기술에 속하는 본 개시의 임의의 특정 구현예는 청구범위 중 어느 하나 이상으로부터 명시적으로 제외될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 구현예는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 제외 사항이 본원에 명시적으로 기재되지 않더라도 제외될 수 있다. 본 개시의 조성물의 임의의 특정 구현예(예를 들어, 임의의 항생제, 치료 또는 활성 성분; 임의의 생산 방법; 임의의 사용 방법 등)는 선행 기술의 존재와 관련이 있는지의 여부와 관계 없이 임의의 이유로 청구항 중 어느 하나 이상으로부터 제외될 수 있다.
사용된 단어는 제한이 아니라 설명의 단어이며, 보다 광범위한 측면에서 본 개시의 진정한 범위 및 사상으로부터 벗어남 없이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 개시는 여러 기재된 구현예와 관련하여 상당히 길게 일부 구체적으로 기술되었지만, 이는 임의의 이러한 세부사항 또는 구현예 또는 임의의 구체적인 구현예로 제한되어야 하는 것으로 의도된 것이 아니고, 선행 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가능한 가장 넓은 해석을 제공하고, 이에 따라 본 개시의 의도된 범위를 효과적으로 포괄하도록 첨부된 청구범위를 참조로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Patterson, James Porteus, Matthew Wiebking, Volker <120> AUXOTROPHIC SELECTION METHODS <130> 1191573 <140> TBA <141> 2020-05-08 <150> 62/904,725 <151> 2019-09-24 <150> 62/844,930 <151> 2019-05-08 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1440 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggtcg ctcgtgcagc tttggggcca ttggtgacgg gtctgtacga cgtgcaggct 60 ttcaagtttg gggacttcgt gctgaagagc gggctttcct cccccatcta catcgatctg 120 cggggcatcg tgtctcgacc gcgtcttctg agtcaggttg cagatatttt attccaaact 180 gcccaaaatg caggcatcag ttttgacacc gtgtgtggag tgccttatac agctttgcca 240 ttggctacag ttatctgttc aaccaatcaa attccaatgc ttattagaag gaaagaaaca 300 aaggattatg gaactaagcg tcttgtagaa ggaactatta atccaggaga aacctgttta 360 atcattgaag atgttgtcac cagtggatct agtgttttgg aaactgttga ggttcttcag 420 aaggagggct tgaaggtcac tgatgccata gtgctgttgg acagagagca gggaggcaag 480 gacaagttgc aggcgcacgg gatccgcctc cactcagtgt gtacattgtc caaaatgctg 540 gagattctcg agcagcagaa aaaagttgat gctgagacag ttgggagagt gaagaggttt 600 attcaggaga atgtctttgt ggcagcgaat cataatggtt ctcccctttc tataaaggaa 660 gcacccaaag aactcagctt cggtgcacgt gcagagctgc ccaggatcca cccagttgca 720 tcgaagcttc tcaggcttat gcaaaagaag gagaccaatc tgtgtctatc tgctgatgtt 780 tcactggcca gagagctgtt gcagctagca gatgctttag gacctagtat ctgcatgctg 840 aagactcatg tagatatttt gaatgatttt actctggatg tgatgaagga gttgataact 900 ctggcaaaat gccatgagtt cttgatattt gaagaccgga agtttgcaga tataggaaac 960 acagtgaaaa agcagtatga aggaggtatc tttaaaatag cttcctgggc agatctagta 1020 aatgctcacg tggtgccagg ctcaggagtt gtgaaaggcc tgcaagaagt gggcctgcct 1080 ttgcatcggg ggtgcctcct tattgcggaa atgagctcca ccggctccct ggccactggg 1140 gactacacta gagcagcggt tagaatggct gaggagcact ctgaatttgt tgttggtttt 1200 atttctggct cccgagtaag catgaaacca gaatttcttc acttgactcc aggagttcag 1260 ttggaagcag gaggagataa tcttggccaa cagtacaata gcccacaaga agttattggc 1320 aaacgaggtt ccgatatcat cattgtaggt cgtggcataa tctcagcagc tgatcgtctg 1380 gaagcagcag agatgtacag aaaagctgct tgggaagcgt atttgagtag acttggtgtt 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Thr Asn Leu Cys Leu 245 250 255 Ser Ala Asp Val Ser Leu Ala Arg Glu Leu Leu Gln Leu Ala Asp Ala 260 265 270 Leu Gly Pro Ser Ile Cys Met Leu Lys Thr His Val Asp Ile Leu Asn 275 280 285 Asp Phe Thr Leu Asp Val Met Lys Glu Leu Ile Thr Leu Ala Lys Cys 290 295 300 His Glu Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn 305 310 315 320 Thr Val Lys Lys Gln Tyr Glu Gly Gly Ile Phe Lys Ile Ala Ser Trp 325 330 335 Ala Asp Leu Val Asn Ala His Val Val Pro Gly Ser Gly Val Val Lys 340 345 350 Gly Leu Gln Glu Val Gly Leu Pro Leu His Arg Gly Cys Leu Leu Ile 355 360 365 Ala Glu Met Ser Ser Thr Gly Ser Leu Ala Thr Gly Asp Tyr Thr Arg 370 375 380 Ala Ala Val Arg Met Ala Glu Glu His Ser Glu Phe Val Val Gly Phe 385 390 395 400 Ile Ser Gly Ser Arg Val Ser Met Lys Pro Glu Phe Leu His Leu Thr 405 410 415 Pro Gly Val Gln Leu Glu Ala Gly Gly Asp Asn Leu Gly Gln Gln Tyr 420 425 430 Asn Ser Pro Gln Glu Val Ile Gly Lys Arg Gly Ser Asp Ile Ile Ile 435 440 445 Val Gly Arg Gly Ile Ile Ser Ala Ala Asp Arg Leu 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Gly Pro Leu Val Thr Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Asp Val Gln Ala Phe Lys Phe Gly Asp Phe Val Leu Lys Ser Gly Leu 20 25 30 Ser Ser Pro Ile Tyr Ile Asp Leu Arg Gly Ile Val Ser Arg Pro Arg 35 40 45 Leu Leu Ser Gln Val Ala Asp Ile Leu Phe Gln Thr Ala Gln Asn Ala 50 55 60 Gly Ile Ser Phe Asp Thr Val Cys Gly Val Pro Tyr Thr Ala Leu Pro 65 70 75 80 Leu Ala Thr Val Ile Cys Ser Thr Asn Gln Ile Pro Met Leu Ile Arg 85 90 95 Arg Lys Glu Thr Lys Asp Tyr Gly Thr Lys Arg Leu Val Glu Gly Thr 100 105 110 Ile Asn Pro Gly Glu Thr Cys Leu Ile Ile Glu Asp Val Val Thr Ser 115 120 125 Gly Ser Ser Val Leu Glu Thr Val Glu Val Leu Gln Lys Glu Gly Leu 130 135 140 Lys Val Thr Asp Ala Ile Val Leu Leu Asp Arg Glu Gln Gly Gly Lys 145 150 155 160 Asp Lys Leu Gln Ala His Gly Ile Arg Leu His Ser Val Cys Thr Leu 165 170 175 Ser Lys Met Leu Glu Ile Leu Glu Gln Gln Lys Lys Val Asp Ala Glu 180 185 190 Thr Val Gly Arg Val Lys Arg Phe Ile Gln Glu Asn Val Phe Val Ala 195 200 205 Ala Asn His Asn Gly Ser 210 <210> 6 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cccctttcta taaaggaagc acccaaagaa ctcagcttcg gtgcacgtgc agagctgccc 60 aggatccacc cagttgcatc gaagcttctc aggcttatgc aaaagaagga gaccaatctg 120 tgtctatctg ctgatgtttc actggccaga gagctgttgc agctagcaga tgctttagga 180 cctagtatct gcatgctgaa gactcatgta gatattttga atgattttac tctggatgtg 240 atgaaggagt tgataactct ggcaaaatgc catgagttct tgatatttga agaccggaag 300 tttgcagata taggaaacac agtgaaaaag cagtatgaag gaggtatctt taaaatagct 360 tcctgggcag atctagtaaa tgctcacgtg gtgccaggct caggagttgt gaaaggcctg 420 caagaagtgg gcctgccttt gcatcggggg tgcctcctta ttgcggaaat gagctccacc 480 ggctccctgg ccactgggga ctacactaga gcagcggtta gaatggctga ggagcactct 540 gaatttgttg ttggttttat ttctggctcc cgagtaagca tgaaaccaga atttcttcac 600 ttgactccag gagttcagtt ggaagcagga ggagataatc ttggccaaca gtacaatagc 660 ccacaagaag ttattggcaa acgaggttcc gatatcatca ttgtaggtcg tggcataatc 720 tcagcagctg atcgtctgga agcagcagag atgtacagaa aagctgcttg ggaagcgtat 780 ttgagtagac ttggtgttta a 801 <210> 7 <211> 266 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Pro Leu Ser Ile Lys Glu Ala Pro Lys Glu Leu Ser Phe Gly Ala Arg 1 5 10 15 Ala Glu Leu Pro Arg Ile His Pro Val Ala Ser Lys Leu Leu Arg Leu 20 25 30 Met Gln Lys Lys Glu Thr Asn Leu Cys Leu Ser Ala Asp Val Ser Leu 35 40 45 Ala Arg Glu Leu Leu Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gly Pro Ser Ile Cys 50 55 60 Met Leu Lys Thr His Val Asp Ile Leu Asn Asp Phe Thr Leu Asp Val 65 70 75 80 Met Lys Glu Leu Ile Thr Leu Ala Lys Cys His Glu Phe Leu Ile Phe 85 90 95 Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Lys Gln Tyr 100 105 110 Glu Gly Gly Ile Phe Lys Ile Ala Ser Trp Ala Asp Leu Val Asn Ala 115 120 125 His Val Val Pro Gly Ser Gly Val Val Lys Gly Leu Gln Glu Val Gly 130 135 140 Leu Pro Leu His Arg Gly Cys Leu Leu Ile Ala Glu Met Ser Ser Thr 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ala Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Ala Ala Val Arg Met Ala 165 170 175 Glu Glu His Ser Glu Phe Val Val Gly Phe Ile Ser Gly Ser Arg Val 180 185 190 Ser Met Lys Pro Glu Phe Leu His Leu Thr Pro Gly Val Gln Leu Glu 195 200 205 Ala Gly Gly Asp Asn Leu Gly Gln Gln Tyr Asn Ser Pro Gln Glu Val 210 215 220 Ile Gly Lys Arg Gly Ser Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Ile Ile 225 230 235 240 Ser Ala Ala Asp Arg Leu Glu Ala Ala Glu Met Tyr Arg Lys Ala Ala 245 250 255 Trp Glu Ala Tyr Leu Ser Arg Leu Gly Val 260 265 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 8 ccccgcagau cgauguagau ggg 23 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 9 ggcggucgcu cgugcagcuu ugg 23 <210> 10 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 10 gccccgcaga ucgauguaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 11 <211> 802 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 11 ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag tccccagcca 60 cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat gatccaggct gcagtgagcc 120 atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct cacaacaaca 180 acagcaacaa aaaggctgag ctgcaccatg cttgacccag tttcttaaaa ttgttgtcaa 240 agcttcattc actccatggt gctatagagc acaagatttt atttggtgag atggtgcttt 300 catgaattcc cccaacagag ccaagctctc catctagtgg acagggaagc tagcagcaaa 360 ccttcccttc actacaaaac ttcattgctt ggccaaaaag agagttaatt caatgtagac 420 atctatgtag gcaattaaaa acctattgat gtataaaaca gtttgcattc atggagggca 480 actaaataca ttctaggact ttataaaaga tcacttttta tttatgcaca gggtggaaca 540 agatggatta tcaagtgtca agtccaatct atgacatcaa ttattataca tcggagccct 600 gccaaaaaat caatgtgaag caaatcgcag cccgcctcct gcctccgctc tactcactgg 660 tgttcatctt tggttttgtg ggcaacatgc tggtcatcct catcctgata aactgcaaaa 720 ggctgaagag catgactgac atctacctgc tcaacctggc catctctgac ctgtttttcc 780 ttcttactgt ccccttctct ag 802 <210> 12 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 12 tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac tttggaaata caatgtgtca actcttgaca 60 gggctctatt ttataggctt cttctctgga atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat 120 aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg 180 gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc 240 tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat tacacctgca gctctcattt tccatacagt 300 cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg 360 ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga 420 aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt 480 ctcttctggg ctccctacaa cattgtcctt ctcctgaaca ccttccagga attctttggc 540 ctgaataatt gcagtagctc taacaggttg gaccaagcta tgcaggtgac agagactctt 600 gggatgacgc actgctgcat caaccccatc atctatgcct ttgtcgggga gaagttcaga 660 aactacctct tagtcttctt ccaaaagcac attgccaaac gcttctgcaa atgctgttct 720 attttccagc aagaggctcc cgagcgagca agctcagttt acacccgatc cactggggag 780 caggaaatat ctgtgggctt 800 <210> 13 <211> 797 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 13 ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag tccccagcca 60 cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat gatccaggct gcagtgagcc 120 atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct cacaacaaca 180 acagcaacaa aaaggctgag ctgcaccatg cttgacccag tttcttaaaa ttgttgtcaa 240 agcttcattc actccatggt gctatagagc acaagatttt atttggtgag atggtgcttt 300 catgaattcc cccaacagag ccaagctctc catctagtgg acagggaagc tagcagcaaa 360 ccttcccttc actacaaaac ttcattgctt ggccaaaaag agagttaatt caatgtagac 420 atctatgtag gcaattaaaa acctattgat gtataaaaca gtttgcattc atggagggca 480 actaaataca ttctaggact ttataaaaga tcacttttta tttatgcaca gggtggaaca 540 agatggatta tcaagtgtca agtccaatct atgacatcaa ttattataca tcggagccct 600 gccaaaaaat caatgtgaag caaatcgcag cccgcctcct gcctccgctc tactcactgg 660 tgttcatctt tggttttgtg ggcaacatgc tggtcatcct catcctgata aactgcaaaa 720 ggctgaagag catgactgac atctacctgc tcaacctggc catctctgac ctgtttttcc 780 ttcttactgt ccccttc 797 <210> 14 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 14 cattcactcc atggtgctat agagcacaag attttatttg gtgagatggt gctttcatga 60 attcccccaa cagagccaag ctctccatct agtggacagg gaagctagca gcaaaccttc 120 ccttcactac aaaacttcat tgcttggcca aaaagagagt taattcaatg tagacatcta 180 tgtaggcaat taaaaaccta ttgatgtata aaacagtttg cattcatgga gggcaactaa 240 atacattcta ggactttata aaagatcact ttttatttat gcacagggtg gaacaagatg 300 gattatcaag tgtcaagtcc aatctatgac atcaattatt atacatcgga gccctgccaa 360 aaaatcaatg tgaagcaaat cgcagcccgc ctcctgcctc cgctctactc actggtgttc 420 atctttggtt ttgtgggcaa catgctggtc atcctcatcc tgataaactg caaaaggctg 480 aagagcatga ctgacatcta cctgctcaac ctggccatct ctgacctgtt tttccttctt 540 actgtcccct tc 552 <210> 15 <211> 541 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 15 tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac tttggaaata caatgtgtca actcttgaca 60 gggctctatt ttataggctt cttctctgga atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat 120 aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg 180 gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc 240 tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat tacacctgca gctctcattt tccatacagt 300 cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg 360 ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga 420 aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt 480 ctcttctggg ctccctacaa cattgtcctt ctcctgaaca ccttccagga attctttggc 540 c 541 <210> 16 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 16 tcgcccctca aacaaatgcc ccgcagccca tttctccacc ctcatttgat gaccgcagat 60 tcaagtgttt tgttaagtaa agtcctgggt gacctggggt cacagggtgc cccacgctgc 120 ctgcctctgg gcgaacaccc catcacgccc ggaggagggc gtggctgcct gcctgagtgg 180 gccagacccc tgtcgccagg cctcacggca gctccatagt caggagatgg ggaagatgct 240 ggggacaggc cctggggaga agtactggga tcacctgttc aggctcccac tgtgacgctg 300 ccccggggcg ggggaaggag gtgggacatg tgggcgttgg ggcctgtagg tccacaccca 360 gtgtgggtga ccctccctct aacctgggtc cagcccggct ggagatgggt gggagtgcga 420 cctagggctg gcgggcaggc gggcactgtg tctccctgac tgtgtcctcc tgtgtccctc 480 tgcctcgccg ctgttccgga acctgctctg cgcggcacgt cctggcagtg gggcaggtgg 540 agctgggcgg gggccctggt gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc 600 <210> 17 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 17 agaagagagg catcgtggag cagtgttgca ctagtatatg tagtctgtat cagttggaaa 60 attattgtaa ctag 74 <210> 18 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 18 agaagcgtgg cattgtggaa caatgctgta ccagcatctg ctccctctac cagctggaga 60 actactgcaa ctagacgcag cccgcaggca gccccacacc cgccgcctcc tgcaccgaga 120 gagatggaat aaagcccttg aaccagccct gctgtgccgt ctgtgtgtct tgggggccct 180 gggccaagcc ccacttcccg gcactgttgt gagcccctcc cagctctctc cacgctctct 240 gggtgcccac aggtgccaac gccggccagg cccagcatgc agtggctctc cccaaagcgg 300 ccatgcctgt cggctgcctg ctgcccccac cctgtggctc agggtccagt atgggagctg 360 cgggggtctc tgaggggcca ggggtggtgg ggccactgag aagtgacttc ttgttcagta 420 gctctggact cttggagtcc ccagagacct tgttcaggaa agggaatgag aacattccag 480 caattttccc cccacctagc cctcccaggt tctattttta gagttatttc tgatggagtc 540 cctgtggagg gaggaggctg ggctgaggga gggggtcctg cagggcgggg ggctgggaag 600 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 19 gagggcaggg gcagcctgct gacctgcggc gacgtggagg agaaccccgg cccc 54 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 20 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 21 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 21 cgcaagcgcc gcagcggcag cggcgagggc cgcggcagcc tgctgacctg cggcgacgtg 60 gaggagaacc ccggccccaa gctt 84 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 22 Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr 1 5 10 15 Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Lys Leu 20 25 <210> 23 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 23 ggaagcggag aaggcagagg aagcctgctc acctgcggcg atgttgaaga aaacccgggt 60 cct 63 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 24 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 25 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 26 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 27 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 28 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 29 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 30 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 31 <211> 1188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 31 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag ccgccacc 1188 <210> 32 <211> 1193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 32 tctagggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 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ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt 540 ggttttcctt tgaagaacac gatgataata tggccacaac catgactagt gccacc 596 <210> 34 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Construct <400> 34 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac 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agagaaggtg 900 gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg 960 gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc 1020 cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta 1080 tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctgcag tacgtgattc ttgatcccga 1140 gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gaggccttgc gcttaaggag ccccttcgcc 1200 tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa tctggtggca 1260 ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt tttgatgacc 1320 tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccaag atctgcacac 1380 tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg 1440 ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt agtctcaagc 1500 tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc 1560 aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc 1620 tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac 1680 acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca 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ttgggagagt 2580 gaagaggttt attcaggaga atgtctttgt ggcagcgaat cataatggtt ctgagggcag 2640 gggcagcctg ctgacctgcg gcgacgtgga ggagaacccc ggccccatgg tgagcaaggg 2700 cgaggaggat aacatggcca tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg 2760 ctccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg 2820 cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat 2880 cctgtcccct cagttcatgt acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc 2940 cgactacttg aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga 3000 ggacggcggc gtggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta 3060 caaggtgaag ctgcgcggca ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac 3120 catgggctgg gaggcctcct ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga 3180 gatcaagcag aggctgaagc tgaaggacgg cggccactac gacgctgagg tcaagaccac 3240 ctacaaggcc aagaagcccg tgcagctgcc cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga 3300 catcacctcc cacaacgagg actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg 3360 ccactccacc ggcggcatgg acgagctgta caagtaactc gagggcgcgc 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tttccttctt 540 actgtcccct tctctagggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 600 tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 660 gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 720 aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca 780 gaacacaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 840 cttgcgtgcc tcgaattact tccacctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 900 gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 960 cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 1020 gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 1080 cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 1140 tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 1200 cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 1260 ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 1320 tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 1380 ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 1440 ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 1500 cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 1560 aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 1620 cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 1680 ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgagccg 1740 ccaccatgcc cccccccagg ctgctgttct tcctgctgtt cctgaccccc atggaggtga 1800 ggcccgagga gcccctggtg gtgaaggtgg aggagggcga caacgccgtg ctgcagtgcc 1860 tgaagggcac cagcgacggc cccacccagc agctgacctg gagcagggag agccccctga 1920 agcccttcct gaagctgagc ctgggcctgc ccggcctggg catccacatg aggcccctgg 1980 ccatctggct gttcatcttc aacgtgagcc agcagatggg cggcttctac ctgtgccagc 2040 ccggcccccc cagcgagaag gcctggcagc ccggctggac cgtgaacgtg gagggcagcg 2100 gcgagctgtt caggtggaac gtgagcgacc tgggcggcct gggctgcggc ctgaagaaca 2160 ggagcagcga gggccccagc agccccagcg gcaagctgat gagccccaag ctgtacgtgt 2220 gggccaagga caggcccgag atctgggagg gcgagccccc ctgcctgccc cccagggaca 2280 gcctgaacca gagcctgagc caggacctga ccatggcccc cggcagcacc ctgtggctga 2340 gctgcggcgt gccccccgac agcgtgagca ggggccccct gagctggacc cacgtgcacc 2400 ccaagggccc caagagcctg ctgagcctgg agctgaagga cgacaggccc gccagggaca 2460 tgtgggtgat ggagaccggc ctgctgctgc ccagggccac cgcccaggac gccggcaagt 2520 actactgcca caggggcaac ctgaccatga gcttccacct ggagatcacc gccaggcccg 2580 tgctgtggca ctggctgctg aggaccggcg gctggaaggt gagcgccgtg accctggcct 2640 acctgatctt ctgcctgtgc agcctggtgg gcatcctgca cctgcagagg gccctggtgc 2700 tgaggaggaa gaggaagagg atgaccgacc ccaccaggag gttccgcaag cgccgcagcg 2760 gcagcggcga gggccgcggc agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggcc 2820 ccaagcttcc cctttctata aaggaagcac ccaaagaact cagcttcggt gcacgtgcag 2880 agctgcccag gatccaccca gttgcatcga agcttctcag gcttatgcaa aagaaggaga 2940 ccaatctgtg tctatctgct gatgtttcac tggccagaga gctgttgcag ctagcagatg 3000 ctttaggacc tagtatctgc atgctgaaga ctcatgtaga tattttgaat gattttactc 3060 tggatgtgat gaaggagttg ataactctgg caaaatgcca tgagttcttg atatttgaag 3120 accggaagtt tgcagatata ggaaacacag tgaaaaagca gtatgaagga ggtatcttta 3180 aaatagcttc ctgggcagat ctagtaaatg ctcacgtggt gccaggctca ggagttgtga 3240 aaggcctgca agaagtgggc ctgcctttgc atcgggggtg cctccttatt gcggaaatga 3300 gctccaccgg ctccctggcc actggggact acactagagc agcggttaga atggctgagg 3360 agcactctga atttgttgtt ggttttattt ctggctcccg agtaagcatg aaaccagaat 3420 ttcttcactt gactccagga gttcagttgg aagcaggagg agataatctt ggccaacagt 3480 acaatagccc acaagaagtt attggcaaac gaggttccga tatcatcatt gtaggtcgtg 3540 gcataatctc agcagctgat cgtctggaag cagcagagat gtacagaaaa gctgcttggg 3600 aagcgtattt gagtagactt ggtgtttaac tcgagggcgc gccccgctga tcagcctcga 3660 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 3720 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 3780 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 3840 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tagttgggct cactatgctg 3900 ccgcccagtg ggactttgga aatacaatgt gtcaactctt gacagggctc tattttatag 3960 gcttcttctc tggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat cgataggtac ctggctgtcg 4020 tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt tggggtggtg acaagtgtga 4080 tcacttgggt ggtggctgtg tttgcgtctc tcccaggaat catctttacc agatctcaaa 4140 aagaaggtct tcattacacc tgcagctctc attttccata cagtcagtat caattctgga 4200 agaatttcca gacattaaag atagtcatct tggggctggt cctgccgctg cttgtcatgg 4260 tcatctgcta ctcgggaatc ctaaaaactc tgcttcggtg tcgaaatgag aagaagaggc 4320 acagggctgt gaggcttatc ttcaccatca tgattgttta ttttctcttc tgggctccct 4380 acaacattgt ccttctcctg aacaccttcc aggaattctt tggcc 4425

Claims (170)

  1. 분화된 세포 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 유전자의 프로모터의 비필수 부분을 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계;
    (b) 조직-특이적 프로모터 및 상기 유전자의 적어도 일부를 포함하는 작제물을 상동성 재조합에 의해 이중대립유전자적(biallelically)으로 삽입하여 전구 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계로서, 상기 유전자는 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는 단계;
    (c) 영양요구 인자와 상기 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계;
    (d) 조직-특이적 프로모터와 관련된 조직으로의 상기 전구 세포의 분화를 자극하는 단계로서, 상기 유전자는 분화에 반응하여 발현되는 단계; 및
    (e) 영양요구 인자를 제거하고, 이에 의해 분화된 세포를 선택하여 분화된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 전구 세포를 5-FOA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자가 UMPS 유전자인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 조직-특이적 프로모터가 UMPS 유전자의 프로모터를 대체하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 인자가 우라실 또는 우라실의 공급원인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물이 분화에 반응하여 발현되는 치료 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, UMPS 유전자의 적어도 일부를 갖는 카세트로서 치료 인자를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물이 폴리시스트론성인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 작제물이 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 포함하는, 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, UMPS 유전자의 적어도 일부가 상동성 아암(arm)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 전구 세포가 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포, 심근세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포 집단이 면역 세포를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 프로모터가 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서(silencer); CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린(Ankyrin)-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴(Dectin)-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE 조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE 조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중(heavy) 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물이 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅되는, 방법.
  17. 분화된 세포 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 전구 세포 특이적 miRNA 표적 부위를 인코딩하는 DNA 서열과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, DNA 서열은 영양요구 유도성 유전자 내로 넉인(knocked into)되어 전구 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되게 하며, miRNA 표적 부위에 결합하는 전구 세포 특이적 miRNA가 전구 세포에서 발현되는 단계;
    (b) 영양요구 인자와 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계;
    (c) 전구 세포의 분화를 자극하는 단계로서, 여기서 분화가 전구 세포 특이적 miRNA의 발현을 억제하고, 유전자의 발현을 활성화시키는 단계; 및
    (d) 영양요구 인자를 제거하고, 이에 의해 분화된 세포를 선택하여 분화된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 복수의 전구 세포를 5-FOA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)이고, 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위는 UMPS 유전자로부터 전사된 mRNA 전사체에 존재하는, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 전구 세포 특이적 miRNA 표적 부위가 영양요구 유도성 유전자로부터 전사된 전사체의 3' 비번역 영역(UTR)에 있는, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 인자가 우라실 또는 우라실의 공급원인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 인자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 작제물을 전구 세포의 유전체 내로 삽입하는 단계로서, 여기서 치료 인자의 발현은 영양요구 유도성 유전자의 발현을 제어하는 프로모터와 동일한 프로모터에 의해 제어되고, 분화된 세포는 치료 인자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자와 프레임 내 카세트로서 치료 인자를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 카세트가 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 전구 세포-특이적 miRNA 표적 부위를 인코딩하는 DNA 서열이 영양요구 유도성 유전자를 표적화하는 상동성 아암을 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 전구 세포가 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포, 심근세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 전구 세포의 분화 자극이 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 조직 및 혈관 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 또는 조직 유형의 분화된 세포를 생성하는, 방법.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포 집단이 면역 세포를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅되는, 방법.
  32. 제13항, 제14항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법.
  33. 분화시 영양요구 인자를 생성함으로써 영양요구성을 완화시키는 방법으로서,
    (a) 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃(knockout)에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 영양요구 유도성 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 작제물을 조직 특이전 유전자좌에 삽입하는 단계로서, 조직-특이적 유전자의 발현이 방해되지 않으며, 이에 의해 조직 특이전 유전자좌와 관련된 조직으로의 전구 세포의 분화시 영양요구 인자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 전구 세포가 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)로부터 선택되는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 유전자가 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 유전자가 우리딘 모노포스페이트 신세타제(UMPS)인, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물이 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 유전자좌가 인슐린 유전자좌인, 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 영양요구성 전구 세포를 면역 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포인, 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 유전자가 삽입 단계 동안 대체되지 않는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 전구 세포의 분화 시 인슐린을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅되는, 방법.
  44. 플라스미드 통합 또는 에피솜 발현이 있는 세포를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 세포에 영양요구성 유발 유전자의 넉아웃을 제공하여 복수의 세포에서 영양요구성을 발생시키는 단계로서, 영양요구성을 갖는 복수의 세포를 복수의 세포에 영양요구 인자를 제공하는 배지에서 성장시키는 단계;
    (b) 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 전달 시스템으로 복수의 세포를 형질감염시키는 단계로서, 전달 시스템이 영양요구 인자를 발현하는 단계; 및
    (c) 배지를 제거하고, 이에 의해 플라스미드 통합 또는 에피솜 발현이 있는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 전달 시스템이 적어도 하나의 트랜스진(transgene)을 발현하는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 유전자가 AACS, AADAT, AASDHPPT, AASS, ACAT1, ACCS, ACCSL, ACO1, ACO2, ACSS3, ADSL, ADSS, ADSSL1, ALAD, ALAS1, ALAS2, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2, AMD1, ASL, ASS1, ATF4, ATF5, AZIN1, AZIN2, BCAT1, BCAT2, CAD, CBS, CBSL, CCBL1, CCBL2, CCS, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPE, CEBPG, CH25H, COQ6, CPS1, CTH, CYP51A1, DECR1, DHFR, DHFRL1, DHODH, DHRS7, DHRS7B, DHRS7C, DPYD, DUT, ETFDH, FAXDC2, FDFT1, FDPS, FDXR, FH, FPGS, G6PD, GCAT, GCH1, GCLC, GFPT1, GFPT2, GLRX5, GLUL, GMPS, GPT, GPT2, GSX2, H6PD, HAAO, HLCS, HMBS, HMGCL, HMGCLL1, HMGCS1, HMGCS2, HOXA1, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB13, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HRSP12, HSD11B1, HSD11B1L, HSD17B12, HSD17B3, HSD17B7, HSD17B7P2, HSDL1, HSDL2, IBA57, IDO1, IDO2, IL4I1, ILVBL, IP6K1, IP6K2, IP6K3, IPMK, IREB2, ISCA1, ISCA1P1, ISCA2, KATNA1, KATNAL1, KATNAL2, KDM1B, KDSR, KMO, KYNU, LGSN, LSS, MARS, MARS2, MAX, MITF, MLX, MMS19, MPC1, MPC1L, MPI, MSMO1, MTHFD1, MTHFD1L, MTHFD2, MTHFD2L, MTHFR, MTRR, MVK, MYB, MYBL1, MYBL2, NAGS, ODC1, OTC, PAICS, PAOX, PAPSS1, PAPSS2, PDHB, PDX1, PFAS, PIN1, PLCB1, PLCB2, PLCB3, PLCB4, PLCD1, PLCD3, PLCD4, PLCE1, PLCG1, PLCG2, PLCH1, PLCH2, PLCL1, PLCL2, PLCZ1, PM20D1, PPAT, PSAT1, PSPH, PYCR1, PYCR2, QPRT, RDH8, RPUSD2, SCD, SCD5, SLC25A19, SLC25A26, SLC25A34, SLC25A35, SLC7A10, SLC7A11, SLC7A13, SLC7A5, SLC7A6, SLC7A7, SLC7A8, SLC7A9, SMOX, SMS, SNAPC4, SOD1, SOD3, SQLE, SRM, TAT, TFE3, TFEB, TFEC, THNSL1, THNSL2, TKT, TKTL1, TKTL2, UMPS, UROD, UROS, USF1, USF2, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS4A 및 VPS4B로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치로 태깅되는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 물질을 포함하는 키트.
  49. 분화된 세포 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 영양요구 유도성 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계로서, 영양요구 유도성 유전자는 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는, 단계;
    (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물은 제1 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제1의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 제2 조직-특이적 프로모터 및 영양요구 유도성 유전자의 제2의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하는, 단계;
    (c) 영양요구 인자와 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계;
    (d) 제1 및 제2 조직-특이적 프로모터를 발현하는 세포 유형 또는 조직으로 전구 세포의 분화를 자극하는 단계로서, 제1 및 제2 상동성 재조합 작제물이 분화된 세포에서 발현되는 단계; 및
    (e) 영양요구 인자를 제거함으로써 분화된 세포를 선택하고, 이에 의해 분화된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 추가로
    제3의 독립적인 기능성 도메인; 제3 및 제4의 독립적인 기능성 도메인; 또는 제3, 제4 및 제5의 독립적인 기능성 도메인을 포함하며;
    상기 방법은 제3의 조직-특이적 프로모터 및 제3의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하는 제3의 상동성 재조합 작제물; 제3 및 제4 조직-특이적 프로모터 및 제3 및 제4의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하는 제3 및 제4의 상동성 재조합 작제물; 또는 제3, 제4 및 제5 조직-특이적 프로모터 및 제3, 제4 및 제5의 독립적인 기능성 도메인의 적어도 일부를 포함하는 제3, 제4 및 제5의 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 각각 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며;
    여기서 세포 유형 또는 조직은 제3, 제3 및 제4, 또는 제3, 제4 및 제5 조직-특이적 프로모터를 각각 발현하며, 제3, 제3 및 제4, 또는 제3, 제4 및 제5 상동성 재조합 작제물은 분화된 세포에서 모두 발현되는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함하는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함하는, 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 전구 세포를 5-FOA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상이 세이프 하버 유전자좌에 삽입되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5인, 방법.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 인자가 우리딘인, 방법.
  57. 제49항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상이 치료 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상이 폴리시스트론성인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 폴리시스트론 작제물 중 하나 이상이 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 포함하는, 방법.
  60. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 전구 세포가 조혈 줄기 세포(HSC), 배아 줄기 세포, 전환분화된 줄기 세포, 신경 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 조골세포, 심근세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유형 또는 조직이 지방 조직, 부신, 복수, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 자궁경부, 결합 조직, 귀, 배아 조직, 식도, 눈, 심장, 조혈 조직, 장, 신장, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 유선, 입, 근육, 신경, 난소, 췌장, 부갑상선, 인두, 뇌하수체, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 편도선, 기관, 탯줄, 자궁, 내분비선, 신경 및 혈관으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포가 면역 세포인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  64. 제49항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 조직-특이적 프로모터가 WAS 근위 프로모터; CD4 미니-프로모터/인핸서; CD2 유전자좌 제어 영역; CD4 최소 프로모터 및 근위 인핸서 및 사일런서; CD4 미니-프로모터/인핸서; LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS2; HS-40, GATA-1, ARE 및 인트론 8 인핸서와 조합되거나 조합되지 않은 앙키린-1 및 α-스펙트린 프로모터; 앙키린-1 프로모터/β-글로빈 HS-40 인핸서; 레트로바이러스 LTR 내의 GATA-1 인핸서 HS1 내지 HS2; 하이브리드 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/β-액틴 프로모터; MCH II-특이적 HLA-DR 프로모터; 파신 프로모터(pFascin); 덱틴-2 유전자 프로모터; DC-STAMP로부터의 5' 비번역된 영역; 중쇄 인트론 인핸서(Eμ) 및 매트릭스 부착 영역; CD19 프로모터; 하이브리드 면역글로불린 프로모터(Igk 프로모터, 인트론 인핸서 및 Ig 유전자의 3' 인핸서); CD68L 프로모터 및 제1 인트론; 당단백질 Ibα 프로모터; 아포지단백질 E(Apo E) 인핸서/알파1-항트립신(hAAT) 프로모터(ApoE/hAAT); HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; 알부민 프로모터; HAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; 알부민 및 hAAT 프로모터/α1-마이크로글로불린 및 프로트롬빈 인핸서; HAAT 프로모터/Apo E 유전자좌 제어 영역; hAAT 프로모터/Apo E 인핸서의 4개 복사체; TBG 프로모터(갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터 및 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서); DC172 프로모터(α1-항트립신 프로모터 및 α1-마이크로글로불린 인핸서); LCAT, kLSP-IVS, ApoE/hAAT 및 간-지방산-결합 단백질 프로모터; RU486-반응성 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 크레아틴 키나제 프로모터; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 크레아틴 키나제 프로모터; α-마이오신 및 크레아틴 키나제(MHCK7)의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; α-마이오신 및 크레아틴 키나제의 하이브리드 인핸서/프로모터 영역; 합성 근육-특이적 프로모터 C5-12; 심장 트로포닌-I 근위 프로모터; E-셀렉틴 및 KDR 프로모터; 프리프로-엔도텔린-1 프로모터; KDR 프로모터/저산소-반응 요소; Flt-1 프로모터; Flt-1 프로모터; ICAM-2 프로모터; 합성 내피 프로모터; 엔도텔린-1 유전자 프로모터; 아밀라제 프로모터; 인슐린 및 인간 pdx-1 프로모터; TRE-조절된 인슐린 프로모터; 에놀라제 프로모터; 에놀라제 프로모터; TRE-조절된 시냅신 프로모터; 시냅신 1 프로모터; PDGF-β 프로모터/CMV 인핸서; CMV 인핸서와 조합된 PDGF-β, 시냅신, 튜불린-α 및 Ca2+/칼모듈린-PK2 프로모터; 포스페이트-활성화된 글루타미나제 및 소포성 글루타메이트 수송체-1 프로모터; 글루탐산 데카르복실라제-67 프로모터; 티로신 하이드록실라제 프로모터; 뉴로필라멘트 중 유전자 프로모터; 인간 레드 옵신 프로모터; 케라틴-18 프로모터; 케라틴-14(K14) 프로모터; 및 케라틴-5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제49항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 재조합 작제물 중 하나 이상이 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제62항 또는 제63항의 면역 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하는 방법.
  67. 영양요구성을 완화시키는 방법으로서,
    (a) 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운에 의해 생성된 복수의 영양요구성 전구 세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 제1의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제1 작제물을 제1 조직-특이적 유전자좌 내로 영양요구성 전구 세포의 유전체에 삽입하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제2 작제물을 제2 조직-특이적 유전자좌 내로 삽입하는 단계로서, 제1 및 제2 유전자좌에서 조직-특이적 유전자의 발현이 방해되지 않으며, 이에 의해 제1 및 제2 유전자좌에서 제1 및 제2 조직-특이적 유전자를 발현하는 세포 유형 또는 조직으로 전구 세포의 분화시 영양요구성을 완화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 추가로
    제3의 독립적인 기능성 도메인; 제3 및 제4의 독립적인 기능성 도메인; 또는 제3, 제4 및 제5의 독립적인 기능성 도메인을 포함하며;
    방법은 영양요구성 전구 세포의 유전체에 제3의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제3 작제물; 제3의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제3 작제물 및 제4의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제4 작제물; 또는 제3의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제3 작제물, 제4의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제4 작제물 및 제5의 독립적인 기능성 도메인의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 제5 작제물을 각각 삽입하는 단계를 추가로 포함하며;
    여기서 세포 유형 또는 조직은 제3, 제3 및 제4, 또는 제3, 제4 및 제5의 조직-특이적 유전자를 각각 발현하며, 제3, 제3 및 제4, 또는 제3, 제4 및 제5 작제물은 분화된 세포에서 모두 발현되는, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 전구 세포가 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)인, 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함하는, 방법.
  71. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함하는, 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물 중 하나 이상이 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 펩티드 2A 서열(P2A)을 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 유전자좌가 인슐린 유전자좌인, 방법.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 영양요구성 전구 세포를 면역 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포인, 방법.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 조직-특이적 유전자가 삽입 단계 동안 대체되지 않는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 전구 세포의 분화 시 인슐린을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 작제물 중 하나 이상이 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  79. 적어도 제1 외인성 유전자 및 제2 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 방법으로서, 방법은
    (a) 복수의 세포에 적어도 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 포함하는 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃 또는 넉다운을 제공하여 복수의 세포에서 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 단계;
    (b) 영양요구 인자를 제공하는 배지에서 복수의 세포를 성장시키는 단계;
    (c) 복수의 세포를 제1 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 전달 시스템, 및 제2 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 전달 시스템으로 형질감염시키는 단계; 및
    (d) 영양요구 인자가 결여된 배지로 배지를 교체하고, 이에 의해 제1 및 제2 외인성 유전자가 기능적으로 통합된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 추가로
    제3의 독립적인 기능성 도메인; 제3 및 제4의 독립적인 기능성 도메인; 또는 제3, 제4 및 제5의 독립적인 기능성 도메인을 포함하며;
    방법은 복수의 세포를 제3 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제3의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전달 시스템; 제3 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제3의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전달 시스템, 및 제4 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제4의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 전달 시스템; 또는 제3 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제3의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 전달 시스템, 제4 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제4의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 전달 시스템, 및 제5 외인성 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제5의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제5의 전달 시스템으로 각각 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있에서, 전달 시스템 중 하나 이상이 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 또는 나노입자를 포함하는, 방법.
  82. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 우리딘 모노포스페이트 신타제(UMPS)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 오로테이트 포스포리보실트랜스페라제(OPRT)를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제(ODC)를 포함하는, 방법.
  83. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 카르바모일-포스페이트 신세타제 2, 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제 및 디하이드로오로타제(CAD)이고, 제1의 독립적인 기능성 도메인은 카르바모일-포스페이트 신세타제 2를 포함하고, 제2의 독립적인 기능성 도메인은 아스파르테이트 트랜스카르바밀라제를 포함하고, 제3의 독립적인 기능성 도메인은 디하이드로오로타제를 포함하는, 방법.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 시스템 중 하나 이상이 조건부 탈안정화 도메인 또는 조건부 리보자임 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  85. 성숙한 인간 베타 세포 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계;
    (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물이 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 인슐린 의존적 발현 제어 서열 또는 인슐린을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 Nkx6.1 의존적 발현 제어 서열 또는 Nkx6.1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 인슐린 및 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는 단계;
    (c) 복수의 전구 세포를 우리딘과 접촉시키는 단계;
    (d) 성숙한 베타 세포로의 복수의 전구 세포의 분화를 자극하는 단계; 및
    (e) 우리딘을 제거함으로써 인슐린 및 Nkx6.1 둘 모두를 발현하는 성숙한 베타 세포를 선택하고, 이에 의해 성숙한 인간 베타 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 제85항의 성숙한 인간 베타 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 유형 1 당뇨병을 완화시키는 방법.
  87. 시험관내 분화된 전구 세포 집단으로부터 선택된 성숙한 인간 베타 세포로서, 성숙한 인간 베타 세포는 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함하는 성숙한 인간 베타 세포.
  88. 제87항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 UMPS이며, 영양요구 인자가 우리딘이며, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 하나 이상의 트랜스진은 인슐린 또는 인슐린-의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 Nkx6.1 또는 Nkx6.1-의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 성숙한 인간 베타 세포.
  89. 인간 심근세포의 하위집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계;
    (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물이 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 TBX5 의존적 발현 제어 서열 또는 TBX5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 NKX2-5 의존적 발현 제어 서열 또는 NKX2-5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, TBX5 및 NKX2-5 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는 단계;
    (c) 복수의 전구 세포를 우리딘과 접촉시키는 단계;
    (d) 복수의 전구 세포의 심근세포로의 분화를 자극하는 단계; 및
    (e) 우리딘을 제거함으로써 TBX5 및 NKX2-5 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 심근세포의 하위집단을 선택하고, 이에 의해 인간 심근세포의 하위집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서,
    (a) TBX5 및 NKX2-5 둘 모두를 발현하는 세포가 심실 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타내며;
    (b) TBX5를 발현하나, NKX2-5는 발현하지 않는 세포는 결절성 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타내며;
    (c) TBX5를 발현하지 않으나 NKX2-5는 발현하는 세포는 심방 심근세포를 포함하는 하위집단을 나타내며;
    (d) TBX5 또는 NKX2-5 어느 것도 발현하지 않는 세포는 내피 세포를 나타내는, 방법.
  91. 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함하는 시험관내 분화된 심근세포의 집단으로부터 선택되는 심근세포.
  92. 제91항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 UMPS이며, 영양요구 인자는 우리딘이며, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 하나 이상의 트랜스진은 TBX5 또는 TBX5 의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 NKX2-5 또는 NKX2-5-의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 심근세포.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 심근세포가 제1 심장장 계통 세포, 심실 심근세포, 심장외막 계통 세포, 결절 심근세포, 제2 심장장 계통 세포 및 심방 심근세포로 구성된 군으로부터 선택된 심근세포의 하위집단에 속하는, 심근세포.
  94. 시험관내 약물 테스트 방법에서 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항의 심근세포의 용도.
  95. 안정한 T reg 세포의 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 인간 UMPS 유전자의 일부를 이중대립유전자적으로 표적화하는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템과 복수의 전구 세포를 접촉시켜 전구 세포가 우리딘에 대해 영양요구성이 되게 하는 단계;
    (b) 제1 상동성 재조합 작제물 및 제2 상동성 재조합 작제물과 복수의 전구 세포를 접촉시키는 단계로서, 제1 상동성 재조합 작제물이 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 FOXP3 의존적 발현 제어 서열 또는 FOXP3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 상동성 재조합 작제물은 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인에 작동가능하게 연결된 세포 순수성(
    Figure pct00014
    )-관련 프로모터의 발현 제어 서열 또는 세포 순수성-관련 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되며, 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 및 FOXP3 둘 모두를 발현하는 전구 세포에서만 발현되는, 단계;
    (c) 복수의 전구 세포를 우리딘과 접촉시키는 단계;
    (d) 안정한 T reg 세포로의 복수의 전구 세포의 분화를 자극하는 단계; 및
    (e) 우리딘을 제거함으로써 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 및 FOXP3 둘 모두를 발현하는 안정한 T reg 세포를 선택하고, 이에 의해 안정한 T reg 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 세포 순수성-관련 프로모터가 PTPRC 또는 CCR7과 관련된 프로모터인, 방법.
  97. 제95항 또는 제96항의 방법에 의해 생성된 안정한 T reg 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 완화시키는 방법으로서, 질병, 장애 또는 질환이 면역 질환 또는 암을 포함하는, 방법.
  98. 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법에서 제95항 또는 제96항의 방법에 의해 생성된 안정한 T reg 세포의 용도로서, 질병, 장애 또는 질환은 면역 질환 또는 암을 포함하는, 용도.
  99. 영양요구 유도성 유전자의 하나 이상의 독립적인 기능성 도메인 또는 영양요구 유도성 유전자를 재발현하는 하나 이상의 트랜스진 및 영양요구 인자에 대한 영양요구성을 발생시키는 영양요구 유도성 유전자의 이중대립유전자적 유전자 변형을 포함하는 T reg 세포의 집단으로부터 선택되는, 안정한 T reg 세포 집단.
  100. 제99항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 UMPS이고, 영양요구 인자는 우리딘이고, 독립적인 기능성 도메인은 OPRT 및 ODC로부터 선택되고, 하나 이상의 트랜스진은 FOXP3 또는 FOXP3-의존적 발현 제어 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 세포 순수성-관련 프로모터와 관련된 유전자 또는 세포 순수성-관련 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 선택적으로 세포 순수성-관련 프로모터는 PTPRC 또는 CCR7과 관련된 프로모터인, 안정한 T reg 세포 집단.
  101. 제1 및 제2 발현 카세트가 혼입된 세포 집단을 생성하는 방법으로서, 방법은
    (a) 우리딘의 존재하에 우리딘에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포를 배양하는 단계;
    (b) 복수의 세포를 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물과 접촉시키는 단계로서,
    제1 발현 작제물은 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하며,
    제2 발현 작제물은 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트 및 UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 발현 카세트를 포함하는, 단계; 및
    (c) 복수의 세포로부터 우리딘을 제거하고, 이에 의해 제1 및 제2 발현 카세트가 혼입된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 제1 발현 작제물이 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물인, 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 제2 발현 작제물이 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물인, 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 특정 유전자좌가 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5인, 방법.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 우리딘에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포가 UMPS 넉아웃 세포를 포함하는, 방법.
  107. 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포가 전구 세포로부터 유래되는, 방법.
  108. 제101항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  109. 제101항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  110. 제101항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  111. 제101항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, UMPS의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  112. 제101항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, UMPS의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  113. 제101항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, UMPS의 제1 및 제2의 독립적 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  114. 제101항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인이 OPRT 및 ODC로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  115. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 세포를 요망되는 세포 유형으로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  116. 제115항에 있어서, 조직-특이적 프로모터가 거핵구-특이적 프로모터이며, 요망되는 세포 유형은 거핵구인, 방법.
  117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 세포를 요망되는 세포 유형으로의 분화가 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 및 제2 페이로드의 발현으로 이어지는, 방법.
  118. 제101항 내지 제116항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 세포 집단.
  119. 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃, 및 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 포함하는 조작된 세포로서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 세포의 유전체 내에 안정하게 통합되며, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각은 영양요구 유도성 유전자의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 세포.
  120. 제119항에 있어서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물이 상동성 재조합에 의해 세포의 유전체 내에 통합되는, 조작된 세포.
  121. 시험관내에서 거핵구를 생성하는 방법으로서,
    (a) 영양요구 인자의 존재 하에 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 전구 세포를 배양하는 단계;
    (b) 세포를 거핵구로 분화시키는 단계; 및
    (c) 영양요구 인자를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 복수의 세포가 전구 세포를 포함하는, 방법.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, 복수의 세포가 UMPS 넉아웃 세포를 포함하는, 방법.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 인자가 우리딘인, 방법.
  125. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 우리딘 제거가 증식성 세포를 치사시키거나 증식에 실패하게 하는, 방법.
  126. 제121항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 거핵세포가 혈소판을 생성하는, 방법.
  127. 제121항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 혈소판이 영양요구 인자를 제거한 후에도 지속되는, 방법.
  128. 제121항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 순수한 혈소판 집단이 생성되는, 방법.
  129. 제121항 내지 제128항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
  130. 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포로부터 시험관내에서 생성된 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
  131. 조작된 혈소판 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 영양요구 인자의 존재 하에 영양요구 인자에 대해 영양요구성이 되도록 유전자 조작된 복수의 세포를 배양하는 단계로서, 복수의 세포는 영양요구 유도성 유전자의 넉아웃을 갖는, 단계;
    (b) 복수의 세포를 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물과 접촉시키는 단계로서,
    제1 발현 작제물은 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 카세트 및 영양요구 유도성 유전자의 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하며,
    제2 발현 작제물은 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 발현 카세트 및 영양요구 유도성 유전자의 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 발현 카세트를 포함하는, 단계; 및
    (c) 복수의 세포로부터 우리딘을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 제1 발현, 제2 발현 작제물, 또는 제1 및 제2 발현 작제물이 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 재조합 작제물인, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 특정 유전자좌가 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  134. 제133항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5인, 방법.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구 유도성 유전자가 UMPS이고, 영양요구 인자가 우리딘인, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인이 OPRT 및 ODC로부터 선택되는, 방법.
  137. 제131항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포가 전구 세포로부터 유래되는, 방법.
  138. 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  139. 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  140. 제131항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 조직-특이적 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  141. 제131항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  142. 제131항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  143. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2의 독립적 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각각 항시성 프로모터의 전사 제어 하에 있는, 방법.
  144. 제131항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 세포를 요망되는 세포 유형으로 분화시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  145. 제144항에 있어서, 조직-특이적 프로모터가 거핵구-특이적 프로모터이며, 요망되는 세포 유형은 거핵구인, 방법.
  146. 제144항 또는 제145항에 있어서, 세포의 요망되는 세포 유형으로의 분화가 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 및 제2 페이로드의 발현으로 이어지는, 방법.
  147. 제145항 또는 제146항에 있어서, 거핵구가 혈소판을 생성하는, 방법.
  148. 제147항에 있어서, 혈소판이 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 및 제2 페이로드로 로딩되는, 방법.
  149. 제144항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 세포 분화가 영양요구 인자의 존재하에 발생하는, 방법.
  150. 제147항에 있어서, 분화된 혈소판이 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 발현하지 않는, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 5-FOA를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  152. 제144항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분화 후 영양요구 인자를 제거하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 나머지 유핵의 증식된 세포는 영양요구 인자의 제거시 치사되거나 증식에 실패하는, 방법.
  153. UMPS의 넉아웃, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물을 포함하는 조작된 세포로서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물은 세포의 유전체 내에 안정하게 통합되며, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각은 OPRT 및 ODC로부터 선택된 UMPS의 제1 및 제2의 독립적인 기능성 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 세포.
  154. 제153항에 있어서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물이 상동성 재조합에 의해 세포의 유전체 내로 통합되는, 조작된 세포.
  155. 제154항에 있어서, 제1 발현 작제물 및 제2 발현 작제물 각각이 특정 유전자좌를 표적화하는 상동성 아암을 포함하는, 조작된 세포.
  156. 제155항에 있어서, 특정 유전자좌가 세이프 하버 유전자좌인, 조작된 세포.
  157. 제156항에 있어서, 세이프 하버 유전자좌가 CCR5이고, 상동성 아암이 CCR5 유전자좌에 대해 표적화되는, 조작된 세포.
  158. 제153항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 작제물이 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 조작된 세포.
  159. 제153항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 발현 작제물이 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 조작된 세포.
  160. 제158항 또는 제159항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 안티센스 RNA, siRNA, 앱타머, 마이크로RNA 모방체, 항-miR, 합성 mRNA 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 세포.
  161. 제160항에 있어서, 제1 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 발현 작제물 및 제2 페이로드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 발현 작제물을 포함하는, 조작된 세포.
  162. 제153항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 전구 세포로부터 유래되거나 분화되는, 조작된 세포.
  163. 제161항에 있어서, 조작된 세포가 시험관내에서 배양된 전구 세포로부터 유래되거나 분화되는, 조작된 세포.
  164. 제153항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 혈소판을 생성하는 방법에 사용하기 위한, 조작된 세포.
  165. 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 혈소판을 생성하는 방법에 사용하기 위한, 조작된 세포.
  166. 제165항에 있어서, 조작된 혈소판이 제1 페이로드, 제2 페이로드, 또는 제1 및 제2 페이로드로 로딩되는, 조작된 세포.
  167. UMPS 넉아웃 세포가 되도록 조작된 세포로부터 시험관내에서 제조된 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
  168. 제167항에 있어서, 혈소판 집단이 유핵 세포 또는 증식 세포가 없거나 실질적으로 없는, 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
  169. 제167항 또는 제168항에 있어서, 대상체에게 혈소판을 투여하는 것을 포함하는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
  170. 제167항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 페이로드를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법에 사용하기 위한, 실질적으로 순수한 혈소판 집단.
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