JP7191041B2 - 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法 - Google Patents

機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7191041B2
JP7191041B2 JP2019562201A JP2019562201A JP7191041B2 JP 7191041 B2 JP7191041 B2 JP 7191041B2 JP 2019562201 A JP2019562201 A JP 2019562201A JP 2019562201 A JP2019562201 A JP 2019562201A JP 7191041 B2 JP7191041 B2 JP 7191041B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
progenitor cells
hepatocytes
intestinal epithelial
small intestinal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019562201A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2019131938A1 (ja
Inventor
明弘 梅澤
透 清野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JPWO2019131938A1 publication Critical patent/JPWO2019131938A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7191041B2 publication Critical patent/JP7191041B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C12N5/068—Stem cells; Progenitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Description

NPMD NITE BP-02591 NPMD NITE BP-02592
本発明は、機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法、およびそれにより得られた機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞、ならびにそれらを用いた再生医療または薬物の毒性評価に関する。
肝硬変などの肝疾患の根本療法には、従来、肝移植が行われており、現在も依然として主流の治療方法である。しかし、臓器提供者の不足、高額な費用、組織適合性など、肝移植が一般的な医療として普及するためには数多くの問題が存在する。そのため、肝細胞または肝前駆細胞を用いた肝再生医療方法の確立が急務である。
また、創薬研究の分野においては、薬剤の毒性試験に実験動物が多用されている。しかし、ヒトと動物との種差によって生体内での薬物動態が異なる場合があり、実験動物を用いた試験では薬物の安全性を十分に評価できずに、治験段階ではじめて肝毒性が報告されて薬剤開発が中止となる場合も多い。そのため、創薬研究の初期段階においてヒト生体内における薬物動態を予測するための、ヒト肝細胞を用いたインビトロの薬物毒性評価系の確立が強く望まれている。
現在までに複数のヒト肝細胞株が確立されているが、そのほとんどは薬物代謝活性が極めて低く、十分な肝機能を有していない。ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞（非特許文献１）は、肝機能を維持するが、肝がん由来であり、腫瘍形成性であるため、肝再生医療における使用には適さない。また、特定の一個体に由来する細胞株であることから、薬物代謝および毒性の個人差については評価できない。一方、ヒト初代培養肝細胞は、そもそも原料となるヒト肝臓の入手が制限される上に、継代培養により薬物代謝活性を喪失し、ごく短期間しか肝機能を維持できないため、安定的な供給は極めて困難である。さらに、ロット差が非常に大きいという問題もある。
したがって、近年では、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から機能的肝細胞を分化誘導する手法に注目が集まっており、これまでにも複数の分化誘導方法が報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。しかし、現在報告されている分化誘導方法はいずれも、分化効率が低く、十分な肝機能を有する肝細胞を高収率かつ高再現性で調製することができないものであった。したがって、十分な薬物代謝能を有する肝細胞を高効率かつ安定的に調製できる方法、およびそのような方法により得られる機能的肝細胞が、依然として必要とされている。
また、小腸上皮細胞も、肝細胞と同様に薬物トランスポーターおよび薬物代謝酵素を発現しており、薬物代謝に重要な役割を果たしていることが知られている。特に、経口製剤のバイオアベイラビリティを予測し安全性を評価するためには、機能的小腸上皮細胞が必要となる。しかし、十分な薬物代謝能を有する小腸上皮細胞を高効率かつ安定的に調製できる方法、およびそのような方法により得られる機能的小腸上皮細胞もまた、現時点では確立されていない。
Ａｎｉｎａｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，２００６；３４（１）：７５－８３ Ｓｏｕｄａｉｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５；１２１（１１）：３８７７－８８ Ａｂｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９９６；２２９（１）：２７－３４
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、十分な薬物代謝能を有する機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を、高効率かつ安定的に調製する方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞を含む細胞集団を抗生物質の存在下で培養することにより、十分な薬物代謝能を有する肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞を調製できることを見出した。
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、機能的肝前駆細胞もしくは機能的肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは機能的小腸上皮細胞を調製する方法であって、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養するステップを含む方法を提供するものである。
前記単離細胞集団は、肝組織または小腸上皮組織由来の初代培養物であることが好ましい。
前記単離細胞集団は、幹細胞から分化誘導されたものであることが好ましい。
前記幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞であることが好ましい。
前記幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であることが好ましい。
前記ｉＰＳ細胞は、健常者由来のものであることが好ましい。
前記ｉＰＳ細胞は、薬物性肝障害患者または薬物性小腸障害患者由来のものであることが好ましい。
前記抗生物質は、ピューロマイシン、ブラストサイジンＳ、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、フレオマイシンおよびフレオマイシンＤ１からなる群から選択されることが好ましい。
前記抗生物質は、０．１～１００μｇ／ｍｌのピューロマイシンであることが好ましい。
前記培養ステップは、肝分化誘導因子の存在下で行われることが好ましい。
前記肝分化誘導因子は、サイトカイン、細胞増殖因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤および細胞外基質からなる群から選択されることが好ましい。
上記方法は、前記単離細胞集団をアンモニアの存在下で培養するステップをさらに含むことが好ましい。
また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により得られた機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を提供するものである。
また、本発明は、一実施形態によれば、機能的肝前駆細胞を含む実質的に均一な単離細胞集団であって、前記機能的肝前駆細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の発現量が、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株におけるその発現量と比較して少なくとも５倍増大している単離細胞集団を提供するものである。
前記機能的肝前駆細胞は、α－フェトプロテイン、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６からなる群から選択される少なくとも１つを、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株よりも高いレベルで発現していることが好ましい。
前記機能的肝前駆細胞は、ＣＤ４４陽性および／またはＥｐＣＡＭ陽性であることが好ましい。
前記実質的に均一な単離細胞集団は、不死化されていることが好ましい。
また、本発明は、一実施形態によれば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＢＰ－０２５９１および／またはＢＰ－０２５９２として寄託された、機能的肝前駆細胞を提供するものである。
また、本発明は、一実施形態によれば、肝機能障害を有する対象を治療する方法であって、上記実質的に均一な単離細胞集団を前記対象に投与するステップを含む方法を提供するものである。
また、本発明は、一実施形態によれば、上記実質的に均一な単離細胞集団を含んでなる、肝機能障害を治療するための医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）上記実質的に均一な単離細胞集団または上記寄託された機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた機能的肝細胞と試験化合物を接触させるステップと、（２）前記機能的肝細胞の障害の程度を解析するステップとを含む、試験化合物の毒性評価方法を提供するものである。
本発明に係る方法によれば、肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養するのみにより、容易かつ安価に、高い再現性をもって、十分な薬物代謝能を有する機能的肝（前駆）細胞または機能的小腸上皮（前駆）細胞を調製することができる。また、本発明に係る方法により得られた機能的肝（前駆）細胞または機能的小腸上皮（前駆）細胞は、再生医療や薬物毒性評価に有用である。
図１は、劇症肝炎患者由来のｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ－Ｋ細胞）の位相差顕微鏡像を示す図である。 図２は、ｉＰＳＣ－Ｋ細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞について、（ａ）ピューロマイシン処理する前、および（ｂ）ピューロマイシン処理した後の位相差顕微鏡像を示す図である。 図３は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞の顕微鏡像（ヘマトキシリン・エオシン染色）を示す図である。 図４は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞の顕微鏡像（右：明視野、左：免疫染色（ＣＹＰ３Ａ４））を示す図である。 図５は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞における肝細胞マーカーの発現を、免疫細胞化学により確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図６は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞における肝細胞マーカーの発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。 図７は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（＋））、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞（ＲＧ）、不死化された成熟肝細胞（ＭＮ）、およびピューロマイシンによる選択を行わずに分化誘導して得られた肝細胞（ＹＫ）における肝細胞マーカーの発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。 図８は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞について、リファンピシン処理を行ったまたは行わなかった場合における肝細胞マーカーの発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。 図９は、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞における増殖細胞マーカーの発現を、免疫細胞化学により確認した顕微鏡像を示す図である。 図１０は、ｉＰＳＣ－Ｋ細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞を、各種抗生物質により処理した後の位相差顕微鏡像を示す図である。 図１１は、ＳＥＥＳ５細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞を、各種抗生物質により処理した後の位相差顕微鏡像を示す図である。 図１２は、ｉＰＳＣ－Ｏ細胞またはＳＥＥＳ５細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞を、ピューロマイシン処理した後、アンモニア処理した後の位相差顕微鏡像を示す図である。 図１３は、ｉＰＳＣ－Ｏ細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞について、ピューロマイシン処理およびアンモニア処理を行って得られた細胞における代謝酵素の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。 図１４は、Ｅｄｏｍ－ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた腸オルガノイドについて、ピューロマイシン処理する前の位相差顕微鏡像を示す図である。 図１５は、Ｅｄｏｍ－ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた腸オルガノイドについて、ピューロマイシン処理した後の位相差顕微鏡像を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
本発明は、第一の実施形態によれば、機能的肝前駆細胞もしくは機能的肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは機能的小腸上皮細胞を調製する方法であって、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養するステップを含む方法である。
本実施形態において「機能的肝前駆細胞」とは、生体内における肝細胞と同様の薬物代謝能を有する肝細胞へと分化する能力を有する細胞を意味する。また、本実施形態において「機能的肝細胞」とは、生体内における肝細胞と同様の薬物代謝能を有する肝細胞を意味する。また、本実施形態において「機能的小腸上皮前駆細胞」とは、生体内における小腸上皮細胞と同様の薬物代謝能を有する小腸上皮細胞へと分化する能力を有する細胞を意味する。また、本実施形態において「機能的小腸上皮細胞」とは、生体内における小腸上皮細胞と同様の薬物代謝能を有する小腸上皮細胞を意味する。ここで、細胞が「薬物代謝能を有する」とは、細胞が、薬物代謝酵素であるシトクロムＰ４５０、具体的には、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６からなる群から選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０を、薬物代謝活性を示すために十分な量で発現していることを意味する。なお、「肝細胞」には、成熟肝細胞および未成熟肝細胞の両方が含まれてよい。
本実施形態において「単離細胞集団」とは、生体内の細胞環境（例えば組織など）から分離され、インビトロにおいて培養することによって得られた複数の細胞からなる集団を意味する。
本実施形態における単離細胞集団は、肝組織または小腸上皮組織由来の初代培養物であってよい。本実施形態において用いることができる肝組織または小腸上皮組織は、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。また、肝組織または小腸上皮組織は、胎児組織または成体組織のいずれであってもよい。肝組織からの初代培養物の調製方法は十分に確立されており、当分野において公知の方法にしたがって調製することができる（Ｃｏｌｅ，Ｋ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８６；４６（３）：１２９０－６；Ａｄａｍｓ Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９２；８９（１９）：８９８１－５）。小腸上皮組織からの初代培養物も、当分野において公知の方法にしたがって調製することができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，２０１５；５２２：１７３－１７８）。
また、本実施形態における単離細胞集団は、幹細胞から分化誘導されたものであってよい。本実施形態において「幹細胞」とは、自己複製能および分化能を有する細胞を意味する。幹細胞は、その分化能に応じて、多能性幹細胞、多能性幹細胞、単能性幹細胞などに分類されるが、本実施形態において用いることができる幹細胞は、少なくとも肝細胞または小腸上皮細胞に分化する能力を有するものであれば、いずれの幹細胞も本実施形態の方法において用いることができる。また、本来は脂肪細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞などに分化し、肝細胞または小腸上皮細胞には分化しない幹細胞であっても、後述する分化誘導手順により肝細胞または小腸上皮細胞に分化する能力を獲得し得る幹細胞であれば、本実施形態の方法において用いることができる。
本実施形態の方法において用いることができる幹細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。また、本実施形態において用いることができる幹細胞は、胚盤胞、胎児組織、成体組織または臍帯血のいずれから調製されたものであってもよい。幹細胞を調製するための組織も、特に限定されず、例えば、骨髄、筋肉、脳、膵臓、肝臓、腎臓などから幹細胞を調製することができる。本実施形態において用いることができる幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、体性幹細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞のいずれであってもよいが、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。また、ｉＰＳ細胞は、健常者由来であってもよいし、薬物性肝障害患者または薬物性小腸障害患者由来であってもよい。
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の調製方法は十分に確立されており、当分野において公知の方法にしたがって調製することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２００７；１３１（５）：８６１－７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）。または、すでに樹立されたＥＳ細胞株またはｉＰＳ細胞株を、例えば、理研バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などから入手してもよい。
幹細胞を肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞へと分化誘導するための種々の培養条件が公知であり、それらを適切に選択することにより、所望の分化度または成熟度の肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞を含む単離細胞集団を調製することが可能である。例えば、幹細胞から胚様体を形成させることにより、幹細胞を肝（前駆）細胞または小腸上皮（前駆）細胞へと分化誘導することができる。胚様体を形成させる培養条件は十分に確立されており、例えば、分化抑制因子を含有しない培地中で幹細胞を１日～２週間浮遊培養することにより、胚様体を形成させることができる。あるいは、例えば、アクチビンＡ、ＦＧＦ、ＢＭＰなどの液性因子を添加した分化誘導培地中で幹細胞を培養することにより、幹細胞を肝（前駆）細胞へと分化誘導することができる。また、例えば、ヘレグリンβ１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦなどの液性因子を添加した分化誘導培地中で幹細胞を培養することにより、幹細胞を小腸上皮（前駆）細胞へと分化誘導することができる。また、液性因子を用いずに、細胞接着領域と細胞非接着領域とがパターン化された基材上に幹細胞を播種し、腸オルガノイドへと分化誘導することもできる（特開２０１７－１８４７４９）。
幹細胞を肝（前駆）細胞へと分化誘導するためのキットは市販されており、そうした市販品を用いてもよい。例えば、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標） ｉＰＳ Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ、Ｙ３００５５）、が好ましい市販品として挙げられる。
本実施形態の方法では、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を、抗生物質の存在下で培養する。ここで、本実施形態において「抗生物質」とは、細胞の生存および増殖を阻害する細胞毒性化合物全般を意味する。本実施形態の方法は、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養することにより、抗生物質を代謝することができない細胞は死滅し、抗生物質を代謝することができる機能的肝前駆細胞もしくは機能的肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは機能的小腸上皮細胞のみが選択されることができる。
本実施形態における抗生物質には、細胞壁合成阻害薬以外の任意の抗生物質を使用することができ、例えば、細胞膜機能阻害薬、タンパク質合成阻害薬、核酸合成阻害薬、葉酸合成阻害薬などを使用することができ、これらから選択される単独または２以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは、本実施形態における抗生物質として、外因性遺伝子を保持する安定な形質転換体を選択するために一般的に使用されている抗生物質（いわゆる選択用抗生物質）を使用することができる。選択用抗生物質には、例えば、ピューロマイシン、ブラストサイジンＳ、Ｇ４１８（ジェネティシン（商標）としても知られる）、ハイグロマイシン、ならびに、ブレオマイシン、フレオマイシン、およびフレオマイシンＤ１（ゼオシン（商標）としても知られる）などのブレオマイシン・ファミリー由来の抗生物質などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法において用いることができる抗生物質は、好ましくはピューロマイシンである。
本実施形態の方法では、抗生物質を添加した培地中で一定期間、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を培養する。抗生物質の濃度は、細胞の種類および／または抗生物質の種類により異なるが、例えば、０．１～５０００μｇ／ｍｌの範囲とすることができる。また、培養期間は、抗生物質の種類により異なるが、例えば、１～１０日間にわたって行うことができる。例えば、抗生物質としてピューロマイシンを用いる場合には、０．１～１００μｇ／ｍｌの濃度において１～１０日間培養することが好ましく、０．５～５０μｇ／ｍｌの濃度において１～５日間培養することが特に好ましい。また、例えば、抗生物質としてフレオマイシンを用いる場合には、２０～１００μｇ／ｍｌの濃度で；ハイグロマイシンを用いる場合には、２０～２０００μｇ／ｍｌの濃度で；ブラストサイジンＳを用いる場合には、１～１００μｇ／ｍｌの濃度で；フレオマイシンＤ１を用いる場合には、２０～２０００μｇ／ｍｌの濃度で；Ｇ４１８を用いる場合には、５０～５０００μｇ／ｍｌの濃度で；１～１０日間培養することが好ましい。
本実施形態の方法において使用できる培地には、例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０などの基礎培地が挙げられ、これらから選択される単独または２種類以上を混合して用いることができる。また、本実施形態の方法において、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団は、１×１０６～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度範囲で播種されることが好ましい。
本実施形態の方法により機能的肝前駆細胞または機能的肝細胞を調製する場合には、培地に肝分化誘導因子を適宜添加することが好ましい。肝分化誘導因子には、サイトカイン、細胞増殖因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤および細胞外基質からなる群から選択される単独または２以上を組み合わせて用いることができる。サイトカインおよび細胞増殖因子としては、例えば、オンコスタチンＭ（２～２００ｎｇ／ｍｌ程度）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（５～５００ｎｇ／ｍｌ程度）、Ｗｎｔ（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、Ｒ－スポンジン１（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、インスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）（５０～５０００ｎｇ／ｍｌ程度）、ニコチンアミド（１～１００ｍＭ程度）、ヒドロコルチゾン（４０～４０００ｎｇ／ｍｌ程度）などを用いることができるが、これらに限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（１～１００μｍｏｌ／ｍｌ程度）などを用いることができる。ＭＡＰＫ阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０２１９０（０．５～５０μＭ程度）などを用いることができる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、Ａ８１－０１（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）などを用いることができる。
本実施形態の方法により機能的小腸上皮前駆細胞または機能的小腸上皮細胞を調製する場合には、培地に小腸上皮分化誘導因子を適宜添加することが好ましい。小腸上皮分化誘導因子には、サイトカイン、細胞増殖因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤および細胞外基質からなる群から選択される単独または２以上を組み合わせて用いることができる。サイトカインおよび細胞増殖因子としては、例えば、オンコスタチンＭ（２～２００ｎｇ／ｍｌ程度）、Ｗｎｔ（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、Ｒ－スポンジン１（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）、インスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）（５０～５０００ｎｇ／ｍｌ程度）、ニコチンアミド（１～１００ｍＭ程度）、ヒドロコルチゾン（４０～４０００ｎｇ／ｍｌ程度）などを用いることができるが、これらに限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（１～１００μｍｏｌ／ｍｌ程度）などを用いることができる。ＭＡＰＫ阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０２１９０（０．５～５０μＭ程度）などを用いることができる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、Ａ８１－０１（１０～１０００ｎｇ／ｍｌ程度）などを用いることができる。
本実施形態の方法における培養は、接着培養法により行ってもよいし、浮遊培養法により行ってもよいが、接着培養法により行うことが好ましい。接着培養には、好ましくは、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、マトリゲルなどの細胞外基質やマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞によりコートされたプレートなどを用いることができる。本実施形態の方法における培養条件は、用いられる幹細胞の種類により適宜設定することができ、例えば、哺乳動物由来の幹細胞であれば、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養することが好ましい。
本実施形態の方法は、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を、アンモニアの存在下で培養するステップをさらに含んでもよい。具体的には、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を、抗生物質を添加した培地中で一定期間培養すればよい。アンモニアの濃度は、例えば、５～１５ｍｇ／ｍｌの範囲であってよい。また、培養期間は、例えば１～１０日間、好ましくは１～５日間にわたって行うことができる。
なお、本実施形態の方法において、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養するステップと、同単離細胞集団をアンモニアの存在下で培養するステップとは、順次または同時に行うことができる。例えば、単離細胞集団を抗生物質の存在下で一定期間培養した後、アンモニアを添加した培地に交換して一定期間培養してもよく；単離細胞集団をアンモニアの存在下で一定期間培養した後、抗生物質を添加した培地に交換して一定期間培養してもよく；抗生物質およびアンモニアの両方を添加した培地中で一定期間培養してもよい。
本実施形態の方法によれば、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養することのみにより、十分な薬物代謝能を有する機能的肝細胞もしくは機能的小腸上皮細胞またはそれらの前駆細胞を調製することが可能である。
本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により得られた機能的肝前駆細胞もしくは機能的肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは機能的小腸上皮細胞である。
本実施形態における「機能的肝前駆細胞」、「機能的肝細胞」、「機能的小腸上皮前駆細胞」および「機能的小腸上皮細胞」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。したがって、上記方法により得られた細胞が機能的肝前駆細胞もしくは機能的肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは機能的小腸上皮細胞であるかどうかは、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６からなる群から選択される少なくとも１つのシトクロムＰ４５０の発現により確認することができ、特に好ましくは、ＣＹＰ３Ａ４の顕著な発現により確認することができる。
すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、機能的肝前駆細胞を含む実質的に均一な単離細胞集団であって、前記機能的肝前駆細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の発現量が、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株におけるその発現量と比較して少なくとも５倍増大している、単離細胞集団である。
本実施形態における「機能的肝前駆細胞」および「単離細胞集団」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。
本実施形態において、単離細胞集団が「実質的に均一」とは、単離細胞集団が、関心対象の細胞を、少なくとも９０％の割合で含む状態にあることを意味する。したがって、本実施形態の単離細胞集団は、機能的肝前駆細胞を少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の割合で含む。以降、本明細書では、機能的肝前駆細胞を含む実質的に均一な単離細胞集団を「機能的肝前駆細胞集団」と記載する。
本実施形態の機能的肝前駆細胞集団に含まれる肝前駆細胞が機能的肝前駆細胞であるかどうかは、ＣＹＰ３Ａ４の顕著な発現を基準に判断することができる。本実施形態の機能的肝前駆細胞集団におけるＣＹＰ３Ａ４の発現量は、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株におけるその発現量と比較して、少なくとも５倍、好ましくは２０倍以上、特に好ましくは１００倍以上増大している。ＣＹＰ３Ａ４および以下に記載するマーカーの発現量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲやウェスタンブロットなどの公知の手法により定量解析することができる。
本実施形態の機能的肝前駆細胞集団における機能的肝前駆細胞は、ＣＹＰ３Ａ４以外に、肝前駆細胞／未熟肝細胞マーカーであるα－フェトプロテイン、未熟肝細胞／成熟肝細胞マーカーであるアルブミン、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６からなる群から選択される少なくとも１つを、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株よりも高いレベルで発現していることが好ましい。加えて、本実施形態の機能的肝前駆細胞集団における機能的肝前駆細胞は、アンモニアを代謝する尿素回路を構成する酵素であるオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）および／またはカルバミルリン酸合成酵素１（ＣＰＳ１）を、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株よりも高いレベルで発現していることが好ましい。より好ましくは、本実施形態の機能的肝前駆細胞集団に含まれる機能的肝前駆細胞は、肝前駆細胞／未熟肝細胞マーカーであるＣＤ４４およびＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）のいずれかまたは両方について、さらに陽性であってよい。
本実施形態の機能的肝前駆細胞集団は、第一の実施形態における方法により調製することができる。さらに、本実施形態の機能的肝前駆細胞集団は、その中に含まれる機能的肝前駆細胞の割合をより高めるために、第一の実施形態における方法により得られた細胞集団から、肝前駆細胞／未熟肝細胞の細胞表面マーカーを発現する細胞を分取してもよい。好ましい肝前駆細胞／未熟肝細胞の細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３などが挙げられる。上記マーカー陽性細胞の分取は、蛍光活性細胞分離（ＦＡＣＳ）や磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）などの公知の手法により行うことができる。
本実施形態の機能的肝前駆細胞集団は、任意で、不死化されていてもよい。ここで、細胞が「不死化されている」とは、細胞が、一定回数の分裂を繰り返した後もなお増殖可能な状態を維持する、すなわち、細胞が無限増殖能を有することを意味する。細胞を不死化する方法はすでに確立されており、公知の手法を採用することができる。例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子などの不死化遺伝子をレトロウイルスベクターにより細胞に導入することにより、細胞を不死化することができる。
上記のようにして得られた機能的肝前駆細胞は、ＨｅｐａＳＭおよびＨｅｐａＮＳと命名され、国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（旧・独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に、受託番号ＢＰ－０２５９１およびＢＰ－０２５９２として寄託された（寄託日：２０１７年１２月６日、受領番号ＡＰ－０２５９１およびＡＰ－０２５９２）。
第二の実施形態における機能的肝前駆細胞および機能的肝細胞、ならびに第三の実施形態における機能的肝前駆細胞集団は、肝疾患の治療や、薬物代謝毒性試験に有用である。
本発明は、第四の実施形態によれば、肝機能障害を有する対象を治療する方法であって、上記の機能的肝前駆細胞集団を前記対象に投与するステップを含む方法である。
本実施形態において「治療」とは、対象における肝機能障害を完全に治癒することのみならず、肝機能障害の症状を寛解させる、状態を緩和する、または、病態の進行を遅らせるもしくは停止させることをも含む。
本実施形態における「対象」は、任意の脊椎動物であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒトなどの哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。
本実施形態における「肝機能障害」は、以下に限定されないが、例えば、肝炎、肝硬変、肝がん、先天性代謝異常症、急性肝不全（劇症肝炎）、慢性肝不全などが挙げられる。
本実施形態の方法は、上記の機能的肝前駆細胞集団を、肝機能障害を有する対象に投与することにより行うことができる。ここで、投与される機能的肝前駆細胞集団は、対象にとって同種異系、同系または自己由来であってよい。また、本実施形態において、機能的肝前駆細胞集団は、任意に遺伝子組換えされたものであってもよい。例えば、先天性代謝異常症の患者から調製されたｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた機能的肝前駆細胞集団に対し、疾患の原因である異常遺伝子に対応する正常遺伝子を導入し、前記患者に投与することができる。
本実施形態において、機能的肝前駆細胞集団は、例えば、注射、注入、移植などの適切な方法により投与することができる。好ましくは、機能的肝前駆細胞集団は、対象の門脈内に注入することができる。機能的肝前駆細胞集団を門脈内に注入する場合には、例えばリン酸緩衝生理食塩水などを用いて調製した細胞懸濁液（１×１０６細胞／ｍｌ）を、約２ｍｌ／分の速度で門脈内に注入すればよい。ここで、機能的肝前駆細胞集団の投与量は、対象の年齢、体重、肝機能障害の重症度などにより異なってよいが、例えば、１×１０５～１×１０１０細胞／ｋｇ（体重）、好ましくは１×１０６～１×１０８細胞／ｋｇ（体重）であってよい。また、前記投与量は、１回で投与されてもよいし、複数回にわたって投与されてもよい。
本発明は、第五の実施形態によれば、上記の機能的肝前駆細胞集団を含んでなる、肝機能障害を治療するための医薬組成物である。
本実施形態における「肝機能障害」および「治療」は、第四の実施形態において定義したものと同様である。
本実施形態の医薬組成物は、上記の機能的肝前駆細胞集団を有効成分として含有する。本実施形態の医薬組成物は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の担体、緩衝剤、その他の成分（例えば肝細胞増殖因子）などを含んでもよい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、有効成分である細胞の生存を維持できるリン酸緩衝生理食塩水などの担体を用いて、注射剤型として調製することができる。本実施形態の医薬組成物の投与方法および投与量は、第四の実施形態において記載したものと同様であってよい。
第四の実施形態における方法および第五の実施形態における医薬組成物は、肝機能障害の根本的な治療に有用である。
本発明は、第六の実施形態によれば、（１）上記の機能的肝前駆細胞集団または寄託された機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた機能的肝細胞と試験化合物を接触させるステップと、（２）前記機能的肝細胞の障害の程度を解析するステップとを含む、試験化合物の毒性評価方法である。
本実施形態の毒性評価方法は、上記の機能的肝前駆細胞集団または寄託された機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた機能的肝細胞を使用する。肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導するための培養条件は、第一の実施形態において記載したように公知であり、適切な培養条件により所望の分化度／成熟度の機能的肝細胞を得ることができる。
本実施形態の毒性評価方法では、機能的肝細胞に、試験化合物を接触させる。試験化合物は、特に限定されないが、例えば、薬物などの合成化合物や、細胞抽出物などの天然化合物などが挙げられる。また、これらの試験化合物は、新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
機能的肝細胞と試験化合物との接触は、例えば、機能的肝細胞を培養する培地またはリン酸緩衝生理食塩水やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に対して試験化合物を添加し、その中で一定時間細胞をインキュベートすることにより行うことができる。添加される試験化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、２０ｎＭ～５００μＭの範囲で適宜選択することができる。インキュベート時間は、好ましくは、２４～４８時間であってよい。
次いで、前記機能的肝細胞の障害の程度を解析する。機能的肝細胞の障害の程度は、例えば、機能的肝細胞の生存率や、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）などの肝障害マーカーの細胞外への漏出量などを測定することにより解析することができる。試験化合物との接触前と比較して、細胞の生存率が有意に低下した場合、または、肝障害マーカーの細胞外への漏出量が有意に増加した場合には、当該試験化合物が肝毒性を有し、薬物として有望ではないと評価することができる。一方、試験化合物との接触前と比較して、細胞の生存率が同程度またはそれ以上である場合、または、肝障害マーカーの細胞外への漏出量が同程度またはそれ以下である場合には、当該試験化合物が肝毒性を有しておらず、薬物として有望であると評価することができる。
本実施形態の方法は、薬物の候補化合物のスクリーニングに有用である。
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．劇症肝炎患者由来ｉＰＳ細胞の作製＞
劇症肝炎患者の線維芽細胞から、以下の手順によりｉＰＳ細胞を作製した。劇症肝炎患者（男性・０歳７ヶ月）から生検により得られた皮膚を培養し、線維芽細胞を得た。得られた線維芽細胞に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃのヒト遺伝子を、センダイウイルスベクターを用いて導入した。その後、２週間培養し、ドーム状のコロニーの出現を確認した。出現したコロニーを単離し、ＭＥＦフィーダー細胞上に移し、ｈｉＰＳ培地（組成は下記）中で継代培養した。
表１．ｈｉＰＳ培地の組成
Figure 0007191041000001
結果を図１に示す。継代培養により、ヒトＥＳ細胞やすでに樹立されたｉＰＳ細胞と同様の、輪郭が明瞭で扁平なコロニーが形成されることが確認され、劇症肝炎患者由来のｉＰＳ細胞が得られたことが示された。以下、このｉＰＳ細胞を「ｉＰＳＣ－Ｋ細胞」と記載する。
また、上記と同様の手順により、別の劇症肝炎患者の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を作製した。以下、このｉＰＳ細胞を「ｉＰＳＣ－Ｏ細胞」と記載する。
＜２．機能的肝前駆細胞の調製＞
（２－１．胚様体（ＥＢ）の形成）
上記ｉＰＳＣ－Ｋ細胞が約８０％コンフルエントになるまで培養した。培地を除去し、ＰＢＳにより洗浄した後、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、１０～２０分間、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。ディッシュを軽く叩いてコロニーを剥がした後、ｈｉＰＳ培地を加え、懸濁した。得られた細胞懸濁液をゼラチンコートされたディッシュに移し、１５分間、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートすることにより、フィーダー細胞を除去した。上清を遠心し、回収されたｉＰＳＣ－Ｋ細胞をＥＢ培地（組成は下記）に懸濁した。浮遊培養用の９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１７４９２９）に、１×１０６細胞／ウェルの濃度でｉＰＳＣ－Ｋ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１０日間培養し、胚様体（以下、「ＥＢ」と記載する）を形成させた。
表２．ＥＢ培地の組成
Figure 0007191041000002
（２－２．ＥＢから機能的肝前駆細胞への分化誘導）
ＥＢを回収し、ＸＦ３２培地（Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．，２０１７；２（１）：ｅ８６４９２，ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．８６４９２）に懸濁した。コラーゲンコートされた２４ウェルプレートに２０ＥＢｓ／ウェルの濃度でＥＢを播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて３５日間、接着培養を行うことにより肝前駆細胞へと分化誘導した。その後、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｗａｋｏ、＃１６０－２３１５１）を添加した改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地（Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５；５２２（７５５５）：１７３－８．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４４８４．，Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｊｕｎ ３）を用いて、さらに２日間培養した。
表３．ＸＦ３２培地の組成
Figure 0007191041000003
結果を図２に示す。ＥＢを接着培養して得られた細胞（図２（ａ））を、ピューロマイシン存在下で培養することにより、細胞のコロニーが得られた（図２（ｂ））。このピューロマイシンにより選択されたコロニーを増殖培養して得られた機能的肝前駆細胞は、「ＨｅｐａＮＳ」と命名され、国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＢＰ－０２５９２として寄託された（寄託日：２０１７年１２月６日、受領番号ＡＰ－０２５９２）。
（２－３．機能的肝前駆細胞の不死化）
続いて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子、変異ヒトＣＤＫ４（ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ）遺伝子、およびヒトサイクリンＤ１遺伝子を、上記により得られた機能的肝前駆細胞に導入し、不死化した。上記遺伝子の導入は、それぞれ、レンチウイルスベクターＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ｈＴＥＲＴ、ＣＳＩＩ－ＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｈＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ、およびＣＳＩＩ－ＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ－ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１を用いて、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２；７（１）：ｅ２９６７７．，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２９６７７．，Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊａｎ １９．に記載の手順にしたがって行った。得られた不死化機能的肝前駆細胞は、「ＨｅｐａＳＭ」と命名され、国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＢＰ－０２５９１として寄託された（寄託日：２０１７年１２月６日、受領番号ＡＰ－０２５９１）。
ＨｅｐａＳＭ細胞を、改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養することにより、肝細胞へと分化誘導した。得られた肝細胞について、以下の解析を行った。
＜３．機能的肝前駆細胞から分化誘導された肝細胞の解析＞
ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞について、ヘマトキシリン・エオシン染色および肝細胞マーカーによる免疫染色を行った。肝細胞マーカーによる免疫染色は、以下の手順により行った。培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド溶液を加え、４℃で１０分間、細胞を固定した。溶液を除去後、０．１％Ｔｒｉｒｏｎ－Ｘ（ナカライテスク）溶液を加え、室温で１０分間細胞を透過処理した。溶液を除去後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｄａｋｏ，Ｘ０９０９）を加え、室温で３０分間ブロッキング処理を行った。一次抗体として、抗ＣＹＰ３Ａ４抗体（Ｃ－１７）（ＳＡＮＴＡ ＣＬＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ｓｃ－２７６３９）（１／１０００希釈）、抗アルブミン抗体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ，ＣＬＦＡＧ２１４０）（１／５０希釈）、または抗α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（Ｂ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ，ＭＡＢ１３６８）（１／１００希釈）を用い、４℃で一晩反応させた。二次抗体には、Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１１０７８）、ＧＦＰ Ｔａｇ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ２１３１１）、またはＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ２１１２３）（いずれも１／１０００希釈）をそれぞれ用い、室温で３０分間反応させた。
結果を図３～５に示す。ヘマトキシリン・エオシン染色の結果、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞が、肝細胞の形態を呈していることが確認された（図３）。また、免疫染色の結果、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた細胞が、肝細胞マーカーであるＣＹＰ３Ａ４、アルブミン（ＡＬＢ）およびα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現していることが確認された（図４、５）。この結果から、ＨｅｐａＳＭ細胞が肝前駆細胞であることが示された。
次いで、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４、アルブミンおよびα－フェトプロテインの発現量を、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により解析した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，７４００４）を使用して、キット付属のプロトコールにしたがって、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、キット付属のプロトコールにしたがって、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡは－２０℃で保存した。
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、キット付属のプロトコールにしたがって行った。ＰＣＲ反応条件は以下の通り：５０℃２分×１サイクル、９５℃２分×１サイクル、（９５℃１５秒，６０℃３０秒）×４０サイクル、９５℃１５秒×１サイクル、６０℃１５秒×１サイクル、９５℃１５秒×１サイクル、５０℃２分×１サイクル。測定は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行い、装置内蔵の解析ソフトによる自動解析により各遺伝子のＣｔ値を算出し、内部標準遺伝子であるユビキチンの発現量により補正した。また、分化誘導およびピューロマイシン存在下での選択を行わずに、同程度の期間にわたり継代培養した未分化ｉＰＳＣ－Ｋ細胞を対照とした。
表４．ｑＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーセット（１）
Figure 0007191041000004
結果を図６に示す。ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（＋））において、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）およびＣＹＰ３Ａ４の発現量がいずれも上昇していることが確認された。以上の結果から、ＨｅｐａＳＭ細胞が、ＣＹＰ３Ａ４を高いレベルで発現する肝細胞に分化できるものである、すなわち、機能的肝前駆細胞であることが示された。
次いで、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞における肝細胞マーカーの発現量を、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手）、ピューロマイシンを添加しない以外は上記２－２と同様の手順により分化誘導して得られた肝細胞、および、不死化された成熟肝細胞における肝細胞マーカーの発現量と比較した。上記と同様の手順により、各肝細胞におけるα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４の発現量を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。なお、不死化された成熟肝細胞は、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．；Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５；１４（１０）：８４５－８５３に記載の手順に従って単離および初代培養した肝細胞を、上記と同様の手順により不死化することにより作製した。
結果を図７に示す。ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞（図中、「ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（＋）」と表記）は、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４を発現していることが確認された。特に、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞は、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞（図中、「ＲＧ」と表記）、不死化された成熟肝細胞（図中、「ＭＮ」と表記）またはピューロマイシンによる選択を行わずに分化誘導して得られた肝細胞（図中、「ＹＫ」と表記）と比較して、顕著に高いレベルでＣＹＰ３Ａ４を発現していることが確認された。この結果から、ＨｅｐａＳＭ細胞は、安定した機能的肝前駆細胞であることが示された。
また、ＨｅｐａＮＳ細胞を分化誘導して得られた肝細胞についても同様にして肝細胞マーカーの発現量を定量した結果、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞と同様に顕著に高いレベルでＣＹＰ３Ａ４を発現していることが確認された（データは省略）。この結果から、ＨｅｐａＮＳ細胞も同様に、安定した機能的肝前駆細胞であることが示された。
＜４．機能的肝前駆細胞における薬物代謝酵素誘導＞
ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞について、シトクロムＰ４５０の発現に基づく薬物代謝酵素誘導試験を行った（Ｋｈｕｕ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｍａｔｕｒｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．，２０１１；２０（２）：２８７－３０２）。リファンピシン（溶媒：ＤＭＳＯ）を、終濃度２０μＭになるように改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地に加え、２日間培養し、その後、上記３と同様の手順により、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。また、リファンピシンに代えてＤＭＳＯを同量添加した培地を用いて同様にして調製した細胞（図中、「ＲＦＰ（－）」と表記）を対照とした。
結果を図８に示す。ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞（図中、「ＲＦＰ（＋）」と表記）では、リファンピシン処理により、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ３Ａ４のいずれのシトクロムＰ４５０の発現量も顕著に増加した。特に、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞は、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞（図中、「ＲＧ」と表記）、不死化された成熟肝細胞（図中、「ＭＮ」と表記）またはピューロマイシンによる選択を行わずに分化誘導して得られた肝細胞（図中、「ＹＫ」と表記）と比較して、顕著に高いＣＹＰ３Ａ４の発現が誘導されることが確認された。この結果から、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞は、ＦＤＡによる非臨床薬物動態相互作用試験ガイドライン（Ｄｒｕｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ－Ｓｔｕｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｏｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，２０１２）に準拠したインビトロ酵素誘導による薬物の毒性試験に使用できるものであることが示された。
また、ＨｅｐａＮＳ細胞を分化誘導して得られた肝細胞についても同様にして薬物代謝酵素誘導試験を行った結果、ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞と同様に顕著に高いＣＹＰ３Ａ４の発現が誘導されることが確認された（データは省略）。この結果から、ＨｅｐａＮＳ細胞を分化誘導して得られた肝細胞も同様に、ＦＤＡによる非臨床薬物動態相互作用試験ガイドラインに準拠したインビトロ酵素誘導による薬物の毒性試験に使用できるものであることが示された。
＜５．機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた肝細胞の増殖能の評価＞
ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞の増殖能を、増殖細胞マーカーであるＫｉ６７およびＰＣＮＡの発現に基づいて評価した。細胞をパラフィン包埋することにより固定した後、脱パラフィン処理し、ＰＢＳで洗浄した。その後、２．５％ヤギ血清／ＰＢＳを加え、室温で３０分間ブロッキング処理を行った。一次抗体として、抗Ｋｉ６７抗体（ＤＡＫＯ，ＰＣ１０）または抗ＰＣＮＡ抗体（ＤＡＫＯ，ＭＩＢ－１）（いずれも１／２００希釈）を用い、室温で１時間反応させた。二次抗体反応およびＤＡＢ発色は、ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いて行った。水で洗浄後、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い、得られた標本を顕微鏡観察した。
結果を図９に示す。ＨｅｐａＳＭ細胞を分化誘導して得られた肝細胞は、増殖細胞マーカーであるＰＣＮＡ（図９（ａ））およびＫｉ６７（図９（ｂ））を発現していることが示された。また、ＨｅｐａＮＳ細胞を分化誘導して得られた肝細胞も同様に、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡの増殖細胞マーカーを発現していることが確認された（データは省略）。さらに、ＨｅｐａＳＭ細胞とＨｅｐａＮＳ細胞のいずれも高い増殖能を有し、６ヶ月を超えて培養できることを確認した。
＜６．各種抗生物質による機能的肝前駆細胞の調製（１）＞
ピューロマイシンに代えて各種抗生物質を用いた以外は上記（２－１）および（２－２）と同様の手順により、ｉＰＳＣ－Ｋ細胞から機能的肝前駆細胞を調製した。用いた抗生物質およびその濃度、ならびに培養日数を以下に示す。
表５．抗生物質および培養条件（ｉＰＳＣ－Ｋ細胞からの機能的肝前駆細胞の調製）
Figure 0007191041000005
結果を図１０に示す。（ａ）フレオマイシン、（ｂ）ハイグロマイシン、（ｃ）ブラストサイジンＳ、（ｄ）ゼオシン（商標）、および（ｅ）Ｇ４１８のいずれの抗生物質を用いた場合にも細胞のコロニーが得られた。
＜７．各種抗生物質による機能的肝前駆細胞の調製（２）＞
以下の手順により、ヒトＥＳ細胞であるＳＥＥＳ５細胞（Ａｋｕｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，２０１５；１：１８－２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｒｅｔｈ．２０１４．１２．００４）から機能的肝前駆細胞を調製した。ｈｉＰＳ培地に代えてＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いた以外は上記（２－１）と同様の手順により、ＥＢを形成させた。ＥＢを回収し、ＸＦ３２培地に懸濁した。コラーゲンコートされた２４ウェルプレートに２０ＥＢｓ／ウェルの濃度でＥＢを播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて１０日間、接着培養を行った。その後、ＨＤ培地（ＸＦ３２培地からｂＦＧＦのみを抜いた組成からなる）に交換して１０日間培養し、さらに改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地に交換して７日間培養した。その後、各種抗生物質を添加した改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地に交換した。用いた抗生物質およびその濃度、ならびに培養日数を以下に示す。
表６． 抗生物質および培養条件（ＳＥＥＳ５細胞からの機能的肝前駆細胞の調製）
Figure 0007191041000006
結果を図１１に示す。（ａ）フレオマイシン、（ｂ）ハイグロマイシン、（ｃ）ブラストサイジンＳ、（ｄ）ゼオシン（商標）、（ｅ）Ｇ４１８、および（ｆ）ピューロマイシンのいずれの抗生物質を用いた場合にも細胞のコロニーが得られた。また、それらの細胞はいずれも顕著に高いレベルでＣＹＰ３Ａ４を発現しており、機能的肝前駆細胞であることが確認された（データは省略）。
＜８．アンモニアによる機能的肝前駆細胞の調製＞
ｉＰＳＣ－Ｋ細胞に代えてｉＰＳＣ－Ｏ細胞を用いた以外は上記（２－１）および（２－２）と同様の手順によりｉＰＳＣ－Ｏ細胞から調製されピューロマイシンにより選択された機能的肝前駆細胞、ならびに、上記７においてＳＥＥＳ５細胞から調製されピューロマイシンにより選択された機能的肝前駆細胞について、以下の手順によりアンモニアによるさらなる選択培養を行った。ｉＰＳＣ－Ｏ細胞から調製された機能的肝前駆細胞またはＳＥＥＳ５細胞から調製された機能的肝前駆細胞の培養物（１０ｃｍディッシュ）から培地を除去し、５ｍｌのＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）により洗浄した。その後、それぞれの培養物に対し、５ｍｇ／ｍｌのアンモニアを添加した改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地または８ｍｇ／ｍｌのアンモニアを添加した改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地を１０ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。その後、培地を除去し、５ｍｌのＤ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）により洗浄し、１０ｍｌの新しい改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地を添加した。
アンモニアによる選択培養後の、ｉＰＳＣ－Ｏ細胞から調製された機能的肝前駆細胞の培養物を図１２（ａ）に、ＳＥＥＳ５細胞から調製された機能的肝前駆細胞の培養物を図１２（ｂ）に示す。いずれの培養物においてもコロニーが形成された。
続いて、アンモニアにより選択されたｉＰＳＣ－Ｏ細胞由来の機能的肝前駆細胞のコロニーを増殖培養し、改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養することにより、肝細胞へと分化誘導した。得られた肝細胞について、上記３と同様の手順により、α－フェトプロテイン、ＣＹＰ３Ａ４、カルバミルリン酸合成酵素１（ＣＰＳ１）、およびオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。また、アンモニア存在下での選択を行わずに同程度の期間にわたり継代培養したｉＰＳＣ－Ｏ細胞由来の機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた肝細胞を対照とした。
表７．ｑＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーセット（２）
Figure 0007191041000007
結果を図１３に示す。アンモニアにより選択された機能的肝前駆細胞を分化誘導して得られた肝細胞（ＮＨ３（＋））において、アンモニア代謝酵素であるＣＰＳ１およびＯＴＣの発現量がいずれも上昇していることが確認された（図１３（ｃ）および（ｄ））。また、アンモニアによる選択により、ＣＹＰ３Ａ４の発現量もさらに上昇することが確認された（図１３（ｂ））。以上の結果から、抗生物質による選択に加えてアンモニアによる選択を行うことにより、優れた薬物代謝能およびアンモニア代謝能を有する機能的肝細胞を調製することが可能であることが示された。
＜９．機能的小腸上皮前駆細胞の調製＞
Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．，２０１７；２（１）：ｅ８６４９２に記載の手順に従って、月経血由来のｉＰＳ細胞であるＥｄｏｍ－ｉＰＳ細胞（ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，２０１１；７（５）：ｅ１００２０８５，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００２０８５）から腸オルガノイドを調製した。３ヶ月経過した腸オルガノイドを、２ｍｇ／ｍｌまたは４００ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン存在下で２日間培養した。
ピューロマイシン処理前の腸オルガノイドを図１４に、処理後の腸オルガノイドを図１５に示す。２ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン（図１５（ａ））または４００ｍｇ／ｍｌのピューロマイシン（図１５（ｂ））存在下で培養することにより、薬物代謝能を有する機能的小腸上皮前駆細胞得られた。
Figure 0007191041000008

Claims (18)

  1. 薬物代謝能を有する肝前駆細胞もしくは肝細胞または薬物代謝能を有する小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法であって、肝前駆細胞もしくは肝細胞または小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を含む単離細胞集団を抗生物質の存在下で培養するステップを含み、
    前記単離細胞集団が、幹細胞から分化誘導されたものであり、
    前記肝前駆細胞もしくは肝細胞または前記小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞が、抗生物質耐性遺伝子を含んでおらず、
    前記抗生物質が、ピューロマイシン、ブラストサイジンＳ、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、フレオマイシンおよびフレオマイシンＤ１からなる群から選択される、方法。
  2. 前記幹細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ｉＰＳ細胞が健常者由来のものである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｉＰＳ細胞が薬物性肝障害患者または薬物性小腸障害患者由来のものである、請求項３に記載の方法。
  6. 前記抗生物質が０．１～１００μｇ／ｍｌのピューロマイシンである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記培養ステップが肝分化誘導因子の存在下で行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記肝分化誘導因子が、サイトカイン、細胞増殖因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤および細胞外基質からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記単離細胞集団をアンモニアの存在下で培養するステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により得られる、薬物代謝能を有する肝前駆細胞または肝細胞。
  11. 請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により得られる、薬物代謝能を有する小腸上皮前駆細胞または小腸上皮細胞。
  12. 請求項１～９のいずれか１項に記載の方法により得られる薬物代謝能を有する肝前駆細胞を含む実質的に均一な単離細胞集団であって、リファンピシンを含まない改変ＳＣＭ－６Ｆ８培地中で培養した場合に、前記薬物代謝能を有する肝前駆細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の発現量が、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株におけるその発現量と比較して少なくとも５倍増大している、単離細胞集団。
  13. 前記薬物代謝能を有する肝前駆細胞が、α－フェトプロテイン、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６からなる群から選択される少なくとも１つを、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）細胞株よりも高いレベルで発現している、請求項１２に記載の単離細胞集団。
  14. 前記薬物代謝能を有する肝前駆細胞が、ＣＤ４４陽性および／またはＥｐＣＡＭ陽性である、請求項１２または１３に記載の単離細胞集団。
  15. 不死化されている、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の単離細胞集団。
  16. 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＢＰ－０２５９１および／またはＢＰ－０２５９２として寄託された、薬物代謝能を有する肝前駆細胞。
  17. 請求項１２～１５のいずれか１項に記載の単離細胞集団を含んでなる、肝機能障害を治療するための医薬組成物。
  18. （１）請求項１２～１５のいずれか１項に記載の単離細胞集団または請求項１６に記載の薬物代謝能を有する肝前駆細胞を分化誘導して得られた薬物代謝能を有する肝細胞と試験化合物を接触させるステップと、
    （２）前記薬物代謝能を有する肝細胞の障害の程度を解析するステップと
    を含む、試験化合物の毒性評価方法。
JP2019562201A 2017-12-27 2018-12-27 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法 Active JP7191041B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017251725 2017-12-27
JP2017251725 2017-12-27
PCT/JP2018/048308 WO2019131938A1 (ja) 2017-12-27 2018-12-27 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2019131938A1 JPWO2019131938A1 (ja) 2021-08-26
JP7191041B2 true JP7191041B2 (ja) 2022-12-16

Family

ID=67067615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019562201A Active JP7191041B2 (ja) 2017-12-27 2018-12-27 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200339955A1 (ja)
JP (1) JP7191041B2 (ja)
CN (1) CN111727239B (ja)
WO (1) WO2019131938A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011016485A1 (ja) 2009-08-04 2011-02-10 国立大学法人岡山大学 ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法
WO2014168157A1 (ja) 2013-04-08 2014-10-16 独立行政法人医薬基盤研究所 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物
JP2015535524A (ja) 2012-11-12 2015-12-14 ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルクＲｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｈｂｖ及び／又はｈｄｖ感受性の細胞、細胞株及び非ヒト動物の開発
WO2016148216A1 (ja) 2015-03-18 2016-09-22 国立大学法人 東京大学 肝細胞及び肝非実質細胞、並びにそれらの調製方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9464275B2 (en) * 2008-08-21 2016-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ex vivo culture, proliferation and expansion of intestinal epithelium
CN103348001A (zh) * 2011-01-31 2013-10-09 独立行政法人国立国际医疗研究中心 源自多能干细胞的高功能性肝细胞及其制备方法、以及药物代谢毒性试验方法
JP6418761B2 (ja) * 2014-03-14 2018-11-07 国立大学法人東京工業大学 肝炎組織体、肝炎ウイルスの感染方法、肝炎組織体の製造方法、肝炎ウイルスの増殖方法、肝炎ワクチンの製造方法、スクリーニング方法、及びキット
JP2019134682A (ja) * 2016-06-01 2019-08-15 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 肝幹細胞様細胞の調製方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011016485A1 (ja) 2009-08-04 2011-02-10 国立大学法人岡山大学 ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法
JP2015535524A (ja) 2012-11-12 2015-12-14 ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルクＲｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｈｂｖ及び／又はｈｄｖ感受性の細胞、細胞株及び非ヒト動物の開発
WO2014168157A1 (ja) 2013-04-08 2014-10-16 独立行政法人医薬基盤研究所 肝幹前駆様細胞の培養方法及びその培養物
WO2016148216A1 (ja) 2015-03-18 2016-09-22 国立大学法人 東京大学 肝細胞及び肝非実質細胞、並びにそれらの調製方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INAMURA, M. et al., Efficient Generation of Hepatoblasts From Human ES cells and iPS Cells by Transient Overexpression of Homeobox Gene HEX, Molecular Therapy, 2011, 19(2):pp.400-407
IWAO, T. et al., Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Functional Enterocyte-like Cells Using a Simple Method, Drug Metab. Pharmacokinet., 2014, 29(1):44-51
KONDO, Y. et al., An Efficient Method for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Hepatocyte-like Cells Retaining Drugs Metabolizing Activity, Drug Metab. Pharmacokinet., 2014, 29(3):237-243
岩垂正矩, 培養肝細胞に対する薬物の作用II, 順天堂医学, 1980, 26(1):29-42

Also Published As

Publication number Publication date
US20200339955A1 (en) 2020-10-29
CN111727239B (zh) 2024-04-19
JPWO2019131938A1 (ja) 2021-08-26
CN111727239A (zh) 2020-09-29
WO2019131938A1 (ja) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11795436B2 (en) Derivation of hepatic stem cells and mature liver cell types and uses thereof
US11530385B2 (en) Hormone responsive tissue culture system and uses thereof
CN105658786B (zh) 用于生产成人肝脏祖细胞的方法
JP2020127423A (ja) 成体肝前駆細胞を作製する方法
US20180051258A1 (en) Ex vivo proliferation of epithelial cells
JP2017524377A (ja) 単一細胞由来オルガノイド
US10093895B2 (en) Hepatic stellate cell precursors and methods of isolating same
JP2008119002A (ja) 単球を起源に持つ、脱分化したプログラム可能な幹細胞およびそれらの製造と使用
WO2011009294A1 (zh) 通过诱导分化获得肝脏细胞、肝脏内胚层细胞和肝脏前体细胞的方法
JP2010500878A (ja) ポリマー膜を用いた幹細胞とフィーダー細胞の共培養方法
KR20210077698A (ko) 저분자 화합물에 의한 내배엽 조직 또는 기관 유래 세포로부터의 줄기/전구 세포의 제작 방법
KR20040099366A (ko) 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 이의생성 방법 및 용도
Petrakova et al. Comparative analysis reveals similarities between cultured submandibular salivary gland cells and liver progenitor cells
JPWO2011016485A1 (ja) ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法
JP7191041B2 (ja) 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法
Yoshizato Growth potential of adult hepatocytes in mammals: Highly replicative small hepatocytes with liver progenitor‐like traits
RU2631005C1 (ru) Способ культивирования клеток слюнной железы человека
JPWO2018225751A1 (ja) 大腸がん幹細胞の維持増幅方法、及び大腸がんオルガノイドの誘導方法
JP2017131194A (ja) 小型肝細胞の継代培養方法
KR20220095153A (ko) 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도
JPWO2020138208A1 (ja) 肝細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
AA64 Notification of invalidation of claim of internal priority (with term)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764

Effective date: 20201009

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210510

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210507

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220419

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220610

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220810

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220906

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221007

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221021

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221111

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221206

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7191041

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150