KR20140048190A - 시험관내 심혈관 모델 - Google Patents

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KR20140048190A
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카트리이나 알토-세탈라
뚤라 헤이노넨
에리야 케르켈라
예르따-리이나 사르카넨
한나 부오렌빠
띠모 일리코미
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땀뻬렌 윌리오피스토
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Abstract

본 발명은 약리학 연구용 세관 형성 플랫폼 및 시험관내 심혈관 모델에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 플랫폼 및 모델의 제조 방법 및 상기 플랫폼 및 심혈관 모델에서 피검 물질의 생물학적 활성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 심장병 치료용 이식형 심장 구조체에 관한 것이다.

Description

시험관내 심혈관 모델{IN VITRO CARDIOVASCULAR MODEL}
본 발명은 약리학 연구에 사용하는 세관 형성 플랫폼(tubule forming platform) 및 시험관내 심혈관 모델에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 플랫폼 및 모델의 제조 방법 및 상기 플랫폼 및 심혈관 모델에서 피검 물질의 생물학적 활성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 심장 질환의 치료에 사용하는 이식형 심장 구조체(implantable cardiac structure)에 관한 것이다.
심혈관계는 호흡계 및 중추신경계와 함께 그 기능으로 생명에 치명적인 영향을 미치는 절대적인 기관 또는 계에 해당한다. 따라서, 약물, 산업적 화학물질, 살생물질, 식품 및 사료 보존제 및 화장품과 같은 화학물질은 심장 독성의 유무에 대해 평가를 받아야 한다. 이들 연구에는 주로 동물이 사용되고 있으나, 동물 기반 시험은 흔히 사람에 미치는 효과를 예측하는데 제한적인 모델로 판명되어 왔다. 게다가, 동물 시험은 윤리적으로 문제가 있고, 비용이 많이 들며, 시간을 소모한다. 이와 같은 이유로 인해 유럽 연합 및 미국의 규제 위원회들은 비동물 모델에서 안전성 시험을 의무적으로 수행하고 각종 시험들은 사람의 조건과 가능한 동일하게 모사한 예측가능한 독성 경로 기반 사람 세포 기관형 모델을 바탕으로 이루어져야 한다는 입장이다(Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy, 2007).
심근 활동 전위(cardiac action potentila)의 이상은 선천적 돌연변이로 인한 것이든 부상으로 인한 것이든 인간 병리학적 증상, 특히 부정맥을 일으킬 수 있다. 1980년대 및 1990년대에 시장에서 퇴출된 여러 약물에서 알 수 있듯이 심장에 유해한 약물 반응은 전형적으로 중증으로 나타나고 치명적일 수 있기 때문에 대단히 중요하다. 이들의 치명성으로 규제 조치가 촉발되었고 2005년에 ICH 가이드라인 S7B 및 E14가 제정되었다. 이들 가이드라인은 모든 연구 약물의 부정맥 유발 책임을 위한 비임상 및 임상 평가를 공식화하였다. 약물 유발성 QT 연장증후군(QT prolongation)에 의한 부정맥 유발은 약물 중단의 가장 일반적인 원인중 두번째에 해당하며 관심을 고조시킨 원인이 되었다. QT 간격은 심박수에 의해 영향을 받는다. 새로운 약물에 대한 안전성 약리 연구에서 현재 가장 일반적으로 사용되고 있는 모델은 기니아 피그 또는 토끼에서 분리한 심장 또는 개에서 분리한 푸르키네(Purkinje) 세포를 이용하는 동물 모델 및 생체외 모델이다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 것으로 검증된 시험관내 심장 모델은 없다.
심장수축성과 심근활동전위를 발휘하는 몇 가지 상이한 시험관내 3D-심장 조직 구조체가 개발되었다(Zimmermann et al., Circulation Research, 2002, 90:22; Akiyama et al., Int. J. Mol. Sci., 2010, 11:2910). 이들 기존 연구 모델들은 동물 생물학(랫트 세포)에 바탕을 두고 있고 불과 단기간(수 일 정도)에만 기능을 유지할 수 있다는 단점을 갖고 있다. 이런 관점에서 단기간의 효과만 평가할 수 있다. 따라서, 사람의 심장 기능(심장박동수, 심장박동세기, 심장전기활동, 상이한 채널활동)을 모사하기 위하여 관련 바이오마커 및 생리화학 상태 조절 및 유지능을 갖는 사람 세포 기반 기능성 조직 구조체를 개발할 필요가 있다.
미국특허원 제2009/0169521호에는 심장 질환 치료용 인공 3D 심장 구조체가 기술되어 있다. 이 심장 구조체는 인공 스캐폴드 상에 또는 안에 심근세포, 상피세포 및 섬유아세포를 함께 접종하여 수득한다. 외래 스캐폴드는 다층 조직 구조체에서 세포간 상호작용 및 세포군 형성을 저해할 수 있기 때문에(Norotte et al., Biomaterials, 2009, 30:5910) 상기 심장 구조체는 약리 독성 연구용으로 최적인 것으로 인정할 수 없다.
사람 세포 기반 기관형 심장 모델(human cell based organotypic heart model)은 화학 물질 및 생물학적 물질의 독성 연구이외에 심혈관 질환용 신규 약물을 연구하는데 필요하다. 서방 국가에서, 심혈관 질환은 가장 일반적인 질환중의 하나인 심부전에 의한 사망에서 가장 일반적인 원인으로 꼽히고 있다. 이러한 이유로 인하여 심장 기능을 복원하기 위한 약물 및 조직 공학 치료법을 신속히 개발할 필요가 있다. 한 가지 방법은 심장경색 부위를 회복시키기 위해 줄기 세포 치료법을 이용하는 것이다. 이러한 줄기 세포 치료법의 목적은 환자 자신의 줄기 세포를 기능성 심근세포로 분화시키고 이 분화 세포를 심근의 손상 부위에 이식하여 복원하는데 있다. 그러나, 줄기 세포 치료법을 임상에 적용할 수 있으려면 줄기 세포 분화, 증식 및 행동에 관한 보다 폭 넓은 이해를 위해 더 많은 연구가 필요하다. 혈관 구조체를 포함한 사람 세포 기반 기능성 심장 모델은 조직 공학 치료법에 상당한 이점이 있을 수 있다.
따라서, 본 분야는 검증된 시험관내 심장 모델이 분명히 필요하다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 분리된 세관 형성 플랫폼 및 심근세포를 포함하는 시험관내 심혈관 구조체를 제공한다. 세관 형성 플랫폼은 사람 지방 줄기 세포(hASC), 선택적으로 외인성 매트릭스 성분 또는 첨가된 바이오 물질이 존재하지 않는 hASC를 포함한다. 일부 양태에서, 플랫폼은 추가로 세관 형성 내피 세포, 예를 들면 사람 제대 정맥 내피 세포, 사람 미세혈관 내피 세포, 사람 지방 줄기 세포 유도된 내피 세포(human adipose stem cell derived endothelial cells), 사람 배아 줄기 세포 유도된 내피 세포, 유도 만능 줄기 세포 유도된 내피 세포, 전환분화 유도된 내피 세포, 내피 전구 세포(endothelial progenitor cells) 또는 유전자 변형에 의해 수득된 내피 세포를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 심장 질환 치료용 시험관내 심혈관 구조체를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 분리된 세관 형성 플랫폼을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 세관 형성 플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) hASC를 준비하는 단계 및 (b) 임의로 어떠한 외인성 매트릭스 성분 또는 첨가된 바이오물질도 존재하지 않으면서, 상기 hASC를 VEGF 및 FGF-2가 보충된 완전 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 이 방법은 추가로 세관 형성 내피 세포를 준비하고 상기 hASC와 공동배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 시험관내 심혈관 구조체를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) hASC, 심근세포 및 선택적으로 세관 형성 내피 세포를 준비하는 단계, (b) 상기 hASC를 선택적으로 상기 세관 형성 내피 세포와 배양하는 단계, (c) 상기 심근세포를 단계(b)에서 형성된 배양물의 상층에서 배양하는 단계 및 (d) VEGF 및 FGF-2를 단계(c)에서 형성된 세포 배양물에 투여하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명의 일 양태는 피검 물질의 생물학적 활성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 세관 형성 플랫폼 또는 시험관내 심혈관 구조체를 준비하는 단계, (b) 피검 물질을 상기 플랫폼 또는 구조체에 투여하는 단계, (c) 상기 플랫폼 또는 구조체에서 피검 물질의 효과를 결정하는 단계 및 (d) 단계(c)에서 결정된 효과를 상기 피검 물질의 부재하에 결정된 상응하는 효과와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 결정될 생물학적 활성은 세포 독성, 세관 형성 조절 활성, 전기적 특성(예, 심근세포 수축율), 기계적 특성(예, 심근세포 수축력) 및/또는 기본 세포 대사로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 심장 구조체를 심장병 환자에 이식하는 단계를 포함하는, 심장병 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 심장병은 이들로 한정하는 것은 아니지만 관상동맥 심장 질환 및 확장성 심근병증으로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태들, 특정 실시예들, 목적들, 세부사항 및 이점들은 종속 청구항, 도면, 상세한 설명 및 실시예에 기술된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 바람직한 양태로서 좀 더 자세히 설명될 것이다.
도 1은 hASC 단독배양 및 hASC+HUVEC 공동배양의 세관 형성을 보여주는 사진이다. 세포는 폰빌레브란트(von Willebrand) 인자 항체(1:500의 항-폰빌레브란트 인자(Sigma), 1:100의 TRITC 결합된 이차 항체(Sigma)와 함께 적색 형광으로 나타남)로 염색되었다. 도 1A: hASC 단독배양 및 hASC+HUVEC 공동배양의 세관 형성의 비교. 세포는 성장 인자 첨가된 EGM-2 BulletKit 배지에서 3일 또는 6일간 배양하여 신생혈관형성(angiogenesis)을 유도하였다. 도 1B: 상이한 처리군에 세관 형성의 반정량 분석. hASC 단독배양 및 hASC+HUVEC 공동배양을 3일 및 6일에 서로 비교하였다. Sarkanen 등에 따른 반정량 스케일(Front Pharmacol, 2011, 1:147). 이 결과는 평균±SD로 기록되었고 p<0.01** 및 p<0.001***일때 유의적인 차이로 간주되었다. 도 1C: 대조군의 경우 HUVEC는 4000세포/cm2로 접종되었고 성장 인자 첨가된 EGM-2에서 성장되었으며, hASC+HUVEC 공동배양물은 외인성 성장 인자를 첨가하지 않고 성장되었다. 도 1D: hASC+HUVEC는 사람 혈청을 함유하는 성장 인자 첨가된 EGM-2(EGM-2, 2% HS) 또는 사람 혈청을 함유하지 않은 성장 인자 첨가된 EGM-2(무혈청 EGM-2)에서 배양되었다.
도 2는 성장 인자 첨가된 EGM-2 배지로 신생혈관형성 유도 후 세관 구조체에서 주위 세포 및 평활근 세포 분화 마커의 발현을 보여주는 사진이다. 세관 형성의 탐지를 위해 세포 배양물은 폰빌레브란트 인자 항체(1:500의 항-폰빌레브란트 인자(Sigma), 1:100의 TRITC 결합된 이차 항체(Sigma)와 함께 적색 형광으로 나타남)로 면역염색되었다. 세관 성숙의 탐지를 위해, 배양물은 항-αSMA(1:200, Sigma), 항-COLIV(1:500, Sigma), 항-PDGFRβ(1:500, Sigma), 항-SMMHC(1:800, Sigma) 또는 항-칼포닌(1:800, Sigma)(이들 모두는 1:100의 FITC-결합된 이차 항체(Sigma)와 함께 녹색 형광으로 나타남)으로 면역염색되었다. 이들 사진은 3일째에 항-PDGFRβ를제외한 것과 항-COLIV와 항-칼포닌을 제외한 것의 6일째의 중복된 면역형광의 합성사진으로 염색 사진(작은 사진)과 FITC-결합된 이차 항체-항-COLIV/항-칼포닌 염색 사진(큰 사진)의 합성 사진을 보여준다.
도 3은 hASC, HUVEC 및 신생 랫트 심근세포를 바탕으로 10일간 배양된 시험관내 심혈관 모델을 보여주는 사진이다. 스케일 막대는 100 μm이다. 세관 형성의 탐지를 위해 세포 배양물은 폰빌레브란트 인자 항체(1:500의 항-폰빌레브란트 인자(Sigma), 1:100의 TRITC 결합된 이차 항체(Sigma))로 면역염색되었다. 심근세포의 탐지를 위해 배양물은 심장 특이적 항-트로포닌 T(1:500, Abcam) 및 FITC-결합된 이차 항체(1:100, Sigma)로 면역염색되었다.
도 4는 hASC, HUVEC 및 사람 배아 줄기 세포 유도된 심근세포를 바탕으로 10일간 배양된 시험관내 심혈관 모델을 보여주는 사진이다. 스케일 막대는 100 μm이다. 세관 형성의 탐지를 위해 세포 배양물은 폰빌레브란트 인자 항체(1:500의 항-폰빌레브란트 인자(Sigma), 1:100의 TRITC 결합된 이차 항체(Sigma))로 면역염색되었다. 심근세포의 탐지를 위해 배양물은 심장 특이적 항-트로포닌 T(1:500, Abcam) 및 FITC-결합된 이차 항체(1:100, Sigma)로 면역염색되었다.
도 5는 동시에 수축하는 심혈관 모델의 제조 후 4일 경과했을 때 그 모델로부터 발생하는 전기 신호를 다채널전극(MEA)으로 기록한 것이다.
본 발명은 약물 안전성 및 독성 연구용 시험관내 심혈관 구조체, 즉 심혈관 모델을 제공한다. 이 모델은 세관 형성 플랫폼에서 배양된 심근세포를 포함한다. 놀랍게도, 이와 같은 기능성 심혈관 모델은 어떠한 외인성 매트릭스 또는 첨가되는 바이오물질이 없어도 수득될 수 있다.
다층 조직 구조체를 생성하는데 전형적으로 사용되는 외인성 스캐폴드는 세포간 상호작용 및 세포군 형성을 저해할 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명의 무스캐폴드 심혈관 모델은 유리하다. 최적의 조직 구조체는 어떠한 동물-유래 성분 또는 비천연 스캐폴드 재료를 함유해서도 안되며 단지 천연 조직에 존재하는 성장 인자 및 단백질만을 함유해야 한다. 적어도 일부 양태에서, 본 발명의 심혈관 모델은 이들 요건을 충족하며 성숙한 혈관의 특징을 갖추고 있다. 즉, 본 발명의 모델은 세관 구조체의 형성에 더하여 특징적으로 혈관주위세포의 모집, 기저막의 형성 및 평활근 세포의 혈관 지지층의 형성으로 나타난다.
본원에 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "세관 형성 플랫폼"은 혈관망 구조체로 스스로 집합하는 능력을 갖는 다층 세포 구조체를 가리킨다.
한 가지 양태로서, 세관 형성 플랫폼은 지방-유도된 간질/줄기 세포(ASC)(예, 사람 지방 줄기 세포(hASC))로부터 단독으로 제조될 수 있다. 이러한 유형의 세관 형성 플랫폼을 단독배양 모델이라고 한다.
본원에 사용된 용어 "지방-유도된 줄기 세포" 또는 "ASC"는 지방 조직으로부터 수득된 비분류된 간질 혈관 분획을 가리킨다. 이러한 분획은 비균질하고 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 보다 최근의 용어체계에 따르면, "ASC"는 또한 "지방-유도된 간질 세포"로도 언급된다. 사람 ASC(hASC)를 수득하는 방법은 본 분야에서 용이하게 실시되는 것이며 이로써 한정하는 것은 아니지만 실시예 1에 기술된 방법을 포함한다. ASC는 본 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 지니고 있다.
다른 양태로서, 세관 형성 플랫폼은 세관 형성 내피 세포와 hASC를 공동배양함으로써 제조된다. 이러한 유형의 세관 형성 플랫폼을 공동배양 모델이라고 한다.
본원에 사용된 용어 "세관 형성 내피 세포"는 혈관망과 같은 혈관 구조체를 형성하는 능력을 가진 내피 세포를 가리킨다. 세관 형성 내피 세포로서는 이들로 한정하는 것은 아니지만 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 사람 미세혈관 내피 세포, 사람 지방 줄기 세포 유도된 내피 세포, 사람 배아 줄기 세포 유도된 내피 세포, 유도 만능 줄기 세포 유도된 내피 세포, 전환분화 유도된 내피 세포, 다른 조직으로부터의 내피 전구 세포 및 유전자 조작에 의해 수득된 내피 세포를 예로 들 수 있다. 상기된 세포의 내피 분화를 유도하는 수단 및 방법은 본 분야의 전문가에게 용이한 것으로 알려져 있다. 또한, 세관 형성 내피 세포는 시판되고 있다.
배아 줄기 세포(ESC)는 내피 세포와 같이 아주 다양한 다른 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진 만능 세포이다. 배아 줄기 세포를 수득하는 방법은 본 분야에서 널리 이용되고 있는 것이다. 또한, WO 2007/130664호에는 공여자 배를 손상시키지 않으면서 사람 배아 줄기 세포를 수득하는 유망한 새로운 방법인 배아 할구 생검법이 기술되어 있다.
본원에 사용된 용어 "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 발생 초기화에 의해 분화된 세포, 전형적으로 섬유아세포와 같은 성숙 체세포로부터 발생된 만능 줄기 세포를 가리킨다. 이와 같은 세포들은 WO 2008/151058 및 US 2008/076176에 기술되어 있다. 사람 유도 만능 줄기 세포는 hiPSC로 언급된다.
본원에 사용된 용어 "전환분화" 또는 "계통 리프로그래밍"는 한 가지 성숙 세포 유형이 중간 만능 상태 또는 전구 세포 유형을 겪지 않고 다른 유형으로 전환되는 것을 가리킨다.
세관 형성 플랫폼은 (i) ASC 또는 (ii) ASC 및 세관 형성 내피 세포를 내피 세포 성장 지지 세포 배양 배지중의 세포 배양 또는 조직 배양 평판(예, 24-웰, 48-웰, 96-웰 평판 또는 마이크로평판)에 접종하는 방법에 의해 수득할 수 있다. 상기 배양 배지로서는 이로써 한정하는 것은 아니지만 Lonza로부터 입수가능한 EGM-2 BulletKitTM을 예로 들 수 있다. 세관 형성은 어떠한 내피 성장 배지(예, Lonza, Provitro, Promocell, BD의 제품)에서도 유도될 수 있으며, 또한 저 농도의 사람 또는 동물 혈청 또는 무혈청 및 bFGF, VEGF, 아스코르빈산, 헤파린 및/또는 하이드로코르티손을 보조제로서 함유하는 DMEM, DMEM/F12 또는 녹아웃(KO) DMEM(예, Gibco Invitrogen, Sigma, BD, Lonza의 제품)에서 유도될 수 있다. 추가로 함유될 수 있는 임의의 인자로서는 이들로 한정하는 것은 아니지만 인슐린, IGF-1, hEGF, 트랜스페린 및/또는 호르몬(예, 트리조도티로닌)을 예로 들 수 있다.
일부 양태로서, 세포 배양 평판의 바닥 표면에 그루브 또는 스크래치를 주어 세관이 목적하는 방향으로 형성되도록 할 수 있다.
단독배양 모델에서, 세포는 반드시 그러한 것은 아니지만 전형적으로 약 24 x 104 세포/cm2 이상의 밀도로 접종된다. 공동배양 모델에서, ASC와 내피 세포는 반드시 그러한 것은 아니지만 전형적으로 2:1 내지 8:1, 바람직하게는 5:1의 비율로 접종된다. 한 가지 양태로서, ASC는 약 20 x 104 세포/cm2의 밀도로 접종되고 세관 형성 내피 세포는 약 4 x 104 세포/cm2의 밀도로 접종된다. 일부 양태로서, 세관 형성 세포(HUVEC)는 ASC(예, hASC)보다 1 내지 3시간 후에 접종된다.
본 발명의 심혈관 모델은 심근세포를 세관 형성 플랫폼의 상층에 접종하여 사람 또는 동물 심장을 형상화하는 방법에 의해 수득된다. 이 모델에 사용하기에 적합한 심근세포로서는 이들로 한정하는 것은 아니지만 신생 랫트 심근세포, 사람 배아 줄기 세포(hESC) 유도된 심근세포, 사람 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 유도된 심근세포, 성체 줄기 세포 유도된 심근세포, 사람 전환분화 유도된 심근세포 및 사람 심장 근세포를 예로 들 수 있다. 심근세포 분화를 유도하는 수단 및 방법은 본 분야에 공지된 것으로 이들로 한정하는 것은 아니지만 Mummery 등에 의해 개발된 내배엽 세포 유도된 분화(Circulation, 2003, 107:2733), Laflamme 등에 의해 개발된 액티빈 A 및 BMP4 유도된 분화(Nat Biotechnol, 2007, 25(9): 1015) 및 Kehat 등에 의해 개발된 배상체 기술(Circ. Res. 2002, 91:659)을 포함한다.
일부 양태로서, 심근세포가 완전 무혈청 배지(CSFM)중의 세관 형성 플랫폼의 상층에 접종된다. 이것은 특히 랫트 심근세포에 적용된다. CSFM를 위한 기본 배지로서 사용하기에 적합한 시판용 세포 배양 배지로서는 이들로 한정하는 것은 아니지만 Gibco에서 판매하고 있는 DMEMTM 또는 DMEM/F12 또는 녹아웃(KO) DMEM을 예로 들 수 있다.
심혈관 구조체를 위해 사람 심근세포를 사용하여 수행하는 경우 배양 배지는 무혈청이거나 약 10% 이하의 소 또는 사람 혈청을 함유할 수 있다. 이러한 경우의 예로서, 기본 배지로서 DMEM/F12를 사용할 수 있다.
전형적으로, 심근세포는 약 1 x 105 또는 약 2 x 105 세포/cm2의 밀도로 접종하지만 이들 접종 밀도로 한정되는 것은 아니다.
필수적인 것은 아니지만 전형적으로 심근세포는 세관 형성 플랫폼을 형성하는 세포보다 1일 후에 세관 형성 플랫폼의 상층에 접종한다. 심혈관 모델에서 심근세포를 접종하기 전에 세관을 완전히 형성하는 것이 전제가 되는 것은 아니다.
세관 형성 및 세관과의 심근세포 배열을 실시간 추적하기 위하여 세관 형성 내피 세포 및/또는 심근세포를 예를 들어 렌티바이러스 감염에 의해 그린 또는 옐로우 형광 단백질을 내피 세포 게놈내로 삽입함으로써 형광 표지시킬 수 있다. 또한, 세포들을 유전자 조작(리포터 유전자, 질병 특이 유전자, 분화 관련 유전자의 삽입을 포함)에 의해 변형시킬 수도 있다.
전형적으로, 심근세포를 이식한 후 1일 경과했을 때 이들 세포에 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)를 투여하여 세포 형성을 유도한다. 이것은 배양 배지를 상기 성장 인자가 보충된 새로운 CSFM으로 교환하여 달성할 수 있다. VEGF의 사용 농도는 전형적으로 약 1 ng/ml 내지 약 20 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 15 ng/ml이고, FGF-2의 사용 농도는 전형적으로 약 0.5 ng/ml 내지 2 ng/ml, 바람직하게는 1 내지 2 ng/ml이다.
본 발명의 모델에서 신생혈관형성의 유도를 증가시켜 주는 임의의 물질로서는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스코르빈산, 헤파린, 하이드로코르티손, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 상피 성장 인자(EGF)(바람직하게는 사람 EGF) 및 이들의 배합물을 예로 들 수 있다.
본 발명의 모델에서 신생혈관형성(즉, 세관 형성)을 유도하기에 적합한 배양 배지중의 임의의 추가 성분로는 10% 이하의 농도로 소 및 사람 혈청이 포함되며, 또한 소 및 사람 알부민이 포함된다. 본 분야의 전문가라면 용이하게 이해할 수 있는 것으로, 본 발명의 세관 형성 플랫폼 및/또는 심혈관 모델을 제조 및/또는 이용하는데 사용되는 배양 배지는 어떠한 것도 항생물질, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트와 같은 세포 배양 배지에 전형적으로 사용되는 어떠한 성분도 함유할 수 있다.
심근세포는 이전에 가능했던 것보다 더 장기간 심혈관 모델에서 살아서 기능을 유지한다. 일부 양태로서, 신생 랫트 심근세포는 수축능을 3주 유지할 수 있는데, 이에 비하여 hiPSC 및 hESC 유도된 심근세포는 수축능을 수개월 유지할 수 있다. 심근세포의 생존능 및 수축능은 완전히 형성된 세관 구조체보다 심혈관 모델에서 더 중요하다. 따라서, 본 발명의 여러 가지 양태에 따라 피검 물질을 시험할 때는 세관이 적당히 형성된 심혈관 모델을 사용할 수 있다.
일부 양태로서, 본 발명의 심혈관 모델에서 시험될 물질은 VEGF 및 FGF-2의 투여 후 1일 경과한 때 세포에 첨가한다. 전제 조건은 화학 물질의 첨가 이전에 심근세포는 기능성을 발휘할 수 있어야 한다는 것이다. 상기 물질의 효과는 예를 들어 2주 내지 3주, 필요한 경우 심지어 수개월간 지속될 수 있으며, 이러한 기간은 심근세포의 적용 및 기원에 의해 좌우된다.
결정될 생물학적 효과의 예로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 예를 들어 상이한 유전자의 발현 증감을 평가함으로써 결정하는 독성 효과; 상이한 수단(예, MTT 검사, 뉴크럴 레드 업테이크(NRU) 시험 또는 Invitrogen의 라이브데드 시험)에 의한 세포의 생존능; 예를 들어 QT 간격을 측정하여 결정하는 전기적 특성(예, 심근세포 수축율 및 재분극 시간의 변화 또는 부정맥 발생); 상이한 평면 바이오센서로 측정하는 수축력 또는 이완력 변화와 같은 기계적 특성; GAP-정션 탐지용 심장 마커(예, 코넥신-43) 또는 심장 특이적 트로포닌 T와 같은 마커의 면역염색; 및 세포 대사(예, 젖산 형성, 칼슘 유입, 이온 채널 변화, 당 소비, 산소 소비 및 이산화탄소 배출)의 변화가 포함된다. 이들 효과는 목적하는 바에 따라 선택적으로 두 가지 이상을 개별적으로, 순차적으로, 부분적으로 또는 동시에 평가할 수 있다.
심혈관 모델은 상기된 세포 효과를 평가하기 위해 평면 바이오센서와 같은 센서를 한 개 이상 함유할 수 있다. 적합한 센서로서는 이로써 한정하는 것은 아니지만 전기화학 센서, 전기 센서 및/또는 광학 센서가 포함된다. 추가로 모니터링용 센서 및 필요한 경우 배양 배지의 물질화학적 특성을 조절하기 위한 센서가 포함될 수 있다.
일부 양태로서, 세관 형성 플랫폼 자체는 피검 물질의 신생혈관형성 특성을 평가하는데 사용할 수 있다. 평가될 신생혈관형성 특성으로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 세관 형성능(예, 세관 길이 및/또는 세관 분지를 측정하거나 내피 조밀 정션의 존재를 결정함으로써) 및 세관 성숙능(예, 기저막 형성, 주변세포의 존재 및 성숙 세포 구조체를 구성하는 평활근 세포를 결정함으로써)을 예로 들 수 있다. 이러한 경우에, 심근세포는 세포 배양물에 첨가하지 않는다. 피검 물질은 세관 형성 플랫폼에 예를 들어 상기된 임의의 신생혈관형성 유도 물질과 함께 또는 이러한 물질 없이 VEGF 및 FGF-2에 의한 신생혈관형성 유도 후 1일 경과한 때 적용할 수 있다. 신생혈관형성 특성은 예를 들어 수일 또는 수주 동안에 나타날 수 있다. 피검 물질은 세관이 완전히 형성되기 전에도 모델에 적용할 수 있다.
본 발명의 심혈관 및 신생혈관형성 모델에서 스크리닝될 피검 물질로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 소분자 화학적 화합물, 나노입자, 폴리펩타이드, 항체 및 성장 인자와 같은 화학적 및 생물학적 물질을 예로 들 수 있다.
비록 심혈관 구조체 및 세관 형성 플랫폼이 어떠한 외인성 매트릭스 성분 및 첨가되는 바이오물질이 없더라도 약물 안전성 및 독성 시험의 목적에 잘 작용하고 저해하는 비천연 성분이 없이도 심장 조직을 모사하더라도 일부 경우에 있어서는 그러한 성분들을 모델 및/또는 플랫폼에 함유시키는 것이 유리할 수 있다. 이러한 양태는 예를 들어 인공 심장 구조체에서 피검 물질의 안정성 및 독성을 검사하는데 사용할 수 있다. 심혈관 모델 및/또는 세관 형성 플랫폼에 제공될 적합한 외인성 매트릭스 성분 또는 바이오물질로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 콜라겐 I 또는 IV, 히알루론산, 젤라틴 또는 다른 세포외 매트릭스 성분과 같은 합성 또는 천연 고분자를 예를 들 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 외인성 매트릭스 성분 및/또는 첨가된 바이오물질을 함유하는 심혈관 구조체는 이들로 한정하는 것은 아니지만 관상성 심장질환 및 확장성 심근병증을 포함한 심장병의 치료용으로 이식가능한 3D 심장 구조체로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료(treatment 또는 treating)"는 질병의 완전한 치유뿐만 아니라 그 질병 또는 연관된 증상의 예방, 완화 및 호전을 포괄한다.
치료 목적상 심장 구조체는 제노프리이어야 한다는 것은 중요하다. 즉, 심장 구조체에는 외인성 기원의 어떠한 성분도 함유되지 않거나 외인성 물질을 함유한 조건하에서 제조되지 않는다. 게다가, 치료 목적의 경우 자가 세포를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
본 분야의 전문가는 발전하는 해당 기술과 더불어 본 발명의 개념을 다양한 방식으로 실시할 수 있음을 명백히 이해할 것이다. 본 발명 및 이의 양태는 상기된 예로 한정되는 것이 아니며 청구범위내에서 다양하게 변형될 수 있다.
실시예
모든 연구는 국가윤리위원회의 가이드라인에 따라 수행되었다. 사람 제대혈은 예정된 제왕절개수술을 통해 획득하였고 사람 지방 조직 시료는 외과 수술을 통해 획득하였으며, 두 경우 모두 Tampere 대학병원의 적절한 승인 및 개인의 사전동의하에 이루어졌다. 또한, Pirkanmaa Hospital District 윤리위원회가 사람 iPS 및 hESC의 유도 및 사용을 승인하였다(각 승인번호 R08070 및 R051116).
실시예 1. 공동배양 기반 세관 형성 플랫폼의 제조 및 성상확인
사람 제대정맥 내피 세포( HUVEC )의 분리:
Tampere 대학병원에서 개인의 사전동의하에(핀란드 탬페레 소재의 Pirkanmaa Hospital District의 윤리위원회 승인번호 R08028) 예정된 제왕절개수술을 통해 입수한 제대혈로부터 HUVEC를 분리하였다. 사람 제대혈로부터 제대정맥 내피 세포(HUVEC)의 분리는 문헌(Jaffe et al., J Clin Invest, 1973, 52:2745)에 기술된 바에 따라 수행하였으나 이 방법은 좀 더 최적화되었다. 태반에서 제대혈을 분리하였고 제대정맥에 20G 바늘의 캐뉼러를 삽입하였다. 외과용 클램프로 바늘위에 제대혈을 집어 고정하였다. 정맥을 제대혈 완충액(UBS, 0.14 M NaCl, 0.004 M KCl 및 0.011 M 글루코즈가 함유된 0.1 M 인산염 완충액)으로 관류시켜 혈액을 뽑아낸 후 제대혈의 반대편 끝을 외과용 클램프로 집어 두었다. 정맥에 0.05% 콜라게나제 I을 주입하였다. 제대혈을 37℃의 수욕에서 20분간 배양하였다. 배양 후 HUVEC를 함유한 콜라게나제 I 용액을 PBS로 관류시켜 제대혈로부터 50 ml 폴리프로필렌 튜브(Sarstedt)로 유출시켰다. 세포를 200 x g로 10분간 원심분리하고, 배지로 1회 세척한 다음, 재차 원심분리하고, EGM-2 BulletKit 배지(스위스 바젤 소재의 Lonza Group Ltd)에 재현탁시킨 후 75 cm2 플라스크에 접종하였다. 세포를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지는 2 내지 3일 마다 교체하였고 세포의 전면 단층이 형성되었을 때 세포를 분할하였다. 대조용으로 HUVEC를 4000 세포/cm2에 접종하고 EGM-2 BulletKit 배지에서 배양하였다.
분리된 HUVEC의 형태, 세포 배양물 순도 및 세포 증식을 매일 현미경으로 관찰하였다. 배지는 2일 내지 3일마다 교체하였다. 세포가 전면 단층으로 성장하였을 때 Tryple Express로 분리해 두었다. 증식능이 양호한 HUVEC 순수 배양물을 1:2 내지 1:4의 비율로 일차 배양물(p0)에서 및 1:3 내지 1:5의 비율로 1 계대(p1) 이상 계대배양하였다.
렌티바이러스 감염:
렌티바이러스 작제물 pLKO-MISSION-Bright-GFP를 Biomedicum Genomics(BMGen, Biomedicum Helsinki, Helsinki, Finland)로부터 구입하였다. EGM-2 BulletKit 배지(1U/ml) 1 ml중의 pLKO-MISSION-Bright-GFP 300 ㎕로 저 계대배양된 HUVEC를 감염시켰다. 8 ㎍/ml의 헥사디메트린 브로마이드(Sigma)로 바이러스 감염을 가속시켰다. 24시간의 배양 후 배지를 새로운 EGM-2 배지로 교환하였다. 클로닝 링으로 고형광 클론을 선별하고 희석 클로닝으로 추가 선별하여 순수한 GFP-HUVEC-배양물을 수득하였다. 감염된 HUVEC를 증식한 후 이들을 아래에 기술한 바와 같이 hASC와 HUVEC 공동배양 검사에 사용하였다.
사람 지방 줄기 세포(hASC)의 분리:
줄기 세포 분리 방법은 문헌(Gimble and Guilak, Cytotherapy, 2003, 5: 362; Hong et al. Mol Cell Biochem, 2005, 276.Niemela et al., J Craniofac Surg, 2007, 18: 325-335)에 공지된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 사람 지방 조직 표본을 작게 절편하고, 37℃의 선회 수욕에서 60분간 둘베코 변형 이글 배지 영양분 혼합물 F-12(DMEM/F12, Gibco, Invitrogen, Carlsban, CA, USA)중의 0.05% 콜라게나제 I(Invitrogen, Paisley, Scotland, UK)로 분해시켰다. 조직 분해물을 실온에서 600 x g로 10분간 원심분리하였다. 조직 분해물을 100 ㎛ 필터(Sarstedt, Numbrecht, Germany)로 여과하고, 원심분리한 다음, 40 ㎛ 필터(Sarstedt)로 여과하였다. 1% L-글루타민(L-glut, Gibco), 1% 항생제-항진균제 혼합물(AB/AM, Gibco) 및 15% 사람 혈청(HS, Cambrex, East Rutherford, NJ, USA)가 보충된 DMEM/F12중의 75 cm2 플라스크(Nunc EasyFlaskTM, Nunc, Roskilde, Denmark)에 세포를 접종하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 수 차례 세척하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 대기, 항습하에 유지해 두었고 2일 내지 3일 마다 배지를 교환해 주었다. 세포가 전면 단층으로 성장했을 때 세포를 1:2 내지 1:3의 비율로 분할하거나 세포 배양물 연구에 사용하였다.
hASC와 HUVEC의 공동배양:
사람 ASC(계대 7차이하)를 48-웰 평판(NunclonTM Multidishes, Nunc, Roskilde, Denmark)내 EGM-2 BulletKit(Lonza) 배양 배지에 20,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 상기와 같이 배양된(계대 4차 이하) HUVEC를 즉시 조심스럽게 hASC의 상층에 4,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 접종 후 다음 날, 공동배양물에 VEGF(10 ng/ml) 및 FGF-2(1 ng/ml)을 적용하였다.
세포를 3일 또는 6일간 배양한 후 면역세포화학 염색 또는 정량 RT-PCR을 실시하였다. 이러한 검사는 배지를 교환하고 3일간 배양된 세포에는 1회, 6일간 배양된 세포에는 2회 수행하였다.
면역세포화학 염색:
폰빌레브란트 인자에 대한 내피 세포 특이 항체(토끼에서 생성된 항-vWf 일차 항체, 1:500, Sigma)로 세관 형성을 가시화하였다. 사람 지방 줄기 세포 분화를 평가하기 위하여, α-vWf로 평행 중복 형광 염색을 수행하였다. 일반적인 주피세포 마커 α-평활근 액틴(모노클로날 항 αSMA 클론 1A4, 1:200, Sigma), 혈관 평활근 세포 마커 평활근 마이오신 중쇄(항-SMMHC, 1:800, Sigma), 수축 평활근 세포 마커 칼포닌(항-칼포닌, 1:800, Sigma), 주피세포 및 평활근 세포 전구세포 마커 혈소판 유래 성장 인자 수용체-β(항-PDGFRβ, 1:800) 또는 기저막 마커 콜라겐 IV(항-COLIV, 1:500, Sigma)에 대한 일차 항체를 항-vWf와 혼합하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 빙냉 70% 에탄올로 20분간 고정한 다음, 0.5% 트리톤 X-100(JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA)로 15분간 투과성화하고, 비특이적 염색을 위해 10% 소혈청 알부민(BSA, Sigma)으로 30분간 봉쇄시켰다. 봉쇄 후, 세포를 상기 한 쌍의 일차 항체와 함께 실온에서 1시간 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 항-vWf에 대한 이차 항체 폴리클로날 항-토끼 IgG TRITC(1:100, Sigma) 및 항-αSMA, 항-COLIV, 항-PDGFR-β 및 항-SMMHC에 대한 폴리클로날 항-마우스 IgG FITC(1:100, Sigma)와 함께 30분간 배양하였다. 세포핵을 Hoeschst 33258(1 ㎍/ml, Sigma)로 5분간 염색하고, PBS로 5회 세척하였다. 항-GFP 염색을 위한 일차 항체 쌍은 GFP(Abcam, Cambridge, UK, 1:100)에 대한 마우스 모노클로날 항체 및 항-vWf이었고, 이차 항체는 항-마우스 IgG TRITC(Sigma, 1:100) 및 토끼 IgG FITC(Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Germany, 1:500)에 대한 폴리클로날 항체이었다. 형광을 Nikon Eclipse Ti-S 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 가시화하고 이미지를 Adobe Photoshop 소프트웨어 7.0(Adobe Systems, San Jose, CA, USA) 및 Corel Draw 소프트웨어 10.0(Corel Corporation, Ottawa, ON, Canada)로 처리하였다.
세관 형성의 현미경 분석:
면역세포화학 염색 후 세관을 48-웰 평판의 웰로부터 Nikon Eclipse TS100 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 40배 확대하여 분석하였다. 다른 배양물에서 세관의 정도를 0 내지 10의 반정량 등급 스케일을 사용하여 시각적으로 정량하였다. 등급은 본 발명자들의 선행 연구에서 공개한 바와 같이(Sarkanen et al., 2011) 세관 형성, 세관 길이 및 세관 분지를 기준으로 정했다.
통계분석:
통계분석을 수행하고 그래프를 GraphPadPrism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)으로 처리하였다. 세관 형성 및 RT-PCR 결과에 대해 일원배치분산분석에 이어서 가능한 경우 Dunnett 및 Bonferroni의 사후 검증을 실시하였다. 이들 결과는 평균±SD로서 기록하였고 p<0.05*, p<0.01** 및 p<0.001***인 경우 유의적 차이로 간주하였다.
결과:
공동배양물의 세관 형성능 및 항-vWf-양성 내피 세관 구조체를 다른 두 시점(3일째 및 6일째)에 평가하고 비교하였다. 공동배양물은 재생가능하고 세포 라인 또는 세포의 계대수에 의해 좌우되지 않는 초기(3일째) 세관망 형성을 나타냈다. 6일째에 공동배양물은 상당히 가속적인 증식율로서 크고 조밀한 다층의 혈관망 형성을 보였다.
세관 형성의 반정량 평가 결과 공동배양물은 3일째보다 6일째에 유의적으로 더 많은 세관을 형성한 것으로 나타났다(p<0.001). 성장 인자 없이 배양된 대조 세포뿐만 아니라, 성장 인자 첨가된 EGM-2 배지에서 성장된 HUVEC 단독배양은 각각 단지 미미한 세관 형성을 나타내거나 세관 형성을 보이지 않았다.
공동배양물은 또한 면역세포화학 염색하였다. PDGFRβ 발현이 3일째에 가장 강하게 나타났고 발생되는 세관주위로 점같은 구조로 일정하게 나타났다. 6일째에 PDGFRβ는 약간의 정도로만 보였다. 기저막의 발생을 보여주는 COLIV는 공동배양물에서 상당히 폭넓게 발현되었다. 이 발현은 발생되는 세관과 같은 위치에 자리하면서 세관을 덮었다. 6일째에 공동배양물에서 α-SMA 및 SMMHC 양성 세포가 폭넓게 발현되었고 흔히 세관 구조체의 분지점과 세관사이에 위치하였다. SMMHC 발현은 3일과 6일사이에 증가하였다. 결론적으로, 공동배양 모델은 완전한 기저막 형성과 같은 성숙한 혈관의 특성을 갖는 조밀한 다층 혈관망 및 세관에 맞춰 수축 특성을 갖는 평활근 세포를 형성한다. 이 공동배양 모델은 기존에 개발된 어떠한 신생혈관형성 모델보다 더 완숙하다.
실시예 2. 단독배양 기반 세관 형성 플랫폼의 제조 및 성상확인
사람 ASC를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득하고 48-웰 평판(NunclonTM Multidishes, Nunc, Roskilde, Denmark)내 EGM-2 BulleKit 배지에 20,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 세포를 EGM-2 BulletKit 배지(EGF, VEGF, bFGF, IGF-1, 아스코르빈산, 헤파린, 0.1% 젠타마이신/암포테리신-B 및 2% FBS가 함유된 성장 인자 첨가 시판 배지) 또는 15% HS, 1mM L-glut 및 1% AB/AM이 보충된 DMEM/F-12 배지에서 3일 또는 6일간 배양하였다. 배지를 교환하고 3일간 배양된 세포에는 1회, 6일간 배양된 세포에는 2회 처리하였다. 검사 대조군으로서 hASC를 15% HS, 1 mM L-glut 및 1% AB/AM이 보충된 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다.
결과:
hASC 단독배양물에서 신생혈관형성의 유도는 공동배양물에서 만큼 크지 않았다. 그러나, 단독배양물에서 혈관 지지 주피 및 평활근 세포 마커가 자주 관찰되었다.
실시예 3. 시험관내 심혈관 모델의 제조 및 성상확인
본 실시예 사용된 HUVEC 및 hASC는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득되었다. 2일령 내지 3일령의 신생 랫트 새끼에서 심근세포를 추출하였다.
시험관내 심혈관 모델을 48-웰 평판에서 다음과 같이 제조하였다:
0일: 세관 형성 플랫폼의 제조
공동배양 모델: hASC(계대 4차 이하)를 48-웰 평판중의 EGM-2 BulletKit-배지에 20,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 1 내지 3 시간 후 EGM-2 배양 배지중의 HUVEC(계대 4차 이하)를 hASC의 상층에 4,000 세포/cm2의 밀도로 주의깊게 접종하였다.
단독배양 모델: hASC(계대 4차 이하)를 48-웰 평판중의 EGM-2 BulletKit-배지에 24,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다.
1일: 시험관내 심혈관 모델의 제조
완전 무혈청 배지(CSFM)중의 신생 랫트 심근세포(100000, 200000 또는 400000 세포)를 세관 형성 플랫폼의 상층에 접종하였다.
2일: 분화 유도
10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)가 보충된 CSFM으로 배지를 교환하였다. 주당 3회 배지를 새로운 배지로 교환하였다.
결과:
신생 랫트 심근세포는 약 7일간의 단독배양 모델에서 및 최소 14일간의 공동배양 모델에서 생존한 상태로 수축성을 유지하였다(표 1 참조). 횡문 형태의 세포 형상이 배양 기간 내내 유지되었다. 심근세포는 세관 구조체에 나란히 위치하거나 인접하였고 배양 내내 동시에 수축 활동이 일어났다.
신생 랫트 심근세포의 수축성
세포 수 단독배양에서 심근세포 수축능의 진행시간 및 정도* 세관 형성 공동배양에서 심근세포 수축능의 진행시간 및 정도*
0.1 x 106 7일, 중간 14일, 강함
0.2 x 106 7일, 중간 14일, 강함
0.4 x 106 12일, 강함 14일, 강함
*육안검사로 어림측정하였다.
(EGM-2 BulletKit Single Quots supplements, Lonza) 및 헤파린(EGM-2 Single Quots supplements, Lonza).
배지 3: 2% FBS(소태아혈청, Gibco), 10 ng/ml VEGF 및 1 ng/ml FGF-2가 보충된 CSFM.
배지 4: 신생혈관형성 자극 배지: 10 ng/ml VEGF, 1 ng/ml FGF-2, 0.1% 젠타마이신(GA-1000, Lonza), 2% 소태아혈청 및 1 mM L-글루타민이 보충된 내피 세포 기본 배지(EBM-2, Lonza).
배지 5: 신생혈관형성 자극 배지+사람 혈청: 10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 및 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2, Sigma), 0.1% 젠타마이신(GA-1000, Lonza) 및 2% 사람 혈청(Lonza) 및 1 mM L-글루타민이 보충된 내피 세포 기본 배지(EBM-2, Lonza).
실시예 4. 비교 결과
공동배양 기반 세관 형성 플랫폼 7가지 다른 처리군에서 신생 랫트 심근세포(NRC)의 세관 형성 및 심근세포 수축능을 평가하였다.
배지 1: 10 ng/ml VEGF(Sigma Aldrich, Manassas, VA, USA) 및 1 ng/ml FGF-2(Sigma)가 보충된 CSFM(완전 무혈청 배지).
50 ml의 CSFM은 다음의 성분으로 구성되었다:
- DMEM/F-12 42 ml
- 200 mM L-글루타민 0.64 ml
- 100 x 페니실린/스트렙토마이신 0.5 ml
- 0.1 nM T3 0.5 ㎕
- 10 x BSA 5 ml
- 100 mM 나트륨 피루베이트 1.4 ml
- ITS 0.576 ml
배지 2: 10 ng/ml VEGF, 1 ng/ml FGF-2, 아스코르빈산(EGM-2 Single Quots supplements, Lonza), 하이드로코르티손이 보충된 CSFM.
배지 6: 2% 소태아혈청(Lonza)이 2% 사람 혈청(Lonza)으로 교체된 EGM-2 BulleKit 배지(Lonza).
배지 7: 소태아혈청이 없는 EGM-2 BulletKit 배지(Lonza).
심근세포 수축성 및 세관 형성
처리군 NRC + 신생혈관형성 모델
(HUVEC+hASC 세포)
생존시간 및 심근세포 수축능 정도* 세관형성**
배지 1:
CSFM +VEGF+ FGF		 14일, 강함 2
배지 2:
CSFM+ VEGF+ FGF
+아스코르빈산
+하이드로코르티손
+헤파린		 13일, 강함 7
배지 3:
CSFM + VEGF + FGF
+ 2 % FBS		 10일, 중간 2
배지 4:
신생혈관형성 자극 배지		 2일, 약함 2
배지 5:
신생혈관형성 자극 배지 +
사람 혈청		 6일, 약함 3
배지 6:
EGM-2 +
사람 혈청		 4일, 약함 8
배지 7:
무혈청 EGM-2		 3일, 약함 8
* 육안 검사로
** Sarkanen et al. 2011에 따른 스케일 1-8로 표시
실시예 5. 시험관내 사람 심혈관 모델의 제조 및 성상확인
본 실시예에 사용된 HUVEC 및 hASC는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득하였다. 사람 배아 줄기 세포 유도된 심근세포를 상기 문헌(Mummery et al.)에 기술된 바와 같이 2주간 분화시켰다. 비팅 클러스터(beating cluster)를 제거 분리하고 10% FBS, 1% NEAA 및 1% 글루타맥스(EB 배지)가 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다.
시험관내 심혈관 모델을 48-웰 평판에서 다음과 같이 제조하였다:
0일: 세관 형성 플랫폼의 제조
공동배양 모델: hASC(계대 4차 이하)를 48-웰 평판중의 EGM-2 BulletKit 배지에 20000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 1 내지 3시간 후 EGM-2 배양 배지중의 HUVEC(계대 4차 이하)를 hASC의 상층에 4000 세포/cm2의 밀도로 주의깊게 접종하였다.
단독배양 모델: hASC(계대 4차 이하)를 48-웰 평판중의 EGM-2 BulletKit 배지에 24000 세포/cm2의 밀도로 접종하였다.
1일: 시험관내 심혈관 모델의 제조
EB중의 사람 배아 줄기 세포 유도된 심근세포(48-웰 평판의 웰당 1 내지 7개 세포 응집체)를 세관 형성 플랫폼의 상층에 접종하였다.
2일: 분화유도
10 ng/ml 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)가 보충된 EB로 배지를 교환하였다. 배지는 주당 3회 새로운 배지로 교환하였다.
결과:
도 4는 공동배양 모델에서 10일 후에서도 사람 심근세포가 기능을 유지하였으며(즉, 수축 활동을 나타냈음) 유사성숙 심근세포의 전형적인 형태를 나타내고 있음을 보여준다.

Claims (20)

  1. (i) 사람 지방 줄기 세포(hASC)를 포함하는 분리된 세관 형성 플랫폼 및 (ii) 심근세포를 포함하는 시험관내 심혈관 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서, 세관 형성 플랫폼이 추가로 세관 형성 내피 세포를 포함하는 시험관내 심혈관 구조체.
  3. 제 2 항에 있어서, 세관 형성 내피 세포가 사람 제대 정맥 내피 세포, 사람 미세혈관 내피 세포, 사람 지방 줄기 세포 유도된 내피 세포, 사람 배아 줄기 세포 유도된 내피 세포, 유도 만능 줄기 세포 유도된 내피 세포, 전환분화 유도된 내피 세포, 내피 전구 세포 및 유전자 변형에 의해 수득된 내피 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시험관내 심혈관 구조체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심근세포가 신생 랫트 심근세포, hiPSC 유도된 심근세포, hESC 유도된 심근세포, 성체줄기세포 유도된 심근세포, 전환분화 유도된 심근세포 및 사람 일차 심근세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시험관내 심혈관 구조체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 고분자, 천연 고분자, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 히알루론산, 젤라틴 및 다른 세포외 매트릭스 성분 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 외인성 매트릭스 성분 또는 첨가된 바이오물질을 추가로 포함하는 시험관내 심혈관 구조체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 심장병 치료용인 시험관내 심혈관 구조체.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 심장병이 관상동맥 심장 질환 및 확장성 심근병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시험관내 심혈관 구조체.
  8. 사람 지방 줄기 세포(hASC)를 포함하는 분리된 세관 형성 플랫폼.
  9. 제 8 항에 있어서, 어떠한 외인성 매트릭스 성분 또는 첨가된 바이오물질도 존재하지 않는, 분리된 세관 형성 플랫폼.
  10. (a) hASC를 준비하는 단계 및 (b) 임의로 어떠한 외인성 매트릭스 성분 또는 첨가된 바이오물질도 존재하지 않으면서, 상기 hASC를 VEGF 및 FGF-2가 보충된 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 제8항에 따른 분리된 세관 형성 플랫폼의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 세관 형성 내피 세포를 준비하여 상기 hASC와 공동배양하는 단계를 추가로 포함하는, 분리된 세관 형성 플랫폼의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 세관 형성 내피 세포가 사람 제대 정맥 내피 세포, 사람 미세혈관 내피 세포, 사람 지방 줄기 세포 유도된 내피 세포, 사람 배아 줄기 세포 유도된 내피 세포, 유도 만능 줄기 세포 유도된 내피 세포, 전환분화 유도된 내피 세포 및 내피 전구 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 분리된 세관 형성 플랫폼의 제조 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 아스코르빈산, 하이드로코르티손, 헤파린, IGF-I 및 EGF로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 한 가지 이상의 물질을 추가로 포함하는, 분리된 세관 형성 플랫폼의 제조 방법.
  14. (a) hASC, 심근세포 및 선택적으로 세관 형성 내피 세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 hASC를 선택적으로 상기 세관 형성 내피 세포와 배양하는 단계;
    (c) 상기 심근세포를 단계 (b)에서 형성된 배양물의 상층에서 배양하는 단계; 및
    (d) VEGF 및 FGF-2를 단계 (c)에서 형성된 세포 배양물에 투여하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 시험관내 심혈관 구조체의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 세관 형성 내피 세포가 사람 제대 정맥 내피 세포, 사람 미세혈관 내피 세포, 사람 지방 줄기 세포 유도된 내피 세포, 사람 배아 줄기 세포 유도된 내피 세포, 유도 만능 줄기 세포 유도된 내피 세포, 전환분화 유도된 내피 세포 및 내피 전구 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 시험관내 심혈관 구조체의 제조 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 단계 (c)가 아스코르빈산, 하이드로코르티손, 헤파린, IGF-I 및 EGF로 이루어진 그룹중에서 선택되는 한 가지 이상의 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 시험관내 심혈관 구조체의 제조 방법.
  17. (a) 제 1 항의 시험관내 심혈관 구조체 또는 제8항의 세관 형성 플랫폼을 준비하는 단계;
    (b) 피검 물질을 상기 구조체 또는 플랫폼에 투여하는 단계;
    (c) 상기 구조체 또는 플랫폼에서 피검 물질의 효과를 결정하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 결정된 효과를 상기 피검 물질의 부재하에 결정된 상응하는 효과와 비교하는 단계를 포함하는, 피검 물질의 생물학적 활성의 결정 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 결정될 생물학적 활성이 세포 독성, 세관 형성 조절 활성, 전기적 특성(예, 심근세포 수축율), 재분극시간의 지속 기간, 부정맥유발성의 존재, 기계적 특성(예, 심근세포 수축력) 및 세포 대사로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 피검 물질의 생물학적 활성의 결정 방법.
  19. 제 5 항의 심혈관 구조체를 심장병 환자에게 이식하는 단계를 포함하는, 심장병 환자의 심장병 치료 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 심장병이 관상동맥 심장 질환 및 확장성 심근병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 심장병 치료 방법.
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