CN109294994B

CN109294994B - 有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用

Info

Publication number: CN109294994B
Application number: CN201810589659.3A
Authority: CN
Inventors: 马燕琳; 龙平; 李崎; 黄元华; 李玲丽
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2038-06-08
Also published as: CN109294994A

Abstract

有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用。本发明提供了一种诱导型多能干细胞。该诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变。根据本发明实施例的诱导型多能干细胞最初是由由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，依据一定的基因修复手段对初始诱导型多能干细胞进行突变修复后，获得本申请的诱导型多能干细胞，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变。根据本发明实施例的诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。

Description

有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，本发明涉及诱导型多能干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

地中海贫血波及了全球，占世界人口的2％，约2.5亿人口为地贫的携带者，其包括α及β地贫，多分布于地中海、非洲等沿海地域，而中国常见于广东、海南等南部沿海区域。成人血红蛋白由4条相互平衡的珠蛋白链构成，包括2条α链和2条β链。ll号常染色体上指导血红蛋白中的β珠蛋白合成的β珠蛋白基因(HBB gene)缺陷引起β珠蛋白合成困难或减少，α珠蛋白失去平衡，多余的α珠蛋白沉积于红细胞膜上，从而破坏红细胞膜，引起溶血性贫血，该常染色体遗传病因而称为β地中海贫血。β-地中海贫血一共有 300多种突变类型，与镰刀形细胞性贫血一起时对于城市的发展是有极大的影响的。而位于16号染色体上的α珠蛋白基因(α-glonbin gene，HBA)缺陷可引起α链的合成不足，β链相对过多，对于胎儿来说形成γ4四聚物，称为Hb Bart's，患病胎儿则称为巴氏水肿胎儿。而对于成人来说形成β4四聚物，称为HbH，相应疾病则称为HbH病。αβ复合地中海贫血则其HBA和HBB都发生了突变，α珠蛋白和β珠蛋白有可能相对平衡，但在临床中发现轻型复合型地贫的临床症状常常主要以轻型的β地贫的症状出现，α地贫的症状被掩盖；而重型复合型地贫常常表现出中间型地贫的症状，关于海南地区的地贫研究发现αβ复合地贫的发生率达到了32.16％，若αβ复合地贫携带者跟正常人生育，最多表现为轻型地贫的症状，但若跟轻型α地贫或β地贫患者婚配，则生出重型患者的几率达到了25％，若跟同样是携带αβ复合突变的患者结婚，那么生出重型地贫患者的几率会大大增高。中间型地贫患者的临床症状有很大的差异，可轻可重,轻型患者仅表现为轻度贫血，而重型患者则类似于重型β地贫患者的临床表现，但与之不同的是中间型患儿可至6、7岁都不需要输血或者只需要偶尔输血便能维持生活，但此后症状逐渐加重，需要长期的输血治疗。重型地贫若不给予输血或其他治疗，患儿诞生不久就会夭折。输血治疗虽然可以暂时缓解贫血症状，不过长期反复地输血，铁离子就会不断地沉积在体内，最后寿命将终止于器官衰竭。当前可以根治地贫仅有的方法是异基因骨髓或造血干细胞移植、自身或异体脐带血移植。但是移植物抗宿主病及免疫排斥依然是异体移植必须面临着的两个难题，因此就需要找到主要组织相容性抗原相匹配的供体，以避免上述排斥反应的发生，对于移植3 年以上的患者仍然存在着一些免疫并发症以及移植失败的风险，在缺乏供体的情况下，可以在移植自体骨髓前将突变位点纠正后再行移植，这或许是治疗地贫的新希望，或者将正常的HBB、HBA导入患者靶细胞弥补缺失的功能也是目前地中海贫血最直接的治疗方式，但由于缺乏安全有效的表达载体而进展缓慢。

因此，安全有效地治疗地中海贫血地方法还有待进一步开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种诱导型多能干细胞。根据本发明的实施例，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞最初来源于地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞并经过IPS诱导和突变修复而来。根据本发明实施例的诱导型多能干细胞最初是由由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，依据一定的基因修复手段对初始诱导型多能干细胞进行突变修复后，获得本申请的诱导型型多能干细胞，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变。根据本发明实施例的诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。

根据本发明的实施例，上述诱导型多能干细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因具有SEQ ID NO:3示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所示诱导型多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，以便获得所述诱导型多能干细胞，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2基因的westmead突变。根据本发明实施例的方法获得诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述突变修复是通过CRISPR/Cas9技术实现的。CRISPR/Cas9 相对于ZFN、TALEN更加简单，且在时间上可以实现准确调控，甚至在干细胞分化的各个阶段进行特定基因的编辑。

根据本发明的实施例，所述HBA2基因的westmead突变的修复是通过如下方式进行的：1)构建sgRNA，所述sgRNA是针对HBA2基因的第三个外显子下游200bp位置设计的，所述sgRNA具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列；2)将所述sgRNA插入PX330，以便构建质粒HBA2-sgRNA；将所述sgRNA插入pTP53-GFP-reporter载体，以便构建质粒HBA2-GFP-reporter-sgRNA；3)通过钙转方式将所述质粒GFP-reporter-sgRNA和质粒 HBB-sgRNA转染入293T细胞，以检测sgRNA的活性；4)构建质粒HBA2-Donor，所述HBA2-Donor的左臂包括完整HBA2基因；5)将线性化的所述质粒HBA2-Donor以及质粒HBA2-sgRNA电转入iPS细胞株；6)将步骤5)获得的iPS细胞株经过G418的筛选、PCR+克隆以及测序分析，以便获得westmead突变修复的iPS细胞株。根据本发明实施例的上述方法可有效实现westmead突变修复，效率高达14％。

根据本发明的实施例，所述携带地中海贫血症westmead突变的羊水细胞为人孕中期羊水细胞，所述羊水细胞为具有westmead突变的ααws/αα的细胞。进而取材方便，其中同时αα^ws/αα突变细胞表示存在人α珠蛋白基因(HBA2gene)Westmead(CAC→CAG) 突变的细胞。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种有效修复地中海贫血Westmead(CAC→CAG) 突变的方法。所述方法包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2基因的westmead(CAC→CAG)突变，根据本发明的实施例构建质粒HBA2-sgRNA、 HBA2-Donor，通过电转染的方式将上述质粒转入含ααws/αα突变的iPSCs，对其westmead突变位点进行修复得到完整修复的iPS细胞株αα/αα_corrected iPS。根据本发明实施例的方法获得诱导型多能干细胞αα/αα_corrected iPS具有多能性，相对于具有 westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。

在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的诱导型多能干细胞(αα/αα _corrected iPS)在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防地中海贫血症。前面所述的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显提高，可有效用于治疗或预防地中海贫血症。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合包括前面所述的诱导型多能干细胞(αα/αα_corrected iPS)。利用根据本发明实施例的药物组合物可有效用于治疗或预防地中海贫血症，且安全性高。

根据本发明的实施例，进一步包括辅剂。根据本发明的具体示例，所述辅剂可包括冻干保护剂，以进一步提高诱导型多能干细胞的活性。

本申请一方面成功地利用CRISPR/Cas9技术修复了羊水细胞来源的iPSCs的HBA2基因westmead突变；另一方面，修复后的iPSCs在细胞形态、核型、多能性基因的表达、多向分化能力均与修复前的iPSCs无显著性差异；再一方面，在定向诱导造血分化的过程中，表现出正常的分化能力和分化效率，修复后的iPS细胞株相对于修复前的iPS细胞株在造血功能方面明显地提高了。

综上，根据本发明实施例获得的诱导型多能干细胞为临床地中海贫血的治疗提供了实验基础，具有重要的研究价值和临床应用前景。

附图说明

图1是根据本发明实施例的成功地修复了HBA2突变位点westmead的结果图；

其中，图1中A显示了以HBA2第三个外显子下游200bp左右为打靶位点设计α2-sgRNA，并构建同源臂质粒，sgRNA切割DNA后诱导DNA的损伤修复机制——同源重组，从而修复突变位点，PR/PF为PCR初步鉴定引物；

B显示了发明人在pTP53-GFP-reporter载体的GFP基因中间插入α2-sgRNA构建质粒GFP-reporter-sgRNA，通过钙转方式将GFP-reporter-sgRNA和HBA2-sgRNA转染入293T细胞，以观测sgRNA的活性，结果证明在同时转染了GFP-reporter-sgRNA和 HBA2-sgRNA的293T细胞其荧光表达量明显增高了；

C显示了若westmead突变修复时，PR/PF扩增可见500bp、2000bp条带；D显示了Westmead突变修复后的测序图(CAS→CAC)；

图2是根据本发明实施例的修复后的iPS细胞株的多能性保持不变的结果图；

其中，图2中A显示了修复后的iPS细胞株为正常女性核型46，XX；

B显示了畸胎瘤实验得到了三个畸胎瘤，最大的约20×12mm，通过切片及HE染色能明显地显示内、中、外三个胚层；

C显示了修复前后多能性基因OCT4、SOX2、NANOG检测无显著性差异(P＞0.05)；

图3是根据本发明实施例的修复后的iPS细胞造血功能明显改善的结果图；

其中，A显示了造血分化过程中的细胞形态；

B显示了修复后iPSCs造血分化过程中CD34⁺CD43⁺双阳性细胞明显高于修复前；

C显示了多能性基因OCT4、SOX2、NANOG在造血分化过程中逐渐降低，趋近于0；

D显示了修复后的iPS细胞在造血分化过程中胚层基因T的表达高峰较修复前提前；

E显示了CFU-E的流式分析结果显示，未修复的iPS细胞未检测到红细胞及β珠蛋白，修复后的iPS细胞可以看到其β珠蛋白的表达与脐血、H1无明显差异；

F显示了倒置显微镜下CFU-E的形态，修复后iPS细胞所形成的CFU-E的数量明显高于修复前(P＜0.05)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

材料和方法

1试剂与材料

1.1实验对象

1.1.1α地中海贫血症westmead(CAC→CAG)突变iPSCs的基因修复

本实验选取羊水来源的iPSCs为实验对象进行αWestmead(CAC→CAG)修复：αα/α^WSαiPS

1.2试剂如下表

1.3材料

名称	品牌
		电泳仪	伯乐
分光光度计	Thermo
		倒置显微镜	Carl Zeiss
超净工作台	ESCO
		电转仪	Lonza
Q-PCR仪	Agilent
		FACS Aria	BD
推车式电动吸引器	斯曼峰
		生物安全柜	Heal Force
涡旋混合器	双旭
		微型离心机	奥盛
低速离心机	中科中佳
		雪花制冰机	Scotsman

1.4相关基因片段及引物序列

超低温冰箱	Thermo
		恒温金属浴	卡尤迪
冷冻离心机	Eppendorf
		荧光定量PCR仪	Bio-Rad

1.5相关基因片段及引物序列

α2-sgRNA-F：CACCGATGGAGAGCGTATGTTAAC(SEQ ID NO：1)。

α2-sgRNA-R：AAACGTTAACATACGCTCTCCATC(SEQ ID NO：2)。

HBA2 Gene：

CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAG AGAGAACCCACCATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGG GGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGG CTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTC AACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATG TTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCT CTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTG GCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCAC AAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTG GGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGG AGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCAC AGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCAC CCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGAC CTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCC CAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA GTGGGCAGCA(SEQ ID NO：3)

HBA2-LA：

tcctgccgacaagaccaacgtcaaggccgcctggggtaaggtcggcgcgcacgctggcgagtatggtgcggaggccctggaga ggtgaggctccctcccctgctccgacccgggctcctcgcccgcccggacccacaggccaccctcaaccgtcctggccccggacccaaac cccacccctcactctgcttctccccgcaggatgttcctgtccttccccaccaccaagacctacttcccgcacttcgacctgagccacggctctg cccaggttaagggccacggcaagaaggtggccgacgcgctgaccaacgccgtggcgcacgtggacgacatgcccaacgcgctgtccg ccctgagcgacctgcacgcgcacaagcttcgggtggacccggtcaacttcaaggtgagcggcgggccgggagcgatctgggtcgaggg gcgagatggcgccttcctctcagggcagaggatcacgcgggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccgcact gaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcct ccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctggg cctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggag(SEQ ID NO:4)。

HBA2-RA：

aggcagtggctcagaagctggggaggagagaggcatccagggttctactcagggagtcccagcatcgccaccctcctttgaaatct ccctggttgaacccagttaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcag gtgccagaacatttctctcattcccaccccttcctgccagagggtaggtggctggagtgagggtgctggccctactcacacttcctgtgtcacg gtgaccctctgagagcagcccagtcagtggggaaggaggaaggggctgggatgctcacagccggcagcccacacctggggagactctt cagcagagcaccttgcggccttactcctgcacgtctcctgcagtttgtaaggtgcattcagaactcactgtgtgcccagccctgagctcccag ctaattgccccacccagggcctctgggacctcctggtcttctgcttcctgtgctgccagcaacttctggaaacgtccctgtccccggtgctgaa gtcctggaatccatgctgggaagttgcacagcccatctggctctcagccagcctaggaacatgagcagcacttccaacccagtccctgcccc acagcaagcctccccctccacactcacagtactggattgagctttggggagggtggagaggaccctgtcactgctttccttctggacatggac ctctctgaattgttggggagttccctcccctctccaccacccgctcttcctgcgcctcacag(SEQ ID NO:5)。

引物：

α2-GFP-sgRNA-F：GATCGATGGAGAGCGTATGTTAACTGG(SEQ ID NO:6)。

α2-GFP-sgRNA-R:AGCTCCAGTTAACATACGCTCTCCATC(SEQ ID NO:7)。

HBA2-LA-F-EcoR1：CGGAATTCTCCTGCCGACAAGACCAAC(SEQ ID NO：8)。

HBA2-LA-R-Cla1：CCATCGATCTCCATTGTTGGCACATTCC(SEQ ID NO:9)。

HBA2-RA-F-Sal1：ACGCGTCGACAGGCAGTGGCTCAGAAGC(SEQ ID NO:10)。

HBA2-RA-R-BamH1:CGGGATCCCTGTGAGGCGCAGGAAGA(SEQ ID NO:11)。

PR:ACCGTGCTGACCTCCAAATAC(SEQ ID NO:12)。

PF：ACTCCAGCCACCTACCCT(SEQ ID NO:13)。

HBA2-Seq-R：ACTGACCCTCTTCTCTGCAC(SEQ ID NO:14)。

HBA2-Seq-F:TGCCCACTCAGACTTTATTCAA(SEQ ID NO:15)。

Oct4-F：CCTCACTTCACTGCACTGTA(SEQ ID NO:16)。

Oct4-R：CAGGTTTTCTTTCCCTAGCT(SEQ ID NO:17)。

Sox2-F：CCCAGCAGACTTCACATGT(SEQ ID NO:18)。

Sox2-R：CCTCCCATTTCCCTCGTTTT(SEQ ID NO:19)。

Nanog-F：TGAACCTCAGCTACAAACAG(SEQ ID NO:20)。

Nanog-R：TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG(SEQ ID NO:21)。

PAX6-F：ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG(SEQ ID NO:22)。

PAX6-R：ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG(SEQ ID NO:23)。

MSX1-F：CGAGAGGACCCCGTGGATGCAGAG(SEQ ID NO:24)。

MSX1-R：GGCGGCCATCTTCAGCTTCTCCAG(SEQ ID NO:25)。

2实验方法

2.1培养基配制：

iPS冻存液：6ml mTesR、3ml DFBS、1ml DMSO

293T培养基：DMEM+10％FBS

Facs Buffer：PBS+2％FBS

293T冻存液：FBS 9ml+DMSO 1ml

OP9培养基：α-MEM+20％FBS

Co-culture培养基：500ml α-MEM+10％DFBS+100ul MTG

2.2打靶质粒构建

2.2.1 HBA2-sgRNA构建

(1)发明人在HBA2第三个外显子下游200bp左右设计α2-sgRNA，并分别加入酶切位点Xba1和Kpn1。

(2)sgRNA合成后根据其量加入ddH₂O溶解，稀释至20μM的浓度。

(3)合成双链sgRNA

β-SgRNA-F 5μl

β-SgRNA-R 5μl

10x NE Buffer 5μl

ddH₂O 35μl

SgRNA-F 5μl

SgRNA-R 5μl

10x NE Buffer 5μl

ddH₂O 35μl

两个体系分别混合之后，水浴锅中95℃10min，倒入泡沫箱里自然冷却4h。

(4)FD Xbal1和FD Kpn1酶切质粒px330(236ng/μl)

Px330 1μg(4.23μl)

FD Xbal1 1μl

FD Kpn1 1μl

Buffer 5μl

dd H₂0 38.77μl

50μl

于37℃培养箱中酶切2h。

(5)琼脂糖凝胶回收px330酶切产物(TIANGEN)

1)制胶：称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1×TAE，微波炉中加热3min，溶液变清澈后轻轻倒入胶板中，避免产生气泡。

2)待胶冷却凝固后点样：5μl loading buffer+10μl Marker，10μl loadingbuffer+酶切产物，2μl loading buffer+1μl px330+7μl ddH2O。

3)跑胶：160v 20min

4)照胶：比较酶切产物及px330的条带，一般酶切后的质粒较原质粒条带大。

5)天根胶回收试剂盒回收酶切产物。

(6)连接px330酶切产物和sgRNA

Px330 0.5μl

sgRNA 4.5μl

Sollution 1 5μl

混匀后于16℃连接2h。

(7)转化并送测序

1)取50μl DH5α于冰上溶解，加入10μl上述PX330-sgRNA连接产物，混匀后，冰浴半小时；

2)42℃热击90s；

3)冰浴3min；

4)超净台里加1ml无抗的LB培养基至混合物中，置于37℃摇床半小时；

5)6000rpm离心2min，超净台中弃900ul上清，余下的100μl溶液重悬后加入至氨苄抗性的LB培养板中，过火冷却的玻璃棒将菌液涂匀；

6)正置于37℃培养箱30分钟以后倒置，第二天挑取菌落。

(8)挑取菌落送测序

超净台中随机挑取5个菌落分别至加有1ml A+的LB培养基的EP管中，置37℃摇床1小时，艾基公司测序，引物：PX330-F：5'GATACAAGGCTGTTAGAG 3'(SEQ ID NO:26)。

(9)测序正确的克隆进行摇菌并提取质粒

2.2.2 HBA2-Donor构建

(1)在HBA2打靶位点的前800bp及后700bp作为左右同源臂(LA、RA)，并插入PUC-57载体中的抗性基因片段neo两侧(步骤同上)，经EcoR1酶切线性化后电转入载体进行同源重组。

线性化：质粒20μg

10xM Buffer 10μl

EcoRΙ4μl

ddH₂O补充至100μl

37℃培养箱酶切过夜

(2)琼脂糖凝胶电泳鉴定：

1)制胶：0.3g琼脂糖粉+30ml 1×TAE(1％琼脂糖凝胶)微波炉加热，溶液清澈后倒入胶槽，凝固后点样如下：

2μl Loading Buffer+5μl Marker(15000)

2μl Loading Buffer+2μl原质粒+5μl ddH₂O

2μl Loading Buffer+2μl酶切产物+5μl H₂O

2)琼脂糖凝胶电泳：150V 20min

在紫外线的照射下可见原质粒的条带较酶切后的质粒条带小，因此可以确定质粒已酶切线性化，线性化的质粒可以更好地与同源基因进行互补从而修复突变基因。

(4)因酶切体系中依然残存一些酶，因此需要进一步纯化(QIAquickGelExtraction Kit)

2.2.3 GFP-reporter-sgRNA构建

(1)合成序列：

α2-GFP-sgRNA-F：GATCCCACCGATGGAGAGCGTATGTTAACTGG(SEQ ID NO:27)。

α2-GPF-sgRNA-R：AGCTTCCAGTTAACATACGCTCTCCATCGGTG(SEQ ID NO:28)。

(2)退火：

将上述合成的引物稀释成20μM；

GFP-sgRNA-F 5μl

GFP-sgRNA-R 5μl

10x NEBuffer 5μl

ddH₂O 35μl

混合后放入95℃水浴锅中10min，倒入泡沫箱里自然冷却4h。

(3)酶切pTP53-GFPreporter

质粒1μg

FD BamH1 1μl

FD HindⅢ 1μl

Buffer 5μl

ddH₂O补充至50μl

37℃培养箱酶切2h。

(4)胶回收酶切产物(TIANGEN)(步骤同px330的胶回收)；

(5)连接

Ptp53-GFPreporter(BamH1/HindⅢ)0.5μl

GFP-sgRNA 4.5μl

Sollution 1 5μl

16℃连接2h。

(6)转化并随机挑取6个菌落送测序(艾基)，测序正确的克隆摇菌提取质粒。

1)取50μl DH5α于冰上溶解，加入10μl上述pTP53-GFPreporter+GFP-sgRNA连接产物，混匀后，冰浴半小时；

2)42℃热击90s；

3)冰浴3min；

6)正置于37℃培养箱30分钟以后倒置，第二天挑取菌落。

7)超净台中随机挑取5个菌落分别至加有1ml A+的LB培养基的EP管中，置37℃摇床1小时，艾基公司测序，引物：PX330-F：5'GATACAAGGCTGTTAGAG 3'(SEQ ID NO:29)。。

8)测序正确的克隆进行摇菌并提取质粒

2.3 sgRNA的活性检测

2.3.1 293T的复苏

(1)37℃水浴箱中轻轻摇晃，直到冻存管内细胞液直至绿豆大小；

(2)拿至生物安全柜，转移至15ml离心管；

(3)逐滴滴入DMEM/F12,同时晃动混匀，直到加至6ml，常温离心机离心3分钟(300g)，去掉上清液；

(4)1ml 293T培养基重悬离心后的沉淀，并转移至已更换为293T培养基的10cm盘中， 37℃培养，每天换液。

2.3.2传代

(1)待细胞密度增至80％时，2ml 0.25T胰酶消化2min；

(2)加入2倍体积的培养基终止消化并重悬，吸取至15ml离心管中，常温下离心3分钟(300g)，吸弃上清液；

(3)1ml培养基重悬，取20μl计数板计数；

(4)以50x10⁴传至12孔板；

(5)24h后进行钙转，剩余的细胞种植至10cm盘。

2.3.3冻存

(1)10cm盘的293T长满后，2ml 0.25％胰酶消化2min；

(2)4ml培养基终止消化并重悬后转移至15ml离心管，常温下离心4分钟,(300g)；

(3)3ml冻存液重悬后，分三分转移至冻存管；

(4)4℃放置半小时后转移至-80℃冰箱，次日放至液氮罐。

2.3.4钙转

(1)12孔板中的293T细胞更换75μl 293T培养基；

(2)分成四组，每组3个孔分别加入如下试剂：

(3)加样顺序：ddH₂O、质粒、CaCl₂、HBS

(4)在加入Cacl₂之后充分混匀，常温下静置3分钟；

(5)加入HBS后充分震荡混匀，静置2min后加入12孔板中；

(6)12h后换液，48h后荧光显微镜下观察，并收集293T进行流式分析。

2.3.5流式(C6)分析：

(1)0.25％胰酶500μl消化2min；

(2)1ml 293T培养基终止消化并重悬，300G离心5min，弃上清；

(3)在EP管中加入500μl Facs Buffer，混匀；

(4)滤网过滤细胞后上流式，收集数据。

2.4 iPSCs的培养

2.4.1 iPSCs的复苏

(1)取出冻存管，快速放到37℃水中溶解，切忌水位超过管口，避免污染，不断晃动。

(2)待冻存管内细胞液溶解至绿豆大小时，酒精擦拭后拿至超净台。

(3)将冻存管内细胞液移至15ml离心管，慢慢滴入DMEM/F12，并轻轻晃动混匀，直到加入到6ml左右，离心后吸弃上清液。

(4)将1ml mTesR1加入Matrigel包被的六孔板中，用1ml mTesR重悬细胞，并种植于六孔板中。

(5)前后左右各摇三次使细胞种植均匀。

(6)放置于37℃培养箱中培养。

2.4.2 iPSCs的换液及传代

(1)iPS需每天更换培养基，即弃旧培养基，加入2ml新鲜培养基。

(2)待细胞增至80％左右时，弃旧培养基，加入500μl 0.5mM EDTA，放至37℃培养箱5min。

(3)弃EDTA，加入2ml mTesR重悬，以1:2分别加入已更换mTseR的Matrigel 包被的六孔板中。

(4)摇晃均匀后置于37℃培养箱。

2.4.3 iPSCs的冻存

(1)待细胞密度增至80％，加入0.5mM EDTA消化5min。

(2)弃EDTA，加入1ml ips冻存液重悬,并转移至冻存管中。

(3)放至4℃30min，转移至-80℃，第二天转移到液氮罐里。

2.5α地贫患者iPSCs的Westmead突变的修复。

2.5.1电转步骤

(1)培养ααws/αα的iPS细胞，隔天1：2传代，直至细胞状态良好。

(2)待细胞密度在80％左右时进行电转实验，提前8小时更换新鲜培养基。

(3)去旧培养基，600μl Accutase消化7min，600μl DMEM/F12终止消化，重悬细胞并转移至无菌的1.5ml EP管中。

(4)200g离心5分钟，弃去上清液，加入82μl sollutionⅡ、18μl sollution 1、2μgHBA2-Donor、4μg HBA2-sgRNA轻轻吹打混匀，避免产生气泡。

(5)将上述混合液转移至电转杯中，并放入电转移中，B-16程序电转。

(6)加入800μl mTesR重悬，并转移入Matrigel包被的已更换mTeSR培养基的三个六孔板中，加入Y27632(终浓度5μM)。

(7)次日更换培养基，不需加Y27632。

2.5.2药物筛选阳性克隆

待电转后细胞密度增至60％，加入G418(100μg/ml)，连续加药7天，待阳性克隆增大后，挑取克隆至24孔板。

2.5.3鉴定

(1)24孔板里的细胞长满后，传代时收取一半细胞至1.5ml EP管中，500g离心5分钟，弃上清，提取基因组(天根试剂盒)。

(2)抗性基因两侧分别设计上下引物PR、PF进行PCR，双侧等位基因突变均修复则琼脂糖凝胶鉴定可见2Kb左右的条带，单侧突变修复则可见一2Kb的条带和一500bp的条带，未修复则只可见一500bp的条带。

(3)PCR阳性的克隆进一步进行测序鉴定(艾基)。

测序引物:ACTGACCCTCTTCTCTGCAC(SEQ ID NO:30)。

2.6基因修复后的ααws/αα_corrected iPS多能性检测

2.6.1畸胎瘤实验

(1)ααws/αα_corrected iPS细胞种植到Matrigel包被的10cm大皿中，mTesR培养基培养；

(2)细胞密度增至80％，Accutase 2ml消化5分钟，2ml DMEM/F12终止消化，重悬后转移至15ml离心管中，常温离心机离心，转速300G，时间5min，去掉上清液；

(3)取消毒后的1.5mlEP管，加入400ulDMEM/F12和200ul Matrigel并混合，转移至15ml离心管将细胞重悬后再转移到1.5ml EP管中；

(4)将上述悬液转移至注射器中，注射至免疫缺陷小鼠皮下。

(5)常规饲养，8周后剥离畸胎瘤并送病理切片。

2.6.2核型分析

(1)秋水仙素处理：向1、2孔长至70％-80％密度的iPSCs中加入新鲜的mTesR培养基2mL，再加入40ul秋水仙素，使其终浓度为0.2μg/ml(储存浓度10μg/ml),置培养箱处理130min。

(2)细胞收获：PBS洗细胞两次，用0.25％胰酶0.5ml消化2min，加入1ml MEF终止消化，转移至15ml离心管中。1500rpm，5min离心，吸去上清收集细胞。

(3)低渗：加入预热的0.075mol/L KCl溶液7ml，用吸管吹打混匀细胞，置37℃水浴箱低渗处理20min。

(4)预固定：配制固定液(甲醇：乙酸＝3:1)，加入1ml固定液预固定3min(吹打混匀，动作轻柔)。

(5)固定：预固定后，1500rpm，5min离心，吸去上清，加入8ml固定液，吹打混匀，于37℃水浴箱固定30min。

(6)滴片：固定完成后，1500rpm，5min离心，吸去上清，加入适量固定液重悬细胞，使用冷藏于4℃的载玻片进行滴片，距离玻片10cm高度滴2滴于玻片不同的位置，等 3-5秒。于酒精灯中焰快速过火5-7次，至玻片上出现均匀的小水珠为佳。

(7)烤片：将滴好的片放到烤片箱中：a、75℃，3h；b、90℃，25min。

(8)染片：配液:

1)胰酶：50ml磷酸盐缓冲液+1ml胰酶液

2)洗涤液：50ml NaCl

3)染液：50ml灭菌注射用水+5ml GiemSa原液

(9)核型分析：染片后自然晾干，在显微镜下挑选出优质的片用扫片仪进行扫片，分析。

2.6.3多能性基因的检测

(1)提取RNA

1)细胞长满六孔板的80％，0.5mM EDTA消化5分钟，1ml F12终止消化，常温离心机离心，转速500G，时间5min，去掉上清液；

2)加入500μl Trizol吹打；

3)加入200μl CHCl₃颠倒均匀，放置2min后，再次混匀，期间重复3-4次；

4)将其放入4℃离心机中，转速14000rpm，时间15min，小心吸取透明的上清液至200μl预冷的异丙醇中；

5)混匀以后冰上放置5分钟，再转移至4℃离心机里，转速14000rpm，时间10min，去掉上清液，加入750μl 75％无水乙醇，轻轻将沉淀弹起，14000rpm离心5min(4℃离心机)，将上清全部吸弃，晾干，直至沉淀变成透明。

6)加入50μl RNAfree H₂O，混匀，测定浓度。

(2)逆转录(逆转录试剂盒)Q-PCR(Takara)

2.7造血分化和集落形成试验

2.7.1造血分化

(1)Co-culture

1)0P9细胞长至融合状态，iPSCs长至六孔板的80％；

2)Dispase消化iPS细胞5分钟，直至克隆边缘稍微卷起，吸弃Dispase，加入1mlDMEM/F12终止消化，枪头呈井字型刮取细胞，并吸取到15ml离心管中，静置5分钟；

3)将种有OP9的10cm盘和六孔板换为Co-culture培养基；

4)将自然沉降的细胞上清吸弃，用mTesR重悬后转移至10cm盘和六孔板中，摇匀，放至37℃培养箱；

5)D2 20ml Co-culture全换液，D4、D6、D8、D10半换液，并收集D2、D4、D6、 D8、D10的细胞提取RNA，D8、D10、D12的细胞上流式。

2.7.2集落形成试验

(1)取co-culture D10细胞，弃旧培养基，2ml胰酶消化20min；

(2)4ml co-culture medium终止消化，转移入15ml离心管中，常温离心机离心，转速 300G，时间5分钟；

(3)去掉上清液，加入500μl Buffer混匀，制成单细胞悬液，再加入10μlFcRBlocking 混匀，4℃放置15分钟；

(4)加入10μl CD34⁺磁珠混匀，4℃放置30min；

(5)加入6ml FACS Buffer混匀，常温离心机离心，转速300G，时间5分钟；

(6)弃上清，加入1ml FACS Buffer混匀，尼龙筛过滤；

(7)2ml FACS Buffer平衡吸附柱，待停漏；

(8)将过滤后的细胞液转移入吸附柱中；

(9)停漏后加入2ml FACS Buffer洗涤，连续3次；

(10)将吸附柱置于新的15ml离心管上，加入1ml FACS Buffer，用泵将其中的CD34⁺细胞压出，细胞计数；

(11)取(2-5)×10⁴/ml细胞量和100μlαMDM+10％血清及1ml甲基纤维素充分混匀种植于35mm的培养皿中；

(12)将35mm培养皿置于大皿中，PBS或灭菌H₂0淹没皿底。

(13)2周后观察CFU红系数量并做流式分析。

实验结果

1、成功地修复了HBA2突变位点westmead(CAC→CAG)

发明人在HBA2第三个外显子下游200bp左右设计了sgRNA，分别插入PX330、pTP53-GFPreporter载体中构建了质粒HBA2-sgRNA、HBA2-GFPreporter-sgRNA，结果证明在同时转染了HBA2-GFPreporter-sgRNA的293T细胞其荧光表达量明显增高了(见图1B)。此外，发明人构建了质粒HBA2-Donor，电转入ααws/ααiPS细胞株，再经过G418筛选1周后，挑取抗药克隆至24孔板，发明人分别提取了各个抗药克隆的基因组，通过PF/PR的初步PCR鉴定，得到了PCR阳性克隆，再通过进一步测序，最终获得了westmead(CAC→CAG)突变修复细胞株αα/αα_corrected iPS(打靶策略及结果见图1A，C，D)，其打靶效率(见表1)。

表1各iPS细胞株打靶效率总结表

iPS细胞株	G418+克隆数	PCR阳性克隆数	效率
				ααws/αα_corredcted iPS	34	5	14％

2、修复后的iPS细胞株的多能性保持不变

染色体核型分析结果显示修复后的iPSCs的核型是46，XX(见图2A)。发明人在免疫缺陷老鼠的皮下三个部位分别注射了1×10⁶个修复后的iPS细胞，6周后获得了三个畸胎瘤，最大的约20×12mm，病例分析可以看出明显的三个胚层，说明修复后的iPS细胞株仍然具有多向分化能力(见图2B)。另外，发明人通过q-PCR检测了多能性基因OCT4、 SOX2、NANOG相对于内参GAPDH的相对表达量(该实验重复了三次)，修复前和修复后的iPS细胞株其多能性基因的表达无显著性差异(P＞0.05)(见图2C)。

4、修复后的iPS细胞造血功能明显改善

通过干细胞与OP9共培养可以使干细胞向造血方向分化的特点，发明人将地贫突变位点修复前和修复后的iPS细胞进行了共培养实验，随着天数的增加，iPS开始分化，形态逐渐改变(见图3A)，并且干细胞基因OCT4、SOX2、NANOG的表达也逐渐降低(见图 3C)。在D10用流式分析检测了CD34和CD43双阳性细胞，修复后的iPS细胞组明显高于未修复的iPS细胞组(见图3B)。此外发明人用Q-PCR检测了D0-D10的GATA4、 T、PAX6基因的相对表达量，内参为GAPDH，修复后的iPS细胞组较未修复的iPS细胞组中胚层基因T的表达高峰明显提前(见图3D)。在共培养D10用磁珠分选CD34+ 细胞并进行集落形成试验，在2周后挑取CFU-E进行流式分析，未修复的iPS细胞未检测到红细胞及β珠蛋白，修复后的iPS细胞可以看到其β珠蛋白的表达与脐血、H1无明显差异(见图3E)。并且修复后iPS细胞所形成的CFU-E的数量明显高于修复前(P ＜0.05)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南医学院

<120> 有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用

<130> PIDC3175052

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-sgRNA-F

<400> 1

caccgatgga gagcgtatgt taac 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-sgRNA-R

<400> 2

aaacgttaac atacgctctc catc 24

<210> 3

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2 Gene

<400> 3

cataaaccct ggcgcgctcg cgggccggca ctcttctggt ccccacagac tcagagagaa 60

cccaccatgg tgctgtctcc tgccgacaag accaacgtca aggccgcctg gggtaaggtc 120

ggcgcgcacg ctggcgagta tggtgcggag gccctggaga ggtgaggctc cctcccctgc 180

tccgacccgg gctcctcgcc cgcccggacc cacaggccac cctcaaccgt cctggccccg 240

gacccaaacc ccacccctca ctctgcttct ccccgcagga tgttcctgtc cttccccacc 300

accaagacct acttcccgca cttcgacctg agccacggct ctgcccaggt taagggccac 360

ggcaagaagg tggccgacgc gctgaccaac gccgtggcgc acgtggacga catgcccaac 420

gcgctgtccg ccctgagcga cctgcacgcg cacaagcttc gggtggaccc ggtcaacttc 480

aaggtgagcg gcgggccggg agcgatctgg gtcgaggggc gagatggcgc cttcctctca 540

gggcagagga tcacgcgggt tgcgggaggt gtagcgcagg cggcggctgc gggcctgggc 600

cgcactgacc ctcttctctg cacagctcct aagccactgc ctgctggtga ccctggccgc 660

ccacctcccc gccgagttca cccctgcggt gcacgcctcc ctggacaagt tcctggcttc 720

tgtgagcacc gtgctgacct ccaaataccg ttaagctgga gcctcggtag ccgttcctcc 780

tgcccgctgg gcctcccaac gggccctcct cccctccttg caccggccct tcctggtctt 840

tgaataaagt ctgagtgggc agca 864

<210> 4

<211> 837

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-LA

<400> 4

tcctgccgac aagaccaacg tcaaggccgc ctggggtaag gtcggcgcgc acgctggcga 60

gtatggtgcg gaggccctgg agaggtgagg ctccctcccc tgctccgacc cgggctcctc 120

gcccgcccgg acccacaggc caccctcaac cgtcctggcc ccggacccaa accccacccc 180

tcactctgct tctccccgca ggatgttcct gtccttcccc accaccaaga cctacttccc 240

gcacttcgac ctgagccacg gctctgccca ggttaagggc cacggcaaga aggtggccga 300

cgcgctgacc aacgccgtgg cgcacgtgga cgacatgccc aacgcgctgt ccgccctgag 360

cgacctgcac gcgcacaagc ttcgggtgga cccggtcaac ttcaaggtga gcggcgggcc 420

gggagcgatc tgggtcgagg ggcgagatgg cgccttcctc tcagggcaga ggatcacgcg 480

ggttgcggga ggtgtagcgc aggcggcggc tgcgggcctg ggccgcactg accctcttct 540

ctgcacagct cctaagccac tgcctgctgg tgaccctggc cgcccacctc cccgccgagt 600

tcacccctgc ggtgcacgcc tccctggaca agttcctggc ttctgtgagc accgtgctga 660

cctccaaata ccgttaagct ggagcctcgg tagccgttcc tcctgcccgc tgggcctccc 720

aacgggccct cctcccctcc ttgcaccggc ccttcctggt ctttgaataa agtctgagtg 780

ggcagcagcc tgtgtgtgcc tgggttctct ctatcccgga atgtgccaac aatggag 837

<210> 5

<211> 794

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-RA

<400> 5

aggcagtggc tcagaagctg gggaggagag aggcatccag ggttctactc agggagtccc 60

agcatcgcca ccctcctttg aaatctccct ggttgaaccc agttaacata cgctctccat 120

caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt 180

gccagaacat ttctctcatt cccacccctt cctgccagag ggtaggtggc tggagtgagg 240

gtgctggccc tactcacact tcctgtgtca cggtgaccct ctgagagcag cccagtcagt 300

ggggaaggag gaaggggctg ggatgctcac agccggcagc ccacacctgg ggagactctt 360

cagcagagca ccttgcggcc ttactcctgc acgtctcctg cagtttgtaa ggtgcattca 420

gaactcactg tgtgcccagc cctgagctcc cagctaattg ccccacccag ggcctctggg 480

acctcctggt cttctgcttc ctgtgctgcc agcaacttct ggaaacgtcc ctgtccccgg 540

tgctgaagtc ctggaatcca tgctgggaag ttgcacagcc catctggctc tcagccagcc 600

taggaacatg agcagcactt ccaacccagt ccctgcccca cagcaagcct ccccctccac 660

actcacagta ctggattgag ctttggggag ggtggagagg accctgtcac tgctttcctt 720

ctggacatgg acctctctga attgttgggg agttccctcc cctctccacc acccgctctt 780

cctgcgcctc acag 794

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-GFP-sgRNA-F

<400> 6

gatcgatgga gagcgtatgt taactgg 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-GFP-sgRNA-R

<400> 7

agctccagtt aacatacgct ctccatc 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-LA-F-EcoR1

<400> 8

cggaattctc ctgccgacaa gaccaac 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-LA-R-Cla1

<400> 9

ccatcgatct ccattgttgg cacattcc 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-RA-F-Sal1

<400> 10

acgcgtcgac aggcagtggc tcagaagc 28

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-RA-R-BamH1

<400> 11

cgggatccct gtgaggcgca ggaaga 26

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PR

<400> 12

accgtgctga cctccaaata c 21

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PF

<400> 13

actccagcca cctaccct 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-Seq-R

<400> 14

actgaccctc ttctctgcac 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBA2-Seq-F

<400> 15

tgcccactca gactttattc aa 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oct4-F

<400> 16

cctcacttca ctgcactgta 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oct4-R

<400> 17

caggttttct ttccctagct 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sox2-F

<400> 18

cccagcagac ttcacatgt 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sox2-R

<400> 19

cctcccattt ccctcgtttt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Nanog-F

<400> 20

tgaacctcag ctacaaacag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Nanog-R

<400> 21

tggtggtagg aagagtaaag 20

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PAX6-F

<400> 22

acccattatc cagatgtgtt tgcccgag 28

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PAX6-R

<400> 23

atggtgaagc tgggcatagg cggcag 26

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MSX1-F

<400> 24

cgagaggacc ccgtggatgc agag 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MSX1-R

<400> 25

ggcggccatc ttcagcttct ccag 24

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PX330-F

<400> 26

gatacaaggc tgttagag 18

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-GFP-sgRNA-F

<400> 27

gatcccaccg atggagagcg tatgttaact gg 32

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> α2-GPF-sgRNA-R

<400> 28

agcttccagt taacatacgc tctccatcgg tg 32

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PX330-F

<400> 29

gatacaaggc tgttagag 18

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 测序引物

<400> 30

actgaccctc ttctctgcac 20

Claims

1.一种制备诱导型多能干细胞的方法，其特征在于，包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，以便获得所述诱导型多能干细胞，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2 基因的westmead突变，所述诱导型多能干细胞的HBA2 基因不具有westmead突变；

所述突变修复是通过CRISPR/Cas9 技术实现的；

所述HBA2 基因的westmead突变的修复是通过如下方式进行的：

1）构建sgRNA，所述sgRNA是针对HBA2 基因的第三个外显子下游 200bp 位置设计的，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；

2）将所述sgRNA插入PX330，以便构建质粒HBA2-sgRNA；将所述sgRNA插入pTP53-GFP-reporter 载体，以便构建质粒HBA2-GFP-reporter-sgRNA；

3）通过钙转方式将所述质粒GFP-reporter-sgRNA和质粒HBB-sgRNA转染入 293T 细胞，以检测sgRNA的活性；

4）构建质粒HBA2-Donor，所述HBA2-Donor的左臂包括完整HBA2基因；

5）将线性化的所述质粒HBA2-Donor 以及质粒HBA2-sgRNA 电转入iPS细胞株；

6）将步骤5）获得的iPS细胞株经过G418的筛选、PCR⁺克隆以及测序分析，以便获得westmead突变修复的iPS细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导型多能干细胞的HBA2 基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞为孕中期羊水细胞，所述羊水细胞为具有westmead突变的αα^ws/αα细胞。

4.诱导型多能干细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防地中海贫血症，所述诱导型多能干细胞是通过权利要求1~3任一项所述制备诱导型多能干细胞的方法获得的。