JP2014519837A - インビトロの心臓血管モデル - Google Patents
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Abstract
本発明は、薬理学的な試験で使用するための細管形成プラットフォーム及びインビトロの心臓血管モデルに関する。さらに本発明は、当該プラットフォーム及びモデルの製造方法、並びに当該プラットフォーム及び心臓血管モデルで試験物質の生物活性を決定する方法に関する。本発明はさらに、心臓障害の治療に使用するための移植可能な心臓構造物に関する。
Description
本発明は、薬理学的な研究で使用するための細管形成プラットフォーム及びインビトロの心臓血管モデルに関する。さらに本発明は、当該プラットフォーム及びモデルの製造方法、並びに当該プラットフォーム及び心臓血管モデルで試験物質の生物活性を決定する方法に関する。さらに本発明は、心臓障害の治療に使用するための移植可能な心臓構造物に関する。
心臓血管系は、呼吸器系及び中枢神経系と共に生命の維持に必要な臓器又は系に属しており、その機能は生命にとって極めて重要である。それゆえに、医薬、工業用化学物質、殺生物剤、食物及び飼料用保存剤、並びに化粧品などの化学物質は、心毒性について評価する必要がある。これらの試験はたいてい動物の使用を伴うが、動物ベースの試験は、ヒトにおける作用を予想することに関して不十分なモデルであることがしばしば実証されている。さらに動物試験は倫理的に問題があり、多大な費用と時間を要する。これらの理由から、欧州委員会(European Commission)及び米国規制機関(US regulatory bodies)はいずれも、安全性試験は非動物モデルで行うこととし、試験は、可能な限り厳密にヒトにおける状態を模擬するヒト細胞の器官型モデルをベースとした予測毒性経路に基づくものとするという方策を立てている(Toxicity Testing in the 21st Century:A Vision and a Strategy、2007)。
心筋活動電位の異常は、先天性の突然変異又は傷害によるかどうかに拘らず、ヒトにおいて病変、特に不整脈を引き起こすことがある。心臓における有害な薬物反応は、1980年代及び1990年代に市場から排除された様々な薬物で観察されたように、一般的に重篤であり死に至る可能性もあることから、最も重要な問題である。このような死を招く事象が、規制への関心と2005年に発表されたICHガイドラインS7B及びE14の開発を喚起した。これらのガイドラインは、あらゆる試験対象薬物の不整脈を誘発する傾向の非臨床的及び臨床的な評価を形式化した。薬物誘発性のQT延長による不整脈誘発は、薬物を取り下げる最も一般的な原因の二番目であり、ますます懸念されている。QT間隔は、心拍数の影響を受ける。新しい医薬の安全性についての薬理学的試験において今日使用されている最も一般的なモデルは、動物モデル、及びモルモット若しくはウサギから単離した心臓、又はイヌから単離したプルキンエ細胞を含むエキソビボのモデルである。これらの目的で使用することができる、有効性が確認されたインビトロの心臓モデルはない。
収縮特性と活動電位との両方を有するいくつかの異なるインビトロの三次元心臓組織構成物が開発されている(Zimmermannら、Circulation Research、2002、90:22;Akiyamaら、Int.J.Mol.Sci.、2010、11:2910)。既存の調査モデルの不利な点は、これらのモデルは、動物の生物学(ラット細胞)に基づいており、これらのモデルは、短い期間(数日)しか機能を維持できない点である。従って、短期間の作用しか評価できない。それゆえに、ヒトに関連する心臓の機能(心拍、鼓動の強さ、電気的活動、様々なチャンネル活性)を模擬するために、関連するバイオマーカーを有し、物理化学的な状態が制御及び維持されたヒト細胞ベースの機能性組織構成物の開発が必要であろう。
US2009/0169521は、心臓障害の治療に使用するための人工の三次元心臓構造を開示している。この構造は、人工足場上に又はその中に、心筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を共に植え付けることにより得られる。外来性の足場は、多層の組織構成物において細胞間相互作用及び細胞アセンブリに干渉する可能性があるため(Norotteら.Biomaterials、2009、30:5910)、開示された心臓構造は、薬理学的な毒性試験に使用するには最適ではないと予想される。
化学物質及び生物学的物質の毒性試験に加えて、ヒト細胞ベースの器官型心臓モデルが、心臓血管疾患のための新規の医薬品の調査において必要であると予想される。西側諸国において、心臓血管疾患は最も一般的な死亡原因であり、心不全は最も一般的な疾患の1つである。そのために、心臓の機能を回復させるための医薬品及び組織工学的な治療を開発する緊急の必要性がある。1つのアプローチは、幹細胞療法を用いて障害のある領域を回復させることである。幹細胞療法の目的は、患者自身の幹細胞を機能的な心筋細胞に分化させ、その細胞を移植して、心筋の障害を受けた領域を回復させることである。しかしながら、幹細胞療法が臨床用途に適用できるようになるには、より多くの調査を行って、幹細胞の分化、増殖、及び挙動をよりよく理解する必要がある。組織工学的な治療は、血管支持体を含む、ヒト細胞をベースとする機能性心臓モデルから大きな利益を得るであろう。
従って、有効性が確認されたインビトロの心臓モデルの必要性が当業界において認められている。
一態様において、本発明は、単離された細管形成プラットフォームと心筋細胞とを含む、インビトロの心臓血管構造物を提供する。細管形成プラットフォームは、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で、ヒト脂肪幹細胞(hASC)を含む。いくつかの実施形態において、プラットフォームはさらに、細管を形成する内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、内皮前駆細胞、又は遺伝学的改変により得られた内皮細胞を含む。
その他の態様において、本発明は、心疾患の治療に使用するためのインビトロの心臓血管構造物を提供する。
さらにその他の態様において、本発明は、上述の単離された細管形成プラットフォームを提供する。
さらにその他の態様において、本発明は、細管形成プラットフォームの製造方法を提供する。本方法は、a)hASCを用意するステップと、b)前記hASCを、VEGF及びFGF−2が補充された完全無血清培地中で、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で培養するステップとを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、その内皮細胞を前記hASCと共培養するステップとをさらに含む。
さらなる態様において、本発明は、上述のインビトロの心臓血管構造物の製造方法を提供する。本方法は、a)hASC、心筋細胞、及び任意選択で細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、b)前記hASCを、任意選択で前記細管を形成する内皮細胞と共に培養するステップと、c)前記心筋細胞を、ステップb)で形成された培養物物の上部で培養するステップと、d)ステップc)で形成された細胞培養物に、VEGF及びFGF−2を投与するステップとを含む。
さらに本発明の一態様は、試験物質の生物活性を決定する方法に関する。本方法は、a)上述の細管形成プラットフォーム又はインビトロの心臓血管構造物を提供するステップと、b)前記プラットフォーム又は構造物に、前記試験物質を投与するステップと、c)前記プラットフォーム又は構造物で試験物質の作用を決定するステップと、d)ステップc)で決定された作用と、それに対応する前記試験物質の非存在下で決定された作用とを比較するステップとを含む。いくつかの実施形態において、決定される生物活性は、細胞毒性、細管形成の調節活性、電気的特性、例えば、心筋細胞の収縮速度、機械的特性、例えば、心筋細胞の収縮力、又は/及び基礎的な細胞代謝からなる群より選択される。
本発明のさらなる一態様は、心疾患の治療を必要とする患者に上述の心臓構造物を移植するステップを含む、心疾患の治療方法を提供する。前記心疾患の非限定的な例は、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択することができる。
本発明のその他の態様、具体的な実施形態、目的、詳細、及び利点は、従属項、以下の図面、詳細な説明、及び実施例に記載される。
以下、本発明を、好ましい実施形態によって添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。
本発明は、薬理学的な安全性及び毒性の試験に使用するための、インビトロの心臓血管構造物、すなわち心臓血管モデルを提供する。本モデルは、細管形成プラットフォーム上で培養された心筋細胞を含む。驚くべきことに、このような機能的な心臓血管モデルは、外来性マトリックスを用いることも生体材料を添加することもなく、得ることができる。
多層の組織構成物を形成するのに一般的に使用される外来性の足場は、細胞間相互作用及び細胞アセンブリに干渉する可能性がある。従って、本発明の足場を含まない心臓血管モデルはこの点において有利である。最適な組織構成物は、動物由来の構成成分又は自然にはない足場材料を含まずに、組織中に自然に見出される増殖因子及びタンパク質のみを含むものとする。本発明の心臓血管モデルは、少なくともいくつかの実施形態において、これらの要求を満たしており、さらに成熟した血管の特徴を有する。すなわち細管構造の形成に加えて、本モデルは、周細胞の補充、基底膜の形成、及び平滑筋細胞の血管支持層の形成を特徴とする。
用語「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」は、本明細書で用いられる場合、用語「からなる(consisting of)」及び「実質的に、〜からなる(consisting essentially of)」を包含する。
用語「細管形成プラットフォーム」は、本明細書で用いられる場合、血管ネットワーク構造に自己集合する能力を有する多層の細胞構造を意味する。
一実施形態において、細管形成プラットフォームは、ヒト脂肪幹細胞(hASC)などの脂肪由来の間質/幹細胞(ASC)のみから構築されていてもよい。このタイプの細管形成プラットフォームを、単一培養モデルと称する。
用語「脂肪由来幹細胞(単数又は複数)」又は「ASC(単数又は複数)」は、本明細書で用いられる場合、脂肪組識から得られる、分別されなかった間質血管細胞フラクションを意味する。このような細胞群は不均一であり、間葉幹細胞を含む。より近年の用語によれば、「ASC」は、「脂肪由来間質細胞」と称される場合もある。ヒトASC(hASC)を得る方法は、当業界において容易に利用することができ、例えば、これに限定されないが、例1で開示された方法が挙げられる。ASCは、当業界でよく知られているように、様々な細胞型に分化する能力を有する。
その他の実施形態において、細管形成プラットフォームは、細管を形成する内皮細胞とhASCとを共培養することによって構築される。このタイプの細管形成プラットフォームを、共培養モデルと称する。
用語「細管を形成する内皮細胞(単数又は複数)」は、本明細書で用いられる場合、血管ネットワークなどの血管構造を形成する能力がある内皮細胞を意味する。細管を形成する内皮細胞の非限定的な例としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、その他の組織からの内皮前駆細胞、及び遺伝学的改変により得られた内皮細胞が挙げられる。上述した細胞の内皮細胞への分化を誘導する手段及び方法は、当業者によく知られている。細管を形成する内皮細胞はまた、市販されてもいる。
胚性幹細胞(ESC)は、内皮細胞などの多種多様の異なる細胞型に分化する能力を有する多能性細胞である。胚性幹細胞を得る方法は、当業界において容易に利用することができる。加えて、WO2007/130664は、ドナーの胎芽にダメージを与えることなくヒト胚性幹細胞を得るための割球生検という有望な新しいアプローチを開示している。
用語「誘導多能性幹細胞」(iPSC)は、本明細書で用いられる場合、発生のリプログラミングによって、分化細胞から、典型的には線維芽細胞などの成人の体細胞から生成した多能性幹細胞を意味する。このような細胞は、例えばWO2008/151058及びUS2008/076176で説明されている。ヒト誘導多能性幹細胞を、hiPSCと称する。
用語「分化転換」又は「系統リプログラミング」は、本明細書で用いられる場合、中間の多能性の状態又は前駆細胞型を経ずに、ある成熟した細胞型からその他の細胞型に転換することを意味する。
細管形成プラットフォームは、i)ASC、又はii)ASC及び細管を形成する内皮細胞を、内皮細胞増殖を支持する細胞培養培地中で、例えば24ウェル、48ウェル、96ウェルのプレート又はマイクロプレートなどの細胞培養又は組織培養プレート上で培養する方法により得ることが可能である。このような培養培地の非限定的な例は、Lonzaから入手できるEGM−2 BulletKit(商標)である。細管形成は、あらゆる内皮細胞増殖培地(例えばLonza、Provitro、Promocell、BDから供給される);或いは低濃度でヒト若しくは動物血清を含むか又は含まず、さらにサプリメントとしてbFGF、VEGF、アスコルビン酸、ヘパリン、及び/又はヒドロコルチゾンを含む、DMEM、DMEM/F12又はノックアウト(KO)DMEM(例えばGibco Invitrogen、Sigma、BD、Lonzaから供給される)中で誘導することが可能である。さらに含まれていてもよい任意選択の因子の非限定的な例は、インスリン、IGF−I、hEGF、トランスフェリン、及び/又はトリヨードチロニン(trijodotyronine)などのホルモンである。
いくつかの実施形態において、細胞培養プレートの底部表面は、細管が望ましい方向を向いて形成されるように細管を並べるための溝やスクラッチが設けられてもよい。
単一培養モデルにおいて、細胞は、典型的には細胞約24×104個/cm2又はそれより高い密度で培養されるが、必ずしもそうでなくてもよい。共培養モデルにおいて、ASC及び内皮細胞は、典型的にはそれぞれ2:1〜8:1の比率で、好ましくは5:1の比率で培養されるが、必ずしもそうでなくてもよい。一実施形態において、ASCは、細胞約20×104個/cm2の密度で培養され、細管を形成する内皮細胞は、細胞約4×104個/cm2の密度で培養される。いくつかの実施形態において、細管を形成する細胞、例えばHUVECは、ASC、例えばhASCより1〜3時間後に培養する。
本発明の心臓血管モデルは、心筋細胞を、細管形成プラットフォーム上に植え付け又は培養してヒト又は動物の心臓モデルを作製する方法により得られる。本モデルでの使用に適した心筋細胞の非限定的な例としては、新生仔ラットの心筋細胞、ヒト胚性幹細胞(hESC)由来心筋細胞、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来心筋細胞、成体幹細胞由来心筋細胞、ヒトの分化転換によって誘導された心筋細胞、及びヒト心筋細胞が挙げられる。心筋細胞の分化を誘導する手段及び方法は当業界で知られており、例えば、これらに限定されないが、Mummeryら(Circulation、2003、107:2733)により開発された内胚葉細胞から誘導される分化、Laflammeら(Nat Biotechnol、2007、25(9):1015)により開発されたアクチビンA及びBMP4から誘導される分化、並びにKehatら(Circ.Res.2002、91:659)により開発された胚様体技術が挙げられる。
いくつかの実施形態において、心筋細胞を、完全無血清培地(CSFM)中で細管形成プラットフォーム上で培養する。これは特にラットの心筋細胞に適用される。CSFM用の基礎培地としての使用に適した市販の細胞培養培地の非限定的な例は、DMEM(商標)、又はDMEM/F12、又はKnock−Out(KO)DMEMであり、これらはGibcoより入手可能である。
心臓血管構造物がヒト心筋細胞を用いて提供される場合、培養培地は、無血清であってもよいし、或いは最大約10%のウシ又はヒト血清を含んでいてもよい。このようなケースにおいて、例えば、基礎培地としてDMEM/F12が用いることができる。
典型的には、心筋細胞は、細胞約1×105又は約2×105個/cm2の密度で培養されるが、植え付けの密度はこれらの値に限定されない。
典型的には、細胞が細管形成プラットフォームを形成してから1日後に、心筋細胞が細管形成プラットフォーム上に植え付けられるが、必ずしもこの限りではない。本心臓血管モデルにとって、心筋細胞を植え付ける前に細管が必ずしも完全に形成されていなくてもよい。
リアルタイムで細管形成及び細管との心筋細胞のアライメントを追跡するために、細管を形成する内皮細胞及び/又は心筋細胞を、例えばレンチウイルス感染などで、緑色又は黄色蛍光タンパク質を内皮細胞のゲノムに挿入することによって蛍光標識してもよい。このような細胞はまた、遺伝子組換え(例えばレポーター遺伝子、疾患に特異的な遺伝子、分化関連の遺伝子の挿入など)がなされてもよい。
典型的には、心筋細胞を培養してから1日後、細管形成を誘導するために、細胞に血管内皮増殖因子(VEGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF−2)が投与される。これは、培養培地を前記増殖因子が補充された新しいCSFMで交換することにより行ってもよい。VEGFは、典型的には約1ng/ml〜約20ng/ml、好ましくは10〜15ng/mlの濃度範囲で用いられ、一方FGF−2は、典型的には約0.5ng/ml〜2ng/ml、好ましくは1〜2ng/mlの濃度範囲で用いられる。
本モデルにおいて血管新生の誘導を高めるための任意選択の物質としては、これらに限定されないが、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、インスリン様増殖因子1(IGF−1)、上皮増殖因子(EGF)、好ましくはヒトEGF、及び何れかのそれらの組み合わせが挙げられる。
本発明のモデルにおいて血管新生(すなわち細管形成)を誘導するのに適した培養培地中のさらなる任意選択の成分としては、最大10%濃度のウシ及びヒト血清、並びにウシ及びヒトアルブミンが挙げられる。当業者であれば容易に理解できるであろうが、本発明の細管形成プラットフォーム及び/又は心臓血管モデルを製造及び/又は利用するのに用いられる培養培地は、抗生物質、L−グルタミン、及びピルビン酸ナトリウムなどの細胞培養培地で典型的に使用される何れかの成分を含んでいてもよい。
本心臓血管モデルにおいて、心筋細胞は、これまで可能だった時間よりも長く生存可能で機能を維持する。いくつかの実施形態において、新生仔ラットの心筋細胞の収縮性は3週間維持することができるが、それに対してhiPSC及びhESC由来心筋細胞は数カ月維持することが可能である。心臓血管モデルにおいて、完全に形成された細管構造よりもまして心筋細胞の生存率及び収縮性のほうがより重要である。従って、適度に細管形成がなされた心臓血管モデルが、本発明の様々な実施形態に従って試験物質を試験するのに用いることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の心臓血管モデルにおいて試験される物質は、VEGF及びFGF−2投与の1日後に細胞に添加される。化学物質が添加される前に、心筋細胞は機能特性を有していることが必須である。前記物質の作用は、心筋細胞の適用及び源に応じて、例えば2〜3週間追跡することができ、必要であれば数カ月でさえ追跡することができる。
決定される生物学的作用の例としては、これらに限定されないが、例えば様々な遺伝子の発現の増加又は減少を評価することによって決定されるような毒作用;様々な手段(例えばMTT試験、ニュートラルレッド取り込み(NRU)分析、又はInvitrogenより入手可能なライブデッド(LiveDead)分析)による細胞の生存率;電気的特性、例えば、心筋細胞の収縮速度及び再分極の時間の変化又は不整脈事象(例えばQT間隔を測定することによって決定される);機械的特性、例えば、様々な平面状のバイオセンサー又は散乱(distruction)によって測定されるような収縮力の変化;GAP結合を検出するためのコネクシン−43などの心臓マーカー、又は心臓特異的なトロポニンTなどのマーカーの免疫染色;並びに細胞代謝の変化(例えば乳酸形成、カルシウム流動、イオンチャンネルの変化、グルコース消費、酸素消費、及び二酸化炭素放出)が挙げられる。これらの作用は、何れかの望ましい組み合わせで、別々に、連続的に、並行して、又は同時に評価してもよい。
本心臓血管モデルは、上述した細胞の作用のいずれかを評価するための、1種又は複数のセンサー、例えば平面のバイオセンサーを含んでいてもよい。適切なセンサーとしては、これらに限定されないが、電気化学的、電気的及び/又は光学的なセンサーが挙げられる。培養培地の物理化学的な特性をモニターし、必要に応じて調節するためのさらなるセンサーが含まれていてもよい。
いくつかの実施形態において、細管形成プラットフォームそのものが、試験物質の血管新生特性を評価するために用いることができる。評価される血管新生特性の非限定的な例としては、細管形成能(例えば、細管の長さ及び/又は分岐を測定すること、または内皮の密着結合(endothelial tight junctions)の存在を決定することによって)、並びに細管の成熟化する能力(例えば、基底膜の形成、成熟した細管構造の内側を覆う周細胞及び平滑筋細胞の存在を決定することによって)が挙げられる。このようなケースにおいて、細胞培養に心筋細胞は添加されない。試験物質は、上述した任意選択の血管新生誘導剤の存在下又は非存在下で、例えばVEGF及びFGF−2による血管新生誘導の1日後に細管形成プラットフォームに適用することができる。血管新生特性は、例えば数日又は2週間追跡してもよい。試験物質は、細管が完全に形成される前であっても本モデルに適用することができる。
本発明の心臓血管及び血管新生モデルにおいてスクリーニングされる試験物質の非限定的な例としては、低分子の化合物、ナノ粒子、ポリペプチド、抗体、及び増殖因子などの化学的及び生物学的な物質が挙げられる。
心臓血管構造及び細管形成プラットフォームは、外来性マトリックス構成成分及び追加の生体材料が全くない状態でも、薬理学的な安全性及び毒性試験の目的で十分機能し、干渉する非天然の構成成分なしで心臓組織を模擬するが、ある種のケースにおいては、本モデル及び/又は本プラットフォームにこのような構成成分が含まれるほうが有利な場合がある。このような実施形態は、例えば人工心臓構造物における試験物質の安全性及び毒性を試験するために用いることができる。心臓血管モデル及び/又は細管形成プラットフォームに提供される適切な外来性マトリックス構成成分又は生体材料の非限定的な例としては、これらに限定されないが、I型又はIV型コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンなどの合成若しくは天然ポリマー、又はその他の細胞外マトリックス構成成分が挙げられる。
本発明のいくつかの態様において、外来性マトリックス構成成分及び/又は追加の生体材料を含む心臓血管構造物は、例えば、これらに限定されないが、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症などの心疾患の治療に使用するための移植可能な三次元心臓構造物として構築されてもよい。
用語「治療」又は「治療すること」は、本明細書で用いられる場合、完全な疾患の治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の予防、緩和、及び改善も意味する。
治療目的では、心臓構造物は異物がないこと(Xeno-free)、すなわち外来の源から生じるあらゆる構成成分を含まないこと、或いは外来病原体を含む条件下で製造されないことが重要である。さらに、治療目的で自己細胞を使用することが有利な場合がある。
当業者には明白であると予想されるが、技術の進歩に伴い、本発明の概念は様々な方法で実施が可能である。本発明及びその実施形態は、上述の例に限定されず、特許請求の範囲内で様々に変化させることが可能である。
全ての作業は、国の倫理委員会のガイドラインに従って行われた。いずれもタンペレ大学病院(Tampere University Hospital)からの適切な同意及びインフォームドコンセントのもとで、計画的な帝王切開によりヒト臍帯を得て、外科手術によりヒト脂肪組識試料を得た。さらにピルカンマー病院地域(Pirkanmaa Hospital District)の倫理委員会は、それぞれ承認番号R08070及びR051116としてヒトiPS及びhESC細胞の誘導及び使用を承認した。
(例1)
共培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離:
タンペレ大学病院によるインフォームドコンセント(ピルカンマー病院地域、Tampere、Finlandの倫理委員会による承認番号R08028)のもとで計画的な帝王切開から得られた臍帯からHUVEC細胞を誘導した。ヒト臍帯静脈からの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離は、Jaffeら(J Clin Invest、1973、52:2745)によって説明されているようにして、ただし過程をさらに最適化して行われた。胎盤から臍帯を分離し、臍帯静脈に20ゲージの針を挿入した。外科用クランプで臍帯を針の上からクランプすることにより針を固定した。静脈を臍帯用緩衝液(UBS;0.14MのNaCl、0.004MのKCl、及び0.011Mグルコースを含む0.1Mリン酸緩衝液)で潅流して血液を洗い流し、その後、臍帯静脈のもう一方の端部を外科用クランプでクランプした。静脈に0.05%コラゲナーゼIを注入した。臍帯を37℃で、20分まで水浴中でインキュベートした。インキュベート後、HUVECを含むコラゲナーゼI溶液を、PBSでの潅流により臍帯から洗い流して50mlポリプロピレンチューブ(Sarstedt)に入れた。細胞を200×gで10分遠心分離し、培地で1回洗浄し、再度遠心分離し、EGM−2 BulletKit培地(Lonza Group Ltd、Basel、Switzerland)に再懸濁し、75cm2のフラスコに植え付けた。細胞を、37℃、5%CO2のインキュベーター中で培養した。2〜3日毎に培地を交換し、細胞がコンフルエントになったら細胞を分けた。分析対照として、HUVECを細胞4000個/cm2でプレートに植え付け、EGM−2 BulletKit培地中で培養した。
共培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離:
タンペレ大学病院によるインフォームドコンセント(ピルカンマー病院地域、Tampere、Finlandの倫理委員会による承認番号R08028)のもとで計画的な帝王切開から得られた臍帯からHUVEC細胞を誘導した。ヒト臍帯静脈からの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離は、Jaffeら(J Clin Invest、1973、52:2745)によって説明されているようにして、ただし過程をさらに最適化して行われた。胎盤から臍帯を分離し、臍帯静脈に20ゲージの針を挿入した。外科用クランプで臍帯を針の上からクランプすることにより針を固定した。静脈を臍帯用緩衝液(UBS;0.14MのNaCl、0.004MのKCl、及び0.011Mグルコースを含む0.1Mリン酸緩衝液)で潅流して血液を洗い流し、その後、臍帯静脈のもう一方の端部を外科用クランプでクランプした。静脈に0.05%コラゲナーゼIを注入した。臍帯を37℃で、20分まで水浴中でインキュベートした。インキュベート後、HUVECを含むコラゲナーゼI溶液を、PBSでの潅流により臍帯から洗い流して50mlポリプロピレンチューブ(Sarstedt)に入れた。細胞を200×gで10分遠心分離し、培地で1回洗浄し、再度遠心分離し、EGM−2 BulletKit培地(Lonza Group Ltd、Basel、Switzerland)に再懸濁し、75cm2のフラスコに植え付けた。細胞を、37℃、5%CO2のインキュベーター中で培養した。2〜3日毎に培地を交換し、細胞がコンフルエントになったら細胞を分けた。分析対照として、HUVECを細胞4000個/cm2でプレートに植え付け、EGM−2 BulletKit培地中で培養した。
単離されたHUVECを、顕微鏡でそれらの形態学、細胞培養純度、及び細胞増殖について毎日観察した。培地を2〜3日毎に交換した。細胞がコンフルエントになったら、トリプルエキスプレス(Tryple Express)で細胞を取り外した。優れた増殖能力を有する純粋なHUVEC培養物の継代培養は、初代培養(p0)では1:2〜1:4の比率で、さらに第一継代(p1)では1:3〜1:5の比率に高めて行われた。
レンチウイルス感染:
レンチウイルス構成物pLKO−MISSION−Bright−GFPを、Biomedicum Genomics(BMGen、Biomedicum Helsinki、Helsinki、Finland)から購入した。低継代のHUVECでの感染を、1mlのEGM−2Bullet Kit培地(1U/ml)中の300μlのpLKO−MISSION−Bright−GFPを用いて行った。ウイルス感染を8μg/ml臭化ヘキサジメトリン(Sigma)で促進した。24時間インキュベートした後、培地を新しいEGM−2培地と置き換えた。高度な蛍光を示すクローンをクローニングリングを用いて選択し、さらに希釈クローニングで選択して、純粋なGFP−HUVEC培養物を得た。感染したHUVECを増やした後、それらを以下で説明されているようなhASCとHUVECとの共培養分析に用いた。
レンチウイルス構成物pLKO−MISSION−Bright−GFPを、Biomedicum Genomics(BMGen、Biomedicum Helsinki、Helsinki、Finland)から購入した。低継代のHUVECでの感染を、1mlのEGM−2Bullet Kit培地(1U/ml)中の300μlのpLKO−MISSION−Bright−GFPを用いて行った。ウイルス感染を8μg/ml臭化ヘキサジメトリン(Sigma)で促進した。24時間インキュベートした後、培地を新しいEGM−2培地と置き換えた。高度な蛍光を示すクローンをクローニングリングを用いて選択し、さらに希釈クローニングで選択して、純粋なGFP−HUVEC培養物を得た。感染したHUVECを増やした後、それらを以下で説明されているようなhASCとHUVECとの共培養分析に用いた。
ヒト脂肪幹細胞(hASC)の単離:
幹細胞の単離手順は、以前に説明されたようにして行われた(Gimble及びGuilak、Cytotherapy、2003、5:362;Hongら、Mol Cell Biochem、2005、276。Niemelaら、J Craniofac Surg、2007、18:325〜335)。簡単に言えば、ヒト脂肪組識試料を細かく切断し、渦を巻いている水浴中で、ダルベッコ改変イーグル培地の栄養混合物F−12(DMEM/F12、Gibco、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)中で、37℃で60分、0.05%コラゲナーゼI(Invitrogen、Paisley、Scotland、UK)で酵素消化した。消化した組織を、室温(RT)で、600×gで10分間遠心分離した。消化した組織を100μmのフィルター(Sarstedt、Numbrecht、Germany)でろ過し、遠心分離し、40μmフィルター(Sarstedt)でろ過した。細胞を、1%L−グルタミン(L−glut、Gibco)、1%抗生−抗真菌性の混合物(AB/AM、Gibco)、及び15%ヒト血清(HS、Cambrex、East Rutherford、NJ、USA)が補充されたDMEM/F12中で75cm2のフラスコ(Nunc EasyFlask(商標)、Nunc、Roskilde、Denmark)に植え付けた。次の日、細胞をPBSで数回洗浄した。細胞を、37℃で、5%CO2の空気雰囲気下で、一定の湿度で維持し、2〜3日毎に培地を交換した。増殖して集密になったら、細胞を1:2〜1:3の比率で分けるか、又はさらに細胞培養研究に用いた。
幹細胞の単離手順は、以前に説明されたようにして行われた(Gimble及びGuilak、Cytotherapy、2003、5:362;Hongら、Mol Cell Biochem、2005、276。Niemelaら、J Craniofac Surg、2007、18:325〜335)。簡単に言えば、ヒト脂肪組識試料を細かく切断し、渦を巻いている水浴中で、ダルベッコ改変イーグル培地の栄養混合物F−12(DMEM/F12、Gibco、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)中で、37℃で60分、0.05%コラゲナーゼI(Invitrogen、Paisley、Scotland、UK)で酵素消化した。消化した組織を、室温(RT)で、600×gで10分間遠心分離した。消化した組織を100μmのフィルター(Sarstedt、Numbrecht、Germany)でろ過し、遠心分離し、40μmフィルター(Sarstedt)でろ過した。細胞を、1%L−グルタミン(L−glut、Gibco)、1%抗生−抗真菌性の混合物(AB/AM、Gibco)、及び15%ヒト血清(HS、Cambrex、East Rutherford、NJ、USA)が補充されたDMEM/F12中で75cm2のフラスコ(Nunc EasyFlask(商標)、Nunc、Roskilde、Denmark)に植え付けた。次の日、細胞をPBSで数回洗浄した。細胞を、37℃で、5%CO2の空気雰囲気下で、一定の湿度で維持し、2〜3日毎に培地を交換した。増殖して集密になったら、細胞を1:2〜1:3の比率で分けるか、又はさらに細胞培養研究に用いた。
hASC及びHUVECの共培養:
ヒトASC(第7継代まで)を、EGM−2 BulletKit(Lonza)培養培地中で48ウェルプレート(Nunclon(商標)マルチディッシュ、Nunc、Roskilde、Denmark)に細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。上述したようにして培養したHUVEC(第4継代まで)を即座にhASCの上に慎重に細胞4000個/cm2の密度で植え付けた。プレートに植え付けた次の日、この共培養物にVEGF(10ng/ml)及びFGF−2(1ng/ml)を加えた。
ヒトASC(第7継代まで)を、EGM−2 BulletKit(Lonza)培養培地中で48ウェルプレート(Nunclon(商標)マルチディッシュ、Nunc、Roskilde、Denmark)に細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。上述したようにして培養したHUVEC(第4継代まで)を即座にhASCの上に慎重に細胞4000個/cm2の密度で植え付けた。プレートに植え付けた次の日、この共培養物にVEGF(10ng/ml)及びFGF−2(1ng/ml)を加えた。
3日間又は6日間のいずれかで細胞を培養した後、免疫細胞化学又は定量RT−PCRを行った。培地を交換し、これらの処理を、3日間培養した細胞に1回、6日間培養した細胞に2回行った。
免疫細胞化学:
細管形成を、フォン・ウィルブランド因子に対する内皮細胞特異的抗体(ウサギ産生抗vWf一次抗体、1:500、Sigma)で可視化した。ヒト脂肪幹細胞分化を評価するために、α−vWfでの平行した二連の免疫蛍光染色を行った。共通の周細胞マーカーであるα−平滑筋アクチン(モノクローナル抗αSMAクローン1A4、1:200、Sigma)、血管平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖(抗SMMHC、1:800、Sigma)、収縮性の平滑筋細胞マーカーであるカルポニン(抗カルポニン、1:800、Sigma)、周細胞及び平滑筋細胞前駆体マーカーである血小板由来増殖因子受容体−β(抗PDGFRβ、1:800)又は基底膜マーカーであるIV型コラーゲン(抗COLIV、1:500、Sigma)のいずれかに対する一次抗体を、抗vWfと組み合わせた。細胞をPBSで3回洗浄し、氷冷した70%エタノールで20分固定し、0.5%トリトンX−100(JT Baker、Phillipsburg、NJ、USA)で15分間透過処理し、10%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)で30分非特異的な染色をブロックした。ブロック後、細胞を一次抗体対と共に室温で1時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、抗vWfに対しては二次抗体のポリクローナル抗ウサギIgG TRITC(1:100、Sigma)、並びに抗αSMA、抗COLIV、抗PDGFR−β、及び抗SMMHCに対してはポリクローナル抗マウスIgG FITC(1:100、Sigma)と共に30分インキュベートした。細胞核を、ヘキスト(Hoechst)33258(1ug/ml、Sigma)で5分染色し、PBSで5回洗浄した。抗GFP染色について、一次抗体対は、GFPに対するマウスモノクローナル抗体(Abcam、Cambridge、UK、1:100)及び抗vWfであり、二次抗体は、それぞれ抗マウスIgG TRITC(Sigma、1:100)及びウサギIgG FITCに対するポリクローナル抗体(Acris Antibodies GmbH、Hiddenhausen、Germany、1:500)であった。蛍光を、ニコンのEclipse Ti−S顕微鏡(株式会社ニコン、東京、日本)で可視化し、画像をアドビフォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウェア7.0(Adobe Systems、San Jose、CA、USA)及びコーレルドロー(Corel Draw)ソフトウェア10.0(Corel Corporation、Ottawa、ON、Canada)で加工した。
細管形成を、フォン・ウィルブランド因子に対する内皮細胞特異的抗体(ウサギ産生抗vWf一次抗体、1:500、Sigma)で可視化した。ヒト脂肪幹細胞分化を評価するために、α−vWfでの平行した二連の免疫蛍光染色を行った。共通の周細胞マーカーであるα−平滑筋アクチン(モノクローナル抗αSMAクローン1A4、1:200、Sigma)、血管平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖(抗SMMHC、1:800、Sigma)、収縮性の平滑筋細胞マーカーであるカルポニン(抗カルポニン、1:800、Sigma)、周細胞及び平滑筋細胞前駆体マーカーである血小板由来増殖因子受容体−β(抗PDGFRβ、1:800)又は基底膜マーカーであるIV型コラーゲン(抗COLIV、1:500、Sigma)のいずれかに対する一次抗体を、抗vWfと組み合わせた。細胞をPBSで3回洗浄し、氷冷した70%エタノールで20分固定し、0.5%トリトンX−100(JT Baker、Phillipsburg、NJ、USA)で15分間透過処理し、10%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)で30分非特異的な染色をブロックした。ブロック後、細胞を一次抗体対と共に室温で1時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、抗vWfに対しては二次抗体のポリクローナル抗ウサギIgG TRITC(1:100、Sigma)、並びに抗αSMA、抗COLIV、抗PDGFR−β、及び抗SMMHCに対してはポリクローナル抗マウスIgG FITC(1:100、Sigma)と共に30分インキュベートした。細胞核を、ヘキスト(Hoechst)33258(1ug/ml、Sigma)で5分染色し、PBSで5回洗浄した。抗GFP染色について、一次抗体対は、GFPに対するマウスモノクローナル抗体(Abcam、Cambridge、UK、1:100)及び抗vWfであり、二次抗体は、それぞれ抗マウスIgG TRITC(Sigma、1:100)及びウサギIgG FITCに対するポリクローナル抗体(Acris Antibodies GmbH、Hiddenhausen、Germany、1:500)であった。蛍光を、ニコンのEclipse Ti−S顕微鏡(株式会社ニコン、東京、日本)で可視化し、画像をアドビフォトショップ(Adobe Photoshop)ソフトウェア7.0(Adobe Systems、San Jose、CA、USA)及びコーレルドロー(Corel Draw)ソフトウェア10.0(Corel Corporation、Ottawa、ON、Canada)で加工した。
細管形成の顕微鏡解析:
免疫細胞化学的染色の後に、48ウェルプレートのウェル中の細管をニコンのEclipse TS100顕微鏡(株式会社ニコン、東京、日本)で40倍の倍率で解析した。様々な培養物における細管の程度を、0〜10の半定量的な格付けスケールを用いて目視で定量したが、この格付けは、我々の以前の研究(Sarkanenら、2011)で説明されているように細管形成、細管の長さ及び分岐に基づいていた。
免疫細胞化学的染色の後に、48ウェルプレートのウェル中の細管をニコンのEclipse TS100顕微鏡(株式会社ニコン、東京、日本)で40倍の倍率で解析した。様々な培養物における細管の程度を、0〜10の半定量的な格付けスケールを用いて目視で定量したが、この格付けは、我々の以前の研究(Sarkanenら、2011)で説明されているように細管形成、細管の長さ及び分岐に基づいていた。
統計的分析:
統計分析を行い、グラフをグラフパッドプリズム(GraphPadPrism)5.0(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA、USA)で加工した。細管形成及びRT−PCRの結果を片側ANOVAで処理し、それに続いて適用できる場合はダネット及びボンフェローニの事後テストで処理した。結果を平均±標準偏差として報告し、p<0.05*、p<0.01**、及びp<0.001***の場合に差を有意とみなした。
統計分析を行い、グラフをグラフパッドプリズム(GraphPadPrism)5.0(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA、USA)で加工した。細管形成及びRT−PCRの結果を片側ANOVAで処理し、それに続いて適用できる場合はダネット及びボンフェローニの事後テストで処理した。結果を平均±標準偏差として報告し、p<0.05*、p<0.01**、及びp<0.001***の場合に差を有意とみなした。
結果:
共培養物の細管形成能力及び抗vWf陽性の内皮細管構造を、2種の異なるタイムポイント(3日目及び6日目)で評価して比較した。共培養物は、初期(3日目)に細管状のネットワーク形成を示し、これは再現可能で、細胞系又は細胞の継代数によらなかった。6日目に、共培養物は、極めて高い増殖速度を示し、充実した高密度の多層血管ネットワークが形成された。
共培養物の細管形成能力及び抗vWf陽性の内皮細管構造を、2種の異なるタイムポイント(3日目及び6日目)で評価して比較した。共培養物は、初期(3日目)に細管状のネットワーク形成を示し、これは再現可能で、細胞系又は細胞の継代数によらなかった。6日目に、共培養物は、極めて高い増殖速度を示し、充実した高密度の多層血管ネットワークが形成された。
細管形成の半定量的評価から、共培養物は、3日目よりも6日目に有意に多くの細管を有していたことが示された(p<0.001)。増殖因子なしで増殖させた対照細胞、並びに増殖因子高含有EGM−2培地中で増殖させたHUVEC単独は、それぞれ少しの細管しか形成されないか、又は細管が形成されないことが示された。
共培養物はまた、免疫細胞化学染色に供した。PDGFRβ発現は3日目で最も強く、継続的に成長する細管を取り囲むドット様の構造として観察された。6日目に、ある程度のPDGFRβが観察された。COLIVは、基底膜の成長を示しており、共培養物中でかなり広範囲に発現された。発現は、成長する細管と共に局在しており、細管を覆っていた。6日目、共培養物中でα−SMA及びSMMHC陽性細胞は広範囲に発現され、これらは細管構造の分岐点及び細管と細管との間に局在することが多かった。SMMHC発現は3日から6日の間に増加した。共培養モデルは、完全な基底膜の形成、及び細管の内側を覆う収縮特性を有する平滑筋細胞などの成熟した血管の特性を有する高密度の多層血管ネットワークを形成すると結論付けることができる。この共培養モデルは、以前に開発されたどの血管新生モデルよりも成熟している。
(例2)
単一培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒトASCを例1で説明されているようにして得て、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレート(Nunclon(商標)マルチディッシュ、Nunc、Roskilde、Denmark)に細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。細胞を、3日間又は6日間のいずれかで、EGM−2 BulletKit培地、すなわちEGF、VEGF、bFGF、IGF−I、アスコルビン酸、ヘパリン、0.1%ゲンタマイシン/アンホテリシン−B、及び2%FBSを含む市販の増殖因子高含有培地中で、又は15%HS、1mMのL−glut、及び1%AB/AMが補充されたDMEM/F−12培地中で培養した。培地を交換し、上記処理を、3日間培養した細胞に1回、6日間培養した細胞に2回行った。分析対照として、hASCを、15%HS、1mMのL−glut、及び1%AB/AMが補充されたDMEM/F−12培地中で培養した。
単一培養ベースの細管形成プラットフォームの構築及び特徴付け
ヒトASCを例1で説明されているようにして得て、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレート(Nunclon(商標)マルチディッシュ、Nunc、Roskilde、Denmark)に細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。細胞を、3日間又は6日間のいずれかで、EGM−2 BulletKit培地、すなわちEGF、VEGF、bFGF、IGF−I、アスコルビン酸、ヘパリン、0.1%ゲンタマイシン/アンホテリシン−B、及び2%FBSを含む市販の増殖因子高含有培地中で、又は15%HS、1mMのL−glut、及び1%AB/AMが補充されたDMEM/F−12培地中で培養した。培地を交換し、上記処理を、3日間培養した細胞に1回、6日間培養した細胞に2回行った。分析対照として、hASCを、15%HS、1mMのL−glut、及び1%AB/AMが補充されたDMEM/F−12培地中で培養した。
結果:
hASC単一培養では、血管新生への誘導は、共培養の場合ほど充実していなかった。しかしながら、単一培養では、血管を支持する周細胞及び平滑筋細胞マーカーがしばしば観察された。
hASC単一培養では、血管新生への誘導は、共培養の場合ほど充実していなかった。しかしながら、単一培養では、血管を支持する周細胞及び平滑筋細胞マーカーがしばしば観察された。
(例3)
インビトロの心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたHUVEC及びhASCを例1で説明されているようにして得た。2〜3日齢の新生仔ラットから新生仔ラットの心筋細胞を抽出した。
インビトロの心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたHUVEC及びhASCを例1で説明されているようにして得た。2〜3日齢の新生仔ラットから新生仔ラットの心筋細胞を抽出した。
48ウェルプレートでインビトロの心臓血管モデルを以下のようにして構築した:
0日目:細管形成プラットフォームの構築
共培養モデル:hASC(第4継代まで)を、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレートに細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。1〜3時間後、EGM−2培養培地中のHUVEC(第4継代まで)を慎重にhASCの上に細胞4000個/cm2の密度で植え付けた。
単一培養モデル:hASC(第4継代まで)を、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレートに細胞24000個/cm2の密度で植え付けた。
1日目:インビトロの心臓血管モデルの構築
完全無血清培地(CSFM)中の新生仔ラットの心筋細胞(細胞100000個、200000個、又は40000個)を細管形成プラットフォーム上に植え付けた。
2日目:分化の誘導
培地を、10ng/ml血管内皮増殖因子(VEGF)及び1ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF−2)が補充されたCSFMに交換した。培地を週3回新しい培地に交換した。
結果:
新生仔ラットの心筋細胞は、単一培養モデルでは約7日間、共培養モデルでは少なくとも14日間、生存可能であり収縮性であった(表1を参照)。培養時間中ずっと、形態学的に筋状の細胞形態が維持された。培養中ずっと、心筋細胞は細管構造に沿って、又は細管構造に近接して配向され、同調して収縮した。
新生仔ラットの心筋細胞は、単一培養モデルでは約7日間、共培養モデルでは少なくとも14日間、生存可能であり収縮性であった(表1を参照)。培養時間中ずっと、形態学的に筋状の細胞形態が維持された。培養中ずっと、心筋細胞は細管構造に沿って、又は細管構造に近接して配向され、同調して収縮した。
(EGM−2 BulletKitシングルクオーツ(Single Quots)サプリメント、Lonza)及びヘパリン(EGM−2シングルクオーツサプリメント、Lonza)。
培地3:2%FBS(ウシ胎仔血清.Gibco)、10ng/mlのVEGF、及び1ng/mlのFGF−2が補充されたCSFM。
培地4:血管新生刺激培地:10ng/mlのVEGF、1ng/mlのFGF−2、0.1%ゲンタマイシン(GA−1000、Lonza)、2%ウシ胎仔血清、及び1mMのL−グルタミンが補充された内皮細胞用基礎培地(EBM−2、Lonza)。
培地5:血管新生刺激培地+ヒト血清:10ng/mlの血管内皮増殖因子及び1ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF−2、Sigma)、0.1%ゲンタマイシン(GA−1000、Lonza)、及び2%ヒト血清(Lonza)血清、及び1mMのL−グルタミンが補充された内皮細胞用基礎培地(EBM−2、Lonza)。
(例4)
比較の結果
新生仔ラットの心筋細胞(NRC)の細管形成及び心筋細胞の収縮性を、共培養ベースの細管形成プラットフォームの7種の異なる処理で評価した。
比較の結果
新生仔ラットの心筋細胞(NRC)の細管形成及び心筋細胞の収縮性を、共培養ベースの細管形成プラットフォームの7種の異なる処理で評価した。
培地1:10ng/mlのVEGF(Sigma Aldrich、Manassas、VA、USA)及び1ng/mlのFGF−2(Sigma)が補充されたCSFM(完全無血清培地)。
50mlのCSFMは、以下の成分で構成された:
− DMEM/F−12 42ml
− 200mMのL−グルタミン 0.64ml
− 100×ペニシリン/ストレプトマイシン 0.5ml
− 0.1nMのT3 0.5μl
− 10×BSA 5ml
− 100mMのピルビン酸ナトリウム 1.4ml
− ITS 0.576ml。
− DMEM/F−12 42ml
− 200mMのL−グルタミン 0.64ml
− 100×ペニシリン/ストレプトマイシン 0.5ml
− 0.1nMのT3 0.5μl
− 10×BSA 5ml
− 100mMのピルビン酸ナトリウム 1.4ml
− ITS 0.576ml。
培地2:10ng/mlのVEGF、1ng/mlのFGF−2、アスコルビン酸(EGM−2シングルクオーツサプリメント、Lonza)、ヒドロコルチゾンが補充されたCSFM、培地6:EGM−2 BulletKit培地(Lonza)であり、この場合、2%ウシ胎仔血清(Lonza)を2%ヒト血清(Lonza)に置き換えた。
培地7:ウシ胎仔血清を含まないEGM−2 BulletKit−培地(Lonza)。
(例5)
in vitroでのヒト心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたHUVEC及びhASCを例1で説明されているようにして得た。ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を、Mummeryら(同じ個所)で説明されているようにして2週間分化させた。拍動する細胞群を切り出し、解離させ、10%FBS、1%NEAA、及び1%グルタマックス(Glutamax)が補充されたDMEM/F12(EB培地)中で培養した。
in vitroでのヒト心臓血管モデルの構築及び特徴付け
この実施例で使用されたHUVEC及びhASCを例1で説明されているようにして得た。ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を、Mummeryら(同じ個所)で説明されているようにして2週間分化させた。拍動する細胞群を切り出し、解離させ、10%FBS、1%NEAA、及び1%グルタマックス(Glutamax)が補充されたDMEM/F12(EB培地)中で培養した。
48ウェルプレート中でインビトロの心臓血管モデルを以下のようにして構築した:
0日目:細管形成プラットフォームの構築
共培養モデル:hASC(第4継代まで)を、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレートに細胞20000個/cm2の密度で植え付けた。1〜3時間後、EGM−2培養培地中のHUVEC(第4継代まで)を慎重にhASCの上に細胞4000個/cm2の密度で植え付けた。
単一培養モデル:hASC(第4継代まで)を、EGM−2 BulletKit培地中で48ウェルプレートに細胞24000個/cm2の密度で植え付けた。
1日目:インビトロの心臓血管モデルの構築
EB中のヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を、細管形成プラットフォーム上に植え付けた(48ウェルプレートのウェル1つあたり細胞1〜7個の集合体)。
2日目:分化の誘導
培地を、10ng/ml血管内皮増殖因子(VEGF)及び1ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF−2)が補充されたEBに交換した。培地を週3回新しい培地に交換した。
結果:
図4は、共培養モデルでは、ヒト心筋細胞は機能的であり、すなわち収縮性があり、さらに10日後でも成熟したような心筋細胞の典型的な形態を示したことを示している。
図4は、共培養モデルでは、ヒト心筋細胞は機能的であり、すなわち収縮性があり、さらに10日後でも成熟したような心筋細胞の典型的な形態を示したことを示している。
Claims (20)
- i)ヒト脂肪幹細胞(hASC)を含む単離された細管形成プラットフォームと、
ii)心筋細胞と
を含む、インビトロの心臓血管構造物。 - 前記細管形成プラットフォームが、細管を形成する内皮細胞をさらに含む、請求項1に記載の構造物。
- 前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、内皮前駆細胞、及び遺伝学的改変により得られた内皮細胞からなる群より選択される、請求項2に記載の構造物。
- 前記心筋細胞が、新生仔ラットの心筋細胞、hiPSC由来心筋細胞、hESC由来心筋細胞、成体幹細胞由来心筋細胞、分化転換によって誘導された心筋細胞、及びヒト初代心筋細胞からなる群より選択される、請求項1から3までのいずれか一項に記載の構造物。
- 合成ポリマー、天然ポリマー、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、及びその他の細胞外マトリックス構成成分、又はそれらの混合物からなる群より選択される外来性マトリックス構成成分又は追加生体材料をさらに含む、請求項1から4までのいずれか一項に記載の構造物。
- 心疾患の治療に使用するための、請求項1から5までのいずれか一項に記載の構造物。
- 前記心疾患が、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択される、請求項5に記載の構造物。
- ヒト脂肪幹細胞(hASC)を含む単離された細管形成プラットフォーム。
- 外来性マトリックス構成成分又は追加生体材料が存在しない、請求項8に記載のプラットフォーム。
- a)hASCを用意するステップと、
b)該hASCを、VEGF及びFGF−2が補充された細胞培養培地中で、任意選択で外来性マトリックス構成成分又は追加の生体材料が存在しない状態で培養するステップと
を含む、請求項8に記載の細管形成プラットフォームの製造方法。 - 細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、該内皮細胞を前記hASCと共培養するステップとをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、及び内皮前駆細胞からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記培養培地が、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、IGF−1、及びEGFからなる群より選択される少なくとも1種の物質をさらに含む、請求項10から12までのいずれか一項に記載の方法。
- a)hASC、心筋細胞、及び任意選択で細管を形成する内皮細胞を用意するステップと、
b)該hASCを、任意選択で該細管を形成する内皮細胞と共に培養するステップと、
c)該心筋細胞を、ステップb)で形成された培養物の上部で培養するステップと、
d)ステップc)で形成された細胞培養物に、VEGF及びFGF−2を投与するステップと
を含む、請求項1に記載のインビトロの心臓血管構造物の製造方法。 - 前記細管を形成する内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、ヒト脂肪幹細胞由来内皮細胞、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞、誘導多能性幹細胞由来内皮細胞、分化転換によって誘導された内皮細胞、及び内皮前駆細胞からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- ステップc)が、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、IGF−1、及びEGFからなる群より選択される少なくとも1種の物質を投与することをさらに含む、請求項14又は15に記載の方法。
- a)請求項1に記載のインビトロの心臓血管構造物又は請求項8に記載の細管形成プラットフォームを提供するステップと、
b)該構造又はプラットフォームに、該試験物質を投与するステップと、
c)該構造又はプラットフォームでの該試験物質の作用を決定するステップと、
d)ステップc)で決定された作用と、それに対応する該試験物質の非存在下で決定された作用とを比較するステップと
を含む、試験物質の生物活性を決定する方法。 - 前記決定される生物活性が、細胞毒性、細管形成の調節活性、電気的特性、例えば、心筋細胞収縮の速度規則性、再分極時間の持続時間、催不整脈性の存在、機械的特性、例えば、心筋細胞の収縮力、及び細胞代謝からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 心疾患の治療を必要とする患者に請求項5に記載の心臓構造物を移植するステップを含む、心疾患の治療方法。
- 前記心疾患が、冠動脈心疾患及び拡張型心筋症からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
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