JP2015535524A - Ｈｂｖ及び／又はｈｄｖ感受性の細胞、細胞株及び非ヒト動物の開発 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）レセプター、並びにＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に感受性であり、免疫学的研究のため、かつ／又は薬物、ポストエントリー抑制因子及びホスト依存性因子のスクリーニングのために使用することができる細胞、細胞株及び非ヒト動物を開発するためのその使用に関する。本発明は、さらに、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用な化合物を同定するための該レセプターの使用に関する。

Description

本発明は、新規なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）レセプター、並びにＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性であり、免疫学的研究のため、かつ／又は薬物、ポストエントリー抑制因子（post-entry restriction factor）及びホスト依存性因子のスクリーニングのために使用することができる細胞、細胞株及び非ヒト動物を開発するためのその使用に関する。本発明は、さらに、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用な化合物の同定のための該レセプターの使用に関する。
ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、急性及び慢性肝感染を引き起こす。３億５千万人が持続的に感染している（Cornberg et al., Minerva Gastroenterol Dietol 2010, 56(4), 451-465）。慢性Ｂ型肝炎は、ワクチンが利用可能であるにもかかわらず大きな世界的健康問題のままであろう。治療法（ＩＦＮα及び５種のヌクレオシド類似体）は限られており、主として非治癒的である。
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科のメンバーである。ヘパドナウイルスは、ｐｇＲＮＡ中間体の逆転写により複製する最小のエンベロープＤＮＡウイルスである。ヌクレオカプシドは、構築の間にラージ（Ｌ）、ミドル（Ｍ）及びスモール（Ｓ）という名の３種のウイルスエンベロープタンパク質を獲得する。それらは、１つのオープンリーディングフレーム中にコードされ、膜アンカーに必要なＳドメインを共有する。Ｓドメインに加えて、Ｍは、アミノ酸５５個のＮ末端親水性伸長部（ｐｒｅＳ２）を含有し、一方でＬは、ｐｒｅＳ１という名のアミノ酸１０７、１１７又は１１８個（遺伝子型依存性）によってさらに伸張されている（Urban, Future Virol. 2008, 3(3), 253-264）。Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、肝細胞への侵入のためにＨＢＶエンベロープタンパク質を利用するサテライトウイルソイドである。Ｌのミリストイル化ｐｒｅＳ１ドメインは、ＨＢＶ及びＨＤＶの感染性に主要な役割を果たすことが公知である。
ヘパドナウイルスは、顕著な種特異性を示す。マウス及びラットがＨＢＶに抵抗性であるという事実は、１つ以上のエントリー因子の欠如又はポストエントリー抑制因子の存在のいずれかに原因があるとされてきた。非感受性種の肝細胞へのプラスミドコード型ＨＢＶゲノムの送達はビリオン分泌を促進するので、ホストの制約が初期感染事象に関係すると想定される。ＨＢＶの別の特性は、肝細胞に選択的にインビボ感染する効力である。種特異性及び異常な肝親和性がＨＢＶ感染の初期段階に、例えば特異的レセプター認識に関連するという仮定は、魅力的である。
現在のところ、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、初代ツパイ（tupeia belangeri）肝細胞（ＰＴＨ）及び分化したＨｅｐａＲＧ細胞だけが完全なＨＢＶ複製サイクルを支援する。後者は、ＤＭＳＯ処理後にＰＨＨ様細胞に分化可能な肝前駆細胞株である。初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）及び初代ラット肝細胞（ＰＲＨ）は、ＨＢＶに抵抗性である。したがって、マウス及びラットは、デノボＨＢＶ感染もウイルス拡散も支援しない。（免疫適格性の）小型動物モデルの欠如は、ＨＢＶ研究における主要な障壁であり、根底となる分子抑制因子の解明を要求している。そのことは、全長のＨＢＶゲノムの組み込み物を担持するＨＢＶトランスジェニックマウス又は免疫欠損ＰＨＨ移植ｕＰＡ／Ｓｃｉｄマウスのような代替システムの開発に繋がる。
本発明者らは、以前に、ＰＨＨ細胞及びＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ及びＨＤＶ感染を遮断するＨＢＶ Ｌタンパク質由来リポペプチドを同定した（Gripon et al., J Virol 2005, 79(3), 1613-1622; Schulze et al., J Virol 2010, 84(4), 1989-2000; 国際公開公報第２００９／０９２６１１Ａ１号）。それらのリポペプチドは、ＨＢＶのｐｒｅＳ１ドメインのＮ末端アミノ酸４７個（ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒ）に相当し、ミリスチン酸による天然改変を含む。細胞をＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ｍｙｒと共に予備インキュベーションすると感染が遮断されるので、それらのリポペプチドは、おそらくレセプター指向性であるが、しかしそのレセプターは今までのところ未知である。
したがって、これらのＨＢＶ Ｌタンパク質由来リポペプチドの結合を担うレセプターを同定することが、本発明の目的であった。
さらに、前記レセプターの発現により、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に感受性である細胞及び細胞株を開発することが、本発明の目的であった。
なお、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に感受性である非ヒトトランスジェニック動物を提供することが、本発明のさらなる目的であった。
次に、そのようなトランスジェニック細胞、細胞株及び動物は、免疫学的研究のために、並びに／又は薬物、ポストエントリー抑制因子及びホスト依存性因子のスクリーニングのために使用することができよう。
さらに、新たに同定されたレセプターは、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用なさらなる化合物を同定するために使用することができよう。
本発明の目的は、
（ａ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号２若しくは配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列、及び
一般式Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ［配列番号１１］（式中、Ｘは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＶａｌより選択される）を有するアミノ酸配列
を含むアミノ酸配列
を有するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）レセプターによって解決される。
本発明の目的は、また、
（ａ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号２若しくは配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ
配列番号１のアミノ酸１５８番に対応する位置にＧｌｙを有するか、若しくは
配列番号１のアミノ酸１５８及び１５９番に対応する位置に配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅを有するアミノ酸配列
を有するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）レセプターによって解決される。
配列番号１は、ヒトタウロコール酸ナトリウム共輸送体ポリペプチドＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１である。
本発明の好ましい態様では、「配列番号１によって表されるアミノ酸配列」は、配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％若しくは９９％同一であるか、又は配列番号１と同一であるアミノ酸配列を指す。
前記アミノ酸配列（ｂ）は、好ましくは２つの領域又はドメインを含む：
（１）ヒトＮＴＣＰのアミノ酸２６５〜２９１番
Figure 2015535524
（又は少なくとも９０、９１若しくは９２％の同一性を有する配列）を含む領域又はドメイン；
（２）一般式
Figure 2015535524
（式中、Ｘは、Ｋ、Ｒ及びＶより選択される）を有するアミノ酸配列を含む領域又はドメイン。
一態様では、前記アミノ酸配列（ｂ）の領域又はドメイン（２）は、（少なくとも）
− 一般式
Figure 2015535524
を有するアミノ酸配列中などの、配列番号１のアミノ酸１５８番に対応する位置にあるＧｌｙを含むか、又は；
− 一般式
Figure 2015535524
を有するアミノ酸配列中などの、配列番号１のアミノ酸１５８及び１５９番に対応する位置に配列Ｇｌｙ−Ｉｌｅを含む若しくは有する。
一態様では、前記アミノ酸配列（ｂ）は、４５０個を超えるアミノ酸を、好ましくは４００個を超えるアミノ酸を含まない。
一態様では、前記アミノ酸配列（ｂ）は、さらに、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ［配列番号１２］を含む。
この態様では、前記アミノ酸配列（ｂ）は、３種の領域又はドメインを含む：
（１）ヒトＮＴＣＰのアミノ酸２６５〜２９１番
Figure 2015535524
（又は少なくとも９０、９１若しくは９２％の同一性を有する配列）を含む領域又はドメイン；
（２）一般式
Figure 2015535524
（式中、Ｘは、Ｋ、Ｒ及びＶより選択される）
を有するアミノ酸配列を含む領域又はドメイン；
（３）アミノ酸配列
Figure 2015535524
を含む領域又はドメイン。
本発明の目的は、また、配列番号１及び配列番号３〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する上記と同義のＨＢＶ又はＨＤＶレセプターによって解決される。
本発明の目的は、また、上記と同義のＨＢＶ又はＨＤＶレセプターをコードする、単離された核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列によって解決される。
本発明の目的は、また、上記と同義の核酸配列を含むベクターによって解決される。
一態様では、前記ベクターは、好ましくはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群より選択されるウイルス導入ベクターである。レンチウイルスベクターは、安定な細胞株を産生させ、アデノウイルスベクター及びＡＡＶは、インビトロで初代肝細胞に、又はインビボでマウスにトランスダクションするのに有用であり、それらをＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に一過性に感受性にする。
本発明の目的は、また、人工的に導入された上記と同義のベクターを含むか又は上記と同義の核酸配列を含むホスト細胞によって解決される。
一態様では、用語「人工的に導入された」は、核酸配列が、非内因性プロモーター、例えば前記ホスト細胞中の前記核酸配列と自然には関連しないプロモーターの制御下で発現されるという事実を指す。
本発明による特に好ましい細胞は、ガン細胞株、幹細胞株及び初代肝細胞であり、ここで、好ましくは、該ガン細胞株は、肝細胞腫細胞株、例えばヒト、マウス又はラット肝細胞腫細胞株より選択される。好ましいヒト肝細胞腫細胞株には、ＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐａＲＧが含まれる。好ましいマウス肝細胞腫細胞株には、Ｈｅｐ５６．１Ｄ及びＨｅｐａ１−６が含まれる。一態様では、該初代肝細胞は、不死化されている。
本発明の目的は、また、１つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞又は細胞株であって、前記１つ以上の導入遺伝子の１つが、上記と同義の核酸配列であることによって、
前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性にするか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対する前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株の感受性を増加させるか、又は前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合可能にする、
トランスジェニック細胞又は細胞株によって解決される。
本発明の目的は、また、上記と同義の１つ以上のトランスジェニック細胞若しくは細胞株を含むか、又は１つ以上の導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、
前記１つ以上の導入遺伝子の１つが、上記と同義の核酸配列であることによって、
前記トランスジェニック動物をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性にするか、又は
ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対する前記トランスジェニック動物の感受性を増加させる、
非ヒトトランスジェニック動物によって解決される。
本発明による好ましい非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット並びにカニクイザル及びアカゲザルなどの非ヒト霊長類からなる群より選択される。特に好ましいトランスジェニック動物はマウスである。
一態様では、前記非ヒトトランスジェニック動物は、免疫適格性である。
本発明の目的は、また、上記と同義の非ヒトトランスジェニック動物から単離された肝細胞によって解決される。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性であるか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対して増加した感受性を有するか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができる細胞を産生させるための方法であって、
− ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に非感受性であるか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対して低感受性を有するか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができない細胞を提供するステップ；並びに
− 上記と同義の核酸配列又は上記と同義のベクターを前記細胞にトランスフェクション又はトランスダクションするステップ
を含む方法によって解決される。
一態様では、前記細胞は、ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に非感受性であるか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができない。
一態様では、該方法は、さらに、
− 前記細胞にトランスフェクション又はトランスダクションする前記ステップの前に、前記細胞に細胞周期停止剤又は分化誘導剤を添加するステップ
を含む。
一態様では、前記細胞周期停止剤又は分化誘導剤はＤＭＳＯであり、ここで好ましくは、ＤＭＳＯは、０．１〜５％（v/v）、より好ましくは０．５〜２．５％（v/v）の範囲内の終濃度で添加される。
一態様では、該方法は、さらに、
− 前記細胞の１つ以上の内因性遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップ
を含む。
一態様では、前記細胞の前記内因性遺伝子は、前記細胞の天然ＮＴＣＰ／ＳＣＬ１０Ａ１ポリペプチド（すなわち、前記細胞をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性にせず、かつ／又は前記細胞をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合させないヒトＮＴＣＰ／ＳＣＬ１０Ａ１ホモログ）をコードする遺伝子である。そのようなノックアウト又はノックダウンは、内因性（非ヒト）遺伝子の優性阻害効果を抑制することを助ける。
一態様では、前記細胞の１つ以上の内因性遺伝子の前記ノックアウト又はノックダウンは、ｓｈＲＮＡベクターにより達成される。一態様では、上記と同義の核酸配列及びｓｈＲＮＡの両方が単一のベクター中に含有される。
一態様では、前記方法は、さらに、
− 前記細胞を不死化させて前記細胞の安定細胞株を得るステップ
を含む。
一態様では、前記細胞は、肝細胞腫細胞株、例えばＨｕＨ７、ＨｅｐＧ２及び特にＨｅｐａＲＧなどのヒト肝細胞腫細胞株より選択される。別の態様では、前記細胞は初代肝細胞である。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に感受性である細胞を産生させる方法であって、
− ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に非感受性である細胞を提供するステップ；並びに
− 配列番号１のアミノ酸１９２〜２００番、好ましくはアミノ酸１９４〜１９７番に対応するアミノ酸を、配列番号１若しくは配列番号５のアミノ酸１９２〜２００番、好ましくはアミノ酸１９４〜１９７番に、かつ／又は
配列番号１のアミノ酸１５５〜１６５番、好ましくはアミノ酸１５６〜１６２番に対応するアミノ酸を、配列番号１、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸１５５〜１６５番、好ましくはアミノ酸１５６〜１６２番に置換するように配列番号１をコードするヒト遺伝子に対応する前記細胞の内因性遺伝子を相同組換えによって改変するステップ
を含む方法によって解決される。
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、本発明者らは、アミノ酸１５５〜１６５番に対応する領域、特にアミノ酸１５７及び１５８番（Ｇｌｙ）が、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶの結合に関与する一方で、アミノ酸１９２〜２００番に対応する領域、特にアミノ酸１９５〜１９７番（Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）が、（例えば膜融合などの細胞侵入ステップを媒介することによって）ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に関与すると信じている。
本発明の目的は、また、上記方法によって得られた細胞によって及び少なくとも１つのそのような細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物、例えばマウス（ｕＰＡ／Ｓｃｉｄマウスなど）によって解決される。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターとして
（ａ）配列番号１によって表されるアミノ酸配列、又は
（ｂ）配列番号２若しくは配列番号２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列、及び
一般式Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ［配列番号１１］（式中、Ｘは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＶａｌより選択される）を有するアミノ酸配列
を含むアミノ酸配列
を使用することによって解決される。
本発明の好ましい態様では、「配列番号１によって表されるアミノ酸配列」は、配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％若しくは９９％同一であるか、又は配列番号１と同一であるアミノ酸配列を指す。
上記と同義のアミノ酸配列（ｂ）の他の態様も使用することができる。
一態様では、前記使用は、
− 前記アミノ酸配列を発現する第１の細胞を、前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合することが公知の化合物に曝露し、前記細胞の応答を測定するステップ；
− 前記アミノ酸配列を発現する前記第１の細胞と同じ種類の第２の細胞を、前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合すると疑われる候補化合物に曝露し、前記第２の細胞の応答を測定するステップ；及び
− 前記細胞の応答と前記第２の細胞の応答を比較し、前記候補化合物が前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合するか否かをそのような比較に基づき判定するステップ
を含む。
前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合することが公知の化合物には、例えば国際公開公報第２００９／０９２６１１Ａ１号に定義されたような、ある種のＨＢＶ ｐｒｅＳ由来リポペプチドが含まれる。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、上記と同義のＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶレセプターに結合し、かつ／又は上記と同義のＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶレセプターへのＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶの結合を阻害する化合物を同定するステップを含む方法によって解決される。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に使用するための、上記と同義のＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶレセプターに結合し、かつ／又は上記と同義のＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶレセプターへのＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶの結合を阻害する化合物であって、ＨＢＶ Ｌタンパク質由来リポペプチド又は前記ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶレセプターの天然基質若しくは結合パートナー（例えばタウロコール酸ナトリウムなどの天然の胆汁酸塩）ではない化合物によって解決される。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置のための医薬の製造に上記と同義の化合物を使用することによって解決される。
本発明の目的は、また、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置の方法であって、それを必要とする被験体に上記と同義の化合物を投与することを含む方法によって解決される。
一態様では、前記化合物は、（ポリ）ペプチド、抗体、アプタマー、並びに小分子及びペプチド模倣化合物などの有機化合物からなる群より選択される。有用な有機化合物には、また、胆汁酸塩の誘導体が含まれ得る。
本明細書に使用される用語「小分子」は、非ポリマー性低分子量有機化合物を指すことを意味する。
一態様では、前記化合物は、配列番号１のアミノ酸１５５〜１６５番、好ましくはアミノ酸１５６〜１６２番におおよそ対応する部位で上記と同義のＨＢＶ及び／又はＨＤＶレセプターに結合する。
本発明の目的は、また、
免疫学的研究のため、かつ／又は薬物、ポストエントリー抑制因子若しくはホスト依存性因子のスクリーニングのために、
上記と同義のホスト細胞、又は
上記と同義のトランスジェニック細胞若しくは細胞株、又は
上記と同義の肝細胞、又は
上記と同義の細胞、又は
上記と同義の非ヒトトランスジェニック動物
を使用することによって解決される。
配列番号１〜１０は、以下の配列を指す：
Figure 2015535524
Figure 2015535524

Figure 2015535524
本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染に主要な役割を果たす新規なＨＢＶ ｐｒｅＳ１特異的レセプターであるヒトタウロコール酸ナトリウム共輸送体ポリペプチドＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１を同定した。このレセプター又はある種の非ヒト対応物の発現は、以前はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができなかった、かつ／又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に非感受性であった細胞を、ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合適格性であり、かつ／又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性である細胞にトランスフォーメーションさせる。ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に既に感受性である細胞（例えばＨｅｐａＲＧ細胞）は、ＮＴＣＰを発現すると顕著に増加した感受性を示す。
さらに、様々な種由来のＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１配列のアライメントは、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶの結合を担い、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に対する感受性を付与すると推定される特異的アミノ酸配列を明らかにした。ＨＢＶ及び／又はＨＤＶの結合適格性及び／又は感染感受性を付与又は増加させるために、これらの特異的アミノ酸配列を、例えば相同組換えによってＨＢＶ及び／又はＨＤＶの結合性又は感染感受性を示さない又は低く示している細胞／生物の内因性ＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１遺伝子に導入することが可能である。
これらの驚くべき知見は、免疫学的研究のため、かつ／又は薬物、ポストエントリー抑制因子及びホスト依存性因子のスクリーニングのために使用することができるＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感受性細胞、細胞株及び非ヒト動物の開発を可能にする。さらに、この重要なレセプターの同定は、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用である新規な化合物の同定を可能にするであろう。
ここで図面を参照する。
異なる種由来のタウロコール酸ナトリウム共輸送体ポリペプチドＮＴＣＰ／ＳＬＣ１０Ａ１の配列アライメントを示す図である。ペプチド結合及びＨＢＶ感染を支援している種（ヒト、チンパンジー、オランウータン、及びツパイ）、感染を支援せずにＨＢＶ−ｐｒｅＳ由来リポペプチドとの結合に適格である種（マウス、ラット、イヌ）及び結合することができず感染を支援しない種を示す。同一のアミノ酸を黄色で強調表示する。非保存型アミノ酸変化を網掛けせずに示す。非結合性の種であるカニクイザル及びブタでは異なるアミノ酸２個（１５７及び１５８番）（Meier et al., Hepatology 2012; Schieck et al., Hepatology 2012、印刷中）は、必須結合部位を示す（枠で強調表示）。 ＨｕＨ７細胞へのヒトＮＴＣＰ及びマウスＮＴＣＰの一過性トランスフェクションが、Ａｔｔｏ６４５ラベルＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチド（Myrcludex B、ＭｙｒＢと呼ばれる）の結合を付与することを示す図である。ＧＦＰをコードするプラスミド（左）、ヒトＮＴＣＰと一緒にＧＦＰをコードするプラスミド（中央）並びにＧＦＰ及びマウスＮＴＣＰをコードするプラスミドをＨｕＨ７細胞に一過性トランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、細胞を蛍光ラベル化ＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチドと共にインキュベーションし、洗浄し、蛍光顕微鏡法によって分析した。ＧＦＰ蛍光を左上欄に示し、細胞を左下欄に示し、ペプチド結合を右上欄に示し、トランスフェクション後の結合適格細胞のマージ画像を右下欄に示す。 ヒト又はマウスＮＴＣＰを発現している安定トランスダクションされたＨｅｐＧ２細胞がＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチドと特異的に結合することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞にｈＮＴＣＰ（上図）又はｍＮＴＣＰ（下図）を安定トランスダクションし、５００nM Ａｔｔｏラベル化野生型ＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチド（左図）又は必須ＨＢＶレセプター結合ドメイン中にアミノ酸交換を有する同濃度の各突然変異型ペプチド（右図）と共にインキュベーションした。ペプチドの結合を蛍光顕微鏡法によって視覚化した。 安定トランスダクションされたマウス肝細胞腫細胞（Ｈｅｐ５６．１Ｄ及びＨｅｐａ１−６）がＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチドと特異的に結合することを示す図である。ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ５６．１Ｄ及びＨｅｐａ１−６細胞にｈＮＴＣＰを安定トランスダクションし、５００nM Ａｔｔｏラベル化野生型ＨＢＶ ｐｒｅＳリポペプチドと共にインキュベーションした。ペプチドの結合を蛍光顕微鏡法によって視覚化した。 ヒトＮＴＣＰをトランスフェクションされたＨｕＨ７細胞がＨＤＶ感染に感受性であることを示す図である。ＨＤＶ含有ヒト血清を接種されたＨｕＨ７は、接種の４日後にＨＤＶ感染のどのマーカーも示さない（左図）。ヒトＮＴＣＰ発現プラスミドをトランスフェクション後に、ＨＤＶデルタ抗原特異的染色を観察した（右図）。 Ｈｅｐ５６．１Ｄマウス細胞株でのヒトＮＴＣＰの内因性発現が、それらの細胞をＨＤＶ感染に感受性にすることを示す図である。Ｈｅｐ５６．１Ｄマウス肝細胞腫細胞株単独（模擬）又はヒトＮＴＣＰ（ｈＮＴＣＰ）をトランスフェクションされたＨｅｐ５６．１Ｄ細胞株にＨＤＶ含有血清を感染させた（右図）。肝炎デルタ抗原を発現している細胞を感染の５日後に計数した。第２の対照として、ヒトＨｕＨ７細胞にヒトＮＴＣＰ又はマウスＮＴＣＰをトランスフェクションし、ＨＤＶを感染させた（左図）。 マウスではなくヒトＮＴＣＰのトランスフェクションがＨｕＨ７細胞を肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）感染に感受性にすることを示す図である。ＨｕＨ７細胞にマウスＮＴＣＰをコードする発現ベクター（左欄）又はヒトＮＴＣＰをコードする発現ベクター（２つの異なる倍率で右側４欄）を一過性トランスフェクションした。コンフルエンス時に細胞を、ＨＤＶを含有する患者の血清と共にインキュベーションした。感染の４日後に、核内デルタ抗原を検出する抗血清で細胞を染色した。 ＮＴＣＰ（ヒト）をトランスフェクションされたマウスＨｅｐ５６．１Ｄ細胞の肝炎デルタウイルス感染後の免疫蛍光分析を示す図である。Ｈｅｐ５６．１Ｄマウス肝細胞腫細胞株にマウスＮＴＣＰ（左側２欄）又はヒトＮＴＣＰ（ｈＮＴＣＰ）（２つの異なる倍率で右側４欄）をトランスフェクションし、ＨＤＶ含有血清を感染させ、肝炎デルタ抗原特異的抗体で染色した。 ヒトＮＴＣＰを安定発現しているＨｅｐＧ２細胞及びＨｕＨ７細胞が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に感受性になることを示す図である。安定的にｈＮＴＣＰをトランスダクションされたＨｅｐＧ２及びＨｕＨ７細胞株に、異なるＤＭＳＯ濃度でＨＢＶを接種して分化過程を誘導した。感染５日後に培地を収集し、ＨＢｅＡｇを定量した。感染についての特異的対照として、ＨＢＶ ｐｒｅＳ由来リポペプチド（ＭｙｒＢ）を使用した（左側バー）。ＨｅｐＧ２細胞に比べてＨｕＨ７細胞は、より少ない量のウイルス複製マーカーを産生し、抑制ステップの存在を示している。
これから以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、本発明を例示するつもりであり、その範囲を限定するつもりはない。
実施例
材料及び方法
ＮＴＣＰの配列
異なる種由来のＮＴＣＰのタンパク質配列をEnsemble（www.ensemble.org）から得た。
アライメント
ベクターＮＴＩ９．０（Invitrogen）を使用することによって異なる種由来のＮＴＣＰタンパク質のアライメントを行った。
プラスミド及びペプチド
ヒトＮＴＣＰ（ｈＮＴＣＰ）含有構築物（ｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ｈＮＴＣＰ）をOrigene（USA）から購入した。ｈＮＴＣＰ及びＮＴＣＰのオープンリーディングフレームをＰＣＲによって増幅し、一過性発現用（ｐＷＰＩ−ＧＦＰ）又は安定発現用（ｐＷＰＩｐｕｒｏ）のｐＷＰＩレンチウイルスベクターに挿入した。
ＨＢＶ感染阻害のために使用したペプチドは、以前にMyrcludex B（ＭｙｒＢ）と記述されていた。それは、ＨＢＶ Ｌタンパク質のアミノ酸４７個を含むＮ−ミリストイル化ペプチドである。ATTO 645及びATTO 488（ATTO-TEC, Germany）は、結合アッセイ法のためにペプチドをラベルするために使用される蛍光色素である。必須結合部位（アミノ酸１１〜１５番）中にアラニン置換を有する突然変異型ペプチドを、結合特異性の対照として使用した。
Figure 2015535524
レンチウイルスのトランスダクション
組換えレンチウイルスを産生するために、トランスフェクションの１日前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播いた。２９３Ｔ細胞に添加する前に、エンベロープタンパク質発現構築物ｐｃｚＶＳＶ−Ｇ ３μｇ、ＨＩＶ Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現構築物ｐＣＭＶΔＲ８．７４ ９μg及びレンチウイルスベクターｐＷＰＩ ９μgをポリエチレンイミン ２５μgと混合した。レンチウイルス偽粒子（pseudoparticle）を含有する上清を採集し、超遠心分離によって濃縮した。沈殿したレンチウイルス粒子を細胞培地中に再懸濁した。
一過性発現のために、４％ＰＥＧ８０００の存在下で肝細胞をレンチウイルスと共にインキュベーションした。一晩インキュベーション後に接種材料を取り出した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ターゲットタンパク質の発現のために３日間培養した。安定細胞株の樹立のために、２．５μg/ml ピューロマイシンを添加して、安定トランスダクションされた細胞を選択した。一般に、未トランスダクション細胞と比べて有意な形態差を示さずに肝細胞の９０％が選択から生存した。
細胞
本研究に４種の肝細胞を使用した。それらの２種はヒト由来であり（ＨｕＨ−７及びＨｅｐＧ２）、残りの２種はマウス由来である（Ｈｅｐ５６．１Ｄ及びＨｅｐａ１−６）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルス産生のために使用した。
蛍光ラベル化ペプチドを用いた結合アッセイ法
肝細胞の結合適格性を決定するために、一過性又は安定トランスダクションされた細胞を、細胞培地中２００〜５００nM 蛍光ラベル化ペプチドと共に１５〜６０分間インキュベーションした。次に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡法によって分析した。
ＨＢＶ及びＨＤＶの感染アッセイ法
ＨＢＶ粒子をＨｅｐＡＤ３８細胞から得た。ＨＢＶ又はＨＤＶ感染のために、４％ＰＥＧ８０００及びウイルス１０〜２０μl（１００倍ウイルス原液）を含有する培地を細胞に３７℃で一晩接種した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたＢ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｅＡｇ）の存在を、Abbott HBeAgアッセイ（Abbott Laboratories）によって判定した。抗ＨＤＶ血清でＨＤＶ感染細胞を免疫染色することによってＨＤＶ感染を判定した。
結果
ＨｅｐａＲＧ細胞株の発明は、ラージ（Ｌ）ウイルス表面タンパク質のＮ末端ｐｒｅＳ１ドメイン由来のペプチド性レセプターリガンドであって、ＨＢＶ感受性細胞に特異的に結合し、感染を効率的に遮断するペプチド性レセプターリガンドの同定に繋がった。ペプチド内の必須部位のマッピングから、脂質部分が必要であること及び保存された配列９−ＮＰＬＧＦＦＰ−１５［配列番号１４］の完全性が明らかとなった。マウス、ラット、イヌ、カニクイザル及びチンパンジーにおけるｐｒｅＳ／レセプター複合体の生体分布並びにそれぞれの種の初代肝細胞又は肝細胞腫細胞株における発現パターン及びターンオーバー動態を分析するために、放射性ラベル及び蛍光ラベルされたペプチド性リガンドを適用した。結果から、レセプターが、（ｉ）肝臓に特異的に発現され、（ｉｉ）ＨｅｐａＲＧ細胞の分化中に誘導されるようになり、（ｉｉ）ＰＭＨ及びＰＲＨの脱分化の際にダウンモデュレーションされ、（ｉｉｉ）形質膜内でほとんど側方移動できない細胞骨格との結合を示し、（ｉｖ）限定されたエンドサイトーシス速度を示し、（ｖ）専ら側底膜にソーティングされ、（ｖｉ）ブタ及びカニクイザルではなく、ヒト、マウス、ラット、イヌ、チンパンジーにおいて結合ドメインを保存していたことが明らかとなった。
これらの結果に基づき、本発明者らは、affimetrixに基づく差次的発現スクリーニングを行った。ＤＭＳＯ誘導分化を受けているＨｅｐａＲＧ細胞においてアップレギュレーションされた遺伝子を、ＤＭＳＯ不在下での脱分化時にＰＭＨにおいてダウンレギュレーションされた遺伝子から差し引いた。両方のスクリーニングの最も顕著なヒットを合わせ、上に定義された基準に供した。タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ、ＳＬＣ１０Ａ１）は、これらの基準に合致する唯一の適切な候補であった。内在性複数回膜貫通タンパク質であるＮＴＣＰは、分化した肝細胞の側底膜上に専ら発現される。このタンパク質は、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７及び多くの他の肝細胞腫細胞株上にほとんど発現されない。ＮＴＣＰは、ＤＭＳＯ処理を受けると、即座にＨｅｐａＲＧ細胞中にMyrcludex Bの飽和レベルに対応するレベルで誘導される。ＮＴＣＰは細胞骨格と結合し、低速で調節された（ＰＫＣ依存性）エンドサイトーシスを受ける。
感染及び結合適格性が異なる３群のホスト由来のＮＴＣＰの配列アライメントによって（図１）、本発明者らは、ＮＴＣＰの２種の重要なアミノ酸（アミノ酸１５７〜１５８番）を定義した。コンセンサス配列（ＫＧ）は、ほとんどの感受性で結合適格性なホストに存在する。対照的に、カニクイザル及びブタのような結合不適格なホストはこのモチーフを含有しない。
本発明者らは、ＨｕＨ−７細胞にｈＮＴＣＰ又はｍＮＴＣＰをトランスダクションし、ペプチド結合アッセイを行った（図２）。空のベクターを有する対照（模擬）に比べて、ヒト由来ＮＴＣＰ及びマウス由来ＮＴＣＰの両方がペプチドに結合する。結合したペプチドのこれらのシグナルは、ＮＴＣＰの発現レベルを示す共発現されたＧＦＰの量に相関する。
本発明者らは、さらに、ｈＮＴＣＰ又はｍＮＴＣＰを安定発現している４種の肝細胞（ＨｕＨ−７、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ５６．１Ｄ及びＨｅｐａ１−６）を作製した。これらの細胞は、突然変異型ペプチドではなく、野生型（ＷＴ）ペプチドと相同結合を示す（図３）。ｈＮＴＣＰ又はｍＮＴＣＰを発現しているマウス肝細胞腫細胞は、同様にペプチドに強い結合性を示す（図４）。
トランスフェクション効力は低いものの（約２０％）、ｈＮＴＣＰをトランスフェクションされたＨｕＨ−７細胞はＨＤＶによって感染され得る（図５）。ｈＮＴＣＰによって獲得されたＨＤＶ感染に対する感受性は、ヒト細胞及びマウス細胞の両方にも観察することができた（図６）。ｈＮＴＣＰの一過性トランスダクションは、ＨＤＶ感染に対するＨｕＨ−７細胞の感受性を付与するが（図７）、一方でペプチド結合性を支援しているｍＮＴＣＰタンパク質は、ＨＤＶ感染を支援しない。マウス細胞株Ｈｅｐ５６．１Ｄは、ｈＮＴＣＰをトランスダクション後にＨＤＶ感染を支援する（図８）。
ＮＴＣＰによって獲得されたＨＢＶ感染に対する感受性は、ｈＮＴＣＰを安定発現しているＨｅｐＧ２細胞において観察することができた（図９）。この感染を、ペプチドMyrcludex B（ＭｙｒＢ）によって特異的に阻害することができ、培養培地にＤＭＳＯを添加することによって強化することができた。ｈＮＴＣＰを発現しているＨｕＨ−７細胞は、ＨＢＶ感染を低レベルで支援するように見え、これは、ＨＢＶ感染を支援している未知の補因子がＨｅｐＧ２細胞に比べてＨｕＨ−７細胞では不在であることを示している。
明細書、特許請求の範囲、及び／又は添付の図面に開示される本発明の特徴は、別々に及びその任意の組み合わせの両方で、本発明をその様々な形態で実現するための材料であり得る。

Claims (24)

  1. （ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列である、配列番号１によって表されるアミノ酸配列、又は
    （ｂ）配列番号２若しくは配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、及び
    一般式Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（式中、Ｘは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＶａｌより選択される）を有するアミノ酸配列
    を含むアミノ酸配列
    を有するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）レセプター。
  2. 配列番号１及び配列番号３〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、
    かつ／又はアミノ酸配列（ｂ）が、さらに、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕを含む、請求項１記載のＨＢＶ又はＨＤＶレセプター。
  3. 請求項１又は２記載のＨＢＶ又はＨＤＶレセプターをコードする、単離された核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列。
  4. 請求項３記載の核酸配列を含むベクター。
  5. 好ましくはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群より選択されるウイルス導入ベクターである、請求項４記載のベクター。
  6. 人工的に導入された請求項４若しくは５記載のベクターを含むか又は請求項３記載の核酸配列を含むホスト細胞。
  7. ガン細胞株、幹細胞株及び初代肝細胞からなる群より選択される請求項６記載のホスト細胞であって、好ましくは前記ガン細胞株が、肝細胞腫細胞株より選択される、ホスト細胞。
  8. １つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞又は細胞株であって、前記１つ以上の導入遺伝子の１つが、請求項３記載の核酸配列であることによって、
    前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性にするか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対する前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株の感受性を増加させるか、又は前記トランスジェニック細胞若しくは細胞株をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合可能にする、
    トランスジェニック細胞又は細胞株。
  9. 請求項８記載の１つ以上のトランスジェニック細胞若しくは細胞株を含むか、又は１つ以上の導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記１つ以上の導入遺伝子の１つが、請求項３記載の核酸配列であることによって、
    前記トランスジェニック動物をＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性にするか、又は
    ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対する前記トランスジェニック動物の感受性を増加させる、
    非ヒトトランスジェニック動物。
  10. マウス、ラット、ウサギ、モルモット並びにカニクイザル及びアカゲザルなどの非ヒト霊長類からなる群より選択される、請求項９記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  11. 請求項９又は１０記載の非ヒトトランスジェニック動物から単離された肝細胞。
  12. ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に感受性であるか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対して増加した感受性を有するか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができる細胞を産生させるための方法であって、
    − ＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に非感受性であるか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶ感染に対して低感受性を有するか、又はＨＢＶ及び／若しくはＨＤＶと結合することができない細胞を提供するステップ；並びに
    − 請求項３記載の核酸配列又は請求項４若しくは５記載のベクターを前記細胞にトランスフェクション又はトランスダクションするステップ
    を含む方法。
  13. さらに、
    − 前記細胞にトランスフェクション又はトランスダクションする前記ステップの前に、前記細胞に細胞周期停止剤又は分化誘導剤を添加するステップ
    を含む、請求項１２記載の方法。
  14. さらに、
    − 前記細胞の１つ以上の内因性遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップ
    を含む、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. さらに、
    − 前記細胞を不死化させて前記細胞の安定細胞株を得るステップ
    を含む、請求項１２〜１４のいずれか記載の方法。
  16. − ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に非感受性である細胞を提供するステップ；並びに
    − 配列番号１のアミノ酸１９２〜２００番、好ましくはアミノ酸１９４〜１９７番に対応するアミノ酸を、配列番号１若しくは配列番号５のアミノ酸１９２〜２００番、好ましくはアミノ酸１９４〜１９７番に、かつ／又は
    配列番号１のアミノ酸１５５〜１６５番、好ましくはアミノ酸１５６〜１６２番に対応するアミノ酸を、配列番号１、配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸１５５〜１６５番、好ましくはアミノ酸１５６〜１６２番に置換するように配列番号１をコードするヒト遺伝子に対応する前記細胞の内因性遺伝子を相同組換えによって改変するステップ
    を含む、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染に感受性である細胞を産生させる方法。
  17. 請求項１２〜１６のいずれか記載の方法によって得られた細胞。
  18. 請求項１７記載の１種以上の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
  19. ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターとしての
    （ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列である、配列番号１によって表されるアミノ酸配列、又は
    （ｂ）配列番号２若しくは配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、及び
    一般式Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（式中、Ｘは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＶａｌより選択される）を有するアミノ酸配列
    を含むアミノ酸配列
    の使用。
  20. − 前記アミノ酸配列を発現する第１の細胞を、前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合することが公知の化合物に曝露し、前記細胞の応答を測定するステップ；
    − 前記アミノ酸配列を発現する前記第１の細胞と同じ種類の第２の細胞を、前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合することが疑われる候補化合物に曝露し、前記第２の細胞の応答を測定するステップ；及び
    − 前記細胞の応答と前記第２の細胞の応答を比較し、前記候補化合物が、前記ＨＢＶ又はＨＤＶに対するレセプターに結合するか否かをそのような比較に基づき判定するステップ
    を含む、請求項１９記載の使用。
  21. 請求項１若しくは２記載のＨＢＶ若しくはＨＤＶレセプターに結合し、かつ／又は請求項１若しくは２記載のＨＢＶ若しくはＨＤＶレセプターへのＨＢＶ若しくはＨＤＶの結合を阻害する化合物を同定するステップを含む、ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に有用な化合物を同定するための方法。
  22. ＨＢＶ及び／又はＨＤＶ感染の処置に使用するための、請求項１若しくは２記載のＨＢＶ若しくはＨＤＶレセプターに結合し、かつ／又は請求項１若しくは２記載のＨＢＶ若しくはＨＤＶレセプターへのＨＢＶ若しくはＨＤＶの結合を阻害する化合物であって、ＨＢＶ Ｌタンパク質由来リポペプチド又は前記ＨＢＶ若しくはＨＤＶレセプターの天然基質若しくは結合パートナーではない化合物。
  23. （ポリ）ペプチド、抗体、アプタマー並びに小分子及びペプチド模倣化合物などの有機化合物からなる群より選択される、請求項２２記載の化合物。
  24. 免疫学的研究のための、及び／又は薬物、ポストエントリー抑制因子若しくはホスト依存性因子のスクリーニングのための、
    請求項６若しくは７記載のホスト細胞、又は
    請求項８記載のトランスジェニック細胞若しくは細胞株、又は
    請求項１１記載の肝細胞、又は
    請求項１７記載の細胞、又は
    請求項９、１０及び１８のいずれか記載の非ヒトトランスジェニック動物
    の使用。
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