CN118056014A - 单碱基编辑修复hba2基因突变的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法及其应用，属于基因编辑技术领域。此方法包括以下步骤：将单碱基编辑器和gRNA与待编辑修复的HBA基因序列接触，使HBA基因序列中的CD142处的密码子靶胞嘧啶碱基脱氨基，转换为胸腺嘧啶。该方法能够对致病突变位点进行精准编辑，不产生双链断裂，不影响染色质构象和基因组稳定；也不在基因组中产生大片段基因的随机插入，对癌基因激活或肿瘤抑制基因失活具有低影响；还不会在基因组其它位点产生随机的插入/缺失；且修复的目的基因表达受天然的HBA2全部调控元件调控，具有较高的安全，也更能平衡α/β珠蛋白的表达。
Description
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法及其应用。
地中海贫血症是一种遗传性溶血性的贫血，在我国长江以南广泛分布，其中广西地区最为严重。根据基因分型，临床上主要出现α地中海贫血、β地中海贫血。引发α地中海贫血的突变分缺失型和非缺失型。非缺失型α地贫是由于α基因核苷酸的“点突变”导致。广东、广西及四川等地的α地贫中，非缺失型占35％～60％。我国较常见的非缺失型α-地贫有3种：Hb-CS(CD142)、Hb-QS(CD125)和Hb-WS(CD122)。其中Hb-CS型患者病情相对最严重，血红蛋白低，生存率不高。
血红蛋白CS(Hb-CS,Haemoglobin-Constant Spring，α142,Term→Gln,TAA>CAA(α2),αcsα/)是一种非缺失形式的α-地中海贫血(α-Thal)，在α2-珠蛋白基因(HBA2)终止密码子CD142处有一个核苷酸取代(UAA>CAA)。Hb-CS若同时复合α2α1双缺失型地贫突变(如αSEA,αMED,αTHAI)，仅剩余一个正常的α1-珠蛋白基因(HBA1)时，基因型为αCSα/--，其临床表现、血象与血红蛋白H病(HbH)相似，称为CS型HbH病(HbH-CS)。此外，受HbH-CS疾病影响的个体通常贫血症状更为严重，并且容易出现明显的肝脾肿大，尤其是与涉及α-珠蛋白基因(--/-α)的三基因缺失的个体相比，HbH-CS型患者输血的需求更大。
造血干细胞(HSC，hematopoietic stem cell)移植是治愈严重地中海贫血的有效手段和唯一途径，而缺乏HLA匹配的健康供体、免疫并发症和病毒载体安全问题限制了其使用。
常规技术中，也有一些针对α地贫的基因治疗方法，如过表达α珠蛋白、ζ珠蛋白等基因，但此类方法存在显著的安全问题，例如过表达的珠蛋白基因拷贝随机整合到基因组数千个不同的位点，导致插入突变和恶性肿瘤的可能性。另外，这些技术均未在患者细胞或者动物实验或者临床试验中证实有效且安全。
也可通过核酸酶切割靶位点，以及同源介导的基因修复方式对Hb-CS位点进行修复，然而该方式效率目前偏低，不足以达到治疗的水平。同时切割的方法会产生indels，导致产生非自然状态的α珠蛋白突变形式，同样存在安全隐患。此外，切割的方法可能存在一定脱靶风险，比如在其它基因座产生随机插入/缺失，或者基因组双链断裂容易引发染色质构象的改变，影响基因组稳定性。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，采用
该方法，能够对致病突变位点进行精准编辑，不产生双链断裂，不影响染色质构象和基因组稳定；也不在基因组中产生大片段基因的随机插入，对癌基因激活或肿瘤抑制基因失活具有低影响；还不会在基因组其它位点产生随机的插入/缺失；同时，修复的目的基因表达受天然的HBA2全部调控元件调控，具有较高的安全，也更能平衡α/β珠蛋白的表达。
本发明公开了一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，包括以下步骤：将单碱基编辑器和gRNA与待编辑修复的HBA2基因序列接触，使突变的HBA2基因CD142处的密码子(CAA)中的靶胞嘧啶碱基脱氨基，转换为胸腺嘧啶(TAA)。
上述单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，利用单碱基编辑器可在不导致DNA双链断裂的情况下，实现精确修改基因组中的单个碱基的特点，将单碱基编辑器和gRNA与发生致病突变的HBA2基因接触，使HBA2基因中的靶胞嘧啶(C)碱基脱氨基，从而导致所述编码α珠蛋白的多核苷酸靶位点中胞嘧啶(C)转换为胸腺嘧啶(T)，提供了一种更高效、更安全的修复Hb-CS突变的方法。
可以理解的，上述单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，也即是一种编辑编码α珠蛋白的多核苷酸的方法，包括使编码α珠蛋白的HBA2多核苷酸序列接触融合蛋白与引导核苷酸序列(如gRNA等)，其中，融合蛋白包括：与引导核苷酸序列结合的可编程DNA结合蛋白域和胞嘧啶脱氨酶域；引导核苷酸序列，为将所述融合蛋白靶向到所述编码HBA2的多核苷酸中的靶胞嘧啶(C)碱基；随后所述接触导致所述融合蛋白对所述靶C碱基脱氨基，从而导致所述编码HBA的多核苷酸中胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)变化。
在一些实施例中，所述单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法用于非治疗目的，如科学研究等。
本发明还公开了上述的单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法在制备用于治疗α地中海贫血症的药物中的应用。
本发明还公开了一种修复HBA2基因突变的组合物，包括：单碱基编辑器和gRNA，
所述单碱基编辑器包含靶核酸结合结构单元和脱氨酶结构单元，所述脱氨酶结构单元包含胞嘧啶脱氨酶活性域；
所述gRNA包括导向序列和与所述单碱基编辑器结合的骨架序列，所述导向序列靶向突变的HBA2基因的CD142密码子(CAA)中的胞嘧啶碱基。
可以理解的，上述“靶向”指gRNA将单碱基编辑器引导至突变的HBA2基因的CD142密码子胞嘧啶附近，以对该胞嘧啶进行编辑。通常而言，该导向序列与突变的HBA2基因的CD142密码子胞嘧啶碱基的反义链结合。
上述单碱基编辑器中的靶核酸结合结构单元即能够准确定位结合至靶核酸编辑区域的结构，可以是核苷酸，也可以是蛋白多肽等。可以理解的，在一些实施例中，有机连接指的是所述靶核酸结合结构单元、脱氨酶结构单元或其部分活性结构域通过肽键或连接肽连接，进而形成融合蛋白。并且可以包括一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI域、一个或多个NLS，一个或多个Gam蛋白等，以提高碱基修复效率，仅需其具备使胞嘧啶(C)碱基脱氨基转换为胸腺嘧啶(T)的功能即可。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器中包含的脱氨酶结构单元可以是脱氨酶蛋白或其活性结构域，也可以是可募集脱氨酶蛋白的多肽，还可以是可募集脱氨酶蛋白的核苷酸结合基序，所述核苷酸结合基序可连接在gRNA上等。
以下列举部分可实现上述脱氨基功能的胞嘧啶脱氨酶，包括但不限于：APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、激活诱导的脱氨酶(AID)和pmCDA1及其变体或其组合。也包括胞嘧啶脱氨酶变体，例如可以是Anc689 APOBEC、YE1 APOBEC等。
对于组合物中的gRNA，其可以是单分子gRNA、双分子gRNA或多分子gRNA。gRNA可替换为其它包含可与靶位点互补配对结合的导向序列、与单碱基编辑器连接或结合的骨架序列的RNA分子。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元包括可编程核酸结合蛋白，即是指可以经编程以靶向基因组内的任何所期望的核苷酸序列的核酸结合蛋白。为了编程核酸结合蛋白以结合所期望的核苷酸序列，核酸结合蛋白可以进行修饰以改变其结合特异性，例如锌指DNA结合域、锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应物蛋白(TALE)等。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元选自：CRISPR/Cas核酸酶、ZFN、TALEN、Argonaute(AGO蛋白)。
上述Argonaute指AGO蛋白，AGO蛋白可结合siRNA，并通过siRNA与mRNA的结合，从而切割目标核苷酸，具有本发明“可编程核酸结合蛋白”特性。
可以理解的，上述靶核酸结合结构单元中CRISPR/Cas核酸酶优选是催化活性部分失活或全部失活的蛋白，仅利用其定位功能即可。
在一些实施例中，所述引导核苷酸序列-可编程核酸结合蛋白可以是DNA结合蛋白，也可以是RNA结合蛋白。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、cas12b2、cas12h、cas12i、cas12g、C2c2、C2c3、C2c4、C2c5、C2c6、C2c7、c2c8、c2c9、c2c10、cas14a、cas14b、cas14c、Cas13d及其变体中的至少一种。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、cas12b2、cas12h、cas12i、cas12g、C2c3、C2c4、C2c5、c2c8、c2c9、c2c10、cas14a、cas14b、cas14c、及其变体中的至少一种。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶具有切口酶活性。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶为具有切口酶活性的Cas9变体。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元选自：核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域、核酸酶无活性的Cpf1域、核酸酶无活性的Argonaute域，或核酸酶部分活性缺失的Cas9(nCas9)域，或其变体，或组合等。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：Cas9切口酶变体(nCas9)。
可以理解的，所述可编程核酸结合蛋白可以有最优PAM(识别位点的毗邻基，protospacer
adjacent motif，PAM)位点，也可以无最优PAM位点或无PAM位点限制。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元没有PAM位点限制。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元具有最优PAM位点。例如，最优PAM位点为NGG、NG、NNNNCC、NAA、NAAN、NGGNG、NNNNGATT、NNNNCNDD、NNNNCAAA、NNNNCRAA、NNAGAAW、NNGRRN、TTN、TTTV/TTTN、ATTN或TTCN(N表示A/T/C/G，R表示A/G，W表示A/T，V表示A/C/G)等。
在一些实施例中，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：SpRY变体、NG-nCas9变体、NGG-nCas9变体中的至少一种。上述SpRY变体即为无PAM位点限制的SpRY核酸酶变体、NG-nCas9变体为最优PAM为NG的nCas9、NGG-nCas9为最优PAM为NGG的nCas9。
在一些实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶域包含载脂蛋白B mRNA-编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。
在一些实施例中，所述脱氨酶结构单元选自：APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、激活诱导的脱氨酶(AID)和pmCDA1及其变体或组合。
在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元与所述脱氨酶结构单元有机连接。上述单碱基编辑器中的靶核酸结合结构单元即能够准确定位结合至靶核酸编辑区域的结构，可以是核苷酸，也可以是蛋白多肽等。
可以理解的，在一些实施例中，所述靶核酸结合结构单元、脱氨酶结构单元或其部分活性结构域通过肽键或连接肽有机连接，形成融合蛋白。并且可以包括一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI域、一个或多个NLS，一个或多个Gam蛋白等，以提高碱基修复效率，仅需其具备使胞嘧啶(C)碱基脱氨基转换为胸腺嘧啶(T)的功能即可。
在一些实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶变体为Anc689 APOBEC变体。
在一些实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶变体为W90Y/R126E APOBEC变体。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器选自：SpRY-CBE、AncBE、YE1-CBE中的至少一种。
上述单碱基编辑器为靶核酸结合结构单元和脱氨酶结构单元的部分活性结构域通过肽键或连接肽有机连接而形成的融合蛋白。
上述SpRY-CBE为无最优PAM位点限制的SpRY核酸酶与胞苷脱氨酶连接(SpRY-CBE)，优选SpRY核酸酶-胞苷脱氨酶与2个UGI连接，优选SpRY核酸酶-胞苷脱氨酶-2×UGI与2个或2个以上的NLS连接，优选为CBE4max-SpRY碱基编辑器。
上述AncBE的胞苷脱氨酶为Anc689 APOBEC变体，优选靶核酸结合结构单元蛋白为活性受损的nCas9核酸酶，优选nCas9-Anc689 APOBEC与2个UGI连接，或nCas9-Anc689 APOBEC-2×UGI与2个或2个以上的NLS连接，更优选为AncBE4max碱基编辑器。
上述YE1-CBE为APOBEC包含W90Y+R126E突变的YE1 APOBEC，优选可编程核酸结合蛋白与YE1 APOBEC连接，优选可编程核酸结合蛋白-YE1 APOBEC-2×UGI与2个或2
个以上的NLS连接，优选为YE1-BE4max碱基编辑器。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173548-173648靶区域结合或反向互补。可以理解的，上述区域即gRNA欲将单碱基编辑器引导至的突变的HBA2基因CD142密码子胞嘧啶所在区域，而由于生物体的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，上述区域可能存在一些天然突变，而gRNA的导向序列可以根据天然突变进行调整设计，或容许存在1-5个碱基错配，能够与上述区域结合，即可实现本发明目的。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173589-173613、Chr16:173588-173612、Chr16:173586-173610、Chr16:173590-173614、Chr16:173587-173611、Chr16:173590-173609、Chr16:173596-173615靶区域结合或反向互补。
在一些实施例中，所述gRNA导向序列3’端碱基与靶区域反义链5’端碱基结合。将gRNA导向序列3’端碱基与基因组区域反义链5’端碱基结合，即限定了Hb-CS突变定位，即限定了Hb-CS突变碱基对与gRNA的3’端或PAM位点的距离。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173599-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613、Chr16:173593-173612、Chr16:173598-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612、Chr16:173591-173610、Chr16:173596-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16:173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610、Chr16:173595-173614、Chr16:173600-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614、Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611、Chr16:173590-173609、Chr16:173594-173609、Chr16:173596-173615、Chr16:173600-173615反向互补或存在1-5个错配。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613、Chr16:173593-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612、Chr16:173591-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16:173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610、
Chr16:173595-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614、Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611反向互补或存在1-5个错配。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613反向互补或存在1-5个错配；
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173593-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612反向互补或存在1-5个错配；
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173591-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16:173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610反向互补或存在1-5个错配；
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173595-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614反向互补或存在1-5个错配；
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列与Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611反向互补或存在1-5个错配。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C12-C18。
上述导向序列的3’端距胞嘧啶的距离也即Hb-CS突变位点距离PAM的距离，本发明通过研究发现，C12-C18的gRNA均可修复Hb-CS突变。
“Hb-CS突变定位”指Hb-CS突变位点在单碱基编辑器-gRNA中的定位，即gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离，具体的，在一些实施例中，使用Hb-CS突变碱基在gRNA导向序列中的位置表示，即自导向序列3’端起第x个核苷酸，或距离PAM位点起第x个核苷酸(有PAM位点的情况)，缩写表示为Cx。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C18。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C17。本发明通过研究证实，虽然C12-C18的gRNA均可修复Hb-CS突变，但C13-C17的gRNA相对于C12、C18的gRNA具有更优的效果。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为SpRY-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C17。
以单碱基编辑器SpRY-CBE配合上述gRNA，具有更好的编辑效率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为SpRY-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C14-C17。
以单碱基编辑器SpRY-CBE配合上述gRNA，具有更好的编辑效率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为SpRY-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C15-C17。
以单碱基编辑器SpRY-CBE配合上述gRNA，具有更低的非目的编辑概率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为AncBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C17。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为AncBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C16。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为AncBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13或C16。
以单碱基编辑器AncBE配合上述gRNA，具有更好的编辑效率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为AncBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C16。
以单碱基编辑器AncBE配合上述gRNA，具有更低的非目的编辑概率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C17。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C14-C17。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C14-C16。
以单碱基编辑器YE1-CBE配合上述gRNA，具有更好的编辑效率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C15-C16。以单碱基编辑器YE1-CBE配合上述gRNA，具有更低的非目的编辑概率。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的长度≥16bp。
综合gRNA结构和上述导向序列匹配靶核酸区域设计而言，gRNA的导向序列的长度应至少为16bp，才能够精准定位进行单碱基修复。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的长度为16-25bp。
在一些实施例中，所述gRNA的导向序列的长度为17-25bp。将gRNA的导向序列的长度设为上述范围，具有较好的编辑修复效果。
在一些实施例中，所述编码gRNA导向序列的靶DNA核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.62所示的基础序列、与所述基础序列存在1-5个碱基错配的错配序列。
在一些实施例中，所述错配序列的错配位点数量低于5个核苷酸，如所述gRNA导向序列可以包含1、2、3、4、5个核苷酸的错配。
在一些实施例中，所述错配序列的错配位点数量低于3个核苷酸，即允许1-3个碱基错配。本发明通过实验证实，错配1-3个核苷酸的gRNA仍然具有Hb-CS突变修复效率。
所述错配位点优选不在Hb-CS位点，优选位于gRNA导向序列前段(近5’端)或中段，进一步优选错配距离导向序列3’末端或PAM位点至少8个核苷酸，更优选至少10个核苷酸。
在一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.58所示序列。采用上述gRNA，具有更高的编辑修复效率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为SpRY-CBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.58所示序列。采用上述gRNA和单碱基编辑器配合，具有更低的非目的编辑率。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为AncBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.36所示序列。
在一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.36所示序列。
在一些实施例中，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.48-SEQ ID NO.58所示序列。采用上述gRNA和单碱基编辑器配合，具有更低的非目的编辑概率。
在一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.58所示序列。
本发明还公开了一种用于单碱基编辑修复HBA2基因突变的gRNA，包含上述的gRNA。
本发明还公开了一种细胞，包含上述的修复HBA2基因突变的组合物。
在一些实施例中，所述细胞为细胞系和/或原代细胞。
在一些实施例中，所述细胞为造血干/祖细胞、诱导多能干细胞、红系祖细胞等具有诱导分化或转分化或重编程为成熟红细胞潜能的细胞。
在一些实施例中，可将含有Hb-CS突变的体细胞重编程为iPSC细胞，导入修复Hb-CS突变的gRNA和单碱基编辑器递后，修复Hb-CS突变，并诱导分化为造血干/祖细胞或红系祖细胞。
本发明还公开了一种修复HBA2基因突变的试剂，包括：
1)上述的单碱基编辑器蛋白或蛋白组合物，或编码所述单碱基编辑器的核苷酸序列；
以及
2)上述的gRNA，或编码所述gRNA的核苷酸序列，或包含编码所述gRNA的核苷酸序列的核苷酸组合物。
可以理解的，上述单碱基编辑器蛋白即指具有单碱基编辑功能的活性蛋白，蛋白组合物指具有单碱基编辑功能的蛋白组合物，如具有靶核酸结合结构单元的活性蛋白与具有脱氨酶结构单元活性的活性蛋白构成的蛋白组合物；上述核苷酸组合物，可以为包括DNA和RNA的混合体。
上述修复HBA2基因突变的试剂、单碱基编辑器和/或其gRNA，可通过质粒载体、病毒载体、核糖核蛋白复合体、类病毒载体等形式在体外、离体或体内递送至宿主细胞，通过修复HBA2基因使其正常发挥功能作用，起到治疗作用。
本发明还公开了一种修复HBA2基因突变的递送系统，用于递送上述的试剂。
可以理解的，对于递送系统，采用本领域的常规递送系统，如脂质体递送、脂质纳米颗粒递送、外囊泡EV、病毒颗粒或电穿孔等，将上述试剂递送至细胞内即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，采用单碱基编辑的方式，与常规基因编辑相比，不产生双链断裂，不影响染色质构象和基因组稳定；也不在基因组中产生大片段基因的随机插入，对癌基因激活或肿瘤抑制基因失活具有低影响；同时还不会在基因组其它位点产生随机的插入/缺失，造成不可预知的风险；且修复的目的基因表达受天然的HBA2全部调控元件调控，安全且更能平衡α/β珠蛋白，治疗效果更佳。
并且，本发明进一步筛选得到的gRNA具有较高的修复效率，特别是Hb-CS突变位点在C13-C17的gRNA，还具有非目的编辑概率低和安全性高的优势。更进一步的，本发明筛选得到了受PAM位点限制较小的gRNA，特别是Hb-CS突变位点在C16的gRNA，几乎不受PAM位点的限制。
图1为实施例1中pLenti6-GFP-HbCS报告载体结构示意图；
图2为实施例4中Hb-CS位点碱基编辑结果测序和效率分析图；
图3为实施例5中Hb-CS突变定位C16的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率示意图；
图4为实施例5中Hb-CS突变定位C15的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率示意图；
图5为实施例5中Hb-CS突变定位C17的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率示意图；
图6为实施例6中AncBE单碱基编辑器修复Hb-CS位点突变结果测序和效率分析图；
图7为实施例7中YE1-CBE单碱基编辑器修复Hb-CS突变结果测序和效率分析图；
图8为实施例8中gRNA导向序列错配示意图，其中：阴影碱基表示错配碱基，下划线碱基表示Hb-CS突变位点。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义：
变体：是一组高度相似的蛋白质成员，这些成员同源于单个蛋白或蛋白家族，具有相同或相似的生物学作用。本发明CRISPR/Cas核酸酶的变体表示CRISPR/Cas同源蛋白，是具有经编程以靶向基因组内的任何所期望的核苷酸序列的核酸结合蛋白。本发明脱氨酶变体表示脱氨酶同源蛋白，具有碱基脱氨基功能。例如，包含CRISPR/Cas核酸酶或其片段的蛋白质可称为“CRISPR/Cas核酸酶变体”，如Cas9变体。CRISPR/Cas核酸酶变体与CRISPR/Cas核酸酶或其片段共享同源性。例如，CRISPR/Cas核酸酶变体与野生型CRISPR/Cas核酸酶至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶变体与野生型CRISPR/Cas核酸酶相比，可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸变化，但其依然具有与可编程核苷酸如gRNA等结合并靶向核酸靶点的功能。
化学合成修饰的gRNA：指可采用本领域技术人员熟知的化学修饰方法进行修饰，如在一些实施例中，以2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰、2’-氟(2'-F)修饰。在一些实施例中，所述gRNA核苷酸之间的修饰方式包含硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施例中，5’末端处的前三个核苷酸，及3’末端处的最后三个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，5’末端处的前四个核苷酸，及3’末端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施例中，所述gRNA也可使用修饰的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其他合成碱基和合成骨架连接(诸如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)等)。在一些实施例中，构成引导核苷酸序列的核酸包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基
(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺连接)。
以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
实施例1
Hb-CS突变-GFP报告基因载体和细胞的构建。
1、设计和构建GFP-HbCS报告载体
选取含有Hb-CS突变的HBA2基因片段(SEQ ID NO.63)：
上述序列片段中，大写粗体下划线C表示Hb-CS，Hb Constant Spring突变，即HBA2:c.427T>C。取代GFP的终止密码子TAA，因此GFP缺失终止密码子，无法发出绿色荧光。
合成目的基因片段：设计以下基因片段：CMV启动子+GFP基因(去除终止密码子TAA)+HBA2基因片段(Hb-CS突变)，并将目的片段插入慢病毒骨架载体后，构建出含有pCMV-GFP-HBA2(HbCS)的慢病毒载体，并测序验证，阳性克隆用于慢病毒包装。
具体的，本实施例使用的pLenti6/V5-GW/lacZ载体(Invitrogen，货号V49610试剂盒)作为慢病毒骨架载体，目的基因片段反向插入并取代原骨架载体的CMV启动子和lacZ基因片段，该pLenti6-GFP-HbCS报告载体结构如图1所示，即载体结构包含慢病毒骨架，抗生素模块包含启动子PSV40-Blasticidin(杀稻瘟菌素)，目的基因模块包含启动子pCMV-GFP(无终止密码子)-HBA2片段(Hb-CS突变)。
2、包装和浓缩慢病毒
复苏、扩增培养293T细胞至指数增长期，然后用Lipofectamine2000将慢病毒质粒和辅助质粒转染293T细胞，48～72h后回收细胞并浓缩病毒。接种293T细胞，增殖至80-90％汇合度后，以备用于慢病毒包装。
转染前一小时，更换新鲜的完全培养基。以转染T25为例说明配置转染复合物的具体步骤：
①500μl OPTI-MEM中加入质粒混匀，质粒剂量分别为pCMV-VSV-G(来源：ADDGENE#8454)：pMDLg(来源：ADDGENE#12251)：pRSV-Rev(来源：ADDGENE#12253)：pLenti6-GFP-HbCS＝2μg：4μg：3μg：5～6μg；
②500μl OPTI-MEM中加入质粒量3倍的Lipo2000混匀；
将①和②室温放置5分钟后，混匀再放置20分钟即成。
将转染复合物均匀加到细胞培养瓶里，继续培养4～6小时。更换新鲜的完全培养基，继
续培养48～72小时。收集培养上清，1500g离心10分钟，再次收集上清。过0.45μM PVDF针头过滤器。加入1/5体积的50％PEG 6000，混合均匀后，4℃放置过夜。可见少量沉淀，1500g离心10分钟使其聚集在管底，去上清，加入不含血清的DMEM重悬到合适的体积，即为浓缩的GFP-HbCS慢病毒。
3、构建GFP-HbCS报告细胞模型
接种待转染宿主细胞(可选如293T细胞、K562细胞、人HUDEP2细胞、人体造血干细胞、红系祖/前体细胞等)至6孔板，每孔添加5μl～10μl浓缩的GFP-HbCS慢病毒，添加Blasticidin抗生素(浓度10-40ug/mL)培养48～72小时，PCR鉴定阳性片段是否插入。
将有阳性克隆细胞分装到96孔细胞培养板，筛选出阳性单克隆细胞系，并保种作为GFP-HbCS报告细胞模型备用。
实施例2
gRNA的设计和合成。
为了实现编辑修复目的碱基，本发明中以gRNA(guide RNA)实现引导定位作用，gRNA中的导向序列结合于靶核酸区域，并以gRNA中的骨架序列部分与单碱基编辑器的靶核酸结合结构单元相结合，从而引导单碱基编辑器对目的碱基进行编辑修复。本实施例中对gRNA进行设计和合成。
1、gRNA的筛选
gRNA序列包含与待编辑的Hb-CS突变位点的上游和下游50个核苷酸内区域Chr16:173548-173648或核酸序列(ccgttgggaggcccagcgggcaggaggaacggctaccgaggctccagcttAacggtatttggaggtcagcacggtgctcacagaagccaggaacttgtcca)(SEQ ID NO.64)结合或反向互补的导向序列，以及与单碱基编辑器结合的骨架序列。
本发明依据单碱基编辑器的编辑窗口要求，如距离PAM或导向序列3’端12-18个核苷酸等，以及gRNA导向序列长度至少16bp等原则综合考虑，设计gRNA导向序列。
同时，由于HBA2基因与HBA1基因的同源性较高，因此，在导向序列设计的过程中，应该优选HBA2特异性的靶位点或者覆盖Hb-CS突变的靶序列。
结合以上进行序列分析和筛选，本发明筛选获得了62个gRNA导向序列(如表1)
表1.gRNA导向序列、gRNA结合位点/靶序列、Hb-CS突变定位列表
以上“Hb-CS突变定位”指Hb-CS突变位点在单碱基编辑器-gRNA中的定位，即gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离，具体的，本实施例中使用Hb-CS突变碱基在gRNA导向序列中的位置表示，即自导向序列3’端起第x个核苷酸，或距离PAM位点起第x个核苷酸(有PAM位点的情况)，缩写表示为Cx。
可以理解的，gRNA可以选自双分子指导RNA(dgRNA，也即crRNA及trRNA)、单分子指导RNA(sgRNA)或多分子引导RNA等形式。
本实施例使用的是单分子gRNA，gRNA包含结构：5’-[导向序列]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu[gRNA骨架序列](SEQ ID NO.65)-3’。如该gRNA的导向序列对应上述编号1的靶序列，则完整gRNA序列为ccgucaagcuggagccucggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(SEQ ID NO.66)。
2、gRNA合成
2.1gRNA质粒的构建
通过常规方法合成得到上表1gRNA导向序列对应的DNA序列正义链和反义链，正义链的5’-端加caccg，在反义链的5’-端加aaac，反义链的3’-端加C。
将上述gRNA导向序列对应的DNA序列正义链(Oligo-F)和反义链(Oligo-R)分别取2μl混合，加入2μl NEB 10x cuttersmart缓冲液，14μl H2O在PCR仪内95℃孵育5分钟，立刻取出并在冰上孵育5分钟，退火形成含粘性末端的双链导向序列DNA。
通过T4连接酶将含粘性末端的双链导向序列DNA与含有gRNA骨架序列的质粒载体(如PUC19-U6启动子-BpiI-BpiI-gRNA骨架，PUC19-U6背景质粒来源于ADDGENE#121958，gRNA骨架序列为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc)(SEQ ID NO.67)的BpiI酶切产物(线性化载体)连接在一起，将连接产物转化，挑选单克隆菌落进行PCR检验和sanger测序验证，筛选获得阳性克隆即gRNA质粒。
2.2gRNA的合成和化学修饰
依据上表1的gRNA导向序列列表，通过化学方式合成和修饰获得甲基和硫代磷酸酯键修饰的gRNA，备用。
如合成修饰的单分子的gRNA1合成序列和修饰为：
5'-mC*mC*mG*UCAAGCUGGAGCCUCGG-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU-3'(下划线为导向序列，m表示2’-O-甲基修饰，*表示硫代磷酸酯键修饰)。
实施例3
将单碱基编辑器和gRNA递送至宿主细胞。
1、复苏细胞
复苏实施例1中步骤3构建成功的GFP-HbCS报告细胞模型，并铺板到6孔细胞培养板
中。CO2孵箱中培养24小时后用于细胞转染。
2、脂质体转染
将6孔板培养的对数生长期宿主细胞用1mL PBS洗，通过消化或回收等操作获取重悬/悬浮宿主细胞溶液，取20μl进行细胞计数，铺板到24孔板，2×105/孔。每孔补充培养基到约500μl。
3、配置转染复合物A
取1.5ml EP管，依次加入实施例1得到的OPTI-MEM、实施例2得到的gRNA质粒、碱基编辑器质粒，轻柔混匀孵育，室温静置20分钟使复合物形成后再加入40μl的OPTI-MEM。
4、配置转染复合物B
取1.5ml EP管，依次加入OPTI-MEM和Lipofectamine 2000转染试剂，轻柔混匀后室温静置10分钟；将转染复合物A与B轻柔混匀，室温静置15分钟，随后将混合物加入24孔板中，每孔50μl继续培养72小时。
5、质粒电转
将6孔板宿主细胞转移至T25培养瓶培养24小时，注意控制细胞密度。将T25细胞培养液转移至15mL离心管，90xg离心10min，去掉上清，1mL PBS重悬。进行细胞计数。取0.5×106细胞，90xg离心10min，去掉上清，用约20μL电转混合液(单碱基编辑器质粒溶液(质粒质量300ng-5μg)/gRNA质粒溶液(质粒质量300ng-5ug)/SF-P3溶液/Supplement溶液的混合液，依据Lonza公司货号V4XC-2032说明书实施)重悬，并转移至电转杯，选择宿主细胞对应的电转程序进行电转操作。
电转后室温静置10min，加入80μL RPMI1640培养基(含10％FBS)；轻柔吹打3次，将细胞转移，培养于24孔板中，补充培养基体积到400μL。
7、RNA体系电转
通过电穿孔将单碱基编辑器mRNA和化学合成gRNA递送入宿主细胞。将6孔板宿主细胞转移至T25培养瓶培养24小时，注意控制细胞密度。将T25细胞培养液转移至15mL离心管，90xg离心10min，去掉上清，1mL PBS重悬。进行细胞计数。取0.5×106细胞，90xg离心10min，去掉上清，用约20μL电转混合液(单碱基编辑器mRNA溶液/gRNA溶液/SF-P3溶液/Supplement溶液的混合液，依据Lonza公司货号V4XC-2032说明书实施)重悬，并转移至电转杯，选择宿主细胞对应的电转程序进行电转操作。
电转后室温静置10min，加入80μL RPMI1640培养基(含10％FBS)；轻柔吹打3次，将细胞转移，培养于24孔板中，补充培养基体积到400μL。
8、RNP电转
将单碱基编辑器蛋白和化学合成gRNA，在体外孵育包装成核糖核蛋白(RNP，ribonucleoprotein)。通过电穿孔将RNP递送入宿主细胞。将6孔板宿主细胞转移至T25培养瓶培养24小时，注意控制细胞密度。将T25细胞培养液转移至15mL离心管，90xg离心10min，去掉上清，1mL PBS重悬。进行细胞计数。取0.5×106细胞，90xg离心10min，去掉上清，用约20μL电转混合液(单碱基编辑器蛋白溶液/gRNA溶液/SF-P3溶液/Supplement
溶液的混合液，依据Lonza公司货号V4XC-2032说明书实施)重悬，并转移至电转杯，选择宿主细胞对应的电转程序进行电转操作。
电转后室温静置10min，加入80μL RPMI1640培养基(含10％FBS)；轻柔吹打3次，将细胞转移，培养于24孔板中，补充培养基体积到400μL。
9、脂质纳米颗粒(LNP，Lipid nanoparticles)递送
将单碱基编辑器和gRNA的质粒DNA、mRNA或核糖核蛋白复合物，包埋在含有融合脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、低水平(5-10mol％)的阳离子脂质的“稳定化的质粒-脂质颗粒”(SPLP)中，并通过聚乙二醇(PEG)涂层稳定化。LNP递送可用于体外将单碱基编辑器-gRNA递送入细胞内，也可用于生物体内递送。
10、转染后测序
转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞，提取基因，PCR扩增目的片段，PCR引物序列为：(F引物)CGACAAGCAGAAGAACGGCATCAA(SEQ ID NO.68)，(R引物)CAGCTGCAGAGAGGTCCTTG(SEQ ID NO.69)，PCR产物用Sanger法测序。
11、结果分析
测序结果经EditR 10.10网站(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)分析基因编辑效率。
实施例4
通过Hb-CS突变修复gRNA引导的单碱基编辑器修复Hb-CS突变。
1、方法
本实施例参照实施例3中质粒电转的方法，将Hb-CS突变定位为C12-18的gRNA1质粒、gRNA15质粒、gRNA26质粒、gRNA37质粒、gRNA48质粒、gRNA59质粒、gRNA61质粒，分别与pCAG-CBE4max-SpRY-P2A-EGFP(来源：Addgene Plasmid#139999)混合电转入K562细胞株中，转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞，提取基因，PCR扩增目的片段，PCR产物用Sanger法测序。
2、结果
测序结果经EditR 10.10网站分析基因编辑效率如下表和图2所示，图2为Hb-CS位点碱基编辑结果测序和效率分析图，其中方框标注的数字表示目的碱基编辑的效率(％)。
表2.SpRY-单碱基编辑器修复Hb-CS突变
上述结果显示，gRNA-1(C16)、gRNA-15(C15)、gRNA-26(C13)、gRNA-37(C17)、gRNA-48(C14)、gRNA-59(C12)介导的SpRY单碱基编辑器可修复HBA2基因的Hb-CS突变，且gRNA-1、gRNA-15、gRNA-26、gRNA-37、gRNA-48对Hb-CS突变位点的修复效率显著优于gRNA-59。
表3.SpRY-单碱基编辑器修复Hb-CS突变的非目的编辑效率
上述结果显示，相对于gRNA-1、gRNA-15、gRNA-26、gRNA-37和gRNA-48，gRNA-59的非目的编辑频率非常高，且高于目的位点的编辑效率。gRNA-1、gRNA-15、gRNA-26、gRNA37、gRNA48的目的编辑效率均高于非目的编辑效率，gRNA-1、gRNA-15、gRNA-26、gRNA37具有更低的非目的编辑效率。
实施例5
不同长度gRNA介导单碱基编辑器修复Hb-CS突变实验。
本实施例参照实施例3质粒电转的方法，将Hb-CS突变定位相同(自导向序列3’端起计碱基数)的不同导向序列长度gRNA与CBE单碱基编辑器共同递送入宿主细胞内，从而观察不同长度的gRNA是否可诱导Hb-CS突变位点修复，并检测不同gRNA长度对修复效率的影响。
1、方法
1.1电转
1)将Hb-CS突变定位为C16(自导向序列3’端)的不同导向序列长度的gRNA-2、gRNA-3、gRNA-4、gRNA-6、gRNA-11分别与pCAG-CBE4max-SpRY-P2A-EGFP(来源：Addgene Plasmid#139999)混合电转入K562细胞株中。
2)将Hb-CS突变定位C15(自导向序列3’端)的导向序列长度不同的gRNA-16、gRNA-17、gRNA-18、gRNA-20、gRNA-25分别与pCAG-CBE4max-SpRY-P2A-EGFP(Addgene Plasmid#139999)混合电转入K562细胞株中。
3)将Hb-CS突变定位C17(自导向序列3’端)的导向序列长度不同的gRNA38、gRNA39、
gRNA40、gRNA42、gRNA47分别与pCAG-CBE4max-SpRY-P2A-EGFP(Addgene Plasmid#139999)混合电转入K562细胞株中。
1.2培养
转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞。
1.3测序
提取基因，PCR扩增目的片段，PCR产物用Sanger法测序。
2、结果
测序结果经EditR 10.10网站分析基因编辑效率如下表和图3-5所示。
表4.Hb-CS突变定位C16的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率
表5.Hb-CS突变定位C15的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率
表6.Hb-CS突变定位C17的长度15-25nt导向序列的gRNA联合单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率
上述实验结果显示，Hb-CS突变定位C16的16-25nt长度的gRNA、Hb-CS突变定位C15的16-25nt长度gRNA、Hb-CS突变定位C17的16-25nt长度gRNA分别联合单碱基编辑器均可修复Hb-CS突变。
且根据本实施例结果结合上述实施例3-4可知，Hb-CS突变定位同为C13-C17(自导向序列3’端计碱基数)的长度16-25nt导向序列的gRNA分别联合单碱基编辑器均可修复Hb-CS突变。
进一步地，Hb-CS突变定位同为C13-C17(自导向序列3’端计碱基数)的长度17-25nt导向序列的gRNA具有更优的Hb-CS突变修复效果，即gRNA与分别起始于人基因组反义链chr16：173613、173612、173610、173614、173611位点的16bp以上的靶核苷酸序列结合或反向互补，均可与单碱基编辑器共同诱导HBA2基因Hb-CS突变位点的C到T的转换，且具有较好的编辑效率。
实施例6
通过AncBE单碱基编辑器修复Hb-CS突变实验。
1、方法
本实施例参照实施例3质粒电转的方法，将gRNA1、gRNA26、gRNA59和gRNA61质粒分别与pCMV-AncBE4max-GFP(来源：Addgene plasmid#112100)混合电转入K562细胞株中，转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞，提取基因，PCR扩增目的片段，PCR产物用Sanger法测序。
2、结果
测序结果经EditR 10.10网站分析基因编辑效率如下表和图6所示，图6为gRNA-1介导的AncBE单碱基编辑器修复Hb-CS位点突变结果测序和效率分析图，方框标注的数字表示目的编辑的效率(％)。
表7.AncBE单碱基编辑器修复Hb-CS突变
上述实验结果显示，gRNA1和gRNA26介导的AncBE单碱基编辑器可修复HBA基因的Hb-CS突变，且修复效率显著优于gRNA59和gRNA61，且经试验表明，gRNA1和gRNA26非目的编辑相对目的编辑的概率更低。
gRNA-26介导的AncBE单碱基编辑器具有更高的Hb-CS突变修复效率，优于与其它单碱基编辑器的组合。虽然gRNA-1并非Anc-BE4中核酸酶的最优PAM位点，但却具有意料不到的显著Hb-CS修复效率，且远远高于非目的位点的编辑效率2-4％。同时，gRNA-1引导
AncBE单碱基编辑器的非目的编辑效率显著低于SpRY单碱基编辑器。由此可知，PAM位点并不是限制单碱基编辑器修复Hb-CS效率的决定因素。
实施例7
通过YE1-CBE单碱基编辑器修复Hb-CS突变
1、方法
本实施例参照实施例3质粒电转的方法，将gRNA-1、gRNA-15、gRNA-48、gRNA-59和gRNA-61质粒分别与YE1-BE4max-NG(来源：Addgene Plasmid#138159)混合电转入K562细胞株中，转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞，提取基因，PCR扩增目的片段，PCR产物用Sanger法测序。
2、结果
测序结果经EditR 10.10网站分析基因编辑效率如下表和图7所示，图7为Hb-CS位点碱基编辑结果测序和效率分析图，其中方框标注的数字表示目的编辑的效率(％)。
表8.YE1单碱基编辑器修复Hb-CS突变
上述实验结果显示，gRNA-1、gRNA-15和gRNA-48介导的YE1-CBE单碱基编辑器可修复HBA2基因的Hb-CS突变，修复效率显著优于gRNA59和gRNA61，且经实验证实，其非目的编辑效率远低于Hb-CS突变的修复效率。
尽管gRNA-2和gRNA-5分别引导YE1-CBE单碱基编辑器修复Hb-CS突变的效率弱于SpRY单碱基编辑器，但是却可显著下调非目的编辑的频率，降低了潜在非目的编辑风险，具有安全性高的优势。
尽管gRNA-15的单碱基编辑效率低于gRNA-48，但gRNA-48的非目的编辑效率显著高于gRNA-15和gRNA-1。
实施例8
PAM位点相同而不同长度gRNA均可介导单碱基编辑器修复Hb-CS突变实验。
1、方法
本实施例参照实施例3质粒电转的方法，将与gRNA-6分别错配1、2、3个核苷酸的质粒(对应gRNA-12、gRNA-13、gRNA-14)与YE1-BE4max-NG(Addgene Plasmid#138159)混合电转入K562细胞株中，转染细胞培养72小时后，回收共转染了单碱基编辑器质粒和gRNA质粒的宿主细胞，提取基因，PCR扩增目的片段，PCR产物用Sanger法测序。
2、结果
测序结果经EditR 10.10网站分析基因编辑效率如下表和图8所示，图8为gRNA导向序列错配示意图，其中阴影碱基表示错配碱基，下划线碱基表示Hb-CS突变位点。
表9.错配1bp-3bp的gRNA都具有碱基修复效果
上述实验结果显示，错配1-3个核苷酸的gRNA6均可修复HBA2基因的Hb-CS突变，由此可知，错配1-3个核苷酸的gRNA仍可引导单碱基编辑器修复HBA2基因的Hb-CS突变。
实施例9
在病人来源的造血干/祖细胞中修复Hb-CS突变实验。
1、离体修复实验
2.1方法
获取含有HBA2基因Hb-CS突变的CD34阳性细胞(mPBSC)复苏后，在富含人类细胞因子(SCF、TPO、Flt3L，各100ng/ml)的StemSpan无血清扩增培养基(StemCell公司，StemSpanTM SFEM#09600)中培养两天。
将修复Hb-CS的CBE单碱基编辑器和gRNA-1递送到mPBSC细胞中。电转完成后在富含人细胞因子(SCF、TPO、Flt3L，各100ng/ml)的SFEM中恢复培养一天，然后分成三阶段诱导mPBSC向红细胞分化。在开始诱导分化的第4天，取出2×105细胞，提取基因组DNA，然后PCR扩增HBA2基因Hb-CS突变位点及临近片段送sanger测序，测序结果经synthego软件分析基因编辑效率。
在开始诱导分化的第18天，通过相对实时定量qPCR检测修复后的HBA2mRNA的相对表达量，通过血红蛋白高效液相色谱(HPLC)分析血液蛋白的百分比，通过流式细胞技术分析修复并诱导分化后的红细胞中去核百分比和细胞大小，以未修复的患者来源造血干细胞/祖细胞诱导分化后的红细胞实验组为阴性对照。
2.2结果
与阴性对照对比，用修复Hb-CS的CBE单碱基编辑器和gRNA-1处理后的mPBSC细胞，诱导分化获得的红细胞恢复了HBA血红蛋白的表达和功能。
2、体内修复
将修复Hb-CS的CBE单碱基编辑器和gRNA-1装载在病毒载体中，或通过脂质纳米颗粒包裹，或通过工程化细胞表达并用外囊泡包裹分泌，制成静脉输注制剂，通过静脉输注递送到机体骨髓，修复造血干细胞中的Hb-CS突变，恢复HBA血红蛋白的表达和功能。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (34)
- 一种单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将单碱基编辑器和gRNA与待编辑修复的HBA2基因序列接触，使突变的HBA2基因CD142密码子中的胞嘧啶碱基脱氨基，转换为胸腺嘧啶。
- 权利要求1所述的单碱基编辑修复HBA2基因突变的方法在制备用于治疗α地中海贫血症的药物中的应用。
- 一种修复HBA2基因突变的组合物，其特征在于，包括：单碱基编辑器和gRNA，所述单碱基编辑器包含靶核酸结合结构单元和脱氨酶结构单元，所述脱氨酶结构单元包含胞嘧啶脱氨酶活性域；所述gRNA包含导向序列和与所述单碱基编辑器结合的骨架序列，所述导向序列靶向突变的HBA2基因的CD142密码子中的胞嘧啶碱基。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述靶核酸结合结构单元选自：CRISPR/Cas核酸酶、ZFN、TALEN、Argonaute。
- 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：Cas9、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、cas12b2、cas12h、cas12i、cas12g、C2c2、C2c3、C2c4、C2c5、C2c6、C2c7、c2c8、c2c9、及其变体中的至少一种。
- 根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：Cas9切口酶变体。
- 根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas核酸酶选自：SpRY变体、NG-nCas9变体、NGG-nCas9变体中的至少一种。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述脱氨酶结构单元选自：APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、激活诱导的脱氨酶和pmCDA1及其变体或组合。
- 根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述单碱基编辑器为融合蛋白，所述靶核酸结合结构单元与所述脱氨酶结构单元有机连接。
- 根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述单碱基编辑器选自：SpRY-CBE、 AncBE、YE1-CBE中的至少一种。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列与Chr16:173548-173648靶区域结合或反向互补。
- 根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列与Chr16:173589-173613、Chr16:173588-173612、Chr16:173586-173610、Chr16:173590-173614、Chr16:173587-173611、Chr16:173590-173609、Chr16:173596-173615靶区域结合或反向互补。
- 根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述gRNA导向序列3’端碱基与靶区域反义链5’端碱基结合。
- 根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173599-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613、Chr16:173593-173612、Chr16:173598-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612、Chr16:173591-173610、Chr16:173596-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16:173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610、Chr16:173595-173614、Chr16:173600-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614、Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611、Chr16:173590-173609、Chr16:173594-173609、Chr16:173596-173615、Chr16:173600-173615反向互补或存在1-5个错配。
- 根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613、Chr16:173593-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612、Chr16:173591-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16: 173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610、Chr16:173595-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614、Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611反向互补或存在1-5个错配。
- 根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列与Chr16:173594-173613、Chr16:173598-173613、Chr16:173597-173613、Chr16:173596-173613、Chr16:173595-173613、Chr16:173593-173613、Chr16:173592-173613、Chr16:173591-173613、Chr16:173590-173613、Chr16:173589-173613反向互补或存在1-5个错配；或者所述gRNA的导向序列与Chr16:173593-173612、Chr16:173597-173612、Chr16:173596-173612、Chr16:173595-173612、Chr16:173594-173612、Chr16:173592-173612、Chr16:173591-173612、Chr16:173590-173612、Chr16:173589-173612、Chr16:173588-173612反向互补或存在1-5个错配；或者所述gRNA的导向序列与Chr16:173591-173610、Chr16:173595-173610、Chr16:173594-173610、Chr16:173593-173610、Chr16:173592-173610、Chr16:173590-173610、Chr16:173589-173610、Chr16:173588-173610、Chr16:173587-173610、Chr16:173586-173610反向互补或存在1-5个错配；或者所述gRNA的导向序列与Chr16:173595-173614、Chr16:173599-173614、Chr16:173598-173614、Chr16:173597-173614、Chr16:173596-173614、Chr16:173594-173614、Chr16:173593-173614、Chr16:173592-173614、Chr16:173591-173614、Chr16:173590-173614反向互补或存在1-5个错配；或者所述gRNA的导向序列与Chr16:173592-173611、Chr16:173596-173611、Chr16:173595-173611、Chr16:173594-173611、Chr16:173593-173611、Chr16:173591-173611、Chr16:173590-173611、Chr16:173589-173611、Chr16:173588-173611、Chr16:173587-173611反向互补或存在1-5个错配。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C12-C18。
- 根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C18。
- 根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的3’端距所述HBA2基因序列中的CD142处的密码子胞嘧啶的距离为C13-C17。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的长度≥16bp。
- 根据权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的长度为16-25bp。
- 根据权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述gRNA的导向序列的长度为17-25bp。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述gRNA导向序列的靶DNA核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.62所示的基础序列、与所述基础序列存在1-5个碱基错配的错配序列。
- 根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.58所示序列。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述单碱基编辑器为SpRY-CBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39-SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.58所示序列。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述单碱基编辑器为AncBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.26-SEQ ID NO.36所示序列。
- 根据权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.36所示序列。
- 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述单碱基编辑器为YE1-CBE，所述基础序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.48-SEQ ID NO.58所示序列。
- 根据权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50-SEQ ID NO.58所示序列。
- 一种用于单碱基编辑修复HBA2基因突变的gRNA，其特征在于，包含权利要求3-31任一项所述的gRNA。
- 一种细胞，其特征在于，包含权利要求3-29任一项所述的修复HBA2基因突变的组合物。
- 根据权利要求31所述的细胞，其特征在于，所述细胞为细胞系和/或原代细胞。
- 根据权利要求32所述的细胞，其特征在于，所述细胞为造血干/祖细胞、诱导多能干细胞、红系祖细胞。
- 一种修复HBA2基因突变的试剂，其特征在于，包括：1)权利要求3-29任一项所述的单碱基编辑器蛋白或蛋白组合物，或编码所述单碱基编辑器的核苷酸序列；以及2)权利要求3-29任一项所述的gRNA，或编码所述gRNA的核苷酸序列，或包含编码所述gRNA的核苷酸序列的核苷酸组合物。
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