CN104726496B - 携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞、间充质干细胞及制备方法。该方法包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。本发明所提供的多能干细胞衍生的间充质干细胞能够用于建立筛选WS治疗药物的药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老的过程提供了更多的线索。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种携带人类成年早衰症基因突变的多能干细胞及制备方法。
背景技术
人口老龄化是世界尤其是中国面临的日益严峻的社会问题。毋庸置疑，衰老及其相关疾病已成为国内外科研领域急需突破的热点问题。模式生物的局限性使其无法在理论和实践层面上应用于人类衰老的基础研究及临床转化，因此新的人类衰老研究模型亟待产生。人类“早衰症”的发现使在实验室内研究人类衰老成为了可能。作为一种极端罕见的先天性遗传疾病，早衰症主要表现为机体的过早过快衰老，同时伴随发生老年群体所患的多种疾病，是人类群体中存在的具备加速老化特征的天然“突变体”。对早衰症疾病进程、并发症及分子机理的研究是揭示人类正常衰老过程及机制的重要途径和突破口。根据发病年龄，早衰症可分为儿童早衰症和成年早衰症。成年早衰症以Werner综合症(WernerSyndrome，WS)为代表，其致病原因是编码DNA损伤修复相关蛋白(Werner syndromeprotein,WRN)的基因发生突变。与儿童早衰症相比，WS能够表现出更多的与人类自然衰老近似的表型和症状，因此作为更接近于人类自然衰老的早衰症模型而倍受关注。WS累及全身几乎所有组织与器官，而伴随人类自然衰老进程发生的特征都会在WS个体中加速体现。WS患者在青春期后就会提前出现一系列明显的机体衰老特征，包括：①身材矮小、面容皱缩、头发变白脱落、皮肤萎缩硬化和色素沉积；②心力衰竭、心肌梗塞等心脏疾病；③动脉粥样硬化与高血压；④胰岛素抵抗的高血糖、高血脂和高尿酸血症；⑤智力衰退与脑萎缩；⑥早发眼部退变；⑦免疫系统异常，易引发类风湿疾病等自身免疫病；⑧骨质疏松、关节畸形和运动受限。非常值得注意的是，WS患者易发生各类肿瘤，尤其是中胚层来源的肿瘤、黑素瘤和星形胶质细胞瘤等，这与老龄化和肿瘤发病率正相关的事实非常相符。WS患者的平均寿命为50岁，大多死于血管疾病与肿瘤。由于WS的临床表征同自然衰老过程非常类似，且表现出大多数生理性衰老相关的疾病类型，因此被认为是研究人类生理性衰老的最合适模型。通过对WS发病机理的研究将有利于认识正常衰老过程，揭示延缓衰老或治疗衰老相关疾病的重要靶点，为衰老从基础研究向临床转化提供重要的理论基础。
有趣的是，最近研究表明人体组织的WRN蛋白表达随着年龄增高而出现逐渐降低的趋势，提示WRN的下调可能是正常衰老的重要作用。因此，研究WRN同人类衰老之间的关系，揭示人类成年早衰症的致病机理，将对于我们理解认识正常衰老过程及其揭示衰老相关疾病的病因具有重要的启示作用。WRN蛋白包含4个结构域，分别为3′→5′核酸外切酶结构域、RecQ DNA解旋酶结构域、RQC结构域及HRDC结构域。人类WS相关的WRN突变包括多种形式，多为错义突变、剪接突变和移码框突变。目前所知的所有疾病相关的58种WS突变均可导致一个共同的结果，即引起WRN蛋白表达的下调或缺失。最近的生物化学及细胞生物学研究表明WRN在DNA复制、DNA损伤修复以及端粒和染色体的稳定性维持等方面均起着重要的作用。
近年来，诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)技术的出现和发展为血液疾病的基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，cMYC等)导入体细胞，使其转变成为的具备胚胎干细胞特性的细胞。iPSC并非源于胚胎组织，不会受到伦理问题的限制；其次现有的基因打靶技术允许针对患者自体来源的iPSC进行基因突变的基因组原位矫正，从而在基因水平清除内源性致病因素；此外患者自体来源的iPSC，避免了配型和排斥反应的困扰，以上三点均体现了iPSC在个性化治疗和转化医学中巨大的应用前景。
然而与其他遗传性疾病相比，WS患者的体细胞重编程研究具有更大的困难和挑战性。已有研究表明，WS患者皮肤成纤维体细胞经体外培养后提前发生老化并伴随严重的染色体异常，而重编程过程中又会进一步引发活性氧(ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡(Senescence)等细胞事件严重阻碍体细胞重编程的过程，因此针对WS患者携带致病突变细胞的体细胞重编程研究困难重重，国内外未见成功实施的案例。
近年来人胚胎干细胞(hESC)基因打靶技术的发展为在实验室内模拟和研究人类衰老和疾病带来了新的曙光。对于已明确遗传背景的人类疾病，生物医学家可以通过基因打靶技术向人hESC基因组的特定位置靶向引入相应的遗传突变，从而在实验室中创造出“疾病特异hESC”，进而通过定向分化技术，可研究疾病特异基因突变对特定组织细胞类型的影响。
由此可见，现有报道均未产生WS的多能干细胞，并利用产生的WS-PSC有效模拟疾病表型，建立药物筛选平台，因而未能开展高效的药物筛选工作。综上所述，目前急需一种体外产生WS-PSC的安全高效技术，以及利用该WS-ESC及其衍生细胞产生高效高通量的药物筛选平台。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种间充质干细胞的制备方法。
本发明所提供的间充质干细胞的制备方法，可包括：
(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN(基因组序列为GenBank：NC_000008.11的第31033262-31173761位，updated on 21-Mar-2015；cDNA序列为GenBank：NM000553.4，updated on PRI 15-MAR-2015)，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；
(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。
步骤(1)中，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN为缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子。
步骤(1)中，缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子(GenBank：NM_000553.4的第2509-2617位，updated on PRI 15-MAR-2015)和第16外显子(GenBank：NM_000553.4的第2618-2686位，updated on PRI 15-MAR-2015)，具体是按照包括如下步骤的方法实现的：
(a1)将序列表中序列1所示DNA片段(失活突变的WRN基因片段)的第11308-12850位构建到辅助腺病毒载体上，获得重组载体；
在本发明中，序列1的第1-21236位通过与所述辅助腺病毒载体同源重组的方式构建得到所述重组载体。序列表中序列1共由21236个核苷酸组成，第1-11307位为上游同源臂；第11308-12850位为插入替换所述WRN第15外显子和第16外显子的Neo抗性基因表达框；第12851-21236位为下游同源臂。
(a2)用所述重组载体转染腺病毒包装细胞，将所得细胞记为重组细胞1；用辅助腺病毒感染所述重组细胞1，将所得细胞记为重组细胞2；
(a3)培养所述重组细胞2，从培养上清中获得重组腺病毒；
(a4)用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞，从而获得所述WRN的第15外显子和第16外显子缺失的人多能干细胞。
其中，用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞后，还包括用G418和Ganciclovir进行克隆筛选的步骤；在克隆筛选之后还包括对挑选的克隆用基因组PCR的方法对其同源重组的情况进行确认的步骤。
在本发明中，所述辅助腺病毒载体具体为pCIHDAdGT8-4载体；相应的，步骤(a1)中，所述重组载体为将序列1所示DNA片段与pCIHDAdGT8-4载体发生同源重组后获得的重组质粒；步骤(a2)中，所述重组载体转染腺病毒包装细胞，具体为：用PI-SceI酶切所述重组载体，使其线性化，然后转染所述腺病毒包装细胞。
所述辅助腺病毒为AdHPBGF35病毒。所述腺病毒包装细胞为人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞。
步骤(2)中，对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞，具体可按照包括如下步骤的方法实现：
(b1)将所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化(如分化14天)，获得拟胚体；
(b2)将所述拟胚体接种于基质胶(matrigel)包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出现(培养时间如2周)；再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述WRN功能丧失的间充质干细胞。
在所述方法中，所述人多能干细胞既可为人胚胎干细胞，也可为人诱导多能干细胞。
在本发明的一个实施例中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞，具体为人胚胎干细胞H9细胞系(WiCell公司产品)。
利用所述方法制备获得的间充质干细胞也属于本发明的保护范围。
所述间充质干细胞在作为人类成年早衰症细胞模型中的应用也属于本发明的保护范围。
所述间充质干细胞在作为药物筛选模型中的应用也属于本发明的保护范围；其中，所述药物为治疗人类成年早衰症的药物。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述间充质干细胞筛选治疗人类成年早衰症的药物的方法。
本发明所提供的利用所述间充质干细胞筛选治疗人类成年早衰症的药物的方法，具体可包括：
(c1)将所述间充质干细胞在含有待筛选药物的培养液中培养；
其中，将所述间充质干细胞在含有待筛选药物的培养液中培养，具体为：将所述间充质干细胞以5×104个每孔铺于六孔板中，细胞贴壁的第二天开始，加入含50M的维生素C的培养基继续培养至细胞长满(大约一周)。
(c2)按照如下确定所述待筛选药物是否为治疗人类成年早衰症的药物：若所述间充质干细胞的衰老表型被逆转，则所述待筛选药物为或候选为治疗人类成年早衰症的药物；若所述间充质干细胞的衰老表型未被逆转，则所述待筛选药物不为或候选不为治疗人类成年早衰症的药物。
其中，所述衰老表型被逆转，可体现为如下：Beta-gal阳性细胞比例减少，以及细胞增殖能力提高(等)。
在本发明中，所述人类成年早衰症为Werner综合症。
本发明将利用HDAdV介导的基因组靶向修饰技术体外创建携带WS相关突变(包括点突变和敲除突变)的hESC，后者经过定向分化诱导产生受WS累及的间充质干细胞，从而在培养皿中建立首个人类成年早衰症研究模型。“疾病”hESC和“野生型”hESC除了敲入的基因突变外，遗传背景完全相同，因此可提供同基因型(isogenic)的严格实验对照组。进而，可利用细胞生物学、分子生物学和生物信息学等多种技术手段，从关键基因、信号通路、蛋白相互作用网络、细胞器到全基因组范围的表观遗传学与基因表达调控等多个视角，研究导致人类细胞衰老的分子网络与遗传机制。HDAdV载体移除了病毒复制和基因组整合元件，无法整合到宿主基因组中，从而可以容纳大片段的同源重组序列，在提供同源重组效率的同时，与其他基因打靶技术(如锌指核酶等)相比，无脱靶(Off-Target)和诱变效应。通过对WRN基因的第15和16号外显子的特异敲除，破坏WRN的解旋酶活性区域，从而破坏了WRN蛋白的稳定性，与WS病人细胞内的情况相同，在基因敲出后的ESC及其衍生物细胞中，WRN的蛋白表达都缺失。
本发明产生的WS-ESC，可以体外定向分化为携带致病基因突变的间充质细胞等衍生细胞，能够完全模拟各种疾病相关表型，因此本发明利用上述WS-ESC及其衍生细胞建立高效高通量的个性化药物筛选平台。
综上所述，本发明所含技术能够用于建立筛选WS治疗药物的药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老的过程提供了更多的线索。
附图说明
图1为本发明的人胚胎干细胞打靶技术方案。A和B为人胚胎干细胞打靶技术方案示意图；C和D为WRN相关打靶鉴定的基因组PCR检测结果。
图2为本发明产生了WRN蛋白缺失的WRN-/-ESC。其中，A为免疫荧光检测结果；B为Western blot结果。
图3为本发明涉及的WRN-/-ESC衍生的MSC具有衰老的表型。其中，A为细胞生长抑制结果；B为SA-beta-Gal染色结果；C为衰老相关基因表达情况的检测结果。
图4为维生素C(vitamin C)可以逆转WRN-/-MSC的衰老表型。其中，A为SA-beta-Gal染色结果；B为免疫荧光检测结果。图中，“对照”表示未添加维生素C。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37摄氏度，5％CO2。
1、用于流式细胞术分选MSC的荧光标记抗体如下：
荧光素FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体(555595)，BD Biosciences。
荧光素PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体(550257)，BD Biosciences。
荧光素APC标记的抗人细胞表面识别分子CD105抗体(17-1057-42)，BDBiosciences。
荧光素APC标记同型对照抗体(555751)，BD Biosciences。
荧光素PE标记同型对照抗体(555749)，BD Biosciences。
荧光素FITC标记同型对照抗体(555742)，BD Biosciences。
2、用于免疫荧光的抗体如下：
抗人OCT4抗体(sc-5279)，Santa Cruz Biotechnology。
抗人SOX2抗体(sc-17320)，Santa Cruz Biotechnology。
抗人NANOG抗体(ab21624)，Abcam。
抗人Ki67抗体(ab16667)，Abcam。
3、细胞系如下：
人胚胎干细胞H9细胞系，WiCell公司产品(货号：WA09(H9)-DL-7)。
4、重组腺病毒包装所用生物材料如下：
辅助腺病毒载体pCIHDAdGT8-4载体：详见“An HSV amplicon-based helpersystem for helper-dependent adenoviral vectors.Shuji Kubo,et al.BBRC.2003.307(4):826-830”一文，公众可从原文作者或中国科学院生物物理研究所获得。
转染人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞：详见“Improved system forhelper-dependent adenoviral vector production.Palmer D.and Ng P.MolecularTherapy.2003.8(5):846-52.”一文，公众可从原文作者或中国科学院生物物理研究所获得。
辅助腺病毒AdHPBGF35：详见“Genome Size and Structure DetermineEfficiency of Postinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-ModifiedAdenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner.Dmitry M.Shayakhmetov,etal.,Journal of Virology.2004.78(18):10009-10022.”一文，公众可从原文作者或中国科学院生物物理研究所获得。
5、人胚胎干细胞H9细胞系培养方法如下：
a.将H9细胞接种至预先培养了经过丝裂霉素(美国Sigma公司产品，货号：M0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(美国Invitrogen公司产品，货号：S1520-100)的培养板中，使用人类胚胎干细胞培养基(CDF12培养基)与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养；
b.将H9细胞接种至预先用细胞外基质(qualified-Matrigel，美国BDBiosciences产品，货号：354277)包被的培养板中，使用mTeSR培养基(美国StemCellTechnologies产品)培养。
6、细胞培养基配方如下：
(1)CDF12培养基配方：
DMEM/F12培养基(Invitrogen，11320-033)；
0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)；
1mM GlutaMAXTM二肽(Invitrogen，35050-061)；
20％(体积百分含量)Knockout血清替代物(Invitrogen，N10828-028)；
1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)；
55μMβ-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)；
10ng/ml人FGF2(Joint Protein Central)。
(2)间充质干细胞(MSC)培养基配方：
MEM培养基(Invitrogen，12571071)；
10％(体积百分含量)胎牛血清(Invitrogen，10091148)；
1％(1g/100ml)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)；
10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(JPC，bFGF)；
5ng/ml TGFβ(Humanzyme，HZ1131)。
实施例1、WS多能干细胞系的建立及其鉴定
本发明涉及在人类胚胎干细胞(hESCs)中靶向失活人类成年早衰症基因——WRN基因(基因组序列为GenBank：NC_000008.11的第31033262-31173761位，updated on21-Mar-2015；cDNA序列为GenBank：NM_000553.4，updated on PRI 15-MAR-2015)。本发明首先设计并通过分子克隆方法获得跨人类基因组中WRN基因第15和16号外显子的基因片段，其中包含设计的突变位点和用于阳性克隆筛选的Neo抗性基因(图1中的A和B)，然后将其构建成为非整合型腺病毒载体(HDAdV载体)并感染hESCs，利用同源重组原理将突变的WRN基因片段导入hESCs中并替换野生型基因片段，从而实现WRN基因的原位失活。后续经过Neo抗性筛选，并通过基因组PCR确认，最终获得WRN基因失活的hESCs，即WRN-/-hESCs(图2)。具体方法如下：
1、重组腺病毒的制备
利用分子克隆方法将WRN突变位点和Neo抗性基因导入来自BAC文库中的人WRNlocus克隆(RP11-54H19，Invitrogen)的野生型WRN基因中，获得携带失活突变的WRN基因片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中，序列1的第1-11307位为上游同源臂；第11308-12850位为插入替换WRN第15外显子和第16外显子的Neo抗性基因表达框；第12851-21236位为下游同源臂。
将序列1所示DNA片段与辅助腺病毒载体——pCIHDAdGT8-4载体进行同源重组，所得重组质粒命名为WRN(mt)-HDAdV质粒。WRN(mt)-HDAdV质粒的结构描述为：在所述pCIHDAdGT8-4载体的上下游同源臂之间插入了序列1的第11308-12850位所示DNA片段的重组质粒。
用PI-SceI(NEB)酶切所述WRN(mt)-HDAdV质粒并纯化，转染人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞，得到重组细胞1；再用辅助病毒AdHPBGF35感染所述重组细胞1，以便包装非基因组整合的重组腺病毒。培养经过如上转染和感染处理的细胞，收集培养上清，并通过超高速离心纯化病毒颗粒。
2、重组腺病毒感染人胚胎干细胞
利用步骤1获得的重组腺病毒感染hESCs细胞(H9)(1×107个细胞，病毒用量为15bgal-transducing units(btu)，病毒用量单位可参见文献“Palmer,D.J.&Ng,P.Physical and infectious titers of helper-dependent adenoviral vectors:amethod of direct comparison to the adenovirus reference material.Mol Ther 10,792‐798(2004).”和“Suzuki,K.et al.Highly efficient transient gene expressionand gene targeting in primate embryonic stem cells with helper-dependentadenoviral vectors.Proc Natl Acad Sci U S A 105,13781‐13786(2008).”)，感染后第2-4天，加入G418(25～400g/ml，invitrogen公司产品)进行阳性的筛选，感染后第10-13天，加入4μM Ganciclovir(GANC,invitrogen公司产品)进行阴性的筛选。
本发明需要两轮HDAdV感染介导的同源重组才能获得WRN缺失的人胚胎干细胞系，第一轮同源重组后，经G418和GANC筛选后，存活下来的细胞即为WRN+/neo；第二轮同源重组后，经G418和GANC筛选后，存活下来的细胞即为WRNneo/-；最后再利用Puromycin(25～400g/ml，invitrogen公司产品)筛选获得移除了筛选标记neo的WRN-/-细胞。G418筛选后存活的细胞即为发生了同源重组，在基因组目的区域(WRN基因)插入了筛选标记neo的细胞，而GANC筛选后将剔除在同源重组过程中插入了HDAdV载体片段的细胞，从而保证所有获得的细胞都是非基因组整合的无安全隐患的细胞。
将所得的各种细胞克隆挑入96孔板中传代。一方面，通过PCR方法进行基因组的鉴定；另一方面，通过Western blot检测WRN蛋白的表达情况，通过免疫荧光检测经过改造的人胚胎干细胞的干细胞特性。
(1)PCR鉴定基因组
引物序列如下：
P1：5’-AAGGCCTCCTGGGACTCAGCAGAAAGCTC-3’；
P2：5’-CCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCA-3’；
P3：5’-CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3’；
P4：5’-AGGTACGCCATCCCCAGCTACCCTGA-3’；
P5：5’-AGATAATGTTGCTGTCATGG-3’；
P6：5’-TTAAGCTGTAGCACTTGGTC-3’；
P7：5’-CCAACATCCCAGCTTGCTT-3’；
P8：5’-GAGCAGGCCCATGTTACCTGA-3’；
P9：5’-AGTTCAGTGGAAAGTGATTC-3’；
P10：5’-AATATCAGCCTCAAGTTGCT-3’；
采用引物对P1+P2，以及引物对P3+P4分别对WRN+/+(野生型)、WRN+/neo和WRNneo/-的三种细胞进行PCR鉴定基因组。采用引物对P5+P6、引物对P7+P8，以及引物对P9+P10分别对WRN+/+和WRN-/-两种细胞进行PCR鉴定基因组，同时以GAPDH为内参，其扩增引物序列如下：
GAPDH-F：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’；
GAPDH-R：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。
理论上，采用引物对P1+P2进行PCR扩增，WRN+/neo和WRNneo/-这两种细胞会扩增得到大小约为12.6kb的含neo片段的目的条带，而WRN+/+这种细胞不能扩增获得该目的条带。采用引物对P3+P4进行PCR扩增，WRN+/neo和WRNneo/-这两种细胞会扩增得到大小约为9.6kb的含neo抗性基因片段的目的条带，而WRN+/+这种细胞不能扩增获得该目的条带。采用引物对P5+P6进行PCR扩增，WRN+/+这种细胞能扩增得到大小约为135bp的含第15外显子片段的目的条带，而WRN-/-这种细胞不能扩增获得该目的条带。采用引物对P7+P8进行PCR扩增，WRN+/+这种细胞能扩增得到大小约为125bp的含第16外显子片段的目的条带，而WRN-/-这种细胞不能扩增获得该目的条带。采用引物对P9+P10进行PCR扩增，WRN+/+这种细胞能扩增得到大小约为328bp的目的条带(不能获得150bp的目的条带)，而WRN-/-这种细胞由于缺失第15和16外显子片段只能扩增获得大小约为150bp的目的条带(不能获得328bp的目的条带)。
PCR鉴定结果如图1中C和D所示，结果显示与理论结果完全一致。
(2)Western blot鉴定WRN蛋白
以WRN+/+和WRN-/-这两种细胞作为供试细胞，使用RIPA裂解液对其进行裂解，提取总蛋白后以BCA蛋白浓度测定方法定量蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。用Bio-Rad的标准电泳装置进行电泳，预计目的蛋白已经被适当分离后停止电泳。使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行转膜。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的脱脂奶粉封闭液中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟，按照适当比例稀释一抗(anti-WRN，兔源，抗WRN蛋白N端的抗体来源abcam公司(ab200)，抗WRN蛋白C端的抗体来源santa cruz公司(sc-5629))，4℃缓慢摇动孵育过夜。再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。按照适当比例用二抗(HRP标记的羊抗兔抗体，Santacruz公司(货号为sc-2004)，再用洗涤液(0.01M TBST)洗涤5-10分钟，共洗涤3次。最后使用显色剂(购自Millipore，货号为407207-1KITCN)显色。实验以β-actin为内参，一抗为鼠源抗β-actin抗体(购自Santa cruz公司，货号为sc-8432)，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体，Santa cruz公司(货号为sc-2005)。
Western blot检测WRN蛋白结果如图2中B所示，WRN-/-细胞用WRN的N端抗体和C端抗体都无法检测到WRN蛋白的表达；而WRN+/+细胞用WRN的N端抗体和C端抗体均可检测到WRN蛋白的表达(约150KD)。
(3)免疫荧光检测经过改造的人胚胎干细胞的干细胞特性
以WRN+/+和WRN-/-这两种细胞作为供试细胞，采用免疫荧光技术对人胚胎干细胞的干性维持情况相关的分子标记物Oct4，Sox2和Nanog进行检测。具体如下：
将培养于盖玻片上的供试细胞用4％的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，使用含有0.4％(体积百分含量)Triton X-100的PBS室温孵育30分钟，继而换用10％(体积百分含量)驴血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然后加入对应二抗，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，用工作浓度为2μg/ml的Hoechst 33258(Invitrogen，货号：H3569)室温孵育15分钟，最后封片和观察。
结果如图2中A所示，与WRN+/+细胞相似，WRN-/-细胞能够表达Oct4(红色荧光)，Sox2(黄色荧光)和Nanog(绿色荧光)三种分子标记物。
综合以上(1)-(3)的结果，可见在WRN-/-表型的重组人胚胎干细胞(记为WRN-/-ESC)中，WRN基因失活，且不影响干细胞干性基因的表达。
实施例2、WRN缺失(WRN-/-)的ESC经体外定向分化产生WRN-/-的MSC
本发明将实施例1中获得的WRN-/-ESC，进一步体外定向分化为间充质干细胞(WRN-/-MSC)，发现WRN-/-MSC能够表现出典型的成年早衰症WS的症状。具体方法如下：
1、间充质干细胞的定向诱导分化
将WRN-/-ESC进行拟胚体(EB)分化，分化14天，将EB接种于基质胶(matrigel)包被的6孔板中进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞类群，即为WRN缺失(WRN-/-)的间充质干细胞(记为WRN-/-MSC)。实验同时设置以野生型hESC(H9)替代WRN-/-ESC的对照，所得间充质干细胞记为WRN+/+MSC。
2、WRN-/-MSC的衰老表型鉴定
(1)生长抑制测定
利用细胞计数统计连续传代的WRN-/-MSC细胞和WRN+/+MSC细胞的生长能力，结果显示，与WRN+/+MSC细胞相比，WRN-/-MSC表现出明显的生长抑制(图3中A)。
(2)SA-beta-Gal染色
细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-beta-Gal(senescence-associated beta-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。
分别以WRN-/-MSC细胞和WRN+/+MSC细胞为供试细胞(第1代和第5代)，吸去6孔板中培养的供试细胞的细胞培养液，用PBS洗涤1次，再加入染色固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15分钟。弃去固定液，用PBS洗涤1次，每孔加入1ml染色工作液。以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况，并进一步对两组细胞中的SA-beta-Gal染色阳性细胞比率进行定量统计分析。
结果如图3中B所示，从图中可以看出，WRN-/-MSC细胞有明显的蓝色，而WRN+/+MSC细胞基本上没有蓝色。进一步的定量分析结果显示，WRN-/-MSC组的SA-beta-Gal染色阳性细胞比率极显著高于WRN+/+MSC组(P<0.01)。可见，WRN-/-MSC细胞表现出严重衰老的症状。
(3)相关基因表达检测
分别以WRN-/-MSC细胞和WRN+/+MSC细胞为供试细胞(第1代和第5代)。从供试细胞中提取总RNA，并将其反转为cDNA，通过定量RT-PCR的方法检测衰老相关基因(p16和p21)的表达水平的变化。使用的引物如下：
p16-F：5’-ATGGAGCCTTCGGCTGACT-3’；
p16-R：5’-GTAACTATTCGGTGCGTTGGG-3’。
p21-F：5’-CGATGGAACTTCGACTTTGTCA-3’；
p21-R：5’-GCACAAGGGTACAAGACAGTG-3’。
然后，用热图的形式将相应的基因表达情况进行展示，模块颜色越红(颜色越深)表示基因表达水平越高。
结果如图3中C所示，从图中可以看出，WRN-/-MSC细胞中高表达衰老相关的基因p16和p21。
实施例3、利用WRN-/-MSC筛选抗衰老表型的小分子化合物
本发明在培养前述源于WRN-/-ESC的WRN-/-MSC的过程，建立了针对抗衰老表型的小分子化合物的筛选方法，发现维生素C(Vitamin C，Vc)可以逆转WRN-/-MSC的衰老表型。具体如下：
将WRN缺失的MSC细胞(WRN-/-MSC)以5×104每孔铺于六孔板中，细胞贴壁的第二天开始，在实验组加入含50M的维生素C的培养基继续培养，37℃的二氧化碳培养中培养大约一周后细胞可以长满，进行分析或传代。
(1)SA-beta-Gal染色
具体方法参照前文进行。
(2)免疫荧光检测
具体方法参照前文进行，采用抗体为抗人Ki67抗体(ab16667)，Abcam。Ki67染色信号越强，说明细胞增殖能力越强，因此其两组细胞的Ki67染色(绿色荧光)如果有强弱之分，就可以判断染色信号强的细胞增殖能力强，信号弱的细胞增殖能力差。
实验同时设置两个对照组：1.WRN+/+MSC；2.WRN-/-MSC且不添加维生素C。
结果显示，对于WRN-/-MSC而言，相比不加维生素C的对照组，添加了维生素C的实验组的SA-beta-Gal阳性细胞比例减少，细胞增殖能力提高(图4)。说明WRN-/-ESC衍生的WRN-/-MSC等分化产物可以治疗WS提供理想的药物筛选平台。
Claims (13)
1.一种间充质干细胞的制备方法，包括：
(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN，使所述WRN丧失功能，得到所述WRN功能丧失的人多能干细胞；
(2)对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，突变所述人多能干细胞中的人类成年早衰症基因WRN为缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，缺失所述人多能干细胞中的所述WRN的第15外显子和第16外显子，是按照包括如下步骤的方法实现的：
(a1)将序列表中序列1的第11308-12850位所示DNA片段构建到辅助腺病毒载体上，获得重组载体；
(a2)用所述重组载体转染腺病毒包装细胞，将所得细胞记为重组细胞1；用辅助腺病毒感染所述重组细胞1，将所得细胞记为重组细胞2；
(a3)培养所述重组细胞2，从培养上清中获得重组腺病毒；
(a4)用所述重组腺病毒感染所述人多能干细胞，从而获得所述WRN的第15外显子和第16外显子缺失的人多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述辅助腺病毒载体为pCIHDAdGT8-4载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述辅助腺病毒为AdHPBGF35病毒。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述腺病毒包装细胞为人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，对所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述WRN功能丧失的间充质干细胞，是按照包括如下步骤的方法实现的：
(b1)将所述WRN功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；
(b2)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出现；再经过一次传代后，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述WRN功能丧失的间充质干细胞。
8.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞H9细胞系。
10.利用权利要求1-9中任一所述方法制备获得的间充质干细胞。
11.权利要求10所述的间充质干细胞在作为人类成年早衰症细胞模型中的应用。
12.权利要求10所述的间充质干细胞在作为药物筛选模型中的应用；所述药物为治疗人类成年早衰症的药物。
13.利用权利要求10所述的间充质干细胞筛选治疗人类成年早衰症的药物的方法，包括：
(c1)将权利要求10所述间充质干细胞在含有待筛选药物的培养液中培养；
(c2)按照如下确定所述待筛选药物是否为治疗人类成年早衰症的药物：若所述间充质干细胞的衰老表型被逆转，则所述待筛选药物为或候选为治疗人类成年早衰症的药物；若所述间充质干细胞的衰老表型未被逆转，则所述待筛选药物不为或候选不为治疗人类成年早衰症的药物。
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