JP6974349B2

JP6974349B2 - ヘモグロビン異常症の処置のための材料及び方法

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Publication number: JP6974349B2
Application number: JP2018555646A
Authority: JP
Inventors: アルバートカウワンチャド; スベンランドバーグアンテ; チャクラボーティティルタ; ミッシェルイ−チンリン; プラサードミッシュラビブー; エリザベスチェ−ウンペク; ケレンズキーアンドルー; ダグラスボーランドトッド
Original assignee: クリスパーセラピューティクスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2021-12-01
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: AU2017252023B2; CN109715198B; CA3021467A1; JP2019513407A; US20240226339A1; DK3445388T3; US20190201553A1; WO2017182881A3; US20200330609A1; IL262416B2; SG10202010261YA; KR102351329B1; AU2017252023A1; LT3445388T; KR20190008533A; FI3445388T3; EP3445388A2; WO2017182881A2; SI3445388T1; RS65592B1

Description

本出願は、ｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方で、ヘモグロビン異常症の患者を処置するための材料及び方法を提供する。加えて本出願は、ゲノム編集により、細胞内のＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の転写制御配列に欠失、修飾、または不活性化をもたらすための材料及び方法を提供する。

関連出願
本出願は、２０１６年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／３２４，０２４号；２０１６年９月１日に出願された米国仮出願第６２／３８２，５２２号；及び２０１６年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／４２９，４２８号の利益を主張する。これらの全ての出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
本出願は、コンピューター可読形態の配列表（ファイル名：１６００７７ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ；１４，４４６，２９９バイト（ＡＳＣＩＩテキストファイル）；２０１７年４月７日作成）を含み、当該配列表は、その全体が参照により本明細書に援用され、また本開示の一部を形成する。

ヘモグロビン異常症には、赤血球の生成減少及び／または破壊増加をもたらす遺伝的原因の貧血が含まれる。このような障害には、酸素濃度を維持できない異常なヘモグロビンの生成をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。このような障害の多くは、十分な量の正常なβ−グロビンタンパク質を生成できない、または正常なβ−グロビンタンパク質を完全に生成できないことからβ−ヘモグロビン異常症と呼ばれる。例えば、β−サラセミアはβ−グロビン遺伝子発現の部分的または完全な欠損に起因し、これが成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）の欠乏または不在につながる。鎌状赤血球貧血は、β−グロビン構造遺伝子の点変異に起因し、これが異常なヘモグロビン（ＨｂＳ）の生成につながる（Ａｔｗｅｈ，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８（４）：３６７−７３（２００１））。ヘモグロビン異常症は血液の酸素運搬能低下をもたらし、これが疲労、めまい、及び息切れ（特に運動時）などの症状につながり得る。

ヘモグロビン異常症と診断された患者については、現時点では、血中酸素濃度を増加させるためのいくつかの対症療法（例えば、輸血）が利用可能であるに過ぎない。

ゲノム操作とは、生物の遺伝情報（ゲノム）のうちの標的となる特定の改変に対する戦略及び技法を指す。ゲノム操作は、特にヒトの健康、例えば、有害な変異を有する遺伝子の修正、または遺伝子の機能を探索する領域で考えられる応用が広範囲であることから、非常に活気のある研究分野である。導入遺伝子を生細胞に挿入するように開発された初期の技術は、ゲノムへの新規配列の挿入におけるランダムな性質による制約を受けることが多かった。ゲノムへのランダム挿入は、隣接する遺伝子の正常な調節を分断し、望ましくない重篤な作用につながる恐れがある。さらに、２つの異なる細胞内の同じ場所に配列が挿入される保証がないため、ランダムな統合技術がもたらす再現性は低い。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、及びＭｅｇａＴＡＬなどの最近のゲノム操作戦略ではＤＮＡの特定の領域を改変することが可能になり、そのため初期の技術に比べれば修正や挿入の精度が上昇している。これらの新たなプラットフォームははるかに高い程度の再現性をもたらすが、依然として制約を有する。

ヘモグロビン異常症への対処を試みる世界中の研究者や医療専門家が払ってきた努力にもかかわらず、依然としてヘモグロビン異常症の安全かつ有効な処置の開発が極めて必要とされている。

本開示は、ヘモグロビン異常症の遺伝的基盤に対処するためのアプローチを提示する。ゲノム操作ツールを使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する欠失、修飾、または不活性化をもたらし得る永続的な変化を単回処置でゲノムに創出することにより、結果得られる治療は、ヘモグロビン異常症による作用を緩和することができる。

本明細書では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する欠失、修飾、または不活性化をもたらすことにより永続的な変化をゲノムに創出するための、細胞のｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの方法が提供され、当該方法はヘモグロビン異常症の処置に使用することができる。また本明細書では、このような方法を実施するための構成要素、キット、及び組成物も提供される。また本明細書では、このような方法によって生成される細胞も提供される。ヘモグロビン異常症の例として、鎌状赤血球貧血及びサラセミア（α、β、δ、γ、及びこれらの組合せ）が考えられる。

本明細書では、ヒト細胞内のＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、ヒト細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすステップを含む方法が提供される。転写制御配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置してもよい。転写制御配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置してもよい。

また本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者（例えば、ヒト）を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｉＰＳＣのＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させるステップと、造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法も提供される。

患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップは、患者から体細胞を単離することと、体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入して、体細胞が多能性幹細胞になるように誘導することと、を含むことができる。当該体細胞は線維芽細胞であってもよい。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子であってもよい。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｉＰＳＣのＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップは、ｉＰＳＣに１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含むことができる。

ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させるステップは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：低分子の組合せを用いた処置、転写因子（例えば、主要転写因子）の送達、または転写因子（例えば、主要転写因子）をコードするｍＲＮＡの送達。

造血前駆細胞を患者に植え込むステップは、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって造血前駆細胞を患者に植え込むことを含むことができる。

また本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者（例えば、ヒト）を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者から間葉系幹細胞を単離するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または間葉系幹細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるステップと、造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法も提供される。

間葉系幹細胞は、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。患者から間葉系幹細胞を単離するステップは、骨髄の吸引及び密度勾配遠心分離媒体を用いた間葉系細胞の単離を含むことができる。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または間葉系幹細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップは、間葉系幹細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含むことができる。

ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるステップは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：低分子の組合せを用いた処置、転写因子（例えば、主要転写因子）の送達、または転写因子（例えば、主要転写因子）をコードするｍＲＮＡの送達。

また本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者（例えば、ヒト）を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者から造血前駆細胞を単離するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または造血前駆細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法も提供される。

当該方法は、患者から造血前駆細胞を単離するステップの前に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を用いて患者を処置することをさらに含むことができる。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を用いて患者を処置するステップは、プレリキサフォルと組み合わせて実施することができる。

患者から造血前駆細胞を単離するステップは、ＣＤ３４＋細胞を単離することを含むことができる。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または造血前駆細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップは、造血前駆細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含むことができる。

ゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むステップは、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによってゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むことを含むことができる。

また本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者（例えば、ヒト）を処置するためのｉｎｖｉｖｏの方法であって、患者の細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するステップを含む方法が提供される。

患者の細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するステップは、細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含むことができる。当該細胞は、骨髄細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、またはこれらの組合せであってもよい。

１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、これらの相同体、これらの天然分子の組換え、これらのコドン最適化、またはこれらの改変バージョン、及びこれらの組合せであってもよい。

当該方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含むことができる。当該方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含むことができる。１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡは、１つ以上の改変ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変ＲＮＡであってもよい。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドであってもよい。１つ以上のタンパク質またはポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。１つ以上のタンパク質またはポリペプチドは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。１つ以上のＮＬＳはＳＶ４０ＮＬＳであってもよい。

当該方法は、細胞に１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含むことができる。１つ以上のｇＲＮＡは単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変ｇＲＮＡ、１つ以上の改変ｓｇＲＮＡ、またはこれらの組合せであってもよい。１つ以上の改変ｓｇＲＮＡは、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含むことができる。改変ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列であってもよい。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡ、１つ以上のｓｇＲＮＡ、またはこれらの組合せと予備複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる。ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列を含むことができ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であってもよく、ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。

当該方法は、細胞に、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含むことができる。

当該方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含むことができる。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近の座位で１つの１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、当該座位でポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、当該座位に近接する染色体ＤＮＡの転写制御配列における永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとすることができる。ｇＲＮＡは、当該座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができる。近接とは、当該座位の上流及び下流両方のヌクレオチドを意味し得る。

当該方法は、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含むことができる。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）及び／または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１の切断は５’座位で、第２の切断は３’座位で起こしまたは創出し、５’座位と３’座位との間でポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの転写制御配列における永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとすることができる。１つのガイドＲＮＡは、一対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出することができる。１つのガイドＲＮＡは、５’座位または３’座位のいずれかに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができる。代替的に、当該方法は第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含むことができる。第１のガイドＲＮＡは５’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができ、第２のガイドＲＮＡは３’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができる。ドナーテンプレートは、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。改変転写制御配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置してもよい。改変転写制御配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置してもよい。

１つまたは２つのｇＲＮＡは、１つまたは２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。１つもしくは２つのｇＲＮＡ、または１つもしくは２つのｓｇＲＮＡは、１つもしくは２つの改変ｇＲＮＡ、または１つもしくは２つの改変ｓｇＲＮＡであってもよい。１つの改変ｓｇＲＮＡは、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含むことができる。１つの改変ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列であってもよい。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予備複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。１つ以上のＮＬＳはＳＶ４０ＮＬＳであってもよい。ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。１つのｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列を含むことができ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であってもよく、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。

挿入は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるものであり得る。

ＳＳＢ、ＤＳＢ、５’座位、及び／または３’座位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置してもよい。ＳＳＢ、ＤＳＢ、５’座位、及び／または３’座位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置してもよい。

当該方法は、細胞に１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含むことができる。１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１のＳＳＢまたはＤＳＢは５’座位で、第２のＳＳＢまたはＤＳＢは３’座位で起こしまたは創出し、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、その結果、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの転写制御配列における永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとすることができる。第１のガイドＲＮＡは５’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含んでもよく、第２のガイドＲＮＡは３’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含む。１つのガイドＲＮＡは、一対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出することができる。１つのガイドＲＮＡは、５’座位または３’座位のいずれかに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができる。代替的に、当該方法は第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含むことができる。第１のガイドＲＮＡは５’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができ、第２のガイドＲＮＡは３’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含むことができる。

１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡであってもよい。１つの改変ｓｇＲＮＡは、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含むことができる。１つの改変ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列であってもよい。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予備複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。１つ以上のＮＬＳはＳＶ４０ＮＬＳであってもよい。ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。１つのｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列を含むことができ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であってもよく、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。

５’座位及び／または３’座位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置してもよい。５’座位及び／または３’座位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置してもよい。

Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートは、別々の脂質ナノ粒子に製剤化されてもよく、１つの脂質ナノ粒子に同時に製剤化されてもよい。

Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡは１つの脂質ナノ粒子に製剤化されてもよく、ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって細胞に送達されてもよい。

Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡは１つの脂質ナノ粒子に製剤化されてもよく、ｇＲＮＡはエレクトロポレーションによって細胞に送達されてもよく、ドナーテンプレートはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって細胞に送達されてもよい。

１つ以上のＲＮＰは、エレクトロポレーションによって細胞に送達されてもよい。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集することは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現を低減することができる。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は染色体２：６０，４５１，１６７〜６０，５５３，５６７（ＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ＧＲＣｈ３８）上に位置してもよい。

また本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者からの細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）も提供される。１つ以上のｇＲＮＡは、配列表の配列番号１〜７１，９４７における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含むことができる。１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡであってもよい。１つ以上の改変ｓｇＲＮＡは、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含むことができる。１つ以上の改変ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列を含むことができる。また本明細書では、配列番号７１，９５９の核酸配列を含む単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も提供される。

本明細書に記載の発明は、この発明の概要で概括されている例に限定されないことを理解されたい。本明細書において他の様々な態様を説明し例示する。

本明細書で開示し説明するヘモグロビン異常症の処置のための材料及び方法における様々な態様は、添付の図を参照することによってさらに十分に理解することができる。

図１Ａ〜Ｃは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼのコドン最適化遺伝子を含むプラスミドを示している。図１Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼのコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−１）である。このＣＴｘ−１プラスミドは、配列表の配列番号１〜２９，４８２に挙げられている配列からの２０ｂｐスペーサー配列を含むｇＲＮＡスキャフォールド配列も含む。図１Ｂは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼの異なるコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−２）である。このＣＴｘ−２プラスミドは、配列表の配列番号１〜２９，４８２に挙げられている配列からの２０ｂｐスペーサー配列を含むｇＲＮＡスキャフォールド配列も含む。図１Ｃは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼのまた別の異なるコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−３）である。このＣＴｘ−３プラスミドは、配列表の配列番号１〜２９，４８２に挙げられている配列からの２０ｂｐスペーサー配列を含むｇＲＮＡスキャフォールド配列も含む。上記説明のとおり。上記説明のとおり。図２Ａ〜ＢはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを図示している。図２Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを図示している。図２Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを図示している。ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるＤＮＡ編集の比率と、種々の得られたＨＰＦＨ遺伝子型の各々とを示している。図４Ａ〜Ｃは、動員末梢血（ｍＰＢ）からのバルク編集されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣから分化した赤血球におけるγ−−グロビン発現の上方調節を示している。図４Ａは、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣから赤血球への血球新生を図示している。図４Ｂは、それぞれの欠失／改変におけるγ／１８ｓＲＮＡの比を示している。図４Ｃは、それぞれの欠失／改変におけるγ／αの比を示している。図５Ａ〜Ｂは、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣからの全ての遺伝子編集されたコロニーから分化した赤血球におけるγ−グロビン発現の上方調節を示している。図５Ａは、遺伝子編集されたコロニーの各々におけるγ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。図５Ｂは、遺伝子改変の各々における平均γ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来赤血球系コロニーにおけるＤＮＡ編集のＢＣＬ１１Ａイントロン（ＳＰＹ１０１）比率を示している。図７Ａ〜Ｂは、遺伝子編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣから分化した単一細胞コロニーにおけるＳＰＹ１０１遺伝子型とγ−グロビン発現との相関を示している。図７Ａは、遺伝子編集されたコロニーの各々におけるγ−グロビン対α−グロビンのパーセンテージ（ＨＢＧ／ＨＢＡ）を示している。図７Ｂは、遺伝子編集されたコロニーの各々におけるβ様グロビンのパーセンテージ（ＨＢＧ／（ＨＢＢ＋ＨＢＧ））を示している。ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞におけるいくつかのｇＲＮＡのオンターゲット編集有効性を示している。図９Ａ〜Ｂは、オフターゲット編集の検出に用いるハイブリッドキャプチャーアッセイと、及びハイブリッドキャプチャーアッセイを用いて、編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣから得られた結果とを示している。図９Ａは、潜在的オフターゲット部位における編集活性の検出に用いるハイブリッドキャプチャーアッセイの概略図を示している。図９Ｂは、ハイブリッドキャプチャーシークエンシングによって観察されたオフターゲット活性を示している。図１０Ａ〜Ｂは、ＳＣＤ患者、β−サラセミア患者、及び健康なドナーからの細胞内で測定したグロビンｍＲＮＡレベルの比を示している。図１０Ａは、ＳＣＤ患者からの細胞内で測定したグロビンｍＲＮＡレベルの比を健康なドナーと比較して示している。図１０Ｂは、β−サラセミア患者からの細胞内で測定したグロビンｍＲＮＡレベルの比を健康なドナーと比較して示している。図１１Ａ〜Ｃは、様々な遺伝子編集された細胞集団の検出に用いるフローサイトメトリー戦略と、フローサイトメトリー戦略を用いて得られた結果とを示している。図１１Ａは、ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣサブ集団、関連する表面マーカー、及びフローサイトメトリーゲーティング戦略を示している。図１１Ｂは、模擬条件及び編集条件において細胞タイプの分布が同様であることを示している。図１１Ｃは、バルクと比較してサブ集団全体において同様に編集効率が高いことを示している。ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの移植から８週後のＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ４５ＲＡ＋細胞集団の解析を示している。データ点は、個々の動物を表し、ヒトＣＤ４５ＲＡ＋生細胞であった生細胞のパーセンテージを図示している。実験室スケール及び臨床上意義のあるスケールにおけるヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣ内のＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の平均編集効率を示している。ＧＬＰ／毒性学研究設計の概要を示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で遺伝子編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣに由来する赤血球系細胞集団におけるヘモグロビンｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルのバルク及び単細胞コロニー解析に対する実験アプローチの概要を示している。図１６Ａ〜Ｂは、種々の標的化編集で改変されたバルク分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビンｍＲＮＡ及びタンパク質の上方調節を示している。図１６Ａは、種々の標的化編集で改変されたバルク分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビンｍＲＮＡの上方調節を示している。図１６Ｂは、種々の標的化編集で改変されたバルク分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビンタンパク質の上方調節を示している。種々の標的編集で改変された分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの個々のコロニーにおける平均γ−グロビンの上方調節を示している。図１８Ａ〜Ｂは、赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの標的５及び標的６編集コロニーにおける遺伝子型と表現型との相関を示している。図１８Ａの左側には各遺伝子型を有するコロニーの％を示すグラフが含まれ、右側には各レベルのγ−グロビン上方調節におけるコロニーのパーセント（γ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比として示す）を示すグラフが含まれる。図１８Ｂは、同様の遺伝子型を有するコロニー群におけるｍＲＮＡ転写レベルを示している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で遺伝子編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣに由来する赤血球系分化細胞集団における、ゲノムＤＮＡからの編集効率、ｍＲＮＡによるヘモグロビン発現、及びタンパク質のバルク解析に対する実験アプローチの概要を示している。図２０Ａ〜Ｂは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡまたはＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣのｅｘｖｉｖｏ赤血球系分化の全体を通じて維持された遺伝子編集のパーセンテージを示している。図２０Ａは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣのｅｘｖｉｖｏ赤血球系分化の全体を通じて維持された遺伝子編集のパーセンテージを示している。図２０Ｂは、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣのｅｘｖｉｖｏ赤血球系分化の全体を通じて維持された遺伝子編集のパーセンテージを示している。図２１Ａ〜Ｄは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球系分化後１１日目または１５日目におけるγ−グロビン転写物（γ／αまたはγ／（γ＋β）として示す）の増加を示している。図２１Ａは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１１日目におけるγ−グロビン転写物（γ／α）の増加を示している。図２１Ｂは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目におけるγ−グロビン転写物（γ／α）の増加を示している。図２１Ｃは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１１日目におけるγ−グロビン転写物（γ／（γ＋β））の増加を示している。図２１Ｄは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目におけるγ−グロビン転写物（γ／（γ＋β））の増加を示している。図２２Ａ〜Ｂは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球系分化後１５日目におけるγ−グロビンの上方調節を示すＦＡＣＳ解析及び蛍光強度中央値（ＭＦＩ）解析である。図２２Ａは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球系分化から１５日後におけるγ−グロビンの上方調節を示すＦＡＣＳ解析である。図２２Ｂは、４名のドナーからの遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞における赤血球系分化後のγ−グロビンの平均的な上方調節を示すＭＦＩ解析である。図２３Ａ〜Ｄは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの赤血球系分化後１５日目におけるγ−グロビン（γ／αまたはγ／（γ＋β）として示す）の上方調節を示すバルク液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）データである。図２３Ａは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目におけるγ−グロビン（γ／α）の上方調節を示すバルク液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）データである。図２３Ｂは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目における γ−グロビン（γ／α）の上方調節を示すバルク液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）データ（ＧＦＰｇＲＮＡでトランスフェクションされたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン（γ／α）を基準に正規化）である。図２３Ｃは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目におけるγ−グロビン（γ／（γ＋β）の上方調節を示すバルク液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）データである。図２３Ｄは、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの分化後１５日目における γ−グロビン（γ／（γ＋β））の上方調節を示すバルク液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）データ（ＧＦＰｇＲＮＡでトランスフェクションされたｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン（γ／α）を基準に正規化）である。ハイブリッドキャプチャーベイト設計を図示している。ハイブリッドキャプチャー法のインデル検出パワーを示すグラフである。ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いたハイブリッドキャプチャー実験から得られたデータの概略を示している。ＳＤ２ｇＲＮＡを用いたハイブリッドキャプチャー実験から得られたデータの概略を示している。移植実験の研究計画を示している。図２９Ａ〜Ｅは、未処置マウス、及び模擬編集細胞、ＧＦＰｇＲＮＡ編集細胞、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ編集細胞、またはＳＤ２ｇＲＮＡ編集細胞を注射したマウスにおける８週時中間出血解析データを示している。図２９Ａは、未処置（ＵｎＴｘ）マウスにおける８週時中間出血解析データを示している。図２９Ｂは、模擬編集細胞を注射したマウスにおける８週時中間出血解析データを示している。図２９Ｃは、ＧＦＰｇＲＮＡ編集細胞を注射したマウスにおける８週時中間出血解析データを示している。図２９Ｄは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ編集細胞を注射したマウスにおける８週時中間出血解析データを示している。図２９Ｅは、ＳＤ２ｇＲＮＡ編集細胞を注射したマウスにおける８週時中間出血解析データを示している。上記説明のとおり。平均の８週時中間出血解析データを示している。様々なＣａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ（ｍＲＮＡ１〜８）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるインデル％を、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（リボ核タンパク質複合体、ＲＮＰ）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。図３２Ａ〜Ｂは、様々なＣａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ（ｍＲＮＡ１〜８）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける正規化された細胞数及び細胞生存率を、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。図３２Ａは、様々なＣａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ（ｍＲＮＡ１〜８）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるエレクトロポレーション後４８時間時の細胞数の増加倍数を、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。図３２Ｂは、様々なＣａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ（ｍＲＮＡ１〜８）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるエレクトロポレーション後４８時間時の細胞生存率を、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）を用いてエレクトロポレーションしたヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。上記説明のとおり。図３３Ａ〜Ｃは、Ｃａｓ９ＲＮＰ最適化に使用するいくつかのＣａｓ９ＲＮＰコンストラクト及び各Ｃａｓ９ＲＮＰコンストラクトに関連するインデル％を示している。図３３Ａは、いくつかのＣａｓ９ＲＮＰコンストラクトを示している。図３３Ｂは、１μｇＣａｓ９：１μｇＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いた各Ｃａｓ９ＲＮＰコンストラクトのインデル％を示している。図３３Ｃは、３μｇＣａｓ９：３μｇＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いた各Ｃａｓ９ＲＮＰコンストラクトのインデル％を示している。図３４Ａ〜Ｂは、非臨床スケール及び臨床スケールにおいてＣａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質（ＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）で処理したヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子編集効率（％）を示している。図３４Ａは、非臨床スケールにおいてＣａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質（ＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）のいずれかで処理したヒトｍＰＢまたは骨髄（ＢＭ）由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子編集効率（％）を示している。図３４Ｂは、臨床スケールにおいてＣａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）で処理したヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子編集効率（％）を示している。図３５Ａ〜Ｂは、ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるＳＰＹ１０１の有効性を、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡまたはＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）のいずれかで処理した細胞におけるγ／αグロビンｍＲＮＡの比（％）とγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比（％）を提示することにより示している。図３５Ａは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡまたはＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）のいずれかで処理したヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。図３５Ｂは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡまたはＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（ＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）のいずれかで処理したヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。図３６Ａ〜Ｂは、骨髄由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるＳＰＹ１０１の有効性を、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体されたＣａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、技術的に最適化ｖｓ非最適化）で処理した細胞におけるγ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）とγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡの比（％）を提示することにより示している。図３６Ａは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質で処理した骨髄由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。図３６Ｂは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質で処理した骨髄由来のＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。図３７Ａ〜Ｂは、ＳＣＤ及びβ−サラセミアの患者の試料におけるＳＰＹ１０１の有効性を示している。図３７Ａは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を用いて処置した６名のＳＣＤ患者及び２名の健康なドナーからの赤血球系分化細胞における平均γ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。ＧＦＰｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を用いて処置したそれぞれの対照試料から全ての値を引いた。図３７Ｂは、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を用いて処置した１名のβ−サラセミア患者及び２名の健康なドナーからの赤血球系分化細胞におけるγ／αグロビンｍＲＮＡ比（％）を示している。ＧＦＰｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を用いて処置したそれぞれの対照試料から全ての値を引いた。図３８Ａ〜Ｂは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９ＲＮＰを使用した場合におけるＤＮＡ編集のＢｃｌ１１ａイントロン（ＳＰＹ１０１）比率を示している。図３８Ａは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡを使用した場合におけるＤＮＡ編集のＢＣＬ１１Ａイントロン（ＳＰＹ１０１）比率を示している。図３８Ｂは、Ｃａｓ９ＲＮＰを使用した場合におけるＤＮＡ編集のＢＣＬ１１Ａイントロン（ＳＰＹ１０１）比率を示している。図３９Ａ〜Ｂは、赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来の単一細胞コロニーにおける、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰがもたらしたＧＡＴＡ１結合部位（ＧＢＳ）の分断がγ−グロビン発現の増加と結び付いていることを示している。図３９Ａは、ＧＢＳ分断なし、単一アレルＧＢＳ分断、または両アレルＧＢＳ分断の場合におけるＳＰＹ１０１編集コロニーのγ／αグロビンｍＲＮＡ比を示している。図３９Ｂは、ＧＢＳ分断なし、単一アレルＧＢＳ分断、または両アレルＧＢＳ分断の場合におけるＳＰＹ１０１編集コロニーのγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比を示している。図４０Ａ〜Ｅは、フローサイトメトリー解析により、赤血球系分化ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン発現の増加を示している。図４０Ａは、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるα−グロビン発現を、ＧＦＰｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ処置赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるα−グロビン発現と比較して示すフローサイトメトリー解析である。図４０Ｂは、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるβ−グロビン発現を、ＧＦＰｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ処置赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるβ−グロビン発現と比較して示すフローサイトメトリー解析である。図４０Ｃは、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン発現を、ＧＦＰｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ処置赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン発現と比較して示すフローサイトメトリー解析である。図４０Ｄは、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるγ−グロビン陽性細胞のパーセンテージを、ＧＦＰｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ処置赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。図４０Ｅは、ＳＰＹ１０１／Ｃａｓ９ＲＮＰ編集赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、ＧＦＰｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ処置赤血球系分化ヒトｍＰＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣと比較して示している。

配列表の簡単な説明
配列番号１〜２９，４８２は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２０ｂｐスペーサー配列である。

配列番号２９，４８３〜３２，３８７は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２０ｂｐスペーサー配列である。

配列番号３２，３８８〜３３，４２０は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２０ｂｐスペーサー配列である。

配列番号３３，４２１〜３３，８５１は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２０ｂｐスペーサー配列である。

配列番号３３，８５２〜３６，７３１は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２０ｂｐスペーサー配列である。

配列番号３６，７３２〜７１，９４７は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａＮｏｖｉｃｉｄａＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いて標的化するための２２ｂｐスペーサー配列である。

配列番号７１，９４８は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼのためのサンプルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。

配列番号７１，９４９は、構造によって分類されるホーミングエンドヌクレアーゼの既知のファミリーを示している。

配列番号７１，９５０はｇＲＮＡＡ（ＣＬＯ１）である。

配列番号７１，９５１はｇＲＮＡＢ（ＣＬＯ８）である。

配列番号７１，９５２はｇＲＮＡＣ（ＣＳＯ２）である。

配列番号７１，９５３はｇＲＮＡＤ（ＣＳＯ６）である。

配列番号７１，９５４はｇＲＮＡＥ（ＨＰＦＨ−１５）である。

配列番号７１，９５５はｇＲＮＡＦ（ＨＰＦＨ−４）である。

配列番号７１，９５６はｇＲＮＡＧ（Ｋｅｎｙａ０２）である。

配列番号７１，９５７はｇＲＮＡＨ（Ｋｅｎｙａ１７）である。

配列番号７１，９５８はｇＲＮＡＩ（ＳＤ２）である。

配列番号７１，９５９はｇＲＮＡＪ（ＳＰＹ１０１）である。

配列番号７１，９６０〜７１，９６２はサンプルｓｇＲＮＡ配列を示している。

詳細な説明
胎児ヘモグロビン

胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ、α_２γ_２）は、ヒト胎児における主な酸素運搬タンパク質であり、これにはアルファ（α）及びガンマ（γ）サブユニットが含まれる。ＨｂＦは生後約６ヵ月で発現しなくなる。成人ヘモグロビン（ＨｂＡ、α_２β_２）は、生後約３４週のヒトにおける主な酸素運搬タンパク質であり、これにはアルファ（α）及びベータ（β）サブユニットが含まれる。３４週後、発生スイッチによってγ−グロブリン遺伝子の転写が減少しβ−グロブリン遺伝子の転写が増加する。ヘモグロビン異常症の多くの形態が、十分な量の正常なβ−グロビンタンパク質を生成できない、または正常なβ−グロビンタンパク質を完全に生成できないことによる結果であるため、γ−グロビン（すなわち、ＨｂＦ）の発現を増加させることによってβ−グロビン疾患の重症度が緩和されることになる。

Ｂ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）

Ｂ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）は、染色体２に位置する遺伝子であり、６０，４５１，１６７〜６０，５５３，５６７ｂｐ（ＧＲＣｈ３８）を範囲とする。ＢＣＬ１１Ａは、ジンクフィンガー転写因子であり、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を抑制し、生後約６週に始まるＨｂＦ発現を下方調節する。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、ゲノムＤＮＡの１０２．４ｋｂにわたる４エキソンを含有する。またＢＣＬ１１Ａは、主要転写因子ＧＡＴＡ−１向けのイントロン２内の結合ドメインを含めた転写調節下にある。ＧＡＴＡ−１結合はＢＣＬ１１Ａ発現を向上させ、ひいてはＨｂＦ発現を抑制する。イントロン２は複数のＤＮアーゼ高感受性部位（ＤＨＳ）を含有し、これには転写開始点からのキロベースの距離に基づき＋５５、＋５８、及び＋６２と呼ばれる部位が含まれる。ＢＣＬ１１Ａの転写制御配列に対する欠失、修飾、または不活性化を行うための様々な編集戦略が以下で論じられる。この領域中の天然ＳＮＰが、ＢＣＬ１１Ａ発現の減少や胎児Ｈｂレベルの増加と関連付けられている（Ｏｒｋｉｎｅｔａｌ．２０１３ＧＷＡＳｓｔｕｄｙ）。このＳＮＰは、３つのＤＮＡ高感受性部位、＋５５ＤＨＳ、＋５８ＤＨＳ、及び＋６２ＤＨＳの周囲で編成されている。３つの領域のうち、＋５８ＤＨＳ領域は、胎児Ｈｂレベルの増加に関連した主要な領域であるように思われ、またＧＡＴＡ１転写制御領域も有する。

治療アプローチ

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＢＣＬ１１Ａの転写制御配列のセグメントを欠失させるのに使用することができ、これは直接、または複数の位置を標的とする１つのｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡによる切断を通じて１つのｇＲＮＡスプライスドナー部位もしくはアクセプター部位を変更することによって行う。

また、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、修飾または不活性化を行うこともでき、これは改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを挿入することによって行う。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）による修飾または不活性化に用いるドナーは、アニーリングを可能にするための小型または大型の相同アームが隣接するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有する。本質的にはＨＤＲは、ＤＳＢ修復の間、供給される相同のＤＮＡ配列をテンプレートとして使用するエラーフリー機構である。相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、転写制御配列と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位または近くにある標的部位を選ぶことが重要である。テンプレートは相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、またはゲノム配列とは異なる配列を含有してもよく、このようにして配列編集が可能になる。

ＮＨＥＪまたはＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に欠失、修飾、または不活性化を行うことに加えて、他にも様々な選択肢が考えられる。小さなまたは大きな欠失が存在する場合、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有するｃＤＮＡをノックインすることができる。全長ｃＤＮＡのノック先を、好適な調節配列を伴ってまたは伴わずに、任意の「セーフハーバー」に、すなわちＢＣＬ１１Ａ遺伝子そのものではない有害性のない挿入ポイントにすることができる。このコンストラクトをＢＣＬ１１Ａ調節エレメント付近にノックインする場合、当該コンストラクトは正常な遺伝子と同様の生理的制御を有するべきである。２つ以上（例えば、１対）のヌクレアーゼを使用して転写制御配列領域の欠失を行ってもよいが、機能の修飾または不活性化を行うには通常はドナーが提供されなければならない。この場合、２つのｇＲＮＡ及び１つのドナー配列が供給されることになる。

本明細書では、ゲノム操作ツールを用いて、下記を行うことによって永続的な変化をゲノムに創出する細胞のｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの方法が提供される：１）ＮＨＥＪ経路によって生じる欠失により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、２）ＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、３）転写制御配列の少なくとも一部の欠失、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡを遺伝子座位もしくはセーフハーバー座位にノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム座位の中またはその付近で、転写制御配列に対する永続的な欠失、挿入、または編集を行う。このようにして、本開示で示す例は、（患者の一生にわたって有望な療法を送達するのではなく）単回処置または限られた回数の処置で、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する欠失、修飾、または不活性化を行う一助になり得る。

本明細書では、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置する方法が提供される。このような方法の一態様は、ｅｘｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が創出され得る。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。次に、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させることができる。最後に、この造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。

このような方法のまた別の態様は、ｅｘｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、患者から間葉系幹細胞が単離され得るが、この間葉系幹細胞は患者の骨髄または末梢血から単離することができる。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの間葉系幹細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。次に、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させることができる。最後に、この造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。

このような方法のさらなる一態様は、ｅｘｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、造血前駆細胞が患者から単離され得る。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。最後に、ゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。

ｅｘｖｉｖｏの細胞療法アプローチにおける１つの利点は、治療薬の包括的な解析を行ってから投与することができる点である。ヌクレアーゼベースの治療薬は、一定レベルのオフターゲット作用を有し得る。ｅｘｖｉｖｏで遺伝子修正を実施することにより、修正された細胞集団の特性決定を実施してから植え込むことができる。本開示は、修正された細胞のゲノム全体をシークエンシングして、オフターゲット作用が存在する場合、それが患者に対する最小のリスクと関連するゲノム位置に存在できるように保証することを含む。さらに、クローン集団を含めた特定の細胞集団は、植え込みの前に単離され得る。

ｅｘｖｉｖｏの細胞療法における別の利点は、他の初代細胞源と比較してのｉＰＳＣの遺伝子修正に関する。ｉＰＳＣは増殖性が高いため、細胞ベース療法に必要となる多数の細胞を容易に得ることができる。さらに、ｉＰＳＣはクローン単離の実施に理想的な細胞タイプである。このため、生存率低下のリスクを伴うことなく正しいゲノム修正についてスクリーニングすることができる。これに対し、他の初代細胞の生存率はわずか数継代に過ぎず、クローン拡大が困難である。したがって、ヘモグロビン異常症の処置向けのｉＰＳＣ操作ははるかに容易であり、所望の遺伝子修正を行うために必要な時間を短縮することができる。

ｅｘｖｉｖｏの療法において、植え込みを行うには、移植する骨髄微小環境またはドナーＨＳＣのクリアランスが必要である。現状の方法は、放射線照射及び／または化学療法に依存している。これらによる制約のため、より安全な条件付けのレジメンがこれまでに開発され、現在も開発中であるが、例としては、造血細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１１７、ｃ−ｋｉｔなど）に向けられた抗体または抗体毒素複合体による骨髄細胞の免疫枯渇がある。ＨＳＣ移植が成功するかは、骨髄への効率的なホーミング、次に行う移植、及び骨髄の再増殖によって決まる。ゲノム編集された細胞が移植されるレベルは、細胞の多系列移植の能力が重要であるのと同じように重要である。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、修正された細胞の供給源を持続させるため、ｅｘｖｉｖｏの遺伝子療法において重要な標的である。処置されたＣＤ３４＋細胞は、患者に戻されることになる。

諸方法は、ｉｎｖｉｖｏベース療法も含み得る。患者内の細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集される。当該細胞は、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞とすることができる。

血球は、ｅｘｖｉｖｏの処置及び治療に対する魅力的な標的を提示するが、送達の有効性を増大させることで、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／または他のＢ及びＴ細胞前駆体（例えば、ＣＤ３４＋細胞）に対し直接ｉｎｖｉｖｏで送達できるようになり得る。理想的には、標的化及び編集は関連細胞に向けられる。他の細胞における切断は、ある特定の細胞及びまたは発生段階でのみ活性を有するプロモーターを使用することで防止することもできる。追加のプロモーターは誘導的であるため、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合は時間的に制御することができる。送達されたＲＮＡ及びタンパク質が細胞内にとどまる時間は、半減期を変えるために加える処置またはドメインを用いて調整することもできる。ｉｎｖｉｖｏの処置は複数の処置ステップを減らすことになるが、送達率がより低いと編集率をより高くする必要が生じ得る。ｉｎｖｉｖｏの処置は、ｅｘｖｉｖｏの処置及び移植からの問題や損失を減らし得る。

ｉｎｖｉｖｏの遺伝子療法の利点は、治療薬の生成及び投与の容易さであり得る。同じ治療アプローチ及び療法が、２人以上の患者（例えば、同じまたは類似の遺伝型またはアレルを共有する複数の患者）の処置に使用される可能性を有することになる。これに対し、ｅｘｖｉｖｏの細胞療法は、典型的には患者自身の細胞を使用する必要があり、この細胞は単離され、操作され、同じ患者に戻される。

また本明細書では、ゲノム編集によって細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための細胞の方法が提供される。例えば、細胞は患者または動物から単離することができる。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。

本明細書で提供される方法は、細胞、ｅｘｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｖｏのいずれの方法であるかにかかわらず、以下のうちの１つまたは組合せを伴い得る：１）ＮＨＥＪ経路によって生じる欠失により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、２）ＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、または３）転写制御配列の少なくとも一部の欠失、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡを、遺伝子座位もしくはゲノム内の異種の位置（例えば、ＡＡＶＳ１などのセーフハーバー部位）にノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う。ＨＤＲ及びノックインの戦略は共に、相同組換え修復（ＨＤＲ）におけるドナーＤＮＡテンプレートを利用する。いずれの戦略におけるＨＤＲも、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによりゲノム内の特定の部位で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことによって達成することができる。

例えば、ＮＨＥＪ戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の少なくとも一部の欠失を伴う可能性があり、これは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つの１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより、あるいは２つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｓｇＲＮＡを用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で２つ以上の１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより行われる。このアプローチは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列向けのｓｇＲＮＡの開発及び最適化が必要となり得る。

例えば、ＨＤＲ戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を伴う可能性があり、これは、細胞のＤＳＢ応答を相同組換え修復に向けるために外来的に導入されたドナーＤＮＡテンプレートの存在下で（ドナーＤＮＡテンプレートは、短い１本鎖オリゴヌクレオチド、短い２本鎖オリゴヌクレオチド、長い１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子であり得る）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つの１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより、あるいは１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｇＲＮＡを用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で２つ以上の１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより行われる。このアプローチは、ｇＲＮＡと、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含むドナーＤＮＡ分子との開発及び最適化が必要となり得る。

例えば、ノックイン戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の上流もしくは当該配列内、またはセーフハーバー部位（例えばＡＡＶＳ１）内を標的とする１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）または一対のｇＲＮＡを用いて、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡをＢＣＬ１１Ａ遺伝子の座位にノックインすることを伴う。ドナーＤＮＡは１本鎖または２本鎖のＤＮＡであり、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む。

上述の戦略（欠失／修飾／不活性化及びノックイン）の利点は、原則的な短期・長期両方における臨床及び実験室の有益作用を含めて類似している。

上に挙げた編集の選択肢に加えて、Ｃａｓ９または類似タンパク質は、エフェクタードメインを、編集用に特定することができる同じ標的部位に、またはエフェクタードメインの範囲内の追加の標的部位に標的化するのに使用することができる。一連のクロマチン改変酵素、メチラーゼまたはデメチラーゼは、標的遺伝子の発現の変更に使用することができる。このようなタイプのエピジェネティック調節は、とりわけ可能性のあるオフターゲット作用が限定されていることから、いくつかの利点を有する。

転写及び翻訳の調節は、細胞のタンパク質またはヌクレオチドと相互作用する複数の異なるクラスの部位を暗示する。しばしば、転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、当該部位の役割を研究する目的での変異または欠失のために標的化され得るが、当該部位は遺伝子発現の変化のためにも標的化され得る。部位は、非相同末端結合ＮＨＥＪまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）による直接的なゲノム編集を通じて付加することができる。ゲノムシークエンシング、ＲＮＡ発現、及び転写因子結合のゲノムワイド研究を多く用いることで、我々は、部位がどのように発生的または時間的な遺伝子調節をもたらすかをますます特定できるようになった。これらの制御システムは、直接的であることもあれば、複数のエンハンサーからの活性の統合が必要となり得る広範な調節を伴うこともある。典型的には、転写因子は長さ６〜１２ｂｐの縮重ＤＮＡ配列に結合する。個々の部位がもたらす低レベルの特異性は、複雑な相互作用及びルールが結合及び機能的結果に関与することを示唆する。縮重性の低い結合部位は、より簡略な調節手段を提供することができる。ゲノム内の類似配列が少なくオフターゲット切断の可能性が低い、より長い配列を特定するように人工転写因子を設計することができる。このようなタイプの結合部位はいずれも、遺伝子調節または発現の変化を可能にするように変異、欠失、または創出も行うことができる（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。ＧＡＴＡ転写因子は、ＧＡＴＡＤＮＡ結合配列に結合する能力を特徴とする転写因子のファミリーである。ＧＡＴＡ結合配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）内に位置する。

このような特徴を有する別のクラスの遺伝子調節領域は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは非コードＲＮＡであり、転写後の遺伝子調節で主要な役割を担う。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳類のタンパク質コード遺伝子の３０％の発現を調節することができる。２本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的かつ強力な遺伝子サイレンシングが発見され、またさらなる低分子非コードＲＮＡも発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングに重要な最も大きなクラスの非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。哺乳類において、ｍｉＲＮＡは最初に長いＲＮＡ転写物として転写されるが、これは別々の転写ユニット、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物であり得る。この長い転写物は１次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、不完全な塩基対合のヘアピン構造を含む。このようなｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ドローシャを伴う核内のタンパク質複合体であるマイクロプロセッサーによって１つ以上のより短いｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断され得る。

ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、２−ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する長さ約７０ヌクレオチドの短いステムループであり、成熟した１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊２本鎖に輸送される。塩基対合の安定性がより低いｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。パッセンジャーガイド鎖（^＊で示す）は機能し得るが、通常は分解する。成熟ｍｉＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中で主に見いだされる標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフにＲＩＳＣを繋留し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ１３６，２１５−２３３（２００９）；Ｓａｊ，Ａ．＆Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２１，５０４−５１０（２０１１））。

ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、及び成長制御において、そして哺乳類及び他の多細胞生物における実質的に全ての生物学的経路において重要であり得る。また、ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御、アポトーシス、及び幹細胞分化、造血、低酸素、筋肉発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製、及び免疫応答にも関与し得る。

１つのｍｉＲＮＡが何百もの異なるｍＲＮＡ転写物を標的とすることができる一方、個々の転写物は多数の異なるｍｉＲＮＡによって標的化され得る。最新のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡが注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは複数の座位によってコードすることができ、そのうちの一部は直列的に共転写されたクラスターから発現され得る。当該機能は、複数の経路及びフィードバック制御を有する複雑な調節ネットワークを可能にする。ｍｉＲＮＡは、これらフィードバック及び調節の回路の一体部分と考えられ、またタンパク質生成を限度内に維持することにより遺伝子発現を調節する一助となり得る（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｈ．＆Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ２４，１３３９−１３４４（２０１０）；Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２７，１−６（２０１４））。

また、ｍｉＲＮＡは、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多数のヒト疾患においても重要であり得る。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調するものである。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究では、ｍｉＲＮＡが免疫応答の調節と結び付けられている（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７，３７６−３８１（２００７））。

また、ｍｉＲＮＡはがんとの強い結び付きがあり、異なるタイプのがんで役割を担っている可能性がある。ｍｉＲＮＡは、複数の腫瘍で下方調節されていることが見いだされている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御及びＤＮＡ損傷応答などの主要ながん関連経路の調節において重要であり得るため、診断に使用することができ、臨床的に標的化することができる。マイクロＲＮＡは血管新生のバランスをきめ細やかに調節することができるため、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験は腫瘍の血管新生を抑制する（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ２８，１０５４−１０６７（２０１４））。

タンパク質コード遺伝子に関して示されたように、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、がんと共に生じるエピジェネティックな変化に供することもできる。多くのｍｉＲＮＡ座位は、ＤＮＡメチル化によって調節の機会を増加させるＣｐＧアイランドと関連する可能性がある（Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｂ．＆Ｌｙｋｏ，Ｆ．ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ６，１００１−１００５（２００７））。多くの研究で、エピジェネティック的にサイレンシングされたｍｉＲＮＡを明らかにするためにクロマチン再形成薬物を用いた処置が使用されてきた。

ＲＮＡサイレンシングにおける役割に加えて、ｍｉＲＮＡは翻訳を活性化することもできる（Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ２７，１−６（２０１４））。これらの部位のノックアウトが標的遺伝子の発現減少をもたらし得る一方で、これらの部位の導入は発現を増加させ得る。

個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性にとって重要であり得るシード配列（マイクロＲＮＡの塩基２〜８）を変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。ＮＨＥＪによる誤修復の前に行われるこの領域内の切断は、標的部位への結合をブロックすることにより、効果的にｍｉＲＮＡ機能を消失させることができる。ｍｉＲＮＡは、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域の特異的標的化によっても阻害され得る。触媒不活性のＣａｓ９もｓｈＲＮＡ発現の阻害に使用することができる（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ４，３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡの標的化に加えて、結合部位にも標的化及び変異を行ってｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止することもできる。

ヒト細胞

本明細書で説明し例示するように、ヘモグロビン異常症の緩和に関して、ゲノム編集の主な標的はヒト細胞である。例えば、ｅｘｖｉｖｏの方法では、ヒト細胞は体細胞であってもよく、体細胞は説明の方法を用いて改変した後に前駆細胞を生じ得る。例えば、ｉｎｖｉｖｏの方法では、ヒト細胞は骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞であってもよい。

患者由来の自己細胞内でゲノム編集を実施することにより、自己細胞は必要とする患者に既に完全に適合しているため、安全に患者に再導入することができる細胞を産生することや、患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態の緩和に有効であり得る細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。

前駆細胞（本明細書では幹細胞とも呼ばれる）は、増殖させることもさらに前駆細胞を生じさせることも可能であり、次にこれらは多数の母細胞を産生することができ、次に母細胞は分化したまたは分化可能な娘細胞を生じることができる。娘細胞自体を、増殖し１つ以上の成熟細胞タイプに分化する後代を産生するように誘導させる一方で親の発生可能性を有する１つ以上の細胞も保持させることができる。そこで「幹細胞」という用語は、特定の状況下でさらに特化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、ある特定の状況下で実質的な分化を伴うことなく増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様において、前駆細胞または幹細胞という用語は、その子孫（後代）が、分化によって、例えば、胚細胞及び胚組織の進行的多様化で生じるように、完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に特化する全般的な母細胞を指す。細胞分化は、典型的には多くの細胞分割を通じて生じる複雑なプロセスである。分化細胞は、自らが多能性細胞由来である多能性細胞に由来してもよい。このような多能性細胞の各々は幹細胞とみなすことができるが、各々が生じ得る細胞タイプの範囲はかなり変動し得る。一部の分化細胞は、発生的可能性がさらに大きい細胞を生じる能力も有する。このような能力は、天然であることもあれば、様々な因子を用いた処置によって人工的に誘導されることもある。多くの生物学的事例において、幹細胞は、２つ以上の異なる細胞タイプの後代を生成することができることから「多能性」である可能性もあるが、このことは「幹細胞性」の要件ではない。

自己再生は、幹細胞におけるもう１つの重要な態様である。理論上、自己再生は２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は非対称的に分割して、一方の娘細胞が幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が何らかの異なる他の特定機能及び表現型を発現することがある。あるいは、集団内の幹細胞の一部が対称的に２つの幹細胞へと分割することがあり、このようにして全体としては集団内の一部の幹細胞が保持され、一方、集団内の他の細胞は分化した後代のみを生じる。概して、「前駆細胞」は、より原始的な（すなわち、発生経路または進行において完全に分化した細胞よりも早期のステップにある）細胞表現型を有する。しばしば、前駆細胞は顕著なまたは非常に高い増殖可能性も有する。前駆細胞は、発生経路に応じて、また細胞が発生し分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞タイプを生じることもあれば、単一の分化細胞タイプを生じることもある。

細胞個体発生の文脈において、「分化した」または「分化させる」という形容詞は相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較対象の細胞よりもさらに発生経路に沿って進行した細胞のことである。したがって、幹細胞は、系列が限定された前駆体細胞（例えば、造血前駆細胞）に分化することができ、次にこの前駆体細胞はさらに経路に沿った他のタイプの前駆体細胞（例えば、造血前駆体）に分化し、次に最終段階の分化細胞（例えば、赤血球）に分化することができるが、この最終段階の分化細胞はある組織タイプで特徴的な役割を担い、さらに増殖する能力を保持することもあれば保持しないこともある。

「造血前駆細胞」という用語は、赤血球系（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）（ＲＢＣ））、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、ならびに樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血球タイプを生じる幹細胞系列の細胞を指す。

「赤血球系列の細胞」とは、接触されている細胞が、赤血球新生を経て、最終分化の際に赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）を形成する細胞であることを指す。このような細胞は、骨髄の造血前駆細胞から生じる。造血前駆細胞は、造血微小環境における特定の成長因子及び他の構成要素の曝露を受けると、一連の中間分化細胞タイプ、赤血球系列の全ての中間体を介し、ＲＢＣに成熟することができる。したがって、「赤血球系列」の細胞は、造血前駆細胞、前赤芽球、前赤血球、赤芽球、後赤血球、網状赤血球、及び赤血球を含む。

造血前駆細胞は、下記の造血前駆細胞に特有の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８１ｏ／−、及びＣ−ｋｉｔ／ＣＤｌ１７＋。本明細書で提供される一部の例において、造血前駆細胞はＣＤ３４＋であり得る。

造血前駆細胞は、患者を顆粒球コロニー刺激因子などの１つ以上の因子を用いて（任意選択でプレリキサフォルと組み合わせて）処置した後に患者から得られる末梢血幹細胞であり得る。ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて豊富化することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に血清フリー培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）内でサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）を用いて刺激することができる。長期移植を改善するために、ＳＲ１及びｄｍＰＧＥ２及び／または他の因子の付加が企図されている。

赤血球系列の造血前駆細胞は、ＣＤ７１及びＴｅｒｌ１９などの赤血球系列に特有の細胞表面マーカーを有し得る。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、修正された細胞の持続的供給源をもたらすため、遺伝子療法の重要な標的であり得る。ＨＳＣは、骨髄系及びリンパ系両系列の血球を生じさせる。成熟血球は有限の寿命を有し、一生を通じて継続的に置き換えられなければならない。血球は多能性ＨＳＣ集団の増殖及び分化によって絶えず生成され、多能性ＨＳＣ集団は自己再生によって補充され得る。骨髄（ＢＭ）は、ヒトにおける主要な血球新生部位であり、造血幹細胞及び造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）の良好な供給源である。ＨＳＰＣは、末梢血（ＰＢ）中にも少数が見いだされ得る。一部の徴候または処置において、ＨＳＰＣの数は増加する。ＨＳＣの後代は段階を通じて成熟し、ＢＣＬ１１Ａを発現する細胞を生じさせるリンパ系前駆細胞を含めた、多分化能の系列決定された後代細胞を産生する。Ｂ細胞前駆体及びＴ細胞前駆体は、再配置の前の段階でこれらを編集され得るようにするためＢＣＬ１１Ａの活性を必要とする２つの細胞集団であるが、前駆体の修正は、修正された細胞の供給源であり続けるという利点を有する。処置された細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）は、患者に戻されることになる。移植のレベルは、ｉｎｖｉｖｏでのＣＤ３４＋注入後の遺伝子編集された細胞に対する細胞の多系列移植能力が重要であり得るのと同じように、重要であり得る。

人工多能性幹細胞

本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣを使用する利点は、当該細胞が、前駆細胞を投与する同じ対象に由来し得ることである。すなわち体細胞は、対象から取得し、人工多能性幹細胞に初期化し、次に対象に投与する前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化させることができる。前駆体は本質的に自己供給源に由来するため、別の対象または別の対象群からの細胞を使用することに比べると、移植拒絶反応またはアレルギー応答のリスクが低減され得る。加えて、ｉＰＳＣを使用することで胚供給源から細胞を得る必要性がなくなる。そのため一態様では、本開示の方法で使用される幹細胞は胚幹細胞ではない。

分化は概して生理的文脈下では非可逆的であるが、近年、体細胞をｉＰＳＣに初期化するいくつかの方法が開発されている。例示的な方法は当業者にとって公知であり、本明細書では下記で簡単に説明する。

「初期化」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更または反転するプロセスを指す。言い換えれば、初期化とは、細胞の分化を逆方向に促進し、より未分化のタイプまたはより原始的なタイプの細胞にするプロセスを指す。多くの初代細胞を培養液中に入れると、完全に分化した特性のいくらかの損失につながり得ることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養することが当該細胞を非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にすることにはならない。分化細胞が多能性に移行するには、培養液中での分化特性の部分的損失をもたらす刺激を超えた初期化刺激が必要である。また、初期化細胞は、培養液中では概して限られた回数の分割しかできない初代細胞の親に比べて、成長可能性を損失することなく継代を延長できるという特徴も有する。

初期化対象の細胞は、初期化する前に部分的に分化していても最終的に分化していてもよい。初期化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態における多能性状態または多分化能状態への完全な復帰を含み得る。初期化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態における未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全または部分的な復帰を含み得る。初期化は、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらす可能性があり、この発現はさらに初期化に寄与する。本明細書に記載のある特定の例において、分化細胞（例えば、体細胞）の初期化により、分化細胞は未分化状態の（例えば、未分化細胞である）様相を呈することができる。得られた細胞は「初期化細胞」または「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）と呼ばれる。

初期化は、細胞分化中に生じる遺伝的パターン、例えば、核酸改変（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティック変化、ゲノムインプリンティングなどにおける少なくとも一部の変更（例えば、逆転）を伴い得る。初期化は、単に、既に多能性を有する細胞における既存の未分化状態を維持することや、既に多分化能を有する細胞（例えば、造血幹細胞）における既存の完全分化未満の状態を維持することとは異なる。また、初期化は、既に多能性または多分化能を有する細胞の自己再生または増殖を促進することとも異なるが、本明細書に記載の組成物及び方法は、一部の例において、このような目的に使用することもできる。

体細胞からの多能性幹細胞の産生に使用され得る多くの方法が、当技術分野で知られている。体細胞を多能性表現型に初期化するこのような方法はいずれも、本明細書に記載の方法での使用に適切であると考えられる。

定義された転写因子の組合せを用いた多能性細胞生成のための初期化方法論を説明してきた。マウス体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの直接的な形質導入により、発生可能性が拡大したＥＳ細胞様細胞に変換することができる。例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉａｎｄＹａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ１２６（４）：６６３−７６（２００６）を参照。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路やエピジェネティックなランドスケープの多くを復元することから、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、全ての多能性に関する標準アッセイ、具体的には、３胚葉における細胞タイプへのｉｎｖｉｔｒｏ分化、奇形腫形成、キメラへの寄与、生殖系列の伝達［例えば、ＭａｈｅｒａｌｉａｎｄＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．３（６）：５９５−６０５（２００８）を参照］、及び４倍体補完法を満たす。

ヒトｉＰＳＣは同様の形質導入方法を用いて得ることができ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの３つの転写因子は多能性を司る転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、ＢｕｄｎｉａｔｚｋｙａｎｄＧｅｐｓｔｅｉｎ，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄ．３（４）：４４８−５７（２０１４）；Ｂａｒｒｅｔｔｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓＭｅｄ３：１−６ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４）；Ｆｏｃｏｓｉｅｔａｌ．，ＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌ４：ｅ２１１（２０１４）；及びこれらの文献内で引用されている文献を参照。ｉＰＳＣの生成は、幹細胞関連の遺伝子をコードする核酸配列を、歴史的にはウイルスベクターを用いて、成人の体細胞に導入することにより達成され得る。

ｉＰＳＣは、最終分化体細胞及び成人の幹細胞または体性幹細胞から産生する、または導き出すことができる。すなわち、非多能性前駆細胞は、初期化によって多能性または多分化能にすることができる。このような場合には、最終分化細胞の初期化に必要な初期化因子と同じ数の初期化因子を含める必要がない可能性がある。さらに、初期化の誘導は、初期化因子の非ウイルス導入により、例えばタンパク質そのものの導入により、または初期化因子をコードする核酸の導入により、または翻訳の際に初期化因子を生成するメッセンジャーＲＮＡの導入により行うことができる（例えば、Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照）。初期化は、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としても知られる）、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、及びＬＩＮ２８を含めた、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せの導入によって達成することができる。本明細書に記載の方法及び組成物を用いた初期化は、さらに、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、及びＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つ以上を体細胞に対し導入することを含み得る。本明細書に記載の方法及び組成物は、さらに、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、及びＫｌｆ４の各々のうちの１つ以上を初期化向けに導入することを含み得る。上で注記したように、初期化に使用する厳密な方法は、本明細書に記載の方法及び組成物に必ずしも決定的なものではない。ただし、初期化細胞から分化した細胞を、例えばヒトの治療で使用する場合、一態様において当該初期化はゲノムを変更する方法によって行われない。したがってこのような例において、初期化は、例えばウイルスまたはプラスミドのベクターを使用することなく、達成することができる。

開始細胞集団から導き出す初期化の効率（すなわち、初期化細胞の数）は、Ｓｈｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ−ＳｔｅｍＣｅｌｌ２：５２５−５２８（２００８）；Ｈｕａｎｇｆｕｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２６（７）：７９５−７９７（２００８）、及びＭａｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ−ＳｔｅｍＣｅｌｌ３：１３２−１３５（２００８）により示されるように、様々な薬剤、例えば低分子の添加によって向上させることができる。したがって、人工多能性幹細胞生成の効率または速度を向上させる薬剤または薬剤の組合せは、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの生成で使用することができる。初期化効率を向上させる薬剤の一部の非限定的な例としては、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ条件培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、及びトリコスタチン（ＴＳＡ）が特に挙げられる。

初期化を向上させる薬剤におけるその他の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）、ＨＣトキシン、ヌルスクリプト（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニル酪酸塩（例えば、フェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰＡ）及び他の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）及びＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１及びＣＨＡＰ５０。初期化を向上させる薬剤としては、例えば、ＨＤＡＣの優性阻害型（例えば、触媒不活性型）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤、及びＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、ＭｅｒｃｋＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＧｌｏｕｃｅｓｔｅｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＴｉｔａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、及びＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手可能である。

本明細書に記載の方法と共に使用する多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンに対し、幹細胞マーカーの発現を試験することができる。体細胞由来の細胞内でこのような発現があれば、当該細胞は多能性幹細胞として特定される。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔ１、Ｅｓｇ１、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、及びＮａｔ１を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ある場合において、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は多能性であるものとして特定される。このようなマーカーの発現を検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ及びコードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析）が挙げられ得る。検出は、ＲＴ−ＰＣＲを伴うだけではなく、タンパク質マーカーの検出も含み得る。細胞内マーカーはＲＴ−ＰＣＲ、または免疫組織化学検査などのタンパク質検出法によって最もよく特定することができ、一方、細胞表面マーカーは、例えば免疫組織化学検査によって容易に特定される。

単離された細胞の多能性幹細胞特性は、３胚葉の各細胞に分化するｉＰＳＣの能力を評価する試験によって確認することができる。一例として、ヌードマウスにおける奇形腫形成は、単離されたクローンの多能特性を評価するのに使用することができる。細胞をヌードマウスに導入し、細胞から生じた腫瘍に組織診断及び／または免疫組織化学検査を実施することができる。例えば、３胚葉全てからの細胞を含む腫瘍の成長は、この細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。

患者特異的ｉＰＳＣの創出

本開示のｅｘｖｉｖｏの方法における一ステップは、患者特異的ｉＰＳ細胞、患者特異的ｉＰＳ細胞、または患者特異的ｉＰＳ細胞株の創出を伴い得る。患者特異的ｉＰＳ細胞の創出については、ＴａｋａｈａｓｈｉａｎｄＹａｍａｎａｋａ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅｅｔａｌ．２００７に記載のように、当技術分野において多くの確立した方法が存在する。例えば、創出するステップは、ａ）患者から体細胞（例えば、皮膚細胞または線維芽細胞）を単離することと、ｂ）多能性細胞になるよう誘導するために、体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入することとを含み得る。多能性関連細胞のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子であってもよい。

患者骨髄の生検または吸引液の実施

生検または吸引液とは、身体から採取された組織または体液の試料のことである。生検または吸引液には多くの様々な種類が存在する。そのほぼ全てが、鋭利な道具を使用して少量の組織を取り出すことを伴う。生検が皮膚または他の敏感な部位である場合、最初に痺れ薬を適用することができる。生検または吸引液は、当技術分野で公知の方法のいずれかに従って実施することができる。例えば、骨髄穿刺液の場合、大型の針を使用して骨盤に侵入させ、骨髄を採取する。

間葉系幹細胞の単離

間葉系幹細胞は、例えば患者の骨髄または末梢血から、当技術分野で公知の任意の方法に従い単離することができる。例えば、骨髄穿刺液をヘパリンと共にシリンジに収集することができる。細胞は洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）で密度勾配遠心分離することができる。血球、肝細胞、間質細胞、マクロファージ、肥満細胞、及び胸腺細胞などの細胞は、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を用いて分離することができる。当該細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）内で培養することができる（ＰｉｔｔｉｎｇｅｒＭＦ，ＭａｃｋａｙＡＭ，ＢｅｃｋＳＣｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９９；２８４：１４３−１４７）。

ＧＣＳＦを用いた患者の処置

任意選択で、患者は、当技術分野で公知の任意の方法に従い、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を用いて処置することができる。ＧＣＳＦはプレリキサフォルと組み合わせて投与されてもよい。

患者からの造血前駆細胞の単離

造血前駆細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって、患者から単離することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて豊富化することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に血清フリー培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）内でサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）を用いて弱く刺激することができる。

ゲノム編集

一般にゲノム編集とは、ゲノムのヌクレオチド配列を改変するプロセスを指し、正確な方法または所定の方法で行われることが好ましい。本明細書に記載のゲノム編集方法の例としては、部位特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム内の正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断することにより、ゲノム中の特定の位置で１本鎖または２本鎖のＤＮＡ切断を創出する方法が挙げられる。このような切断は、近年Ｃｏｘｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２１（２），１２１−３１（２０１５）で概説されているように、相同組換え修復（ＨＤＲ）及びＮＨＥＪなどの天然の内因性細胞プロセスによって修復され得るものであり、また通常はそのように修復される。これら２つの主なＤＮＡ修復プロセスは、代替経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは２本鎖切断から生じたＤＮＡ末端を直接連結するが、時としてヌクレオチド配列の損失または付加を伴い、遺伝子発現を分断するまたは向上させる可能性がある。ＨＤＲは、定義されたＤＮＡ配列を切断ポイントで挿入するためのテンプレートとして、相同配列、すなわちドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内因性ゲノム内に存在してもよい。代替的に、ドナーは外因性核酸であってもよく、例えば、ヌクレアーゼ切断される座位と相同性が高い領域を有し、ただし切断される標的座位に組み込むことができる追加の配列または配列変化（欠失を含む）も含有し得るプラスミド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、またはウイルスであってもよい。第３の修復機構としては、少数の欠失及び挿入が切断部位で起こり得る点において遺伝子的結果がＮＨＥＪと同様のマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）（「代替的ＮＨＥＪ」とも呼ばれる）が考えられる。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用してさらに好ましいＤＮＡ末端修復結果を推進することができ、最近の研究ではこのプロセスにおける分子機構がさらに明らかになっている（例えば、ＣｈｏａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ５１８，１７４−７６（２０１５）；Ｋｅｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）；Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５１８，２５４−５７（２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５２８，２５８−６２（２０１５）を参照）。場合によっては、ＤＮＡ切断部位における潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。

このようなゲノム編集機構の各々は、所望のゲノム変更の創出に使用することができる。ゲノム編集プロセスにおける１つのステップは、変異が意図された部位付近としての標的座位で、１つまたは２つのＤＮＡ切断（後者は２本鎖切断または２つの１本鎖切断として）を創出することであってもよい。これは、本明細書で説明し例示する部位特異的ポリペプチドの使用によって達成することができる。

部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）内に２本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復、すなわち非相同末端結合、または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）、すなわちマイクロホモロジー媒介末端結合）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートの必要なしに、切断された標的核酸を修復することができる。このことにより、時として切断部位における標的核酸内で少数の欠失または挿入（インデル）がもたらされ、遺伝子発現の分断または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、すなわちドナーが利用可能であるときに生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同であり得る配列を含むことができる。姉妹染色分体が修復テンプレートとして細胞に使用されてもよい。ただしゲノム編集の目的においては、修復テンプレートは、外因性核酸（例えば、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸）として供給され得る。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（例えば、導入遺伝子）または改変（例えば、単一または複数の塩基変化または欠失）を相同する隣接領域間に導入して、追加のまたは変更された核酸配列も標的座位に組み込まれるようにしてもよい。ＭＭＥＪは、少数の欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと同様の遺伝子的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進することができる。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。

したがって一部の場合において、相同組換えは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するのに使用することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（またはドナー、もしくはドナー配列、もしくはポリヌクレオチドドナーテンプレート）と称される。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位に天然には存在しない配列であってもよい。

ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、統合、遺伝子修正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子分断、転座、及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非ネイティブ核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的間隔の短回文のリピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ））ゲノム座位は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノム内で見いだすことができる。原核生物において、ＣＲＩＳＰＲ座位は免疫システムの１タイプとして機能する産物をコードして、原核生物をウイルス及びファージなどの外部侵入者から防御する一助となる。ＣＲＩＳＰＲ座位機能には３つの段階が存在する：ＣＲＩＳＰＲ座位への新規配列の統合、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外部侵入者核酸のサイレンシング。５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が特定されている。

ＣＲＩＳＰＲ座位は、「リピート」と呼ばれる複数の短い反復配列を含む。リピートは発現すると２次構造（例えば、ヘアピン）を形成し、及び／または非構造的１本鎖配列を含み得る。通常、リピートはクラスター内に生じ、種間で異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と呼ばれる一意の介在配列によって規則的に間隔が置かれており、その結果、リピート−スペーサー−リピートの座位アーキテクチャーがもたらされる。スペーサーは、既知の外部侵入者配列と同一であるか、高い相同性を有する。スペーサー−リピート単位はｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃrＲＮＡ）をコードし、このｃｒＲＮＡは処理されて成熟形態のスペーサー−リピート単位になる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸の標的化に関与する「シード」またはスペーサー配列を含む（原核生物における天然の形態では、スペーサー配列は外部侵入者核酸を標的化する）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。

また、ＣＲＩＳＰＲ座位は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるバイオジェネシス及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同の２次及び／または３次構造を含む。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡバイオジェネシスは、本質的にトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性のＲＮアーゼＩＩＩによって改変し、次にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイにおけるｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズさせることができる。内因性のＲＮアーゼＩＩＩは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの切断に動員することができる。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼのトリミングに供して成熟ｃｒＲＮＡ形態を生成することができる（例えば、５’トリミング）。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたままでいることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズし得る標的核酸まで複合体を誘導することができる。ｃｒＲＮＡと標的核酸とのハイブリダイズは、標的核酸の切断のためにＣａｓ９を活性化させ得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。本質的に、ＰＡＭは部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と標的核酸との結合を容易にするために不可欠である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）は、さらにＩＩ型Ａ（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ型Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）に細分される。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることが示され、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号では、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにおける多数の例及び応用が提供されている。

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムに対するいくつかの重要な相違点を有する。例えば、Ｃｐｆ１は単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ＩＩ型システムと対照的にｔｒａｃｒＲＮＡが欠如している。実際には、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく成熟ｃｒＲＮＡに処理され得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２〜４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡに処理することができ、各成熟ｃｒＲＮＡは１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで開始し、次に２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。これに対し、ＩＩ型システムにおける成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で開始し、次に約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続き得る。また、Ｃｐｆ１はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用して、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡ（これに対し、ＩＩ型システムではＧリッチＰＡＭは標的ＤＮＡの次に来る）を効率的に切断するようにできる。したがって、ＩＩ型システムがＰＡＭに隣接するポイントで切断するのに対し、Ｖ型システムはＰＡＭから離れたポイントで切断する。加えて、ＩＩ型システムと対照的に、Ｃｐｆ１のＤＮＡ切断は、４または５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有するねじれ形のＤＮＡ２本鎖切断によって行う。ＩＩ型システムは、平滑な２本鎖切断によって切断する。Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムと同様に、予測されたＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインが欠如している点はＩＩ型システムと対照的である。

Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ

例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Ｆｏｎｆａｒａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）の図１にあるＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、多くの書き換えを経てきた。Ｆｏｎｆａｒａ（上記）の図５に、様々な種からのＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列が示されている。

部位特異的ポリペプチド

部位特異的ポリペプチドとは、ＤＮＡ切断のためにゲノム編集で使用されるヌクレアーゼのことである。部位特異的ヌクレアーゼまたはポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡとして、細胞または患者に投与することができる。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈において、部位特異的ポリペプチドはガイドＲＮＡに結合することができ、次にガイドＲＮＡは当該ポリペプチドが導かれる標的ＤＮＡ内の部位を特定する。本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおいて、部位特異的ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼであり得る。

部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含むことができる。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に結合することができる。例えば、リンカーは可動性リンカーを含むことができる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０またはそれ以上の長さのアミノ酸を含む。

天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン、１つのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び１つのＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されているＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。

ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様の折りたたみを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行のβ鎖及び１つのαヘリックスを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、２価のカチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断することができる。

ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲｎアーゼＨ様折りたたみを含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方への作用を含めた多様なセットの核酸ベースの機能に関与する。ＲｎアーゼＨドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、２価のカチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、２本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。

部位特異的ポリペプチドは、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）内に２本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復（ＨＤＲ）、またはＮＨＥＪ、または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）、すなわちマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートの必要なしに、切断された標的核酸を修復することができる。このことにより、時として切断部位における標的核酸内で少数の欠失または挿入（インデル）がもたらされ、遺伝子発現の分断または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、すなわちドナーが利用可能であるときに生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同である配列を含むことができる。姉妹染色分体が修復テンプレートとして細胞に使用されてもよい。ただしゲノム編集の目的においては、修復テンプレートは、外因性核酸（例えば、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸）として供給され得る。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（例えば、導入遺伝子）または改変（例えば、単一または複数の塩基変化または欠失）を相同する隣接領域間に導入して、追加のまたは変更された核酸配列も標的座位に組み込まれるようにしてもよい。ＭＭＥＪは、少数の欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと同様の遺伝子的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進することができる。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。

したがって一部の場合において、相同組換えは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するのに使用することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列）と称される。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位に天然には存在しない配列であってもよい。

部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド［例えば、ＵＳ２０１４／００６８７９７の配列番号８またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，３９（２１）：９２７５−９２８２（２０１１）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９］に対し、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び他の様々な部位特異的ポリペプチドを含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。

部位特異的ポリペプチドは、改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドを含むことができる。改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する変異を含むことができる。改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性を有することができる。改変形態の部位特異的ポリペプチドは、実質的に核酸切断活性を有しない可能性がある。部位特異的ポリペプチドが実質的に核酸切断活性を有しない改変形態であるとき、この部位特異的ポリペプチドは本明細書では「酵素的に不活性」と呼ばれる。

改変形態の部位特異的ポリペプチドは、（例えば、２本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格のうちの１つのみを切断することによって）標的核酸上に１本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導できるような変異を含むことができる。当該変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性をもたらし得る。当該変異は、標的核酸の相補鎖の切断能力を保持し、標的核酸の非相補鎖の切断能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。当該変異は、標的核酸の非相補鎖の切断能力を保持し、標的核酸の相補鎖の切断能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。例えば、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９ポリペプチドにおける残基（例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６）は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように変異させる。変異対象の残基は、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９ポリペプチドにおける残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６に対応し得る（例えば、配列及び／または構造アラインメントによって決定される）。変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが挙げられる。当業者であれば、アラニン置換以外の変異が好適であり得ると認識することになる。

Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｎ８５６Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。１つの実質的に不活性のヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）のニッカーゼバリアントは、ＣＲＩＳＰＲが媒介するゲノム編集の特異性を増加させるのに使用することができる。典型的には、野生型のＣａｓ９は、標的配列内の指定された約２０ヌクレオチドの配列（例えば、内在的ゲノム座位）とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによって誘導される。しかし、ガイドＲＮＡと標的座位との間にいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で必要な相同性の長さが、例えばわずか１３ｎｔの相同性に効果的に低減されることにより、結果的に、標的ゲノム内の別の場所でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び２本鎖核酸切断（オフターゲット切断としても知られる）が生じる可能性が高まる。Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントはそれぞれ１本の鎖しか切断しないため、２本鎖切断を創出するには、１対のニッカーゼが近接して標的核酸の対向鎖上で結合することにより、２本鎖切断の等価物である１対のニックを創出する必要がある。このために求められるのは、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに対し１つ）が、近接して標的核酸の対向鎖上で結合しなければならないということである。この要件は、本質的に、２本鎖切断が生じるのに必要な相同性の最短の長さを倍増するものであり、これによってゲノム内の別の場所で２本鎖切断の事象が生じる可能性は低減され、もし２つのガイドＲＮＡ部位が存在しても、これらが２本鎖切断形成を可能にするほど十分に近接して存在する可能性は低い。当技術分野で説明されているように、ニッカーゼは、ＮＨＥＪに対しＨＤＲを促進するために使用することもできる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通じて、選択された変化をゲノム内の標的部位に導入するのに使用することができる。

企図されている変異としては、置換、付加、及び欠失、またはこれらの任意の組合せが挙げられ得る。当該変異は、変異対象のアミノ酸をアラニンに変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸を非天然のアミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸をアミノ酸ミミック（例えば、ホスホミミック）に変換する。当該変異は、保存的変異であってもよい。例えば、当該変異は、変異対象のアミノ酸を、変異対象のアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体構造、及び／または回転異性体に類似するアミノ酸に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。当該変異は、リーディングフレームのシフト、及び／または未成熟終止コドンの創出を引き起こし得る。変異は、遺伝子の調節領域または１つ以上の遺伝子の発現に作用する座位に対し、変化を引き起こし得る。

部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的化することができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡを標的化することができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的化することができる。

部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非ネイティブ配列を含むことができる（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、核酸結合ドメインと、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができる。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができる。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメインとを含むことができ、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインに対し少なくとも５０％のアミノ酸同一性を備える。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）と、非ネイティブ配列（例えば、核局在化シグナル）または部位特異的ポリペプチドを非ネイティブ配列に結合させるリンカーとを含むことができる。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができ、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含む。

部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができ、ヌクレアーゼドメインの一方はアスパラギン酸１０の変異を含み、及び／またはヌクレアーゼドメインの一方はヒスチジン８４０の変異を含むことができ、当該変異はヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％低減する。

１つ以上の部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ゲノム内の特定の座位に１つの２本鎖切断を共にもたらす２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特定の座位に２つの２本鎖切断を共にもたらすまたは起こす４つのニッカーゼを含むことができる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ゲノム内の特定の座位に１つの２本鎖切断をもたらすまたは起こすことができる。

部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。ＮＬＳは、当技術分野で知られている任意のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ）とすることができる。

ゲノム標的化核酸

本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸中の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列とハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲリピート配列を含むことができる。ＩＩ型システムにおいては、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）においては、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズしてデュプレックスを形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）においては、ｃｒＲＮＡがデュプレックスを形成する。両方のシステムにおいて、このデュプレックスは部位特異的ポリペプチドに結合し、それによってガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは複合体を形成することができる。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの会合によって、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、ゲノム標的化核酸は部位特異的ポリペプチドの活性を向けることができる。

例示的なガイドＲＮＡとしては、配列表における配列番号１〜７１，９４７のスペーサー配列及び配列番号７１，９５０〜７１，９５９のｓｇＲＮＡ配列が挙げられる。当業者が理解するように、各ガイドＲＮＡは、自らのゲノム標的配列に対し相補的なスペーサー配列を含めるように設計することができる。例えば、配列表における配列番号１〜７１，９４７の各スペーサー配列を、（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡに入れてもよい。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）または表１を参照。

ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。

二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含むことができる。

ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含むことができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）をもたらすエレメントを含むことができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含むことができる。

Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を含むことができる。

ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドを超えるスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７〜３０ヌクレオチドの可変長のスペーサー配列を含むことができる（表１参照）。

ｓｇＲＮＡは、例えば表１の配列番号７１，９６１のように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まなくてもよい。ｓｇＲＮＡは、例えば表１の配列番号７１，９６２のように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含むことができる。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つのウラシル（Ｕ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２つのウラシル（ＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３つのウラシル（ＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。

ｓｇＲＮＡは、非改変であっても改変されていてもよい。例えば、改変ｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオアートヌクレオチドを含むことができる。

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用するガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、以下に例示し当技術分野で説明されているように、化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順が継続的に拡大している一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を顕著に上回って増加するにつれて、難易度が高くなる傾向がある。より長いＲＮＡを産生するために用いる１つのアプローチは、共にライゲーションした２つ以上の分子を生成することである。さらに長いＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ）は、より容易に酵素的に産生される。様々なタイプのＲＮＡ改変、例えば、安定性の向上、自然免疫応答の可能性または程度の低減、及び／または当技術分野で説明されているような他の特質を向上させる改変を、ＲＮＡの化学合成及び／または酵素的産生の最中または後に導入することができる。

スペーサー延長配列

ゲノム標的化核酸の一部の例において、スペーサー延長配列は、活性を改変し、安定性を提供し、及び／またはゲノム標的化核酸が改変を行う位置を提供することができる。スペーサー延長配列は、オンもしくはオフターゲット活性または特異性を改変することができる。一部の例において、スペーサー延長配列が提供され得る。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドを超える長さを有することができる。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。スペーサー延長配列は、１０ヌクレオチド長未満であってもよい。スペーサー延長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。スペーサー延長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。

スペーサー延長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含むことができる。当該部分は、核酸標的核酸の安定性を減少または増加させることができる。当該部分は、転写終結セグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。当該部分は、真核生物内で機能することができる。当該部分は、原核生物内で機能することができる。当該部分は、真核生物内及び原核生物内の両方で機能することができる。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性調節及び／または接近可能性調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（例えば、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、トラッキングをもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質に結合部位をもたらす改変または配列（例えば、転写活性化因子、転写制御、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。

スペーサー配列

スペーサー配列は、目的の標的核酸の配列とハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイズによる配列特異的な方法（すなわち、塩基対合）で、標的核酸と相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動し得る。

本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、当該システムで使用するＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸とハイブリダイズするように設計することができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチすることもあればミスマッチを有することもある。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ内で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは標的核酸内で配列５’−ＮＲＧ−３’（式中、ＲはＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎはスペーサー配列に標的化された標的核酸配列の３’のすぐ近くにある）を含むＰＡＭを認識する。

標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含むことができる。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸配列は、ＰＡＭにおける第１のヌクレオチドの５’のすぐ近くに２０塩基を含むことができる。例えば、

（配列番号７１，９４８）を含む配列において、標的核酸はＮに対応する配列を含むことができる（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、下線付きのＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである）。

標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有することができる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔとすることができる。一部の例において、スペーサー配列は２０ヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、スペーサーは１９ヌクレオチドを含むことができる。

一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の最も５’側にある連続した６ヌクレオチドについて１００％である。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、連続した約２０ヌクレオチドについて少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチドだけ相違することがあり、これはバルジ（単数または複数）として考えられ得る。

スペーサー配列は、コンピュータープログラムを用いて設計または選択することができる。コンピュータープログラムは、予測融解温度、２次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノム文脈、クロマチン接近可能性、ＧＣ％、ゲノム出現頻度（例えば、同一の配列、または類似するがミスマッチ、挿入、もしくは欠失の結果１つ以上のスポットで異なる配列について）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、参照ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列であり得る。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内で最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、デュプレックス、すなわち塩基が対合した二本鎖構造を形成することができる。共に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を備えることができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、最大で約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を備えることができる。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の例において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ９ヌクレオチド長であってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ１２ヌクレオチド長であってもよい。

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドについて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドについて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であってもよい。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列であり得る。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内で最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含むことができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、デュプレックス、すなわち塩基が対合した二本鎖構造を形成することができる。共に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズすることができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的であることができる。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さであってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチド長であってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（上記）に記載のｔｒａｃｒＲＮＡｎｔ２３〜４８からなっていてもよい。

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であってもよい。

最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、二重らせんを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。

デュプレックスは、ミスマッチを含み得る（すなわち、デュプレックスの２本鎖は１００％相補的ではない）。デュプレックスは、少なくとも約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含み得る。デュプレックスは、最大で約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含み得る。デュプレックスは、２つ以下のミスマッチを含み得る。

バルジ

一部の場合において、最小ＣＲＩＳＰＲＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスに「バルジ」が存在することがある。バルジとは、デュプレックス中のヌクレオチドにおける対合していない領域のことである。バルジは、デュプレックスが部位特異的ポリペプチドと結合する一助となり得る。バルジは、デュプレックスの一方の側に対合していない５’−ＸＸＸＹ−３’（式中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは対向鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成することができるヌクレオチドを含む）と、デュプレックスの他方の側に対合していないヌクレオチド領域とを含むことができる。デュプレックスの２つの側における対合していないヌクレオチドの数は異なり得る。

一例において、バルジは、対合していないプリン（例えば、アデニン）をバルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に含むことができる。一部の例において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の対合していない５’−ＡＡＧＹ−３’を含むことができ、式中、Ｙは最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成することができるヌクレオチドを含む。

デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１、２、３、４、または５、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの対合していないヌクレオチドを含むことができる。

デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、第２の側（例えば、デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）のバルジは、４つの対合していないヌクレオチドを含むことができる。

バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対合を含むことができる。一部の例において、バルジは、最大で１つのゆらぎ対合を含むことができる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含むことができる。

ヘアピン

様々な例において、１つ以上のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内で最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対し３’側に位置することができる。

ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列のデュプレックスにおける最後の対合ヌクレオチドから３’側の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始することができる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列のデュプレックスにおける最後の対合ヌクレオチドの３’側の最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始することができる。

ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。ヘアピンは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。

ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含むことができる。

ヘアピンは、デュプレックスヌクレオチド（すなわち、ヘアピン内の共にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含むことができる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピンデュプレックス内に、ＧＧジヌクレオチドとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含むことができる。

ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。

一部の例では２つ以上のヘアピンが存在し、他の例では３つ以上のヘアピンが存在する。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有することができる。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対し、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であってもよい。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上のデュプレックス領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズ領域）を含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つのデュプレックス領域を含むことができる。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ステムループ構造は、機能的部分を含むことができる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、及びエキソンを含むことができる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含むことができる。一部の例において、Ｐドメインはヘアピン内の２本鎖領域を含むことができる。

ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列

ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイドの文脈にあるか二重分子ガイドの文脈にあるかにかかわらず提供することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約２０〜約５０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０ヌクレオチド長未満を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。

ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含むことができる。この機能的部分は、転写終結セグメント（すなわち、転写終結配列）を含むことができる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有することができる。機能的部分は、真核細胞内で機能することができる。機能的部分は、原核細胞内で機能することができる。機能的部分は、真核細胞内及び原核細胞内の両方で機能することができる。

好適なｔｒａｃｒＲＮＡ延長機能的部分の非限定的な例としては、ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性調節及び／または接近可能性調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、トラッキングをもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質に結合部位をもたらす改変または配列（例えば、転写活性化因子、転写制御、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、プライマー結合部位または分子指標（例えば、バーコード配列）を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１つ以上のアフィニティータグを含むことができる。

単一分子ガイドリンカー配列

単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（上記）では、シンプルな４ヌクレオチドの「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することができる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。

リンカーは様々な配列のいずれも含むことができるが、一部の例において、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的な広範な領域を有する配列は、ガイドの他の機能的領域を妨害し得る分子内結合を引き起こす可能性があり、リンカーはこのような配列を含まないことになる。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（上記）では、シンプルな４ヌクレオチドの配列−ＧＡＡＡ−が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２））が、より長い配列を含めた他の多く配列も同様に使用することができる。

リンカー配列は、機能的部分を含むことができる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエキソンを含めた１つ以上の特徴を含むことができる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。一部の例において、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。

本開示におけるｅｘｖｉｖｏの方法のステップは、ゲノム操作を用いて患者特異的ｉＰＳＣ細胞を編集することを含むことができる。代替的に、本開示におけるｅｘｖｉｖｏの方法のステップは、間葉系幹細胞または造血前駆細胞を編集することを含むことができる。同様に、本開示におけるｉｎｖｉｖｏの方法のステップは、ゲノム操作を用いて、ヘモグロビン異常症を有する患者における細胞を編集することを含むことができる。同様に、本開示の細胞の方法におけるステップは、ヒト細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、ゲノム操作によって編集することを含むことができる。

ヘモグロビン異常症を有する異なる患者には、概して、異なる欠失、修飾、または不活性化の戦略が必要となる。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを本開示の方法で使用することができるが、それぞれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは各自の関連ＰＡＭを有し、当該ＰＡＭは疾患特異的であることも疾患特異的でないこともある。例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号１〜２９，４８２で特定されている。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号２９，４８３〜３２，３８７で特定されている。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号３２，３８８〜３３，４２０で特定されている。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号３３，４２１〜３３，８５１で特定されている。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号３３，８５２〜３６，７３１で特定されている。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａＮｏｖｉｃｉｄａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いて標的化するｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号３６，７３２〜７１，９４７で特定されている。

例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、ＮＨＥＪ経路に起因して生じる欠失によって修飾または不活性化を行うことができる。ＮＨＥＪは遺伝子、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のセグメントを欠失させるのに使用することができ、これは直接、または複数の位置をターゲットとする１つのｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡによる切断を通じて１つのｇＲＮＡスプライスドナー部位もしくはアクセプター部位を変化させることによって行う。

また、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、修飾または不活性化を行うこともでき、これは改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを挿入することによって行う。例えば、ＨＤＲによる修飾または活性化に用いるドナーは、アニーリングを可能にするための小型または大型の相同アームが隣接するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有する。本質的にはＨＤＲは、ＤＳＢ修復の間、供給される相同のＤＮＡ配列をテンプレートとして使用するエラーフリー機構である。相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、転写制御配列と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位または最も近くにある標的部位を選ぶことは重要である。テンプレートは相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、またはゲノム配列とは異なる配列を含有してもよく、このようにして配列編集が可能になる。

ＮＨＥＪまたはＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾、または不活性化を行うことに加えて、他にも様々な選択肢が考えられる。小さなまたは大きな欠失が存在する場合、改変転写制御配列を含有するｃＤＮＡをノックインすることができる。全長ｃＤＮＡを任意の「セーフハーバー」内にノックインすることもできるが、供給されたプロモーターまたは他のプロモーターを使用しなければならない。このコンストラクトを正しい位置内にノックインする場合、当該コンストラクトは正常な遺伝子と同様の生理的制御を有することになる。ヌクレアーゼの対を使用して遺伝子領域の欠失を行ってもよいが、機能の修飾または不活性化を行うには通常はドナーが提供されなければならない。この場合には、２つのｇＲＮＡ及び１つのドナー配列が供給されることになる。

一部のゲノム操作戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の少なくとも一部の欠失を行うことにより、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを、相同組換え修復（ＨＤＲ）（相同組換え（ＨＲ）としても知られる）によって対応遺伝子の座位またはセーフハーバー座位にノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の修飾または不活性化を行うことを伴う。この戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行い、疾患状態を反転、処置、及び／または軽減することができる。転写制御配列に対する修飾／不活性化を行うためのドナーヌクレオチドは小さい（＜３００ｂｐ）ことが多い。ＨＤＲ効率はドナー分子のサイズと反比例し得るため、このことは有利である。また、ドナーテンプレートが、サイズ制約があるがドナーテンプレート送達に有効な手段であることが示されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子に適合し得ることも予想される。

相同組換え修復は、２本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲには、１本鎖アニーリング及び代替ＨＤＲを含めた追加の経路が存在する。ゲノム操作ツールによって、研究者が細胞の相同組換え経路を操作して、ゲノムに対し部位特異的改変を創出することが可能になる。細胞がトランスで提供される合成ドナー分子を用いて２本鎖切断を修復できることが分かっている。そのため、特定の変異付近で２本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することにより、ゲノム内で標的変化を施すことができる。特異的切断は、ＨＤＲの比率を、相同ドナーのみを受け取った場合の１０^６細胞中１という比率よりも１，０００倍超増加させる。特定のヌクレオチドにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、切断部位への距離の関数であるため、重複する標的部位または最も近くにある標的部位を選ぶことが重要である。ｉｎｓｉｔｕでの修正は残りのゲノムを安定した状態にしておけるため、遺伝子編集は遺伝子付加に対する優位性をもたらす。

ＨＤＲによる編集向けに供給されるドナーは著しく多様であるが、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするための小型または大型の隣接する相同アームを有する意図された配列を含有することができる。導入される遺伝子変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下であっても、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有することができる数キロベースという大きなカセットであってもよい。１本鎖及び２本鎖両方のオリゴヌクレオチドドナーが使用されている。これらのオリゴヌクレオチドのサイズは１００ｎｔ未満から何ｋｂ超にも及ぶが、それよりも長いｓｓＤＮＡも産生及び使用され得る。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含めた２本鎖ドナーを使用することができる。概して、ＡＡＶベクターがドナーテンプレートの送達に非常に有効な手段であり得ることが分かっているが、個々のドナーに対するパッケージングの限界は＜５ｋｂとなっている。ドナーの活性転写はＨＤＲを３倍増加させたが、これはプロモーターを含めることで変換が増加し得ることを示している。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。

Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、いずれか一方のヌクレアーゼドメインが不活性化されていることにより１本のＤＮＡ鎖のみを切断するニッカーゼバリアントが存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。ドナーは、１本鎖であっても、ニックであっても、ｄｓＤＮＡであってもよい。

ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼを用いて供給されることもあれば、独立して様々な異なる方法によって、例えばトランスフェクション、ナノ粒子、マイクロ注入、またはウイルス形質導入によって供給されることもある。ＨＤＲ向けドナーの可用性を向上させるために、様々な繋留の選択肢が提案されている。例としては、ドナーをヌクレアーゼに付着させること、付近に結合するＤＮＡ結合タンパク質に付着させること、またはＤＮＡ末端結合または修復に関与するタンパク質に付着させることが挙げられる。

修復経路の選択は、複数の培養条件（例えば、細胞周期に影響を及ぼす条件）によって、またはＤＮＡ修復及び関連タンパク質の標的化によって、誘導することができる。例えば、ＨＤＲを増加させるために、主要なＮＨＥＪ分子、例えばＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶが抑制されてもよい。

ドナーが存在しない場合、１つのＤＮＡ切断における両端または異なる切断からの複数の端部は、いくつかの非相同の修復経路を用いて連結することができ、このときＤＮＡ末端は、接合部に少数の塩基対合を伴うか塩基対合なしで連結する。古典的ＮＨＥＪに加えて、同様の修復機構（例えば、代替的ＮＨＥＪ）が存在する。２つの切断が存在する場合、介在セグメントは欠失または逆転され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部に挿入、欠失、または変異をもたらすことができる。

ＮＨＥＪを使用して、１５ｋｂの誘導性遺伝子発現カセットをヌクレアーゼ切断後のヒト細胞株内の定義された部位に挿入した。Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆Ｙａｎｇ，Ｙ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ２３，５３９−５４６（２０１３）。

ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する部位特異的な遺伝子挿入が行われている。ある特定の状況（場合によってはイントロン／エキソン境界を含む）では、組合せアプローチが適用可能であり得る。イントロン内のライゲーションにはＮＨＥＪが有効であると判明する可能性がある一方、コード領域内ではエラーフリーＨＤＲの方がより適している可能性がある。

さらなる代替として、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡは、対応する遺伝子の座位にノックインするか、またはＡＡＶＳ１などのセーフハーバー部位にノックインすることができる。一部の例において、当該方法は、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡであって、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの一部または全体をノックインするためのポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の組み込みを容易にするために使用することができる、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡを提供することができる。

当該方法は、ｇＲＮＡの対であって、一方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の３’末端で切断し、遺伝子を２回切断することによって欠失をもたらし、この欠失がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列を置き換えるためのポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の挿入を容易にする、ｇＲＮＡの対を提供することができる。切断は、各々がゲノム内でＤＳＢを行う１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、または共にゲノム内でＤＳＢを行う複数のニッカーゼによって、達成することができる。

代替的に、当該方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の周囲で１つの２本鎖切断を行う１つのｇＲＮＡであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列を改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡで置き換えるための、ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の挿入を容易にする、１つのｇＲＮＡを提供することができる。２本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、または共にゲノム内でＤＳＢを行う複数のニッカーゼによって行うことができる。

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中または付近における例示的な改変としては、上記で言及したＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の中または付近で（近接して）の置き換え、例えば、転写制御配列の３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流または下流の領域内での置き換えが挙げられる。

このようなバリアントとしては、問題となる特定の置き換えよりも５’及び／もしくは３’方向に大きな置き換え、またはいずれかの方向での小さな置き換えが挙げられ得る。したがって、特定の置き換えに関する「付近」または「近接」とは、所望の置き換え境界（本明細書ではエンドポイントとも呼ばれる）に関連するＳＳＢまたはＤＳＢ座位が、記載の参照座位から約３ｋｂ未満の領域内であり得ることが意図されている。ＳＳＢまたはＤＳＢ座位はさらに近接して、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内であってもよい。小さな置き換えの場合、所望のエンドポイントは参照座位にあってもそれに「隣接」していてもよく、このことにより、エンドポイントが参照座位から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ〜５ｂｐ未満であり得ることが意図される。

より大きなまたはより小さな置き換えを含む例は、転写制御活性が修飾または不活性化されている限り、同じ利点をもたらすことが予想され得る。したがって、本明細書で説明し例示する置き換えの多くのバリエーションは、ヘモグロビン異常症の緩和に有効であり得ることが予想される。

別のゲノム操作戦略は、エキソンまたはイントロンの欠失を伴う。特定のエキソンまたはイントロンの欠失標的化は、単一の治療カクテルを用いて大きなサブセットの患者を処置するための魅力的な戦略であり得る。欠失は、単一のエキソンまたはイントロンの欠失であることも、複数のエキソンまたはイントロンの欠失であることもある。複数のエキソン欠失は多数の患者に到達し得る一方で、欠失が多い場合については、欠失の効率はサイズ増加に伴って大きく減少する。そのため、欠失の範囲は、４０〜１０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズとすることができる。例えば、欠失は、４０〜１００、１００〜３００、３００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜３，０００、３，０００〜５，０００、または５，０００〜１０，０００塩基対のサイズを範囲とすることができる。イントロンが、転写制御エレメント（例えば、転写因子結合部位）などの調節エレメントを含有する場合、イントロンを欠失させることが望ましいことがある。

欠失後にｐｒｅ−ｍＲＮＡが適切に処理されることを保証するために、周囲のスプライシングシグナルを除去することができる。スプライシングドナー及びアクセプターは、概して、近隣イントロンの１００塩基対以内である。そのため、一部の例において、方法は、目的の各エキソン／イントロン接合部についておよそ＋／−１００〜３１００ｂｐを切断する全てのｇＲＮＡを提供することができる。

ゲノム編集戦略のいずれについても、ゲノム編集はシークエンシングまたはＰＣＲ解析によって確認することができる。

標的配列の選択

特定の参照座位に対する５’境界及び／または３’境界の位置のシフトを使用して、特定のゲノム編集応用を容易にするまたは向上させることができ、このシフトは部分的には当該編集向けに選択されるエンドヌクレアーゼシステムに依存し、これについて本明細書でさらに説明し例示する。

このような標的配列の選択における第１の非限定的な例において、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、切断における潜在的標的部位の初期選択を誘導することができる規則または基準（例えば、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型またはＶ型のエンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件）を有する。

標的配列の選択または最適化についての別の非限定的な例において、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せに関するオフターゲット活性の出現頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位に生じるＤＳＢの出現頻度）は、オンターゲット活性との比較で評価することができる。一部の場合において、所望の座位で正しく編集された細胞は、他の細胞に対し選択優位性を有することができる。選択優位性における例示的、ただし非限定的な例としては、複製率、持続率、ある特定の条件に対する抵抗率の向上、移植の成功率または患者への導入後のｉｎｖｉｖｏ持続率の向上などの特質の獲得、及びこのような細胞の数または生存率の維持または増加に関連する他の特質の獲得が挙げられる。他の場合において、所望の座位で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を特定、ソート、または他の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーニング法によってポジティブに選択され得る。選択優位性及び定方向選択のいずれの方法も、修正に関連する表現型を活用することができる。一部の場合において、細胞は、意図された細胞集団を選択または精製するために使用される新規の表現型を創出する第２の改変を創出するために、２回以上編集することができる。このような第２の改変は、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーのための第２のｇＲＮＡを追加することによって創出することができると考えられる。一部の場合において、細胞は、ｃＤＮＡとさらに選択可能なマーカーとを含有するＤＮＡ断片を用いて、所望の座位で正しく編集することができる。

特定の場合においていずれの選択優位性が適用可能であるかいずれの定方向選択が適用されるべきかにかかわらず、標的配列の選択は、適用の有効性を向上させるために、及び／または所望の標的以外の部位における望ましくない変更の可能性を低減するために、オフターゲットの出現頻度の考慮によっても誘導され得る。本明細書及び当技術分野においてさらに説明及び例示するように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似点及び相違点ならびに使用する特定のエンドヌクレアーゼを含めた複数の因子による影響を受ける可能性がある。オフターゲット活性の予測を支援するバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、しばしばこのようなツールは、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位の特定に使用することもでき、次にこれをオフターゲット対オンターゲット活性の相対的出現頻度を評価するための実験設定で評価することができ、それによって相対的オンターゲット活性がより高い配列を選択することが可能になる。このような技法の例示的な例が本明細書に示され、他の例は当技術分野において公知である。

標的配列の選択における別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同的領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象の焦点として働き得る。このような組換え事象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の正常な複製の途中で、また他の時、例えば２本鎖切断（ＤＳＢ）が修復される場合のようにＤＮＡ配列が合成されている際にも生じ、これは正常な細胞複製の周期中に定期的に生じるが、様々な事象（例えば、ＵＶ光及び他のＤＮＡ切断誘導物質）の発生またはある特定の薬剤（例えば、様々な化学的誘導物質）の存在によっても向上し得る。多くのこのような誘導物質がゲノム内でＤＳＢを無差別に引き起こし、ＤＳＢが正常な細胞内で規則的に誘導され修復され得る。修復の間に、元の配列が完全な忠実さで再構築されることもあるが、一部の場合には小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）がＤＳＢ部位に導入される。

また、ＤＳＢは、本明細書で説明する、選択された染色体位置で定方向または優先的遺伝子改変事象を引き起こすために使用され得るエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の位置で特異的に誘導することもできる。相同配列がＤＮＡ修復（及び複製）の文脈で組換えに供される傾向は、複数の状況で活用することができ、この傾向は、遺伝子編集システムの１つの応用、例えばＣＲＩＳＰＲにとっての基礎となる（ＣＲＩＳＰＲでは、相同組換え修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通じて提供される対象の配列を、所望の染色体位置に挿入する）。

特定の配列間の相同領域（わずか１０以下の塩基対を含み得る小さな「マイクロホモロジー」領域であり得る）を、所望の欠失をもたらすために使用することもできる。例えば、単一のＤＳＢを、付近の配列に対しマイクロホモロジーを呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの正常な修復過程の間に高い出現頻度で生じる結果は、ＤＳＢが容易にする組換え及び同時発生的な細胞修復プロセスの結果としての、介在配列の欠失である。

しかし、一部の状況において、相同領域内での標的配列の選択は、遺伝子融合（欠失がコード領域内の場合）を含めたはるかに大きな欠失をもたらすことがあり、これは特定の状況を仮定すれば望ましいことも望ましくないこともある。

本明細書に示す例は、転写制御タンパク質活性の修飾または不活性化をもたらす置き換えを誘導するように設計されたＤＳＢの創出のための様々な標的領域の選択、そしてオンターゲット事象に対しオフターゲット事象を最小化するように設計されたこのような領域内での特定の標的配列の選択を、さらに例示する。

核酸の改変

一部の場合において、細胞に導入するポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞における活性、安定性、もしくは特異性を向上させ、送達を変更し、自然免疫応答を低減するために、または本明細書でさらに説明する当技術分野で公知の他の向上のために、個々にまたは組み合わせて使用され得る１つ以上の改変を含むことができる。

ある特定の例において、改変ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用することができ、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイド）及び／または細胞に導入するＤＮＡまたはＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、以下で説明及び例示するように改変することができる。このような改変ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム座位を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用することができる。

このような用法の非限定的な例示の目的でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用すると、ガイドＲＮＡの改変は、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドであっても二重分子ガイドであってもよい）及びＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を向上させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変は、さらにまたは代替的に、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動態を向上させるために使用することができ、これは例えばオンターゲット活性を向上させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変は、さらにまたは代替的に、特異性を向上させるために、例えばオンターゲット部位におけるゲノム編集の相対的比率を他の（オフターゲット）部位における影響と比較して向上させるために使用することができる。

改変は、さらにまたは代替的に、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用することができ、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するガイドＲＮＡの耐性を増加させて細胞内の半減期を増加させることによって行われる。ガイドＲＮＡの半減期を向上させる改変は、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞に導入されてエンドヌクレアーゼの産生に翻訳が必要なＲＮＡによって編集される態様においては、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼをコードするのと同時に導入ガイドＲＮＡの半減期を増加させることがガイドＲＮＡ及びコードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの細胞内の共存時間を増加させるために使用され得るため、特に有用であり得る。

改変は、さらにまたは代替的に、細胞に導入されるＲＮＡによる自然免疫応答の誘発の可能性または程度を低下させるために使用することができる。このような応答は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（以下で、そして当技術分野で説明されているように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む）の文脈において十分に特性が明らかになっており、ＲＮＡの半減期低減に及び／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。

１つ以上のタイプの改変は、エンドヌクレアーゼをコードし細胞に導入されるＲＮＡに対しても行うことができ、この改変には、以下に限定されないが、ＲＮＡの安定性を向上させる改変（例えば、細胞内に存在するＲＮアーゼによるＲＮＡ分解を増加することにより行う）、得られた産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を向上させる改変、及び／または細胞に導入されるＲＮＡによる自然免疫応答の誘発の可能性もしくは程度を低下させる改変が含まれる。

改変（例えば上記及びその他）の組合せも同様に使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、１つ以上のタイプの改変を（上記で例示したものを含めて）ガイドＲＮＡに対し行うことができ、及び／または１つ以上のタイプの改変を（上記で例示したものを含めて）ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対し行うことができる。

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用するガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、以下に例示し当技術分野で説明されているように、複数の改変を容易に組み込むことが可能な化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順が継続的に拡大している一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を顕著に上回って増加するにつれて、難易度が高くなる傾向がある。より長い化学的改変ＲＮＡを産生するために用いられ得る１つのアプローチは、共にライゲーションした２つ以上の分子を生成することである。さらに長いＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ）は、より容易に酵素的に産生される。酵素的に産生されたＲＮＡでの使用において利用可能な改変タイプはより少ない一方で、それでもなお、例えば、安定性の向上、自然免疫応答の可能性もしくは程度の低減、及び／または以下で、そして当技術分野でさらに説明される他の特質の向上に使用され得る改変が存在し、新たなタイプの改変が定常的に開発されている。

様々なタイプの改変、特により低分子の化学合成ＲＮＡと共にしばしば使用される改変の例示として、改変は、糖の２’位で改変された１つ以上のヌクレオチド、一部の態様では２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ改変ヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、ＲＮＡ改変は、ピリミジン、脱塩基残基、またはＲＮＡの３’末端にある逆位塩基のリボースに、２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’Ｏ−メチル改変を含むことができる。このような改変は通例的にオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、当該オリゴヌクレオチドは、所与の標的に対し２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、高い標的結合親和性）を有することが示されている。

複数のヌクレオチド及びヌクレオシドの改変において、組み込んだオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化に対する耐性がネイティブなオリゴヌクレオチドよりも高まり、この改変オリゴが非改変オリゴヌクレオチドよりも長期間インタクトのまま残存することが示されている。改変オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、改変骨格、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環の糖間結合を含むものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、特に、ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２、ＣＨ，〜Ｎ（ＣＨ_３）〜Ｏ〜ＣＨ_２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ_２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２、ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２、及びＯ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２骨格（ネイティブなホスホジエステル骨格はＯ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨ，として表される）；アミド骨格［ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒｅｔａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎａｎｄＷｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置き換えられ、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５４，１４９７を参照）を有する。リン含有結合としては、以下に限定されないが、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホナート及びキラルホスホナートを含むメチル及び他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスファート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を有するものが挙げられる；米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号を参照。

モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ＢｒａａｓｃｈａｎｄＤａｖｉｄＣｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ３０，Ｉｓｓｕｅ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）；Ｌａｃｅｒｒａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）；及び１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号で説明されている。

シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチドミメティックは、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。

リン原子を含まない改変ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成されている）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２が混合した構成要素部分を有する他の骨格を含む；米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，６７７，４３９号を参照。

１つ以上の置換された糖部分、例えば以下のうちの１つも２’位に含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ_３ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＮＨ_２、またはＯ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル、またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２；Ｎ_３；ＮＨ_２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチド及び同様の特性を有する他の置換基の薬物動態特性を改善する基。一部の態様において、改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られている））（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）を含む。他の改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。また、同様の改変をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖ミメティックを有することもできる。

いくつかの例において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち、骨格）の両方が新規の基で置き換えることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイズ特性を有することが示されたオリゴヌクレオチドミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格（例えば、アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることができる。核酸塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）で見いだすことができる。

またガイドＲＮＡは、追加的または代替的に、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の改変または置換も含む。本明細書において、「非改変」または「天然」の核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。改変核酸塩基には、天然の核酸では低頻度または過渡的にしか見いだされない核酸塩基が含まれ、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野ではしばしば５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当技術分野で知られている「普遍的な」塩基（例えば、イノシン）も含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸デュプレックスの安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の諸態様である。

改変核酸塩基は、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むことができる。

さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、‘ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａＯｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，８５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈらによる、ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ’，１９９１，３０：６１３頁で開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものを含むことができる。これらの核酸塩基の一部は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及び０−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを構成する。５−メチルシトシン置換は、核酸デュプレックス安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，‘ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、とりわけ２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合には塩基置換の態様となる。改変核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。

したがって、「改変」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、もしくはＢＣＬ１１Ａの転写制御配列に、またはガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる非天然の糖、リン酸塩、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が一様に改変される必要はなく、実際には前述の改変のうちの２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシド内であっても、組み込むことができる。

ガイドＲＮＡ及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、活性、細胞分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞取込みを向上させる１つ以上の部分または結合体に化学的に結合することができる。このような部分は、以下に限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）及びＳｈｅａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］を含む。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号も参照。

糖及び他の部分は、ヌクレオチド（例えば、カチオン性ポリソーム及びリポソーム）を含むタンパク質及び複合体を特定の部位に対し標的化するために使用することができる。例えば、肝細胞に向けた移行は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介され得る。例えば、Ｈｕ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＰｅｐｔＬｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照。当技術分野において公知であり定常的に開発されている他のシステムを使用して、本発明において使用する生体分子及び／またはその複合体を特定の目的の標的細胞に対し標的化することができる。

このような標的化部分または結合体は、官能基（例えば、１級または２級ヒドロキシル基）と共有結合した結合体基を含むことができる。本発明の結合体基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。典型的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。本開示の文脈において薬物力学特性を向上させる基としては、取込みを改善する、分解に対する耐性を向上させる、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイズを強化する基が挙げられる。本発明の文脈において薬物動態特性を向上させる基としては、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。代表的な結合体基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。結合体部分としては、以下に限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、もしくはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号を参照。

化学合成の適用が難しく典型的には酵素的合成によって生成されるより長いポリヌクレオチドも、様々な方法によって改変することができる。このような改変としては、例えば、ある特定のヌクレオチドアナログの導入、分子の５’または３’末端における特定の配列または他の部分の組み込み、及び他の改変が挙げられる。例示として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡはおよそ４ｋｂの長さであり、ｉｎｖｉｔｒｏの転写によって合成することができる。ｍＲＮＡに対する改変は、例えば、その翻訳または安定性を増加させるために（例えば、細胞による分解に対する耐性を増加させることによって）適用することもあれば、ＲＮＡが自然免疫応答（外因的ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするＲＮＡのようなより長いＲＮＡの導入後に、細胞内でしばしば観察される）を誘発する傾向を低減するために適用することもある。

当技術分野では、このような改変が多数説明されており、例えば、ｐｏｌｙＡテール、５’キャップアナログ（例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡｎｔｉＲｅｖｅｒｓｅＣａｐＡｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、改変５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変塩基の使用（例えば、シュード−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート（５−メチル−ＣＴＰ）、もしくはＮ６−メチル−ＡＴＰ）、または５’末端ホスファートを除去するためのホスファターゼによる処理がある。これら及び他の改変は当技術分野において公知であり、新たなＲＮＡ改変が定常的に開発されている。

改変ＲＮＡの供給業者は多数存在し、これにはＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＩｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、その他多数が含まれる。例えば、ＴｒｉＬｉｎｋが説明しているように、５−メチル−ＣＴＰは、ヌクレアーゼの安定性の増加、翻訳の増加、または自然免疫受容体とｉｎｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの、所望の特徴を付与するために使用することができる。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュード−ＵＴＰ及び２−チオ−ＵＴＰは、以下で参照されるＫｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．及びＷａｒｒｅｎｅｔａｌ．による刊行物に例示されているように、培養液中及びｉｎｖｉｖｏで自然免疫応答を低減する一方で翻訳を向上させることが示されている。

ｉｎｖｉｖｏで送達される化学的改変ｍＲＮＡは、治療効果の改善を達成するために使用され得ることが示されている。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９，１５−１５７（２０１１）を参照。このような改変は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、及び／またはその免疫原性を低減するために使用することができる。シュード−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、及び５−メチル−Ｃなどの化学的改変を使用して、ウリジン及びシチジン残基のちょうど４分の１をそれぞれ２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃで置換すると、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介のｍＲＮＡ認識が顕著に低下することがマウスで見いだされている。これらの改変は、自然免疫システムの活性化を低減することにより、ｉｎｖｉｖｏでのｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増加させるために使用することができる。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎｅｔａｌ．（上記）を参照。

また、生得的な抗ウイルス応答を迂回するように設計された改変を組み込む合成メッセンジャーＲＮＡを繰り返し投与することで、分化したヒト細胞が多分化能に初期化されることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照。このような一次的初期化タンパク質として作用する改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞タイプを初期化する効率的な手段であり得る。このような細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５−メチル−ＣＴＰ、シュード−ＵＴＰ及びアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込む酵素的合成ＲＮＡは、細胞の抗ウイルス応答を効果的に避けるために使用することができると思われることが明らかになった。例えば、Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．（上記）を参照。

当技術分野で説明されている他のポリヌクレオチド改変としては、例えば、ｐｏｌｙＡテールの使用、５’キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、または５’末端ホスファートを除去するためのホスファターゼによる処理が挙げられ、新たなアプローチが定常的に開発されている。

本明細書で使用するための改変ＲＮＡの産生に適用可能な複数の組成物及び技法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含めたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の改変との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉によって遺伝子サイレンシングに及ぼす影響が概して一過性であることから反復投与を必要とし得るため、ｉｎｖｉｖｏにおける特定の課題が提示される。加えて、ｓｉＲＮＡは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であるが、哺乳類細胞の免疫反応は、ウイルス感染の副産物であることが多いｄｓＲＮＡを検出し無効化するように進化してきた。このように、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介し得るＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）などの哺乳類酵素及び潜在的レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにこのような分子に応答してサイトカインの誘導を作動させ得るトール様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）が存在する。例えば、Ａｎｇａｒｔｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）；ＪｕｄｇｅａｎｄＭａｃＬａｃｈｌａｎ，ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１９（２）：１１１−２４（２００８）による概説、及びこれらにおける引用文献を参照。

本明細書に記載のように、ＲＮＡ安定性を向上させるため、自然免疫応答を低減するため、及び／またはヒト細胞へのポリヌクレオチド導入との関連で有用であり得る他の利益を達成するために、多種多様な改変が開発され適用されている。例えば、ＷｈｉｔｅｈｅａｄＫＡｅｔａｌ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）；ＧａｇｌｉｏｎｅａｎｄＭｅｓｓｅｒｅ，ＭｉｎｉＲｅｖＭｅｄＣｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａｅｔａｌ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍＣｈａｐｔｅｒ１６：Ｕｎｉｔ１６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８（４）：３０５−１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅｒ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＧｅｎｅｔ３：１５４（２０１２）による概説を参照。

上述のように改変ＲＮＡの供給業者は複数存在し、その多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された改変に特化している。文献で報告された様々な知見に基づく様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ１１：１２５−１４０（２０１２）による報告のように、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために、硫黄（ホスホロチオアート、ＰＳ）による非架橋酸素の置き換えを広範に使用したと言及している。リボースの２’位置の改変は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方でデュプレックス安定性（Ｔｍ）を増加させることが報告されており、また免疫活性化からの保護をもたらすことも示されている。低分子で認容性の高い２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）を用いた適度なＰＳ骨格改変の組合せは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４３２：１７３−１７８（２００４）による報告のように、ｉｎｖｉｖｏでの適用向けに安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており、また２’−Ｏ−メチル改変は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９：１９１−２０２（２００９）による報告のように、安定性の改善に有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を低下させることに関しては、特定の配列を２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで改変すると、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、サイレンシング活性を概ね保つことが報告されている。例えば、Ｊｕｄｇｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）及びＣｅｋａｉｔｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）を参照。追加的な改変、例えば、２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びＮ６−メチルアデノシンが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫作用を最小化することも示されている。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：１６５−１７５（２００５）を参照。

当技術分野でも公知であるように、また市販されているように、細胞による送達及び／または取込みを向上させることができる複数の結合体を、本明細書で使用するポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）に適用することができ、このような結合体としては、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、及びアプタマーが挙げられる。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）による概説、及びその引用文献を参照。

コドン最適化

部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内での発現のために、当技術分野で標準の方法に従ってコドン最適化することができる。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９ポリペプチド生成用にＣａｓ９をコードするヒトのコドン最適化ポリヌクレオチドを使用することが企図される。

ゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体

ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用して、複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。

ＲＮＰ

部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、細胞または患者にそれぞれ別々に投与することができる。その一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のゲノム標的化核酸（ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒にしたｃｒＲＮＡ）と予め複合体化されてもよい。次に予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。ＲＮＰ内の部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとすることができる。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。ＮＬＳは、当技術分野で知られている任意のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ）とすることができる。ＲＮＰ内のゲノム標的化核酸：部位特異的ポリペプチドの重量比は１：１とすることができる。例えば、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。例えば、ｓｇＲＮＡは、配列番号７１，９５９の核酸配列を含むことができ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であってもよく、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。

核酸コードシステムの構成要素

本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子を提供する。

本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含むことができる。

「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントをライゲーションすることができる環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターの場合、追加の核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに統合されて、宿主ゲノムに連動して複製される。

一部の例において、ベクターは、自らが作用可能に結合した核酸の発現を指示することが可能であり得る。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」またはより簡略に「発現ベクター」と呼ばれ、同等の機能を果たす。

「作用可能に連結」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、当該ヌクレオチド配列の発現を可能にするようにして調節配列（複数可）に結合していることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。このような調節配列は当技術分野において周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）で説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及びある特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者であれば、発現ベクターの設計が標的細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解することになる。

企図される発現ベクターとしては、以下に限定されないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づいたウイルスベクター、ならびに他の組換えベクターが挙げられる。真核生物の標的細胞向けに企図される他のベクターとしては、以下に限定されないが、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のベクターが挙げられる。真核生物の標的細胞向けに企図されるさらなるベクターとしては、以下に限定されないが、ｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、及びｐＣＴｘ−３のベクターが挙げられ、これらは図１Ａ〜１Ｃに記載されている。他のベクターも、宿主細胞に適合性である限り使用することができる。

一部の例において、ベクターは１つ以上の転写及び／または翻訳制御エレメントを含むことができる。利用する宿主／ベクターシステムに応じて、複数の好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれか（構成的及び誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む）が発現ベクター内で使用され得る。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活性化する自己不活性化ベクターであり得る。

好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期からのもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期のＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、トリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１座位プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。

Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含めた低分子ＲＮＡの発現に関しては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１を含む）のような様々なプロモーターが有利であり得る。このようなプロモーターについての説明及びその用法を向上するパラメーターは当技術分野において公知であり、追加の情報及びアプローチが定常的に記載されている。例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ − ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照。

発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含有することができる。また発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列も含むことができる。また発現ベクターは、非ネイティブなタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードし、部位特異的ポリペプチドと融合することで融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含むことができる。

プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）であってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）であってもよい。一部の場合において、プロモーターは、空間的制約のある、及び／または時間的制約のあるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞タイプ特異的プロモーターなど）であってもよい。

本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸及び／または部位特異的ポリペプチドは、細胞への送達に用いる送達ビヒクル内に、またはその表面上にパッケージ化することができる。企図される送達ビヒクルとしては、以下に限定されないが、ナノ球体、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられる。当技術分野で説明されているように、このようなビヒクルと所望の細胞タイプまたは位置との優先的相互作用を向上させるために、様々な標的化部分を使用することができる。

本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、結合体化、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって生じ得る。

送達

ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーション、機械力、細胞変形（ＳＱＺＢｉｏｔｅｃｈ）、及び細胞膜透過性ペプチドによって送達することができる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらに代替的な態様において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、単体で、または１つ以上のガイドＲＮＡと共に、もしくはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒の１つ以上のｃｒＲＮＡと共に予め複合体化させて、１つ以上のポリペプチドとして送達することができる。

エレクトロポレーションは、細胞膜の浸透性を増加させて、薬物、核酸（ゲノム標的化核酸）、タンパク質（部位特異的ポリペプチド）、またはＲＮＰなどの物質を細胞に導入できるようにするために、１つ以上の細胞に電場を適用する送達技法である。概して、エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションキュベット内の懸濁細胞の１〜２ミリメートルの距離にわたり数千ボルトを通すことによって機能する（１．０〜１．５ｋＶ、２５０〜７５０Ｖ／ｃｍ）。

ポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、低分子ＲＮＡ結合体、アプタマー−ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ融合タンパク質複合体を含めた非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。一部の例示的な非ウイルス送達ビヒクルは、ＰｅｅｒａｎｄＬｉｅｂｅｒｍａｎ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７−１１３３（２０１１）（他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡ向けの非ウイルス送達ビヒクルに焦点が当てられている）に記載されている。

ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または患者に送達させることができる。

ＬＮＰとは、直径が１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の任意の粒子を指す。代替的に、ナノ粒子のサイズは、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍを範囲とすることができる。

ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性の脂質から作製することができる。膜融合リン脂質ＤＯＰＥまたは膜構成要素コレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を向上させるための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含めることができる。カチオン性脂質の制約としては、安定性が低いこと及び迅速なクリアランスによる有効性の低さ、ならびに炎症応答または抗炎症応答の産生が挙げられる。

また、ＬＮＰは疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質及び親水性脂質の両方から構成されてもよい。

当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組合せをＬＮＰの生成に使用することができる。ＬＮＰの生成に使用する脂質の例としては、以下のものがある：ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。カチオン性脂質の例としては、以下のものがある：９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１。中性脂質の例としては、以下のものがある：ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭ。ＰＥＧ改変脂質の例としては、以下のものがある：ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０。

脂質は、任意の数字のモル比で組み合わせてＬＮＰを生成することができる。加えてポリヌクレオチド（複数可）は、広範囲のモル比で脂質（複数可）と組み合わせてＬＮＰを生成することができる。

先述のように、部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、細胞または患者にそれぞれ別々に投与することができる。その一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒にした１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されてもよい。次に予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。

ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的な相互作用を形成することができる。この特性は、多くの生物学的プロセスで活用されている一方で、核酸リッチな細胞環境では無差別な相互作用のリスクも伴う。この問題への１つの解決法は、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予め複合体化されたリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰのもう１つの利点は、ＲＮＡを分解から保護することである。

ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは改変されても改変されなくてもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは改変されても改変されなくてもよい。多数の改変が当技術分野において公知であり、それらを使用することができる。

エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは、概して１：１のモル比で組み合わせることができる。代替的に、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、概して１：１：１のモル比で組み合わせることができる。ただし、ＲＮＰの生成には広範囲のモル比を使用することができる。

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達に使用することができる。送達するポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むパッケージ化ＡＡＶゲノムが細胞に提供されるｒＡＡＶを生成する技法は、当技術分野では標準的である。ＡＡＶの生成は、典型的には、単一の細胞（本明細書ではパッケージ化細胞を意味する）中に以下の構成要素が存在することが要件となる：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、ｒＡＡＶ内ではない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、また、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からのものであってもよく、これには以下に限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、及びＡＡＶｒｈ．７４が含まれる。シュードタイプｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。表２を参照されたい。

パッケージ化細胞を産生する方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要な構成要素の全てを安定的に発現する細胞株を創出することを伴う。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が欠如したｒＡＡＶゲノムを含む１つのプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーが、細胞のゲノムに統合される。ＡＡＶゲノムの細菌プラスミドへの導入は、例えば、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）などの手順によって行われてきた。次に、パッケージ化細胞株をアデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させることができる。この方法の利点は、細胞が選択可能であることや、ｒＡＡＶの大規模生産に適していることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージ化細胞に導入する。

ｒＡＡＶ生成の全般的な原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）で概説されている。様々なアプローチが以下の文献に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９８８Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌｅｔａｌ．（１９９３）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．（１９９６）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；及び米国特許第６，２５８，５９５号。

ＡＡＶベクター血清型は、標的細胞タイプにマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞タイプは、特に示されるＡＡＶ血清型によって形質導入することができる。表３を参照。

アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターも使用することができる。このようなウイルスベクターとしては、以下に限定されないが、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。

一部の例において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つまたは２つの座位を標的化するｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、それぞれ別々に脂質ナノ粒子に製剤化することができ、あるいは１つの脂質ナノ粒子に同時に製剤化される。

一部の例において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に製剤化することができ、一方ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡはＡＡＶベクターにおいて送達することができる。

Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達する選択肢が利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現させることができ、またはＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡは、その半減期を変更もしくは改善するように、または免疫応答の可能性もしくは程度を低下させるように、化学的に改変することができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化させてから送達することができる。ウイルスベクターは効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９及びＣａｓ９のより小さなオルソログの分割バージョンは、ＨＤＲドナーと同様、ＡＡＶにパッケージ化することができる。これらの構成要素の各々を送達することができる一連の非ウイルス送達方法も存在し、または非ウイルス及びウイルスの方法を同時並行的に用いることができる。例えば、ナノ粒子をタンパク質及びガイドＲＮＡの送達に使用し、一方ＡＡＶをドナーＤＮＡの送達に使用することができる。

遺伝子改変細胞

「遺伝子改変細胞」という用語は、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いて）ゲノム編集によって導入された少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書の一部のｅｘｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変前駆細胞であり得る。本明細書の一部のｉｎｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変造血前駆細胞であり得る。本明細書では、外因的ゲノム標的化核酸及び／またはゲノム標的化核酸をコードする外因的核酸を含む遺伝子改変細胞が企図されている。

「対照処置集団」という用語は、ゲノム編集構成要素の追加以外では、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、ｐＨなどを用いて処置された細胞集団を説明する。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列またはタンパク質発現または活性の修飾または不活性化を測定することができ、例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子タンパク質の転写制御配列に対するウェスタンブロット解析、またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子ｍＲＮＡの転写制御配列の定量化がある。

「単離細胞」という用語は、その細胞が最初に発見された生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞をｉｎｖｉｔｒｏで、例えば定義された条件下でまたは他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、のちに第２の生物に導入するか、または単離元の生物（または由来細胞）に再導入することができる。

細胞における単離集団に関しての「単離集団」という用語は、混合または不均質の細胞集団から取り出し分離された細胞集団を指す。一部の場合において、単離集団は、当該細胞の単離または豊富化を行った不均質の集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団であり得る。一部の場合において、単離集団は、ヒトの前駆細胞の単離集団、例えば、ヒト前駆細胞及びヒト前駆細胞が由来する細胞を含む不均質な細胞集団と比較して、ヒト前駆細胞の実質的に純粋な集団であり得る。

特定の細胞集団に対する「実質的に向上した」という用語は、特定のタイプの細胞の出現率が、例えば、ヘモグロビン異常症改善向けにこのような細胞に所望されるレベルに応じて、既存または基準レベルに対し少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはそれ以上の倍数だけ増加した細胞集団を指す。

特定の細胞集団に対する「実質的に豊富化された」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に対し少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはそれ以上である細胞集団を指す。

特定の細胞集団に対する「実質的に純粋な」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に対し少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、前駆細胞集団に対する「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満の、本明細書における用語によって定義される前駆細胞ではない細胞を含有する細胞集団を指す。

ゲノム編集されたｉＰＳＣの造血前駆細胞への分化

本開示におけるｅｘｖｉｖｏの方法の別のステップは、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。

ゲノム編集された間葉系幹細胞の造血前駆細胞への分化

本開示におけるｅｘｖｉｖｏの方法の別のステップは、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。

患者への細胞植え込み

本開示におけるｅｘｖｉｖｏの方法の別のステップは、細胞を患者に植え込むことを含むことができる。この植え込みステップは、当技術分野で公知の任意の植え込み方法を用いて達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞は、患者の血液に直接注射するか、または別の方法で患者に投与することができる。遺伝子改変細胞は、選択マーカーを用いてｅｘｖｉｖｏで精製することができる。

薬学的に許容される担体

本明細書で企図されている前駆細胞を対象に投与するｅｘｖｉｖｏの方法は、前駆細胞を含む治療組成物の使用を伴い得る。

治療組成物は、細胞組成物と一緒に生理的に認容性の担体と、任意選択で、本明細書に記載の少なくとも１つの追加の生物活性剤とを、活性成分として組成物中に溶解または分散した状態で含有することができる。一部の場合において、治療組成物は、所望されていない限り、治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与された際に実質的に免疫原性ではない。

概して、本明細書に記載の前駆細胞は、医薬的に許容される担体を有する懸濁液として投与することができる。当業者であれば、細胞組成物で使用される医薬的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、保存料、または他の薬剤を含まないことを認識することになる。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の統合性を維持できるようにする浸透圧緩衝液と、任意選択で、細胞生存率を維持するまたは投与時に移植を向上させる栄養素とを含むことができる。このような製剤及び懸濁液は、当業者に公知であり、及び／または、本明細書に記載のように、通常の実験を用いて前駆細胞との使用に適応させることができる。

また、細胞組成物は、乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさないことを条件に、乳化させることもリポソーム組成物として提示することもできる。細胞及び他の任意の活性成分は、医薬的に許容され活性成分に適合性である賦形剤と、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で、混合することができる。

細胞組成物に含まれる追加の薬剤は、中の構成要素の医薬的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成された（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成された）酸付加塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など）、及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）に由来してもよい。

生理的に認容性の担体は当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、活性成分及び水の他に材料を含有しない無菌水性溶液、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、またはその両方（例えば、リン酸緩衝食塩水）を含有する無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は２つ以上の緩衝塩、さらに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、ブドウ糖、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含有することができる。また液体組成物は、水に加えて及び水以外に、液相も含有することができる。このような追加の液相の例示としては、グリセリン、綿実油などの植物油、及び水−油エマルジョンがある。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物で使用する活性化合物の量は、その障害または状態の性質に依存する可能性があり、標準的な臨床技法によって決定され得る。

投与及び有効性

「投与する」「導入する」及び「移植する」という用語は、細胞（例えば、前駆細胞）を対象に配置する文脈で互換的に使用され、所望の効果（複数可）を生じさせるために、所望部位（例えば、損傷または修復の部位）で導入細胞の少なくとも部分的な局在化がもたらされるような方法または経路が用いられる。細胞（例えば、前駆細胞またはその分化した後代）は、植え込まれる細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存できる対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後における細胞の生存期間は、数時間という短期間であることもあれば、例えば、２４時間から数日、さらに数年という長期間であることもあれば、さらに患者の生涯にわたる、すなわち長期移植であることもある。例えば、本明細書に記載の一部の態様において、有効量の筋原性前駆細胞は、全身の投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与される。

「個体」「対象」「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様では、対象は哺乳類である。一部の態様では、対象はヒトである。

予防的に提供される場合、本明細書に記載の前駆細胞は、ヘモグロビン異常症のいずれかの症状の前に、例えば、疲労、息切れ、黄疸、成長の遅れ、思春期の遅発、関節、骨、及び胸部の痛み、脾臓及び肝臓の肥大が発生する前に、対象に投与することができる。したがって、造血前駆細胞集団の予防的投与は、Ｂ−サラセミアまたは鎌状赤血球症などのヘモグロビン異常症の予防に役立つ。

治療的に提供される場合、造血前駆細胞は、ヘモグロビン異常症の症状または徴候の発生時（またはその後）に、例えば、疾患の発症後すぐに提供される。

本明細書に記載の方法に従って投与される造血前駆細胞集団は、１名以上のドナーから得られた同種の造血前駆細胞を含むことができる。「同種」とは、１名以上の同じ種の異なるドナーから得られ、１つ以上の座位における遺伝子が同一ではない造血前駆細胞または造血前駆細胞を含む生物学的試料を指す。例えば、対象に投与される造血前駆細胞集団は、１名以上の非血縁のドナー対象、または１名以上の同一でない同胞に由来してもよい。一部の場合において、同系の造血前駆細胞集団、例えば遺伝子的に同一の動物または同一の双生子から得られた造血前駆細胞集団を使用することができる。造血前駆細胞は自己細胞とすることができる。すなわち、造血前駆細胞は、対象から得られまたは単離されて同じ対象に投与され、すなわち、ドナーとレシピエントが同じである。

「有効量」という用語は、ヘモグロビン異常症における少なくとも１つ以上の徴候または症状の予防または軽減に必要な前駆細胞またはその後代の集団の量を指し、例えばヘモグロビン異常症を有する対象を処置するために、所望の効果の提供に十分な量の組成物に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えばヘモグロビン異常症を有するまたはその危険性がある対象に投与した際に特定の効果を促進するのに十分である、前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。

本明細書に記載の様々な態様での使用において、有効量の前駆細胞は、少なくとも１０^２個の前駆細胞、少なくとも５×１０^２個の前駆細胞、少なくとも１０^３個の前駆細胞、少なくとも５×１０^３個の前駆細胞、少なくとも１０^４個の前駆細胞、少なくとも５×１０^４個の前駆細胞、少なくとも１０^５個の前駆細胞、少なくとも２×１０^５個の前駆細胞、少なくとも３×１０^５個の前駆細胞、少なくとも４×１０^５個の前駆細胞、少なくとも５×１０^５個の前駆細胞、少なくとも６×１０^５個の前駆細胞、少なくとも７×１０^５個の前駆細胞、少なくとも８×１０^５個の前駆細胞、少なくとも９×１０^５個の前駆細胞、少なくとも１×１０^６個の前駆細胞、少なくとも２×１０^６個の前駆細胞、少なくとも３×１０^６個の前駆細胞、少なくとも４×１０^６個の前駆細胞、少なくとも５×１０^６個の前駆細胞、少なくとも６×１０^６個の前駆細胞、少なくとも７×１０^６個の前駆細胞、少なくとも８×１０^６個の前駆細胞、少なくとも９×１０^６個の前駆細胞、またはその倍数を含む。前駆細胞は、１名以上のドナーに由来してもよく、自己供給源から得てもよい。本明細書に記載の一部の例において、前駆細胞は、培養液中で増やしてからそれを必要とする対象に投与することができる。

「投与される」とは、前駆細胞組成物が、所望の部位で少なくとも部分的な当該細胞組成物の局在化をもたらす方法または経路によって、対象に送達されることを指す。細胞組成物は、対象において有効な処置をもたらす、すなわち、投与によって対象内の所望の位置に送達され、送達された組成物の少なくとも一部、すなわち少なくとも１×１０^４細胞が、ある期間の間所望の部位に送達される、任意の適切な経路によって送達され得る。投与様式には、注射、注入、点滴、または摂取が含まれる。「注射」には、以下に限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。一部の例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与を行うことができる。

細胞は全身的に投与することができる。「全身投与」「全身的に投与される」「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、臓器に直接ではない形で前駆細胞集団を投与することを指し、当該投与の結果、前駆細胞集団は、対象の循環系に侵入することにより、代謝及び他の類似プロセスに供される。

ヘモグロビン異常症の処置用の組成物を含む処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。ただし、一例として、機能的ＢＣＬ１１Ａ及び機能的ＨｂＦのレベルのいずれか１つまたは全ての徴候または症状が有益な方法で変更された場合（例えば、ＢＣＬ１１Ａが少なくとも１０％低下し、及び／またはＨｂＦが少なくとも１０％増加した場合）、または疾患における他の臨床的に容認された症状またはマーカーが改善または緩和した場合、処置は「有効な処置」とみなされる。また、有効性は、個体が入院施設で評価された通りに悪化しないことや医療介入を必要としない（例えば、疾患の進行が停止している、または少なくとも遅くなっている）ことによっても測定され得る。これらの指標の測定方法は当業者に公知であり、及び／または本明細書に記載されている。処置には、個体または動物（一部の非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳類が挙げられる）における任意の疾患処置が含まれ、以下のものが挙げられる：（１）疾患の抑制、例えば、疾患の進行の抑止もしくは緩徐化、または（２）疾患の軽減、例えば、疾患の後退をもたらすこと、及び（３）症状が発生する可能性の予防または低減。

本開示による処置は、個体における機能的ＢＣＬ１１Ａの量を低下させ、及び／または機能的ＨｂＦの量を増加させることによって、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の症状を緩和することができる。典型的にヘモグロビン異常症に関連する早期の徴候としては、例えば、疲労、息切れ、黄疸、成長の遅れ、思春期の遅発、関節、骨、及び胸部の痛み、脾臓及び肝臓の肥大が挙げられる。

キット

本開示は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本明細書に記載の方法の諸態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、またはこれらの任意の組合せのうちの１つ以上を含むことができる。

キットは、（１）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクター（複数可）及びまたはポリペプチドを再構成及び／または希釈するための試薬と、を含むことができる。

キットは、（１）（ｉ）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを再構成及び／または希釈するための試薬と、を含むことができる。

上記キットのいずれかにおいて、キットは単一分子ガイドゲノム標的化核酸を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、キットは二重分子ゲノム標的化核酸を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、キットは２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含むことができる。キットは、核酸標的化核酸をコードするベクターを含むことができる。

上記キットのいずれかにおいて、キットは、所望の遺伝子改変をもたらすために挿入されるポリヌクレオチドをさらに含むことができる。

キットの構成要素は、別々の容器に入っていても単一の容器に一緒に入っていてもよい。

上述の任意のキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含むことができ、このような追加の試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからポリペプチドをｉｎｖｉｔｒｏ生成するための試薬、シークエンシング用のＤＮＡアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。また、キットは、オンターゲット結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易にするもしくは向上させるために、または標的化の特異性を改善するために使用され得る、１つ以上の構成要素も含むことができる。

上述の構成要素に加えて、キットは、当該方法の実施のためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。当該方法を実施する説明書は、好適な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷することができる。説明書は、添付文書としてキット内、キットまたはその構成要素の容器のラベル内（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連して）などに存在してもよい。説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど）上に存在する電子記憶データファイルとして存在してもよい。一部の場合において、実際の説明書はキット内に存在するのではなく、（例えば、インターネット経由で）リモートソースから説明書を得る手段が提供されてもよい。この場合の一例としては、説明書を見ることができる、及び／またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットがある。説明書と同様に、説明書を得るこの手段が好適な基材に記録されていてもよい。

ガイドＲＮＡの製剤化

本開示のガイドＲＮＡは、医薬的に許容される賦形剤（例えば、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など）を用いて、特定の投与様式及び剤形に応じて製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、生理的適合性のｐＨを達成するように製剤化することができ、製剤及び投与経路に応じて、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、約ｐＨ３〜約ｐＨ７を範囲とすることができる。一部の場合において、ｐＨは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調整することができる。一部の場合において、当該組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に含むことができる。任意選択で、当該組成物は、本明細書に記載の化合物の組合せを含むことができ、または細菌成長の処置または予防に有用な第２の活性成分（例えば、以下に限定されないが、抗菌剤または抗微生物剤）を含むことができ、または本開示の試薬の組合せを含むことができる。

好適な賦形剤としては、例えば、大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（例えば、以下に限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、以下に限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、以下に限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、以下に限定されないが、油、水、食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられ得る。

考えられる他の治療アプローチ

遺伝子編集は、特定の配列を標的化するように操作されたヌクレアーゼを用いて行うことができる。現時点では、４つの主要なタイプのヌクレアーゼが存在する：メガヌクレアーゼ及びその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステム。ヌクレアーゼプラットフォームは、とりわけＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性がタンパク質−ＤＮＡ相互作用を通じたものである一方で、Ｃａｓ９を主に誘導するのはＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用であることから、設計の難しさ、標的化密度、及び作用様式が様々である。また、Ｃａｓ９切断は隣接モチーフであるＰＡＭも必要とし、ＰＡＭは異なるＣＲＩＳＰＲシステム間で異なる。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９はＮＧＧＰＡＭを用いて切断し、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ、及びＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭをもつ部位で切断し得る。他の複数のＣａｓ９オルソログは、代替ＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的化する。

Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本開示の方法で使用することができる。ただし、本明細書に記載の教示内容（例えば、治療標的部位）は、他の形態のエンドヌクレアーゼ、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、もしくはＭｅｇａＴＡＬへの適用、またはヌクレアーゼの組合せを用いた適用がされ得ると考えられる。しかし、本開示の教示内容をこのようなエンドヌクレアーゼに適用するには、特定の部位に向けられたタンパク質の操作がとりわけ必要になると考えられる。

追加の結合ドメインをＣａｓ９タンパク質と融合させて特異性を増加させることができる。このようなコンストラクトの標的部位は、特定されたｇＲＮＡ指定部位にマッピングするが、例えばジンクフィンガードメインについては、追加の結合モチーフが必要となると考えられる。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合において、メガヌクレアーゼはＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは特異性を増加させ、切断をもたらすことができる。同様に、不活性または死状態のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は切断ドメインと融合させることができ、この融合ＤＮＡ結合ドメインのためのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び隣接する結合部位が必要となり得る。これは、追加の結合部位なしで結合を減少させるには、おそらくは触媒不活性化に加えてｄＣａｓ９のいくらかのタンパク質操作が必要になると考えられる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能することから、ＺＦＮの対は、対向ＤＮＡ鎖上の同族の標的「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に対し、触媒活性のＦｏｋＩ二量体が形成できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのＤＮＡ２本鎖切断がもたらされる。

各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的にはＣｙｓ２−Ｈｉｓ２豊富アーキテクチャーの３〜６つのジンクフィンガーから構成され、各フィンガーは主として標的ＤＮＡ配列の１本鎖上にあるヌクレオチドのトリプレットを認識するが、第４のヌクレオチドとの交差鎖相互作用も重要であり得る。フィンガーのアミノ酸のＤＮＡとの主要な接触を行う位置が変更されると、所与のフィンガーの配列特異性が変更される。このようにして、４フィンガーＺｎフィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識し、このとき標的配列は各フィンガーがもたらすトリプレット選好性が合成されたものであるが、トリプレット選好性は様々な程度で近隣のフィンガーによる影響を受ける可能性がある。ＺＦＮの重要な態様は、単に個々のフィンガーを改変することにより、ほとんどあらゆるゲノムアドレスに対し容易に再標的化できることである。ただし、これを良好に行うためにはかなりの専門的技術が必要となる。ＺＦＮのほとんどの用途において、４〜６フィンガーのタンパク質が使用され、これらはそれぞれ１２〜１８ｂｐを認識する。そのため、典型的には、ＺＦＮの対は半部位間の典型的な５〜７ｂｐのスペーサーを含めない２４〜３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識することになる。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含めたより大きなスペーサーでさらに分離することができる。設計プロセス中に反復配列または遺伝子相同体が除外されるとすれば、この長さの標的配列はヒトゲノム内において一意である可能性がある。それでも、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ相互作用は特異性において絶対的ではないため、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体としての、またはＺＦＮのいずれか一方のホモ二量体としてのオフターゲット結合及び切断事象は生じる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作して「プラス」及び「マイナス」バリアントを創出することによって効果的に取り除くことができる。このバリアントは偏性ヘテロ二量体バリアントとしても知られ、相互にのみ二量体化し、自ら同士では二量体化しない。強制的に偏性ヘテロ二量体にすることで、ホモ二量体の形成が防止される。これはＺＦＮの特異性だけでなく、このＦｏｋＩバリアントを採用する他の任意のヌクレアーゼの特異性も大きく向上させた。

様々なＺＦＮベースシステムが当技術分野で説明されており、その改変が定常的に報告されており、多数の文献がＺＦＮの設計の指針に使用される規則及びパラメーターを記載している。例えば、Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（６）：２７５８−６３（１９９９）；ＤｒｅｉｅｒＢｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．３０３（４）：４８９−５０２（２０００）；ＬｉｕＱｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７（６）：３８５０−６（２００２）；Ｄｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０（４２）：３５５８８−９７（２００５）；及びＤｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６−７８（２００１）を参照。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）

ＴＡＬＥＮはもう１つのフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これを用いると、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに結合し、ＴＡＬＥＮの対が同時並行的に作動して標的化されたＤＮＡ切断を達成する。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質や、関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥタンパク質に由来するが、ＴＡＬＥタンパク質は元々は植物の細菌病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種において説明されていた。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大２０ｂｐの標的ＤＮＡ配列（標的配列の全長は最大４０ｂｐとなる）内で単一の塩基対を認識する。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３にちょうど２つのアミノ酸を含む反復可変２残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもＺＦＮと同様、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は特異性において絶対的ではないため、ＴＡＬＥＮも、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体バリアントの使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。

触媒機能が不活性化されている、ＦｏｋＩドメインの追加のバリアントが創出されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮいずれかの対の半分が不活性のＦｏｋＩドメインを含有する場合、ＤＳＢではなく１本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが標的部位で生じることになる。この結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の「ニッカーゼ」変異体（Ｃａｓ９切断ドメインのうちの１つが不活性化されている）の使用に匹敵するものである。ＤＮＡニックはＨＤＲによるゲノム編集の推進に使用することができるが、ＤＳＢを用いた場合よりも効率は低い。主な利点は、オフターゲットニックは、ＮＨＥＪ媒介の誤修復を被りやすいＤＳＢとは異なり、迅速かつ正確に修復される点である。

様々なＴＡＬＥＮベースシステムが当技術分野で説明されており、その改変が定常的に報告されている。例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０９−１２（２００９）；Ｍａｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３５（６０６９）：７１６−９（２０１２）；及びＭｏｓｃｏｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照。「ゴールデンゲート」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づいたＴＡＬＥＮの使用は、複数のグループによって説明されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（１４）：６３１５−２５（２０１１）；Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＪＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ４１（６）：３３９−４７，Ｅｐｕｂ２０１４Ｍａｙ１７（２０１４）；及びＣｅｒｍａｋＴｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１２３９：１３３−５９（２０１５）を参照。

ホーミングエンドヌクレアーゼ

ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、高い特異性で（しばしばゲノム内で一意の部位で）ＤＮＡを切断する配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥは、構造によって分類される少なくとも６つの既知のファミリーが存在し、これにはＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７１，９４９）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様が含まれ、これらは真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含めた広範囲の宿主に由来する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様、ＨＥは、ゲノム編集の最初のステップとして標的部位でＤＳＢを創出するのに使用することができる。加えて、一部の天然及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの１本鎖のみを切断することにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥは、大きな標的配列やＨＥがもたらす特異性により、部位特異的ＤＳＢの創出において魅力的な候補となっている。

様々なＨＥベースシステムが当技術分野で説明されており、その改変が定常的に報告されている。例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２４（８）：６６３−８０（２０１４）；ＢｅｌｆｏｒｔａｎｄＢｏｎｏｃｏｒａ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１１２３：１−２６（２０１４）；ＨａｆｅｚａｎｄＨａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ５５（８）：５５３−６９（２０１２）による概説、及びこれらの文献内で引用されている文献を参照。

ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ

ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン及び触媒活性ＨＥの融合物を使用し、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性と、ＨＥの切断配列特異性との両方を利用している。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌｅｔａｌ．，ＮＡＲ４２：２５９１−２６０１（２０１４）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｇ３４：１１５５−６５（２０１４）；及びＢｏｉｓｓｅｌａｎｄＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１−９６（２０１５）を参照。

さらなるバリエーションにおいて、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャーは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合物である。２つの活性部位はＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性の付着末端を有する２つのＤＳＢを産生する。例えば、Ｗｏｌｆｓｅｔａｌ．，ＮＡＲ４２，８８１６−２９（２０１４）を参照。本明細書に記載の標的化されたゲノム改変の達成には、他の組合せの既存ヌクレアーゼベースのアプローチが進化し、有用となることが予測される。

ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ

上述のヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性及び機能的特性を組み合わせることで、固有の欠点のいくつかを潜在的に克服し得るゲノム編集へのさらなるアプローチがもたらされる。１つの例として、典型的には、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを創出する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡ（加えて、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９の場合には隣接するＮＡＧまたはＮＧＧＰＡＭ配列における追加の２塩基）とのワトソン・クリック塩基対合を経る、ガイドＲＮＡ内の２０または２４のヌクレオチド配列によって推進される。このような配列はヒトゲノム内で一意となる程度に十分長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的ではなく、特に標的配列の５’半分において顕著な混乱状態が認容され、特異性を推進する塩基の数が事実上低減される。これに対する１つの解決法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒機能を完全に不活性化し（ＲＮＡに誘導されるＤＮＡ結合機能のみ保持し）、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化Ｃａｓ９に融合させることである。例えば、Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ３２：５６９−７６（２０１４）；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７−８２（２０１４）を参照。ＦｏｋＩが触媒活性になるには二量化しなければならないため、２つのＦｏｋＩ融合物を接近状態で繋留して二量体を形成しＤＮＡを切断させるには、２つのガイドＲＮＡが必要となる。これにより、組み合わされた標的部位における塩基の数が本質的に倍増し、よってＣＲＩＳＰＲベースシステムによる標的化の厳密性が上昇する。

さらなる例として、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥ（例えば、Ｉ−ＴｅｖＩ）との融合は、オフターゲット切断がさらに低減され得ることを期待して、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性と、ＨＥの切断配列特異性との両方を利用している。

シークエンシングによるオンターゲット及びオフターゲットの変異検出

オンターゲット部位及び推定上のオフターゲット部位をシークエンシングするため、適切な増幅プライマーが特定され、このプライマーによって反応を設定し、ゲノムＤＮＡは、トランスフェクションから３日後の処理された細胞からＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて回収したものを用いた。増幅プライマーは、アダプターが隣接する遺伝子特異的部分を含有する。フォワードプライマーの５’末端は、改変フォワード（リード１）プライマー結合部位を含む。リバースプライマーの５’末端は、組み合わせられた改変リバース（リード２）及びバーコードプライマー結合部位を逆向きで含有する。個々のＰＣＲ反応は、アガロースゲル上で分離することによって検証され、次に精製し再増幅する。第２ラウンドのフォワードプライマーは、ＩｌｌｕｍｉｎａＰ５配列の次に改変フォワード（リード１）プライマー結合部位の一部を含有する。第２ラウンドのリバースプライマーは、ＩｌｌｕｍｉｎａＰ７配列（５’末端）の次に６塩基バーコードならびに組み合わされた改変リバース（リード２）及びバーコードプライマー結合部位を含有する。第２ラウンドの増幅もアガロースゲル上でチェックし、次に精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量化した。増幅産物をプールして濃度をマッチさせ、次にライブラリー調製及びＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｓｅｑ機器によるシークエンシングのためにＥｍｏｒｙＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＧｅｎｏｍｉｃｃｏｒｅに提出した。

シークエンシングリードをバーコードによって並び替え、次にバイオインフォマティクスにより各産物に与えられた参照配列に対し整列させた。整列させたシークエンシングリードにおける挿入及び欠失の比率を、先述のソフトウェアを用いて推定切断部位の領域内で検出した。例えば、Ｌｉｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４２：７４７３−７４８５（２０１４）を参照。次に、このウィンドウ内で検出した挿入及び欠失のレベルを、模擬トランスフェクション細胞から単離したゲノムＤＮＡの同じ位置で見られたレベルと比較して、シークエンシングアーティファクトの影響を最小化した。

変異検出アッセイ

Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡの組合せにおけるオンターゲット及びオフターゲット切断活性を、ＮＨＥＪによる２本鎖切断の不完全修復から得られる変異率を用いて測定した。

オンターゲット座位の増幅にはＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＨｉｇｈＦｉｄｅｌｔｙ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って４０サイクル（９４℃を３０秒；５２〜６０℃を３０秒；６８℃を６０秒）、１μｌの細胞可溶化物と１μｌのそれぞれ１０μＭの増幅プライマーとを含有する５０μｌ反応液中で行った。製造業者のプロトコルに従ってＴ７ＥＩ変異検出アッセイを実施し［Ｒｅｙｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０：４６０−４６５（２０１２）］、２％アガロースゲル上で消化物を分離し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化した［Ｇｕｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６４９：２４７−２５６（２０１０）］。当該アッセイは、細胞のバルク集団における挿入／欠失（「インデル」）のパーセンテージを測定する。

本発明の方法及び組成物

したがって、本開示は、特に以下の非限定的な発明に関する。第１の方法、方法１において、本開示では、ヒト細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、ヒト細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすステップを含む方法が提供される。

別の方法、方法２において、本開示では、方法１で提供される、ヒト細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、転写制御配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法３において、本開示では、方法１または２で提供される、ヒト細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、転写制御配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法４において、本開示では、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｉＰＳＣのＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させるステップと、造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法が提供される。

別の方法、方法５において、本開示では、方法４で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、創出するステップが、患者から体細胞を単離することと、体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入して、体細胞が多能性幹細胞になるように誘導することと、を含む方法が提供される。

別の方法、方法６において、本開示では、方法５で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、体細胞が線維芽細胞である方法が提供される。

別の方法、方法７において、本開示では、方法５または６で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、多能性関連遺伝子のセットがＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上である方法が提供される。

別の方法、方法８において、本開示では、方法４〜７のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、編集するステップが、ｉＰＳＣに１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含む方法が提供される。

別の方法、方法９において、本開示では、方法４〜８のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、分化させるステップが、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させるために以下：低分子の組合せを用いた処置、主要転写因子の送達、主要転写因子をコードするｍＲＮＡの送達、または転写因子をコードするｍＲＮＡの送達のうちの１つ以上を含む方法が提供される。

別の方法、方法１０において、本開示では、方法４〜９のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、植え込むステップが、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって造血前駆細胞を患者に植え込むことを含む方法が提供される。

別の方法、方法１１において、本開示では、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者から間葉系幹細胞を単離するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または間葉系幹細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるステップと、造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法が提供される。

別の方法、方法１２において、本開示では、方法１１で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、間葉系幹細胞が患者の骨髄または末梢血から単離される方法が提供される。

別の方法、方法１３において、本開示では、方法１１または１２で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、単離するステップが、骨髄の吸引及び密度勾配遠心分離媒体を用いた間葉系細胞の単離を含む方法が提供される。

別の方法、方法１４において、本開示では、方法１１〜１３のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、編集するステップが、間葉系幹細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含む方法が提供される。

別の方法、方法１５において、本開示では、方法１１〜１４のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、分化させるステップが、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるために以下：低分子の組合せを用いた処置、主要転写因子の送達、主要転写因子をコードするｍＲＮＡの送達、または転写因子をコードするｍＲＮＡの送達のうちの１つ以上を含む方法が提供される。

別の方法、方法１６において、本開示では、方法１１〜１５のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、植え込むステップが、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって造血前駆細胞を患者に植え込むことを含む方法が提供される。

別の方法、方法１７において、本開示では、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、患者から造血前駆細胞を単離するステップと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または造血前駆細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、ゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むステップと、を含む方法が提供される。

別の方法、方法１８において、本開示では、方法１７で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、単離するステップの前に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を用いて患者を処置することをさらに含む方法が提供される。

別の方法、方法１９において、本開示では、方法１８で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、処置するステップがプレリキサフォルと組み合わせて実施される方法が提供される。

別の方法、方法２０において、本開示では、方法１７〜１９のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、単離するステップがＣＤ３４＋細胞を単離することを含む方法が提供される。

別の方法、方法２１において、本開示では、方法１７〜２０のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、編集するステップが、造血前駆細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含む方法が提供される。

別の方法、方法２２において、本開示では、方法１７〜２１のいずれか１つで提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｅｘｖｉｖｏの方法であって、植え込むステップが、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによってゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むことを含む方法が提供される。

別の方法、方法２３において、本開示では、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｉｎｖｉｖｏの方法であって、患者の細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するステップを含む方法が提供される。

別の方法、方法２４において、本開示では、方法２３で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｉｎｖｉｖｏの方法であって、編集するステップが、細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含む方法が提供される。

別の方法、方法２５において、本開示では、方法２３または２４で提供される、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置するためのｉｎｖｉｖｏの方法であって、細胞が骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞である方法が提供される。

別の方法、方法２６において、本開示では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、これらの相同体、これらの天然分子の組換え、これらのコドン最適化、またはこれらの改変バージョン、及びこれらの組合せである、方法１、８、１４、２１、及び２４のいずれか１つに記載の方法が提供される。

別の方法、方法２７において、本開示では、方法２６で提供される方法であって、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む方法が提供される。

別の方法、方法２８において、本開示では、方法２６または２７で提供される方法であって、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含む方法が提供される。

別の方法、方法２９において、本開示では、方法２７または２８で提供される方法であって、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡが、１つ以上の改変ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変ＲＮＡである方法が提供される。

別の方法、方法３０において、本開示では、方法２６で提供される方法であって、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが１つ以上のタンパク質またはポリペプチドである方法が提供される。

別の方法、方法３１において、本開示では、方法３０で提供される方法であって、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法３２において、本開示では、方法３１で提供される方法であって、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドが、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法３３において、本開示では、方法３１〜３２のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＮＬＳがＳＶ４０ＮＬＳである方法が提供される。

別の方法、方法３４において、本開示では、方法１〜３３のいずれか１つで提供される方法であって、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含む方法が提供される。

別の方法、方法３５において、本開示では、方法３４で提供される方法であって、１つ以上のｇＲＮＡが単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である方法が提供される。

別の方法、方法３６において、本開示では、方法３４または３５で提供される方法であって、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである方法が提供される。

別の方法、方法３７において、本開示では、方法３６で提供される方法であって、１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む方法が提供される。

別の方法、方法３８において、本開示では、方法３７で提供される方法であって、改変ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列である方法が提供される。

別の方法、方法３９において、本開示では、方法３４〜３８で提供される方法であって、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する方法が提供される。

別の方法、方法４０において、本開示では、方法３９で提供される方法であって、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法４１において、本開示では、方法４０で提供される方法であって、ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列を含み、ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であり、ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法４２において、本開示では、方法１〜４１のいずれか１つで提供される方法であって、細胞に、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む方法が提供される。

別の方法、方法４３において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４のいずれか１つで提供される方法であって、当該方法が、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近の座位に１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、当該座位でポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、当該座位に近接する染色体ＤＮＡの転写制御配列の永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ｇＲＮＡが当該座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含む方法が提供される。

別の方法、方法４４において、本開示では、方法４３で提供される方法であって、近接とは、座位の上流及び下流両方のヌクレオチドを意味する方法が提供される。

別の方法、方法４５において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４のいずれか１つで提供される方法であって、当該方法が、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１の切断を５’座位で、第２の切断を３’座位で起こしまたは創出し、５’座位と３’座位との間でポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの転写制御配列における永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである方法が提供される。

別の方法、方法４６において、本開示では、方法４５で提供される方法であって、１つのｇＲＮＡが一対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する方法が提供される。

別の方法、方法４７において、本開示では、方法４５で提供される方法であって、１つのｇＲＮＡが、５’座位または３’座位のいずれかに対し相補的であるスペーサー配列を含む方法が提供される。

別の方法、方法４８において、本開示では、方法４５で提供される方法であって、当該方法が第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、第１のガイドＲＮＡが５’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが３’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含む方法が提供される。

別の方法、方法４９において、本開示では、方法４３〜４８のいずれか１つで提供される方法であって、１つまたは２つのｇＲＮＡが１つまたは２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である方法が提供される。

別の方法、方法５０において、本開示では、方法４３〜４９のいずれか１つで提供される方法であって、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡが、１つもしくは２つの改変ｇＲＮＡまたは１つもしくは２つの改変ｓｇＲＮＡである方法が提供される。

別の方法、方法５１において、本開示では、方法５０で提供される方法であって、１つの改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む方法が提供される。

別の方法、方法５２において、本開示では、方法５１で提供される方法であって、１つの改変ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列である方法が提供される。

別の方法、方法５３において、本開示では、方法４３〜５２のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する方法が提供される。

別の方法、方法５４において、本開示では、方法５３で提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法５５において、本開示では、方法５４で提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法５６において、本開示では、方法５４〜５５のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＮＬＳがＳＶ４０ＮＬＳである方法が提供される。

別の方法、方法５７において、本開示では、方法５３で提供される方法であって、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法５８において、本開示では、方法５３で提供される方法であって、１つのｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列を含み、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であり、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法５９において、本開示では、方法４３〜５８のいずれか１つで提供される方法であって、ドナーテンプレートが１本鎖または２本鎖である方法が提供される。

別の方法、方法６０において、本開示では、方法４２〜５９のいずれか１つで提供される方法であって、改変転写制御配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法６１において、本開示では、方法４２〜５９のいずれか１つで提供される方法であって、改変転写制御配列がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法６２において、本開示では、方法４２〜６１のいずれか１つで提供される方法であって、挿入が相同組換え修復（ＨＤＲ）によるものである方法が提供される。

別の方法、方法６３において、本開示では、方法８、１４、２１、２４、４３、及び４５のいずれか１つで提供される方法であって、ＳＳＢ、ＤＳＢ、または５’座位及び３’座位が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法６４において、本開示では、方法８、１４、２１、２４、４３、及び４５のいずれか１つで提供される方法であって、ＳＳＢ、ＤＳＢ、または５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢが、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法６５において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４のいずれか１つで提供される方法であって、当該方法が、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１のＳＳＢまたはＤＳＢは５’座位で、第２のＳＳＢまたはＤＳＢは３’座位で起こしまたは創出し、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、その結果、５’座位と３’座位との間で染色体ＤＮＡの転写制御配列における永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである方法が提供される。

別の方法、方法６６において、本開示では、方法６５で提供される方法であって、１つのｇＲＮＡが一対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する方法が提供される。

別の方法、方法６７において、本開示では、方法６５で提供される方法であって、１つのｇＲＮＡが、５’座位または３’座位のいずれかに対し相補的であるスペーサー配列を含む方法が提供される。

別の方法、方法６８において、本開示では、方法６５で提供される方法であって、当該方法が第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを含み、第１のガイドＲＮＡが５’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが３’座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含む方法が提供される。

別の方法、方法６９において、本開示では、方法６５〜６８で提供される方法であって、１つ以上のｇＲＮＡが１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である方法が提供される。

別の方法、方法７０において、本開示では、方法６５〜６９で提供される方法であって、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである方法が提供される。

別の方法、方法７１において、本開示では、方法７０で提供される方法であって、１つの改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む方法が提供される。

別の方法、方法７２において、本開示では、方法７１で提供される方法であって、１つの改変ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列である方法が提供される。

別の方法、方法７３において、本開示では、方法６５〜７２のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する方法が提供される。

別の方法、方法７４において、本開示では、方法７３で提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法７５において、本開示では、方法７４で提供される方法であって、１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接している方法が提供される。

別の方法、方法７６において、本開示では、方法７４〜７５のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＮＬＳがＳＶ４０ＮＬＳである方法が提供される。

別の方法、方法７７において、本開示では、方法７３で提供される方法であって、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法７８において、本開示では、方法７３で提供される方法であって、１つのｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列を含み、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９であり、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である方法が提供される。

別の方法、方法７９において、本開示では、方法６５〜７８のいずれか１つで提供される方法であって、５’座位及び３’座位の両方が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法８０において、本開示では、方法６５〜７８のいずれか１つで提供される方法であって、５’座位及び３’座位の両方が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する方法が提供される。

別の方法、方法８１において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４〜８０のいずれか１つで提供される方法であって、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートが、それぞれが別々の脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または全てが１つの脂質ナノ粒子に同時に製剤化される方法が提供される。

別の方法、方法８２において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４〜８０のいずれか１つで提供される方法であって、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートの両方がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって細胞に送達される方法が提供される。

別の方法、方法８３において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４〜８０のいずれか１つで提供される方法であって、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡがエレクトロポレーションによって細胞に送達され、ドナーテンプレートがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって細胞に送達される方法が提供される。

別の方法、方法８４において、本開示では、方法１、８、１４、２１、または２４〜８０のいずれか１つで提供される方法であって、１つ以上のＲＮＰがエレクトロポレーションによって細胞に送達される方法が提供される。

別の方法、方法８５において、本開示では、方法１〜８４のいずれか１つで提供される方法であって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が染色体２：６０，４５１，１６７〜６０，５５３，５６７（ＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ＧＲＣｈ３８）に位置する方法が提供される。

別の方法、方法８６において、本開示では、方法１〜８５のいずれか１つで提供される方法であって、ヘモグロビン異常症が、鎌状赤血球貧血及びサラセミア（α、β、δ、γ、及びこれらの組合せ）からなる群から選択される方法が提供される。

別の方法、方法８７において、本開示では、方法１〜８６のいずれか１つで提供される方法であって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集することが、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現を低減することができる方法が提供される。

第１の組成物、組成物１において、本開示では、ヘモグロビン異常症を有する患者からの細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号１〜７１，９４７における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸が提供される。

別の組成物、組成物２において、本開示では、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、組成物１に記載の１つ以上のｇＲＮＡが提供される。

別の組成物、組成物３において、本開示では、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡである、組成物１または２に記載の１つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが提供される。

別の組成物、組成物４において、本開示では、前記１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、組成物３に記載の１つ以上のｓｇＲＮＡが提供される。

別の組成物、組成物５において、本開示では、前記１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、配列番号７１，９５９の核酸配列を含む、組成物３に記載の１つ以上のｓｇＲＮＡが提供される。

別の組成物、組成物６において、本開示では、配列番号７１，９５９の核酸配列を含む単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が提供される。

定義

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に対し本質的である組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用され、ただし、本質的であるかそうでないかにかかわらず、指定されていないエレメントを含むことに対する制限はない。

「〜から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要とされるエレメントを指す。この用語は、本発明の当該態様の基本的及び新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的な影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。

「〜からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素を指し、態様の記載に挙げられていないエレメントはいずれも除外される。

文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。

本明細書で挙げられている任意の数値範囲は、挙げられた範囲内に含まれる同じ数値的精度（すなわち、指定の桁の同じ数字）の全てのサブ範囲を記述しているものとする。例えば、「１．０〜１０．０」と挙げられた範囲は、挙げられた最小値の１．０から挙げられた最大値の１０．０の間（両端の値を含む）の全てのサブ範囲を記述しているものとし、例えば、「２．４〜７．６」という範囲が明細書の本文に明示的に挙げられていない場合であっても「２．４〜７．６」を記述しているものとする。したがって、出願人は、本明細書内に明示的に挙げられた範囲内で含まれる同じ数値的精度の任意のサブ範囲を明示的に挙げる目的で、請求項を含めて本明細書を修正する権利を留保する。全てのこのような範囲は本質的に本明細書に記載されており、任意のこのようなサブ範囲を明示的に挙げるための修正は、米国特許法第１１２条（ａ）及び欧州特許条約第１２３（２）条の要件を含めて、書面の記載、記載の十分性、及び追加事項要件に従うことになる。また、明示的な記載がないまたは文脈により別段の要求がない限り、本明細書に記載の全ての数値パラメーター（例えば、値、範囲、量、パーセンテージなどを表現するもの）は、「約」という語が明示的に数字の前に出現しない場合であっても、「約」という語が手前に置かれているかのように読み取ってもよい。加えて、本明細書に記載の数値パラメーターは、報告された有効桁の数、数値精度に照らして、そして通常の丸め技法を適用することによって、解釈されるべきである。また、本明細書に記載の数値パラメーターは、パラメーターの数値の決定に使用された基礎的測定技法における固有の可変性の特徴を必然的に所持することも理解される。

本発明は、本発明の例示的かつ非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照することによってさらに十分に理解されることになる。

本実施例は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらす定義されたゲノムの欠失、挿入、または置き換え（本明細書では「ゲノム改変」と称される）をＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で創出するための例示的なゲノム編集技法として、ＣＲＩＳＰＲシステムの用法を説明する。定義された治療的改変の導入は、本明細書で説明し例示するように、ヘモグロビン異常症の有望な緩和のための新規の治療戦略に相当する。

実施例１ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号１〜２９，４８２に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例２ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号２９，８４３〜３２，３８７に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例３ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号３２，３８８〜３３，４２０に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例４ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号３３，４２１〜３３，８５１に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例５ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号３３，８５２〜３６，７３１に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例６ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１２．４ｋｂの転写制御配列の領域を標的部位のためにスキャンした。各エリアについて、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をスキャンした。配列表の配列番号３６，７３２〜７１，９４７に示すように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ２２ｂｐスペーサー配列を特定した。

実施例７ガイド鎖のバイオインフォマティクス解析
理論上の結合及び実験で評価された活性の両方を伴うマルチステッププロセスにおいて、候補ガイドをスクリーニング及び選択する。例示として、ＰＡＭが隣接する特定のオンターゲット部位（例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列中の部位）にマッチする配列を有する候補ガイドに対し、同様の配列を有するオフターゲット部位を切断する可能性を評価することができ、これには、以下により詳細に記載し例示するようなオフターゲット結合の評価に利用できる様々なバイオインフォマティクスツールのうちの１つ以上を用いて、意図される位置以外の染色体位置における作用の可能性を評価する。オフターゲット活性が比較的低いと予測される候補は、次に実験的評価を受けてそのオンターゲット活性を測定し、次に様々な部位におけるオフターゲット活性を測定することができる。好ましいガイドは、選択された座位で所望レベルの遺伝子編集を達成するのに十分に高いオンターゲット活性と、他の染色体座位における変更の可能性を低減する比較的低いオフターゲット活性とを有する。オンターゲット活性：オフターゲット活性の比は、しばしばガイドの「特異性」と呼ばれる。

予測オフターゲット活性の最初のスクリーニングを行うには、最も可能性の高いオフターゲット部位の予測に使用することができる既知の公的に入手可能な複数のバイオインフォマティクスツールが存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼシステムにおける標的部位への結合は、相補的な配列間のワトソン・クリック塩基対合によって推進されるため、相違点の程度（及びそのためのオフターゲット結合の可能性低減）は、本質的には一次的な配列の相違：ミスマッチ及びバルジ（すなわち、非相補的な塩基に変化した塩基）、ならびに標的部位に対する潜在的オフターゲット部位内の塩基の挿入または欠失、に関連する。ＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、及び欠失を有するＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位（ＣＲＩＳＰＲＯｆｆ−ｔａｒｇｅｔＳｉｔｅｓｗｉｔｈＭｉｓｍａｔｃｈｅｓ，ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｎｄＤｅｌｅｔｉｏｎｓ））と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツール（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕのウェブで入手可能）は、このような類似性を収集する。他のバイオインフォマティクスツールとしては、以下に限定されないが、ＧＵＩＤＯ、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、及びＣＣｔｏｐが挙げられる。

変異及び染色体再編の有害な作用を低減するため、バイオインフォマティクスを使用してオフターゲット切断を最小化した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの研究からは、特にＰＡＭ領域から離れた位置における、塩基対ミスマッチ及び／またはバルジを伴ったガイド鎖とＤＮＡ配列との非特異的なハイブリダイズに起因する高いオフターゲット活性の可能性が示唆された。そのため、塩基対ミスマッチに加え、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入及び／または欠失を有する、潜在的オフターゲット部位を特定することができるバイオインフォマティクスツールを有することは重要である。そのため、バイオインフォマティクスベースツールのＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、及び欠失を有するＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位（ＣＲＩＳＰＲＯｆｆ−ｔａｒｇｅｔＳｉｔｅｓｗｉｔｈＭｉｓｍａｔｃｈｅｓ，ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓａｎｄＤｅｌｅｔｉｏｎｓ））を使用して、潜在的ＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位のゲノムを探索した（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕのウェブで入手可能）。ＣＯＳＭＩＤ出力がミスマッチの数及び位置に基づいて潜在的オフターゲット部位のリストをランク付けしたことにより、詳しい情報に基づいた標的部位の選択が可能になり、可能性の高いオフターゲット切断を伴う部位の使用を回避した。

領域内のｇＲＮＡ標的化部位における推定オン及び／またはオフターゲット活性を重み付けする追加のバイオインフォマティクスパイプラインを用いた。活性の予測に使用され得る他の特徴としては、対象の細胞タイプ、ＤＮＡ接近可能性、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、及び他のＣＨＩＰ−ｓｅｑデータについての情報が挙げられる。編集効率を予測する追加の因子（例えば、ｇＲＮＡの対の相対的位置及び方向、局所配列の特徴、及びマイクロホモロジー）を重み付けする。

実施例８細胞内での好ましいガイドのオンターゲット活性試験
最も低いオフターゲット活性を有すると予測されたｇＲＮＡは、次にＫ５６２細胞におけるオンターゲット活性を試験し、ＴＩＤＥを用いてインデルの出現頻度を評価することになる。

ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）によって決定される標的部位のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に評価するウェブツールである。ＴＩＤＥソフトウェアは、２つの標準的なキャピラリーシークエンシング反応からの定量的配列トレースデータに基づいて、編集効率を定量化し、標的化された細胞プールのＤＮＡにおける主要なタイプの挿入及び欠失（インデル）を特定する。詳細な説明及び例については、Ｂｒｉｎｋｍａｎｅｔａｌ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１４）を参照。代替的な１つの方法は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）（高スループットシークエンシングとしても知られている）であり、これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シークエンシング、Ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング、及びＳＯＬｉＤシークエンシングを含めた種々の複数の現代型シークエンシング技術の説明に使用される包括的な用語である。このような近年の技術によって、過去に使用されたＳａｎｇｅｒシークエンシングよりもはるかに迅速かつ低コストでＤＮＡ及びＲＮＡのシークエンシングを行うことが可能になったため、ゲノミクス及び分子生物学の研究に革命がもたらされた。

組織培養細胞のトランスフェクションによって、異なるコンストラクトのスクリーニングや活性及び特異性を試験するためのロバストな手段が可能になる。Ｋ５６２またはＨＥＫ２９３Ｔなどの組織培養細胞株はトランスフェクションが容易であり、高い活性をもたらす。これらのまたは他の細胞株を評価してＣＤ３４＋にマッチする細胞株を決定し最良のサロゲートを提供する。次にこれらの細胞を多くの早期段階試験に使用する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９向けの個々のｇＲＮＡは、例えば図１Ａ〜１Ｃに記載のＣＴｘ−１、ＣＴｘ−２、またはＣＴｘ−３のようなヒト細胞における発現に適したプラスミドを用いて細胞にトランスフェクションすることができる。代替的に、市販のベクターも使用することができる。本明細書に記載のＢＣＬ１１ＡｇＲＮＡのインデル出現頻度評価については、市販のＣａｓ９発現プラスミド（ＧｅｎｅＡｒｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。数日後（本実験については４８時間）、ゲノムＤＮＡを回収し、標的部位をＰＣＲによって増幅した。遊離ＤＮＡ末端のＮＨＥＪ修復によって導入された挿入、欠失、及び変異の比率によって切断活性を測定した。この方法では、修復された配列を切断されていないＤＮＡと正しく区別することができないが、切断のレベルは誤修復の量によって計測することができる。オフターゲット活性は、特定された推定オフターゲット部位を増幅し、同様の切断検出の方法を使用することによって観察することができる。また転座についても、特異的な切断及び転座が起こっているかを決定するために、切断部位に隣接するプライマーを使用してアッセイすることができる。ｇｕｉｄｅ−ｓｅｑを含めたオフターゲット切断の補完的試験を可能にする非ガイドアッセイが開発されている。この場合、顕著な活性を有するｇＲＮＡまたは一対のｇＲＮＡを培養細胞に追加して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列中の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）の修飾または不活性化を測定することができる。次にオフターゲット事象が再び起こり得る。同様に、ＣＤ３４＋細胞をトランスフェクションし、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列中の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）の修飾または不活性化のレベル及び可能性のあるオフターゲット事象を測定することができる。これらの実験は、ヌクレアーゼ及びドナーの設計及び送達の最適化を可能にする。

実施例９細胞内での好ましいガイドのオフターゲット活性試験
上記実施例におけるＴＩＤＥ及び次世代シークエンシング研究から得られた最良のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡは、次に全ゲノムシークエンシングを用いてオフターゲット活性を試験することになる。候補ｇＲＮＡをＣＤ３４＋細胞またはｉＰＳＣでより徹底的に評価する。

実施例１０細胞内での好ましいｇＲＮＡ組合せの試験
ＴＩＤＥ及び次世代シークエンシング研究から得られた最良のオンターゲット活性及び最も低いオフターゲット活性を有するｇＲＮＡは、組み合わせて試験を行って、各ｇＲＮＡの組合せの使用から得られる欠失のサイズを評価することになる。有望なｇＲＮＡの組合せは、初代ヒトＣＤ３４＋細胞で評価する。

例えば、ｇＲＮＡの組合せに対し、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の全てまたは一部を欠失させる効率を試験する。また、ｇＲＮＡの組合せに対し、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）の全てまたは一部を欠失させる効率を試験する。

実施例１１ＨＤＲ遺伝子編集に対する種々のアプローチの試験
オンターゲット活性及びオフターゲット活性の両方におけるｇＲＮＡの試験をした後は、修飾／不活性化及びノックイン戦略をＨＤＲ遺伝子編集に対して試験することになる。

修飾／不活性化アプローチについては、短い１本鎖オリゴヌクレオチド、短い２本鎖オリゴヌクレオチド（インタクトＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）、長い１本鎖ＤＮＡ分子（インタクトＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）、または長い２本鎖ＤＮＡ分子（インタクトＰＡＭ配列／変異ＰＡＭ配列）としてドナーＤＮＡテンプレートが提供される。ドナーＤＮＡテンプレートは、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡ、または改変（例えば、変異した）＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含む。加えて、ドナーＤＮＡテンプレートはＡＡＶによって送達される。

ｃＤＮＡノックインアプローチについては、１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、４０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、８０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、１００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、１５０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、３００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、４００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含むことができる。代替的に、ＤＮＡテンプレートはＡＡＶによって送達される。

ｃＤＮＡノックインアプローチについては、１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、４０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、８０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、１００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、１５０ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、３００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。１本鎖または２本鎖のＤＮＡは、４００ｎｔを超えるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）を含むことができる。代替的に、ＤＮＡテンプレートはＡＡＶによって送達される。

実施例１２リードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せの再評価
ＨＤＲ遺伝子編集に対する異なる戦略を試験した後は、初代ヒト細胞においてリードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せの欠失の効率、組換え、及びオフターゲット特異性を再評価することになる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＲＮＰは送達のために脂質ナノ粒子に製剤化し、ｓｇＲＮＡはナノ粒子に製剤化するかまたはＡＡＶとして送達させ、ドナーＤＮＡはナノ粒子に製剤化するかＡＡＶとして送達させる。

実施例１３適切な動物モデルにおけるｉｎｖｉｖｏ試験
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せを再評価した後は、リード製剤を動物モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで試験することになる。

上述のように、ヒト細胞内で培養することでヒト標的及びバックグラウンドヒトゲノムにおける直接的試験が可能になる。

前臨床の有効性及び安全性の評価は、ＮＳＧまたは同様のマウスにおける改変マウスまたはヒトＣＤ３４＋細胞の移植を通じて観察することができる。改変細胞は、移植から数ヶ月後に観察することができる。

実施例１４様々なｇＲＮＡを用いた細胞の編集
ヒトドナー１〜３からのヒト動員末梢血ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４＋増大サプリメントを含む無血清ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中で２日間培養した。１００，０００細胞を洗浄し、ＣｏｒｆｕＬａｒｇｅ（ＣＬＯ）ｇＲＮＡ、ＣｏｒｆｕＳｍａｌｌ（ＣＳＯ）ｇＲＮＡ、ＨＰＦＨ５ｇＲＮＡ、ＫｅｎｙａｇＲＮＡ、ＳＤ２ｓｇＲＮＡ、またはＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡと共にＣａｓ９ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。細胞を２日間回復させてから赤血球系分化培地（ＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘに５％のヒト血清、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、３Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、１ｕＭのデキサメタゾン、１ｕＭのβ−エストラジオール、３３０ｕｇ／ｍｌのホロ−トランスフェリン、及び２Ｕ／ｍｌのヘパリンを追加したもの）に切り替えた。本明細書に記載の「シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によるオンターゲット及びオフターゲットの変異検出」及び「変異検出アッセイ」のセクションで説明されているように、ＣｏｒｆｕＬａｒｇｅ（ＣＬＯ）ｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞、ＣｏｒｆｕＳｍａｌｌ（ＣＳＯ）ｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞、ＨＰＦＨ５ｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞、ＫｅｎｙａｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞、ＳＤ２ｓｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞、及びＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞の各々について挿入／欠失（「インデル」）のパーセンテージを決定した（図３）。これらの細胞を赤血球系分化培地中で１２日間分化させた後、ＲＮＡを収集して定量的リアルタイムＰＣＲによりヘモグロビンレベルを評価した（図４Ａ〜４Ｃ）。

１日後、フローサイトメトリーを用いて単一赤血球系前駆細胞を産生し、赤血球系分化培地中で培養してコロニーとして増大及び成長させた。各コロニーを分け、選別から１２日後にＤＮＡ及びＲＮＡ解析用に収集した。姉妹コロニーを選別から１５日後にヘモグロビンタンパク質の解析用に収集した。定量的リアルタイムＰＣＲによってグロビン発現（γ／１８ｓＲＮＡの比またはγ／αの比）を決定し、編集された赤血球系コロニーの各々について比較した（図５Ａ〜５Ｂ）。

実施例１５ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡの試験
ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡを使用した場合にＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２中で生じ得る遺伝子編集結果は３つ考えられる。ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡを使用した場合に生じ得る第１の遺伝子編集結果は、両方のアレルにおいてインデルのみをもたらす（インデル／インデル、図６）。ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡを使用した場合に生じ得る第２の遺伝子編集結果は、２つのアレルにおいて両方のインデル及び野生型配列によるクローンをもたらす（インデル／ＷＴ、図６）。ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡを使用した場合に生じ得る第３の遺伝子編集結果は、両方のアレルにおいて野生型配列によるコロニーをもたらす（ＷＴ／ＷＴ、図６）。

ＳＰＹ１０１ｓｇＲＮＡを使用した場合、赤血球コロニーの９２％が編集された。例えば、赤血球コロニーの９２％はインデルを伴うアレルを有した（図６）。

ＳＰＹ１０１を用いて編集した単一赤血球系コロニーにおけるγ−グロビン発現（γ／α グロビンｍＲＮＡ比またはγ／（γ＋β）グロビンｍＲＮＡ比）を測定した（図７Ａ〜Ｂ）。単一赤血球系コロニーには、両アレルまたはホモ接合性のインデルを伴うコロニー（インデル／インデル）、単一アレルまたはヘテロ接合性のインデルを伴うコロニー（インデル／ＷＴ）、及び両方のアレルに野生型配列を伴うコロニー（ＷＴ／ＷＴ）が含まれた。インデルを有する赤血球系コロニーは、両方のアレルにおいて野生型配列を伴うクローンと比較して、より高いレベルのガンマグロビンを発現することができた（図７Ａ〜Ｂ）。

実施例１６鎌状赤血球症（ＳＣＤ）及びβ−サラセミアに対する治療戦略
以下の表（表４）は、実施例１６〜１７で使用したｇＲＮＡに関する情報を示している。

ａ、ｇ、ｕ：２’−Ｏ−メチル残基
ｓ：ホスホロチオアート
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ：ＲＮＡ残基

以下の表（表５）は、実施例１６〜１７で言及した標的に関する情報を示している。

ＳＣＤ及びβ−サラセミアに対する治療戦略では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＨＰＦＨ患者に天然に存在する遺伝子変異と同じものを再創出した。患者の造血幹細胞を単離し、この細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてｅｘｖｉｖｏで処置してＨＰＦＨ遺伝子編集を創出し、次に編集された細胞を患者に再導入した。遺伝子改変幹細胞は、疾患症状の重症度の顕著な低減に十分なレベルのＨＢＦを含有する赤血球をもたらした。複数の遺伝子編集物に対する優先順位付けを、本来見られるＨＢＦ上方調節の程度、これらの編集物をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて高い効率で再創出する能力、及びオフターゲット編集の不在に基づいて行った。

候補ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を計算的に選択し、次にＣＤ３４＋細胞におけるオンターゲット編集有効性をスクリーニングした。１つのこのようなスクリーニングの結果が図８に示されている。ｇＲＮＡは、複数のドナー試料にわたる一貫した高い（＞７０％）オンターゲット編集によって特定した。各ＣＤ３４＋細胞ドナーを一意の印（▲、_★、●）で表し、各ドナーにおけるオンターゲット編集効率を２回測定する。

意図されたオンターゲット部位に配列が最も類似しておりオフターゲット活性の可能性が最も高いことが計算的に特定された数百の部位を調べることにより、ＣＤ３４＋細胞における候補ｇＲＮＡのオフターゲット活性をスクリーニングした。図９Ａ〜Ｂは、図８で試験した各ｇＲＮＡに対する実験アプローチ（図９Ａ）及び結果（図９Ｂ）を示している。ほとんどのｇＲＮＡが、予測部位でさえも検出可能なオフターゲット活性を示さなかった。ｇＲＮＡＣ及びｇＲＮＡＧのみがオフターゲット活性を示している。各予測部位に対し複数のプローブを使用してアッセイ感受性を高めた。

候補ｇＲＮＡを使用して、ＳＣＤ及びβ−サラセミア患者ならびに健康なドナーから得られた赤血球系細胞において特異的なＨＰＦＨまたは他の改変を再創出した。赤血球系分化後、グロビン転写レベルを測定して、α−またはβ−グロビンに対するγ−グロビンの増加を評価した。図１０Ａ〜Ｂに示されるように、ｇＲＮＡを用いて編集してＨＰＦＨ標的５及び６を再創出した患者細胞において３０％を超えるγ−グロビンｍＲＮＡレベルが観察された。ＳＣＤ及びβ−サラセミアの患者の試料は、健康なドナーのものよりもγ−グロビンの大きな絶対的増加を示し、ＨＰＦＨのヘテロ接合体キャリアよりも高いＨｂＦが患者で観察されたことと一致した。示された値から、各ドナーからの模擬処置された細胞のバックグラウンドレベルを引いた。データは単回の実験に相当するが、ＳＣＤ患者データは例外で、３名の異なるドナーの試料の平均に相当する。編集効率は、全実験において同様のものであった。

バルクＣＤ３４＋集団における編集効率が長期再増殖ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）を代表することを保証するため、図１１Ａ〜Ｃに示されるように、バルクＣＤ３４＋細胞を特定のサブ集団に選別し、オンターゲット編集効率をアッセイした。ＬＴ−ＨＳＣ集団における高い編集効率が観察された。実験は、４名のドナー全体にＳＰＹ１０１及びＣａｓ９タンパク質を用いて行った。バーは平均±ＳＥＭを示している。ＬＴ−ＨＳＣ、長期造血幹細胞；ＭＰＰ、多分化能前駆体；ＭＬＰ、多リンパ系前駆体；ＣＭＰ、骨髄系共通前駆体；ＭＥＰ、巨核球赤血球前駆体；ＧＭＰ、顆粒球マクロファージ前駆体。

遺伝子編集されたＨＳＰＣが造血系の長期再増殖への可能性を保持することを確認するために、免疫低下マウスにおいてｉｎｖｉｖｏの移植研究を実施した。未処置、未編集、またはＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いた遺伝子編集のいずれかを行った健康なドナーからのヒトＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウスに導入した。図１２に示されるように、同様のレベルのｈＣＤ４５ＲＡ＋細胞（移植後８週時）が未処置／未編集ＨＳＰＣを注射したマウス及びＳＰＹ１０１遺伝子編集ＨＳＰＣを注射したマウスに存在することで、ＳＰＹ１０１編集細胞が移植可能性を保持することが確認された。データ点は、個々の動物を表し、ヒトＣＤ４５ＲＡ＋であった生細胞のパーセンテージを図示している。平均±ＳＤ。「未処置」は、エレクトロポレーションせずに免疫低下マウスに注射したＨＳＰＣを表す。「未編集」は、エレクトロポレーションしたが遺伝子編集を行わずに免疫低下マウスに注射したＨＳＰＣを表す。「ＳＰＹ１０１」は、Ｃａｓ９及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションして免疫低下マウスに注射したＨＳＰＣを表す。

臨床研究に備え、ＧＭＰ対応施設でプロセス開発を開始した。図１３に示されるように、ＧＭＰ適合性プロセスにおいて、臨床スケールでは遺伝子編集有効性の顕著な損失は観察されなかった。データは、４以上の実験全体での平均±ＳＤであった。

図１４に示されるように、発明者らのリード候補に対するＧＬＰ／毒性学研究が開始されている。ＮＳＧマウスにおける２つの別々の研究により、編集されたＣＤ３４＋細胞の体内分布及び毒性学における包括的な特性決定が可能になると考えられる。

実施例１７鎌状赤血球症（ＳＣＤ）及びβ−サラセミアに対する治療戦略
ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞における６つの異なるＨＰＦＨバリアントの再形成、すなわち「標的」の編集から得られた結果が図１６Ａ〜Ｂ及び図１７に示されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＣＤ３４＋細胞を処置し、赤血球に分化させ、次に、図１５に示されている実験プロセスを用いて、バルク（図１６Ａ〜Ｂ）及びコロニー（図１７）におけるＨＢＦｍＲＮＡ及びタンパク質発現をアッセイした。

図１６Ａ〜Ｂに提示された結果は、標的１〜３については３名の異なるドナーから、標的４〜６については７名の異なるドナーからのものであった。模擬処置細胞のバックグラウンドレベルを引いておいた。データは平均±ＳＥＭである。バルク解析からはＨＢＦの上方調節が確認され、また最も高いレベルのＨＢＦを示す標的の優先順位付けが可能になった。

図１７に提示されたクローン解析から、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９がもたらす遺伝子編集が、確かに個々の細胞レベルにおけるＨＢＦの増加の理由であることを確認することができた。結果は、単一のドナーからのものであり、標的当たり５０〜８０コロニーであった。ｍＲＮＡ転写レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。データは平均±ＳＥＭである。

標的５及び６は最も高いＨＢＦレベルを示し、図１８Ａ〜Ｂでさらに解析を行った。データは平均±ＳＥＭである。ＷＴは遺伝子編集の証拠を示さないコロニーを示し、ヘテロ接合またはＨｅｔは１つのアレルが編集されたコロニーを示し、ホモ接合またはＨｏｍｏは両方のアレルが編集されたコロニーを示す。図１６Ａ〜Ｂ、１７、及び１８Ａ〜Ｂにおける証拠は、もたらされた遺伝子編集とＨＢＦの所望の上方調節との間の因果関係を支持しており、提案された治療戦略に対するさらなる確証をもたらすものである。

実施例１８細胞内での好ましいガイドＲＮＡのオンターゲット活性試験
４名の独立したドナーからのヒト動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｉｔ３−リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、及び１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む無血清ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培地中で培養した。ドナー当たり２００，０００細胞を洗浄し、Ｌｏｎｚａエレクトロポレーション装置を用いて、いずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集構成要素もなし（模擬エレクトロポレーション試料）、陰性対照としてのＧＦＰｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＧＦＰ）、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＳＰＹ）、ＳＤ２ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＳＤ２）、または二重ＢＣＬ１１Ａエキソン２ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（Ｅｘ２）を伴ったものに対しエレクトロポレーションした。組換えＣａｓ９タンパク質は、２つのＳＶ４０核局在化配列（ＮＬＳ）に隣接するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９をコードする。これらの実験は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９の重量比が１：１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を用いて実施した。ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａ座位のイントロン２内でＤＨＳ＋５８Ｇａｔａ１結合部位のインデル分断を創出する。ＳＤ２ｇＲＮＡは、ヒトベータグロビン座位内でインデル及び４．９ｋｂ欠失を創出する。４．９ｋｂ欠失はＨＢＧ１の上流に位置し、ＨＢＧ２配列全体を含む。４．９ｋｂ欠失は、ＨＢＧ２コード配列に対し５’側の１６８ｂｐで開始し、ＨＢＧ１コード配列に対し５’側の１６８ｂｐで終了する。エキソン２ｇＲＮＡはＢＣＬ１１Ａ座位のエキソン２上に１９６ｂｐの欠失を創出し、陽性対照としての役割を果たした。エレクトロポレーションしなかったヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞は陰性対照（ＥＰなし）としての役割を果たした。

エレクトロポレーションの後、遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞を２日間回復させてから赤血球系分化培地（ＩＭＤＭ＋Ｌ−グルタミンに５％のヒト血清、１０μｇ／ｍＬのインスリン、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、３Ｕ／ｍＬのＥＰＯ、１ｕＭのデキサメタゾン、３３０ｕｇ／ｍｌのホロ−トランスフェリン、及び２Ｕ／ｍＬのヘパリンを追加したもの）に切り替えた。遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞を赤血球に分化させ、ＴＩＤＥ解析、ｄｄＰＣＲ解析、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、ＦＡＣＳ、及びＬＣ−ＭＳによりさらに試験を行った（図２０Ａ〜Ｂ、２１Ａ〜Ｄ、２２Ａ〜Ｂ、及び２３Ａ〜Ｄ）。全体的な実験プロセスが図１９に示されている。

ＴＩＤＥ解析／ｄｄＰＣＲ解析

ゲノムＤＮＡを単離し、分化培地中で成長した各々の遺伝子編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞試料を試験した。分化後１、１１、１３、及び１５日目にゲノムＤＮＡを細胞から単離した。ゲノムＤＮＡをＴＩＤＥ解析によって解析した。ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）によって決定される標的部位のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に評価するウェブツールである。図２０Ａ〜Ｂに提示された結果は、４名の異なるドナーからのものであり、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞（図２０Ｂ）及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞（図２０Ａ）におけるｅｘｖｉｖｏ赤血球系分化全体を通じて遺伝子編集のパーセンテージが維持されていることを実証するものであった。データは平均±ＳＤである。

ゲノムＤＮＡは、ＳＤ２処置による４．９ｋｂ欠失出現頻度を検出するため、ｄｄＰＣＲ解析による解析も行った。図２０Ｂに提示された結果は、４名の異なるドナーからのものであり、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞（図２０Ｂ）におけるｅｘｖｉｖｏ赤血球系分化全体を通じて遺伝子編集のパーセンテージが維持されていることを実証するものであった。データは平均±ＳＤである。

定量的リアルタイムＰＣＲ解析

ｍＲＮＡを単離し、分化培地中で成長した各々の遺伝子編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞試料を試験した。分化後１１日目及び１５日目にｍＲＮＡ単離を実施した。グロビン発現（γ／αの比及びγ／（γ＋β））の比）を定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集された各々のヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞について比較した（図２１Ａ〜Ｄ）。図２１Ａ〜Ｄに提示された結果は、４名の異なるドナーからのものであり、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞のγ−グロビン転写物における陰性対照と比較しての増加を実証するものであった。データは平均±ＳＤである。

ＦＡＣＳ／ＬＣ−ＭＳ

ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞を分化培地中で１５日間成長させた。ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞を、さらに二重ＢＣＬ１１Ａエキソン２ｇＲＮＡ（Ｅｘ２）またはＧＦＰｇＲＮＡも用いて編集し、分化培地中で１５日間成長させた。一部のヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞には任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集構成要素を用いた編集を行わず（模擬エレクトロポレーション試料）、一部のヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞にはエレクトロポレーションしなかった（ＥＰなし）。生細胞を、赤血球系成熟マーカーのグリコフォリンＡで染色した。次に細胞を固定し、透過処理を行った。固定した細胞の各グロビンサブユニットをフルオロフォア結合抗体で染色した。次に、染色した細胞をＦＡＣＳにより解析した。γ−グロビンの一例が図２２Ａに示されている。４名の異なるドナーからのγ−グロビンにおける平均の蛍光強度中央値は図２２Ｂに示されており（平均±ＳＥＭ）、これは、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞におけるγ−グロビンの上方調節を実証するものであった。

ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞を分化培地中で１５日間成長させた。ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞を、さらに二重ＢＣＬ１１Ａエキソン２ｇＲＮＡ（Ｅｘ２）またはＧＦＰｇＲＮＡも用いて編集し、分化培地中で１５日間成長させた。一部のヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞には任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集構成要素を用いた編集を行わず（模擬エレクトロポレーション試料）、一部のヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞にはエレクトロポレーションしなかった（ＥＰなし）。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して、変性したグロビン単量体を検出した（図２３Ａ〜Ｄ）。図２３Ａ〜Ｄに提示された結果は、４名の異なるドナーからのものであり、また、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたｍＰＢＣＤ３４＋細胞のγ−グロビンにおける上方調節を実証するものであった。データは平均±ＳＤである。

実施例１９細胞内での好ましいガイドＲＮＡのオフターゲット活性試験
ゲノムのオンターゲット編集が治療の成功に必須である一方で、任意のオフターゲット事象の検出は、製品安全性を保証する重要な構成要素である。オフターゲット部位における改変を検出する１つの方法は、オンターゲット部位に最も類似しているゲノムの領域をハイブリッドキャプチャーシークエンシングによって豊富化し、検出される任意のインデルを定量化することを伴う。

ハイブリッドキャプチャーシークエンシングは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集細胞及びＤＮＡにおけるオフターゲット編集を定量化する方法である。ハイブリッドキャプチャーシークエンシング法に関する詳細は、以下の通りである。

材料及び方法

材料及び供給源

１．１．１．ゲノムＤＮＡ

この方法の目的は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による編集がゲノム内のオフターゲット部位で生じるかを判定することであるため、典型的には少なくとも２つの入力試料、処置試料及び対照（未処置、模擬エレクトロポレーションなど）試料を使用する。各試料は適切な方法によって抽出されたゲノムＤＮＡ（ｇＲＮＡ）を有し、このｇＤＮＡを、ハイブリッドキャプチャーライブラリー（１．１．２）とハイブリダイズさせ、次に後述するプロトコルの残りを行う。

１．１．２．ハイブリッドキャプチャーライブラリー

（１．２．２）に記載のハイブリッドキャプチャーライブラリーは、最大５７，０００の１２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドベイト配列のリストを提供することによってもたらされ、次にカスタムＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴハイブリッドキャプチャーキットとして合成される。

１．２方法

１．２．１．オフターゲット部位検出アルゴリズム

オフターゲット編集を有する可能性が最も高い部位を決定するため、発明者らは異なる特徴を有するいくつかのアルゴリズムを使用して、広範囲のオフターゲット部位の網羅を保証している。

１．１．１．１．ＣＣＴｏｐ

所与のガイド配列に対し、ＣＣＴｏｐはＢｏｗｔｉｅ１配列マッピングアルゴリズムを用いて、ゲノムにおいて、部位とガイドとの間に最大５つのミスマッチを有するオフターゲット部位を探索する。ゲノム内の潜在的オフターゲット部位の決定に配列の相同性のみが使用されているため、発明者らはこのような部位を（「予測オフターゲット部位」ではなく）「相同オフターゲット部位」と呼んでいる。この５つのミスマッチは、配列のＰＡＭ末端に最も近い５塩基アラインメントシード領域では２つ以下のミスマッチに制限されている。ＣＲＩＳＰＯＲアルゴリズム（１．２．１．２）はシード領域における制限を有しないため、ＣＣＴｏｐを補完する。

１．２．１．１．ＣＯＳＭＩＤ

一部のオフターゲットＣａｓ９切断部位は、自らとガイドとの間に短いインデル（バルジとも呼ばれる）を有することがあるため、発明者らによる探索は、インデル（典型的には最大２つのインデルに制限）を伴うオフターゲット部位を検出し、そのためＣＣＴｏｐによる探索を補完するＣＯＳＭＩＤアルゴリズムも用いている。

１．２．１．２．ＣＲＩＳＰＯＲ

ＣＲＩＳＰＯＲは、様々な方法を比較する目的で、多くの異なる公表されたＣＲＩＳＰＲのオン及びオフターゲットスコア付け機能を実装するツールである。ＣＲＩＳＰＯＲは、ゲノムに対するガイド配列の探索にＢＷＡアルゴリズムを使用してオフターゲット部位を見いだす。このアルゴリズムは、ＣＣＴｏｐで使用されているＢｏｗｔｉｅ１アルゴリズムとは異なっており、ＣＣＴｏｐのようにＰＡＭ領域付近のミスマッチが５塩基のうちの２塩基に制限されていない点においてわずかに許容性の高い探索が可能である。

１．２．１．３．ＰＡＭ

初期設定では、スクリーニングは、いくらかの最大活性を有するＮＧＧまたはＮＡＧＰＡＭを用いたガイドの探索によって行われる。後期のスクリーニングは、オフターゲット部位を（活性が非常に低いものであっても）見逃さないことを保証するために、さらに多くのＰＡＭを含み得る。

１．２．１．４．アルゴリズムの組合せ

各アルゴリズムによるガイドの出力を一緒に合わせて、同一のオフターゲット部位を取り除き、ハイブリッドキャプチャーベイトの設計構成要素に加える。

１．２．２．ハイブリッドキャプチャーベイト

１．２．２．１設計

オフターゲット部位検出アルゴリズム（１．２．１．）によってもたらされた部位のリストは、次に、入力ｇＤＮＡ試料におけるオフターゲット部位の各々を豊富化するハイブリッドキャプチャープローブを産生するのに使用する。標的ＤＮＡ配列の豊富化を成功させるには１つのベイトで十分であり得るが、特異的結合が困難であり得る反復配列がベイトの側面に隣接する場合であってもベイトが標的領域を特異的にプルダウンする可能性を高めるために、一般的には複数のベイトを設計し、標的部位にまたがってベイトをタイル状に重ねる（図２４）。ベイト（２０−ｍｅｒ、^＊で示される淡色部分）にまたがってタイル状に重なったハイブリッドキャプチャーベイト（１２０−ｍｅｒ、濃色部分）（図２４）。

１．２．３．シークエンシング

ハイブリッドキャプチャー豊富化の後に、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑシークエンサー上でペアードエンド１２５ｂｐリード及び１７５ｂｐ挿入サイズでシークエンシングが行われる。典型的には、シークエンシングは最小頻度事象から検出される５リードを有することを標的化するカバレッジ深度を標的化するように行われる。例えば０．５％のインデル事象を検出するには、０．５％の事象が５リードを有するように１０００ｘカバレッジへのシークエンシングが実施される。

１．２．４．ベイトの有効性

典型的な実験において、発明者らは、ベイトが大多数の標的部位を高いレベルのシークエンシングカバレッジで網羅することを見いだしている。シークエンシングカバレッジには、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法では達成され得るいくつかの制限が存在するが、それは、高いまたは低いＧＣ％、複雑性の低い配列、低いベイト親和性、ベイト非特異性、及び他の理由に起因するものである。実験における実際のインデル検出パワーは、異なる真のインデル出現頻度を有する部位における異なるシークエンシングカバレッジのサンプリングパワーを計算することによって推定される。概して、シークエンスカバレッジの増加によって、低出現頻度のインデルを有する部位に対する検出パワーが増加する。例えば、ある部位が２５００ｘシークエンシングカバレッジを有する場合、ハイブリッドキャプチャーはインデル出現頻度０．４％の部位の参照には９９％のパワーを有し、インデル出現頻度０．３％の部位の参照には９４％のパワーを有することになる（図２５）。

１．２．５．定量化

ヒトゲノムビルドｈｇ３８に対するデフォルトパラメーターを用いたＢＷＡアルゴリズムを用いて、シークエンシングデータを整列させる。各潜在的オフターゲット部位において、潜在的Ｃａｓ９切断部位の全ての３ｂｐ以内のインデルをカウントし、切断部位におけるカバレッジにより分類し、よって特定の切断部位におけるインデルの数がもたらされる。

１．２．６．顕著な切断部位の統計評価

様々な事象がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結果ではないインデルをもたらす可能性があり、これはゲノム生殖系列インデルバリアントまたは多型、ゲノム切断を受けやすい領域、ホモポリマーランを有する領域、及び他の点でシークエンシングが困難な領域のように、ゲノム全体にわたる部位で検出される。

１．２．６．１．解析から除外される部位

ドナーごとの「生殖系列」インデルを伴う任意の部位（あらゆる試料においてドナーは＞３０％のインデル出現頻度を有する）、女性の試料における任意の染色体Ｙ部位、及び０カバレッジを伴う任意の部位は、解析から除外する。

１．２．６．２．統計検定

潜在的オフターゲット部位で見られるインデルが本当にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９誘導事象であるかどうかを評価するため、マン・ホイットニーウィルコクソン検定及びスチューデントｔ検定の両方を使用して、Ｃａｓ９及びガイドを用いて処置した試料が未処置試料よりも有意に高い出現頻度のインデルを有するかどうかについて試験を行う。これらの検定のいずれかが有意（ｐ＜０．０５）である場合、その部位に、ＰＣＲで追跡し有意な編集が存在するかを判定するためのフラグが立ったものとみなす。可能な限り積極的に追跡部位にフラグを立てることを保証するため、有意であると見いだされる部位の数を減少させると考えられる多重仮説検定補正は実施しない。

また、陰性対照解析も確立させて解析を繰り返し、それ以外では処置試料よりも非処置試料において高い出現頻度のインデルを有する部位を探す。生物学的には、この解析で「真のヒット」を見いだすことを期待する根拠はないが、当該解析では、このデータセット内で発見を予測することができるバックグラウンドノイズに起因し得る偽陽性の数についての経験的な情報がもたらされる。さらに、Ｃａｓ９またはガイドなしでエレクトロポレーションした細胞、及びＣａｓ９及びＧＦＰガイドを用いてエレクトロポレーションした細胞を含めた追加の２つの陰性対照試料を投入することにより、これを経験的な帰無分布へと拡大することができる。「処置が少ない」試料のヒットを「処置が多い」試料と比較して検定することにより、偽陽性ヒットにおける保存的で経験的な帰無分布を決定し、これは、処置試料ｖｓ非処置試料についての独自解析におけるヒットの信用性を申告するのに使用することができる。

ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集されたヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞を、本明細書に記載のハイブリッドキャプチャーシークエンシング法によって解析した。図２６〜２７に提示された結果は、３〜４名の異なるドナーからのものであり、遺伝子編集ｍＰＢＣＤ３４＋細胞（これは、ＳＤ２ｇＲＮＡを用いて編集した細胞（図２７）及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡを用いて編集された遺伝子編集ｍＰＢＣＤ３４＋細胞（図２６）である）において、切断の根拠を伴う０オフターゲット部位が実証された。ラウンド１のインデル出現頻度は０．５％より大きい（＞）。ラウンド２のインデル出現頻度は０．２％より大きい（＞）。

実施例２０移植実験
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳＣＤ３４マイクロビーズ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳＰｒｏｄｉｇｙ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて健康なドナーからヒト動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を単離し、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｉｔ３−リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、及び１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む無血清ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）培地中で培養した。次に、Ｍａｘｃｙｔｅ（登録商標）デバイスを用いて、製造業者の指示に従って、以下のうちの１つを用いて細胞にエレクトロポレーションした：いずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集構成要素も含有しない空のベクター（模擬エレクトロポレーション試料）、陰性対照としてのＧＦＰｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＧＦＰ）、ＳＰＹ１０１ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＳＰＹ１０１）、またはＳＤ２ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（ＳＤ２）。組換えＣａｓ９タンパク質は、２つのＳＶ４０核局在化配列（ＮＬＳ）に隣接するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９をコードする。これらの実験は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９の重量比が１：１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を用いて実施した。

各遺伝子編集されたｍＰＢＣＤ３４＋ヒト細胞を１６匹の免疫低下マウス（「ＮＳＧ」またはＮＯＤｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ））に尾静脈経由で注射して、ホーミング及び移植の能力を実証した。ＮＳＧは、近交系の実験用マウス系統であり、現時点において最も免疫不全性の高いものの１つとして説明される。例えば、Ｓｈｕｌｔｚｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２）：１１８−１３０（２００７）を参照。移植実験に関する詳細は、図２８に提示されている。注射後８週時にＮＳＧマウスを出血させ、ＦＡＣＳにより、末梢血のヒトＣＤ４５ＲＡ＋及びマウスＣＤ４５＋生細胞について解析した。注射後１６週時にＮＳＧマウスを屠殺し、ＦＡＣＳにより、骨髄、脾臓、及び末梢血のヒトＣＤ４５ＲＡ＋及びマウスＣＤ４５＋生細胞について解析した。全ての処置群において照射ＮＳＧマウスへのｍＰＢＣＤ３４＋ヒト細胞移植を３名全ての健康なドナーから観察した。全てのドナーからの３つ全ての造血臓器において、ＦＡＣＳを用いてヒトＣＤ４５ＲＡ＋細胞が検出された。トランスフェクションしていないＣＤ３４＋対照細胞はわずかに良好な移植パーセンテージを示した。全てのトランスフェクション細胞群は、模擬トランスフェクション群を含め、３名全てのドナー全体において同様の移植パーセンテージを有した。概して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡＲＮＰの付加は、模擬トランスフェクション対照と比較して移植に影響を及ぼさなかった（図２９Ａ〜Ｅ及び図３０）。図２９Ａ〜Ｅにおけるデータ点は、個々のマウスを表し、ヒトＣＤ４５ＲＡ＋生細胞であった生細胞のパーセンテージを図示している。データは平均±ＳＥＭである。

実施例２１Ｃａｓ９ＲＮＰを用いたＳＰＹ１０１の編集効率及び有効性の評価
ＳＰＹ１０１を用いたＳＣＤ及びβ−サラセミアの処置に対しＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いて最も高い有効性を達成するため、発明者らは、２つの異なるＣａｓ９フォーマット、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質について、動員末梢血（ｍＰＢ）からのヒトＣＤ３４＋細胞における編集効率、有効性、及び毒性を評価した。Ｃａｓ９タンパク質に対するＣａｓ９ｍＲＮＡについての様々なソースの比較を、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＳＰＹ１０１ｇＲＮＡまたはＳＰＹ１０１ｇＲＮＡと複合体化されたＣａｓ９タンパク質（リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として）をヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレーションし、エレクトロポレーション後４８時間時におけるこれらの編集効率及び細胞生存率を評価することによって行った。Ｃａｓ９タンパク質に対するＣａｓ９ｍＲＮＡの様々なソースを比較し、一部のＣａｓ９ｍＲＮＡはＣａｓ９タンパク質に対し同様のレベルの編集効率を達成できる（図３１）一方で、図３２Ａ〜Ｂに示されるように、ほとんどは対照試料（エレクトロポレーションなし（ＥＰなし）または基質なしのエレクトロポレーション（模擬ＥＰ）の対照）と比較して有意に低い細胞生存率を有することを見いだした。このことは、Ｃａｓ９ＲＮＰが、ヒトｍＰＢＣＤ３４＋細胞へのＣａｓ９及びｇＲＮＡの効率的送達のために使用する上で最良のフォーマットであることを示している。

次に、Ｃａｓ９タンパク質について種々のソースを比較し、さらにＮまたはＣ末端に様々な数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を有するＣａｓ９タンパク質についても、編集をもたらす核へのＣａｓ９の効率的な局在化に影響を及ぼし得るため比較した。図３３Ａ〜Ｃに示されるように、Ｎ及びＣ末端の両方に１つのＮＬＳを有するＡｌｄｅｖｒｏｎＣａｓ９タンパク質は細胞生存率の変化を伴わずに最良の編集効率をもたらすことが見いだされた。

次に、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質（先の実施例から選択されたＦｅｌｄａｎまたはＡｌｄｅｖｒｏｎ）を用いて様々なヒトｍＰＢＣＤ３４＋ドナーにわたって調べたＳＰＹ１０１編集効率を収集し、ＡｌｄｅｖｒｏｎＣａｓ９タンパク質が最も高い編集効率をもたらすことが観察された（図３４Ａ）。さらに、Ｃａｓ９タンパク質を用いた臨床スケールでのＧＭＰ適合性の製造において、同様の比率の編集効率を達成することができた（図３４Ｂ）。

次に、ｍＰＢ（図３５Ａ〜Ｂ）または骨髄（ＢＭ、図３６Ａ〜Ｂ）に由来するいくつかのＣＤ３４＋ドナー全体におけるＳＰＹ１０１の有効性を調べた。発明者らの最適化プロセス全体にわたり、赤血球系分化ＣＤ３４＋細胞におけるα−グロビンまたはβ−グロビン様グロビン（β−グロビン＋γ−グロビン）に対するγ−グロビン発現として定量的リアルタイムＰＣＲによって測定された有効性が、より良好に達成されることが分かった。

次に、ＳＰＹ１０１がＳＣＤまたはβ−サラセミア患者から得られた細胞内で有効であるかどうかを調べた。健康なドナーまたは患者からの末梢血単核球に対し、ＳＰＹ１０１Ｃａｓ９ＲＮＰ及び上記実施例と同様の赤血球系分化を用いてエレクトロポレーションし、それからＲＮＡを抽出してγ−グロビン発現を測定した。ＳＰＹ１０１が確かに患者試料内でのγ−グロビン増加において有効であることが分かった（図３７Ａ〜Ｂ）。

ＳＰＹ１０１編集赤血球系細胞における表現型と遺伝子型との関係をより十分に理解するため、実施例１５と同様の単一コロニー解析をＣａｓ９ＲＮＰを用いて実施し、これにより、Ｃａｓ９ｍＲＮＡに比べてＣａｓ９ＲＮＰを用いた場合に、より大きな画分の両アレル編集コロニーが増加することが分かった（図３８Ａ〜Ｂ）。さらに、未編集コロニー、ＳＰＹ１０１により標的化されたＧＡＴＡ１結合部位の単一アレル分断、及びＧＡＴＡ１結合部位の両アレル分断の詳細なブレイクダウンから、対照ＧＦＰｇＲＮＡ処置細胞と比較してのγ−グロビン増加として測定された有効性の用量依存性がＳＰＹ１０１において明らかになった（図３９Ａ〜Ｂ）。

γ−グロビンを発現する細胞のパーセンテージを調べるため、ヒトｍＰＢからのＳＰＹ１０１Ｃａｓ９ＲＮＰ編集ＣＤ３４＋細胞におけるＦＡＣＳ解析を実施した。対照ＧＦＰｇＲＮＡ処置細胞と比較すると、ＳＰＹ１０１編集細胞では、γ−グロビンを発現する赤血球系分化細胞のパーセンテージがより高く（図４０Ａ〜Ｄ）、細胞当たりのγ−グロビン発現が増加した（図４０Ｅ）ことが分かる。

例示的な実施例に関する注記

本開示は、本発明の様々な態様及び／または潜在的用途を例示する目的で、様々な特定の態様における説明を提供しているが、バリエーション及び改変が生じ得ることが当業者には理解される。したがって、本明細書に記載の発明（単数または複数）は、少なくとも特許請求される内容と同じ範囲で理解されるべきであり、本明細書で提供される特定の例示的態様によって定義されるより狭い範囲で理解されるべきではない。

本明細書で特定された任意の特許、刊行物、または開示資料は、別段の指示がない限り、ただし、組み込まれる資料が既存の説明、定義、記載、または本明細書で明示的に記された他の開示資料と矛盾しない程度において、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなものとして、また必要な程度において、本明細書で記された明示的開示は、参照により組み込まれたいかなる矛盾する資料にも優先される。参照により本明細書に組み込まれると述べられ、ただし既存の定義、記載、または本明細書に記された他の開示資料と矛盾する任意の資料またはその一部は、この組み込まれた資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲にとどまって組み込まれる。出願人らは、本明細書を修正して、参照により本明細書に組み込まれる任意の主題またはその一部を明示的に挙げる権利を留保する。

Claims

ヒト細胞におけるＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、
前記ヒト細胞にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入して、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすステップを含み、任意に、前記転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロンまたは前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球エンハンサーの＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置し、前記１つ以上のｇＲＮＡの１つが配列番号７１，９５９の核酸配列を含む、前記方法。
（ｉ）前記細胞に、前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及び前記１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること；または
（ｉｉ）前記細胞に、前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及び前記１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含み、任意には、前記１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡが、１つ以上の改変ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
前記１つ以上のタンパク質またはポリペプチドが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接しており、任意には、前記１つ以上のＮＬＳがＳＶ４０ＮＬＳである、請求項１または２に記載の方法。
前記１つ以上のｇＲＮＡが単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼが前記１つ以上のｇＲＮＡまたは前記１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成し、任意には、前記ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ＮＬＳを含み、ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項５に記載の方法。
前記方法が、前記細胞に、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）前記方法が、前記細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することを含み、ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近の座位に１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、前記座位で前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、前記座位に近接する前記染色体ＤＮＡの前記転写制御配列の永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす；または
（ｉｉ）前記方法が、前記細胞に、前記１つ以上のｇＲＮＡと、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することを含み、ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１の切断を５’座位で、第２の切断を３’座位で起こしまたは創出し、前記５’座位と前記３’座位との間で前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、前記５’座位と前記３’座位との間で前記染色体ＤＮＡの前記転写制御配列における永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成し、任意には、前記ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項８に記載の方法。
（ｉ）前記ドナーテンプレートが１本鎖または２本鎖であり、及び／または
（ｉｉ）前記改変転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置するか、または、前記改変転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球エンハンサーの＋５８ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）前記Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートが、それぞれが別々の脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または全てが１つの脂質ナノ粒子に同時に製剤化されるか；または
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９が１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、前記ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートの両方がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって前記細胞に送達されるか；または
（ｉｉｉ）前記Ｃａｓ９が１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、前記ｇＲＮＡがエレクトロポレーションによって前記細胞に送達され、ドナーテンプレートがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって前記細胞に送達される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上のＲＮＰがエレクトロポレーションによって前記細胞に送達される、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。