JP2022532535A - 栄養要求性選択方法 - Google Patents

栄養要求性選択方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022532535A
JP2022532535A JP2021565891A JP2021565891A JP2022532535A JP 2022532535 A JP2022532535 A JP 2022532535A JP 2021565891 A JP2021565891 A JP 2021565891A JP 2021565891 A JP2021565891 A JP 2021565891A JP 2022532535 A JP2022532535 A JP 2022532535A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
promoter
auxotrophic
cell
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021565891A
Other languages
English (en)
Inventor
ジェイムズ パターソン
マシュー ポルテウス
フォルカー ウィービング
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of JP2022532535A publication Critical patent/JP2022532535A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03002—Aspartate carbamoyltransferase (2.1.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
    • C12Y305/02003—Dihydroorotase (3.5.2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/05—Carbon-nitrogen ligases with glutamine as amido-N-donor (6.3.5)
    • C12Y603/05005—Carbamoyl-phosphate synthase (glutamine-hydrolysing) (6.3.5.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/0201—Orotate phosphoribosyltransferase (2.4.2.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01023—Orotidine-5'-phosphate decarboxylase (4.1.1.23)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本開示は、栄養要求性細胞の集団および分化した細胞の集団を生成し、分割栄養要求性を使用して、トランスフェクトされた細胞の集団を選択するための方法および組成物を提供する。TIFF2022532535000022.tif77170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年5月8日に出願された米国特許仮出願第62/844,930号および2019年9月24日に出願された第62/904,725号に対する優先権を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表ととともに出願されている。1191573PCT_SEQLST.txtと題する配列表ファイルは2020年4月27日に作成され、66,244バイトのサイズである。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本開示の分野
本開示は、分化した細胞の集団を生成し、かつトランスフェクトされた細胞の集団を選択する方法に関する。
本開示の背景
細胞療法は有望な治療を提供することが示されている。それにもかかわらず、ヒト受容者への改変細胞の再導入は、免疫反応、悪性形質転換、または導入遺伝子の過剰産生もしくは制御の欠如を含めて、危険性をともなう。
遺伝子工学のいくつかのアプローチによって、細胞のシグナル、増殖、またはアポトーシスのようなヒト細胞の機能に対する制御が可能になり（例えば、Bonifant, Challice L., et al. "Toxicity and management in CAR T-cell therapy." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016): 16011（非特許文献1）；Sockolosky, Jonathan T., et al. "Selective targeting of engineered T cells using orthogonal IL-2 cytokine-receptor complexes." Science 359.6379 (2018): 1037-1042（非特許文献2）；およびTey, Siok‐Keen. "Adoptive T‐cell therapy: adverse events and safety switches." Clinical & translational immunology 3.6 (2014): e17（非特許文献3）を参照されたい；これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）、細胞療法の重度の副作用でさえも制御することが可能になる（Bonifant et al., 2016）。こうした進歩にもかかわらず、他の適用は、広範な適用、例えば、再生医療のための操作された多能性細胞の使用を遂げることが妨げられており（Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277（非特許文献4）; Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004（非特許文献5）; Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441（非特許文献6）を参照されたい；これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）、これは、遺伝的にコードされる制御メカニズムを細胞へ導入することに依拠する制御システムに複数の制限があるという事実による（Tey, 2014）。
起こり得る主な問題のうちの2つは、「漏出性」、すなわち、その誘発因子の非存在下での前記メカニズムの低レベルの活性（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608（非特許文献7）を参照されたい）および前記メカニズムの活性化の際に細胞集団全体の除去がないこと（Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129（非特許文献8）；Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683（非特許文献9）；Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683（非特許文献10）; Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485（非特許文献11）を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）であり、これは、外部制御からのいくつかの逃避メカニズムが理由である。例えば、ウイルス形質導入によって導入される導入遺伝子は、細胞による発現がサイレンスされ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sulkowski et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197（非特許文献12）を参照されたい）か、または細胞がエフェクターメカニズムに対して抵抗性を発達させ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485（非特許文献11）を参照されたい）。別の懸念は、遺伝的不安定性を有する細胞タイプ、例えば、長期間培養された細胞株、または腫瘍細胞株における導入遺伝子の突然変異である（Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233（非特許文献13）；D’Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894（非特許文献14）。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。さらに、一次細胞集団は、エクスビボ培養において限られた時間だけの間その機能性を保持することが多く、多くのタイプは、クローン単離によって純化することができない。
したがって、増殖性前駆体に由来する細胞療法生成物の場合は、患者に導入する前に、インビトロで分化した非増殖性細胞を選択する方法の必要性が長い間感じられている。一般に、多分化能前駆細胞からの分化した細胞生成物の産生は、関心対象の望ましい分化した細胞集団を選択することができないことによって阻まれてきた。
Bonifant, Challice L., et al. "Toxicity and management in CAR T-cell therapy." Molecular Therapy-Oncolytics 3 (2016): 16011 Sockolosky, Jonathan T., et al. "Selective targeting of engineered T cells using orthogonal IL-2 cytokine-receptor complexes." Science 359.6379 (2018): 1037-1042 Tey, Siok‐Keen. "Adoptive T‐cell therapy: adverse events and safety switches." Clinical & translational immunology 3.6 (2014): e17 Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277 Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004 Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441 Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608 Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129 Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683 Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683 Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485 Sulkowski et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197 Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233 D’Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894
本開示の概要
本開示の様々な態様は、以下を含む、分化した細胞の集団を生成する方法を提供する：
(a)複数の前駆細胞を遺伝子のプロモーターの必ずしも必要ではない部分を標的とするガイドRNA（gRNA）を含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程；
(b)相同組換えによって、組織特異的プロモーターおよび遺伝子の少なくとも一部を含むコンストラクトを両アレルに挿入する工程であって、遺伝子が、
Figure 2022532535000002
からなる群より選択され、結果として、前駆細胞が栄養要求性因子に対して栄養要求性になる、工程；
(c)複数の前駆細胞を栄養要求性因子と接触させる工程；
(d)組織特異的プロモーターと関連する組織への前駆細胞の分化を刺激する工程であって、遺伝子が分化に応じて発現する、工程；ならびに
(e)栄養要求性因子を除去し、それによって、分化した細胞を選択して、分化した細胞の集団を生成する工程。
プロモーターの部分は、その領域中の単純IN/DELが栄養要求性を引き起こさないことを確実にするのに必ずしも必要ではない。相同組換えによる組織特異的プロモーターの挿入は、前駆細胞において栄養素合成遺伝子の発現を失わせ、それにより栄養要求性をもたらすであろう。分化の際に、栄養素合成遺伝子の発現がオンになり、分化した細胞のみが生存する状態で栄養素を除去することができる。
ある特定の態様では、方法は、複数の細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む。ある特定の態様では、遺伝子はUMPS遺伝子である。ある特定の態様では、UMPS遺伝子のプロモーターは組織特異的プロモーターに置き換わる。ある特定の態様では、栄養要求性因子はウラシルの供給源、例えばウリジンである。ある特定の態様では、コンストラクトは、分化に応じて発現する治療的タンパク質または治療的因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の態様では、方法は、UMPS遺伝子の少なくとも一部を有するカセットとして治療的タンパク質を発現させる工程をさらに含む。ある特定の態様では、コンストラクトはポリシストロニックである。ある特定の態様では、コンストラクトは配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を含む。ある特定の態様では、UMPS遺伝子の少なくとも一部は相同性アームである。ある特定の態様では、複数の前駆細胞は、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、および心筋細胞からなる群より選択される。ある特定の態様では、組織は、脂肪組織、副腎、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択される。ある特定の態様では、分化した細胞の集団は免疫細胞を含む。ある特定の態様では、免疫細胞はT細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である。
ある特定の態様では、組織特異的プロモーターは、以下からなる群より選択される：WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーター。本明細書に記載される方法のある特定の態様では、コンストラクトは条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされる。
本開示の様々な態様は、以下を含む、分化した細胞の集団を生成する方法を提供する：
(a)複数の前駆細胞を1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位をコードするDNA配列と接触させる工程であって、DNA配列が栄養要求性誘導遺伝子中にノックインされ、結果として、前駆細胞が栄養要求性因子に対して栄養要求性になり、かつ、miRNA標的部位に結合する前駆細胞特異的miRNAが前駆細胞で発現する、工程；
(b)複数の前駆細胞を栄養要求性因子と接触させる工程；
(c)前駆細胞の分化を刺激する工程であって、分化が前駆細胞特異的miRNAの発現を抑制して、遺伝子の発現を活性化する工程；および
(d)栄養要求性因子を除去し、それによって、分化した細胞を選択して、分化した細胞の集団を生成する、工程。
ある特定の態様では、方法は、複数の細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む。ある特定の態様では、栄養要求性誘導遺伝子は、
Figure 2022532535000003
からなる群より選択される。
ある特定の態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位は、UMPS遺伝子から転写されるmRNA転写物中に存在する。ある特定の態様では、1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位は栄養要求性誘導遺伝子から転写されるmRNA転写物の3’非翻訳領域（UTR）中にある。ある特定の態様では、栄養要求性因子はウラシルの供給源、例えばウリジンである。ある特定の態様では、方法は、治療的因子をコードする遺伝子を含むコンストラクトを前駆細胞のゲノムに挿入する工程をさらに含み、治療的因子の発現は栄養要求性誘導遺伝子の発現を制御するプロモーターと同じプロモーターによって制御され、分化した細胞は治療的因子を発現する。ある特定の態様では、方法は、栄養要求性誘導遺伝子とインフレームのカセットとして治療的タンパク質を発現させる工程をさらに含む。ある特定の態様では、カセットは配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を含む。ある特定の態様では、1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位をコードするDNA配列は、栄養要求性誘導遺伝子を標的とする相同性アームをさらに含む。ある特定の態様では、複数の前駆細胞は、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、および心筋細胞、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。ある特定の態様では、前駆細胞の分化を刺激することは、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択される細胞または組織型の分化した細胞をもたらす。ある特定の態様では、分化した細胞の集団は免疫細胞を含む。例えば、免疫細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
本開示の様々な態様は、対象において疾患、障害または状態を治療する方法であって、分化した細胞の純化集団を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本開示の様々な態様は、以下を含む、分化の際に栄養要求性因子を産生することによって栄養要求性を軽減する方法を提供する：
(a)栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトによって生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供する工程；および
(b)栄養要求性誘導遺伝子のオープンリーディングフレームを含むコンストラクトを組織特異的遺伝子座に挿入する工程であって、組織特異的遺伝子の発現が破壊されず、それによって、組織特異的遺伝子座と関連する組織への前駆細胞の分化の際に栄養要求性因子を産生する、工程。
ある特定の態様では、前駆細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）より選択される。ある特定の態様では、遺伝子は、
Figure 2022532535000004
からなる群より選択される遺伝子からなる群より選択される。ある特定の態様では、遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）である。ある特定の態様では、コンストラクトは配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）をさらに含む。ある特定の態様では、組織特異的遺伝子座はインスリン座位である。ある特定の態様は、複数の栄養要求性前駆細胞を免疫細胞に分化させる工程をさらに含む。免疫細胞は、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞を含むことができる。ある特定の態様では、組織特異的遺伝子は挿入工程の間に置き換えられない。ある特定の態様では、方法は、前駆細胞の分化の際にインスリンを産生する工程をさらに含む。本明細書に記載される方法のある特定の態様では、遺伝子は条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされる。
本開示の様々な態様は、以下を含む、プラスミドの組み込みまたはエピソーム発現を有する、すなわち、少なくとも1つの外来遺伝子を機能的に組み込み込んだ細胞を選択する方法を提供する：
(a)複数の細胞に栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトをもたらし、結果として栄養要求性をもたらす、すなわち栄養要求性因子を必要とする複数の細胞をもたらす工程であって、複数の細胞を、複数の細胞に栄養要求性因子を提供する培地中で増殖させる、工程；
(b)プラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびナノ粒子からなる群より選択される送達システムを複数の細胞にトランスフェクトする工程であって、送達システムが栄養要求性因子を発現する、工程；ならびに
(c)培地を除去し、それによって、プラスミドの組み込みまたはエピソーム発現を有する細胞、すなわち、外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する、工程。
ある特定の態様では、送達システムは少なくとも1つの導入遺伝子を発現する。ある特定の態様では、遺伝子は、
Figure 2022532535000005
からなる群より選択される。本明細書に記載される方法のある特定の態様では、遺伝子は条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされる。
本開示の様々な態様は、本明細書に記載される方法を実施するための材料を含むキット提供する。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、栄養要求性誘導遺伝子の一部を両アレル性に標的化するガイドRNA（gRNA）を含むCRISPR/Casシステムと前駆細胞を接触させる工程を含む、分化した細胞の集団を生成する方法を提供する。両アレル標的化は、例えば、オープンリーディングフレームもしくは調節配列を中断することによって、またはタンパク質もしくはヌクレオチドの抑制もしくは分解のための標的配列を導入することによって、栄養要求性誘導遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることができる。栄養要求性誘導遺伝子が少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む態様では、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、前駆細胞をそれぞれの独立した機能ドメインに対して栄養要求性にする。前駆細胞において栄養要求性を誘導する際に、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトを細胞に導入することができ、第1の相同組換えコンストラクトは第1の組織特異的プロモーターと栄養要求性誘導遺伝子の第1の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含み、第2の相同組換えコンストラクトは第2の組織特異的プロモーターと栄養要求性誘導遺伝子の第2の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む。前駆細胞を栄養要求性因子の存在下で増殖させることができ、細胞の分化を刺激して、第1および第2の組織特異的プロモーターを発現し、結果として、第1および第2の相同組換えコンストラクトが分化した細胞で発現する分化した細胞（例えば、細胞型または組織）を作製することができる。このようにして、栄養要求性因子を除去することによって、第1および第2の独立した機能ドメインを欠く細胞を排除し、両方のドメインを機能的に組み込んだ細胞を選択する。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子は2つ以上の独立した機能ドメイン、例えば、3つ、4つ、もしくは5つの独立した機能ドメイン、または5つより多い独立した機能ドメインを有し、栄養要求性細胞におけるそれぞれの独立した機能ドメインの再発現が栄養要求性を軽減するのに必要とされ、それによって、望ましい分化した細胞型または組織で発現する異なる組織特異的プロモーターの調節下で異なる独立した機能ドメインを発現する2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の相同組換えコンストラクトで細胞を改変することによって、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の組織特異的プロモーターを発現する細胞の選択が可能になる。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はカルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。
いくつかの態様では、方法は細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む。
いくつかの態様では、相同組換えコンストラクトの1つまたは複数はセーフハーバー座位、例えばCCR5に挿入される。
いくつかの態様では、栄養要求性因子はウリジンである。
いくつかの態様では、相同組換えコンストラクトの1つまたは複数は、治療的因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。相同組換えコンストラクトの1つまたは複数はポリシストロニックでもよく、例えば、例えば独立した機能ドメインをコードするコード配列と治療的因子をコードするコード配列とを分離する配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を有する。
本明細書に記載される方法における使用のための例示的な前駆細胞としては、限定されないが、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、および心筋細胞が挙げられる。
本明細書に記載される方法における使用のための分化した細胞型または組織の例としては、限定されないが、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン、および血管が挙げられる。
いくつかの態様では、分化した細胞は免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である。
本明細書に記載される方法における使用のための組織特異的プロモーターの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーター。
いくつかの態様では、相同組換えコンストラクトの1つまたは複数は、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。この方法で、独立した機能ドメインの不安定化のための条件または独立した機能ドメインをコードするメッセージRNAの分解のための条件を誘発することによって、本明細書に記載される改変細胞の栄養要求性をさらに調節することができる。条件は、例えば、不安定化ドメインを安定化するリガンドの存在、またはリガンドの非存在、それによる、独立した機能ドメインの不安定化および分解の誘導であり得る。
本明細書に記載される方法を使用して生成された細胞の分化集団を対象に投与することができる。いくつかの態様では、分化した細胞は治療的因子を保有する免疫細胞であり、対象は治療的因子を必要としているか、または治療的因子を必要としていることが疑われる。
栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供する工程であって、該遺伝子が少なくとも第1の独立した機能ドメインおよび第2の独立した機能ドメインを含む前記工程、ならびに栄養要求性前駆細胞のゲノム中に、第1の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第1のコンストラクトを第1の組織特異的遺伝子座に挿入し、第2の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第2のコンストラクトを第2の組織特異的遺伝子座に挿入する工程を含む、栄養要求性を軽減する方法も提供される。いくつかの態様では、第1および第2の座位における組織特異的遺伝子の発現は破壊されない。したがって、それによって、栄養要求性は、第1および第2の座位において第1および第2の組織特異的遺伝子を発現する細胞型または組織への前駆細胞の分化の際に軽減される。
2つより多い独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子の活用が企図される。例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインのそれぞれの再発現が栄養要求性を軽減するのに必要とされるように、栄養要求性誘導遺伝子は、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインを含むことができる。それぞれの独立した機能ドメインがそれぞれの組織特異的遺伝子座で栄養要求性前駆細胞のゲノムに挿入される場合、独立した機能ドメインを組み込んだ第1、第2、第3、第4、および／または第5の組織特異的座位のそれぞれに対応する組織特異的プロモーターを発現する細胞のみが、栄養要求性因子の除去を切り抜けて生存すると考えられる。
いくつかの態様では、前駆細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）である。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はカルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。
いくつかの態様では、コンストラクトの1つまたは複数はポリシストロニックであり、例えば治療的因子をさらにコードし、コンストラクトのシストロンの発現を調節する配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）をさらに含む。
いくつかの態様では、組織特異的遺伝子座はインスリン座位である。
いくつかの態様では、方法は、複数の栄養要求性前駆細胞を免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞に分化させる工程をさらに含む。
いくつかの態様では、組織特異的遺伝子は挿入工程の間に置き換えられない。
いくつかの態様では、分化した細胞はインスリンを産生する。
いくつかの態様では、コンストラクトの1つまたは複数は、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列を含む。
少なくとも第1の外来遺伝子および第2の外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する方法も提供される。本方法は、複数の細胞に、少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンをもたらし、結果として、複数の細胞において栄養要求性因子に対して栄養要求性をもたらす工程を含むことができる。栄養要求性因子を提供する培地中で細胞を増殖させることができ、第1の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第1の送達システム、ならびに第2の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の送達システムを細胞にトランスフェクトすることができる。栄養要求性因子を欠く培地との培地の交換の際に、第1と第2の外来遺伝子の両方を機能的に組み込んでいない細胞は栄養要求性のままであると考えられ、かつ培養中に存続しないと考えられ、それによって、第1および第2の外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する。
記載される方法は、独立した機能ドメインのそれぞれの再発現が、改変細胞において栄養要求性を軽減するのに必要とされるようにさらなる独立した機能ドメインを有する栄養要求性誘導遺伝子、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインを有する栄養要求性誘導遺伝子の活用をさらに企図する。
いくつかの態様では、方法は、栄養要求性誘導遺伝子の各機能ドメインに対応する送達システムを複数の細胞にトランスフェクトする工程であって、各送達システムが、外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む前記工程を含む。いくつかの態様では、送達システムの1つまたは複数は、プラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、またはナノ粒子を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はカルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。
以下を含む、成熟ヒトベータ細胞の集団を生成する方法も提供される：
(a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させ、結果として、前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる工程；
(b)複数の前駆細胞を第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたインスリンをコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列含み、第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結されたNkx6.1をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列を含み、第1および第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、インスリンとNkx6.1の両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、工程；
(c)複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
(d)成熟ベータ細胞への複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
(e)ウリジンを除去することによって、インスリンとNkx6.1の両方を発現する成熟ベータ細胞を選択し、それによって、成熟ヒトベータ細胞の集団を生成する工程。
本明細書に記載される方法に従って作製される成熟ヒトベータ細胞を対象に投与する工程を含む、対象において1型糖尿病を軽減する方法も提供される。
インビトロで分化した前駆細胞の集団より選択される成熟ヒトベータ細胞であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変、および栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子を含む、成熟ヒトベータ細胞も提供される。栄養要求性誘導遺伝子はUMPSであり得、栄養要求性因子はウリジンであり得、独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより選択することができ、1つまたは複数の導入遺伝子は、インスリンをコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列、およびNkx6.1をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列をさらに含むことができる。
以下を含む、ヒト心筋細胞の亜集団を生成する方法も提供される：
(a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させ、結果として、前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる工程；
(b)複数の前駆細胞を第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたTBX5をコードするヌクレオチド配列またはTBX5依存的発現制御配列を含み、第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結されたNKX2-5をコードするヌクレオチド配列またはNKX2-5依存的発現制御配列を含み、第1および第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、TBX5およびNKX2-5の一方または両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、工程；
(c)複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
(d)心筋細胞への複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
(e)ウリジンを除去することによって、TBX5およびNKX2-5の一方または両方を発現する心筋細胞の亜集団を選択し、それによって、ヒト心筋細胞の亜集団を生成する工程。
いくつかの態様では、TBX5とNKX2-5の両方を発現する細胞は、心室心筋細胞を含む亜集団に相当する。
いくつかの態様では、TBX5を発現するがNKX2-5を発現しない細胞は、結節性心筋細胞を含む亜集団に相当する。
いくつかの態様では、TBX5を発現しないがNKX2-5を発現する細胞は、心房の心筋細胞を含む亜集団に相当する。
いくつかの態様では、TBX5もNKX2-5も発現しない細胞は内皮細胞に相当する。
本開示は、インビトロで分化した心筋細胞の集団より選択される心筋細胞であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変、および栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子を含む心筋細胞をさらに提供する。栄養要求性誘導遺伝子はUMPSであり得、栄養要求性因子はウリジンであり得、独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより選択することができ、1つまたは複数の導入遺伝子はTBX5をコードするヌクレオチド配列またはTBX5依存的発現制御配列およびNKX2-5をコードするヌクレオチド配列またはNKX2-5依存的発現制御配列をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、心筋細胞は、一次心臓領域系譜細胞、心室心筋細胞、心外膜系譜細胞、結節性心筋細胞、二次心臓領域系譜細胞、および心房の心筋細胞からなる群より選択される心筋細胞の亜集団に属する。
本開示は、インビトロ薬物試験の方法における本明細書に記載される心筋細胞の使用も提供する。
以下を含む、安定なT reg細胞の集団を生成する方法も提供される：
(a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させ、結果として、前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる工程；
(b)複数の前駆細胞を第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたFOXP3をコードするヌクレオチド配列またはFOXP3依存的発現制御配列を含み、第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結された細胞ナイーブ（cell naivete）関連プロモーターをコードするヌクレオチド配列または細胞ナイーブ関連プロモーターの発現制御配列を含み、第1および第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、FOXP3と細胞ナイーブ関連プロモーターと関連する遺伝子との両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、工程；
(c)複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
(d)安定なT reg細胞への複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
(e)ウリジンを除去することによって、FOXP3と細胞ナイーブ関連プロモーターと関連する遺伝子との両方を発現する安定なT reg細胞を選択し、それによって、安定なT reg細胞の集団を生成する工程。
いくつかの態様では、細胞ナイーブ関連プロモーターはPTPRCまたはCCR7と関連するプロモーターである。
対象において疾患、障害または状態を軽減する方法であって、本明細書に記載される方法に従って作製された安定なT reg細胞を対象に投与する工程を含み、疾患、障害または状態が免疫疾患または癌を含む方法も提供される。
本開示は、対象において疾患、障害、または状態を治療するための方法における、本明細書の方法によって生成される安定なT reg細胞の使用であって、疾患、障害または状態が免疫疾患または癌を含む使用も提供する。
T reg細胞集団より選択される安定なT reg細胞の集団であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変、および栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子を含む安定なT reg細胞の集団も提供される。いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はUMPSであり、栄養要求性因子はウリジンであり、独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより選択され、1つまたは複数の導入遺伝子は、FOXP3をコードするヌクレオチド配列またはFOXP3依存的発現制御配列および細胞ナイーブ関連プロモーターをコードするヌクレオチド配列または細胞ナイーブ関連プロモーターと関連する遺伝子をさらに含み、任意で、細胞ナイーブ関連プロモーターはPTPRCまたはCCR7と関連するプロモーターである。
第1および第2の発現カセットが組み込まれた細胞の集団を生成する方法であって、
(a)ウリジンに対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞をウリジンの存在下で培養する工程；
(b)複数の細胞を第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクト接触させる工程；ならびに
(c)複数の細胞からウリジンを取り除き、それによって、第1および第2の発現カセットが組み込まれた細胞の集団を生成する工程
を含む方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、第1の発現コンストラクトは、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現カセットおよびUMPSの第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現カセットを含む。第2の発現コンストラクトは、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現カセットおよびUMPSの第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の発現カセットを含むことができる。したがって、第1および第2の発現コンストラクトは4つの発現カセット、すなわち、UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットおよび1つまたは複数のペイロードをコードする残りの発現カセットを含むことができる。いくつかの態様では、方法は、さらなる発現コンストラクトおよび／またはさらなるペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト導入する工程を含む。
いくつかの態様では、第1の発現コンストラクトは特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトである。いくつかの態様では、第2の発現コンストラクトは特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトである。特定の遺伝子座はセーフハーバー座位であり得る。セーフハーバー座位の例はCCR5である。
ウリジンに対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞はUMPSノックアウト細胞であり得る。いくつかの態様では、複数の細胞はUMPSノックダウン細胞となるように遺伝子操作されている。
いくつかの態様では、複数の細胞は前駆細胞、例えば多能性幹細胞に由来する。
いくつかの態様では、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列は組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列は組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列および第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ組織特異的プロモーターの転写制御下にある。
いくつかの態様では、UMPSの第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、UMPSの第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターの転写制御下にある。そのような態様では、UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインは構成的に発現し、第1および第2の発現コンストラクトを安定して組み込んだ細胞がウリジンの非存在下で生存することを可能にする。
いくつかの態様では、UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより独立に選択される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、望ましい細胞型にインビトロで細胞を分化させる工程をさらに含む。
いくつかの態様では、組織特異的プロモーターは巨核球特異的プロモーターであり、望ましい細胞型は巨核球である。
いくつかの態様では、望ましい細胞型に細胞を分化させることによって、第1のペイロード、第2のペイロード、または第1のペイロードおよび第2のペイロードの発現が導かれ、これらは、望ましい細胞型に対応する、すなわち、望ましい細胞型でアップレギュレートされる組織特異的プロモーターを有し得る。
本明細書に記載される方法によって生成された第1および第2の発現カセットを含む細胞の集団も本明細書において提供される。
栄養要求性誘導遺伝子のノックアウト、第1の発現コンストラクト、および第2の発現コンストラクトを含む操作された細胞であって、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトが細胞のゲノム中に安定して組み込まれており、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトがそれぞれ栄養要求性誘導遺伝子の第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む操作された細胞も提供される。
操作された細胞のいくつかの態様では、第1および第2の発現コンストラクトは、相同組換えによって細胞のゲノム中に組み込まれる。
(a)栄養要求性因子の存在下で、栄養要求性因子に対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞を培養する工程；(b)細胞を巨核球に分化させる工程：および(c)栄養要求性因子を取り除く工程を含む、インビトロで巨核球を生成する方法も提供される。
インビトロで血小板を生成する方法は、前駆細胞、例えば多能性幹（PS）細胞を含む複数の細胞から出発することを含むことができる。PS細胞を含む複数の細胞はUMPSノックアウト細胞を含むことができる。栄養要求性誘導遺伝子がUMPSである方法および／または細胞は、栄養要求性因子としてのウリジンの使用を含むことができる。したがって、ウリジンを取り除くによって、UMPSの第1および／または第2の独立した機能ドメインを欠く増殖性細胞は、死ぬかまたは増殖しなくなる。
いくつかの態様では、分化した巨核球は血小板を生成する。分化した巨核球はインビトロで血小板を生成することができる。血小板は、栄養要求性因子、例えばウリジンを取り除いた後に存続する。いくつかの態様では、血小板の実質的に純粋な集団が生成される。血小板の実質的に純粋な集団は、有核細胞、増殖性細胞、巨核球、多能性細胞、および／または他の細胞型がない可能性がある。
したがって、本明細書において提供される方法によって生成された血小板の実質的に純粋な集団を含む組成物も本明細書において提供される。
栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞からインビトロで生成された血小板の実質的に純粋な集団も提供される。
以下を含む、操作された血小板の集団を生成する方法も本明細書において提供される：
(a)栄養要求性因子の存在下で、栄養要求性因子に対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞を培養する工程であって、複数の細胞が栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトを有する、工程；
(b)複数の細胞を第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクト接触させる工程；ならびに
(c)複数の細胞から栄養要求性因子を取り除く工程。
いくつかの態様では、第1の発現コンストラクトは、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現カセットおよび栄養要求性誘導遺伝子の第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現カセットを含む。いくつかの態様では、第2の発現コンストラクトは、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現カセットおよび栄養要求性誘導遺伝子の第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の発現カセットを含む。
いくつかの態様では、第1の発現コンストラクト、第2の発現コンストラクト、または第1および第2の発現コンストラクトは、特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトであり得る。特定の遺伝子座はセーフハーバー座位であり得る。セーフハーバー座位はCCR5であり得る。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はUMPSであり、栄養要求性因子はウリジンである。したがって、第1および第2の独立した機能ドメインは、UMPSの独立した機能ドメインOPRTおよびODCより選択することができる。
いくつかの態様では、複数の細胞は前駆細胞、例えば多能性幹細胞に由来する。
いくつかの態様では、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列は組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列は組織特異的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列および第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ組織特異的プロモーターの転写制御下にある。
いくつかの態様では、第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列は構成的プロモーターの転写制御下にある。いくつかの態様では、第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列はそれぞれ構成的プロモーターの転写制御下にある。
操作された血小板の集団を生成する方法のいくつかの態様は、望ましい細胞型にインビトロで細胞を分化させる工程をさらに含む。組織特異的プロモーターは、例えば巨核球特異的プロモーターであり得、望ましい細胞は巨核球であり得る。望ましい細胞型に細胞を分化させることによって、第1のペイロード、第2のペイロード、または第1のペイロードおよび第2のペイロードの発現を導くことができる。
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法に従って作製される巨核球は血小板を産生する。
いくつかの態様では、血小板に第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードがロードされる。
いくつかの態様では、インビトロで細胞を分化させる工程は栄養要求性因子の存在下で実施される。いくつかの態様では、分化した血小板は第1および第2の独立した機能ドメインを発現しない。
いくつかの態様では、5-FOAとともに細胞をさらに培養することによって、細胞を選択することができる。5-FOAの存在は、栄養要求性因子、例えばウリジンの存在下で、いかなる残留性非編集細胞も、例えばいかなる残留性PS細胞も排除することができる。
操作された血小板の集団を生成するいくつかの態様は、細胞を分化させた後に栄養要求性因子を取り除く工程であって、栄養要求性因子を取り除いた際に、残存する有核増殖性細胞が死ぬかまたは増殖しない前記工程をさらに含む。
UMPSのノックアウト、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトを含む操作された細胞であって、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトが細胞のゲノム中に安定して組み込まれており、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトがそれぞれOPRTおよびODCより選択されるUMPSの第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む操作された細胞も本明細書において提供される。第1および第2の発現コンストラクトは、相同組換えによって細胞のゲノム中に組み込まれ得る。いくつかの態様では、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトはそれぞれ特定の遺伝子座を標的とする相同性アームを含む。特定の遺伝子座はセーフハーバー座位であり得る。セーフハーバー座位はCCR5であり得、相同性アームはCCR5座位にターゲティングされ得る。
いくつかの態様では、操作された細胞は、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列をさらに含む発現カセットを含む第1の発現コンストラクトを含む。
いくつかの態様では、操作された細胞は第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列をさらに含む発現カセットを含む第2の発現コンストラクトを含む。
いくつかの態様では、ペイロードをコードするヌクレオチド配列をさらに含む発現カセットは、アンチセンスRNA、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物、抗miR、合成mRNA、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、操作された細胞は、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現コンストラクトおよび第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現コンストラクトを含む。
操作された細胞は、前駆細胞、例えば多能性幹細胞に由来し得るか、またはこれから分化し得る。いくつかの態様では、操作された細胞は、前駆細胞、例えばインビトロで培養された多能性幹細胞に由来し得るか、またはこれから分化し得る。
操作された血小板を生成する方法で使用するための操作された細胞も提供される。いくつかの態様では、操作された血小板に、第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードがロードされ得る。
UMPSノックアウト細胞となるように操作された細胞からインビトロで調製された血小板の実質的に純粋な集団を含む組成物も提供される。いくつかの態様では、血小板の実質的に純粋な集団は、有核もしくは増殖性細胞がないかまたは実質的にない可能性があり、その結果、いかなる残存する有核または増殖性細胞も、老化を示す、死ぬ、非機能的である、非増殖性である、生育不能である、および／または実際上存在しないような十分に少ない数でしか存在しない。
いくつかの態様では、血小板の実質的に純粋な集団は、対象に血小板を投与する工程を含む対象を治療する方法で使用することができる。
いくつかの態様では、血小板の実質的に純粋な集団は、治療的ペイロードをそれらを必要とする対象に送達する方法で使用することができる。
参照による組み入れ
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが、参照により組み入れられることが具体的かつ個々に示される場合と同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。
図1は、PS細胞由来の操作された巨核球で使用するための発現ベクターを最適化するために分割栄養要求性選択を使用する実例プロセスの概略図である。 図2は、インビトロで巨核球（MK）に分化させられたUMPSノックアウト（KO）多能性幹（PS）細胞からインビボ適用のための血小板を生成するためにウリジン栄養要求性ベースの選択方法を使用する実例プロセスの概略図である。 図3は、多能性幹（PS）細胞から操作された血小板をインビトロで作製するために分割栄養要求性を使用する実例プロセスの概略図である。
詳細な説明
I.序論
最近の進展によって、ヒト細胞のゲノムの正確な改変が可能になる。この遺伝子操作によって、幅広い適用が可能になるが、細胞挙動を制御するための新しい方法も必要となる。細胞に対する代替制御システムは、代謝における遺伝子を標的とすることによって操作することができる栄養要求性である。代謝の中心遺伝子を破壊することによって栄養要求性を遺伝子操作するという、本明細書に記載されるアプローチは、ヒト細胞について探究されていない細胞機能に関して外部制御メカニズムを作り出すための代替パラダイムである。
栄養要求性は、例えば、操作された遺伝子回路の導入によって非天然物質に対して（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kato, Y. (2015) An engineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid: a novel biological containment system. PeerJ 3, e1247を参照されたい）、または細菌遺伝子のノックアウトによってピリミジンに対して（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789を参照されたい）、微生物において以前に操作された。後者の概念は魅力的であり、なぜならば、これは、細胞が遺伝子改変または抵抗性メカニズムの発達を逆転させるのを妨げる複雑な発現カセットの導入の代わりに、遺伝子のノックアウトに依拠し、したがって、代替システムのこの問題に対処するからである。ピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオチドが、DNAおよびRNA合成、エネルギー移動、シグナル伝達、ならびにタンパク質修飾を含めた幅広い細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすという事実（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、van Kuilenburg, A.B.P. and Meinsma, R. (2016). Biochem. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1862, 1504-1512を参照されたい）によって、それらの合成経路が理論的に魅力的な標的になる。
ヒト細胞は、外部供給源または共生生物のいずれかから獲得しなければならないアミノ酸のようなある特定の化合物に対して、天然に栄養要求性である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Murray, P.J. (2016). Nat. Immunol. 17, 132-139を参照されたい）。さらに、栄養要求性は、例えば、細胞が栄養要求性である代謝産物の差次的な供給または枯渇によって免疫細胞の機能をモジュレートするための、天然のメカニズムである（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Grohmann et al., (2017). Cytokine Growth Factor Rev. 35, 37-45を参照されたい）。細胞の栄養要求性はまた、例えば、アルギニンを除去することによって腫瘍増殖を阻害するマクロファージの場合において、悪性増殖に対する防御メカニズムで重要な役割を果たす（Murray, 2016）。さらに、いくつかの悪性細胞タイプは、ある特定の代謝産物について栄養要求性であることが示されており（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fung, M.K.L. and Chan, G.C.F. (2017). J. Hematol. Oncol. 10, 144を参照されたい）、これは、白血病患者の治療のために、アスパラギンの治療的枯渇に活用される（Hill et al., (1967). JAMA 202, 882を参照されたい）。
微生物について以前に開発された抑制ストラテジーに加えて、Cas9リボ核タンパク質（RNP）／rAAV6に基づく遺伝子編集を使用する、本明細書に記載されるアプローチは、一次ヒト細胞タイプおよび治療的に関連するヒト細胞タイプの非常に効率的な操作を可能にする。栄養要求性および5-FOAに対する抵抗性は、UMPS遺伝子の完全な破壊を有するすべての細胞に固有であるが、概念実証を示すために、選択マーカーのターゲティングされた組み込みによる両アレルのノックアウトを用いて、集団の特定が容易になった。一次ヒト細胞の効率的なターゲティングされた改変を可能にする方法の最近の開発（Bak, Rasmus O., et al. CRISPR/Cas9 and AAV6." Elife 6 (2017): e27873; Bak, Rasmus O., et al. "Correction: Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6." Elife 7 (2018): e43690; Bak, Rasmus O., Daniel P. Dever, and Matthew H. Porteus. "CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells." Nature protocols 13.2 (2018): 358;およびPorteus, Matthew H., and David Baltimore. "Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells." Science 300.5620 (2003): 763-763を参照されたい; これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）は、代謝的栄養要求性の確立とともに、ヒト細胞の使用が必要な状況において、例えば、幹細胞もしくは幹細胞由来組織または特定のエフェクター機能および低減した免疫原性を有する他の自己体細胞の使用において、治療的アプローチのさらなる開発のための基礎を築く。特に、迅速な臨床解釈を容易にすると考えられるコンストラクトおよび試薬、例えば、免疫原性を回避する、ターゲティングコンストラクト中の選択マーカーtNGFRおよびtEGFR、ならびにそのFDA承認プロドラッグを使用してインビボモデルで供給されるウリジンが使用されている。
細胞機能を制御するための操作されたメカニズムには、制御メカニズムを媒介するタンパク質を発現する細胞の完全に純粋な集団を選択するというさらなる問題がある。細胞毒性作用物質に対して抵抗性にすることによって操作された細胞を選択することが可能であることは、これが、非有害物質を使用して制御することができる細胞の非常に純粋な集団の作製を可能にすることによって実質的に効率を高めることができ、かつ、生命の維持に必要な代謝経路の機能に極めて重要な遺伝子の除去が、細胞が逃避メカニズムを発生するのを防ぐので、特に魅力的である。したがって、この方法は、遺伝的不安定性および悪性形質転換の危険性が役割を果たす状況、および例えば、体性または多能性幹細胞の使用において、それらの抑制を逃れる少数の細胞でさえも悲惨な影響を与え得る状況において、既存の制御メカニズムと比べていくつかの利点を与える。
この概念は、微生物について探究され（Steidler et al., 2003）、酵母遺伝学者によって、ほぼ普遍的な研究ツールとして広く使用されている。これは、複雑な制御メカニズムの導入による代わりに遺伝子のノックアウトによって作り出されるならば、および栄養要求性が、細胞の内在性代謝の一部である非毒性化合物に対するものであるならば、哺乳動物細胞において特に強力であろう。これは、代謝経路の必須遺伝子を破壊し、その経路の産物が外部から供給され、その環境から細胞によって取り込まれる場合のみ、細胞が機能することが可能になることによって、達成することができる。さらに、それぞれの遺伝子が細胞毒性作用物質の活性化にも関与するならば、遺伝子ノックアウト（KO）は、その薬物に対して細胞を抵抗性にし、それによって、細胞集団において非改変細胞の枯渇および操作された細胞の純化を可能にするであろう。代謝に関するいくつかの一遺伝子性先天的エラーは、代謝産物の供給によって治療することができ、したがって、ヒト栄養要求性のモデルと考えることができる。
ある特定の態様では、栄養要求性は、ゲノム編集を介してデノボピリミジン合成経路中のUMPSを破壊することによって、ヒト細胞に導入される。これによって、細胞の機能が外来性ウリジンの存在に依存するようになる。さらに、これは、5-フルオロオロト酸を5-FUに代謝する細胞の能力を無効にし、これによって、インタクトなUMPSアレルを有する残存細胞の枯渇が可能になる。遺伝子操作された栄養要求性によってヒト細胞の機能に影響を及ぼすために、および他の細胞を枯渇させるために、代謝産物を使用する能力は、制御可能な細胞の純粋な集団が必要である様々な適用のための本アプローチの開発をもたらす。
栄養要求性の一例は遺伝性オロト酸尿症であり、これは、UMPS遺伝子中の突然変異が、高用量のウリジンの補給によって治療することができる機能障害をもたらす（Fallon et al., 1964）。この概念を関心対象の細胞タイプに移して、遺伝子操作を使用して、ヒト細胞でUMPS遺伝子をノックアウトし、これによって、ウリジンに対して栄養要求性であり、5-フルオロオロト酸（5-FOA）に抵抗性である細胞を作製した。UMPS-/-細胞株および一次細胞は、インビトロにおいて、ウリジンの存在下でのみ生存および増殖すること、ならびにUMPSが操作された細胞の増殖は、インビボにおいて、ウリジンの補給がない場合に阻害されることが、本明細書において示される。さらに、本細胞は、5-FOAの存在下で培養することによって混合集団より選択することができる。
ある特定の態様では、組織特異的プロモーターをUMPS座位に挿入して、前駆細胞において遺伝子の発現を制御することができ、挿入されたプロモーターと関連する組織型への前駆細胞の分化が、UMPS遺伝子の発現をもたらす。
II.本開示の組成物
細胞選択方法および導入遺伝子の選択的発現で使用するための方法および組成物のいくつかの態様が本明細書において開示される。ある場合には、方法は、細胞を栄養要求性にし、分化した細胞を原栄養性（すなわち、生存および／または増殖に必要とされるすべての栄養素または因子を合成することができる）にし、かつ導入遺伝子の発現を通じて遺伝子療法の有効性、効力、および／または安全性の向上をもたらす方法で、治療的因子をコードする導入遺伝子を含む、または組織特異的プロモーターを含む可能性があるコンストラクトを細胞へ送達することを含む。
特定の栄養要求性誘導座位へのコンストラクトの送達は、例えば、遺伝子の破壊もしくはノックアウト、または遺伝子の活性のダウンレギュレーションを通じて、栄養要求性細胞を作出し、この細胞は、今や、増殖および繁殖に対する栄養要求性因子の継続投与に依存している。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位を標的とするヌクレアーゼシステム、本明細書において開示されるコンストラクトを挿入するためのベクター、キット、ならびに栄養要求性であり、導入されたコンストラクトを発現させることができる改変細胞を作製するためにそのようなシステム、テンプレート、およびベクターを使用する方法を用いることを含む。
いくつかの態様では、改変細胞の増殖および複製を制御する － 増大させる、低下させる、または停止させる － ための、ならびに導入遺伝子の発現を制御するための、ならびに治療的因子のレベルを制御するための、薬学的組成物、治療方法、および栄養要求性因子の投与の方法を含めた、改変細胞の使用のための方法、組成物、およびキットも、本明細書に開示される。
ある場合には、所望の座位へのコンストラクトの送達は、相同組換えなどの方法を介して達成することができる。本明細書において使用する場合、「相同組換え（HR）」は、相同組換え修復メカニズムを介したDNA中の二本鎖切断の修復の間のヌクレオチド配列の挿入を指す。このプロセスは、二本鎖切断を修復するためのテンプレートとして、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」分子または「ドナーテンプレート」を使用する。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを容易にする。ドナー配列は物理的に組み込まれ得るか、または相同組換えを介する切断の修復のためのテンプレートとして使用され、結果として、ヌクレオチド配列の全部または一部が導入され得る。このプロセスは、二本鎖切断を生じさせるいくつかの異なる遺伝子編集プラットフォーム、例えばメガヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR-Cas9遺伝子編集システムによって使用される。
いくつかの態様では、遺伝子は、例えば、複数の治療的因子の発現のために、または合成制御因子として作用するか、もしくは（例えば、第2の座位から転写因子を発現させることによって）改変細胞をある特定の系列に偏らせるように作用する第2の遺伝子の導入のために、2つ以上の座位に送達される。いくつかの態様では、遺伝子は、2つ以上の栄養要求性誘導座位に送達される。例えば、異なる遺伝子または同じ遺伝子の第2のコピーが第2の栄養要求性誘導座位に送達される。
いくつかの態様では、細胞が栄養要求性因子を生成する能力をもはや有さないので、細胞は栄養要求性である。本明細書において使用する場合、「細胞」、「改変細胞」、または「改変宿主細胞」は、同じ細胞に由来する細胞の集団であって、集団の各細胞が同様の遺伝的構成を有し、同じ改変を保持する細胞の集団を指す。
いくつかの態様では、栄養要求性因子は、1種または2種またはそれ以上の栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、非有機分子、非必須アミノ酸、もしくは（正常な生理的濃度と比較して）成分の変化した濃度、またはこれらの組み合わせを含む。本明細書における栄養要求性因子に対するすべての言及は、複数の因子の投与を企図する。本明細書に記載される態様のいずれかでは、栄養要求性因子は、改変宿主細胞を維持するのに十分である濃度において、対象において有毒でもなく生物学的に利用可能でもない栄養素または酵素であり、本出願の全体を通した「栄養要求性因子」へのいかなる言及も、栄養素または酵素への言及を含み得ることを理解されたい。
ある場合には、改変細胞に栄養要求性因子が継続的に供給されない場合、細胞は増殖を停止するか、または死ぬ。ある場合には、改変細胞は、発癌性形質転換を含む他の細胞ベース療法と関連する危険性を低下させる安全スイッチを提供する。
本明細書に開示される方法および組成物は、いくつかの利点、例えば以下を提供する：レンチベクターを用いるような無秩序な組み込みではなく、同じ座位へ組み込むことによる、一貫性がある結果および状態；天然のプロモーターもしくはエンハンサーを有する領域、またはサイレンシングされる領域が避けられることによる、導入遺伝子の一定の発現；ポアソン分布ではなく、1または2コピーである、組み込みの一貫性があるコピー数；および発癌性形質転換の可能性が限られていること。ある場合には、本開示の改変細胞は、レンチベクターまたは他のウイルスベクターによって操作された生成物よりも不均一性が少ない。
A.治療的因子
以下の態様は、栄養要求性宿主細胞中で治療的因子を生成することによって治療される状態を提供する。
例えば、凝固障害は、凝固カスケード中の因子がないか、または突然変異のために機能が低減している、かなり一般的な遺伝性障害である。これは、血友病A（第VIII因子欠損）、血友病B（第IX因子欠損）、または血友病C（第XI因子欠損）を含む。
アルファ-1アンチトリプシン（A1AT）欠損は、血液および肺において不適切なA1ATレベルをもたらす、アルファ1-アンチトリプシンの不完全な生成に引き起こされる、常染色体劣性疾患である。これは、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および肝臓障害の発生と関連し得る。
I型糖尿病は、膵ベータ細胞の免疫介在性破壊がインスリン生成の極めて大きな欠損をもたらす障害である。合併症としては、虚血性心疾患（狭心症および心筋梗塞）、卒中、ならびに末梢血管疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、ならびに透析を必要とする慢性腎疾患をもたらす可能性がある糖尿病性腎障害が挙げられる。
抗体は、疾患を引き起こす標的タンパク質の中和またはクリアランス、ならびにある特定のタイプの細胞（例えば、癌細胞、自己免疫疾患におけるある特定の免疫細胞、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、RSV、Flu、Ebola、CMVなどに感染した細胞）の非常に選択的な死滅に使用される分泌性タンパク質産物である。抗体療法は、腫瘍学、リウマチ学、移植、および眼疾患を含めた、多くのヒトの状態に広く適用されている。ある場合には、本明細書に開示される組成物にコードされる治療的因子は、癌、感染症、および自己免疫疾患などの状態を予防または治療するために使用される抗体である。ある特定の態様では、癌は、対象において、腫瘍の増殖の速度を低下させることによって、または腫瘍のサイズを縮小させることによって、治療される。
治療的使用のためにFDAによって承認されたモノクローナル抗体としては、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、アベルマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、オクレリズマブ、ブロダルマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、インフリキシマブ、オビルトキサキシマブ、アテゾリズマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、ニボルマブ、アリロクマブ、イダルシズマブ、エボロクマブ、ジヌツキシマブ、ベバシズマブ、ペンブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、インフリキシマブ、オビヌツズマブ、ブレンツキシマブ、ラキシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、デノスマブ、オファツムマブ、ベシレソマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブペゴル、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、カツマキソマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ファノレソマブ、アダリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、インフリキシマブ、パリビズマブ、ネシツムマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、ボツムマブ、スレソマブ、アルシツモマブ、イミシロマブ（Imiciromab）、カプロマブ、ノフェツモマブ、アブシキシマブ、サツモマブ、およびムロモナブ-CD3が挙げられる。治療的使用のためにFDAによって承認された二重特異性抗体としては、ブリナツモマブが挙げられる。いくつかの態様では、抗体は、HIVまたは他の感染症を予防または治療するために使用される。HIVの治療で使用するための抗体としては、ヒトモノクローナル抗体（mAb）VRC-HIVMAB060-00-AB（VRC01）；mAb VRC-HIVMAB080-00-AB（VRC01LS）；mAb VRC-HIVMAB075-00-AB（VRC07-523LS）；mAb F105；mAb C2F5；mAb C2G12；mAb C4E10；抗体UB-421（T-リンパ球および単球のCD4分子（ドメイン1）上のHIV-1受容体を標的とする）；Ccr5mab004（Ccr5に対するヒトモノクローナルIgG4抗体）；mAb PGDM1400；mAb PGT121（HIV外被タンパク質のV1V2（PGDM1400）およびV3グリカン依存的（PGT121）エピトープ領域を標的とする組換えヒトIgG1モノクローナル抗体）；KD-247（ヒト化モノクローナル抗体）；PRO140（モノクローナルCCR5抗体）；mAb 3BNC117；ならびにPG9（抗HIV-1 gp120モノクローナル抗体）が挙げられる。
治療的RNAとしては、アンチセンス、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物／抗miR、および合成mRNAが挙げられ、これらのうちのいくつかは、導入遺伝子によって発現され得る。
リソソーム蓄積症（LSD）は、酵素欠乏の結果として、体の細胞中の様々な有毒物質の異常な蓄積を特徴とする、遺伝性代謝疾患である。全部でほぼ50のこれらの障害が存在し、これらは、骨格、脳、皮膚、心臓、および中枢神経系を含めた体の様々な部分に影響を及ぼす。一般的な例としては、スフィンゴリピドーシス、ファーバー病（ASAH1欠損）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼまたはGALCの欠損）、ガラクトシアリドーシス、ガングリオシドーシス、アルファ-ガラクトシダーゼ,ファブリー病（α-ガラクトシダーゼ欠損-GLA、またはアガルシダーゼアルファ／ベータ）、シンドラー病（アルファ-NAGA欠損）、GM1ガングリオシドーシス、GM2ガングリオシドーシス（ベータ-ヘキソサミニダーゼ欠損）、サンドホフ病（ヘキソサミニダーゼ-B欠損）、テイ・サックス病（ヘキソサミニダーゼ-A欠損）、ゴーシェ病タイプ1/2/3（グルコセレブロシダーゼ欠損－遺伝子名：GBA）、ウォルマン病（LAL欠損）、ニーマン・ピック病タイプA/B（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1欠損--SMPD1または酸性スフィンゴミエリナーゼ）、スルファチドーシス、異染性白質ジストロフィー、ハーラー症候群（アルファ-Lイズロニダーゼ欠損--IDUA）、ハンター症候群またはMPS2（イズロネート-2-スルファターゼ欠損-イデュルスルファーゼまたはIDS）、サンフィリポ症候群、モルキオ、マロトー・ラミー症候群、スライ症候群（β-グルクロニダーゼ欠損）、ムコリピドーシス、I細胞病、リピドーシス、=神経セロイドリポフスチン症、バッテン病（トリペプチジルペプチダーゼ-1欠損）、ポムペ（アルグルコシダーゼアルファ欠損）、低ホスファターゼ症（アスホターゼアルファ欠損）、MPS1（ラロニダーゼ欠損）、MPS3A（ヘパリンN-スルファターゼ欠損）、MPS3B（アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ欠損）、MPS3C（ヘパリン-a-グルコサミニドN‐アセチルトランスフェラーゼ欠損）、MPS3D（N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ欠損）、MPS4（エロスルファーゼアルファ欠損）、MPS6（グラスルフェート欠損）、MPS7（B-グルクロニダーゼ欠損）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損）、およびMLD（アリールスルファターゼA欠損）が挙げられる。一まとめにして、LSDは、7000人の出生に約1人の個体数の発生率があり、早期死を含めた深刻な影響がある。これらの疾患のうちのいくつかについて可能性のある治療に対して臨床試験は進行中であるが、多くのLSDについて承認された治療は現在存在しない。すべてではないがいくつかのLSDについての現在の治療選択は、酵素補充療法（ERT）を含む。ERTは、体内において不足しているかまたは存在しない酵素を補充する医学的治療である。ある場合には、これは、酵素を含む溶液の静脈内（IV）注入を患者に与えることによって行われる。
いくつかの態様では、それらを必要とする個体においてLSDを治療する方法が、本明細書において開示され、方法は、本明細書に開示される組成物、例えば本明細書に記載の方法の態様を使用して選択された細胞を使用して、個体に酵素補充療法を提供することを含む。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位に組み込まれた酵素をコードするコンストラクトを含む、エクスビボの改変宿主細胞を含み、該改変宿主細胞は栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ個体で不足している酵素を発現することができ、それによって、個体においてLSDを治療する。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、表2の遺伝子内または表2の遺伝子の発現を制御する領域内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はウリジンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はビオチンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アスパラギン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアスパラギンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アスパルテートトランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアスパルテートである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アラニントランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアラニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、シスタチオニンβ合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はシステインである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、シスタチオニンガンマ－リアーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はシステインである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、グルタミン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はグルタミンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンまたはグリシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、グリシン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はグリシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はチロシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アルギニノコハク酸合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアルギニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アルギニノコハク酸リアーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアルギニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子は葉酸またはテトラヒドロ葉酸である。
いくつかの態様では、それらを必要とする個体において疾患または障害を治療する方法が、本明細書においてさらに開示され、方法は、本明細書に開示される組成物を使用して、タンパク質補充療法を個体に提供することを含む。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位に組み込まれたタンパク質をコードするコンストラクトを含む、エクスビボの改変宿主細胞を含み、該改変宿主細胞は栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ個体で不足しているタンパク質を発現することができ、それによって、個体において疾患または障害を治療する。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、表2の遺伝子内または表2の遺伝子の発現を制御する領域内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はウリジンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はビオチンである。ある場合には、疾患はフリードライヒ失調症であり、タンパク質はフラタキシンである。ある場合には、疾患は遺伝性血管性浮腫であり、タンパク質はC1エステラーゼインヒビター（例えば、HAEGAARDA（登録商標）皮下注射剤）である。ある場合には、疾患は脊髄性筋萎縮症であり、タンパク質はSMN1である。
B.栄養要求性細胞集団
いくつかの態様では、栄養要求性になるように遺伝子操作されている細胞、好ましくはヒト細胞を含む組成物が本明細書において開示される。栄養要求性は、栄養要求性誘導座位における、栄養要求性誘導遺伝子、またはいくつかの態様では栄養要求性因子、および／もしくは治療的因子をコードするコンストラクトの挿入を通じて、誘導され得、治療的因子を発現させることができる。エクスビボ、インビトロ、またはインビボで改変された動物細胞、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞が企図される。他の霊長；商業関連の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットを含めた哺乳動物；商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウを含めたトリの細胞も含まれる。
いくつかの態様では、組織特異的プロモーターは栄養要求性誘導座位に挿入される。例えば、栄養要求性因子、再発現した栄養要求性誘導遺伝子、および／または治療的因子は、前駆細胞が組織特異的プロモーターと関連する組織に分化させられる場合のみ発現する。
いくつかの態様では、前駆細胞は、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞もしくは間葉系間質細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核球（PBMC）である。例えば、細胞は、CARを発現するように操作することができ、それによって、CAR-T細胞を作製する。
対象に投与した場合に改変細胞の免疫拒絶反応を予防するために、改変される細胞は、好ましくは、対象自身の細胞に由来する。したがって、好ましくは、哺乳動物細胞は改変細胞で治療される対象に由来する。ある場合には、哺乳動物細胞は自家細胞である。ある場合には、哺乳動物細胞は、同種異系細胞である。ある場合には、改変T細胞は、例えば、T細胞受容体座位を不活性化することによって、移植片対宿主病を防止するようにさらに改変され得る。ある場合には、改変細胞は、例えば、B2Mを欠失させて、細胞の表面上のMHCクラスIを除去することによって、またはB2Mを欠失させ、次いでHLA-G-B2M融合体を表面に戻して、その表面にMHCクラスIを有さない細胞のNK細胞拒絶反応を予防することによって、免疫不活性であるようにさらに改変され得る。
細胞株は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S.8,945,862に示されるような以下の技法を使用して、維持され、分化させられた幹細胞を含むことができる。いくつかの態様では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、細胞株は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO2003/046141またはChung et al. Cell Stem Cell, February 2008, Vol. 2, pages 113-117に開示される技法によって作製された幹細胞を含むことができる。
例えば、細胞は、上皮、軟骨、骨、平滑筋、横紋筋、神経上皮、重層扁平上皮、および神経節のいずれかにおける再生医学的治療で使用するために対象から単離した幹細胞でもよい。1種または少数種の細胞タイプの死または機能障害に起因する疾患、例えば、パーキンソン病および若年型糖尿病も一般に幹細胞を使用して治療される（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Thomson et al., Science, 282:1145-1147, 1998を参照されたい）。
いくつかの態様では、細胞は、対象から収集され、本明細書に開示される方法に従って改変され、方法は、ある特定の細胞タイプを選択すること、任意で、細胞を拡大すること、および任意で、細胞を培養することを含むことができ、栄養要求性誘導座位に組み込まれたコンストラクトを含む細胞を選択することをさらに含むことができる。
C.コンストラクト
改変宿主細胞のゲノムにコードされる治療的実体は、治療効果、例えば、分子輸送、細胞死の誘導、さらなる細胞の動員、または細胞増殖をもたらし得る。いくつかの態様では、治療効果は治療的タンパク質の発現である。いくつかの態様では、治療効果は、腫瘍細胞の細胞死を含めた誘導性細胞死である。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼシステムを使用してDNAを切断した後、DNA切断の修復中にコンストラクトを挿入するために、相同組換え修復メカニズムを使用してもよい。ある場合には、コンストラクトテンプレートは、ドナーテンプレートが切れ目に隣接する領域にハイブリダイズして、切断を修復するためのテンプレートとして使用されるように、切断の領域中のヌクレオチド配列に相同な領域を含む。
いくつかの態様では、コンストラクトの両側に、栄養要求性誘導座位の断片またはその相補体に相同なヌクレオチド配列が隣接している。ある場合には、コンストラクトは一本鎖、二本鎖、プラスミド、またはDNA断片である。ある場合には、プラスミドは、プロモーターおよび任意で3’UTRを含めた、複製に必要なエレメントを含む。
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列を含むベクターが、本明細書においてさらに開示され、これは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス（組み込み能力のあるレンチウイルスベクターと組み込みに欠陥があるレンチウイルスベクターの両方）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスのベクターでもよい。ウイルスベクターは、ウイルスベクターの複製に必要な遺伝子をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、ターゲティングコンストラクトは、
(1)ウイルスを生成するための、ウイルスベクター骨格、例えば、AAV骨格；
(2)標的部位への高レベルの再現性のあるターゲティングを確実にするために、両側に、少なくとも200bpであるが理想的には400bpである標的部位に相同なアーム（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 56:163-190 (2016)を参照されたい）；
(3)潜在的に、治療的因子をコードしかつ治療的因子を発現することができる導入遺伝子、ならびに；
(4)導入遺伝子に機能的に連結される発現制御配列；ならびに任意で、
(5)改変宿主細胞の濃縮および／またはモニタリングを可能にする追加的なマーカー遺伝子
を含む。
適切なマーカー遺伝子は、当技術分野において公知であり、Myc、HA、FLAG、GFP、トランケートされたNGFR、トランケートされたEGFR、トランケートされたCD20、トランケートされたCD19、および抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。
当技術分野において公知である任意のAAVを使用することができる。いくつかの態様では、主要なAAV血清型はAAV6である。
先行態様のいずれかでは、コンストラクトまたはベクターは、栄養要求性誘導座位の断片、任意で、以下の表2の遺伝子のいずれかに相同なヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、栄養要求性誘導座位の少なくとも200、250、300、350、または400個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも85、88、90、92、95、98、または99％同一であり；400ヌクレオチドまでが、通常、正確な組換えを確実にするのに十分である。前述のパラメーターの任意の組み合わせが想定され、例えば、少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一である。
本開示は、cas9タンパク質、およびガイドRNAを含む、栄養要求性誘導座位へのコンストラクトの組み込みをターゲティングするためのシステムも企図する。
本開示は、前記ドナーテンプレートまたはベクター、および前記栄養要求性誘導座位に対して特異的なエンドヌクレアーゼを含む、栄養要求性誘導座位へのコンストラクトの組み込みをターゲティングするためのシステムをさらに企図する。エンドヌクレアーゼは、例えば、ZFN、TALEN、またはメガヌクレアーゼでもよい。
挿入されるコンストラクトは、急性毒性の理由から細胞の急速な除去が必要とされ得る状況で、座位中に他の安全スイッチ、例えば、標準的な自殺遺伝子（例えばiCasp9）を含むこともできる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法を使用して選択された分化した細胞は、インビトロでの分化の際に原栄養性であるが、本明細書に記載されるように、条件付き安全スイッチ、例えば条件付き不安定化ドメイン、またはリボザイムを挿入することによって、その後（例えば、治療適用のために対象に移入するより前に）再び栄養要求性にすることができ、その結果、栄養要求性因子の除去によって、体内に移植された任意の操作された細胞を排除することができる。これは、操作された細胞が癌性細胞に変換した場合、特に重要である。
ある場合には、ドナーポリヌクレオチドまたはベクターは、任意で、前記導入遺伝子に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む。いくつかの態様では、発現制御配列は、プロモーターもしくはエンハンサー、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発現制御配列、転写後制御配列、またはマイクロRNA（miRNA）である。
D.ヌクレアーゼシステム
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、栄養要求性誘導座位を標的とするヌクレアーゼシステムを含む。例えば、本開示は、
(a)前記栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ切断する、エンドヌクレアーゼ、または
(b)該エンドヌクレアーゼを発現させるためのベクターシステムを含めた、該エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド
を企図する。一例として、エンドヌクレアーゼは、
(i)栄養要求性誘導座位に結合する転写活性化因子様エフェクター（TALE）DNA結合ドメインであって、TALE DNA結合タンパク質が複数のTALE反復単位を含み、各TALE反復単位が、栄養要求性誘導座位の標的配列のヌクレオチドに結合するアミノ酸配列を含む、転写活性化因子様エフェクター（TALE）DNA結合ドメイン、および
(ii)DNA切断ドメイン
を含む融合タンパク質である、TALENである。
(a)Cas（例えば、Cas9）もしくはCpf1ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
(b)前記栄養要求性誘導座位に特異的にハイブリダイズするガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸
を含む、前記栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ切断するCRISPR/CasまたはCRISPR/Cpf1システムも、本明細書に開示される。自然界では、Cas9システムは、Cas9ポリペプチド、crRNA、およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）から構成される。本明細書において使用する場合、「Cas9ポリペプチド」は、天然に存在するCas9ポリペプチド、またはDNAの少なくとも1つの鎖を切断する能力を保持する改変Cas9ポリペプチドを指す。改変Cas9ポリペプチドは、例えば、天然に存在するCas9ポリペプチドに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、または95％同一であり得る。様々な細菌種由来のCas9ポリペプチドを使用することができ；化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）が一般に市販されている。Cas9ポリペプチドは、通常は二本鎖切断を生じさせるが、HNHまたはRuvCドメインに不活性化突然変異を導入することによって、DNAの一本鎖のみを切断する（すなわち、「一本鎖切断」を生成する）ニッカーゼに変換させることができる。同様に、天然に存在するtracrRNAおよびcrRNAは、これらが、引き続き望ましいDNAにハイブリダイズして所望のDNAを標的とする能力、およびcas9に結合する能力を保持する限り、改変することができる。ガイドRNAは、2つのRNAが例えば人工のループを用いて一緒に縮合しているキメラRNAでもよく、またはガイドRNAは、2つのハイブリダイズしたRNAを含むことができる。メガヌクレアーゼまたはCRISPR/CasまたはCRISPR/Cpf1システムは、例えば、突出を含む切断末端を生成するために、栄養要求性誘導座位内に二本鎖切断または1つまたは複数の一本鎖切断を生じさせることができる。
ある場合には、本明細書に記載されるヌクレアーゼシステムは、本明細書に記載されるコンストラクトをさらに含む。
例えば、遺伝子ノックアウトを引き起こす、または遺伝子の発現をダウンレギュレートさせるために、核酸を編集するための様々な方法が、当技術分野において公知である。例えば、様々なヌクレアーゼシステム、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせは、核酸を編集するために使用されることが当技術分野において公知であり、本開示で使用することができる。メガヌクレアーゼは、典型的には、延長した、または融合したDNA認識配列を有する、天然に存在する制限酵素の改変バージョンである。
CRISPR/Casシステムは、例えば、WO2013/176772、WO2014/093635、およびWO2014/089290で詳しく述べられており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。T細胞におけるその使用は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2014/191518で示唆されている。T細胞のCRISPR操作は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるEP3004349で論じられている。
突然変異体（ノックアウト、ノックイン、または遺伝子置換された）細胞株の生成についての時間制限因子は、CRISPR/Cas9プラットフォームの開発の前は、クローンのスクリーニングおよび選択であった。本明細書において使用する場合、用語「CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム」は、Cas9に対する結合部位および改変される領域に対して特異的なターゲティング配列を有するガイドRNA（gRNA）（さらに、「シングルガイドRNA」（sgRNA））配列を含む遺伝子操作ツールを指す。Cas9はgRNAに結合して、標的領域に結合し、標的領域を切断するリボ核タンパク質を形成する。ある特定の態様では、gRNA/sgRNAは、2018年5月10日に出願されたU.S. 62/669,848に記載のものから選択される。
プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含むgRNA配列は、表1に提供される。
（表１）gRNA配列
Figure 2022532535000006
CRISPR/Cas9プラットフォーム（これは、タイプII CRISPR/Casシステムである）に加えて代替システムが存在し、これには、タイプI CRISPR/Casシステム、タイプIII CRISPR/Casシステム、およびタイプV CRISPR/Casシステムが含まれる。様々なCRISPR/Cas9システムが開示されており、数例を挙げれば、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（SpCas9）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9（StCas9）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Cas9（CjCas9）、およびナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）Cas9（NcCas9）が挙げられる。Casシステムの代替物としては、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）Cpf1（FnCpf1）、アシダミノコッカス属種Cpf1（AsCpf1）、およびラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ND2006 Cpf1（LbCpf1）のシステムが挙げられる。上記のCRISPRシステムのいずれかを、本明細書に開示される細胞株を作製するための方法で使用することができる。例えば、使用されるCRISPRシステムはCRISPR/Cas9システム、例えば、化膿性連鎖球菌CRISPR/Cas9システムでもよい。
E.栄養要求性因子
いくつかの態様では、単一遺伝子の破壊が所望の栄養要求性を生じさせる。代替の態様では、複数の遺伝子の破壊が所望の栄養要求性をもたらす。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、栄養要求性因子を生成するタンパク質をコードする遺伝子であり、タンパク質には、栄養要求性因子を生成するための経路の上流のタンパク質が含まれる。
本明細書に記載されるいくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子（対応する栄養要求性因子はウラシルである）、またはホロカルボキシラーゼ合成酵素をコードする遺伝子（対応する栄養要求性因子はビオチンである）である。いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、表2の以下の遺伝子より選択される。表2の遺伝子は、サッカロミセス属（Saccharomyces）ゲノムデータベース（SGD）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cherry et al. 2012, Nucleic Acids Res. 40:D700-D705を参照されたい）の酵母表現型オントロジーデータベースからの「化学」データとともにダウンロードした、「栄養要求性」と注釈が付けられた表現型を有する出芽酵母（S. cerevisiae）遺伝子を選択することによって、照合された。これらの遺伝子は、YeastMine（登録商標）データベースを使用して、または代替の態様では、サッカロミセス属ゲノムデータベース（SGD）を使用して、ヒト相同体に変換された。遺伝子は、ENSEMBLデータベース（www.ensembl.org）に見られる、そのENSEMBL遺伝子記号およびENSG識別子によって、特定される。ENSG識別子（例えば、ENSG00000）の最初の5つの0は、除去した。
（表２）栄養要求性誘導座位
Figure 2022532535000007
Figure 2022532535000008
Figure 2022532535000009
CCBL1はKYAT1とも称され得る。CCBL2はKYAT3とも称され得る。DHFRL1はDHFR2とも称され得る。PYCRLはPYCR3とも称され得る。HRSP12はRIDAとも称され得る。
栄養要求性因子は、1種または2種またはそれ以上の栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、非有機分子、非必須アミノ酸、もしくは（正常な生理的濃度と比較して）成分の変化した濃度、またはこれらの組み合わせでもよい。本明細書における栄養要求性因子に対するすべての言及は、複数の因子の投与を企図する。対象に対して毒性がなく、かつ生物学的に利用可能でないか、または未治療の対象において、改変宿主細胞の増殖および複製を維持するのに十分な濃度で存在しない限り、いかなる因子も適切である。
例えば、栄養要求性因子は、増殖に必要とされる物質である、または改変宿主細胞の代謝において補助因子として機能する、栄養素でもよい。様々な栄養要求性因子が表2に開示される。ある特定の態様では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、セリン、ウリジン、バリン、およびコレステロールより選択される。ビタミンB7としても公知であるビオチンは、細胞増殖に必要である。ある場合には、バリンは、造血幹細胞の増殖および維持に必要とされる。ある場合には、バリン補給の必要を軽減し、それによって、バリンが食事から除かれる場合に細胞に非改変細胞と比較して選択的利点を与える酵素をHSCにおいて発現するために、本明細書に開示される組成物は使用される。
F.コンストラクトの挿入
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、表2に開示されるものより選択される標的遺伝子またはその遺伝子発現を制御する領域内にある。いくつかの態様では、標的遺伝子は、UMPS（ウリジンに対して栄養要求性の細胞株を作出する）およびホロカルボキシラーゼ合成酵素（ビオチンに対して栄養要求性の細胞株を作出する）より選択される。いくつかの態様では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、セリン、ウリジン、およびコレステロールより選択される。
本明細書に記載される細胞を作製するために前記ヌクレアーゼシステムを使用する方法が本明細書においてさらに開示され、これは、（a)栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ切断する1種または複数種のヌクレアーゼシステム、例えば、メガヌクレアーゼ、例えばZFNもしくはTALEN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼ、例えばCRISPR/Cas9の構成成分、および(b)本明細書に記載されるコンストラクトまたはベクターを細胞に導入する工程を含む。各構成成分は細胞に直接導入することができ、または前記1種または複数種のヌクレアーゼシステムの構成成分をコードする核酸を導入することによって、細胞中で発現させることができる。方法は、第2の座位のDNAを標的としかつ切断する第2のヌクレアーゼシステム、例えば、第2のメガヌクレアーゼもしくは第2のCRISPR/Casヌクレアーゼ、または第2の座位のDNAを標的とする第2のガイドRNA、または前述のいずれかをコードする核酸、および(b)第2のコンストラクトまたはベクターを導入する工程を含むこともできる。第2のコンストラクトまたはベクターは、異なる導入遺伝子または同じ導入遺伝子の第2のコピーを含むことができ、これらは、次いで、本明細書に記載されるそのような方法に従って、第2の座位に組み込まれるであろう。
ある特定の態様では、そのような方法は、エクスビボで、宿主細胞の栄養要求性誘導座位に、治療的因子をコードする導入遺伝子を含むコンストラクトの組み込みをターゲティングするであろう。
そのような方法は、(a)任意で前記細胞を拡大させた後に、または任意で前記細胞を拡大させる前に、コンストラクトまたはベクターを細胞に導入する工程、および(b)任意で細胞を培養する工程をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、本開示は、改変された哺乳動物細胞を作製する方法であって、(a)Cas9ポリペプチド、または該Cas9ポリペプチドをコードする核酸、(b)栄養要求性誘導座位に特異的なガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および(c)本明細書に記載されるコンストラクトまたはベクターを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法を企図する。方法は、(a)第2の栄養要求性誘導座位に特異的な第2のガイドRNAおよび(b)第2のコンストラクトまたはベクターを導入する工程を含むこともできる。そのような方法では、ガイドRNAはキメラRNAでもよく、または2つのハイブリダイズしたRNAでもよい。
これらの方法のいずれかでは、ヌクレアーゼは、栄養要求性誘導座位内に1つまたは複数の一本鎖切断を、または栄養要求性誘導座位内に1つの二本鎖切断を生じさせることができる。これらの方法では、栄養要求性誘導座位は、前記コンストラクトまたはベクターを用いる相同組換えによって改変されて、該座位へコンストラクトが挿入される。
方法は、(c)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択する工程をさらに含むことができる。選択工程は、(i)生存するために栄養要求性因子を必要とする細胞を選択する工程、および任意で(ii)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択する工程を含むことができる。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子であり、細胞は、細胞を5-FOAと接触させることによって選択される。UMPS遺伝子は5-FOAを5-FUMPに代謝するのに必要とされ、5-FUMPは、RNA/DNA中へのその取り込みの理由から、細胞に対して毒性がある。したがって、UMPS遺伝子中に破壊がある細胞は、5-FOA処理を切り抜けて生存すると考えられる。得られた細胞は、すべての細胞が導入遺伝子を含み得るとは限らないが、すべて栄養要求性であると考えられる。導入遺伝子に対するその後のポジティブ選択は、栄養要求性であり、かつ導入遺伝子を発現することもできる改変宿主細胞のみを単離すると考えられる。
いくつかの態様では、本開示は、改変ヒト宿主細胞を作出する方法であって、(a)細胞のプールを得る工程、(b)ヌクレアーゼを使用して、例えば、遺伝子の発現をノックアウトまたはダウンレギュレーションすることによって、栄養要求性誘導座位にコンストラクトを導入する工程、および(c)栄養要求性についてスクリーニング工程、および(d)導入遺伝子の存在についてスクリーニング工程を含む方法を提供する。
スクリーニング工程は、表2に開示される栄養要求性因子のうちの1つとともにまたはそのまま細胞を培養することによって、行うことができる。
機能的または治療的因子、抗体、および細胞表面レセプターを発現することができる、大きな導入遺伝子を含めた導入遺伝子を含むコンストラクトの挿入のための技法は、当技術分野において公知である（例えば、Bak and Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18; 20(3): 750-756（EGFRの組み込み）；Kanojia et al., Stem Cells. 2015 Oct;33(10):2985-94（抗Her2抗体の発現）；Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117（CARの部位特異的組み込み）；O’Connell et al., 2010 PLoS ONE 5(8): e12009（ヒトIL-7の発現）；Tuszynski et al., Nat Med. 2005 May;11(5):551-5（線維芽細胞におけるNGFの発現）；Sessa et al., Lancet. 2016 Jul 30;388(10043):476-87（MLDを治療するためのエクスビボ遺伝子療法におけるアリールスルファターゼAの発現）；Rocca et al., Science Translational Medicine 25 Oct 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347（フラタキシンの発現）；Bak and Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Issue 3, 18 July 2017, Pages 750-756（単一座位への大きな導入遺伝子カセットの組み込み）、Dever et al., Nature 17 November 2016: 539, 384-389（改変細胞を選択し濃縮するための、造血幹細胞（HSC）およびHSPCへのtNGFRの付加）を参照されたい；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
G.遺伝子発現制御
ある場合には、導入遺伝子は、任意で、遺伝子の内在性プロモーター、または異種性の構成的もしくは誘導性プロモーター、エンハンサー、組織特異的プロモーター、あるいは転写後調節配列を含めた、1種または複数種の発現制御配列に連結される。例えば、導入遺伝子の発現を駆動するために、組織特異的プロモーター（転写性ターゲティング）を使用することができ、またはある特定の組織において発現を避けるために、RNA中に調節配列（マイクロRNA（miRNA）標的部位）を含むことができる（転写後ターゲティング）。ある場合には、発現制御配列は正常個体と同じ発現パターン（生理的発現）に従って治療的導入遺伝子を発現するように、機能する（プロモーターおよび調節配列への参照のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Toscano et al., Gene Therapy (2011) 18, 117-127 (2011)を参照されたい）。
構成的哺乳動物プロモーターとしては、限定されないが、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPTR）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのためのプロモーター、α-アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。真核細胞で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート（LTR）、および他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。一般に使用されるプロモーターとしては、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター／エンハンサー、EF1a（伸長因子1a）、SV40（シミアンウイルス40）、ニワトリβ-アクチンおよびCAG（CMV、ニワトリβ-アクチン、ウサギβ-グロビン）、ユビキチンCおよびPGKが挙げられ、これらすべては、ほとんどの細胞タイプにおいて構成的に活性な高レベルの遺伝子発現を提供する。他の構成的プロモーターは当業者に公知である。
誘導性プロモーターは、誘導作用物質の存在下で活性化される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を増大するように活性化される。他の誘導性プロモーターとしては、アルコール調節型、テトラサイクリン調節型、ステロイド調節型、金属調節型、栄養素調節型プロモーター、および温度調節型プロモーターが挙げられる。
ある特定の態様において、プロモーターは組織特異的である。例えば、プロモーターは関連組織への細胞の分化によって活性化され得る。肝臓特異的ターゲティングについて、第VIIa因子、第VIII因子または第IX因子の発現を肝細胞にターゲティングするために、天然およびキメラのプロモーターおよびエンハンサーが、ウイルスおよび非ウイルスベクターに組み込まれている。アルブミンおよびヒトα1アンチトリプシン（hAAT）などの肝臓特異的遺伝子由来のプロモーター領域は、天然プロモーターの好例である。あるいは、キメラプロモーターが、特異性および／またはベクター効率を高めるために開発された。好例は、4コピーの肝臓特異的ApoE/hAATエンハンサー／プロモーターの組み合わせを内部に持つ(ApoE)4/hAATキメラプロモーター／エンハンサー、ならびに1コピーのhAATプロモーターおよび2コピーのα(1)-ミクログロブリンエンハンサーからなるDC172キメラプロモーターである。
筋肉特異的ターゲティングについて、効率的かつ特異的な筋肉発現を達成するために、天然（クレアチンキナーゼプロモーター－MCK、デスミン）および合成（α-ミオシン重鎖エンハンサー－／MCKエンハンサー－プロモーター（MHCK7））プロモーターがウイルスおよび非ウイルスベクターに含まれている。
内皮特異的ターゲティングについて、内皮特異的発現を駆動するために、天然プロモーター（vWF、FLT-1、およびICAM-2）と合成プロモーターの両方が使用されている。
骨髄細胞ターゲティングについて、骨髄性転写因子CAATボックスエンハンサー結合ファミリータンパク質（C/EBP）および顆粒球の分化の間に高発現しているPU.1に対する結合部位を含む合成キメラプロモーターが、主として骨髄細胞での導入遺伝子の発現を指示することが報告されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Santilli et al., Mol Ther. 2011 Jan;19(1):122-32を参照されたい。CD68も骨髄ターゲティングのために使用することもできる。
遺伝性疾患の遺伝子療法のための組織特異的プロモーターおよびベクターの例を表3に示す。
（表３）組織特異的プロモーター
Figure 2022532535000010
Figure 2022532535000011
Figure 2022532535000012
いくつかの態様では、本明細書に記載されるコンストラクトの導入遺伝子の発現を調節するために使用するためのプロモーターとしては、T reg様細胞に特異的なプロモーターが挙げられる。安定なT reg細胞集団の発現プロファイルはPasseriniらによって記載されており、彼らは、通常のCD4+T細胞は、FOXP3発現を導入することによって、十分に機能的なT reg様細胞に変換され得ることを示した（その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Passerini, Laura, et al. "CD4+ T cells from IPEX patients convert into functional and stable regulatory T cells by FOXP3 gene transfer." Science translational medicine 5.215 (2013): 215ra174-215ra174を参照されたい）。したがって、いくつかの態様では、FOXP3（ENSG00000049768）の発現制御配列によって、例えば、FOXP3プロモーターを使用して、本明細書に記載されるコンストラクトを調節することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるコンストラクトの導入遺伝子の発現を調節するために使用するためのプロモーターとしては、細胞ナイーブ関連プロモーターに特異的なプロモーター（例えば、CD45RA/RO［ENSG00000081237］またはCCR7［ENSG00000126353］）が挙げられる。したがって、いくつかの態様では、CD45受容体AもしくはO、またはCCR7の発現制御配列またはプロモーターによって本明細書に記載されるコンストラクトを調節することができる。
遺伝性疾患の遺伝子療法のための生理的に調節されるプロモーターおよびベクターの例を表4に示す。
（表４）生理的に調節されるベクター
Figure 2022532535000013
組織特異的および／または生理的に調節される発現は、導入遺伝子のmRNA安定性および／または翻訳効率を改変する（転写後ターゲティング）ことによって、遂行することもできる。あるいは内在性宿主細胞機構を動員して、特定の組織または細胞タイプにおいて導入遺伝子の発現を遮断する（脱ターゲティング）ために、発現mRNAへのmiRNA標的認識部位（miRT）の組み込みが使用されている。miRNAは、miRTと称される特定のmRNAの3‘UTR領域に完全にまたは部分的に相補的である、およそ22ヌクレオチドの非コードRNAである。特定のmiRTへのmiRNAの結合は、翻訳の減衰／不活性化および／または分解を促進する。miRNAを介する発現の調節は、Geisler and Fechner, World J Exp Med. 2016 May 20, 6(2): 37-54；Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009 Aug, 10(8):578-85；Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 Nov, 80(5):393-403に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。特定のmiRNA細胞タイプによって認識されるmiRT-ベクターを操作することは、所望されない細胞タイプにおいて治療的遺伝子の発現をノックダウンするための有効な方法であることが示されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Toscano et al.、前記を参照されたい）。
ノックアウトされた栄養要求性誘導遺伝子を発現し、それによって、細胞分化またはプラスミド形質導入の際に栄養要求性をレスキューする導入遺伝子は、条件付き不安定化ドメインでタグ付けされ得る。本明細書において使用される不安定化ドメインは、それが関連する遺伝子産物に不安定化特性を与えるペプチド、タンパク質、またはそれらの小部分を指す。不安定化ドメインは公知である（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO2018/160993を参照されたい）。WO2018/160993に記載されているように、刺激またはリガンドの有無に基づいて、条件付き不安定化ドメインを活性化させて、それが関連する遺伝子産物の安定性または不安定性を誘導することができる。本文脈では、不安定化ドメインを、例えば再発現した栄養要求性誘導遺伝子に遺伝的に付加することができ、その結果、再発現遺伝子を提供する導入遺伝子の組み込みおよび発現の際に、不安定化ドメインが遺伝子に結合する。遺伝子と不安定化ドメインの組み合わせは、例えば、不安定化ドメインに安定性シグナルを与えるリガンドを提供することによって、前駆体または非形質導入細胞が除去されるインビトロ選択プロセスの間「安定な」ままであると考えられる。次いで、患者への導入時に、または患者への導入の前にリガンドを除去することによって、本組み合わせを不安定な状態にすることができ、それによって、細胞を再び栄養要求性にすることができる。これは、さらなる機能的安全スイッチの恩恵という追加的な恩恵を提供し、これによって、本明細書に記載される栄養要求性選択方法を使用して生成される細胞を、場合によっては、再発現した栄養要求性誘導遺伝子を条件付きに不安定化するようにすることができ、他の場合では、再発現した栄養要求性誘導遺伝子を安定化するようにすることができる。自己切断リボヌクレオチドエレメントであるリボザイムは、栄養要求性誘導遺伝子をコードする導入遺伝子のRNA転写物の自己破壊を誘発するためのリボザイムをコードすることによって、同様の効果に使用することができる。したがって、不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチの少なくとも1つによって、本明細書に記載される栄養要求性誘導遺伝子のいずれかを条件付きにすることができる。
III. 本開示の方法
A.単一栄養要求性システム
本開示は、分化した細胞の集団を生成するために本明細書に記載されるコンストラクトを使用する方法を提供する。提供される方法は、特定の細胞型の純粋および／または濃縮集団を生成するために使用することができる。特定の細胞型の純粋および濃縮集団を生成することは、治療的および診断的適用で有用であり得る。例えば、分化した前駆細胞に由来するグルコース応答性成熟ベータ細胞の純化または濃縮集団は、糖尿病の治療で有用であり得る。
記載される方法によって作製された分化した細胞は前駆細胞に由来し得る。いくつかの態様では、前駆細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、および心筋細胞であり得る。
いくつかの態様では、方法は、細胞において組換えまたは相同組換えを誘導するために複数の前駆細胞をヌクレアーゼシステム接触させる工程を含む。いくつかの態様では、CRISPR/Casは相同組換えを誘導するために配置されるヌクレアーゼシステムである。CRISPR/Casシステムは、栄養要求性誘導遺伝子のプロモーターの必ずしも必要ではない部分を標的とするガイドRNA（gRNA）を含むことができる。本明細書において使用される場合、「必ずしも必要ではない部分」は、ヌクレアーゼによって破壊された場合に、および／または導入遺伝子の挿入によって中断された場合に、プロモーターが機能的なままであり、かつ内在性の細胞性刺激、例えば転写および他の因子に応答性のままである、遺伝子のプロモーターの部分を指す。ヌクレアーゼシステムが栄養要求性誘導遺伝子のプロモーターの必ずしも必要ではない部分を一旦標的化すると、コンストラクトは、ヌクレアーゼによって標的化される部位で相同組換えを誘導し、その結果、コンストラクトが細胞のゲノムに挿入されるように、挿入され得る。コンストラクトを両アレルに挿入することができ、結果として、ホモ接合型ノックイン細胞がもたらされる。相同組換えのために標的化され得る栄養要求性誘導座位を表2に提供する。（例えば、両アレルに）挿入されるコンストラクトは、組織特異的プロモーターの全部または一部および
Figure 2022532535000014
からなる群より選択される遺伝子の少なくとも一部を含むことができる。このようにして作製された細胞は、栄養要求性誘導座位に対応する栄養要求性因子に対して栄養要求性であると考えられる。
細胞を栄養要求性因子と接触させることによって、細胞を増殖させることができる。栄養要求性誘導遺伝子またはその一部を発現する導入遺伝子コンストラクトを有する細胞のみが、栄養要求性因子を取り除くことを切り抜けて生存すると考えられる。ヌクレアーゼおよび／または組換え工程の失敗により栄養要求性にされなかった集団の細胞は、いくつかの態様では、生存すると考えられる。栄養要求性誘導座位がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子である態様では、細胞を5-FOAと接触させることによって、細胞を選択することができる。UMPS遺伝子は5-FOAを5-FUMPに代謝するのに必要とされ、5-FUMPは、RNA/DNA中へのその取り込みの理由から、細胞に対して毒性がある。したがって、UMPS遺伝子中に破壊がある細胞は、5-FOA処理を切り抜けて生存すると考えられる。得られた細胞は、すべての細胞が導入遺伝子を含むとは限らないが、すべて栄養要求性であると考えられる。導入遺伝子に対するその後のポジティブ選択は、栄養要求性であり、かつ導入遺伝子を発現することもできる改変宿主細胞のみを単離すると考えられる。
本明細書に記載される方法は、組織特異的プロモーターと関連する組織への前駆細胞の分化を刺激するために使用することができる。この文脈では、望ましい分化した細胞または組織型で特異的に発現している内在性の組織特異的因子によって、栄養要求性誘導遺伝子を再発現する導入遺伝子コンストラクトを調節することができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載されるコンストラクトは、望ましい細胞運命、細胞型、または組織型への細胞の分化に応じて発現する。このようにして、本方法は、例えば、望ましい細胞型に分化したインビトロで分化した細胞の集団を選択するために使用することができる。分化した細胞の集団を生成するために本明細書に記載されるコンストラクトを使用する方法は、栄養要求性因子を除去し、それによって、分化した細胞を選択する工程をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、導入遺伝子の組織特異的プロモーターはUMPS遺伝子または他の栄養要求性誘導遺伝子標的のプロモーターに置き換わる。
いくつかの態様では、導入遺伝子が挿入されたコンストラクトは、治療的因子または治療的因子をコードする遺伝子をさらに含むことができる。治療的因子は、標的化される栄養要求性誘導遺伝子またはその一部を有するカセットとして発現させることができる。治療的因子を含むコンストラクトの発現は、例えば、2つ以上の発現される構成成分の間にリンカーを有するポリシストロニックコンストラクトを作出することによって最適化することができ、リンカーは配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）などである。例示的なリンカー配列は、SEQ ID NO: 20、22、24、25、26、27、28、29、および30として提供される。
いくつかの態様における再発現した栄養要求性誘導遺伝子または他の導入遺伝子の発現は、EF1a（SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 32）などの真核生物のプロモーター配列によって調節することができる。バイシストロニックまたはマルチシストロニックなコンストラクトは、記載されるリンカーを用いて、またはSEQ ID NO: 33のものなどの配列内リボソーム進入部位（IRES）を使用してコンストラクトの発現される構成成分を分離することによって、調製することができる。
終結およびポリアデニル化シグナル配列は、本明細書に記載される導入遺伝子コンストラクトから産生される転写産物を終結および安定化するために使用することができる。いくつかの態様では、転写は、SEQ ID NO: 39または40のものなどのウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化シグナル配列を使用して、終結および安定化される。
標的栄養要求性誘導遺伝子座において相同組換えを指示するために、栄養要求性誘導遺伝子座のヌクレオチド配列を含むコンストラクトの一部は、内在配列に相補的な相同性アームとして働くことができ、その結果、これは、ハイブリダイズし、相同組換えを開始すると考えられる。いくつかの態様では、標的栄養要求性誘導遺伝子座で指示された相同組換えは、遺伝子の発現が破壊されないように栄養要求性誘導遺伝子座にコンストラクトを挿入することを必然的にともなう。例えば、栄養要求性誘導遺伝子のプロモーターの必ずしも必要ではない部分を標的とする相同組換えコンストラクトは、栄養要求性誘導遺伝子とインフレームで挿入され得、結果として、栄養要求性誘導遺伝子のオープンリーディングフレームをインタクトなままにしておく、例えば組織特異的プロモーターを含むコンストラクトの挿入がもたらされる。
本明細書に記載される方法は、特定の組織に分化した細胞を選択するために使用することができる。組織は、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択されるものであり得る。いくつかの態様では、分化した細胞は免疫細胞であり、免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞に分化することができる。
本明細書に記載されるコンストラクトおよび方法で利用可能な組織特異的プロモーターは、以下からなる群より選択することができる：WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーター。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるコンストラクトは、発現される遺伝子産物を条件付き不安定化ドメインでタグするか、またはコンストラクトの転写されるメッセージ中にリボザイムスイッチを挿入し、遺伝子産物の条件付き不安定化またはRNAメッセージの破壊を導く。
本明細書に記載される分化した細胞の集団を選択する方法のいくつかの態様は、1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位をコードするDNA配列を栄養要求性誘導遺伝子中にノックインするように設計されているコンストラクトと前駆細胞を接触させる工程を含むことができる。このようにして栄養要求性誘導遺伝子中にノックインしたmiRNA標的部位は、前駆細胞を栄養要求性誘導遺伝子に対応する栄養要求性因子に対して栄養要求性にする（例えば、表2を参照されたい）。非前駆細胞運命への前駆細胞の分化は、1種または複数種の前駆細胞特異的miRNAをもはや発現しなくし、それによって栄養要求性誘導遺伝子のmiRNA-媒介性抑制を解除し、栄養要求性因子を取り除いた際に細胞の生存を可能にする。本明細書に記載される方法を使用して選択された分化した細胞集団は、望ましい細胞型の純化または濃縮集団であり得る。分化した細胞は、疾患または状態を治療するために、該細胞型を必要としている対象に投与することができる。例えば、免疫療法を必要としている患者を治療するために、記載される分化した免疫細胞を投与することができ、またはインスリン障害の患者を治療するために、記載される分化した成熟ベータ細胞を投与することができる。したがって、栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトにより生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供し；遺伝子のオープンリーディングフレームを含むコンストラクトを組織特異的遺伝子座に挿入し、組織特異的遺伝子の発現が破壊されず、それによって、組織特異的遺伝子座と関連する組織への前駆細胞の分化の際に、栄養要求性因子または再発現した栄養要求性誘導遺伝子を作製する方法が、本明細書において提供される。前駆細胞は、例えば、iPSCまたは胚性幹細胞であり得る。
いくつかの態様では、細胞に導入される栄養要求性誘導遺伝子または他の遺伝子コンストラクトは、プラスミドの組み込みを介してもよく、またはエピソーム発現を介してもよい。選択的増殖および分化のための、細胞への本明細書に記載されるコンストラクトの導入は、例えば、DNAプラスミド、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、またはナノ粒子送達システムを使用して達成することができる。
B.分割栄養要求性システム
本明細書に記載される方法を使用して栄養要求性にされた細胞および細胞集団を、少なくとも2つの別々の方法：1)栄養要求性因子を細胞に与えること；または2)ノックアウトもしくはダウンレギュレートされた栄養要求性遺伝子を細胞中で発現させることによって栄養要求性をレスキューすることによって、インビボまたはインビトロで維持する（すなわち、生存可能な状態および／または増殖状態で持続させる）ことができる。例えば、本明細書に記載されるUMPS-/-細胞の場合に、ウリジンを与えることによって、またはUMPS導入遺伝子を発現させる（すなわち、UMPSの再発現）によって、細胞を維持することができる。本明細書に記載されるように、栄養要求性遺伝子の再発現は、栄養要求性因子が除去されるかまたは取り除かれる場合に、細胞の集団中の首尾よくトランスフェクトされた細胞の選択を可能にする。例えば本明細書に記載される組織特異的プロモーターを含む発現制御配列の制御下に栄養要求性遺伝子の再発現を置くことにより、首尾よくトランスフェクトされた細胞の選択が可能になり、さらに、望ましい分化した細胞集団（すなわち、選択された組織特異的プロモーターに特異的な因子を発現する細胞）の選択が可能になる。本明細書に記載される方法のいくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、少なくとも1つの組織特異的因子の発現によって示される。いくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、2つ以上の組織特異的因子の発現によって示される。いくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、3つ以上の組織特異的因子の発現によって示される。いくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、4つ以上の組織特異的因子の発現によって示される。いくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、5つ以上の組織特異的因子の発現によって示される。いくつかの態様では、望ましい分化した細胞は、6つ以上の組織特異的因子の発現によって示される。1つより多い組織特異的因子を選択することによって、望ましい分化した細胞の選択の特異性を増大させることができる。すなわち、望ましい分化した細胞集団を示す2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上の組織特異的因子を発現する細胞のみを細胞の集団から選択することは、選択方法の特異性を向上させ、かつ望ましい分化した細胞の選択された集団の純度を高める。
いくつかの態様では、望ましい分化した細胞集団を示す2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上の組織特異的因子を発現する細胞のみを細胞の集団から選択する工程は、2つ以上の栄養要求性誘導座位、3つ以上の栄養要求性誘導座位、4つ以上の栄養要求性誘導座位、5つ以上の栄養要求性誘導座位、または6つ以上の栄養要求性誘導座位に栄養要求性遺伝子を送達する（すなわち、これらの座位で栄養要求性遺伝子を再発現させる）ことを含む。
いくつかの態様では、1つより多い再発現される栄養要求性遺伝子で1つより多い栄養要求性誘導座位を置き換えるかまたは破壊することは、好ましくないかまたは望ましくなく、それにもかかわらず、望ましい分化した細胞集団を示す1つより多い組織特異的因子を選択することは、依然として望ましい。こうした状況下で、「分割栄養要求性」を導入する、および望ましい分化した細胞集団を示す1つより多い組織特異的因子の選択を可能にするために、1つより多い独立した機能ドメインまたはサブユニットを有する栄養要求性遺伝子を活用することができる。例えば、栄養要求性遺伝子は、第1の独立した機能ドメインおよび第2の独立した機能ドメインを有し得る。栄養要求性遺伝子の再発現は、完全な機能的遺伝子として栄養要求性遺伝子を発現させることによって達成することができ、または第1の独立した機能ドメインが第1の発現制御配列の制御下にあり、第2の独立した機能ドメインが第2の発現制御配列の制御下にある状態で、第1および第2の独立した機能ドメインの発現を分割することによって達成することができる。第1の独立した機能ドメインを第1の座位に送達することができる。いくつかの態様では、第2の独立した機能ドメインを第2の座位に送達することができる。第1の座位は栄養要求性誘導座位であり得る。第2の座位は、例えば、CCR5などのセーフハーバー座位であり得る。いくつかの態様では、CCR5座位は、CCR5相同性アームを使用して標的化され、相同性アームは左および右相同性アームと定義される。例示的なCCR5左相同性アームはSEQ ID NO: 11と定義される。代替のCCR5左相同性アームは、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14として提供される。例示的なCCR5右相同性アームはSEQ ID NO: 12と定義される。代替のCCR5右相同性アームはSEQ ID NO: 15として提供される。あるいは、例えば、それぞれSEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12のCCR5左および右相同性アームを使用して、第1と第2の独立した機能ドメインの両方をCCR5などのセーフハーバー座位に送達することができる。
CCR5に対する左および右相同性アームは、標的CCR5座位への高レベルの再現性のあるターゲティングを確実にするために、両側（左および右）に、少なくとも200bpであるが理想的には400bpの標的CCR5座位に対する相同性を有するべきである。本明細書に記載されるCCR5左および右相同性アーム（すなわち、SEQ ID NO: 11、12、13、14、および15）は、例としてのみ提供される。有効な相同性アームは、標的座位中の位置に対してコンストラクトの左（5’）側をターゲティングする約100、約200、約300、約400、約500、または約600ヌクレオチド、および標的座位中の位置に対してコンストラクトの右（3’）側をターゲティングする約100、約200、約300、約400、約500、または約600ヌクレオチドを使用して、CCR5座位を標的とするように設計することができる。同様の様式で、任意の他の非CCR5遺伝子座を相同組換えのために標的化することができる。
第1の発現制御配列は、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第1の転写因子によって調節される、第1の組織特異的プロモーターであり得る。同様に、第2の発現制御配列は、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第2の転写因子によって調節される、第2の組織特異的プロモーターであり得る。この方法で、単一の栄養要求性誘導遺伝子より多くをノックアウトもダウンレギュレートもする必要なしで、望ましい分化した細胞集団の特異性を向上させるために、複数の組織特異的因子を選択することができる。したがって、操作された細胞の栄養要求性は、「分割されている」と言われ、栄養要求性因子を除去するまたは取り除くことを切り抜けて生存するために、栄養要求性遺伝子の独立した機能ドメインのそれぞれの再発現を必要とする。これにより、1つの栄養要求性因子を使用して、複数の導入遺伝子の組み込みを選択することが可能になる。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はヒトUMPS（ENSG00000114491）であり、第1の独立した機能ドメインは、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはOPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（OMPdecaseまたはODC）を含む。ヒトUMPSでは、OPRTおよびODCは同じ遺伝子内に別々の独立した機能ドメインを含むが、他の生物では、2つのドメインは別々の遺伝子によって発現される。したがって、ヒトUMPS-/-細胞では、UMPS活性は、（例えば、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のヌクレオチド配列を使用した）UMPS cDNAの再発現によって、または（例えば、SEQ ID NO: 4のヌクレオチド配列を使用した）OPRT活性と（例えば、SEQ ID NO: 6のヌクレオチド配列を使用した）ODC活性の別々の発現によって、置き換えられ得る。ウリジンの非存在下で、ヒトUMPS-/-細胞はOPRTおよびODC活性の発現なしでは生存しないと考えられ、これによって、OPRTとODC活性の両方を発現する両方の導入遺伝子が細胞の維持および生存のために存在する条件が確立される。この例では、OPRTおよびODCの独立した機能ドメインを別々の発現制御配列の制御下に置くことによって、1つより多い系譜特異的遺伝子を使用して、望ましい分化した細胞集団を選択することが可能になる。例えば、OPRTを第1の座位に送達することができ、ODCを第2の座位に送達することができる。第1の座位は栄養要求性誘導座位であり得る。第2の座位は、例えば、CCR5などのセーフハーバー座位であり得る。いくつかの態様では、第2の座位は、CCR5相同性アームを使用して標的化され、相同性アームは左および右相同性アームと定義される。例示的なCCR5左相同性アームはSEQ ID NO: 11と定義される。例示的なCCR5右相同性アームはSEQ ID NO: 12と定義される。あるいは、例えば、それぞれSEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12のCCR5左および右相同性アームを使用して、OPRTとODCの両方をCCR5などのセーフハーバー座位に送達することができる。OPRTは、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第1の転写因子によって調節される第1の発現制御配列の発現制御下にあり得る。同様に、ODCは、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第2の転写因子によって調節される第2の発現制御配列の発現制御下にあり得る。いくつかの態様では、OPRTおよびODC配列は、それらのそれぞれの第1および第2の発現制御配列に独立に連結される。
いくつかの態様では、栄養要求性遺伝子はヒトCAD（カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ）（ENSG00000084774）である。ヒトCADは、ピリミジン生合成経路における最初の3つの酵素活性に相当する3つの独立した機能ドメインを有するタンパク質をコードする。栄養要求性遺伝子がヒトCADであるいくつかの態様では、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。ウリジンの非存在下で、CAD活性が阻害されたヒト細胞は生存しないと考えられ（その内容が、参照によりその全体が組み入れられる、Swyryd, Elizabeth A., Sally S. Seaver, and George R. Stark. "N-(phosphonacetyl)-L-aspartate, a potent transition state analog inhibitor of aspartate transcarbamylase, blocks proliferation of mammalian cells in culture." Journal of Biological Chemistry 249.21 (1974): 6945-6950を参照されたい）、これにより、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼのそれぞれを発現する導入遺伝子が細胞の維持および生存のために存在する条件が確立される。この例では、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼの独立した機能ドメインを別々の発現制御配列の制御下に置くことによって、より多くの3つの系譜特異的遺伝子を使用して、望ましい分化した細胞集団を選択することが可能になる。例えば、カルバモイルリン酸合成酵素2を第1の座位に送達することができ、アスパルテートトランスカルバミラーゼを第2の座位に送達することができ、ジヒドロオロターゼを第3の座位に送達することができる。第1の座位は栄養要求性誘導座位であり得る。第2および／または第3の座位は、例えば、CCR5などのセーフハーバー座位であり得る。いくつかの態様では、第2の座位は、CCR5相同性アームを使用して標的化され、相同性アームは左および右相同性アームと定義される。例示的なCCR5左相同性アームはSEQ ID NO: 12と定義される。例示的なCCR5右相同性アームはSEQ ID NO: 11と定義される。あるいは、例えば、それぞれSEQ ID NO: 11およびSEQ ID NO: 12のCCR5左および右相同性アームを使用して、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをそれぞれCCR5などのセーフハーバー座位に送達することができる。カルバモイルリン酸合成酵素2は、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第1の転写因子によって調節される第1の発現制御配列の発現制御下にあり得る。同様に、アスパルテートトランスカルバミラーゼは、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第2の転写因子によって調節される第2の発現制御配列の発現制御下にあり得る。ジヒドロオロターゼは、例えば、望ましい分化した細胞集団で特異的に発現している第3の転写因子によって調節される第3の発現制御配列の発現制御下にあり得る。いくつかの態様では、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ配列は、それらのそれぞれの第1、第2、および第3の発現制御配列に独立に連結される。
1つより多いマルチドメイン栄養要求性遺伝子のノックアウトまたはダウンレギュレーションが本明細書においてさらに企図される。例えば、細胞の集団においてUMPS遺伝子とCAD遺伝子の両方の機能をノックアウトまたはノックダウンすることによって、細胞の集団において、5つの異なる遺伝子改変、例えば、導入遺伝子の挿入の選択が可能になるであろう。栄養要求性因子としてのウリジンの非存在下で、UMPS遺伝子とCAD遺伝子の両方を欠く細胞は、それぞれの独立した機能ドメインOPRT、ODC、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼの酵素活性を必要とすると考えられ、これによって、5つの独立した機能ドメインのそれぞれを独立に再発現することができる5つの異なる遺伝子操作または導入遺伝子の挿入の選択が可能になる。
本明細書に記載される1つより多い独立した機能ドメインを含む栄養要求性遺伝子を細胞ブールスイッチの設計に組み入れることができる。本明細書において使用される場合、ブールスイッチは、1つまたは複数のインプットに基づいて論理演算を行うように設計されており、アウトプットを発生する回路を指す。ブールスイッチによって行われる論理演算としては、限定されないが、AND、OR、NOR、NAND、NOT、IMPLY、NIMPLY、XOR、およびXNORが挙げられる。例えば、ORは、アウトプットを発生するために1つまたは複数のインプットのいずれかが必要とされるシナリオを示し；ANDは、アウトプットを生成するためにインプットのすべてが必要とされるシナリオを示し；NOTゲートは、その機能がインプットを反転させることであるインバータである。複数の論理演算からなる化合物ブールスイッチも生成することができる。単純なANDゲートブールスイッチの例は、OPRTを発現する第1の導入遺伝子およびODCを発現する第2の導入遺伝子が組み込まれたヒトUMPS-/-細胞を含むことができ、その結果、細胞におけるOPRT活性とODC活性の両方の存在は、ウリジンの非存在下で生存という細胞のアウトプットをもたらす。いくつかの態様では、栄養要求性因子の供給または（OR）第1の独立した機能ドメインおよび（AND）第2の独立した機能ドメインの再発現は、細胞のアウトプットを発生するために1つまたは複数の論理条件を満たすことを必要とする化合物ブールスイッチを含む。1つまたは複数のブールスイッチ（AND、OR、NOR、NAND、NOT、IMPLY、NIMPLY、XOR、およびXNOR）を満たす論理条件は、例えば、栄養要求性因子の存在／非存在、1つもしくは複数の独立した機能ドメインの存在／非存在、1つもしくは複数の組織特異的因子の存在／非存在、および／または1つもしくは複数の栄養要求性因子、独立した機能ドメイン、もしくは組織特異的因子の濃度／相対レベル／存在／非存在の持続期間を含むことができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、栄養要求性誘導遺伝子の一部を両アレル性に標的化するガイドRNA（gRNA）を含むCRISPR/Casシステムと前駆細胞を接触させる工程を含む、分化した細胞の集団を生成する方法を含む。両アレル性に標的化することにより、例えば、オープンリーディングフレームもしくは調節配列を中断することによって、またはタンパク質もしくはヌクレオチドの抑制もしくは分解のための標的配列を導入することによって、栄養要求性誘導遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることができる。栄養要求性誘導遺伝子が少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む態様では、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、前駆細胞をそれぞれの独立した機能ドメインに対して栄養要求性にする。前駆細胞において栄養要求性を誘導する際に、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトを細胞に導入することができ、第1の相同組換えコンストラクトは第1の組織特異的プロモーターと栄養要求性誘導遺伝子の第1の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含み、第2の相同組換えコンストラクトは第2の組織特異的プロモーターと栄養要求性誘導遺伝子の第2の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む。前駆細胞を栄養要求性因子の存在下で増殖させることができ、細胞の分化を刺激して、第1および第2の組織特異的プロモーターを発現し、結果として、第1および第2の相同組換えコンストラクトが分化した細胞で発現する分化した細胞（例えば、細胞型または組織）を作製することができる。このようにして、栄養要求性因子を除去することによって、第1および第2の独立した機能ドメインを欠く細胞を排除し、両方のドメインを機能的に組み込んだ細胞を選択する。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子は2つ以上の独立した機能ドメイン、例えば、3つ、4つ、もしくは5つの独立した機能ドメイン、または5つより多い独立した機能ドメインを有し、栄養要求性細胞におけるそれぞれの独立した機能ドメインの再発現が栄養要求性を軽減するのに必要とされ、それによって、望ましい分化した細胞型または組織で発現する異なる組織特異的プロモーターの調節下で異なる独立した機能ドメインを発現する2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の相同組換えコンストラクトで細胞を改変することによって、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の組織特異的プロモーターを発現する細胞の選択が可能になる。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はカルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。
方法は、細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含むことができる。
相同組換えコンストラクトの1つまたは複数は、セーフハーバー座位、例えばCCR5に挿入され得る。いくつかの態様では、CCR5座位は相同性アームを使用して標的化され得、相同性アームは左および右相同性アームと定義される。例示的なCCR5左相同性アームはSEQ ID NO: 11と定義される。例示的なCCR5右相同性アームはSEQ ID NO: 12と定義される。
栄養要求性因子はウリジンであり得る。
いくつかの態様では、相同組換えコンストラクトの1つまたは複数は、治療的因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。相同組換えコンストラクトの1つまたは複数はポリシストロニックでもよく、例えば、例えば独立した機能ドメインをコードするコード配列と治療的因子をコードするコード配列とを分離する配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を有する。
本明細書に記載される方法における使用のための実例前駆細胞としては、限定されないが、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、および心筋細胞が挙げられる。
本明細書に記載される方法における使用のための分化した細胞型または組織の例としては、限定されないが、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン、および血管が挙げられる。
いくつかの態様では、分化した細胞は免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である。
本明細書に記載される方法における使用のための組織特異的プロモーターの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーター。
いくつかの態様では、相同組換えコンストラクトの1つまたは複数は、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。この方法で、独立した機能ドメインの不安定化のための条件または独立した機能ドメインをコードするメッセージRNAの分解のための条件を誘発することによって、本明細書に記載される改変細胞の栄養要求性をさらに調節することができる。条件は、例えば、不安定化ドメインを安定化するリガンドの存在、またはリガンドの非存在、それによる、独立した機能ドメインの不安定化および分解の誘導であり得る。
本明細書に記載される方法を使用して生成された細胞の分化集団を対象に投与することができる。いくつかの態様では、分化した細胞は治療的因子を保有する免疫細胞であり、対象は治療的因子を必要としているか、または治療的因子を必要としていることが疑われる。
栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供する工程であって、該遺伝子が少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む前記工程、ならびに栄養要求性前駆細胞のゲノム中に、第1の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第1のコンストラクトを第1の組織特異的遺伝子座に挿入し、第2の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第2のコンストラクトを第2の組織特異的遺伝子座に挿入する工程を含む、栄養要求性を軽減する方法も提供される。いくつかの態様では、第1および第2の座位における組織特異的遺伝子の発現は破壊されない。したがって、それによって、栄養要求性は、第1および第2の座位において第1および第2の組織特異的遺伝子を発現する細胞型または組織への前駆細胞の分化の際に軽減される。
2つより多い独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子の活用が企図される。例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインのそれぞれの再発現が栄養要求性を軽減するのに必要とされるように、栄養要求性誘導遺伝子は、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインを含むことができる。それぞれの独立した機能ドメインがそれぞれの組織特異的遺伝子座で栄養要求性前駆細胞のゲノムに挿入される場合、独立した機能ドメインを組み込んだ第1、第2、第3、第4、および／または第5の組織特異的座位のそれぞれに対応する組織特異的プロモーターを発現する細胞のみが、栄養要求性因子の除去を切り抜けて生存すると考えられる。
いくつかの態様では、前駆細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）である。
栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり得、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
栄養要求性誘導遺伝子は、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり得、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインがジヒドロオロターゼを含む。
コンストラクトの1つまたは複数は、ポリシストロニックであり得、例えば治療的因子をさらにコードし、コンストラクトのシストロンの発現を調節する配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）をさらに含む。
いくつかの態様では、組織特異的遺伝子座はインスリン座位である。
いくつかの態様では、分化した細胞は免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である。
いくつかの態様では、組織特異的遺伝子は挿入工程の間に置き換えられない。
いくつかの態様では、分化した細胞はインスリンを産生する。
コンストラクトの1つまたは複数は、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
少なくとも2つの外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する方法も提供される。本方法は、複数の細胞に、少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンをもたらし、結果として、複数の細胞において栄養要求性因子に対して栄養要求性をもたらす工程を含むことができる。栄養要求性因子を提供する培地中で細胞を増殖させることができ、第1の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第1の送達システム、ならびに第2の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の送達システムを細胞にトランスフェクトすることができる。栄養要求性因子を欠く培地との培地の交換の際に、第1と第2の外来遺伝子の両方を機能的に組み込こんでいない細胞は栄養要求性のままであると考えられ、かつ培養中に存続しないと考えられ、それによって、第1および第2の送達システムを機能的に組み込んだ細胞を選択する。
記載される方法は、独立した機能ドメインのそれぞれの再発現が改変細胞において栄養要求性を軽減するのに必要とされるようにさらなる独立した機能ドメインを有する栄養要求性誘導遺伝子、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の独立した機能ドメインを有する栄養要求性誘導遺伝子の活用をさらに企図する。
本方法は、栄養要求性誘導遺伝子の各機能ドメインに対応する送達システムを複数の細胞にトランスフェクトする工程であって、各送達システムが、外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む前記工程を含むことができる。送達システムの1つまたは複数は、プラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、またはナノ粒子であり得る。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインはオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む。
いくつかの態様では、栄養要求性誘導遺伝子はカルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインはカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインはアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインはジヒドロオロターゼを含む。
成熟ベータ細胞を選択する方法
複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させ、結果として、前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる工程を含む、成熟ヒトベータ細胞の集団を生成する方法も提供される。あるいは、本方法は、非CRISPRベースの方法体系を使用してヒトUMPS遺伝子をノックダウンまたはそうでなければノックアウトする工程を含むことができる。方法は、複数の前駆細胞を第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたインスリン（ENSG00000254647、もしくはその一部）をコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列を含み、第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結されたNkx6.1（ENSG00000163623、もしくはその一部）をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列を含む前記工程をさらに含むことができる。いくつかの態様では、第1および第2の独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより選択され、インスリンとNkx6.1の両方を発現する細胞でのみ発現する。非相同組換えベースの導入遺伝子挿入も本明細書に記載される方法における使用が企図される。細胞は、組換えコンストラクトが細胞に導入されるときまで、および組換えコンストラクトが細胞に導入されるときを過ぎて、ウリジンの存在下で増殖させることができる。ウリジンの存在下で、例えば、それぞれの開示が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Ma, Haiting, et al. "Establishment of human pluripotent stem cell-derived pancreatic β-like cells in the mouse pancreas." Proceedings of the National Academy of Sciences 115.15 (2018): 3924-3929；Pagliuca, Felicia W., et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro." Cell 159.2 (2014): 428-439；および／またはRezania, Alireza, et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells." Nature biotechnology 32.11 (2014): 1121に記載されている方法を使用して、細胞を成熟ベータ細胞へと刺激することができる。方法は、ウリジンを除去することによって、インスリンとNkx6.1の両方を発現する成熟ベータ細胞を選択する工程をさらに含むことができる。こうした状況下でウリジンを取り除くことまたは除去することによって、インスリンとNkx6.1の両方を発現しない細胞の増殖または生存が阻害されると考えられる。
いくつかの態様では、独立した機能ドメインの導入遺伝子が挿入された分割栄養要求性コンストラクトの1つまたは複数は、治療的因子または治療的因子をコードする遺伝子をさらに含むことができる。治療的因子は、標的化される栄養要求性誘導遺伝子またはその一部を有するカセットとして発現させることができる。治療的因子を含むコンストラクトの発現は、例えば、2つ以上の発現される構成成分の間にリンカーを有するポリシストロニックコンストラクトを作出することによって最適化することができ、リンカーは配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）などである。例示的なリンカー配列は、SEQ ID NO: 20、22、24、25、26、27、28、29、および30として提供される。
いくつかの態様では、再発現される栄養要求性誘導遺伝子、その独立した機能ドメイン、または他の導入遺伝子発現は、EF1a（SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 32）などの真核生物のプロモーター配列によって調節することができる。バイシストロニックまたはマルチシストロニックなコンストラクトは、記載されるリンカーを用いて、またはSEQ ID NO: 33のものなどの配列内リボソーム進入部位（IRES）を使用してコンストラクトの発現される構成成分を分離することによって、調製することができる。
終結およびポリアデニル化シグナル配列は、本明細書に記載されるコンストラクトから産生される転写産物を終結および安定化するために使用することができる。いくつかの態様では、転写は、SEQ ID NO: 39または40のものなどのウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化シグナル配列を使用して、終結および安定化される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、対象において1型糖尿病を軽減するのに有用である。方法は、本明細書に記載される方法によって作製される成熟ヒトベータ細胞を対象に投与する工程を含むことができる。
インビトロで分化した前駆細胞の集団より選択される成熟ヒトベータ細胞も提供される。成熟ヒトベータ細胞は、本明細書に記載される栄養要求性因子に対して栄養要求性をもたらす、栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変を含むことができる。成熟ヒトベータ細胞は、栄養要求性誘導遺伝子または栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子をさらに含むことができ、その結果、細胞は、導入遺伝子の組み込みが成功した後、栄養要求性因子の除去の際に生存することができる。いくつかの態様では、成熟ヒトベータ細胞は、栄養要求性誘導遺伝子UMPSの遺伝子操作を有する。したがって、栄養要求性因子はウリジンであり得、独立した機能ドメインはOPRTおよびODCより選択することができ、1つまたは複数の導入遺伝子は、インスリンをコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列およびNkx6.1をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列をさらに含むことができる。OPRTおよびODCの独立した機能ドメインがそれぞれインスリンおよびNkx6.1の発現のために機能的に連結される場合、場合次第で、インスリンとNkx6.1の両方を発現する細胞は、OPRTおよびODCも発現すると考えられ、かつ栄養要求性誘導遺伝子を効果的に再発現すると考えられ、それによって、培養培地からウリジンを取り除いた後でさえも生存可能なままである。
分化した巨核球を選択する方法
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、操作された巨核球および／または操作された血小板を生成するのに有用である。操作された巨核球および／または操作された血小板は、治療的タンパク質またはポリペプチドであり得るペイロード、例えば、関心対象のタンパク質を発現することができる。本明細書に記載される選択方法に従って操作および作製された巨核球はペイロードを発現することができ、このペイロードは、続いて、巨核球から産生された血小板中にロードされる。同様に、本明細書に記載される選択方法に従って操作および作製された血小板に、例えば、ペイロードの治療効果を必要としている対象に送達するための治療的ペイロードがロードされ得る。
いくつかの態様では、操作された巨核球および／または操作された血小板は第1のペイロードおよび第2のペイロードを発現する。第1および／または第2のペイロードは治療剤、例えば、治療的タンパク質またはポリペプチドであり得る。本明細書に記載される選択方法に従って操作および作製された巨核球は第1および／または第2のペイロードを発現することができ、このペイロードは、続いて、巨核球から産生された血小板中にロードされる。同様に、本明細書に記載される選択方法に従って操作および作製された血小板に、例えば、ペイロードの治療効果を必要としている対象に送達するための第1および／または第2の治療的ペイロードがロードされ得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるペイロードは、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Du, Lily M., et al. "Platelet-targeted gene therapy with human factor VIII establishes haemostasis in dogs with haemophilia A." Nature communications 4.1 (2013): 1-11に記載されているように、血友病の治療剤として第VIII因子を含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるペイロードは、例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Zhang, Xudong, et al. "Engineering PD-1-presenting platelets for cancer immunotherapy." Nano letters 18.9 (2018): 5716-5725に記載されているように、操作された血小板をPD-L1を発現する腫瘍細胞にターゲティングするために、PD-1または抗PD-L1抗体を含むことができる。
巨核球特異的プロモーターの使用は、巨核球および／または血小板においてペイロードの細胞型特異的発現を可能にする。巨核球特異的プロモーターの例としては、例えば、ヒトPGK、Pf4、GP1BA、GP6、またはGP9プロモーター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Latorre‐Rey, L. J., et al. "Targeting expression to megakaryocytes and platelets by lineage‐specific lentiviral vectors." Journal of Thrombosis and Haemostasis 15.2 (2017): 341-355を参照されたい）ならびにCD68Lプロモーター、糖タンパク質Ibαプロモーター、およびインテグリンαIIbプロモーター（表3および4を参照されたい）が挙げられる。
本明細書において提供される選択方法は、操作された巨核球および血小板の集団の純化および／または濃縮を可能にする。例えば、図1は、PS細胞由来の操作された巨核球で使用するための発現ベクターを最適化するために分割栄養要求性選択を使用する実例プロセスの概略図を示す。多能性幹（「PS」）細胞などの前駆細胞を、例えば、CRISPRベースのシステムまたは他の遺伝子操作システムを使用して、UMPSノックアウト（「KO UMPS」）となるように操作する。UMPSノックアウト細胞をウリジンで培養して生存および増殖を促進し、例えば、CCR5などのセーフハーバー座位にドナーベクター／発現コンストラクトを挿入するために、相同組換え（HR）ドナーベクター（本明細書において第1および第2の発現コンストラクトとも称される）、ガイドRNA（「gRNA」）、ならびにCas9をこの細胞にトランスフェクトし、例えば、エレクトロポレーションし、生存および／または増殖にウリジンを必要とする二重ノックイン（KI）細胞を得る。HRドナーベクター／発現コンストラクトは、巨核球特異的プロモーターによって駆動される第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列および巨核球特異的プロモーターによって駆動される第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列（それぞれ、それぞれ「プロモーター」によって駆動される「ペイロード1」および「ペイロード2」として図1に描写される）を含む第1の発現カセットを含む。UMPSが、巨核球特異的プロモーターの発現を駆動するのに十分な条件下で、二重KIを持つ細胞においてペイロード1およびペイロード2とともに機能的に再発現するように、HRドナーベクター／発現コンストラクトは、それぞれ、UMPSの第1の独立した機能ドメインおよびUMPSの第2の独立した機能ドメインを含む第2の発現カセットを含む。UMPSの独立した機能ドメインは、UMPSの独立した機能ドメインが構成的に発現するように、例えば、EF1aなどの構成的哺乳類プロモーターの転写調節制御下であり得る。HRドナーベクター／発現コンストラクトから発現するポリペプチド（すなわち、ペイロード1、ペイロード2、UMPSの第1の独立した機能ドメイン、および／またはUMPSの第2の独立した機能ドメイン）の機能性を評価することができる。HRドナーベクター／発現コンストラクトから発現するポリペプチドの機能性を評価する例としては、ドナーベクター／発現コンストラクトに対応するDNAを検出すること（例えば、PCR）、ドナーベクターの転写に対応するRNAを検出すること（例えば、rtPCR）、ドナーベクターの発現に対応するタンパク質を検出すること（例えば、ウエスタンブロット、免疫細胞学、セルソーティングなど）、またはドナーベクターの機能的発現の証拠に関して細胞の形態および／または機能を解析することが挙げられる。次いで、（例えば、ペイロード1単独に対して、ペイロード2単独に対して、またはペイロード1およびペイロード2に対して）最適化された発現カセットを生成し、これを組織特異的プロモーター、例えば、巨核球特異的プロモーターの制御下でペイロードを安定して発現する細胞株の作出に使用することができる。
さらに、図2は、インビトロで巨核球（MK）に分化させられたUMPSノックアウト（KO）多能性幹（PS）細胞からインビボ適用のための血小板を生成するためにウリジン栄養要求性ベースの選択方法を使用する実例プロセスの概略図を示す。図2に描写される本実例プロセスの一態様では、有核および／または増殖性細胞（例えば、残留性PS細胞および／または増殖性巨核球を含める）は、培養条件からウリジンが取り除かれる場合に、分化後に死ぬかまたは増殖しない。巨核球から産生された血小板は培養中に存続する。血小板は下流のインビボ適用で使用することができる。いくつかの態様では、方法は、増殖性細胞を欠くかまたは実質的に欠く、血小板の実質的に純粋な集団を作製する。対象への投与の際、巨核球によって産生された血小板は機能的なままであるが、いかなる残留性PSもしくは巨核球または他の有核もしくは増殖性細胞も、ウリジンに対して栄養要求性であるので、インビボで死ぬか、または増殖しない。いくつかの態様では、インビボでの内在性ウリジンレベルは、対象への投与後に、いかなる残留性PSもしくは巨核球または他の有核もしくは増殖性細胞の生存率も維持するのに不十分である。いくつかの態様では、細胞の栄養要求性の性質は、非有核の非増殖性血小板のみが存続することを可能にする。
図3は、多能性幹（PS）細胞から操作された血小板をインビトロで作製するために分割栄養要求性を使用する別の態様の概略図を示す。多能性幹（「PS」）細胞は、例えば、CRISPRベースのシステムまたは他の遺伝子操作システムを使用して、UMPSノックアウト（「KO UMPS」）になるように操作される。UMPSノックアウト細胞をウリジンで培養して生存および増殖を促進し、例えば、CCR5などのセーフハーバー座位にドナーベクターを挿入するために、相同組換え（HR）ドナーベクター（例えば、発現コンストラクト）、ガイドRNA（「gRNA」）、およびCas9をこの細胞にトランスフェクトし、例えば、エレクトロポレーションし、生存および／または増殖にウリジンを必要とする二重ノックイン（KI）細胞を得る。第1のHRドナーベクター／発現コンストラクトは、巨核球特異的プロモーターによって駆動される第1のペイロード（「ペイロード1」）をコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現カセットおよびUMPSの第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現カセットを含む。UMPSが、巨核球特異的プロモーターの発現を駆動するのに十分な条件下で、二重KIを持つ細胞において第1および第2のペイロードとともに機能的に再発現するように、第2のHRドナーベクター／発現コンストラクトは、巨核球特異的プロモーター（「プロモーター」）によって駆動される第2のペイロード（「ペイロード2」）をコードするヌクレオチド配列をコードする第3の発現カセットおよびUMPSの第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の発現カセット含む。いくつかの態様では、UMPSの独立した機能ドメインは、UMPSの独立した機能ドメインが構成的に発現するように、例えば、EF1aなどの構成的哺乳類プロモーターの転写調節制御下であり得る。ウリジンの存在下で、二重ノックイン細胞をインビトロで巨核球（MK）に分化させて、二重ノックイン細胞の生存を確実にする。UMPSの発現、例えば、OPRTおよびODCの独立した機能ドメインの発現は分化した細胞で失われる。5-FOA選択を使用して、残留性多能性細胞を排除することができる。いくつかの態様では、巨核球によって産生された血小板に、発現したペイロードポリペプチドがロードされる。いくつかの態様では、巨核球によって産生された血小板はウリジンを取り除いた後に存続するが、いかなる残留性PS細胞または巨核球などの有核または増殖性細胞も、ウリジンを取り除いた後に死ぬか、または増殖しない。
本明細書に記載される方法に従って作製され、選択される巨核球は操作された巨核球であり得る。操作された巨核球は、例えば、ペイロードをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ペイロードは、例えば、治療的RNA、例えば、アンチセンスRNA、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物／抗miR、および合成mRNAをコードするヌクレオチド配列であり得る。ペイロードは、例えば、ペイロードポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。ペイロードポリペプチド配列は、例えば、インビボで送達されるポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、治療的ポリペプチドであり得る。
本明細書において提供される方法は、機能的に成熟した血小板の実質的に純粋な集団を生成するために使用することができる。血小板の実質的に純粋な集団は、有核および／または増殖性細胞を欠くかまたは実質的に欠く可能性がある。本開示による血小板の実質的に純粋な集団を対象に投与することができる。対象への投与の際、いかなる残留性の増殖性および／または有核細胞、例えば、残留性非分化細胞、残留性前駆体／多能性幹細胞、または有核もしくは増殖性のままである残留性巨核球も、機能的UMPSまたは他の栄養要求性誘導遺伝子がないので、インビボで死ぬと考えられる。いくつかの態様では、ウリジンまたは他の栄養要求性因子のインビボの内在性レベルは、ウリジンまたは他の栄養要求性因子に対して栄養要求性になるように操作された細胞を持続させるのに不十分である。したがって、本明細書の方法に従って作製された細胞の集団の投与は、対象への投与の際、生育不能であり、増殖することができず、および／または生存することができない。
C.治療方法
疾患、障害、または状態の治療のための本開示に記載される細胞の使用も包含される。
ある特定の態様は、癌、パーキンソン病、移植片対宿主疾患（GvHD）、自己免疫性状態、過剰増殖性障害または状態、悪性形質転換、肝臓状態、遺伝性遺伝子欠陥を含めた遺伝学的状態、若年型真性糖尿病、および眼コンパートメントの状態からなる群より選択されるような疾患、障害、または状態を提供する。
ある特定の態様では、疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環系、神経系、リンパ系、呼吸器内分泌系、消化器系、排泄器系、および生殖器系からなる群より選択される、体の少なくとも1つの系に影響を及ぼす。対象の1種より多い細胞型に影響を及ぼす状態は、各細胞株が異なる栄養要求性因子によって活性化される、本開示に記載される細胞の1つより多い態様を用いて、治療することができる。
ある特定の態様は、再生性として細胞株を提供する。本開示の一局面では、対象を1種より多い細胞および／または1種もしくは複数種の栄養要求性因子と接触させることができる。ある特定の態様は、栄養要求性因子、例えば栄養素または酵素の局在型放出を提供する。代替の態様は、全身的送達を提供する。例えば、局在型放出は生体適合性装置の利用によって影響を受ける。本開示の一局面では、生体適合性装置は対象において細胞株の拡散を制限することができる。方法のある特定の態様は、対象において改変宿主細胞の治療効果を枯渇させるために、または改変宿主細胞の細胞死を誘導するために、栄養要求性因子を除去することを提供する。方法のある特定の態様は、以下からなる群より選択される少なくとも1つを含むような治療効果を提供する：分子輸送、細胞死の誘導、細胞死、およびさらなる細胞の動員。方法のある特定の態様は、非改変宿主細胞が、改変宿主細胞で対象を治療する前の同じ対象に由来することを提供する。
本開示は、任意で容器またはバイアルを用いて、そのような組成物またはそのような組成物の構成成分を含むキットを企図する。
本明細書に記載される方法は、特定の組織に分化した細胞を選択するために使用することができる。組織は、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択されるものであり得る。いくつかの態様では、分化した細胞は免疫細胞であり、免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞に分化することができる。
本明細書に記載される方法を使用して生成された細胞の分化集団を対象に投与することができる。いくつかの態様では、分化した細胞は治療的因子を保有する免疫細胞であり、対象は治療的因子を必要としているか、または治療的因子を必要としていることが疑われる。
一例を挙げると、本明細書に記載される方法は、対象において1型糖尿病を軽減するのに有用である。本方法は、本明細書に記載される方法によって作製される成熟ヒトベータ細胞を対象に投与する工程を含むことができる。
D.薬物スクリーニングのための方法
治療方法に加えて、本明細書に記載される方法を使用して作製される分化した細胞集団は、インビトロでの薬物スクリーニングに有用であり得る。分化した細胞集団を調製するための公知の方法は、望ましい分化した細胞もしくは組織型に前駆細胞を分化させる不適切な方法、および／または前駆細胞の集団から分化した細胞を選択する不適切な方法によって阻まれている（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Goversen, Birgit, et al. "The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1." Pharmacology & therapeutics 183 (2018): 127-136を参照されたい）。したがって、インビトロで分化した前駆細胞の集団から分化した細胞集団を選択する方法は、インビトロ薬物スクリーニングの方法体系の効率および有効性を向上させるために使用することができる。候補薬物または薬物ライブラリーを分化した細胞の集団に与えて、関心対象の細胞型への薬物曝露の有効性、忍容性、毒性、投薬量、バイオアベイラビリティ、吸収、半減期、分子相互作用、有害作用、代謝的作用、遺伝的作用、生理学的作用、電気生理学的作用、または他のアウトカムを決定することができる。一態様では、例えば、候補薬物または薬物ライブラリーを本明細書に記載される方法を使用して分化および選択されたiPSC由来の心筋細胞または心筋細胞亜集団に投与して、特定の細胞サブタイプにおける薬物アウトカムを決定することができる。例えば、記載される分化方法は、この亜集団における薬物のインビトロ試験のために、心室心筋細胞にさらに分化することができる一次心臓領域系譜細胞を選択するために使用することができる。他の態様では、本明細書において記載される分化方法は、この亜集団におけるインビトロ薬物試験のために、結節性心筋細胞にさらに分化することができる心外膜系譜細胞を選択するために使用することができる。他の態様では、本明細書において記載される分化方法は、この亜集団におけるインビトロ薬物試験のために、心房の心筋細胞にさらに分化することができる二次心臓領域系譜細胞を選択するために使用することができる。さらに別の態様では、本明細書において記載される分化方法は、この亜集団におけるインビトロ薬物試験のためであり得る、内皮細胞を選択するために使用することができる。
IV.薬学的組成物
いくつかの態様では、改変細胞の増殖および繁殖を制御する（増大させる、低下させる、または止める）ための、および導入遺伝子による治療的因子の発現を制御するための、薬学的組成物、治療方法、および栄養要求性因子の投与の方法を含めて、改変細胞の使用のための方法、組成物、およびキットが本明細書において開示される。さらに、本明細書に記載される方法、組成物、およびキットは、トランスフェクトされた細胞の選択および細胞の分化集団の生成に使用することもできる。
改変された哺乳動物宿主細胞は、栄養要求性因子とは別に、または栄養要求性因子と組み合わせて、対象に投与することができる。本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの投与に適している薬学的組成物に関するが、そのような組成物は、一般に任意の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。
薬学的組成物の投与が企図される対象としては、限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットを含めた哺乳動物、商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウを含めたトリが挙げられる。いくつかの態様では、組成物はヒト、ヒト患者、または対象に投与される。
ある場合には、本明細書に記載される薬学的組成物は、対象において疾患、障害、または状態を治療する方法で使用され、方法は、
(i)栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、およびニッチ環境が対象中に存在しないように、栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、成分の変化した濃度、および／またはニッチ環境について栄養要求性である細胞株を作製すること；
(ii)工程(i)の、得られた栄養要求性の細胞株と、対象を接触させること；
(iii)栄養要求性因子が栄養要求性のシステムまたは要素を活性化し、細胞株の増殖および／または対象のための1種もしくは複数種の治療的実体の発現をもたらすように、栄養素、酵素、pHおよび／または温度を変化させる成分、ならびに対象の細胞のニッチ環境より選択される栄養要求性因子と(ii)の対象を接触させること
を含む。
本開示の薬学的組成物は、
(a)本開示に従って改変宿主細胞を対象に投与すること、および
(b)改変宿主細胞の増殖を促進するのに十分である量で、栄養要求性因子を対象に投与すること
を含む、対象において疾患、障害、または状態を治療する方法で使用することもできる。
栄養性栄養要求性因子（nutrient auxotrophic factor）を含む組成物は、本開示の改変細胞を含むヒトへの投与のために使用することもできる。
幹細胞を含む多くの現在の薬学的組成物は患者に癌を生じさせる可能性があり；したがって、細胞集団を分化させる必要がある。本明細書に記載される方法は、患者への投与のために、いかなる幹細胞も含まない純粋に分化した細胞集団を提供する。
V.製剤
改変宿主細胞は、栄養要求性誘導座位に治療的因子を含むコンストラクトをコードする導入遺伝子を挿入するように、遺伝子操作されている。所望の座位を標的とするCas9タンパク質／gRNAリボ核タンパク質複合体（Cas9 RNP）の送達は、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、または核局在化によって行うことができる。いくつかの態様では、改変宿主細胞は、エレクトロポレーション後に、血清を含む培地と接触する。いくつかの態様では、改変宿主細胞は、エレクトロポレーション後に、還元血清を含むかまたは血清を含まない培地と接触する。
本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子は、
(1)安定性を高める；
(2)生体内分布を変化させる（例えば、細胞株を特定の組織もしくは細胞タイプにターゲティングする）；
(3)コードされる治療的因子の放出プロファイルを変化させる；および／または
(4)栄養要求性因子の取り込みを向上させる
ために、1種または複数種の賦形剤を使用して製剤化することができる。
本開示の製剤は、非限定的に、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって、調製することができる。本明細書において使用する場合、用語「薬学的組成物」は、少なくとも1種の活性成分、および任意で、薬学的に許容される1種または複数種の賦形剤を含む組成物を指す。本開示の薬学的組成物は無菌であってもよい。
一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または1種もしくは複数種の他の補助成分と混合させる工程を含む。本明細書において使用する場合、フレーズ「活性成分」は、一般に、
(a)栄養要求性誘導座位に挿入された、治療的因子を発現することができる導入遺伝子を含む、改変宿主細胞もしくはコンストラクト、または
(b)対応する栄養要求性因子、または
(c)栄養要求性誘導座位内の切断をターゲティングするためのヌクレアーゼシステム
のいずれかを指す。
改変宿主細胞または栄養要求性因子と本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、当技術分野において公知である様々な方法によって、調製することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法を使用して作製された分化細胞の集団が対象に投与される。
本開示による薬学的組成物は、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで、調製、包装、および／または販売することができる。本明細書において使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量を指す。
本開示による薬学的組成物中の活性成分（例えば、改変宿主細胞もしくは栄養要求性因子）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、治療を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、およびさらに、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、0.1％～99％（w/w）の活性成分を含むことができる。例として、組成物は、0.1％～100％、例えば、0.5～50％、1～30％、5～80％、または少なくとも80％（w/w）の活性成分を含むことができる。
A.賦形剤および希釈剤
いくつかの態様では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％純粋でもよい。いくつかの態様では、賦形剤は、ヒトについての使用について、および獣医学的使用について承認されている。いくつかの態様では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。いくつかの態様では、賦形剤は、薬学的グレードのものであり得る。いくつかの態様では、賦形剤は、米国薬局方（USP）、欧州薬局方（EP）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。
本明細書において使用する場合、賦形剤としては、限定されないが、所望の特定の剤形に適する、あらゆるすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性作用物質、等張作用物質、増粘もしくは乳化作用物質、防腐剤などが挙げられる。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照されたい）。任意の所望されない生物学的効果をもたらすこと、または薬学的組成物の任意の他の構成成分と有害な方法で相互作用することなどによって、任意の従来の賦形剤媒体がある物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除いて、従来の賦形剤媒体の使用も本開示の範囲内で企図され得る。
例示的な希釈剤としては、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、ショ糖、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖など、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
B.不活性成分
いくつかの態様では、製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含むことができる。本明細書において使用する場合、用語「不活性成分」は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない1種または複数種の作用物質を指す。いくつかの態様では、本開示の製剤で使用することができる不活性成分のすべてが米国食品医薬品局（FDA）によって承認されていてもよく、いくつかが承認されていてもよく、またはどれも承認されていなくてもよい。
C.薬学的に許容される塩
栄養要求性因子は、その薬学的に許容される塩として投与することができる。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、（例えば、遊離塩基の基を適切な有機酸と反応させることによって）既存の酸または塩基成分をその塩形態に変換することによって、親化合物が改変されているような、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基のミネラルまたは有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩（acetate）、酢酸（acetic acid）塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（benzenesulfonate）、ベンゼンスルホン酸（benzene sulfonic acid）塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例えば、限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば無毒の無機または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒塩が挙げられる。
VI.服用および投与
上記の薬学的組成物中に含まれる本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子は、治療的に有効な転帰をもたらす、任意の送達経路、全身送達、または局所送達によって投与することができる。これらとしては、限定されないが、腸内（腸管中）、胃腸内、硬膜外（硬膜中）、経口（口経由）、経皮、脳内（大脳中）、脳室内（脳室中）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻部を介する）、静脈内（静脈中）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈中）、筋肉内（筋肉中）心臓内（心臓中）、骨内注入（骨髄中）、髄腔内（脊柱管中）、実質内（脳組織中）、腹腔内（腹膜中への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介する）、空洞内注射（病的空洞中）、空洞内（陰茎の基部）、腟内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身的分布のためのインタクトな皮膚を介する拡散）、経粘膜（粘膜を介する拡散）、経腟、吹送（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、または点耳剤中、耳（耳の中または耳経由）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（1本の歯または複数の歯へ）、電気浸透、頸管内、洞内（endosinusial）、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨中）、仙骨内（馬尾中）、大槽内（小脳延髄槽（cisterna magna cerebellomedularis）中）、角膜内（角膜中）、歯冠内（dental intracornal）、冠動脈内（冠動脈中）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張可能な空間中）、椎間板内（椎間板内）、管内（腺の管の中）、十二指腸内（十二指腸中）、硬膜内（硬膜の中または下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の中）、歯肉内（歯肉中）、回腸内（小腸の遠位部分中）、病巣内（限局性病変部中、または限局性病変部に直接的に導入される）、管腔内（管の内腔中）、リンパ内（リンパ中）、髄内（骨の骨髄腔中）、髄膜内（髄膜中）、心筋内（心筋中）、眼内（眼の中）、卵巣内（卵巣中）、心膜内（心膜中）、胸膜内（胸膜中）、前立腺内（前立腺中）、肺内（肺またはその気管支中）、腔内（intrasinal）（鼻腔または眼窩周囲洞中）、脊髄内（脊柱中）、滑液包内（関節の滑膜腔中）、腱内（腱中）、精巣内（精巣中）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸における脳脊髄液中）、胸腔内（胸腔中）、管内（臓器の細管中）、腫瘍内（腫瘍中）、鼓膜内（中耳中）、血管内（1つの血管または複数の血管中）、心室内（心室中）、イオントフォレーシス（可溶性塩のイオンが体の組織中に移動する電流による）、潅注（開放創または体腔を浸すまたは洗い流す）、喉頭（喉頭上に直接）、鼻腔胃（鼻部から胃へ）、密封包帯技法（包帯によって覆われ、その領域が塞がれる、局部経路投与）、眼部（外部の眼へ）、口咽頭（口および咽頭に直接的に）、非経口、経皮的、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身作用のために経口的または経鼻的に吸入することによる気道中）、眼球後（脳橋の後ろまたは眼球の後ろ）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局部、経胎盤性（胎盤を介する、または横断する）、経気管（気管壁を介する）、経鼓膜（鼓膜を横断するまたは介する）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、腟、仙骨ブロック、診断的、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、ならびに脊髄が挙げられる。
A.非経口および注射可能な投与
いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は非経口的に投与することができる。
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤は、公知の技術に従って、適切な分散作用物質、湿潤作用物質、および／または懸濁化作用物質を使用して、製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば、1,3-ブタンジオールの溶液として、無毒の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中の無菌の注射可能な溶液剤、懸濁剤、および／または乳濁剤であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として、慣習的に用いられる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製で使用することができる。
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、および／または使用前に滅菌水または他の無菌の注射可能な媒体に溶解または分散させることができる無菌固体組成物の形態で無菌作用物質を組み入れることによって、無菌化することができる。
活性成分の効果を延ばすために、皮下または筋肉内注射から活性成分の吸収を遅らせることが望ましいことが多い。これは、水溶性が乏しい結晶性または非結晶性材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。活性成分の吸収速度は、溶解速度に依存し、ひいては、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、油状ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることによって達成され得る。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。
B.デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示の改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、持続放出のためにデポー剤に製剤化される。一般に、特定の臓器または組織（「標的組織」）が、投与のために標的とされる。いくつかの態様では、局所的放出は生体適合性装置の利用を介して影響を受ける。例えば、生体適合性装置は対象において細胞株の拡散を制限することができる。
本開示のいくつかの局面では、本開示の改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、標的組織内に、または標的組織の近位に空間的に保持される。改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物を、標的組織中でそれらが実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99％より多くが標的組織中に保持されるような条件下で、（1つまたは複数標的細胞を含む）標的組織を改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物と接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織にもたらす方法が提供される。例えば、対象に投与される改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物の少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、または99.99％より多くが、投与後に一定期間存在する。
本開示のある特定の局面は、本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物を、それらが標的組織中で実質的に保持されるような条件下で改変宿主細胞を含む薬学的組成物と標的組織を接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織にもたらす方法に関する。改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、少なくとも1つの標的細胞で関心対象の効果がもたらされるように十分な活性成分を含む。いくつかの態様では、改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、一般に、1種または複数種の細胞侵入作用物質を含むが、薬学的に許容される賦形剤を有する、または有さない、（例えば、細胞侵入作用物質または他の作用物質を有さない）「ネイキッド」製剤も企図される。
C.用量およびレジメン
本開示は、本開示による改変宿主細胞または栄養要求性因子をそれらを必要とする対象に投与する方法を提供する。本明細書に記載の細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物および本開示の組成物は、疾患、障害、および／または状態を予防する、治療する、管理する、または診断するのに有効な、投与の任意の量および任意の経路を使用して、対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式になど応じて、対象ごとに変動すると考えられる。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物でもよい。任意の特定の個体に対する、特定の治療的に有効な、予防的に有効な、または適切な診断の用量レベルは、治療を受ける障害および障害の重症度；用いられる特定のペイロードの活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事;投与時間、投与経路、および栄養要求性因子の排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の改変宿主細胞または栄養要求性因子と組み合わせて、または同時に使用される薬物;医学分野で周知な因子などを含めた、様々な因子に依存すると考えられる。
ある特定の態様では、本開示による本明細書に記載の細胞または栄養要求性因子の薬学的組成物は、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために、1日あたり1回または複数回で、1日あたり、対象の体重について、約0.0001mg/kg～約100mg/kg、約0.001mg/kg～約0.05mg/kg、約0.005mg/kg～約0.05mg/kg、約0.001mg/kg～約0.005mg/kg、約0.05mg/kg～約0.5mg/kg、約0.01mg/kg～約50mg/kg、約0.1mg/kg～約40mg/kg、約0.5mg/kg～約30mg/kg、約0.01mg/kg～約10mg/kg、約0.1mg/kg～約10mg/kg、または約1mg/kg～約25mg/kgを送達するのに十分である投薬量レベルで投与することができる。
ある特定の態様では、本開示による、本明細書に記載の細胞または栄養要求性因子の薬学的組成物は、約10～約600μl/部位、50～約500μl/部位、100～約400μl/部位、120～約300μl/部位、140～約200μl/部位、約160μl/部位で投与することができる。非限定例として、改変宿主細胞または栄養要求性因子は、50μl/部位および／または150μl/部位で投与することができる。
本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子の所望の投薬量は、1回のみ、1日3回、1日2回、1日1回、隔日、3日ごと、毎週、2週間ごと、3週間ごと、または4週間ごと送達され得る。ある特定の態様では、所望の投薬量は、複数回投与（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14回、またはそれ以上の投与）を使用して、送達され得る。
本開示の細胞の所望の投薬量は、1回または複数回投与することができる。栄養要求性因子は、ある期間にわたって設定された頻度で定期的に、または「連続フロー」として継続的に、投与される。24時間で与えられるまたは処方される量である全1日用量は、これらの方法のいずれかによって、またはこれらの方法の組み合わせとして、投与することができる。
いくつかの態様では、本開示の細胞または栄養要求性因子の対象への送達は、少なくとも1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、1年、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、18か月、19か月、20か月、20か月、21か月、22か月、23か月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、または10年より多くにわたって、治療効果をもたらす。
本明細書に記載の細胞は、1種または複数種の他の治療的、予防的、研究用、もしくは診断的作用物質、または医学手順と組み合わせて、連続してまたは同時に、使用することができる。一般に、各作用物質は、その作用物質について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されると考えられる。いくつかの態様では、本開示は、薬学的、予防的、研究用、または診断的組成物を、それらの生物学的利用能を向上させる、それらの代謝を低減させるおよび／もしくは改変する、それらの排出を阻害する、ならびに／または体内のそれらの分布を改変することができる作用物質と組み合わせて送達することを包含する。
例えば、本明細書に記載の細胞または栄養要求性因子は、治療のために標的とされる領域で生物学的利用能を高めるために、対象において拡散を制限する生体適合性装置として投与される。本明細書に記載の細胞または栄養要求性因子は、局所送達によっても投与され得る。
用語「前処置レジメ」は、幹細胞移植の前に患者が受ける療法の過程を指す。例えば、造血幹細胞移植前に、患者は、たとえ幹細胞が同じ患者に由来したとしても、幹細胞移植の拒絶反応を予防するために、骨髄破壊的療法、非骨髄破壊的療法、または強度が低減された前処置を受け得る。前処置レジメは、細胞毒性作用物質の投与をともない得る。前処置レジメは、免疫抑制、抗体、および照射を含み得る。他の可能性のある前処置レジメントとしては、抗体媒介性前処置（例えば、Czechowicz et al., 318(5854) Science 1296-9 (2007)；Palchaudari et al., 34(7) Nature Biotechnology 738-745 (2016)；Chhabra et al., 10:8(351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)を参照されたい）およびCAR-T媒介性前処置（例えば、Arai et al., 26(5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018)を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられる。前処置は、操作されたHSCに由来するミクログリアが移動して、関心対象のタンパク質を送達するための空間を脳内に作り出すために使用される必要がある（ALDおよびMLDに対する最近の遺伝子療法試験）。前処置レジメンは、移植細胞が生着および増殖するための場所を体内に有することを可能にするニッチ「空間」を作り出すようにも設計される。造血幹細胞移植では、例えば、前処置レジメンは、移植造血幹細胞が生着するためのニッチ空間を骨髄中に作り出す。前処置レジメンなしでは、移植造血幹細胞は生着することができない。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されているT細胞である。操作された栄養要求性T細胞は、生きている薬物として作用するように、CAR T細胞として使用することができ、造血幹細胞移植のために患者を前処理するために、栄養要求性因子とともに患者に投与することができる。ドナー造血幹細胞の送達より前に、栄養要求性因子を除去することができ、これによって、操作された栄養要求性T細胞が排除される。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されている同種異系T細胞である。操作された栄養要求性同種異系T細胞は、治療効果をもたらすために、栄養要求性因子とともに患者に投与することができる。患者が移植片対宿主病（GvHD）を発生した際に、栄養要求性因子を除去することができ、これによって、アロ反応性になった操作された栄養要求性同種異系T細胞が排除される。
疾患、障害、または状態の治療のための、本開示に記載の細胞の使用も、本開示によって包含される。
ある特定の態様は、癌、パーキンソン病、移植片対宿主病（GvHD）、自己免疫性状態、過剰増殖性の障害または状態、悪性形質転換、肝臓の状態、遺伝性遺伝子欠陥を含めた遺伝的状態、若年型糖尿病、および眼の区画の状態からなる群より選択されるような、疾患、障害、または状態を提供する。
ある特定の態様では、疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化器系、排出系、および生殖器系からなる群より選択される、体の少なくとも1つの系に影響を及ぼす。対象において1種より多い細胞タイプに影響を及ぼす状態は、各細胞株が異なる栄養要求性因子によって活性化される、本開示に記載の1種より多い態様の細胞で治療することができる。
ある特定の態様は、再生性として細胞株を提供する。本開示の一局面では、対象を、1種より多い改変宿主細胞と、および／または1種または複数種の栄養要求性因子と、接触させてもよい。ある特定の態様は、栄養要求性因子、例えば、栄養素または酵素の局所的放出を提供する。代替の態様は全身送達を提供する。例えば、局所的放出は、生体適合性装置の利用を介して影響を受ける。本開示の一局面では、生体適合性装置は対象において細胞株の拡散を制限することができる。方法のある特定の態様は、対象において、改変宿主細胞の治療効果を枯渇させるために、または改変宿主細胞において細胞死を誘導するために、栄養要求性因子を除去することを提供する。方法のある特定の態様は、分子輸送、細胞死の誘導、細胞死、およびさらなる細胞の動員からなる群より選択される少なくとも1つを含むような治療効果を提供する。方法のある特定の態様は、非改変宿主細胞が、改変宿主細胞による対象の治療より前の同じ対象に由来することを提供する。
本開示は、そのような組成物またはそのような組成物の構成成分を任意で容器またはバイアルとともに含むキットを企図する。
VII.定義
数値xに関する用語「約」は、例えば、x±10％を意味する。
用語「活性成分」は、概して、治療効果の発揮に関与する、組成物中の成分を指す。本明細書において使用する場合、これは、概して、
(a)本明細書に記載される導入遺伝子を含む、改変宿主細胞またはコンストラクト、
(b)本明細書に記載される対応する栄養要求性因子、または
(c)栄養要求性誘導座位内の切断をターゲティングするためのヌクレアーゼシステム
を指す。
本明細書において使用する場合、用語「変化した濃度」は、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象における栄養要求性因子の濃度と比較した場合の、栄養要求性因子の濃度の増大を指す。
本明細書において使用する場合、用語「変化したpH」は、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象におけるpHと比較した場合の、対象において誘導されるpHの変化を指す。
本明細書において使用する場合、用語「変化した温度」、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象における温度と比較した場合の、対象において誘導される温度の変化を指す。
本明細書において使用する場合、用語「栄養要求性」または「栄養要求性の」は、細胞の増殖および複製を維持するために栄養要求性因子の外来性投与を必要とする細胞の状態を指す。
本明細書において使用する場合、用語「栄養要求性誘導座位」または「栄養要求性誘導遺伝子」は、破壊された場合に細胞を栄養要求性にする、細胞中の染色体の領域を指す。例えば、細胞は、栄養要求性因子の合成、再利用またはサルベージに関与する酵素をコードする遺伝子を（直接的に、もしくは栄養要求性因子を生成するために使用される中間体を合成することを介して上流で）破壊することによって、または、栄養要求性誘導遺伝子のオープンリーディングルレームを破壊することなく、遺伝子の発現を調節する発現制御配列を破壊することによって、栄養要求性になり得る。
本明細書において使用する場合、用語「生物学的利用能」は、対象に投与される改変宿主細胞または栄養要求性因子の所与の量の全身利用能を指す。
本明細書において使用する場合、用語「Cas9」は、ゲノム編集で使用するためのエンドヌクレアーゼであるCRISPR関連タンパク質9を指す。
用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」および「からなる」を意味し、例えば、Xを「含む（comprising）」組成物は、Xのみからなり得るか、または追加的な何か、例えば、X＋Yを含み（include）得る。
用語「前処置レジメ」は、幹細胞移植の前に患者が受ける療法の過程を指す。
本明細書において使用する場合、用語「連続フロー」は、単一経路／単一接触点で、ある期間にわたって継続的に投与される治療剤の投与、すなわち、継続投与事象を指す。
本明細書において使用する場合、用語「CRISPR」は、侵入する細胞のRNAヌクレオチドを切断する酵素を配備する、DNAのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）を指す。
本明細書において使用する場合、用語「CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム」は、Cas9に対する結合部位および標的DNA中の切断される部位に対して特異的なターゲティング配列を有するガイドRNA（gRNA）配列を含む遺伝子操作ツールを指す。Cas9はgRNAに結合して、標的部位に結合しかつ標的部位を切断するリボ核タンパク質複合体を形成する。
細胞の文脈で使用される場合、用語「拡大する」は、後代の生成を介して細胞の数を増加させること指す。
用語「発現制御配列」は、関心対象のヌクレオチド配列の発現を調節または制御することができるヌクレオチド配列を指す。例としては、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、miRNA結合部位等が挙げられる。
用語「相同組換え」（HR）は、相同組換え修復メカニズムを介したDNA中の切断の修復の間のヌクレオチド配列の挿入を指す。このプロセスは、切断を修復するためのテンプレートとして、切断領域中のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」分子または「ドナーテンプレート」を使用する。挿入されるヌクレオチド配列は、ゲノム中の一塩基変化でもよく、または大きなDNA配列の挿入でもよい。ドナーテンプレートは、発現コンストラクトの1つまたは複数の機能的構成成分をコードする、例えば、mRNAまたはポリペプチドペイロードをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、1つまたは複数の発現コンストラクトを含むことができる。例えば、本明細書において使用される場合、「相同組換えドナーベクター」(および同様の用語）は、相同組換えを介して細胞のゲノムに組み入れられるか、または組み入れられるように設計される、ドナー分子またはドナーテンプレート核酸分子を指す。発現コンストラクトはポリシストロニックであり得る。いくつかの態様では、発現コンストラクトおよびまたは発現コンストラクト内の発現カセットは、1つまたは複数のリンカー配列、例えば、配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）、T2A（まとめて、「2A配列」）などを含む。
用語「発現コンストラクト」は、真核細胞における発現に必要である配列エレメント、例えばプロモーター配列およびコード配列を含むヌクレオチド配列を指す。場合によっては、発現コンストラクトは1つまたは複数の「発現カセット」を含み、各発現カセットは独立したコード配列に機能的に連結される独立したプロモーターを含む。本明細書において言及されるコード配列は、例えば、DNA、RNA、またはポリペプチドペイロードをコードすることができる。
本明細書において使用される場合、用語「ペイロード」は、生体分子、例えば、DNA、RNA、またはポリペプチド生体分子を指す。例えば、ペイロードは治療的生体分子であり得る。ペイロードは、例えば、アンチセンスRNA、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物、抗miR、合成mRNA、またはポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、ペイロードは、望ましい細胞機能を達成するように細胞内で作用する。いくつかの態様では、ペイロードは、望ましい細胞機能を達成するように細胞の表面で作用する。いくつかの態様では、ペイロードは、望ましい細胞機能を達成するように細胞の外部で作用する。いくつかの態様では、ペイロードは、望ましい細胞機能を達成するように細胞の内因的に（cell-intrinsically）作用する。いくつかの態様では、ペイロードは、望ましい細胞機能を達成するように細胞の外因的に（cell-extrinsically）作用する。
本明細書において使用される場合、用語「前駆細胞」は、例えば、幹細胞、胚性幹細胞（ESC）、多能性幹（PS）細胞（PSC）、人工多能性幹（iPS）細胞（iPSC）、造血幹細胞（HSC）、体性幹細胞、分化転換した幹細胞、分化した細胞、間葉系幹細胞または間葉系間質細胞、神経前駆細胞または神経幹細胞、造血幹細胞または造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、骨格幹細胞、筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、末梢血単核球（PBMC）を指す。
2つ以上のヌクレオチド配列の文脈で使用する場合、用語「相同な」または「相同性」は、生理的条件下で、細胞中で2つのヌクレオチド配列が一緒に特異的に結合するのに十分である、塩基対形成またはハイブリダイゼーションの程度を指す。相同性は、例えば、特定の塩基数にわたって、少なくとも70％の同一性、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれより高い同一性で、相補的配列とワトソン・クリック塩基対形成を受けるであろうヌクレオチドのパーセンテージを計算することによって、説明することもできる。ドナーテンプレートについては、例えば、相同性は200～400塩基にわたり得る。ガイド配列については、例えば、相同性は15～20塩基にわたり得る。
用語「独立した機能ドメイン」は、それぞれが完全なタンパク質に機能を付与する、タンパク質の個々のドメインを指す。例えば、自然界のある特定のタンパク質は、構造的および機能的にタンパク質の残部と異なる酵素または触媒ドメインを含む。そのような酵素または触媒ドメインは、タンパク質配列の残部とは別々に、かつ該残部から独立して発現する場合に、正常な細胞または生理的条件下でその酵素または触媒活性を保持するならば、独立した機能ドメインとみなすことができる。「独立した機能ドメイン」は、それぞれが完全なタンパク質に機能を付与する、タンパク質の個々のサブユニットを指すこともできる。独立した機能ドメインは、単一遺伝子から発現し、それが由来する遺伝子／タンパク質の全体的な機能から分離可能であるか、またはその構成成分である独立した機能を依然として有する、タンパク質の個々のドメイン、サブユニット、または断片であり得る。
用語「機能的に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、または一連の転写因子結合部位）と第2の核酸配列の間の機能的連結であって、発現制御配列が第2の核酸配列の転写および／または翻訳に影響を及ぼす、機能的連結を指す。
本明細書において使用する場合、用語「薬学的組成物」は、少なくとも1種の活性成分、および任意で、薬学的に許容される1種または複数種の賦形剤を含む組成物を指す。
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、（例えば、遊離塩基の基を適切な有機酸と反応させることによって）既存の酸または塩基成分をその塩形態に変換することによって、親化合物が改変されているような、開示される化合物の誘導体を指す。本明細書における化合物または構成成分に対するすべての言及は、その薬学的に許容される塩を含む。
本明細書において使用する場合、用語「再生性」は、対象の臓器または系の一新または修復を指す。
例えば「栄養要求性誘導遺伝子の再発現」の文脈で本明細書において使用される場合、用語「再発現」は、細胞において遺伝子、例えば栄養要求性誘導遺伝子の発現に置き換わる、該発現をレスキューする、補う、または増強する、導入遺伝子の発現を指す。
本明細書において使用される場合、用語「組織特異的因子」は、特定の組織の分化した細胞で独特にまたは差次的に発現している、遺伝子またはタンパク質または遺伝子もしくはタンパク質の組み合わせを指す。ある場合には、組織特異的因子は、特定の望ましい細胞運命の中間体である細胞型で独特にまたは差次的に発現している、遺伝子またはタンパク質である。したがって、細胞または組織における、ある特定の組織特異的因子または組織特異的因子のある特定の組み合わせの存在は、細胞または組織を望ましい細胞運命または組織型に従って分化したものとして特定することができる。
本明細書において使用される場合、用語「組織特異的プロモーター」は、特定の組織または細胞型で遺伝子の発現を駆動するヌクレオチド制御配列を指す。様々な例示的な組織特異的プロモーターが表3に提供される。ある場合には、特定の組織または細胞型における組織特異的因子の存在は、対応する組織特異的プロモーターによって調節される標的遺伝子の発現を駆動する。
用語「治療的因子」は、対象の疾患、障害、または状態の症状を治療および／または緩和する、挿入される導入遺伝子にコードされる生成物を指す。
用語「治療量」は、疾患、障害、または状態の症状の緩和または改善を意味する「治療効果」を発揮するのに十分である治療的因子の量を指す。
本明細書において使用する場合、用語「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量を指す。
本開示の1つまたは複数の態様の詳細を、以下の付随する説明で記述する。本明細書に記載されるものと同様または均等な任意の材料および方法を本開示の実施または試験で使用することができるが、好ましい材料および方法を、次に記載する。本開示の他の特色、目的、および利点は説明から明らかであろう。説明では、単数形は、文脈において別段明記しない限り複数形も含む。別段規定されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、本明細書が優先する。
本開示を以下の非限定例によってさらに例示する。
実施例1.幹細胞の培養
UMPS／ウリジン栄養要求性をヒト多能性細胞で操作する。本明細書の開示の主題である改変宿主細胞は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S.8,945,862に示されるような以下の技法を使用して維持され、分化させられる幹細胞を含むことができる。
失活させたマウス胚線維芽細胞（MEF）支持細胞層（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401）上で、未分化hESC（WICELL（登録商標）のH9株、継代35～45回）を増殖させる。0.1％のゼラチンでコーティングしたプレート上の照射した低継代MEF支持細胞層上で細胞を未分化段階で維持する。培地は毎日交換する。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/F-12、20％ノックアウト血清代替品、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、0.1mM β-メルカプトエタノール、および4ng/ml rhFGF-2（R&D Systems Inc., Minneapolis）からなる。未分化hESCをDMEM/F12中で1mg/mlコラゲナーゼタイプIVによって処理し、継代の当日に機械的にばらばらにする。分化に先立って、以下のようにMEFから調製した馴化培地（CM）中のMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングしたプレート上にhESCを播種する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Nat Biotechnol, 2001. 19(10): p. 971-4）。MEF細胞を収集し、50Gyで照射し、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を有さないhES培地で培養した。CMは毎日採取し、追加的な4ng/mlのbFGFを補充してから、hES細胞に供給する。
実施例2.栄養要求性細胞へのコンストラクトの挿入
Cas9 RNPのエレクトロポレーションによってhESCにおいてUMPS座位を破壊して、組織特異的プロモーターを含む発現制御配列をゲノム遺伝子座に挿入する。プロモーターは、内皮組織との相互作用により、転写を引き起こし始めると考えられる。遺伝子編集のために、hESCを10μm ROCKインヒビター（Y-27632）で24時間処理してから、エレクトロポレーションを行う。ACCUTASE（登録商標）溶液（Life Technologies）を用いて、70～80％コンフルエンスの細胞を収集する。150μg/mLのSpCas9濃度（Integrated DNA Technologies）および1:3のCas9:sgRNAモル比で、反応あたり500,000細胞を使用し、エレクトロポレーションは、4D NUCLEOFECTORシステム（Lonza）の16ウェルのNUCLEOCUVETTE（商標）ストリップにおいて、P3一次細胞溶液（Lonza）中で行った。エレクトロポレーションの直後に、10μM Y-27632を有する500μlのmTeSR（商標）培地（STEMCELL Technologies）を含む、MATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングした24ウェルプレートの1ウェルに、細胞を移す。編集から24時間後に培地を交換し、48時間後にY-27632を除去する。
実施例3.ヒト胚性幹細胞（ESC）－内皮細胞（EC）のインビトロでの分化
hESCの分化を誘導するために、先に記載されるように（Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4391-6およびStem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401を参照されたい；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、懸濁胚様体（EB）を形成するための超低付着プレートのいずれかにおいて、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）および15％の規定されたウシ胎仔血清（FBS）（Hyclone, Logan, Utah）、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、450μMモノチオグリセロール（Sigma, St. Louis, Mo.）、50U/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを含む分化培地中で、未分化hESCを培養する。手短に言えば、馴化培地とともにMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングしたプレート上で培養したhESCを、2mg/mlディスパーゼ（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）によって37℃で15分間処理して、コロニーをほぐした。次いで、コロニーを削りとり、胚様体形成のために、超低付着プレート（Corning Incorporated, Corning, N.Y.）に移した。
実施例4.分化した細胞の純粋な集団の選択
細胞を5-FOAおよびウリジン供給源で増殖させる。分化開始の前に5-FOAを除去する。実施例3に記載されているように一旦分化が行われると、培地からウリジンを除去する。挿入された組織特異的プロモーターの制御下でUMPSを発現しない細胞は死に、それによって、分化した細胞の純粋な集団が残る。
実施例5.UMPS-/-バックグラウンドでUMPSを再発現する細胞の選択
本明細書に記載されるように両アレルでノックアウトされたUMPS遺伝子を有する細胞集団へのUMPSを発現するコンストラクトの挿入は、本明細書に記載される方法を使用する選択を原理上実証する。DNAベクターによって送達される、構成的プロモーター（EF1a）の制御下で2Aリンカー配列によって分離されたmCherryおよびUMPSを発現するコンストラクト（SEQ ID NO: 42）を、相同組換えアームを使用して標的化されるCCR5座位中にエレクトロポレーションによって挿入した。細胞をウリジンの存在下で増殖させて、いかなる選択圧も軽減させ、次いで、ウリジンを除去して、UMPSを首尾よく再発現する細胞を選択した。フローサイトメトリーを使用して、mCherryの発現によって細胞を選別した。14日間の培養後、ウリジンの存在下でmCherry+細胞の％はおよそ20％であり；ウリジンの非存在下でmCherry+細胞の％はおよそ90％であった。したがって、UMPSノックアウト細胞におけるUMPSの再発現は、栄養要求性ベースの細胞選択を実証する。
実施例6.分割栄養要求性
2つの別々のベクターを使用して、実施例2に従って、UMPSの独立した機能ドメイン、すなわち、OPRTおよびODCをUMPSノックアウト細胞に再導入する。OPRTおよびmCherryを保有する第1の相同組換えドナーベクター（SEQ ID NO: 43）は、OPRT（SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列をコードするSEQ ID NO: 4）をコードする配列、2Aリンカー（それぞれ、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、およびSEQ ID NO: 24のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、またはSEQ ID NO: 23）、およびmCherry蛍光タンパク質（それぞれSEQ ID NO: 36のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 34またはSEQ ID NO: 35）をコードする配列を含む。ODCおよびCD19を保有する相同組換えドナーベクター（SEQ ID NO: 44）は、tCD19（SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列をコードするSEQ ID NO: 37）をコードする配列、2Aリンカー、およびODC（SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列をコードするSEQ ID NO: 6）をコードする配列を含む。OPRTおよびODCコンストラクトの発現は、真核生物のプロモーター、例えばEF1a（SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 32）によって駆動させることができる。相同組換えベクターは、（例えば、本明細書に記載されるSEQ ID NO: 11～15より選択されるCCR5左および右相同性アームを使用して）セーフハーバー座位CCR5への組み込みのために共ターゲティングされる。相同組換えベクターは、bGH-ポリA終結シグナル（SEQ ID NO: 39またはSEQ ID NO: 40）などの終結シグナルをさらに含むことができる。ウリジン有り無し両方で細胞を培養し、CD19とmCherryの両方を発現する細胞（CD19+/mCherry+）のパーセントをフローサイトメトリーによって経時的に測定する。16日目の結果を表5に提供する。
（表５）分割UMPSは二重導入遺伝子組み込みの選択を可能にする
Figure 2022532535000015
表5に示すように、ウリジンを取り除くことによって、UMPSノックアウト細胞の培養においてCD19+/mCherry+細胞が濃縮され、このことは、ウリジンの非存在が、一緒にUMPS機能を置き換える二重導入遺伝子を発現する細胞の選択圧を加えることを示す。
実施例7.成熟ベータ細胞の選択のための分割栄養要求性システム
成熟ベータ細胞は、1種または複数種の組織または細胞型特異的因子の発現を特徴とする。例えば、インスリン（「INS」、ENSG00000254647）とNKX6.1（ENSG00000163623）の共発現は、成熟した幹細胞由来ベータ細胞を示す（例えば、Ma, Haiting, et al. "Establishment of human pluripotent stem cell-derived pancreatic β-like cells in the mouse pancreas." Proceedings of the National Academy of Sciences 115.15 (2018): 3924-3929；Pagliuca, Felicia W., et al. "Generation of functional human pancreatic β cells in vitro." Cell 159.2 (2014): 428-439；およびRezania, Alireza, et al. "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells." Nature biotechnology 32.11 (2014): 1121を参照されたい；これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。Rezaniaらによれば、「PDX1（膵臓ホメオドメイン転写因子［ENSG00000139515］）とNKX6.1（ホメオボックス転写因子）は多分化能膵臓前駆細胞で共発現しており、これらは、すべての成熟した（adult）膵臓内胚葉細胞を生じさせ」、それらの共発現はベータ細胞に限定される。NEUROD1（ENSG00000162992）、NKX2.2（ENSG00000125820）、およびMAFA（ENSG00000182759）は、その発現が成熟ベータ細胞に限定されるかまたは成熟ベータ細胞で差次的に発現している、さらなる遺伝子に相当する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Nishimura, Wataru, Satoru Takahashi, and Kazuki Yasuda. "MafA is critical for maintenance of the mature beta cell phenotype in mice." Diabetologia 58.3 (2015): 566-574を参照されたい）。Rezaniaら、およびPagliucaらは、分化の各段階についての発現プロファイルを用いてヒト多能性幹細胞から成熟ベータ細胞を調製するための多段式分化手順をさらに詳述し、このようにして分化した細胞がインビボで糖尿病を回復させることを示す。
例えば、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、例えばインスリンを発現する導入遺伝子またはインスリン依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒト細胞の集団から成熟ベータ細胞を特異的に選択することができることが、今や特に企図され、ここで、導入遺伝子は、内在性のインスリン発現制御配列によって調節され、UMPSをさらに含む。mCherryおよびUMPS（SEQ ID NO: 41）を保有する相同組換えベクターを使用して、インスリン遺伝子を相同組換えのために標的化することができ、このベクターは、SEQ ID NO: 16および／またはSEQ ID NO: 17を含む左相同性アームならびにSEQ ID NO: 18を含む右相同性アームを含む。SEQ ID NO: 16およびSEQ ID NO: 18の左および右相同性アームは、それぞれ、SEQ ID NO: 17のインスリンコード配列の部分の上流にある、インスリンコード配列中のある位置を標的とするヌクレアーゼシステムに依拠する。インスリン座位に挿入された導入遺伝子は、例えば、IRES駆動性mCherryレポーターをさらに含むことができ、IRESはSEQ ID NO: 33または同様の配列を含み、mCherryはSEQ ID NO: 34またはSEQ ID NO: 35を含む。レポータータンパク質の発現は、UMPS（SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2）をコードするヌクレオチド配列を提供することによって、UMPSの発現と関連付けることができる。例えば、本明細書の他の個所で記載されるT2Aリンカーを使用して、UMPSコード配列をレポーターから分離することができる。したがって、INS-mCherry-UMPSコンストラクトは、内在性インスリン調節性制御配列下にあるインスリン、mCherry、およびUMPSを発現するトリシストロニックコンストラクトを含む。bGH-ポリA終結シグナル（SEQ ID NO: 39またはSEQ ID NO: 40）などの終結シグナルをUMPSコード配列の後に含めることによって、トリシストロニックカセットの発現を終結させることができる。
内在性のインスリン発現制御配列の制御下にあるINS-mCherry-UMPS導入遺伝子のウリジン栄養要求性細胞への挿入は、インスリンを発現する細胞、すなわち、成熟ベータ細胞でのみUMPSの再発現を可能にする。したがって、本明細書に記載される方法は、単一栄養要求性選択を使用して細胞の集団から成熟ベータ細胞を選択する方法を含み、「単一」は1種の栄養要求性誘導遺伝子（すなわち、UMPS）の使用を指す。
本明細書に記載される方法は、分割栄養要求性を使用する二重特異性選択方法をさらに含む。例えば、例えばUMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、例えばインスリンを発現する第1の導入遺伝子またはインスリン依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒト細胞の集団から成熟ベータ細胞を特異的に選択することができ、ここで、導入遺伝子は、内在性のインスリン発現制御配列によって調節され、第1のUMPS独立機能ドメイン（例えばODC）をさらに含む。例えば、ODCのみを発現する細胞はウリジンに対して栄養要求性のままであると考えられる。したがって、栄養要求性を解除し、ウリジンを取り除くことを可能にするためには、例えばOPRTを発現する第2の導入遺伝子が発現しなければならない。第2の導入遺伝子の発現は、第2の成熟ベータ細胞特異的因子、例えばNKX6.1に固有の内在性発現制御配列の調節下にあり得る。したがって、インビトロで分化した細胞の集団から栄養要求性因子ウリジンを取り除いた際、インスリンとNKX6.1の両方を発現する細胞のみが生存すると考えられ、それによって、成熟ベータ細胞を選択する。
同様に、例えば、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、第1のUMPS独立機能ドメイン（例えばODC）を含む例えばインスリンを発現する導入遺伝子またはインスリン依存的導入遺伝子、および第2のUMPSの独立した機能ドメイン（例えばOPRT）を含むMAFAまたはMAFA依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒト細胞の集団から成熟ベータ細胞を特異的に選択することができることが、特に企図される。インビトロで分化した細胞の集団から栄養要求性因子ウリジンを取り除いた際、インスリンとMAFAの両方を発現する細胞のみが生存すると考えられ、それによって、成熟ベータ細胞を選択する。
例えば、1型糖尿病の対象を含めて、グルコース感受性の成熟インスリン産生ベータ細胞を必要としている対象において糖尿病を軽減するために、本明細書に記載される単一および二重特異性選択方法を使用して選択し、濃縮した細胞をインビボで投与することができることが企図される。
本明細書において提供される成熟ベータ細胞を選択する方法を以下の表6に概説する。表6に示すように、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発して、1種もしくは複数種のベータ細胞特異的因子および／または1種もしくは複数種のベータ細胞特異的プロモーターを利用して、栄養要求性遺伝子を再発現させることができ、その結果、ウリジンを取り除いた際、ベータ細胞特異的遺伝子を発現する細胞のみ、したがって成熟ベータ細胞のみが生存および／または増殖すると考えられる。
（表６）栄養要求性選択方法および分割栄養要求性選択方法を使用した、分化した細胞の選択のための方法
Figure 2022532535000016
単一栄養要求性選択の状況では、UMPSの再発現をインスリン、NEUROD1、NKX2.2、および／またはMAFAの細胞性発現によって調節して、成熟ベータ細胞に分化した細胞を選択することができる。
二重特異性栄養要求性選択の状況では、ODCおよびOPRTの再発現をそれぞれインスリンおよびNKX6.1；それぞれインスリンおよびNEUROD1；それぞれインスリンおよびNKX2.2；それぞれインスリンおよびMAFA；またはそれぞれインスリンおよびPDX1の細胞性発現によって調節して、成熟ベータ細胞に分化した細胞を選択することができる。あるいは、OPRTおよびODCの再発現をそれぞれインスリンおよびNKX6.1；それぞれインスリンおよびNEUROD1；それぞれインスリンおよびNKX2.2；それぞれインスリンおよびMAFA；またはそれぞれインスリンおよびPDX1の細胞性発現によって調節して、成熟ベータ細胞に分化した細胞を選択することができる。
概念実証として、インスリンを発現するようにUMPSノックアウト細胞を操作し、これを、例えば、本明細書において議論され、組み入れられるMa et al. (2018), Pagliuca et al. (2014)、および／またはRezania et al. (2014)に記載される適切な方法を使用して、膵臓前駆細胞に分化させた。本明細書に記載される方法に従って、H9ヒト胚性幹細胞（hESC）においてUMPS遺伝子をノックアウトした。構成的プロモーターの調節下にあるGFP-ルシフェラーゼ発現コンストラクトを相同組換えによってHBB座位に組み込んだ（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Dever, Daniel P., et al. "CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells." Nature 539.7629 (2016): 384-389を参照されたい）。インスリンのN末端部のコード配列に機能的に連結されたmCherry-UMPS発現カセット（上記のINS-mCherry-UMPSコンストラクト）を保有する第2の相同組換えドナーベクターをインフレームでインスリン座位に組み込み、その結果、インスリン、mCherry、およびUMPSはすべて改変インスリン座位から発現する。GFP発現は、構成的に発現することが細胞中で確認された。細胞を分化プロトコールに供し、それにより、培養の開始後1日目にhESC分化の段階1を開始して、最終的な内胚葉細胞が生じた。3日目に段階2を開始して、最終的な内胚葉細胞が原始的な腸管細胞に分化した。6日目に段階3を開始して、原始的な腸管細胞が後方前腸細胞分化した。9日目に段階4を開始して、14日目ごろに後方前腸細胞が膵臓前駆細胞に分化した。細胞をモニターし、mCherryおよびUMPSの発現についてその後25日目まで評価した。18日目まで、または培養期間の終了まで、またはわずか12日目（段階4の間）までのウリジンの継続的な存在下のいずれかの細胞を用いて、分化プロトコールに従った。mCherryおよびUMPSの発現を評価した。mCherryのオン対オフ閾値を定義して、蛍光画像に基づく閾値処理を使用して、UMPS発現細胞（所与のUMPSの発現はmCherryと連結される）を特定した。なぜならば、GFP発現は遍在性プロモーターからであり、細胞の分化状態と無関係であることが分かったからである。閾値処理したmCherry－オフ細胞は未分化と考えることができ、一方で、mCherry－オン細胞はベータ細胞に分化していると考えることができる（なぜならば、mCherryおよびUMPSの発現はベータ細胞特異的遺伝子であるインスリンのプロモーターによって駆動されるからである）。
本実験では、ウリジンを取り除くこと（12日目）によって、UMPSを発現しない（したがって、mCherryを発現しない）細胞において、細胞増殖（および遺伝子発現）が阻害されるはずである。したがって、mCherry陰性細胞におけるGFPの発現は、ウリジンが存在する場合、ウリジンが存在しない場合のmCherry陰性細胞におけるGFPの発現よりも高いことが予想された。したがって、ウリジンを取り除いた条件下の［平均GFP（mCherry－オフ）／平均GFP（mCherry－オン）］の比をウリジンを継続した条件下の［平均GFP（mCherry－オフ）／平均GFP（mCherry－オン）］の比と比較した。表7に結果を示し、「栄養要求性メトリック」は、ウリジンを取り除いた条件下の平均GFP比をウリジンを継続した条件下の平均GFP比で割ったもの：［（平均GFP（mCherry－オフ）／平均GFP（mCherry－オン））ウリジンを取り除いた条件］／［（平均GFP（mCherry－オフ）／平均GFP（mCherry－オン））ウリジンを継続した条件]として計算した。顕微鏡画像の複数の視野にわたってこの比を計算し、この結果は、ウリジンを取り除くことによって、UMPS/mCherryを発現しない、したがって分化していない細胞でGFP発現が阻害されることを示した。これは、系譜特異的栄養要求性を使用して、分化した細胞を選択することができることを実証するものである。
（表７）ウリジンを取り除いた条件下の非インスリン（UMPS）発現細胞におけるGFPタンパク質の発現の低下
Figure 2022532535000017
このようにして選択し濃縮した細胞を、例えば、1型糖尿病の対象を含めて、グルコース感受性の成熟インスリン産生ベータ細胞を必要としている対象において糖尿病を軽減するために、インビボで投与することができることが企図される。成熟ベータ細胞の分化と併せた栄養要求性選択方法の使用は、例えば、必要とする対象への投与のために、インビトロで分化した成熟ベータ細胞の純度、量、および有効性を向上させることができる。
実施例8.心筋細胞の定義されたサブセットの分化
実施例6において成熟ベータ細胞の分化について記述されるパラダイムを使用して、栄養要求性選択方法を使用して、心筋細胞の定義されたサブセット、特に心室心筋細胞に分化した細胞を選択することができる。
TBX5（ENSG00000089225）およびNKX2-5（ENSG00000183072）の遺伝子発現は心室筋細胞を特徴づけ、これらの差次的発現は、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞の少なくとも4つの異なる系譜特異的亜集団：TBX5陽性／NKX2-5陽性、TBX5陽性／NKX2-5陰性、TBX5陰性／NKX2-5陽性、およびTBX5陰性／NKX2-5陰性を特定する（その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Zhang, Joe Z., et al. "A human iPSC double-reporter system enables purification of cardiac lineage subpopulations with distinct function and drug response profiles." Cell stem cell 24.5 (2019): 802-811を参照されたい）。特に、TBX5陽性／NKX2-5陽性細胞は心室心筋細胞への分化に有用な一次心臓領域系譜細胞に近い系譜に相当し；TBX5陽性／NKX2-5陰性細胞は、結節性心筋細胞への分化に有用な心外膜系譜に相当し；TBX5陰性／NKX2-5陽性細胞は、心房の心筋細胞への分化に有用な二次心臓領域系譜細胞と類似している亜集団に相当し；TBX5陰性／NKX2-5陰性細胞は、内皮細胞特性を示す亜集団に相当する。
ヒトiPSCに由来する心筋細胞の亜集団を含めた心筋細胞が、今や特に企図される。特に、結節性心筋細胞への分化に有用な心外膜系譜細胞は、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、例えばTBX5を発現する導入遺伝子またはTBX5依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒトiPSCの集団から特異的に選択することができ、ここで、導入遺伝子は、内在性のTBX5発現制御配列によって調節され、UMPSをさらに含む。内在性のTBX5発現制御配列の制御下にあるTBX5-UMPS導入遺伝子のウリジン栄養要求性細胞への挿入は、TBX5を発現する細胞でのみUMPSの再発現を可能にする。
心房の心筋細胞への分化に有用な二次心臓領域系譜細胞と類似している亜集団は、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、例えばNKX2-5を発現する導入遺伝子、またはNKX2-5依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒトiPSCの集団から特異的に選択することができ、ここで、導入遺伝子は、内在性のNKX2-5発現制御配列によって調節され、UMPSをさらに含む。内在性のNKX2-5発現制御配列の制御下にあるNKX2-5-UMPS導入遺伝子のウリジン栄養要求性細胞への挿入は、NKX2-5を発現する細胞でのみUMPSの再発現を可能にする。
分割栄養要求性を使用する二重特異性選択方法を使用して、心室筋細胞に分化する亜細胞の集団を選択することができる。例えば、心室筋細胞は、例えば、UMPS／ウリジン栄養要求性のヒトiPSCから出発し、例えばTBX5を発現する第1の導入遺伝子、またはTBX5依存的導入遺伝子を挿入することによって、インビトロで分化したヒト細胞の集団から特異的に選択することができ、ここで、導入遺伝子は、内在性のTBX5発現制御配列によって調節され、第1のUMPS独立機能ドメイン（例えばODC）をさらに含む。ODCのみを発現する細胞はウリジンに対して栄養要求性のままであると考えられる。したがって、栄養要求性を解除し、ウリジンを取り除くことを可能にするためには、例えばOPRTを発現する第2の導入遺伝子が発現しなければならない。第2の導入遺伝子の発現は、第2の心室心筋細胞特異的因子、例えばNKX2-5に固有の内在性発現制御配列の調節下にあり得る。したがって、インビトロで分化した細胞の集団から栄養要求性因子ウリジンを取り除いた際、TBX5とNKX2-5の両方を発現する細胞のみが生存すると考えられ、それによって、心室筋細胞を選択する。
実施例9.安定なT reg細胞集団の生成
本明細書に記載される分割栄養要求性システムを用いる選択方法を使用して、安定なT reg細胞集団を生成することができる。Passeriniらは、通常のCD4+T細胞が、FOXP3発現を導入することによって、十分に機能的なT reg様細胞に変換され得ることを示した。さらに、CD4+T regにおけるFOXP3の安定発現は、可塑的とは対照的に安定なT reg細胞を示すことが示された（その開示が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Passerini, Laura, et al. "CD4+ T cells from IPEX patients convert into functional and stable regulatory T cells by FOXP3 gene transfer." Science translational medicine 5.215 (2013): 215ra174-215ra174を参照されたい）。
UMPSの第1の独立した機能ドメイン（例えばODC）を、例えばFOXP3プロモーターを使用して、FOXP3（ENSG00000049768）の発現制御配列の制御下で発現させることができ、UMPSの第2の独立した機能ドメイン（例えばOPRT）を、細胞ナイーブ関連プロモーター（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ受容タイプC（PTPRC）［ENSG00000081237］：CD45RAもしくはCD45RO；またはCCR7［ENSG00000126353］）の発現制御配列の制御下で発現させることができることが、今や特に企図される。FOXP3プロモーター－ODCとナイーブ関連プロモーターの制御下にあるOPRTとの両方を組み入れる細胞は、安定なT reg細胞に相当すると考えられる。
分割栄養要求性選択方法を使用して、CAR T細胞株を選択し安定化すること、および同種異系細胞を作製こともできる。例えば、T細胞を単離し、これを、UMPS遺伝子を中断することによって栄養要求性になるように操作することができる。UMPS座位を標的とする第1の相同組換えドナーベクターを、内在性UMPSの発現をノックアウトし、かつUMPSの第1の独立した機能ドメイン、例えばOPRTをノックインするように操作することができる。第1の相同組換えドナーベクターは、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されるFOXP3コード配列を含むことができる。FOXP3コード配列とUMPSの第1の独立した機能ドメインをコードする配列とを、例えばIRES配列によって、機能的に連結することがきる。例えば、内在性TCRアルファ（TCRA）をコードするT細胞受容体（TCR）アルファ定常（TRAC）座位を標的とする第2の相同組換えドナーベクターを用いて、単離したT細胞をさらに操作することができる。第2の相同組換えドナーベクターは、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする配列およびUMPSの第2の独立した機能ドメイン、例えばODCをコードする配列を含むことができる。CARコード配列とUMPSの第2の独立した機能ドメインをコードする配列とを、例えばIRES配列によって機能的に連結することができる。二重ノックイン細胞はUMPSを機能的に再発現すると考えられ、かつウリジンの非存在下で生存すると考えられるが、単一ノックインまたは非ノックイン細胞は、ウリジンの非存在下で餓死するかまたは増殖しないと考えられる。したがって、分割栄養要求性システムによって、CARを発現する、内在性TCRノックアウトの、FOXP3陽性細胞のみが生存および／または増殖することが確実になる。
実施例10.PS細胞由来の操作された巨核球で使用するための発現ベクターを最適化するための分割栄養要求性選択
本明細書に記載される方法に従って、UMPSノックアウト細胞を生成し、ウリジン含有培地中で培養することによってノックアウト細胞を選択することによって、人工多能性幹細胞などの前駆細胞をウリジン栄養要求性を有するように本明細書に記載される方法に従って操作する（例えば、実施例1を参照されたい）。
UMPSノックアウト細胞に第1および第2の相同組換えドナーベクターをトランスフェクトする。第1の相同組換えドナーベクターは以下を保有する：1)EF1aなどの構成的プロモーターを含む発現制御配列の転写調節下にあるOPRTコード配列（SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 4）、および2)PF4などの巨核球特異的プロモーターを含む発現制御配列の転写調節下にある、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列。第2の相同組換えドナーベクターは以下を保有する：1)EF1aなどの構成的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にあるODC（SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 6）、および2)PF4などの巨核球特異的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にある、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列。第1および第2の相同組換えベクターは、（例えば、本明細書に記載されるSEQ ID NO: 11～15より選択されるCCR5左および右相同性アームを使用して）CCR5などのセーフハーバー座位を標的とする相同性アームを有し得る。
トランスフェクトされた細胞をウリジンの非存在下で培養する。第1と第2の相同組換えドナーベクターの両方が首尾よくトランスフェクトされたUMPSノックアウト細胞は、ウリジンを取り除くことを切り抜けて生存するが、第1と第2の相同組換えドナーベクターの両方を首尾よく発現しない細胞は死に、それによって、UMPSの両方の独立した機能ドメインを発現する二重ノックイン細胞を選択する。
当技術分野において公知である方法を使用して、ペイロードの発現および機能について二重ノックイン細胞を評価する。発現レベルは、リンカーまたは他の転写調節配列を組み入れることにより、プロモーターまたはコード配列を調整することによって、最適化することができる。望ましいレベルのペイロードを発現する二重ノックイン細胞は、最適化された第1および第2の相同組換えドナーベクターを有するとして特定される。最適化された第1および第2の相同組換えドナーベクターを続いて使用して、UMPSの独立した機能ドメインを欠く最適化された第1および第2のベクターを設計する。すなわち、最適化された第1のベクターは、PF4などの巨核球特異的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にある、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含み、UMPSの独立した機能ドメインのコード配列／プロモーターを欠き；最適化された第2のベクターは、PF4などの巨核球特異的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にある、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含み、UMPSの独立した機能ドメインのコード配列／プロモーターを欠く。最適化された第1および第2のベクターは、（例えば、本明細書に記載されるSEQ ID NO: 11～15より選択されるCCR5左および右相同性アームを使用して）CCR5などのセーフハーバー座位を標的とする相同組換えアームを含む。
最適化された第1および第2のベクターをウリジンの存在下で培養したUMPSノックアウト細胞にトランスフェクトする。第1と第2の最適化されたベクターの両方を発現するクローンを選択する。選択したクローン集団は、例えば、巨核球に、および／または巨核球から産生される血小板にさらに分化することができ、そうするとすぐに、巨核球特異的プロモーターがペイロードの発現を駆動する。本明細書に記載される巨核球および／または操作された血小板は、Moreau, Thomas, et al. "Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming." Nature communications 7 (2016): 11208；Ito, Yukitaka, et al. "Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production." Cell 174.3 (2018): 636-648；および／またはFeng Q, et al. “Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.” Stem cell reports. 2014;3(5):817-831に記載されている技法を使用して作製することができ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの研究は、iPSCから不死化巨核球前駆細胞株を生成するための方法および血小板の臨床スケールの作製を提供する。
実施例11.巨核球の生成
本明細書に記載される方法に従って、UMPSノックアウト細胞を生成し、ウリジン含有培地中で培養することによってノックアウト細胞を選択することによって、人工多能性幹細胞などの前駆細胞をウリジン栄養要求性を有するように本明細書に記載される方法に従って操作する（例えば、実施例1を参照されたい）。
UMPSノックアウト細胞は巨核球に分化することができる。本明細書に記載される巨核球および／または操作された血小板は、例えば、Moreauら、Itoら、またはFeng Qらに記載される技法を使用して、作製することができる。巨核球への分化の際に、ウリジンを取り除き、そうするとすぐに、残留性巨核球を含む増殖性細胞は死ぬが、巨核球から産生される血小板は、ウリジン代謝の要求が低減したので存続する。したがって、血小板の濃縮集団は、例えば、インビボ適用で使用することができるヒト多能性幹細胞から生成される。インビボのウリジンレベルは、UMPSノックアウト細胞が生存または増殖するのを妨げるほど十分に低い。
実施例12.インビトロでの操作された血小板の作製のための分割栄養要求性
本明細書に記載される方法に従って、UMPSノックアウト細胞を生成し、ウリジン含有培地中で培養することによってノックアウト細胞を選択することによって、人工多能性幹細胞などの前駆細胞をウリジン栄養要求性を有するように本明細書に記載される方法に従って操作する（例えば、実施例1を参照されたい）。
UMPSノックアウト細胞に第1および第2の相同組換えドナーベクターをトランスフェクトする。第1の相同組換えドナーベクターは以下を保有する：1)EF1aなどの構成的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にあるOPRTコード配列（SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 4）、および2)PF4などの巨核球特異的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にある、第1のペイロードタンパク質をコードするヌクレオチド配列。第2の相同組換えドナーベクターは以下を保有する：1)EF1aなどの構成的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にあるODC（SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列をコードする、SEQ ID NO: 6）、および2)PF4などの巨核球特異的プロモーターの発現制御配列の転写調節下にある、第2のペイロードタンパク質をコードするヌクレオチド配列。第1および第2の相同組換えベクターは、（例えば、本明細書に記載されるSEQ ID NO: 11～15より選択されるCCR5左および右相同性アームを使用して）CCR5などのセーフハーバー座位を標的とする相同性アームを有し得る。
トランスフェクトされた細胞をウリジンの非存在下で培養する。第1と第2の相同組換えドナーベクターの両方が首尾よくトランスフェクトされたUMPSノックアウト細胞は、ウリジンを取り除くことを切り抜けて生存するが、第1と第2の相同組換えドナーベクターの両方を首尾よく発現しない細胞は死に、それによって、UMPSの両方の独立した機能ドメインを発現する二重ノックイン細胞を選択する。
例えば、Moreauら、Ito, Y.ら、またはFeng, Q.らに記載される技法を使用して、二重ノックイン細胞をインビトロで巨核球に分化させる。分化した細胞は、UMPSのEF1a駆動性OPRT/ODC独立機能ドメインを発現するのを停止する。5-FOA選択を使用して、いかなる残留性多能性細胞も排除する。残存する巨核球は、下流の治療適用で使用することができる血小板を産生する。ウリジンを取り除き、そうするといかなる残存する有核の増殖性巨核球または他の増殖性細胞も死に、インビトロで前駆細胞に由来する血小板の純粋な集団が残る。
均等物および範囲
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本開示による特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
特許請求の範囲では、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、そうでないと示されない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、1つまたは1つより多くを意味し得る。群の1つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、そうでないと示されない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーの1つ、1つより多く、またはすべてが、所与の生成物もしくはプロセス中に存在する、所与の生成物もしくはプロセスで用いられる、またはそうでなければ所与の生成物もしくはプロセスに関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、群の正確に1つのメンバーが、所与の生成物もしくはプロセス中に存在する、所与の生成物もしくはプロセスで用いられる、またはそうでなければ所与の生成物もしくはプロセスに関連する態様を含む。本開示は、1つより多い、または全部の群のメンバーが、所与の生成物もしくはプロセス中に存在する、所与の生成物もしくはプロセスで用いられる、またはそうでなければ所与の生成物もしくはプロセスに関連する態様を含む。
用語「含む（comprising）」はオープンであることが意図され、さらなる要素または工程の包含を許可するが、該包含を必要としないことにも留意されたい。したがって、用語「含む」が本明細書において使用される場合、用語「からなる」も包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別段指示がない限り、またはそうでなければ文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈において別段明記しない限り、範囲の下限の単位の10分の1まで、本開示の様々な態様において定められた範囲内の任意の特定の値または部分範囲を想定することができることを理解されたい。
さらに、先行技術の範囲内に入る本開示の任意の特定の態様は、請求項のいずれか1つまたは複数から明確に排除され得ることを理解されたい。そのような態様は当業者に公知であるとみなされるので、本明細書において排除が明確に記述されていないとしても、これらは排除され得る。本開示の組成物の任意の特定の態様（例えば、任意の抗生物質、治療成分、または活性成分；任意の作製方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在と関連しているかどうかを問わず、任意の理由で、任意の1つまたは複数の請求項から排除され得る。
使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であること、および本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、そのより広い局面において、添付の特許請求の範囲の範囲内において変更を行うことができることを理解されたい。
いくつかの記載される態様に関して、ある程度の長さで、ある程度詳細に本開示を記載してきたが、任意のそのような事項もしくは態様または任意の特定の態様に限定されるべきであることは意図されず、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供するように、したがって、本開示の意図された範囲を効果的に包含するように解釈されるべきである。

Claims (170)

  1. 以下の工程を含む、分化した細胞の集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、遺伝子のプロモーターの必ずしも必要ではない部分を標的とするガイドRNA（gRNA）を含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程；
    (b)相同組換えによって、組織特異的プロモーターおよび該遺伝子の少なくとも一部を含むコンストラクトを両アレルに挿入する工程であって、該遺伝子が、
    Figure 2022532535000018
    からなる群より選択され、結果として、該前駆細胞が栄養要求性因子に対して栄養要求性になる、該工程；
    (c)該複数の前駆細胞を該栄養要求性因子と接触させる工程；
    (d)該組織特異的プロモーターと関連する組織への該前駆細胞の分化を刺激する工程であって、該遺伝子が分化に応じて発現する、該工程；および
    (e)該栄養要求性因子を除去し、それによって、分化した細胞を選択して分化した細胞の集団を生成する工程。
  2. 前記複数の前駆細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記遺伝子がUMPS遺伝子である、請求項1または2記載の方法。
  4. UMPS遺伝子のプロモーターが前記組織特異的プロモーターに置き換わる、請求項3記載の方法。
  5. 前記栄養要求性因子がウラシルであるかまたはウラシルの供給源である、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記コンストラクトが、分化に応じて発現する治療的因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記UMPS遺伝子の少なくとも一部を有するカセットとして前記治療的因子を発現させる工程をさらに含む、請求項6記載の方法。
  8. 前記コンストラクトがポリシストロニックである、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記コンストラクトが配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を含む、請求項8記載の方法。
  10. 前記UMPS遺伝子の少なくとも一部が相同性アームである、請求項3～9のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記複数の前駆細胞が、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、心筋細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 前記組織が、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択される、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 分化した細胞の前記集団が免疫細胞を含む、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
  15. 前記組織特異的プロモーターが、WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーターからなる群より選択される、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記コンストラクトが条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされている、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 以下の工程を含む、分化した細胞の集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位をコードするDNA配列と接触させる工程であって、
    該DNA配列が栄養要求性誘導遺伝子中にノックインされ、結果として、該前駆細胞が栄養要求性因子に対して栄養要求性になり、かつ
    該miRNA標的部位に結合する前駆細胞特異的miRNAが該前駆細胞で発現する、
    該工程；
    (b)該複数の前駆細胞を該栄養要求性因子と接触させる工程；
    (c)該前駆細胞の分化を刺激する工程であって、分化が該前駆細胞特異的miRNAの発現を抑制して、該遺伝子の発現を活性化する、該工程；および
    (d)該栄養要求性因子を除去し、それによって、分化した細胞を選択して分化した細胞の集団を生成する工程。
  18. 前記複数の前駆細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
  19. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、
    Figure 2022532535000019
    からなる群より選択される、請求項17または18記載の方法。
  20. 前記栄養要求性誘導遺伝子がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、前記1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位がUMPS遺伝子から転写されるmRNA転写物中に存在する、請求項17～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位が前記栄養要求性誘導遺伝子から転写される転写産物の3’非翻訳領域（UTR）中にある、請求項17～20のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記栄養要求性因子がウラシルであるかまたはウラシルの供給源である、請求項17～21のいずれか一項記載の方法。
  23. 治療的因子をコードする遺伝子を含むコンストラクトを前記前駆細胞のゲノムに挿入する工程をさらに含み、該治療的因子の発現が前記栄養要求性誘導遺伝子の発現を制御するプロモーターと同じプロモーターによって制御され、前記分化した細胞が該治療的因子を発現する、請求項17～22のいずれか一項記載の方法。
  24. 前記栄養要求性誘導遺伝子とインフレームのカセットとして前記治療的因子を発現させる工程をさらに含む、請求項17～23のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記カセットが配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を含む、請求項24記載の方法。
  26. 前記1つまたは複数の前駆細胞特異的miRNA標的部位をコードするDNA配列が、前記栄養要求性誘導遺伝子を標的とする相同性アームをさらに含む、請求項20～25のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記複数の前駆細胞が、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、心筋細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17～26のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記前駆細胞の分化を刺激する工程が、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン組織、および血管組織からなる群より選択される細胞または組織型の分化した細胞をもたらす、請求項17～27のいずれか一項記載の方法。
  29. 分化した細胞の前記集団が免疫細胞を含む、請求項17～28のいずれか一項記載の方法。
  30. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  31. 前記遺伝子が条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされている、請求項17～30のいずれか一項記載の方法。
  32. 対象において疾患、障害または状態を治療する方法であって、請求項13、14、29、および30のいずれか一項記載の免疫細胞を該対象に投与する工程を含む、該方法。
  33. 以下の工程を含む、分化の際に栄養要求性因子を産生することによって栄養要求性を軽減する方法：
    (a)栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトによって生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供する工程；および
    (b)該栄養要求性誘導遺伝子のオープンリーディングフレームを含むコンストラクトを組織特異的遺伝子座に挿入する工程であって、該組織特異的遺伝子の発現が破壊されず、それによって、該組織特異的遺伝子座と関連する組織への該前駆細胞の分化の際に、該栄養要求性因子を産生する、該工程。
  34. 前記前駆細胞が人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）より選択される、請求項33記載の方法。
  35. 前記遺伝子が、
    Figure 2022532535000020
    からなる群より選択される遺伝子からなる群より選択される、請求項33または34記載の方法。
  36. 前記遺伝子がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）である、請求項35記載の方法。
  37. 前記コンストラクトが配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）をさらに含む、請求項33～36のいずれか一項記載の方法。
  38. 前記組織特異的遺伝子座がインスリン座位である、請求項33～37のいずれか一項記載の方法。
  39. 前記複数の栄養要求性前駆細胞を免疫細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項33～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 前記免疫細胞がT細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である、請求項39記載の方法。
  41. 前記組織特異的遺伝子が前記挿入工程の間に置き換えられない、請求項33～40のいずれか一項記載の方法。
  42. 前記前駆細胞の分化の際にインスリンを産生する工程をさらに含む、請求項41記載の方法。
  43. 前記遺伝子が条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされている、請求項33～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 以下の工程を含む、プラスミドの組み込みまたはエピソーム発現を有する細胞を選択する方法：
    (a)複数の細胞に栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトをもたらし、結果として、該複数の細胞において栄養要求性をもたらす工程であって、該栄養要求性を有する該複数の細胞を、該複数の細胞に栄養要求性因子を提供する培地中で増殖させる、該工程；
    (b)プラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびナノ粒子からなる群より選択される送達システムを該複数の細胞にトランスフェクトする工程であって、該送達システムが該栄養要求性因子を発現する、該工程；ならびに
    (c)該培地を除去し、それによって、プラスミドの組み込みまたはエピソーム発現を有する細胞を選択する工程。
  45. 前記送達システムが少なくとも1つの導入遺伝子を発現する、請求項44記載の方法。
  46. 前記遺伝子が、
    Figure 2022532535000021
    からなる群より選択される、請求項44または45記載の方法。
  47. 前記遺伝子が条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチでタグ付けされている、請求項44～46のいずれか一項記載の方法。
  48. 請求項1～47のいずれか一項記載の方法を実施するための材料を含むキット。
  49. 以下の工程を含む、分化した細胞の集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、栄養要求性誘導遺伝子の一部を両アレル性に標的化するガイドRNA（gRNA）を含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程であって、該栄養要求性誘導遺伝子が、少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含み、結果として、該前駆細胞が栄養要求性因子に対して栄養要求性になる、該工程；
    (b)該複数の前駆細胞を、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、該第1の相同組換えコンストラクトが、第1の組織特異的プロモーターと該栄養要求性誘導遺伝子の該第1の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含み、該第2の相同組換えコンストラクトが、第2の組織特異的プロモーターと該栄養要求性誘導遺伝子の該第2の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む、該工程；
    (c)該複数の前駆細胞を該栄養要求性因子と接触させる工程；
    (d)該第1および該第2の組織特異的プロモーターを発現する細胞型または組織への該前駆細胞の分化を刺激する工程であって、該第1および該第2の相同組換えコンストラクトが、分化した細胞で発現する、該工程；ならびに
    (e)該栄養要求性因子を除去することによって分化した細胞を選択し、それによって、分化した細胞の集団を生成する工程。
  50. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、
    第3の独立した機能ドメイン；第3および第4の独立した機能ドメイン；または第3、第4、および第5の独立した機能ドメイン
    をさらに含み；
    前記方法が、
    前記複数の前駆細胞を、第3の組織特異的プロモーターと第3の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む第3の相同組換えコンストラクト；第3および第4の組織特異的プロモーターと第3および第4の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む第3および第4の相同組換えコンストラクト；または第3、第4、および第5の組織特異的プロモーターと第3、第4、および第5の独立した機能ドメインの少なくとも一部とを含む第3、第4、および第5の相同組換えコンストラクトとそれぞれ接触させる工程
    をさらに含み；
    前記細胞型または組織が、それぞれ、第3、第3および第4、または第3、第4、および第5の組織特異的プロモーターを発現し、第3、第3および第4、または第3、第4、および第5の相同組換えコンストラクトがすべて、分化した細胞で発現する、
    請求項49記載の方法。
  51. 前記栄養要求性誘導遺伝子がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインがオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインがオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む、請求項49記載の方法。
  52. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインがカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインがアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインがジヒドロオロターゼを含む、請求項50記載の方法。
  53. 前記前駆細胞を5-FOAと接触させる工程をさらに含む、請求項49～52のいずれか一項記載の方法。
  54. 前記相同組換えコンストラクトの1つまたは複数がセーフハーバー座位に挿入される、請求項49～53のいずれか一項記載の方法。
  55. 前記セーフハーバー座位がCCR5である、請求項54記載の方法。
  56. 前記栄養要求性因子がウリジンである、請求項49～55のいずれか一項記載の方法。
  57. 前記相同組換えコンストラクトの1つまたは複数が治療的因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項49～56のいずれか一項記載の方法。
  58. 前記相同組換えコンストラクトの1つまたは複数がポリシストロニックである、請求項49～57のいずれか一項記載の方法。
  59. 前記ポリシストロニックコンストラクトの1つまたは複数が配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）を含む、請求項58記載の方法。
  60. 前記複数の前駆細胞が、造血幹細胞（HSC）、胚性幹細胞、分化転換した幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、心筋細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49～59のいずれか一項記載の方法。
  61. 前記細胞型または組織が、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、頸管、結合組織、耳、胚組織、食道、眼、心臓、造血組織、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、気管、臍帯、子宮、内分泌、ニューロン、および血管からなる群より選択される、請求項49～60のいずれか一項記載の方法。
  62. 前記分化した細胞が免疫細胞である、請求項49～61のいずれか一項記載の方法。
  63. 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項62記載の方法。
  64. 前記2つ以上の組織特異的プロモーターが、WAS近位プロモーター；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；CD2座位制御領域；CD4ミニマルプロモーターならびに近位エンハンサーおよびサイレンサー；CD4ミニプロモーター／エンハンサー；LTR内のGATA-1エンハンサーHS2；HS-40、GATA-1、ARE、およびイントロン8エンハンサーと組み合わされた、または組み合わされていない、アンキリン-1およびα-スペクトリンプロモーター；アンキリン-1プロモーター／β-グロビンHS-40エンハンサー；レトロウイルスLTR内のGATA-1エンハンサーHS1-HS2；ハイブリッドサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー／β-アクチンプロモーター；MCH II-特異的HLA-DRプロモーター；ファスシンプロモーター（pFascin）；デクチン-2遺伝子プロモーター；DC-STAMP由来の5’非翻訳領域；重鎖イントロンエンハンサー（Eμ）およびマトリックス結合領域；CD19プロモーター；ハイブリッド免疫グロブリンプロモーター（Ig遺伝子由来のIgkプロモーター、イントロンエンハンサー、および3’エンハンサー）；CD68Lプロモーターおよび第1イントロン；糖タンパク質Ibαプロモーター；アポリポタンパク質E（Apo E）エンハンサー／アルファ1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター（ApoE/hAAT）；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；アルブミンプロモーター；HAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；アルブミンおよびhAATプロモーター／α1-ミクログロブリンおよびプロトロンビンエンハンサー；HAATプロモーター／Apo E座位制御領域；hAATプロモーター／4コピーのApo Eエンハンサー；TBGプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターおよびα1-ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）；DC172プロモーター（α1-アンチトリプシンプロモーターおよびα1-ミクログロブリンエンハンサー）；LCAT、kLSP-IVS、ApoE/hAAT、および肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター；RU486応答性プロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；クレアチンキナーゼプロモーター；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；クレアチンキナーゼプロモーター；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域（MHCK7）；α-ミオシンおよびクレアチンキナーゼのハイブリッドエンハンサー／プロモーター領域；合成筋肉特異的プロモーターC5-12；心臓トロポニン-I近位プロモーター；E-セレクチンおよびKDRプロモーター；プレプロエンドセリン-1プロモーター；KDRプロモーター／低酸素応答性エレメント；Flt-1プロモーター；Flt-1プロモーター；ICAM-2プロモーター；合成内皮プロモーター；エンドセリン-1遺伝子プロモーター；アミラーゼプロモーター；インスリンおよびヒトpdx-1プロモーター；TRE調節性インスリンプロモーター；エノラーゼプロモーター；エノラーゼプロモーター；TRE調節性シナプシンプロモーター；シナプシン1プロモーター；PDGF-βプロモーター／CMVエンハンサー；CMVエンハンサーと組み合わされたPDGF-β、シナプシン、チューブリン-α、およびCa2+／カルモジュリン-PK2プロモーター；リン酸活性化型グルタミナーゼおよび小胞グルタミン酸トランスポーター-1プロモーター；グルタミン酸デカルボキシラーゼ-67プロモーター；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター；神経フィラメント重鎖遺伝子プロモーター；ヒト赤オプシンプロモーター；ケラチン-18プロモーター；ケラチン-14（K14）プロモーター；ならびにケラチン-5プロモーターからなる群より選択される、請求項49～63のいずれか一項記載の方法。
  65. 前記相同組換えコンストラクトの1つまたは複数が、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項49～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 対象において疾患、障害または状態を治療する方法であって、請求項62または63記載の免疫細胞を該対象に投与する工程を含む、該方法。
  67. 以下の工程を含む、栄養要求性を軽減する方法：
    (a)少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって生成された複数の栄養要求性前駆細胞を提供する工程；ならびに
    (b)該栄養要求性前駆細胞のゲノム中に、該第1の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第1のコンストラクトを第1の組織特異的遺伝子座に挿入し、かつ、該第2の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第2のコンストラクトを第2の組織特異的遺伝子座に挿入する工程であって、該第1および第2の座位における該組織特異的遺伝子の発現が破壊されず、それによって、該第1および第2の座位において該第1および該第2の組織特異的遺伝子を発現する細胞型または組織への該前駆細胞の分化の際に、該栄養要求性を軽減する、該工程。
  68. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、
    第3の独立した機能ドメイン；第3および第4の独立した機能ドメイン；または第3、第4、および第5の独立した機能ドメイン
    をさらに含み；
    前記方法が、
    第3の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第3のコンストラクト；第3の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第3のコンストラクトおよび第4の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第4のコンストラクト；または第3の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第3のコンストラクト、第4の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第4のコンストラクト、および第5の独立した機能ドメインのオープンリーディングフレームを含む第5のコンストラクトを前記栄養要求性前駆細胞のゲノム中にそれぞれ挿入する工程
    をさらに含み；
    前記細胞型または組織が、それぞれ第3、第3および第4、または第3、第4、および第5の組織特異的遺伝子発現し、第3、第3および第4、または第3、第4、および第5のコンストラクトがすべて、分化した細胞で発現する、
    請求項67記載の方法。
  69. 前記前駆細胞が人工多能性幹細胞（iPSC）または胚性幹細胞（ESC）である、請求項67または68記載の方法。
  70. 前記栄養要求性誘導遺伝子がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインがオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインがオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む、請求項67～69のいずれか一項記載の方法。
  71. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインがカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインがアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインがジヒドロオロターゼを含む、請求項67～69のいずれか一項記載の方法。
  72. 前記コンストラクトの1つまたは複数が配列内リボソーム進入部位（IRES）またはペプチド2A配列（P2A）をさらに含む、請求項67～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 前記組織特異的遺伝子座がインスリン座位である、請求項67～72のいずれか一項記載の方法。
  74. 前記複数の栄養要求性前駆細胞を免疫細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項67～73のいずれか一項記載の方法。
  75. 前記免疫細胞がT細胞、B細胞、またはナチュラルキラー（NK）細胞である、請求項74記載の方法。
  76. 前記組織特異的遺伝子が挿入工程の間に置き換えられない、請求項67～75のいずれか一項記載の方法。
  77. 前記前駆細胞の分化の際にインスリンを産生する工程をさらに含む、請求項76記載の方法。
  78. 前記コンストラクトの1つまたは複数が条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項67～77のいずれか一項記載の方法。
  79. 以下の工程を含む、少なくとも第1の外来遺伝子および第2の外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する方法：
    (a)複数の細胞に、少なくとも第1および第2の独立した機能ドメインを含む栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトまたはノックダウンをもたらし、結果として、該複数の細胞において栄養要求性因子に対して栄養要求性をもたらす工程；
    (b)該栄養要求性因子を提供する培地中で該複数の細胞を増殖させる工程；
    (c)該第1の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および該第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第1の送達システム、ならびに該第2の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および該第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の送達システムを該複数の細胞にトランスフェクトする工程；ならびに
    (d)栄養要求性因子を欠く培地と該培地を交換し、それによって、該第1および第2の外来遺伝子を機能的に組み込んだ細胞を選択する工程。
  80. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、
    第3の独立した機能ドメイン；第3および第4の独立した機能ドメイン；または第3、第4、および第5の独立した機能ドメイン
    をさらに含み、
    前記方法が、
    第3の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第3の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第3の送達システム；第3の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第3の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第3の送達システム、ならびに第4の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第4の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の送達システム；または第3の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第3の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第3の送達システム、第4の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第4の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の送達システム、ならびに第5の外来遺伝子をコードするヌクレオチド配列および第5の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第5の送達システムを該複数の細胞にそれぞれトランスフェクトする工程
    をさらに含む、
    請求項79記載の方法。
  81. 前記送達システムの1つまたは複数が、プラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、またはナノ粒子を含む、請求項79または80記載の方法。
  82. 前記栄養要求性誘導遺伝子がウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）であり、第1の独立した機能ドメインがオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ（OPRT）を含み、第2の独立した機能ドメインがオロチジン5’-リン酸デカルボキシラーゼ（ODC）を含む、請求項79～81のいずれか一項記載の方法。
  83. 前記栄養要求性誘導遺伝子が、カルバモイルリン酸合成酵素2、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ（CAD）であり、第1の独立した機能ドメインがカルバモイルリン酸合成酵素2を含み、第2の独立した機能ドメインがアスパルテートトランスカルバミラーゼを含み、第3の独立した機能ドメインがジヒドロオロターゼを含む、請求項79～81のいずれか一項記載の方法。
  84. 前記送達システムの1つまたは複数が、条件付き不安定化ドメインまたは条件付きリボザイムスイッチをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項79～83のいずれか一項記載の方法。
  85. 以下の工程を含む、成熟ヒトベータ細胞の集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程であって、結果として、該前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる、該工程；
    (b)該複数の前駆細胞を、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、該第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたインスリンをコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列を含み、該第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結されたNkx6.1をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列を含み、該第1および該第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、かつインスリンとNkx6.1の両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、該工程；
    (c)該複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
    (d)成熟ベータ細胞への該複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
    (e)ウリジンを除去することによってインスリンとNkx6.1の両方を発現する成熟ベータ細胞を選択し、それによって、成熟ヒトベータ細胞の集団を生成する工程。
  86. 対象において1型糖尿病を軽減する方法であって、請求項85記載の成熟ヒトベータ細胞を該対象に投与する工程を含む、該方法。
  87. インビトロで分化した前駆細胞の集団より選択される成熟ヒトベータ細胞であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変と、栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子とを含む、該成熟ヒトベータ細胞。
  88. 前記栄養要求性誘導遺伝子がUMPSであり、前記栄養要求性因子がウリジンであり、前記独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、前記1つまたは複数の導入遺伝子が、インスリンをコードするヌクレオチド配列またはインスリン依存的発現制御配列、およびNkx6.1をコードするヌクレオチド配列またはNkx6.1依存的発現制御配列をさらに含む、請求項87記載の成熟ヒトベータ細胞。
  89. 以下の工程を含む、ヒト心筋細胞の亜集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程であって、結果として、該前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる、該工程；
    (b)該複数の前駆細胞を、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、該第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたTBX5をコードするヌクレオチド配列またはTBX5依存的発現制御配列を含み、該第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結されたNKX2-5をコードするヌクレオチド配列またはNKX2-5依存的発現制御配列を含み、該第1および該第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、かつTBX5およびNKX2-5の一方または両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、該工程；
    (c)該複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
    (d)心筋細胞への該複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
    (e)ウリジンを除去することによってTBX5およびNKX2-5の一方または両方を発現する心筋細胞の亜集団を選択し、それによって、ヒト心筋細胞の亜集団を生成する工程。
  90. (a)TBX5とNKX2-5の両方を発現する細胞が、心室心筋細胞を含む亜集団に相当し；
    (b)TBX5を発現するがNKX2-5を発現しない細胞が、結節性心筋細胞を含む亜集団に相当し；
    (c)TBX5を発現しないがNKX2-5を発現する細胞が、心房の心筋細胞を含む亜集団に相当し；
    (d)TBX5もNKX2-5も発現しない細胞が内皮細胞に相当する、
    請求項89記載の方法。
  91. インビトロで分化した心筋細胞の集団より選択される心筋細胞であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変と、栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子とを含む、該心筋細胞。
  92. 前記栄養要求性誘導遺伝子がUMPSであり、前記栄養要求性因子がウリジンであり、前記独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、前記1つまたは複数の導入遺伝子が、TBX5をコードするヌクレオチド配列またはTBX5依存的発現制御配列、およびNKX2-5をコードするヌクレオチド配列またはNKX2-5依存的発現制御配列をさらに含む、請求項91記載の心筋細胞。
  93. 前記心筋細胞が、一次心臓領域系譜細胞、心室心筋細胞、心外膜系譜細胞、結節性心筋細胞、二次心臓領域系譜細胞、および心房の心筋細胞からなる群より選択される心筋細胞の亜集団に属する、請求項91または92記載の心筋細胞。
  94. インビトロ薬物試験の方法における、請求項91～93のいずれか一項記載の心筋細胞の使用。
  95. 以下の工程を含む、安定なT reg細胞の集団を生成する方法：
    (a)複数の前駆細胞を、ヒトUMPS遺伝子の一部を両アレル性に標的化するgRNAを含むCRISPR/Casシステムと接触させる工程であって、結果として、該前駆細胞がウリジンに対して栄養要求性になる、該工程；
    (b)該複数の前駆細胞を、第1の相同組換えコンストラクトおよび第2の相同組換えコンストラクトと接触させる工程であって、該第1の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第1の独立した機能ドメインに機能的に連結されたFOXP3をコードするヌクレオチド配列またはFOXP3依存的発現制御配列を含み、該第2の相同組換えコンストラクトが、UMPSの第2の独立した機能ドメインに機能的に連結された細胞ナイーブ（cell naivete）関連プロモーターをコードするヌクレオチド配列または細胞ナイーブ関連プロモーターの発現制御配列を含み、該第1および該第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、かつFOXP3と該細胞ナイーブ関連プロモーターに関連する遺伝子との両方を発現する前駆細胞でのみ発現する、該工程；
    (c)該複数の前駆細胞をウリジンと接触させる工程；
    (d)安定なT reg細胞への該複数の前駆細胞の分化を刺激する工程；ならびに
    (e)ウリジンを除去することによって、FOXP3と該細胞ナイーブ関連プロモーターに関連する遺伝子との両方を発現する安定なT reg細胞を選択し、それによって、安定なT reg細胞の集団を生成する工程。
  96. 前記細胞ナイーブ関連プロモーターがPTPRCまたはCCR7と関連するプロモーターである、請求項95記載の方法。
  97. 対象において疾患、障害または状態を軽減する方法であって、請求項95または96記載の方法によって作製された安定なT reg細胞を該対象に投与する工程を含み、該疾患、障害または状態が免疫疾患または癌を含む、該方法。
  98. 対象において疾患、障害、または状態を治療するための方法における、請求項95または96記載の方法によって作製された安定なT reg細胞の使用であって、該疾患、障害または状態が免疫疾患または癌を含む、該使用。
  99. T reg細胞集団より選択される安定なT reg細胞の集団であって、栄養要求性因子に対する栄養要求性をもたらす栄養要求性誘導遺伝子の両アレル遺伝子改変と、栄養要求性誘導遺伝子または該栄養要求性誘導遺伝子の1つもしくは複数の独立した機能ドメインを再発現する1つまたは複数の導入遺伝子とを含む、該安定なT reg細胞の集団。
  100. 前記栄養要求性誘導遺伝子がUMPSであり、前記栄養要求性因子がウリジンであり、前記独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択され、前記1つまたは複数の導入遺伝子が、FOXP3をコードするヌクレオチド配列またはFOXP3依存的発現制御配列、および細胞ナイーブ関連プロモーターをコードするヌクレオチド配列または細胞ナイーブ関連プロモーターと関連する遺伝子をさらに含み、任意で、該細胞ナイーブ関連プロモーターがPTPRCまたはCCR7と関連するプロモーターである、請求項99記載の安定なT reg細胞の集団。
  101. 以下の工程を含む、第1および第2の発現カセットが組み込まれた細胞の集団を生成する方法：
    (a)ウリジンに対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞をウリジンの存在下で培養する工程；
    (b)該複数の細胞を、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトと接触させる工程であって、
    該第1の発現コンストラクトが、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現カセット、およびUMPSの第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現カセットを含み、
    該第2の発現コンストラクトが、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現カセット、およびUMPSの第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の発現カセットを含む、
    該工程；ならびに
    (c)該複数の細胞からウリジンを取り除き、それによって、第1および第2の発現カセットが組み込まれた細胞の集団を生成する工程。
  102. 第1の発現コンストラクトが、特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトである、請求項101記載の方法。
  103. 第2の発現コンストラクトが、特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトである、請求項101または102記載の方法。
  104. 前記特定の遺伝子座がセーフハーバー座位である、請求項102または103記載の方法。
  105. 前記セーフハーバー座位がCCR5である、請求項104記載の方法。
  106. ウリジンに対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている前記複数の細胞がUMPSノックアウト細胞を含む、請求項101～105のいずれか一項記載の方法。
  107. 前記複数の細胞が前駆細胞に由来する、請求項101～106のいずれか一項記載の方法。
  108. 第1のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列が組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～107のいずれか一項記載の方法。
  109. 第2のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列が組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～107のいずれか一項記載の方法。
  110. 第1のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列および第2のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列がそれぞれ組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～109のいずれか一項記載の方法。
  111. UMPSの第1の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～110のいずれか一項記載の方法。
  112. UMPSの第2の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～110のいずれか一項記載の方法。
  113. UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列がそれぞれ構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項101～112のいずれか一項記載の方法。
  114. UMPSの第1および第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより独立に選択される、請求項101～113のいずれか一項記載の方法。
  115. 望ましい細胞型に前記細胞をインビトロで分化させる工程をさらに含む、請求項108～110のいずれか一項記載の方法。
  116. 前記組織特異的プロモーターが巨核球特異的プロモーターであり、前記望ましい細胞型が巨核球である、請求項115記載の方法。
  117. 前記望ましい細胞型に前記細胞を分化させることによって、第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードの発現が導かれる、請求項115または116記載の方法。
  118. 請求項101～116のいずれか一項記載の方法によって生成された、第1および第2の発現カセットを含む細胞の集団。
  119. 栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトならびに第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトを含む操作された細胞であって、該第1の発現コンストラクトおよび該第2の発現コンストラクトが該細胞のゲノム中に安定して組み込まれており、該第1の発現コンストラクトおよび該第2の発現コンストラクトが、それぞれ該栄養要求性誘導遺伝子の第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、該操作された細胞。
  120. 第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトが、相同組換えによって前記細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項119記載の操作された細胞。
  121. 以下の工程を含む、インビトロで巨核球を生成する方法：
    (a)栄養要求性因子の存在下で、該栄養要求性因子に対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の前駆細胞を培養する工程；
    (b)該細胞を巨核球に分化させる工程：および
    (c)該栄養要求性因子を取り除く工程。
  122. 前記複数の細胞が前駆細胞を含む、請求項121記載の方法。
  123. 前記複数の細胞がUMPSノックアウト細胞を含む、請求項121または122記載の方法。
  124. 前記栄養要求性因子がウリジンである、請求項121～123のいずれか一項記載の方法。
  125. 前記ウリジンを取り除くことによって、増殖性細胞が死ぬかまたは増殖しなくなる、請求項121～124のいずれか一項記載の方法。
  126. 前記巨核球が血小板を生成する、請求項121～125のいずれか一項記載の方法。
  127. 前記栄養要求性因子を取り除いた後に前記血小板が存続する、請求項121～126のいずれか一項記載の方法。
  128. 血小板の実質的に純粋な集団が生成される、請求項121～127のいずれか一項記載の方法。
  129. 請求項121～128のいずれか一項記載の方法によって生成された、血小板の実質的に純粋な集団。
  130. 栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞からインビトロで生成された、血小板の実質的に純粋な集団。
  131. 以下の工程を含む、操作された血小板の集団を生成する方法：
    (a)栄養要求性因子の存在下で、該栄養要求性因子に対して栄養要求性になるように遺伝子操作されている複数の細胞を培養する工程であって、該複数の細胞が栄養要求性誘導遺伝子のノックアウトを有する、該工程；
    (b)該複数の細胞を、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトと接触させる工程であって、
    該第1の発現コンストラクトが、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現カセット、および該栄養要求性誘導遺伝子の第1の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現カセットを含み、
    該第2の発現コンストラクトが、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第3の発現カセット、および該栄養要求性誘導遺伝子の第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む第4の発現カセットを含む、
    該工程；ならびに
    (c)該複数の細胞からウリジンを取り除く工程。
  132. 第1の発現、第2の発現コンストラクト、または第1および第2の発現コンストラクトが、特定の遺伝子座を標的とする相同組換えコンストラクトである、請求項131記載の方法。
  133. 前記特定の遺伝子座がセーフハーバー座位である、請求項132記載の方法。
  134. 前記セーフハーバー座位がCCR5である、請求項133記載の方法。
  135. 前記栄養要求性誘導遺伝子がUMPSであり、前記栄養要求性因子がウリジンである、請求項131～134のいずれか一項記載の方法。
  136. 第1および第2の独立した機能ドメインがOPRTおよびODCより選択される、請求項135記載の方法。
  137. 前記複数の細胞が前駆細胞に由来する、請求項131～136のいずれか一項記載の方法。
  138. 第1のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列が組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～137のいずれか一項記載の方法。
  139. 第2のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列が組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～137のいずれか一項記載の方法。
  140. 第1のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列および第2のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列がそれぞれ組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～139のいずれか一項記載の方法。
  141. 第1の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～140のいずれか一項記載の方法。
  142. 第2の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～140のいずれか一項記載の方法。
  143. 第1および第2の独立した機能ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列がそれぞれ構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項131～142のいずれか一項記載の方法。
  144. 望ましい細胞型に前記細胞をインビトロで分化させる工程をさらに含む、請求項131～143のいずれか一項記載の方法。
  145. 前記組織特異的プロモーターが巨核球特異的プロモーターであり、前記望ましい細胞型が巨核球である、請求項144記載の方法。
  146. 前記望ましい細胞型に前記細胞を分化させることによって、第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードの発現が導かれる、請求項144または145のいずれか一項記載の方法。
  147. 前記巨核球が血小板を産生する、請求項145または146記載の方法。
  148. 前記血小板に第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードがロードされる、請求項147記載の方法。
  149. インビトロで前記細胞を分化させることが前記栄養要求性因子の存在下である、請求項144～148のいずれか一項記載の方法。
  150. 前記分化した血小板が第1および第2の独立した機能ドメインを発現しない、請求項147のいずれか一項記載の方法。
  151. 5-FOAの添加をさらに含む、請求項150記載の方法。
  152. 前記細胞を分化させた後に前記栄養要求性因子を取り除く工程であって、前記栄養要求性因子を取り除いた際に、残存する有核増殖性細胞が死ぬかまたは増殖しない、該工程
    をさらに含む、請求項144～151のいずれか一項記載の方法。
  153. UMPSのノックアウト、第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトを含む操作された細胞であって、該第1の発現コンストラクトおよび該第2の発現コンストラクトが該細胞のゲノム中に安定して組み込まれており、該第1の発現コンストラクトおよび該第2の発現コンストラクトが、それぞれOPRTおよびODCより選択されるUMPSの第1および第2の独立した機能ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、該操作された細胞。
  154. 第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトが、相同組換えによって前記細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項153記載の操作された細胞。
  155. 第1の発現コンストラクトおよび第2の発現コンストラクトが、それぞれ特定の遺伝子座を標的とする相同性アームを含む、請求項154記載の操作された細胞。
  156. 前記特定の遺伝子座がセーフハーバー座位である、請求項155記載の操作された細胞。
  157. 前記セーフハーバー座位がCCR5であり、前記相同性アームがCCR5座位にターゲティングされている、請求項156記載の操作された細胞。
  158. 第1の発現コンストラクトが、第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列をさらに含む発現カセットを含む、請求項153～157のいずれか一項記載の操作された細胞。
  159. 第2の発現コンストラクトが、第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列をさらに含む発現カセットを含む、請求項153～158のいずれか一項記載の操作された細胞。
  160. 第1のペイロードをコードする前記ヌクレオチド配列が、アンチセンスRNA、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物、抗miR、合成mRNA、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項158または159記載の操作された細胞。
  161. 第1のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現コンストラクト、および第2のペイロードをコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現コンストラクトを含む、請求項160記載の操作された細胞。
  162. 前記操作された細胞が前駆細胞に由来するかまたは前駆細胞から分化する、請求項153～161のいずれか一項記載の操作された細胞。
  163. 前記操作された細胞がインビトロで培養された前駆細胞に由来するかまたはインビトロで培養された前駆細胞から分化する、請求項161記載の操作された細胞。
  164. 操作された血小板を生成する方法で使用するための、請求項153～163のいずれか一項記載の操作された細胞。
  165. 操作された血小板を生成する方法で使用するための、請求項160～163のいずれか一項記載の操作された細胞。
  166. 前記操作された血小板に第1のペイロード、第2のペイロード、または第1および第2のペイロードがロードされる、請求項165記載の操作された細胞。
  167. UMPSノックアウト細胞となるように操作された細胞からインビトロで調製された、血小板の実質的に純粋な集団。
  168. 血小板の前記集団に有核または増殖性細胞がないかまたは実質的にない、請求項167記載の血小板の実質的に純粋な集団。
  169. 前記血小板を対象に投与する工程を含む該対象を治療する方法で使用するための、請求項167または168記載の血小板の実質的に純粋な集団。
  170. 治療的ペイロードをそれを必要とする対象に送達する方法で使用するための、請求項167～169のいずれか一項記載の血小板の実質的に純粋な集団。
JP2021565891A 2019-05-08 2020-05-08 栄養要求性選択方法 Pending JP2022532535A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962844930P 2019-05-08 2019-05-08
US62/844,930 2019-05-08
US201962904725P 2019-09-24 2019-09-24
US62/904,725 2019-09-24
PCT/US2020/032114 WO2020227637A1 (en) 2019-05-08 2020-05-08 Auxotrophic selection methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022532535A true JP2022532535A (ja) 2022-07-15

Family

ID=73050556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021565891A Pending JP2022532535A (ja) 2019-05-08 2020-05-08 栄養要求性選択方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220325301A1 (ja)
EP (1) EP3966339A4 (ja)
JP (1) JP2022532535A (ja)
KR (1) KR20220018495A (ja)
CN (1) CN114026243A (ja)
AU (1) AU2020267598A1 (ja)
BR (1) BR112021022110A2 (ja)
CA (1) CA3138030A1 (ja)
IL (1) IL287886A (ja)
MA (1) MA55912A (ja)
MX (1) MX2021013522A (ja)
SG (1) SG11202111965YA (ja)
WO (1) WO2020227637A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240093206A1 (en) * 2021-03-15 2024-03-21 490 BioTech, Inc. System of stable gene expression in cell lines and methods of making and using the same
CN113215168B (zh) * 2021-04-29 2023-04-28 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种卵巢癌细胞耐药的标志物及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030224411A1 (en) * 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
US9181529B2 (en) * 2010-10-19 2015-11-10 Cellular Dynamics International, Inc. Titration of differentiation medium components
MY171958A (en) * 2013-03-15 2019-11-08 Amyris Inc Use of phosphoketolase and phosphotransacetylase for production of acetyl-coenzyme a derived compounds
EP3080256B1 (en) * 2013-12-13 2018-06-13 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
WO2017053729A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
GB201618414D0 (en) * 2016-11-01 2016-12-14 Patterson James Regulated cell lines and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA3138030A1 (en) 2020-11-12
MX2021013522A (es) 2021-12-10
AU2020267598A1 (en) 2021-12-16
CN114026243A (zh) 2022-02-08
BR112021022110A2 (pt) 2022-01-04
EP3966339A4 (en) 2023-01-25
US20220325301A1 (en) 2022-10-13
KR20220018495A (ko) 2022-02-15
EP3966339A1 (en) 2022-03-16
IL287886A (en) 2022-01-01
MA55912A (fr) 2022-03-16
SG11202111965YA (en) 2021-11-29
WO2020227637A1 (en) 2020-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190309274A1 (en) Il-10 receptor alpha homing endonuclease variants, compositions, and methods of use
CN110785489A (zh) 使用CRISPR/Cpf1在T细胞中进行基因编辑的组合物和方法
JP2020509780A (ja) 細胞並びにその使用方法及び製造方法
JP2021511803A (ja) ヒト心筋細胞におけるジストロフィン変異を修正するための組成物および方法
JP2021500889A (ja) 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2019534050A (ja) 調節可能な細胞系およびそれらの使用方法
JP2022532535A (ja) 栄養要求性選択方法
US11045498B2 (en) Nonviral minicircle vector carrying SOX gene and construction method therefor
JP2019536484A (ja) ムコ多糖症ｉ型のための遺伝子治療
US20210052741A1 (en) Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
CN118056014A (zh) 单碱基编辑修复hba2基因突变的方法及其应用
US20220213488A1 (en) Correction of the two most prevalent ush2a mutations by genome editing
JP2022531930A (ja) 栄養要求性調節可能な細胞を使用する方法および組成物
US20240150718A1 (en) Method for gene repair in primary human muscle stem cells (satellite cells) in vitro and genetically repaired human muscle stem cell
WO2024059618A2 (en) Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
TW202408595A (zh) 用於對細胞進行遺傳修飾之方法及組合物
WO2020210218A1 (en) Methods for treating inherited eye defects
CN113544279A (zh) 包含芳基硫酸酯酶a的重组载体及其在用于治疗异染性脑白质营养不良的干细胞治疗中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221104