CN108866005A - 一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L‑myc基因的重组慢病毒载体；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。本发明永生化细胞系的制备方法是一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略；制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，同时该细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然可以快速增殖，并且无致瘤性。

Description

一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学及神经科学技术领域，具体涉及一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。
背景技术
神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)起初被认为只存在于出生前及出生后不久，近来证据表明其同样存在于成人的侧脑室下层和海马齿状回处，具有分化为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的多向潜能，能自我更新、具有低免疫原性和良好的组织相容性。由于NSCs可以提供各种神经细胞来维持和修复损伤的脑组织，因此被认为是治疗神经系统疾病的良好工具和最具希望的天然资源。众多临床前研究均已证实了移植外源性神经干细胞可以在疾病如缺血性脑卒中中具有一定的治疗效果。然而神经干细胞在进行临床转化之前还有一些实际关切的重要问题有待解决，其中主要的如细胞的代谢衰老问题，随着培养细胞的正常增殖、分化，体外培养难以获得大量的同质细胞，反复提取和输注细胞又同时增加了成本、安全和伦理问题。因此，目前研究认为对移植细胞进行永生化处理是一个很好的策略，可以为基础研究和临床转化提供大量的同质可靠的种子细胞。
永生化(immortalization)细胞是指细胞处于连续周期中而停止发育进程。目前细胞的永生化方法主要是通过基因改造，如通过病毒载体将编码癌基因蛋白的基因导入目的细胞中，使细胞获得长期传代的能力。目前对细胞进行永生化用的较多的方法是将不同形式的c-myc、p53、腺病毒EIA、端粒酶hTERT以及SV40大T抗原导入早期阶段的细胞内制成永生化细胞系，其中c-myc和SV40大T抗原的使用最为广泛。然而目前这些细胞永生化的方法还不够稳定，或者伴有潜在的致癌风险，如单独的hTERT基因导入或不足以永生化，联合SV40抗原又增加编码的复杂性和潜在致瘤风险。目前国际上使用的两株临床级永生化神经干细胞系HB1.F3.CD21NSCs和CTX0E03NSCs，均是在2006年前通过高度致癌基因v-myc/c-myc编码生成。近来研究逐渐发现myc基因中L-myc亚型也可以表现出一定的编码潜能，且比其他myc具有更低的肿瘤源性和稳定性。因此，我们计划研究利用新型的L-myc基因来对人源NSCs进行永生化编码，探讨编码后的永生化NSCs和原代NSCs间的生物学特性，发展一种新的安全有效的永生化编码策略，以满足未来神经干细胞的基础研究和临床转化需求。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。本发明发展一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略，利用新型L-myc编码基因来构建一种永生化的人源神经干细胞系，以满足未来在神经干细胞及神经系统疾病上的基础研究甚至临床转化需求，克服现有的技术不足及目前编码永生化细胞策略中的潜在致瘤风险。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；
(2)构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag；
(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；
(4)选取合适浓度慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。
其中，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：
(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；
(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代，培养到第3代(P3代)，第3代时用于慢病毒转染；
(C)取1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。
其中，步骤(2)所述构建含L-myc基因的重组慢病毒载体为选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段，对重组质粒载体进行测序鉴定。
其中，对重组质粒载体进行测序鉴定的正向测序引物为(SEQ ID NO.1)CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；反向测序引物为(SEQ ID NO.2)WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA。
其中，步骤(3)所述慢病毒包装生产及上清液收集为对步骤(2)构建好的重组慢病毒载体进行大量抽提，用293T细胞进行转染后收集病毒上清。
其中，步骤(4)所述转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系的具体步骤为：
(A)选择P3代人海马来源神经干细胞进行L-myc基因的慢病毒感染，于层粘连蛋白预处理过的6孔板中铺40-50万细胞后，在第二天加入慢病毒上清液，慢病毒转染主要看MOI值，本发明采用慢病毒上清液的MOI值为3，因为病毒不同滴度、不同细胞量和培养基的多少加入的慢病毒剂量是不一定的，本发明换算成MOI值就是3。MOI值＝病毒滴度(TU/mL)×病毒加样体积(mL)/细胞个数；
(B)感染后用嘌呤霉素进行筛选稳转株，于6孔板中筛选成功构建永生化的人源神经干细胞系；
(C)分别提取永生化干细胞的蛋白和RNA分别进行western bolt和qRT-PCR实验鉴定永生化细胞系中L-myc蛋白或基因的表达。
本发明所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法所制备的永生化人源神经干细胞系。
本发明所述用于制备永生化人源神经干细胞系的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag，其特征在于，所述载体含有L-myc基因的重组慢病毒载体。
其中，对永生化的干细胞系进行扩增传代培养，检测干细胞的增殖能力和三系分化情况；同时需要对永生化干细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验评估永生化后的干细胞的致瘤潜能，并用人胶质瘤细胞系U251作为阳性对照。
本发明制备方法具体实施步骤为：
1、分离培养原代人海马来源神经干细胞。收集自然流产终止妊娠的3月左右胎儿脑组织；显微分离获取海马，浸于生理盐水或DMEM/F12培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化5-10分钟，离心，用完全培养基(DMEM/F12+2％B27+20ng/ml EGF+20ng/mlbFGF+2nM L-glutamine+2μg/ml Heparin sodium+1％penicillin-streptomycin)重悬，过400目滤网，分瓶培养，3天换液，7天传代；取1-3代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1等Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG等marker表达。
2、构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag。查询L-myc的GenBank ID为NM_001033081；选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段大小为1095bp；对重组质粒载体进行测序鉴定。
L-myc基因(SEQ ID NO.3)：
ATGGACTACGACTCGTACCAGCACTATTTCTACGACTATGACTGCGGGGAGGATTTCTACCGCTCCACGGCGCCCAGCGAGGACATCTGGAAGAAATTCGAGCTGGTGCCATCGCCCCCCACGTCGCCGCCCTGGGGCTTGGGTCCCGGCGCAGGGGACCCGGCCCCCGGGATTGGTCCCCCGGAGCCGTGGCCCGGAGGGTGCACCGGAGACGAAGCGGAATCCCGGGGCCACTCGAAAGGCTGGGGCAGGAACTACGCCTCCATCATACGCCGTGACTGCATGTGGAGCGGCTTCTCGGCCCGGGAACGGCTGGAGAGAGCTGTGAGCGACCGGCTCGCTCCTGGCGCGCCCCGGGGGAACCCGCCCAAGGCGTCCGCCGCCCCGGACTGCACTCCCAGCCTCGAAGCCGGCAACCCGGCGCCCGCCGCCCCCTGTCCGCTGGGCGAACCCAAGACCCAGGCCTGCTCCGGGTCCGAGAGCCCAAGCGACTCGGAGAATGAAGAAATTGATGTTGTGACAGTAGAGAAGAGGCAGTCTCTGGGTATTCGGAAGCCGGTCACCATCACGGTGCGAGCAGACCCCCTGGATCCCTGCATGAAGCATTTCCACATCTCCATCCATCAGCAACAGCACAACTATGCTGCCCGTTTTCCTCCAGAAAGCTGCTCCCAAGAAGAGGCTTCAGAGAGGGGTCCCCAAGAAGAGGTTCTGGAGAGAGATGCTGCAGGGGAAAAGGAAGATGAGGAGGATGAAGAGATTGTGAGTCCCCCACCTGTAGAAAGTGAGGCTGCCCAGTCCTGCCACCCCAAACCTGTCAGTTCTGATACTGAGGATGTGACCAAGAGGAAGAATCACAACTTCCTGGAGCGCAAGAGGCGGAATGACCTGCGTTCGCGATTCTTGGCGCTGAGGGACCAGGTGCCCACCCTGGCCAGCTGCTCCAAGGCCCCCAAAGTAGTGATCCTAAGCAAGGCCTTGGAATACTTGCAAGCCCTGGTGGGGGCTGAGAAGAGGATGGCTACAGAGAAAAGACAGCTCCGATGCCGGCAGCAGCAGTTGCAGAAAAGAATTGCATACCTCACTGGCTACTAA
3、慢病毒包装生产并收集上清液。对构建好的重组慢病毒载体进行大量抽提；用293T细胞进行转染，48小时后收集病毒上清，0.45um滤器过滤，超速离心，4度72000xg离心2小时；用新鲜培养基重悬病毒沉淀后保存，并检测病毒滴度。
4、转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。选择P3代人海马来源神经干细胞进行L-myc基因的慢病毒感染，于层粘连蛋白预处理过的6孔板中铺40-50万细胞后，在第二天加入慢病毒，使用慢病毒剂量的MOI值为3；感染3天后用嘌呤霉素进行筛选稳转株，于6孔板中筛选30天后成功构建永生化的人源神经干细胞系；分别提取永生化细胞的蛋白和RNA分别进行western bolt和qRT-PCR实验鉴定永生化细胞系中L-myc的表达。
5、永生化人源神经干细胞系的生物学及毒理学特征评估。对永生化的细胞系进行扩增传代培养，检测细胞的增殖能力和三系分化情况；对永生化细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验评估永生化后的细胞的致瘤潜能，并用人胶质瘤细胞系U251作为阳性对照。
本发明获得了一种永生化的人源神经干细胞系，命名为ihNSCs-CHN01。通过构建重组慢病毒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag载体，将新型的L-myc基因导入到人海马来源神经干细胞内，通过稳筛出稳定表达L-myc基因的细胞以建立永生化的人源神经干细胞系，并进行了各种水平(包括qRT-PCT、Western blot)的验证。同时经过细胞传代培养及免疫荧光实验鉴定，比较了编码后的永生化细胞系和原代细胞间的生物学特性，证实所获得的该永生化细胞系与原代细胞无任何生物学差异(包括神经球的形成及三系分化等)。另外还通过裸鼠皮下成瘤实验并用人胶质瘤细胞系U251进行对照，证实了该永生化干细胞系的安全性，为将来的神经干细胞基础研究及临床转化治疗提供了高质同源的种子细胞。
有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：
(1)本发明提供了一种永生化细胞系的制备方法，发展了一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略，利用新型L-myc编码基因制备了一种永生化的人源神经干细胞系。
(2)本发明制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，是一种正常的细胞类型，具有正常细胞的形态及生长方式，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。
(3)本发明制备的永生化人源神经干细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然具有快速的细胞增殖能力，与原代细胞无生物学差异，同时裸鼠致瘤实验证实该细胞系无致瘤性。
附图说明
图1为人海马来源原代神经干细胞培养过程中的神经球生长形态(第三天D3和第六天D6)示意图；
图2为人海马来源原代神经干细胞的标志物免疫荧光鉴定(Nestin、SOX2和Musshi1)示意图；
图3为人海马来源原代神经干细胞的标志物western blot鉴定(Nestin、SOX2和Musshi1)示意图；
图4为人海马来源原代神经干细胞诱导分化为神经元(Tuj1)、星形胶质细胞(GFAP)及少突胶质细胞(MOG)的免疫荧光鉴定示意图；
图5为慢病毒空载体结构图pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag；
图6为重组慢病毒结构插入L-myc基因片段后pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag示意图；
图7为阳性重组慢病毒载体基因测序后软件比对测序结果示意图；
图8为重组慢病毒质粒感染293T细胞后白光与荧光对比图；
图9为重组慢病毒质粒感染293T细胞后western bolt验证L-myc基因表达情况示意图；
图10为重组慢病毒感染P3代人源神经干细胞并经嘌呤霉素筛选30天后贴壁细胞及神经球生长形态示意图；
图11为Western bolt鉴定永生化人源神经干细胞内L-myc基因蛋白水平表达情况示意图；
图12为qRT-PCR鉴定永生化人源神经干细胞内L-myc基因RNA水平表达情况示意图；
图13为免疫荧光鉴定第20代永生化人源神经干细胞标志物(Nestin、SOX2和Musshi1)示意图；
图14为免疫荧光鉴定第20代永生化人源神经干细胞诱导分化为神经元(Tuj1)、星形胶质细胞(GFAP)及少突胶质细胞(MOG)示意图；
图15为裸鼠皮下成瘤实验对比分析第20代永生化人源神经干细胞和人胶质瘤细胞系U251的成瘤情况示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
人海马来源原代神经干细胞的提取培养及鉴定
1、原代人海马来源神经干细胞的提取
在东南大学附属中大医院临床研究伦理委员会的审查批准下(批准号：2017ZDSYLL048-P01)，并得到流产孕妇的知情同意，收集被终止妊娠的3月左右胎儿脑组织，严格按照临床神经外科手术一般流程及标准，通过显微微创手术方式进行取材(取胎儿脑组织中的海马组织)，术后尽量保证胎儿胎脑的完整及胎儿的尊严，最后根据国家医疗机构临床尸体的处理方法进行合理安全销毁。
获取的脑神经海马组织在无菌条件下通过胰酶裂解后800rpm离心5min，用完全培养基(DMEM/F12+体积分数2％B27,20ng/mL basic FGF,20ng/mL EGF,2nM L-glutamine,2μg/ml Heparin sodium,1％penicillin-streptomycin)重悬，过400目滤网，获取原代神经干细胞，分瓶培养，3天换液，7天传代，随后对细胞进行传代并扩增，传至第3代时用于转染。
图1可见第3天和第6天原代人源神经干细胞的形态，说明神经干细胞是悬浮生长方式，且具有典型的神经球征象。
2、原代人海马来源神经干细胞的鉴定
先用多聚赖氨酸(PDL)预包被24孔板爬片，37℃包被2小时或过夜，PBS洗3遍后晾至少2小时。取出培养的细胞，用Accutase酶消化神经干细胞球成单细胞后按5×104个细胞每孔进行种板，待细胞贴壁后加入足量完全培养基(同步骤1)；另96孔板不用包被处理，每孔加入1×104个细胞，100ul完全培养基。(1)细胞增殖实验，96孔板分别于培养第0、1、2、3、4、5天固定时间点加入10ulCCK-8试剂，培养箱培养4小时后检测细胞450nm吸光值；24孔板爬片用完全培养基培养2-3天后进行免疫荧光实验检测神经干细胞markers表达；(2)细胞分化鉴定，用分化培养基(DMEM/F12+2％FBS)对24孔板爬片进行培养7-10天后进行免疫荧光实验检测神经干细胞分化为三系细胞的表达。(3)免疫荧光实验步骤如下：先用PBS(PH7.4)清洗细胞2-3次，体积分数4％多聚甲醛固定15-30min，0.3％Triton x-100通透30min，10％驴血清封闭1hour，一抗4℃过夜，(抗Nestin、Sox2、Musashi1或者beta III-tubilin、GFAP、MOG抗体)，荧光二抗室温孵育1hour，PBS洗3次后DAPI染核5min，最后用抗荧光淬灭剂封片，荧光观察并拍照。
提取细胞的蛋白，正常收集代数生长期的细胞，800rpm离心5min后弃上清，用PBS洗细胞沉淀一次，加入100ulRIPA蛋白裂解液，蛋白裂解液冰上裂解30min，中间吹打震荡2-3次，12000rpm离心5min既得细胞总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)按操作说明对细胞总蛋白进行定量后，加入5Xloading buffer煮样95℃ 5min。
Western blot蛋白电泳，根据蛋白制胶说明配10％SDS-PAGE胶准备进行蛋白电泳，上样、80V和120V电泳，随后用0.45μm PVDF转膜后，用5％牛奶封闭1小时，一抗4℃孵育过夜，抗Nestin、Sox2、Musashi1抗体，二抗室温孵育1hour，洗膜，ECL发光液显色拍照。
免疫荧光及western blotting结果可见培养的原代细胞明显表达特异性标志物markers(Nestin,SOX2,Musashi)，说明其具有神经干细胞的典型征象(图2-3)，图4免疫荧光则发现培养的原代细胞还可以分化为神经元(Tuj1)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(MOG)，结果进一步证明了神经干细胞的属性特征。
实施例2
永生化人源神经干细胞系的建立
1、构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag
查询基因L-myc的序列情况，GenBank ID为NM_001033081；选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag(图5)，在EcoRI位点插入的L-myc基因(图6)，有效片段大小为1095bp；对重组质粒载体进行测序鉴定。
(1)目的基因片段的获得
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的基因：使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，随后PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
(2)线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
(3)目的基因构建入线性化表达载体中：
将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：
最适插入片段使用量＝[0.04x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)
最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)
混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。
(4)转化：
用DH5α感受态细胞，取10μL反应液体转化到感受态细胞中进行转化，轻轻摇匀,冰上放置30分钟后，42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟，向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
(5)菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl作为模板进行菌落PCR鉴定。
(6)阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析，图7的测序结果表明了重组质粒构建成功，对重组质粒载体进行测序鉴定所用的正向测序引物为CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；反向测序引物为WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA；测序结果如下(其中加粗的为-MYC基因的序列，用于验证重组质粒是正确的)：
AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGAATTCGCCACCATGGACTACGACTCGTACCAGCACTATTTCTACGACTATGACTGCGGGGAGGATTTCTACCGCTCCACGGCGCCCAGCGAGGACATCTGGAAGAAATTCGAGCTGGTGCCATCGCCCCCCACGTCGCCGCCCTGGGGCTTGGGTCCCGGCGCAGGGGACCCGGCCCCCGGGATTGGTCCCCCGGAGCCGTGGCCCGGAGGGTGCACCGGAGACGAAGCGGAATCCCGGGGCCACTCGAAAGGCTGGGGCAGGAACTACGCCTCCATCATACGCCGTGACTGCATGTGGAGCGGCTTCTCGGCCCGGGAACGGCTGGAGAGAGCTGTGAGCGACCGGCTCGCTCCTGGCGCGCCCCGGGGGAACCCGCCCAAGGCGTCCGCCGCCCCGGACTGCACTCCCAGCCTCGAAGCCGGCAACCCGGCGCCCGCCGCCCCCTGTCCGCTGGGCGAACCCAAGACCCAGGCCTGCTCCGGGTCCGAGAGCCCAAGCGACTCGGAGAATGAAGAAATTGATGTTGTGACAGTAGAGAAGAGGCAGTCTCTGGGTATTCGGAAGCCGGTCACCATCACGGTGCGAGCAGACCCCCTGGATCCCTGCATGAAGCATTTCCACATCTCCATCCATCAGCAACAGCACAACTATGCTGCCCGTTTTCCTCCAGAAAGCTGCTCCCAAGAAGAGGCTTCAGAGAGGGGTCCCCAAGAAGAGGTTCTGGAGAGAGATGCTGCAGGGGAAAAGGAAGATGAGGAGGATGAAGAGATTGTGAGTCCCCCACCTGTAGAAAGTGAGGCTGCCCAGTCCTGCCACCCCAAACCTGTCAGTTCTGATACTGAGGATGTGACCAAGAGGAAGAATCACAACTTCCTGGAGCGCAAGAGGCGGAATGACCTGCGTTCGCGATTCTTGGCGCTGAGGGACCAGGTGCCCACCCTGGCCAGCTGCTCCAAGGCCCCCAAAGTAGTGATCCTAAGCAAGGCCTTGGAATACTTGCAAGCCCTGGTGGGGGCTGAGAAGAGGATGGCTACAGAGAAAAGACAGCTCCGATGCCGGCAGCAGCAGTTGCAGAAAAGAATTGCATACCTCACTGGCTACGAATTCGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAAGGATCCTCAACCTCTGGATTACAAAATT
(7)质粒小提：
测序通过的阳性克隆，安排质粒小提，保存或用于后续大提。
2、慢病毒包装生产并收集上清液。
对构建好的重组慢病毒载体进行大量抽提；首先用293T细胞进行转染，图8示不同剂量的重组慢病毒载体对293T细胞的转染效率，其中10ul剂量的转染效率最高；在转染48小时后开始收集病毒上清，045um滤器过滤，超速离心，4度72000xg离心2小时；用新鲜培养基重悬病毒沉淀后保存，并检测病毒滴度。滴度(integration units per ml，IU ml-1)的计算公式如下：
IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V
病毒载体信息如下：
检测结果如下:
用western blot验证重组慢病毒质粒在293T细胞中的表达效果，目的基因L-myc的预测蛋白大小约为40KDa，图9结果表明在阳性质粒组L-myc蛋白明显表达，说明阳性慢病毒上清液生产成功。
3、转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。
选择P3代人海马来源神经干细胞进行L-myc基因的慢病毒感染，于层粘连蛋白预处理过的6孔板中铺40-50万细胞后，在第二天加入慢病毒，使用慢病毒剂量的MOI值为3；感染3天后用嘌呤霉素进行筛选稳转株，于6孔板中筛选30天后成功构建永生化的人源神经干细胞系，图10说明筛选后的永生化细胞形态及生长状态良好；分别提取永生化细胞的蛋白和RNA分别进行western bolt和qRT-PCR实验鉴定永生化细胞系中L-myc的表达，图11-12可见L-myc基因在RNA和蛋白水平均明显高表达，结果说明慢病毒上清液对神经干细胞成功感染，间接说明了永生化的人神经干细胞系构建成功。
实施例3
永生化人源神经干细胞系的生物学特征及毒理学评估
1、对永生化的细胞系进行扩增传代培养，检测细胞的增殖能力和三系分化情况；
细胞增殖、分化实验及检测方法基本同前，预先用多聚赖氨酸(PDL，Sigam)包被24孔板，Accutase酶消化细胞球成单细胞后按5-10×104个细胞进行种板。增殖鉴定实验，用完全培养基进行培养2-3天后进行免疫荧光实验；分化鉴定实验，用分化培养基(DMEM/F12+2％FBS)进行培养7-10天后进行免疫荧光实验。免疫荧光实验，先用PBS(pH7.4)清洗细胞2-3次，体积分数4％多聚甲醛固定15-30min，0.3％Triton x-100通透30min，10％驴血清封闭1hour，一抗4℃过夜，(抗Nestin、Sox2、Musashi1或beta III-tubilin、GFAP、MOG抗体)，荧光二抗室温孵育1hour，PBS洗3次后DAPI染核5min，最后用抗荧光淬灭剂封片，荧光观察并拍照。
图13免疫荧光证实了永生化的细胞系明显表达神经干细胞特异性标志物markers(Nestin,SOX2,Musashi)；图14结果发现永生化的细胞系经诱导后可以成功分化为神经元(Tuj1)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(MOG)；此结果可以直接说明永生化的人神经干细胞系构建成功，且具有原代神经干细胞的基本属性和特征。
2、对永生化细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验评估永生化后的细胞的致瘤潜能，并用人胶质瘤细胞系U251作为阳性对照。
收集正常培养条件下代数生长期的永生化神经干细胞，同Accutase酶消化成单细胞后，调整单细胞浓度为1×107/ml；同样准备代数生长期的U251胶质瘤细胞，调整单细胞浓度为1×107/ml；购买BALB/c-nu裸鼠(重约20g)10只，每组5只，接种位置是腋下，进针接种前用75％的酒精对进针部位擦拭消毒；排去一次性针头内空气，从进针部位向前穿刺大约1cm，进行皮下注射；注射时，每次注射量大约为0.1ml，注射完毕后缓慢退出针头，尽量避免漏液；注射过程中，细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，并尽量在半小时内完成；每日观察肿瘤生长情况，并持续观察30天。实验结果(图15)：注射U251胶质瘤细胞组在接种2-3天后便可见小点状突起，10-14天后看到米粒大小肿块长起，至30天时肿块长至黄豆大小，期间有一只死亡；然而注射永生化神经干细胞组始终未见肿块形成，皮下亦无结缔组织生长，裸鼠状态好，无死亡。因此，本实验结果说明构建的永生化人神经干细胞系无致瘤性，在体内是安全的。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catagcgtaa aaggagcaac a 21
<210> 3
<211> 1095
<212> DNA
<213> L-myc基因(L-myc)
<400> 3
atggactacg actcgtacca gcactatttc tacgactatg actgcgggga ggatttctac 60
cgctccacgg cgcccagcga ggacatctgg aagaaattcg agctggtgcc atcgcccccc 120
acgtcgccgc cctggggctt gggtcccggc gcaggggacc cggcccccgg gattggtccc 180
ccggagccgt ggcccggagg gtgcaccgga gacgaagcgg aatcccgggg ccactcgaaa 240
ggctggggca ggaactacgc ctccatcata cgccgtgact gcatgtggag cggcttctcg 300
gcccgggaac ggctggagag agctgtgagc gaccggctcg ctcctggcgc gccccggggg 360
aacccgccca aggcgtccgc cgccccggac tgcactccca gcctcgaagc cggcaacccg 420
gcgcccgccg ccccctgtcc gctgggcgaa cccaagaccc aggcctgctc cgggtccgag 480
agcccaagcg actcggagaa tgaagaaatt gatgttgtga cagtagagaa gaggcagtct 540
ctgggtattc ggaagccggt caccatcacg gtgcgagcag accccctgga tccctgcatg 600
aagcatttcc acatctccat ccatcagcaa cagcacaact atgctgcccg ttttcctcca 660
gaaagctgct cccaagaaga ggcttcagag aggggtcccc aagaagaggt tctggagaga 720
gatgctgcag gggaaaagga agatgaggag gatgaagaga ttgtgagtcc cccacctgta 780
gaaagtgagg ctgcccagtc ctgccacccc aaacctgtca gttctgatac tgaggatgtg 840
accaagagga agaatcacaa cttcctggag cgcaagaggc ggaatgacct gcgttcgcga 900
ttcttggcgc tgagggacca ggtgcccacc ctggccagct gctccaaggc ccccaaagta 960
gtgatcctaa gcaaggcctt ggaatacttg caagccctgg tgggggctga gaagaggatg 1020
gctacagaga aaagacagct ccgatgccgg cagcagcagt tgcagaaaag aattgcatac 1080
ctcactggct actaa 1095

Claims (8)

1.一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；
(2)构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag；
(3)对重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；
(4)采用慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。
2.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：
(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；
(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代；
(C)取第1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。
3.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述构建含L-myc基因的重组慢病毒载体为选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段，对重组质粒载体进行测序鉴定。
4.根据权利要求3所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，对重组质粒载体进行测序鉴定的正向测序引物为CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；反向测序引物为WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA。
5.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述慢病毒包装生产及上清液收集为对步骤(2)构建好的重组慢病毒载体进行大量抽提，用293T细胞进行转染后收集病毒上清。
6.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系的具体步骤为：
(A)选择P3代人海马来源神经干细胞进行L-myc基因的慢病毒感染，于层粘连蛋白预处理过的6孔板中铺40-50万细胞后，在第二天加入慢病毒上清液；
(B)感染后用嘌呤霉素进行筛选稳转株，于6孔板中筛选成功构建永生化的人源神经干细胞系；
(C)分别提取永生化干细胞的蛋白和RNA分别进行western bolt和qRT-PCR实验鉴定永生化细胞系中L-myc蛋白或基因的表达。
7.一种权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法所制备的永生化人源神经干细胞系。
8.一种用于制备权利要求7所述的永生化人源神经干细胞系的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag，其特征在于，所述载体含有L-myc基因的重组慢病毒载体。
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