CN105255836A - 一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上，转染人干细胞，可高表达含多个神经营养因子的融合蛋白，发挥其共同作用促进神经功能的修复；同时也利用了干细胞自身增殖分化能力，参与神经功能的修复，无成瘤性；本发明提供的人干细胞将有望对神经系统疾病的达到更佳的治疗效果。

Description

一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种神经修复功能提高的人干细胞的方法以及通过所述方法获得促进神经修复的人干细胞，特别地，本发明涉及构建含多个神经营养因子融合基因的重组病毒载体，使得人干细胞能稳定表达多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥神经营养因子生物学功能；本发明的神经修复功能提高的人干细胞保持良好的增殖能力，促进神经修复的提高，而无成瘤性，可望用于临床治疗神经系统疾病，促使受损神经细胞的修复。

背景技术

目前成体干细胞已经用于临床治疗神经系统疾病，包括神经干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞等，在临床上取得了很好的疗效。多数人干细胞来源于废弃的流产胚胎和脐带，在体外培养获得足够多的干细胞数，然后通过静脉、动脉介入或立体定像进行移植治疗。另外成体干细胞来源可以自体，因而不存在胚胎干细胞移植所存在的免疫排斥、伦理学及致瘤性等方面的限制，具有良好的临床应用前景。

但是成体干细胞移植治疗让人困惑的是成体干细胞移植后进入病灶位发挥修复功能的干细胞数量是有限的，部分干细胞在迁移到病灶位之前可能已经死亡或凋亡了，最后发挥神经修复功能的干细胞就更为有限了，这严重限制了成体干细胞自体移植的临床效果。而成体干细胞分泌的神经营养因子在神经修复中发挥了一定的作用，其可以改善颅内微环境，促进干细胞和内源性的神经干细胞修复作用，但是干细胞分泌的神经营养因子也是有限的，有研究认为实际上干细胞移植治疗，真正发挥作用的是其分泌的神经营养因子。

本发明将构建好的含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒载体上，感染人干细胞后表达含多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥这些神经营养因子的生物学功能，而无成瘤性。人干细胞来源方便，主要包括人神经干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞和胚胎干细胞等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产。因而，本发明表达含多个神经营养因子融合蛋白的人干细胞制备简单，可表达多个神经营养因子融合蛋白，共同创造有利于神经再生的微环境，有望对神经系统疾病产生更好的治疗效果，能个体化临床治疗，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗神经系统疾病。

发明内容

许多临床研究已发现干细胞在治疗神经系统疾病中发挥着独特的功能，能促进缺血区的新血管再生及神经再生，修复受损的组织，主要是通过分泌神经营养因子和细胞因子的作用，改善机体微环境，调动机体内源性干细胞参与神经修复功能。然而临床使用人干细胞表达的神经营养因子和细胞因子是非常有限的。

本发明利用人干细胞分化再生和“归巢”的特性，将构建的含多个神经营养因子的融合基因片段的重组病毒载体进行转染，可表达含多个神经营养因子的融合蛋白，共同发挥神经营养因子的生物学作用和干细胞本身的功能，改善颅内微环境，促进内源性神经干细胞增殖分化，参与神经修复。

其中，所述神经营养因子至少包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3；

按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因比未转染的hNSCs高至少45倍；

所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上。

神经营养因子(neurotrophin，NT)包括脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子等，它们在促使神经元存活、生长、分化和维持其功能方面发挥着关键的作用。脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactors，BDNF)对周围神经元和中枢神经元具有广谱的营养保护作用；神经营养因子3(neurotrophin-3，NT-3)参与调控脊髓发育，影响神经-肌肉突触功能活性；胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)对保护多巴胺运动神经元、中枢及外周的运动神经元、感觉神经元及交感神经元等都具有同等的营养作用。需要应用这些神经营养因子靶向神经干细胞存活、生长、分化和维持其功能，将有助于减少患者神经细胞病变和促进神经组织再生。

本发明经我们研发工作发现了神经营养因子慢病毒载体转染的人干细胞，其稳定表达的神经营养因子能提高神经修复能力，而且无成瘤活性。这一研究结果提示了我们可以通过多个神经营养因子的融合基因构建慢病毒载体转染人干细胞，使得人干细胞经多次传代培养后仍稳定表达含多个神经营养因子的融合蛋白，具有发挥其各自生物学功能的能力。在保证了临床治疗使用的细胞数量的同时，也保持了干细胞很强的增殖、分化、归巢活性，可能在临床治疗神经系统疾病中发挥着更好的作用。

本发明提供了一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复。

本发明所述的含多个神经营养因子的融合基因片段是通过PCR技术扩增含多个神经营养因子cDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染人干细胞，获得促进神经修复的人干细胞。

所述促进神经修复的神经营养因子cDNA序列之间通过一个无关DNA序列(Linker)链接，构建成融合基因片段，然后重组到病毒表达载体上。

本发明所述的促进神经修复的神经营养因子，包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3、神经营养因子4和胶质细胞源性神经营养因子中的三种以上。

本发明所述人干细胞包括神经干细胞(neuralstemcell，NSC)、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞和胚胎干细胞等，优选地，为神经干细胞。由于人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人神经干细胞来源人废弃脐带血、胎盘血或自体骨髓等，优选地，来源于人自体骨髓和脐带。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。

本发明提供一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF(bng)。

将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定后，构建好的质粒可以保存在-80℃超低温冰箱中。再将bng融合基因片段克隆到慢病载体上，构建好的重组bng慢病毒载体，可以转染人干细胞，制备成bng融合基因慢病毒转染的人干细胞。

感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF-L-NT3-L-GDNF融合基因病毒转染人干细胞成功，获得持续表达BDNF-L-NT3-L-GDNF的人干细胞。

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的人干细胞传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因高于未转染的hNSCs为47.5倍。

本发明所述的神经修复功能提高的人干细胞，可以体外传代培养，即重组BDNF-L-NT3-L-GDNF慢病毒载体转染的hNSCs通过完全培养液DMEM/F12(7∶3)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(含0.05％EDTA)消化传代；

取传代培养到3代和10代hNSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的hNSCs与其他转染目的基因的hNSCs具有相似的细胞形态，细胞成神经球生长，可以分化神经元和少突胶质细胞。

所述神经修复功能提高的人神经干细胞过表达含多种神经营养因子的融合蛋白，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上，体内、体外成瘤实验中未发现成瘤现象，保证了其安全性。

本发明还提供所述神经修复功能提高的人干细胞的应用，保证了体外培养获得足够数量的人干细胞，并具有稳定表达含多个神经营养因子融合蛋白，共同发挥其神经修复功能，能用于从人干细胞修复神经系统疾病中损伤的神经细胞并促进神经细胞再生。

附图说明

图1表示为构建BDNF-L-NT3-L-GDNF融合蛋白构建的示意图

图2表示为重组bng慢病毒在转染293FT后免疫荧光图

图3表示为重组bng慢病毒在转染hNSCs后基因表达水平图

图4表示为重组bng慢病毒在转染hNSCs后免疫荧光图

图5表示为第10代重组bng慢病毒转染的hNSCs分化为神经元和少突胶质细胞免疫荧光图

图6表示为重组bng慢病毒转染hNSCs裸鼠体内皮下注射后成瘤结果图

图7表示为脑卒中大鼠模型重组bng慢病毒转染NSC移植后mNSS评分改善结果图

图8表示为脑卒中大鼠模型重组bng慢病毒转染NSC移植后相对组织缺损面积结果图

图9表示为脑卒中大鼠模型重组bng慢病毒转染NSC移植后神经丝蛋白表达改善图

图10表示为脑卒中大鼠模型重组bng慢病毒转染NSC移植后成熟神经元数量改善图

具体实施方式

本发明提供了一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复。

本发明所述的含多个神经营养因子的融合基因片段是通过PCR技术扩增含多个神经营养因子cDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到重组到表达质粒上，例如pBR322系列、pET系列和pUC系列等表达质粒。

所述促进神经修复的神经营养因子cDNA序列之间通过一个无关DNA序列(Linker)链接，构建成融合基因片段，然后重组到病毒表达载体上。

本发明所述的促进神经修复的神经营养因子，包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3、神经营养因子4和胶质细胞源性神经营养因子中的三种以上。

将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF(bng)。

将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pUC229载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合BDNF-L-NT3-L-GDNF大小(2487bp)和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存。其中将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5mlOpti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，取36μllipofectamine2000加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。

根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293FT细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μl(2E+8TU/ml)分装，保存于-80℃超低温冰箱。

将20μl(1E+7TU/ml)重组bng慢病毒加入到人神经干细胞的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液DMEM/F12(1∶1)(含20ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、20ng/ml重组人表皮生长因子和5％胎牛血清)；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶(含0.05MEDTA)消化，转入25cm²培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养。生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，bng慢病毒转染组。

感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF-L-NT3-L-GDNF融合基因病毒转染人神经干细胞成功，获得持续表达BDNF-L-NT3-L-GDNF的人神经干细胞。

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因高于未转染的hNSCs为47.5倍。

本发明所述的神经修复功能提高的人神经干细胞，可以体外传代培养，即重组BDNF-L-NT3-L-GDNF慢病毒载体转染的hNSCs通过完全培养液DMEM/F12(7∶3)体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶(含0.05％EDTA)消化传代；取传代培养到3代和10代hNSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的hNSCs与其他转染目的基因的hNSCs具有相似的细胞形态，细胞成神经球生长，可以分化神经元和少突胶质细胞。

所述神经修复功能提高的人神经干细胞过表达含多种神经营养因子的融合蛋白，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上。

本发明所述的神经修复功能提高的人神经干细胞，裸鼠体内皮下注射后，未发现成瘤现象，保证了其安全性，而接种的胶质瘤细胞系U87-MG阳性对照出现了成瘤。

所述人干细胞包括人神经干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞和胚胎干细胞等，优选地，为神经细胞。人干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备表达多个神经营养因子融合蛋白的人干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人干细胞来源人废弃脐血、胎盘血、脐带、自体骨髓等体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓和脐带。

本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。

本发明还提供神经修复功能提高的人干细胞的应用，体外培养可以获得更多数量级的人干细胞，并保证了人干细胞增殖、分化、“归巢”和成血管能力，在神经系统疾病临床治疗中更佳的发挥出更好的神经修复功能。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1重组BDNF-L-NT3-L-GDNF慢病毒载体的构建和包装

将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF(bng)，见图1。

BDNF-L-NT3-L-GDNF和pUC229载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，于37℃12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合BDNF-L-NT3-L-GDNF大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存。其中将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。

取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5mlOpti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，取36μllipofectamine2000加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。

根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293FT细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μl(2E+8TU/ml)分装，保存于-80℃超低温冰箱。

图2中为重组bng慢病毒在转染293FT后免疫荧光图片。重组bng慢病毒载体携带绿色荧光蛋白(GFP)，转染了重组bng慢病毒的293FT细胞荧光倒置显微镜下呈绿色，表明重组bng慢病毒转染293FT细胞和构建成功。

实施例2重组bng慢病毒转染人神经干细胞的制备

人神经干细胞从美国Neuostem公司购买，用完全培养液DMEM/F12(1∶1)(含20ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、20ng/ml重组人表皮生长因子和5％胎牛血清)在75cm²培养瓶中培养；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶(含0.05MEDTA)消化，转入两个75cm²培养瓶中生长，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养。

将20μl(1E+7TU/ml)重组bng慢病毒加入到获得的人神经干细胞的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液DMEM/F12(1∶1)(含20ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、20ng/ml重组人表皮生长因子和5％胎牛血清)；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶(含0.05MEDTA)消化，转入25cm²培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养。生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，bng慢病毒转染组。

图3为融合基因bng在转染重组bng慢病毒了的第10代hNSCs中的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，转染了重组bng慢病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达bng基因均高于未转染的第1代hNSCs，高于47.5倍。

第1代和第10代重组bng慢病毒转染的hNSCs种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。细胞半干时，覆盖以4％冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。0.5％TritonX-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。与二抗相同宿主的进口胎羊血清室温封闭30分钟。配制一抗：巢蛋白(美国Bioscience公司)用胎羊血清稀释200倍，加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。次日：取出细胞复温至室温约1h。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。配制荧光标记二抗：羊抗兔免疫球蛋白G(Goatanti-rabbitIgG(H&L)TRITC，美国Abcam公司，Ab50598)，用PBS或FBS配制，浓度1∶200。加入二抗，室温孵育1小时(避光)。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。加入防荧光淬灭封片剂，避光。上机共聚焦免疫荧光显微镜观测、拍照。图4为重组bng慢病毒在转染hNSCs后免疫荧光检测标志物表达水平。巢蛋白(Nestin)在转染重组bng慢病毒的第1代和第10代hNSCs中均表达90％以上；

取第10代重组bng慢病毒转染的hNSCs接种到预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的6孔培养板，待细胞生长至完全融合后诱导液(含10ng/ml神经营养因子3和50ng/mlβ-巯基乙醇)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，去除诱导液，加入分化完全培养液DMEM/F12(1∶1)(含20ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、20ng/ml重组人表皮生长因子和5％胎牛血清)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔72h换液1次，培养7天时间。培养7天后用4％多聚甲醛将细胞用固定，进行(β-Tubulin-III)神经胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)免疫细胞化学检查，方法如上述。图5为第10代重组bng慢病毒转染的hNSCs分化为神经元和少突胶质细胞免疫荧光图。A图为4倍物镜观察的神经元和少突胶质细胞免疫荧光图，B图为20倍物镜观察的神经元和少突胶质细胞免疫荧光图，图中可以观察到成红色丝状的β-Tubulin-III染色的神经元，绿色星状的GFAP染色的少突胶质细胞，表明第10代重组bng慢病毒转染的hNSCs可以分化为神经元和少突胶质细胞。

实施例3重组bng慢病毒转染人神经干细胞体内成瘤分析

取实施例2中传代培养获得的第1代hNSCs，传代培养到第15代单独转染了bng慢病毒的hNSCs(hNSCs-bng)，各3×10⁶细胞，其中以胶质瘤细胞系U87-MG细胞系为阳性对照，皮下注射于8周裸鼠腹部侧翼(北京大学医学部实验动物中心)，连续观察3个月，注意是否注射部位是否出现肿瘤生长。

图6为重组bng慢病毒转染hNSCs裸鼠体内皮下注射后成瘤结果图，裸鼠体内皮下注射后，所有hNSCs均未发现成瘤现象(A和B图)，而接种的U87-MG阳性对照出现了成瘤(C图)，表明转染了重组bng慢病毒的hNSCs具有很好临床安全性。

实施例4缺血性脑卒中大鼠模型神经损伤修复体内实验

购自北京大学医学部动物中心的18只实验SD大鼠，用10％水合氯醛(400mg/kg)溶液腹腔注射麻醉后，俯卧位固定在立体定向仪上，根据大鼠大脑立体定位图谱，调整立体定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前卤和后卤在同一平面上。将头部背侧的鼠毛剪去，皮肤消毒、切开皮肤找到大脑中动脉，显微手术结扎大脑中动脉和将自凝血块注入颈内动脉，缝合皮肤切口，引起梗塞建立缺血性脑卒中大鼠模型。

建立的缺血性脑出血大鼠模型随机分为A、B和C三组，每组6只，A组为实施例2制备的重组bng慢病毒转染NSC的神经干细胞移植组，B组实施例2制备的神经干细胞的移植组，C组为生理盐水移植组。

建立的缺血性脑卒中大鼠模型分笼饲养72小时后，再度麻醉，俯卧位固定在立体定向仪上，根据大鼠大脑立体定位图谱，同样用牙科钻在前卤点推注肝素胶原酶IV位置钻孔，直径5mm，切开硬脑膜、蛛网膜，找到血肿部位，敷上人羊膜，分层缝合，分笼饲养。分别于移植后1天和移植后第1、2、3、4、5、6周对所有大鼠进行改良神经功能缺失评分(modifiedNeurologicalSeverityScores，mNSS)，结果如下表1所示。

表1

说明：改良神经功能缺失评分(modifiedNeurologicalSeverityScores，mNSS)从0～18分(正常，0分；最大神经功能缺失，18分)，1分无损伤；2～6分轻度损伤；7～12分中度损伤；13～18分重度损伤。

从表1可已看出，C组与A或B组相比p值远小于0.01，并且D、E和F组与C组相比p值远小于0.05，从图7中可以看出A和B组的mNSS评分明显高于C组，其中A组的mNSS评分明显低于B组(p＜0.05)，即用于治疗脑卒中的本发明的功能组织工程材料具有优异的治疗效果，并且免疫排斥很小，重组bng慢病毒转染NSCs和未转染的NSCs促使了脑出血大鼠的神经功能恢复，其中重组bng慢病毒转染NSCs效果更显著。

实施例5

缺血性脑卒中大鼠模型体内重组bng病毒转染神经干细胞移植神经修复分析

实施例4中缺血性脑卒中大鼠模型在NSC移植4周后，将大鼠断颈处死后立即取出鼠脑，4％多聚甲醛中固定48小时。石蜡包埋，大脑冠状切片(5μm)，进行苏木素-伊红(HE)染色，应用购买北京碧云天生产的苏木素-伊红染色试剂盒按照使用说明书进行，最后显微镜观察，照相。

从图8中A和B组的相对组织缺损面积显著小于C组(p＜0.01)，而A和B组之间差别不大。因而重组bng病毒转染NSCs和未转染NSCs都显著减少了脑卒中后的组织缺损，其中重组bng病毒转染NSCs更佳。

大脑冠状石蜡切片(5μm)进行免疫组化检测神经丝蛋白(NF)和成熟神经元标志物(NeuN)表达水平。石蜡切片粘附在多聚赖氨酸处理过的玻片上，脱蜡前在室温中放置60分钟。石蜡切片依次二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；无水乙醇，5分钟；95％乙醇，五分钟；75％乙醇，五分钟；50％乙醇，五分钟；去离子水，五分钟。PBS洗3次各5分钟。样品用0.1％胰酶在37℃湿盒中消化30分钟进行抗原修复；弃酶液后用PBS洗3次各5分钟；3％H2O2去离子水处理10分钟，使内源过氧化酶失活。PBS洗3次各5分钟，滴加一抗小鼠来源的抗NF单抗(1∶200)或抗NeuN单抗(1∶500)(购买美国Santa公司)50μl，4℃过夜后PBS洗3次每次5分钟；滴加碱性磷酸酶标记的抗小鼠二抗(1∶1000)50μl(购买北京中杉公司)，37℃静置1小时；PBS洗3次各5分钟，滴加新鲜配置DAB显色10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10分钟；脱水、透明、中性树脂封片，显微镜观察拍照。

从图9中A和B组的表达神经丝蛋白比C组显著升高(p＜0.01)。同时图10中A和B组中成熟神经元数量明显比C组更高(p＜0.01)，并且A组也比B组更多(p＜0.05)。因而重组bng病毒转染NSCs和未转染NSCs都显著表达神经丝蛋白，促使了神经的再生；同时促进了血肿周围区成熟神经元的存活，其中重组bng病毒转染NSC效果更加明显。

Claims (10)

1.一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建含多个神经营养因子的融合基因片段，重组到病毒表达载体上并转染人干细胞，制备成可高表达含多个神经营养因子融合蛋白的干细胞，促进神经损伤修复，提高人干细胞发挥更佳的神经功能修复；其中，所述神经营养因子至少包括脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经营养因子3；

按照荧光定量PCR试剂盒的使用说明书进行检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因比未转染的hNSCs高至少45倍；

所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR技术扩增含多个神经营养因子cDNA序列，重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，基因重组病毒载体转染人干细胞，获得促进神经修复的人干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法其特征在于所述神经营养因子cDNA序列之间通过一个无关DNA序列(Linker)链接，不影响神经营养因子的生物学功能，构建成融合基因片段，然后重组到病毒表达载体上。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述神经营养因子，包括脑源性神经营养因子，神经生长因子、神经营养因子3、神经营养因子4和胶质细胞源性神经营养因子中的三种以上；

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述人干细胞为神经干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞、视网膜祖细胞或胚胎干细胞，优选地，为神经干细胞。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述人干细胞来源人废弃流产胚胎、废弃脐带、脐血或自体骨髓经体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓或脐带。

7.一种神经修复功能提高的人干细胞的制备方法，其特征在于，

将人BDNF、NT3和GDNF序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，在人BDNFcDNA设计反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的引物，NT3设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3和反链含连接DNA序列(CCGCCGCCGCCGTCA)3的一对引物，GDNF设计在正链含连接DNA序列(GGCGGCGGCGGCAGT)3的引物，通过PCR方法将三者扩增连接在一起，形成完整的含人BDNF、NT3和GDNF的DNA，两者之间由表达连接DNA链接，即BDNF-L-NT3-L-GDNF；

将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pUC229载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合BDNF-L-NT3-L-GDNF大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述BDNF-L-NT3-L-GDNF大小为2487bp；

将BDNF-L-NT3-L-GDNF的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；

取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5mlOpti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，取36μllipofectamine2000加入1.5mlOpti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h；

根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μl2E+8TU/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱；

将20μl1E+7TU/ml重组bng慢病毒加入到人神经干细胞的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37℃、5％CO₂的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液DMEM/F12，所述完全培养液含20ng/ml重组人碱性成纤维生长因子、20ng/ml重组人表皮生长因子和5％胎牛血清；当细胞生长融合达到90％时，用0.25％胰酶消化，转入25cm²培养瓶中生长，1孔对应1个培养瓶，在25cm²培养瓶中融合达到90％时继续消化传代培养；生长转染分为3组：未转染对照组，空白慢病毒转染组，bng慢病毒转染组；

感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescemprotein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF-L-NT3-L-GDNF融合基因病毒转染人干细胞成功，获得持续表达BDNF-L-NT3-L-GDNF的人干细胞；

通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了BDNF-L-NT3-L-GDNF病毒载体的hNSCs传代培养到第10代后，其表达BDNF-L-NT3-L-GDNF基因高于未转染的hNSCs为47.5倍。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，

重组BDNF-L-NT3-L-GDNF慢病毒载体转染的hNSCs通过完全培养液DMEM/F12体外传代培养，当细胞培养到第5-6天，细胞生长融合达到90％以上，需要使用质量体积比为0.25％的胰酶消化传代；

取传代培养到3代和10代hNSCs倒置显微镜下观察的细胞形态，未转染的hNSCs与其他转染目的基因的hNSCs具有相似的细胞形态，细胞成神经球生长，可以分化神经元和少突胶质细胞。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述人干细胞过表达神经营养因子，细胞免疫荧光检测神经干细胞标志物巢蛋白和DAPI表达90％以上，无瘤性。

10.一种如权利要求1-9任一项所述神经修复功能提高的人干细胞及其应用。