CN103814124A - 体外心血管模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于药理学研究的小管形成平台和体外心血管模型。此外，本发明涉及用于制备所述平台和模型的方法，以及在所述平台和心血管模型中测定受试物质的生物活性的方法。另外，本发明涉及用于治疗心脏疾病的可植入的心脏结构。
Description
技术领域
本发明涉及用于药理学研究的小管形成平台和体外心血管模型。此外，本发明涉及用于制备所述平台和模型的方法，以及在所述平台和心血管模型中测定受试物质的生物活性的方法。另外，本发明涉及用于治疗心脏疾病的可植入的心脏结构。
背景技术
心血管系统与呼吸系统和中枢神经系统一起属于重要的器官或系统，其功能对于生命来说极为重要。因此，必须对化学物质例如药物、工业化学品、杀生物剂、食品和饲料防腐剂以及化妆品进行心脏毒性评估。这些研究主要包括动物的使用，但是基于动物的试验通常被证明对于预测在人类中的效应来说是不良的模型。此外，动物试验存在伦理问题，成本高并且耗时。出于这些原因，欧盟委员会（EuropeanCommission）和美国监管理机构（US regulatory bodies）两者的策略是应该在非动物模型中进行安全性试验，并且试验应该基于尽可能接近地模拟人类中的条件的基于毒性途径的预测性人类细胞器官型模型（《21世纪的毒性试验：展望和策略》（Toxicity Testing in the21stCentury:A Vision and a Strategy），2007）。
心脏动作电位的异常，不论是由先天性突变还是受伤造成的，都能够引起人类的病理症状，特别是心律失常。心脏的不良药物反应是极为重要的，因为它们通常是严重的并且可能是致命的，正如从1980年代和1990年代从市场撤出的各种药物所看出的。这些死亡事故引起监管部门的注意，并促使2005年公布的ICH准则S7B和E14的产生。这些准则使所研究的所有药物的致心律失常倾向性的非临床和临床评估正式化。由药物诱导的QT延长造成的致心律失常性是停药的第二常见原因，并且引起了越来越多的关注。QT间期受到心率的影响。目前在新药物的安全性药理研究中使用的最常见的模型是动物模型和含有从豚鼠或兔分离的心脏或从狗分离的浦肯野细胞的离体模型。不存在可用于这些目的的经验证的体外心脏模型。
已开发了数种不同的具有收缩性质和动作电位两者的体外3D心脏组织构建物（Zimmermann等，Circulation Research,2002,90:22；Akiyama等，Int.J.Mol.Sci.,2010,11:2910）。现有研究模型的缺点在于它们基于动物生物学（大鼠细胞），以及模型只能短时间（数天）内保持有功能。因此只能评估短期效应。因此，为了模拟与人类相关的心脏功能（心搏频率、心搏强度、电活性、不同的通道活性），需要开发具有相关生物标志物以及物理化学条件控制和维持的基于人类细胞的功能性组织构建物。
US2009/0169521公开了一种用于治疗心脏疾病的人造3D心脏结构。所述结构通过将心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞共接种在人造支架上或共接种在人造支架内来获得。由于外源性支架可能干扰细胞-细胞相互作用和多层组织构建物中的细胞组装（Norotte等，Biomaterials,2009,30:5910），因此所公开的心脏结构对于在药理毒理学研究中的应用来说不是最佳的。
除了化学物质和生物物质的毒性研究之外，在用于心血管疾病的新药物的研究中也需要基于人类细胞的器官型心脏模型。在西方国家中，心血管疾病是最常见的死亡原因，其中心力衰竭是最常见疾病之一。因此，对开发修复心脏功能的药物和组织工程治疗存在迫切需求。一种方法是使用干细胞疗法来修复梗死区域。干细胞疗法的目的是使患者自身的干细胞分化成有功能的心肌细胞，并移植所述细胞以修复心肌的受损区域。然而，在干细胞疗法能够应用于临床使用之前，需要更多的研究来更好地理解干细胞的分化、增殖和行为。组织工程治疗将极大地受益于包括血管支持的基于人类细胞的功能性心脏模型。
因此，在本技术领域中对于经验证的心脏体外模型存在着已确认的需求。
发明内容
一方面，本发明提供了一种体外心血管结构，其包含分离的小管形成平台和心肌细胞。所述小管形成平台包含人类脂肪干细胞（hASC），并任选地不含任何外源性基质组分或添加的生物材料。在某些实施方式中，所述平台还包含形成小管的内皮细胞，例如人类脐静脉内皮细胞、人类微血管内皮细胞、人类脂肪干细胞来源的内皮细胞、人类胚胎干细胞来源的内皮细胞、诱导的多能干细胞来源的内皮细胞、转分化来源的内皮细胞、内皮祖细胞或通过遗传修饰获得的内皮细胞。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗心脏病的体外心血管结构。
另一方面，本发明提供了如上所述的分离的小管形成平台。
另一方面，本发明提供了一种生产小管形成平台的方法。所述方法包括下列步骤：a）提供hASC；b）增补有VEGF和FGF-2的无血清完全培养基中，任选地在不存在任何外源性基质组分或添加的生物材料的条件下培养所述hASC。在某些实施方式中，所述方法还包括提供形成小管的内皮细胞并将它们与所述hASC进行共培养的步骤。
另一方面，本发明提供了一种生产如上所述的体外心血管结构的方法。所述方法包括下列步骤：a）提供hASC、心肌细胞和任选的形成小管的内皮细胞；b）培养所述hASC，任选地将所述hASC与所述形成小管的内皮细胞一起进行培养；c）将所述心肌细胞在步骤b）中形成的培养物的顶上进行培养；以及d）向在步骤c）中形成的细胞培养物施用VEGF和FGF-2。
此外，本发明的一个方面涉及一种测定受试物质的生物活性的方法。所述方法包括下列步骤：a）提供如上所述的小管形成平台或体外心血管结构；b）向所述平台或结构施用所述受试物质；c）在所述平台或结构中测定所述受试物质的效应；以及d）将在步骤c）中测定的效应与在不存在所述受试物质的条件下测定的相应效应进行比较。在某些实施方式中，待测定的生物活性选自细胞毒性、小管形成调节活性、电学性质例如心肌细胞收缩的速率、机械性质例如心肌细胞收缩力或/和基础细胞代谢。
本发明的另一方面提供了一种在需要的患者中治疗心脏病的方法，所述方法包括将上述心脏结构植入到所述患者中。所述心脏病的非限制性实例可以选自冠心病和扩张性心肌病。
本发明的其他特征、特定实施方式、目的、详细情况和优点被示出在从属权利要求、下面的图、详细描述和实施例中。
附图说明
下面将参考附图，利用优选实施方式对本发明进行更详细描述，在所述附图中
图1是示出了hASC单培养物和hASC+HUVEC共培养物的小管形成的照片。将细胞用血管性血友病因子抗体（抗血管性血友病因子抗体，1:500，Sigma，红色荧光由TRITC偶联的第二抗体示出，1:100，Sigma）进行染色。图1A：hASC单培养物与hASC+HUVEC共培养物的小管形成的比较。将细胞在富含生长因子的EGM-2BulletKit培养基中培养并诱导血管生成3或6天。图1B：不同处理之间的小管形成的半定量分析。在3和6天将hASC单培养物和hASC+HUVEC共培养物相互进行比较。半定量标度按照Sarkanen等（Front.Pharmacol,2011,1:147.）。结果被报告为平均值±SD，并且当p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***时，差异被认为是显著的。图1C：对于对照来说，将HUVEC以4000个细胞/cm2铺板并在富含生长因子的EGM-2中生长，并且在不外源性添加生长因子的条件下生长hASC+HUVEC共培养物。图1D：将hASC+HUVEC在含有人血清（EGM-2，2%HS）或不含血清（EGM-2无血清）的富含生长因子的EGM-2中培养。
图2是示出了在用富含生长因子的EGM-2培养基进行血管生成诱导后，小管结构中周细胞和平滑肌细胞分化标志物的表达的照片。为了检测小管形成，将细胞培养物用血管性血友病因子抗体（抗血管性血友病因子抗体，1:500，Sigma，红色荧光由TRITC偶联的第二抗体示出，1:100，Sigma）进行免疫染色。为了检测小管成熟，将培养物用抗αSMA抗体（1:200，Sigma）、抗COLIV抗体（1:500，Sigma）、抗PDGFRβ抗体（1:500，Sigma）、抗SMMHC抗体（1:800，Sigma）或抗calponin抗体（1:800，Sigma）进行免疫染色，所有这些绿色荧光都由FITC偶联的第二抗体（1:100，Sigma）示出。示出的图像都是第6天的双重免疫荧光的合并图像，例外的是抗PDGFRβ抗体的图像，其是第3天的合并图像，以及抗COLIV抗体和抗calponin抗体的图像，对于它们示出了染色（小图像）和FITC偶联的第二抗体-抗COLIV抗体/抗calponin抗体染色（大图像）的两个合并图像。
图3是示出了培养10天的基于hASC、HUVEC和新生大鼠心肌细胞的体外心血管模型的照片。标尺条为100μm。为了检测小管形成，将细胞培养物用血管性血友病因子抗体（抗血管性血友病因子抗体，1:500，Sigma，TRITC偶联的第二抗体，1:100，Sigma）进行免疫染色。为了检测心肌细胞，将培养物用心脏特异性抗肌钙蛋白T抗体（1:500，Abcam）和FITC偶联的第二抗体（1:100，Sigma）进行免疫染色。
图4是示出了培养10天的基于hASC、HUVEC和人类胚胎干细胞来源的心肌细胞的体外心血管模型的照片。标尺条为100μm。为了检测小管形成，将细胞培养物用血管性血友病因子抗体（抗血管性血友病因子抗体，1:500，Sigma，TRITC偶联的第二抗体，1:100，Sigma）进行免疫染色。为了检测心肌细胞，将培养物用心脏特异性抗肌钙蛋白T抗体（1:500，Abcam）和FITC偶联的第二抗体（1:100，Sigma）进行免疫染色。
图5是多电极阵列（MEA）记录，其示出了在模型构建后4天来自于同步收缩的心血管模型的电信号。
具体事实方式
本发明提供了在药理安全性和毒性研究中使用的体外心血管结构，即心血管模型。所述模型包含被培养在小管形成平台上的心肌细胞。令人吃惊的是，可以在不使用任何外源性基质或添加的生物材料的条件下获得这样的功能性心血管模型。
通常用于产生多层组织构建物的外源性支架可能干扰细胞-细胞相互作用和细胞组装。因此，就此而言，本发明的无支架心血管模型是有利的。最佳组织构建物应该不含动物来源的组分或非天然的支架材料，并且应只含天然存在于组织中的生长因子和蛋白质。至少在某些实施方式中，本发明的心血管模型满足这些要求，并具有成熟血管的特征，即除了形成小管结构之外，模型还具有以下特征：周细胞募集、基膜形成、以及平滑肌细胞的血管支撑层的形成。
当在本文中使用时，术语“包含”涵盖术语“由……构成”和“基本上由……构成”。
当在本文中使用时，术语“小管形成平台”是指具有自组装成血管网络结构的能力的多层细胞结构。
在一种实施方式中，小管形成平台可以仅由脂肪来源的基质/干细胞（ASC）例如人类脂肪干细胞（hASC）构造而成。这种类型的小管形成平台被称为单培养物模型。
当在本文中使用时，术语“脂肪来源的干细胞”或“ASC”是指从脂肪组织获得的未分选的基质血管级分。这样的级分是非均质的，并包含间充质干细胞。根据最近的术语，“ASC”也可以被称为“脂肪来源的基质细胞”。获得人类ASC（hASC）的方法在本领域中是容易获得的，包括但不限于在实施例1中公开的方法。正如本领域中公知的，ASC具有分化成多种细胞类型的能力。
在另一种实施方式中，通过将形成小管的内皮细胞和hASC进行共培养来构造小管形成平台。这种类型的小管形成平台被称为共培养物模型。
当在本文中使用时，术语“形成小管的内皮细胞”是指具有形成血管结构例如血管网络的能力的内皮细胞。形成小管的内皮细胞的非限制性实例包括人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人类微血管内皮细胞、人类脂肪干细胞来源的内皮细胞、人类胚胎干细胞来源的内皮细胞、诱导的多能干细胞来源的内皮细胞、转分化来源的内皮细胞、来自于其他组织的内皮祖细胞和通过遗传修饰获得的内皮细胞。用于诱导上述细胞的内皮分化的手段和方法，对于本领域技术人员来说是容易知道的。形成小管的内皮细胞也是可商购的。
胚胎干细胞（ESC）是具有分化成广泛的各种不同细胞类型例如内皮细胞的能力的多能细胞。获得胚胎干细胞的方法在本领域中是容易获得的。此外，WO2007/130664公开了一种用于在不损伤供体胚胎的情况下获得人类胚胎干细胞的有希望的新方法，该方法被称为卵裂球活检。
当在本文中使用时，术语“诱导的多能干细胞”（iPSC）是指通过发育重编程（developmental reprogramming）从分化细胞、通常是从成人体细胞例如成纤维细胞产生的多能干细胞。这样的细胞例如已被描述在WO2008/151058和US2008/076176中。诱导的人类多能干细胞被称为hiPSC。
当在本文中使用时，术语“转分化”或“谱系重编程（lineagereprogramming）”是指一种成熟细胞类型不经历中间的多能状态或祖细胞类型而转变成另一种成熟细胞类型。
小管形成平台可以通过下述方法来获得，在所述方法中，将i）ASC或ii）ASC与形成小管的内皮细胞，铺在细胞培养板或组织培养板例如24孔、48孔、96孔板或微孔板上的支持内皮细胞生长的细胞培养基中。这样的培养基的非限制性实例是可以从Lonza获得的EGM-2BulletKitTM。可以在任何内皮生长培养基（由例如Lonza、Provitro、Promocell、BD供应）中，或在含低浓度人类或动物血清或不含血清并含有bFGF、VEGF、抗坏血酸、肝素和/或氢化可的松作为增补剂的DMEM、DMEM/F12或敲除（KO）DMEM（例如由Gibco Invitrogen、Sigma、BD、Lonza供应）中诱导小管形成。可以进一步包含的任选因子的非限制性实例是胰岛素、IGF-I、hEGF、转铁蛋白和/或激素例如三碘甲状腺氨酸。
在某些实施方式中，细胞培养板的底表面可以具有沟槽或划痕，以使将要形成的小管朝着所需方向对齐。
在单培养物模型中，通常但不是必需地将细胞以约24x104个细胞/cm2或更高的密度进行铺板。在共培养物模型中，通常但不是必需地将ASC和内皮细胞以2:1至8:1、优选地5:1的比例分别进行铺板。在一种实施方式中，将ASC以约20x104个细胞/cm2的密度进行铺板，并将形成小管的内皮细胞以约4x104个细胞/cm2的密度进行铺板。在某些实施方式中，将形成小管的细胞例如HUVEC比ASC例如hASC晚1至3小时进行铺板。
本发明的心血管模型通过下述方法获得，在所述方法中，将心肌细胞接种或铺在小管形成平台的顶上，由此塑造人类或动物心脏。适用于这种模型的心肌细胞的非限制性实例包括新生大鼠心肌细胞、人类胚胎干细胞（hESC）来源的心肌细胞、诱导的人类多能干细胞（hiPSC）来源的心肌细胞、成体干细胞来源的心肌细胞、人类转分化来源的心肌细胞和人类心肌细胞。用于诱导心肌细胞分化的手段和方法在本领域中是已知的，并包括但不限于由Mummery等（Circulation,2003,107:2733）开发的内胚层细胞诱导的分化，由Laflamme等（NatBiotechnol,2007,25（9）:1015）开发的活化素A和BMP4诱导的分化，以及由Kehat等（Circ.Res.2002,91:659）开发的胚状体技术。
在某些实施方式中，将心肌细胞在无血清完全培养基（CSFM）中铺于小管形成平台的顶上。这特别适用于大鼠心肌细胞。适合用作CSFM的基础培养基的可商购的细胞培养基的非限制性实例是可以从Gibco获得的DMEMTM或DMEM/F12或敲除（KO）DMEM。
如果使用人类心肌细胞来实现心血管结构，培养基可以是无血清的或含有高达约10%的牛血清或人血清。在这样的情形中，例如DMEM/F12可以用作基础培养基。
心肌细胞通常以约1x105或约2x105个细胞/cm2的密度进行铺板，但是接种密度不限于这些值。
通常但不是必需地，将心肌细胞比形成小管形成平台的细胞晚一天接种在小管形成平台的顶上。对于心血管模型来说，在接种心肌细胞之前完全形成小管不是先决条件。
为了实时追踪小管形成和心肌细胞与小管的对齐，可以利用例如慢病毒感染，通过将例如绿色或黄色荧光蛋白插入到内皮细胞基因组中，对形成小管的内皮细胞和/或心肌细胞进行荧光标记。也可以对细胞进行遗传修饰（包括插入报告基因、疾病特异性基因、分化相关基因）。
通常，在将心肌细胞铺板后一天，向细胞施用血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）以便诱导小管形成。这可以通过将培养基替换成增补有所述生长因子的新鲜CSFM来进行。通常，使用在约1ng/ml至约20ng/ml、优选地10至15ng/ml的浓度范围内的VEGF；而通常使用在约0.5ng/ml至2ng/ml、优选地1至2ng/ml的浓度范围内的FGF-2。
用于在模型中提高血管生成诱导的任选试剂包括但不限于抗坏血酸、肝素、氢化可的松、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）、优选为人类EGF，及其任何组合。
适合于在本发明的模型中诱导血管生成（即小管形成）的其他任选的培养基成分包括浓度高达10%的牛血清和人血清，以及牛白蛋白和人白蛋白。正如专业技术人员容易理解的，用于生产和/或利用本发明的小管形成平台和/或心血管模型的任何培养基可以含有细胞培养基中通常使用的任何成分，例如抗生素、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。
在心血管模型中，心肌细胞以比以前可能的更长的时间保持存活和有功能。在某些实施方式中，新生大鼠心肌细胞的收缩性可以维持三周，与此相比，hiPSC和hESC来源的心肌细胞可以维持数月。在心血管模型中，心肌细胞的存活性和收缩性比完全形成的小管结构更加重要。因此，根据本发明的各种实施方式，可以使用具有适度小管形成的心血管模型来测试受试物质。
在某些实施方式中，在施用VEGF和FGF-2后一天，向细胞加入将要在本发明的心血管模型中测试的物质。先决条件是在添加化学物质之前，心肌细胞必需具有功能性质。如果需要，所述物质的效应可以被追踪例如2至3周或甚至数月，这取决于心肌细胞的应用和来源。
待测定的生物效应的实例包括但不限于毒性效应，其例如通过评估不同基因表达的增加或降低来测定；细胞的存活性，其通过不同手段（例如MTT试验、中性红摄入（NRU）测定法或可以从Invitrogen获得的LiveDead测定）来测定；电学性质例如心肌细胞收缩速率和复极化时间的变化或心律失常事件，其例如通过测量QT间隔来测定；机械性质例如收缩力的变化，其通过不同的平面生物传感器或牵引术来测量；心脏标志物例如用于检测GAP结点的连接蛋白-43或诸如心脏特异性肌钙蛋白T的标志物的免疫染色；以及细胞代谢的变化（例如乳酸形成、钙通量、离子通道的变化、葡萄糖消耗、氧消耗和二氧化碳释放）。这些效应可以以任何所需的组合分开地、顺序地、并行地或同时地进行评估。
心血管模型可以含有一种或多种传感器例如平面生物传感器，用于评估任何上面提到的细胞效应。适合的传感器包括但不限于电化学、电学和/或光学传感器。可以包括用于监测以及如果需要、用于调节培养基的物理化学性质的其他传感器。
在某些实施方式中，小管形成平台本身可用于评估受试物质的血管生成性质。待评估的血管生成性质的非限制性实例包括小管形成能力（例如通过测量小管长度和/或分支，或确定内皮紧密连接的存在）和小管成熟能力（例如通过确定基膜形成、成熟小管结构的周细胞和平滑肌细胞衬的存在）。在这样的情形中，不向细胞培养物添加心肌细胞。可以在例如使用或不使用上述任选的血管生成诱导剂通过VEGF和FGF-2进行血管生成诱导后一天，向小管形成平台施加受试物质。血管生成性质可以被追踪例如数天或两周。甚至可以在小管完全形成之前，向模型施加受试物质。
将要在本发明的心血管和血管生成模型中筛选的受试物质的非限制性实例包括化学和生物物质例如小分子化合物、纳米粒子、多肽、抗体和生长因子。
尽管在不存在任何外源性基质组分和添加的生物材料的条件下，心血管结构和小管形成平台对于药理学安全性和毒性试验的目的来说性能良好，并且模拟心脏组织而没有干扰性的非本源组分，但是在某些情况下，将这样的组分包含在模型和/或平台中可能是有利的。这样的实施方式可用于例如在人工心脏构建物中测试受试物质的安全性和毒性。将要被提供在心血管模型和/或小管形成平台中的适合的外源性基质组分或生物材料的非限制性实例包括但不限于合成或天然聚合物例如胶原蛋白I或IV、透明质酸、明胶或其他细胞外基质组分。
在本发明的某些情况下，可以构建含有外源性基质组分和/或添加的生物材料的心血管结构作为可植入的3D心脏结构，用于治疗心脏病，包括但不限于冠心病和扩张性心肌病。
当在本文中使用时，术语“治疗”不仅指疾病的完全治愈，而且还指疾病或与其相关的症状的预防、缓解和改善。
对于治疗目的来说，重要的是心脏结构是不含异物的，即它不含从外部来源获得的任何组分，或者不是在含有外来试剂的条件下制备得到的。此外，对于治疗目的来说，使用自体细胞可能是有利的。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，随着技术进步，本发明的概念可以以各种不同方式来实施。本发明及其实施方式不限于上面描述的实例，而是可以在权利要求书的范围内变化。
实施例
所有工作按照国家伦理委员会的指导方针来进行。人类脐带从计划的剖腹产手术获得，而人类脂肪组织样本从外科手术获得，两者都从Tampere大学医院获得了适当的许可和知情同意。此外，Pirkanmaa医院地区伦理委员会已批准了人类iPS和hESC细胞的获取和使用，许可号分别为R08070和R051116。
实施例1.基于共培养物的小管形成平台的构建和表征
人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离：
HUVEC细胞源自于从计划的剖腹产手术获得的脐带，所述剖腹产手术具有来自于Tampere大学医院的知情同意（许可号R08028，来自于Finland的Tampere的Pirkanmaa医院地区伦理委员会）。按照Jaffe等（J Clin Invest,1973,52:2745）的描述从人类脐带静脉进行脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离，但是对方法进行了进一步优化。从胎盘分离脐带，并用20G针头对脐静脉进行插管。通过在针头上方用外科夹子夹住脐带使针头稳固。用脐带缓冲溶液（UBS；0.1M磷酸盐缓冲溶液，含有0.14M NaCl、0.004M KCl和0.011M葡萄糖）灌注静脉以洗掉血液，然后用外科夹子夹住脐静脉的另一端。将静脉用0.05%胶原酶I进行灌输。将脐带在水浴中在37℃下温育长达20min。在温育后，通过用PBS灌注，将含有HUVEC的胶原酶I溶液从脐带冲洗到50ml聚丙烯管（Sarstedt）中。将细胞以200xg离心10min，用培养基洗涤一次，再次离心，重悬浮在EGM-2BulletKit培养基（Lonza Group Ltd,Basel,Switzerland）中，并接种到75cm2瓶中。将细胞在5%CO2培养箱中在37℃下进行培养。每2至3天更换培养基，并且在汇合时将细胞分开。对于测定对照来说，将HUVEC以4000个细胞/cm2进行铺板，并在EGM-2BulletKit培养基中进行培养。
每天在显微镜下观察分离的HUVEC的形态学、细胞培养物纯度和细胞增殖。每2-3天更换培养基。在汇合时，用Tryple Express将细胞分离。将具有良好增殖能力的纯HUVEC培养物，在原代培养（p0）时以1:2–1:4的比率进行传代培养，在第1代（p1）及以后以1:3–1:5的比率进行传代培养。
慢病毒感染：
慢病毒构建物pLKO-MISSION-Bright-GFP购自BiomedicumGenomics（BMGen,Biomedicum Helsinki,Helsinki,Finland）。使用1mlEGM-2Bullet Kit培养基中的300μl pLKO-MISSION-Bright-GFP（1U/ml）对低传代次数的HUVEC进行感染。使用8μg/ml海地美溴铵（Sigma）加速病毒感染。在温育24小时后，将培养基替换为新鲜的EGM-2培养基。使用克隆环选择高荧光克隆，并使用稀释克隆法进行进一步选择以获得纯GFP-HUVEC培养物。在将感染的HUVEC扩增后，它们被用于如下所述的hASC和HUVEC共培养物测定法。
人类脂肪干细胞（hASC）的分离：
按照以前所描述的（Gimble和Guilak，Cytotherapy,2003,5:362；Hong等，Mol Cell Biochem,2005,276；Niemela等，J Craniofac Surg,2007,18:325-335）进行干细胞分离程序。简单来说，将人类脂肪组织样本切成小块，用Dulbecco改良的Eagle培养基营养混合物F-12（DMEM/F12,Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）中的0.05%胶原酶I（Invitrogen,Paisley,Scotland,UK），在回旋水浴中在37℃下进行酶消化60min。将消化的组织在室温（RT）下以600x g离心10min。将消化的组织过滤通过100μm滤器（Sarstedt,Nümbrecht,Germany），离心，并过滤通过40μm滤器（Sarstedt）。在75cm2瓶（Nunc EasyFlaskTM,Nunc,Roskilde,Denmark）中，将细胞接种在增补有1%L-谷氨酰胺（L-glut,Gibco）、1%抗生素-抗真菌剂混合物（AB/AM,Gibco）和15%人血清（HS,Cambrex,East Rutherford,NJ,USA）的DMEM/F12中。第二天，将细胞用PBS洗涤数次。将细胞维持在37℃、5%CO2空气气氛和恒定湿度下，并且每2至3天更换培养基。在生长至汇合后，将细胞以1:2-1:3的比率分开，或进一步用于细胞培养研究。
hASC和HUVEC的共培养：
将人类ASC（最多传代7次）以20000个细胞/cm2的密度接种在48孔板（NunclonTMMultidishes,Nunc,Roskilde,Denmark）中的EGM-2BulletKit（Lonza）培养基中。将如上培养的HUVEC（最多传代4次）立即以4000个细胞/cm2的密度小心地接种在hASC的顶上。在铺板后的第二天，向共培养物施加VEGF（10ng/ml）和FGF-2（1ng/ml）。
将细胞培养3或6天，然后进行免疫细胞化学或定量RT-PCR。更换培养基，并对培养3天的细胞施加一次处理，对培养6天的细胞施加两次处理。
免疫细胞化学：
使用针对血管性血友病因子的内皮细胞特异性抗体（在兔中产生的抗vWf第一抗体，1:500，Sigma），对小管形成进行可视化。为了评估人类脂肪干细胞分化，用α-vWf进行平行的双重免疫荧光染色。将针对常见周细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（单克隆的抗αSMA克隆1A4，1:200，Sigma）、血管平滑肌细胞标志物平滑肌肌球蛋白重链（抗SMMHC抗体，1:800，Sigma）、收缩性平滑肌细胞标志物calponin（抗calponin抗体，1:800，Sigma）、周细胞和平滑肌细胞祖细胞标志物血小板衍生生长因子受体-β（抗PDGFRβ抗体，1:800）或基膜标志物胶原蛋白IV（抗COLIV抗体，1:500，Sigma）的第一抗体与抗vWf抗体组合。将细胞用PBS洗涤3次，用冰冷的70%乙醇固定20分钟，用0.5%Triton X-100（JT Baker,Phillipsburg,NJ,USA）通透化15分钟，并用10%牛血清白蛋白（BSA,Sigma）封闭非特异性染色30分钟。在封闭后，将细胞与第一抗体对在RT下温育1小时。将细胞用PBS洗涤三次，与第二抗体温育30min，所述第二抗体对于抗vWf抗体来说是多克隆抗兔IgG TRITC抗体（1:100，Sigma），对于抗αSMA抗体、抗COLIV抗体、抗PDGFR-β抗体和抗SMMHC抗体来说是多克隆抗小鼠IgG FITC抗体（1:100，Sigma）。将细胞核用Hoechst33258（1ug/ml,Sigma）染色5分钟并用PBS洗涤5次。对于抗GFP染色来说，第一抗体对是针对GFP的小鼠单克隆抗体（Abcam,Cambridge,UK,1:100）和抗vWf抗体，第二抗体分别是抗小鼠IgG TRITC抗体（Sigma,1:100）和针对兔IgG FITC的多克隆抗体（Acris Antibodies GmbH,Hiddenhausen,Germany,1:500）。使用Nikon Eclipse Ti-S显微镜（Nikon,Tokyo,Japan）将荧光可视化，并用Adobe Photoshop软件7.0（AdobeSystems,San Jose,CA,USA）和Corel Draw软件10.0（Corel Corporation,Ottawa,ON,Canada）处理图像。
小管形成的显微镜分析：
在免疫细胞化学染色后，使用Nikon Eclipse TS100显微镜（Nikon,Tokyo,Japan）以40x放大倍数从48孔板的孔分析小管。使用从0至10的半定量分级量表对不同培养物中小管的程度进行定量，所述分级是基于小管形成、小管长度和分支，正如在我们以前的研究中所描述的（Sarkanen等，2011）。
统计学分析：
进行统计学分析，并使用GraphPadPrism5.0（GraphPad软件,Inc.,San Diego,CA,USA）处理图表。对小管形成和RT-PCR结果进行单因素ANOVA分析，并且在适用时随后进行Dunnett’s和Bonferroni’s事后检验。结果被报告为平均值±SD，并且当p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***时，差异被认为是显著的。
结果：
在两个不同时间点（第3天和第6天），对共培养物的小管形成能力和抗vWf抗体阳性内皮小管结构进行评估和比较。共培养物显示出早期（第3天）小管网络形成，所述小管网络形成是可重复的并且不依赖于细胞系或细胞的传代次数。在第6天，共培养物显示出极为加速的增殖速率，因为有大量致密的多层血管网络形成。
小管形成的半定量评估显示共培养物在第6天具有比第3天显著更多的小管（p<0.001）。在没有生长因子的条件下生长的对照细胞以及在富含生长因子的EGM-2培养基中生长的单独的HUVEC，分别仅显示出少量小管形成或没有小管形成。
也对共培养物进行免疫细胞化学染色。在第3天，PDGFRβ的表达最强，并且作为始终围绕发育中的小管的点状结构而被观察到。在第6天，以一定程度观察到PDGFRβ。显示出基膜发育的COLIV被非常广泛地表达在共培养物中。所述表达与发育中的小管共定位，覆盖所述小管。在第6天，α-SMA和SMMHC阳性细胞在共培养物中广泛表达，通常位于小管结构的分支点中和小管之间。在第3天和第6天之间，SMMHC表达增加。可以得出结论，共培养物模型形成致密的多层血管网络，其具有成熟血管的性质例如完整的基膜形成和与小管对齐的具有收缩性质的平滑肌细胞。这种共培养物模型与以前开发的任何血管生成模型相比更加成熟。
实施例2.基于单培养物的小管形成平台的构建和表征
如实施例1中所述获得人类ASC，并将其以20000个细胞/cm2的密度接种在48孔板（NunclonTMMultidishes,Nunc,Roskilde,Denmark）中的EGM-2BulletKit培养基中。将细胞在EGM-2BulletKit培养基这种含有EGF、VEGF、bFGF、IGF-I、抗坏血酸、肝素、0.1%庆大霉素/两性霉素B和2%FBS的可商购的富含生长因子的培养基中，或者在增补有15%HS、1mM L-glut和1%AB/AM的DMEM/F-12培养基中培养3或6天。更换培养基，并向培养3天的细胞施加一次处理，向培养6天的细胞施加两次处理。作为测定对照，将hASC在增补有15%HS、1mM L-glut和1%AB/AM的DMEM/F-12培养基中进行培养。
结果：
在hASC单培养物中，对血管生成的诱导不如共培养物中那样强。然而，在单培养物中，常常观察到支撑血管的周细胞和平滑肌细胞标志物。
实施例3.体外心血管模型的构建和表征
如实施例1中所述获得在本实施例中使用的HUVEC和hASC。新生大鼠心肌细胞取自2至3日龄的新生大鼠幼仔。
如下所述在48孔板中构建体外心血管模型：
第0天：小管形成平台的构建
共培养物模型：将hASC（最多传代4次）以20000个细胞/cm2的密度接种在48孔板中的EGM-2BulletKit培养基中。在1-3小时后，将EGM-2培养基中的HUVEC（最多4次传代）以4000个细胞/cm2的密度小心地接种在hASC的顶上。
单培养物模型：将hASC（最多传代4次）以24000个细胞/cm2的密度接种在48孔板中的EGM-2BulletKit培养基中。
第1天：体外心血管模型的构建
将无血清完全培养基（CSFM）中的新生大鼠心肌细胞（100000、200000或40000个细胞）接种在小管形成平台的顶上。
第2天：分化的诱导
将培养基更换为增补有10ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）和1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）的CSFM。每周三次将培养基更换成新鲜培养基。
结果：
活的并且可收缩的新生大鼠心肌细胞在单培养物模型中存活约7天，在共培养物模型中存活至少14天（参见表1）。在整个培养时间中维持条纹状形式的细胞形态。心肌细胞沿着小管结构或靠近小管结构取向，并且在整个培养物中同步收缩。
表1.新生大鼠心肌细胞的收缩性
*通过目测检查得到的近似值
（EGM-2BulletKit Single Quots增补物，Lonza）和肝素（EGM-2Single Quots增补物，Lonza）。
培养基3：增补有2%FBS（胎牛血清，Gibco）、10ng/ml VEGF和1ng/ml FGF-2的CSFM。
培养基4：血管生成刺激培养基：增补有10ng/ml VEGF、1ng/mlFGF-2、0.1%庆大霉素（GA-1000,Lonza）、2%胎牛血清和1mM L-谷氨酰胺的内皮细胞基础培养基（EBM-2，Lonza）。
培养基5：血管生成刺激培养基+人血清：增补有10ng/ml血管内皮生长因子和1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2,Sigma）、0.1%庆大霉素（GA-1000,Lonza）和2%人血清（Lonza）和1mM L-谷氨酰胺的内皮细胞基础培养基（EBM-2，Lonza）。
实施例4.比较结果
在基于共培养物的小管形成平台中，在7种不同处理下评估新生大鼠心肌细胞（NRC）的小管形成和心肌细胞收缩能力。
培养基1：增补有10ng/ml VEGF（Sigma Aldrich,Manassas,VA,USA）和1ng/ml FGF-2（Sigma）的CSFM（无血清完全培养基）。
50ml CSFM由下列成分构成：
-DMEM/F-12 42ml
-200mM L-谷氨酰胺 0.64ml
-100x青霉素/链霉素 0.5ml
-0.1nM T3 0.5μl
-10x BSA 5ml
-100mM丙酮酸钠 1.4ml
-ITS 0.576ml
培养基2：增补有10ng/ml VEGF、1ng/ml FGF-2、抗坏血酸（EGM-2Single Quots增补物，Lonza）、氢化可的松的CSFM。
培养基6：EGM-2BulletKit培养基（Lonza），其中将2%胎牛血清（Lonza）用2%人血清（Lonza）替换。
培养基7：不含胎牛血清的EGM-2BulletKit培养基（Lonza）。
表2.心肌细胞收缩能力和小管形成
*通过目测检查
**根据Sarkanen等，2011的1-8的量表。
实施例5.体外人类心血管模型的构建和表征
如实施例1中所述获得在本实施例中使用的HUVEC和hASC。将人类胚胎干细胞来源的心肌细胞如Mummery等（同上）所述分化2周。将搏动簇切下，分离，并在增补有10%FBS、1%NEAA和1%Glutamax的DMEM/F12（EB培养基）中进行培养。
如下所述在48孔板中构建体外心血管模型：
第0天：小管形成平台的构建
共培养物模型：将hASC（最多传代4次）以20000个细胞/cm2的密度接种在48孔板中的EGM-2BulletKit培养基中。在1-3小时后，将EGM-2培养基中的HUVEC（最多4次传代）以4000个细胞/cm2的密度小心地接种在hASC的顶上。
单培养物模型：将hASC（最多传代4次）以24000个细胞/cm2的密度接种在48孔板中的EGM-2BulletKit培养基中。
第1天：体外心血管模型的构建
将EB中的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞（每个48孔板的孔1-7个细胞聚集体）接种在小管形成平台的顶上。
第2天：分化的诱导
将培养基更换为增补有10ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）和1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）的EB。每周三次将培养基更换成新鲜培养基。
结果
图4示出了在共培养物模型中，即使在10天后人类心肌细胞也是有功能的，即能收缩的并表现出类似成熟心肌细胞的典型形态。
Claims (20)
1.体外心血管结构，其包含：
i）分离的小管形成平台，所述小管形成平台包含人类脂肪干细胞（hASC），以及
ii）心肌细胞。
2.权利要求1的结构，其中所述小管形成平台还包含形成小管的内皮细胞。
3.权利要求2的结构，其中所述形成小管的内皮细胞选自人类脐静脉内皮细胞、人类微血管内皮细胞、人类脂肪干细胞来源的内皮细胞、人类胚胎干细胞来源的内皮细胞、诱导的多能干细胞来源的内皮细胞、转分化来源的内皮细胞、内皮祖细胞和通过遗传修饰获得的内皮细胞。
4.权利要求1至3任一项的结构，其中所述心肌细胞选自新生大鼠心肌细胞、hiPSC来源的心肌细胞、hESC来源的心肌细胞、成体干细胞来源的心肌细胞、转分化来源的心肌细胞和人类原代心肌细胞。
5.权利要求1至4任一项的结构，其还包含外源性基质组分或添加的生物材料，所述外源性基质组分或添加的生物材料选自合成聚合物、天然聚合物、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、透明质酸、明胶和其他细胞外基质组分，或其混合物。
6.权利要求1至5任一项的结构，其用于治疗心脏病。
7.权利要求5的结构，其中所述心脏病选自冠心病和扩张性心肌病。
8.分离的小管形成平台，其包含人类脂肪干细胞（hASC）。
9.权利要求8的平台，其不含任何外源性基质组分或添加的生物材料。
10.生产权利要求8的小管形成平台的方法，所述方法包括：
a）提供hASC；
b）在增补有VEGF和FGF-2的细胞培养基中，任选地在不存在任何外源性基质组分或添加的生物材料的条件下培养所述hASC。
11.权利要求10的方法，其还包括：提供形成小管的内皮细胞，并将它们与所述hASC进行共培养。
12.权利要求11的方法，其中所述形成小管的内皮细胞选自人类脐静脉内皮细胞、人类微血管内皮细胞、人类脂肪干细胞来源的内皮细胞、人类胚胎干细胞来源的内皮细胞、诱导的多能干细胞来源的内皮细胞、转分化来源的内皮细胞和内皮祖细胞。
13.权利要求10至12任一项的方法，其中所述培养基还包含至少一种选自以下的试剂：抗坏血酸、氢化可的松、肝素、IGF-1和EGF。
14.生产权利要求1的体外心血管结构的方法，所述方法包括：
a）提供hASC、心肌细胞和任选的形成小管的内皮细胞；
b）培养所述hASC，任选地将所述hASC与所述形成小管的内皮细胞一起进行培养；
c）将所述心肌细胞在步骤b）中形成的培养物的顶上进行培养；以及
d）向在步骤c）中形成的细胞培养物施用VEGF和FGF-2。
15.权利要求14的方法，其中所述形成小管的内皮细胞选自人类脐静脉内皮细胞、人类微血管内皮细胞、人类脂肪干细胞来源的内皮细胞、人类胚胎干细胞来源的内皮细胞、诱导的多能干细胞来源的内皮细胞、转分化来源的内皮细胞和内皮祖细胞。
16.权利要求14或15的方法，其中步骤c）还包括施用至少一种选自以下的试剂：抗坏血酸、氢化可的松、肝素、IGF-1和EGF。
17.测定受试物质的生物活性的方法，所述方法包括下列步骤：
a）提供权利要求1的体外心血管结构或权利要求8的小管形成平台；
b）向所述结构或平台施用所述受试物质；
c）在所述结构或平台中测定所述受试物质的效应；以及
d）将在步骤c）中测定的效应与在不存在所述受试物质的条件下测定的相应效应进行比较。
18.权利要求17的方法，其中待测定的生物活性选自细胞毒性、小管形成调节活性、电学性质例如心肌细胞收缩的速率规律性、复极化持续时间、致心律失常性的存在、机械性质例如心肌细胞收缩力和细胞代谢。
19.在需要的患者中治疗心脏病的方法，所述方法包括将权利要求5的心脏结构植入到所述患者中。
20.权利要求19的方法，其中所述心脏病选自冠心病和扩张性心肌病。
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