CN104955837A - Hbv和/或hdv易感细胞、细胞系和非人动物的开发 - Google Patents
Hbv和/或hdv易感细胞、细胞系和非人动物的开发 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104955837A CN104955837A CN201380059075.0A CN201380059075A CN104955837A CN 104955837 A CN104955837 A CN 104955837A CN 201380059075 A CN201380059075 A CN 201380059075A CN 104955837 A CN104955837 A CN 104955837A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hbv
- cell
- hdv
- seq
- aminoacid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 134
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims abstract description 129
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 claims abstract description 127
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 140
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 50
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 8
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 7
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 5
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 4
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- -1 antibody Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 claims description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 108091006611 SLC10A1 Proteins 0.000 description 50
- 102100021988 Sodium/bile acid cotransporter Human genes 0.000 description 49
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 11
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108010003524 sodium-bile acid cotransporter Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 5
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 4
- 241000288667 Tupaia glis Species 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000488893 Tupeia Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000034998 susceptibility to hepatitis B virus Diseases 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2730/10152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/10011—Arenaviridae
- C12N2760/10111—Deltavirus, e.g. hepatitis delta virus
- C12N2760/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/10011—Arenaviridae
- C12N2760/10111—Deltavirus, e.g. hepatitis delta virus
- C12N2760/10151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2760/10152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
- C12N2999/005—Biological teaching, e.g. a link between protein and disease, new virus causing pandemic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
- G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus
- G01N2333/188—Hepatitis G; Hepatitis NANBNCNDNE
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及新颖乙型肝炎病毒(HBV)和/或丁型肝炎病毒(HDV)受体及其用于开发易受HBV和/或HDV感染且可用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子和宿主依赖因子的细胞、细胞系和非人动物的用途。其进一步涉及所述受体用于鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的化合物的用途。
Description
本发明涉及新颖乙型肝炎病毒(HBV)和/或丁型肝炎病毒(HDV)受体及其用于开发易受HBV和/或HDV感染且可用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子和宿主依赖因子的细胞、细胞系和非人动物的用途。其进一步涉及所述受体用于鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的化合物的用途。
人乙型肝炎病毒(HBV)引起急性和慢性肝脏感染。3.5亿人持续感染(Cornberg等人, Minerva Gastroenterol Dietol 2010, 56(4), 451-465)。慢性乙型肝炎仍将是一个主要的全球健康问题，尽管有疫苗可用。治疗(IFNα和五种核苷类似物)是有限的，且主要是非治愈性的。
HBV是嗜肝DNA病毒科的成员。嗜肝DNA病毒是最小的包膜DNA病毒，其经由pgRNA中间体的逆转录复制。在装配过程中，核衣壳获取称为大(L)、中(M)和小(S)的三种病毒包膜蛋白。它们被编码在一个开放阅读框中，并且共享对于膜锚定所需的S结构域。除了S-结构域以外，M含有55个氨基酸的N端亲水性延伸(preS2)，而L进一步延伸107、117或118个氨基酸(基因型依赖性)，被称为preS1 (Urban, Future Virol. 2008, 3(3), 253-264)。丁型肝炎病毒(HDV)是利用HBV包膜蛋白用于进入肝细胞的卫星拟病毒。已知L的肉豆蔻酰化的preS1-结构域在HBV和HDV感染性中发挥关键作用。
嗜肝DNA病毒显示显著的物种特异性。小鼠和大鼠对于HBV是抗感染的事实已归因于缺乏一种或多种进入因子或存在进入后限制因子(post-entry restriction factor)。由于将质粒编码的HBV-基因组递送至非易感物种的肝细胞促进病毒体分泌，所以假设宿主约束条件与早期感染事件相关。HBV的另一个特点是在体内选择性感染肝细胞的效力。物种特异性和非凡的肝脏向性与HBV感染的早期步骤(例如，特异性受体识别)相关的假说是有吸引力的。
目前，只有原代人(PHH)、原代缅甸树鼩(tupeia belangeri)(PTH)肝细胞和分化的HepaRG细胞支持完整的HBV复制周期。后者是DMSO处理后能够分化成PHH样细胞的肝祖细胞系。原代小鼠(PMH)和原代大鼠肝细胞(PRH)对于HBV是抗感染的。因此，小鼠和大鼠既不支持从头HBV感染，也不支持病毒传播。(具有免疫能力的)小动物模型的缺乏是HBV研究的一个主要障碍，所述HBV研究要求阐明潜在的分子限制因子。其导致开发替代系统，如具有超长(over-length) HBV基因组的整合物的HBV转基因小鼠，或免疫缺陷的PHH移植的uPA/Scid小鼠。
本发明人先前已经鉴定了HBV L-蛋白衍生的脂肽，其阻断HBV和HDV感染PHH和HepaRG细胞(Gripon等人, J Virol 2005, 79(3), 1613-1622; Schulze等人, J Virol 2010, 84(4), 1989-2000; WO 2009/092611 A1)。它们代表了HBV的preS1-结构域的N-端47个氨基酸(HBVpreS/2-48myr)，并且包括天然存在的肉豆蔻酸修饰。由于细胞与HBVpreS/2-48myr预孵育阻断感染，因此它们据推测针对受体(address a receptor)，然而，所述受体是迄今未知的。
因此，本发明的一个目标是鉴定负责这些HBV L-蛋白衍生脂肽的结合的受体。
本发明的一个进一步目标是开发通过表达所述受体易受HBV和/或HDV感染的细胞和细胞系。
本发明的又一个进一步目标是提供易受HBV和/或HDV感染的非人转基因动物。
此类转基因细胞、细胞系和动物然后可用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子和宿主依赖因子(host dependency factor)。此外，新鉴定的受体可用于鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的进一步化合物。
本发明的目标通过乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)受体解决，所述乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)受体具有
(a) SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列，或
(b) 包含以下的氨基酸序列，
SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2至少90％、优选至少91％、更优选至少92％相同的氨基酸序列，和
具有通式Pro-Tyr-X-Gly-Ile [SEQ ID NO:11]的氨基酸序列，其中X选自Lys、Arg和Val。
本发明的目标还通过乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)受体解决，所述乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)受体具有
(a) SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列，或
(b) 包含以下的氨基酸序列，
SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2至少90％、优选至少91％、更优选至少92％相同的氨基酸序列，和
在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸158的位置具有Gly或在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸158和159的位置具有序列Gly-Ile。
SEQ ID NO:1是人牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP/SLC10A1。
在本发明的优选实施方案中，“SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列”是指与SEQ ID NO:1至少90％、优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95%或99%相同或与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。
所述氨基酸序列(b)优选包含两个区域或结构域：
(1) 包含人NTCP的氨基酸265至291(或具有至少90、91或92％同一性的序列)的区域或结构域
(2) 包含具有以下通式的氨基酸序列的区域或结构域
其中X选自K、R和V。
在一个实施方案中，所述氨基酸序列(b)的区域或结构域(2)包含(至少)
- Gly，其在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸158的位置，
诸如在具有通式PYXGI [SEQ ID NO.:11]的氨基酸序列中；
或
- 包含或具有在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸158和159的位置的序列Gly-Ile，
诸如在具有通式PYXGI [SEQ ID NO.:11]的氨基酸序列中。
在一个实施方案中，所述氨基酸序列(b)不包含多于450个氨基酸，优选不多于400个氨基酸。
在一个实施方案中，所述氨基酸序列(b)进一步包含氨基酸序列。
在该实施方案中，所述氨基酸序列(b)包含三个区域或结构域：
(1) 包含人NTCP的氨基酸265至291(或具有至少90、91或92％同一性的序列)的区域或结构域
(2) 包含具有以下通式的氨基酸序列的区域或结构域
其中X选自K、R和V。
(3) 包含以下氨基酸序列的区域或结构域
。
本发明的目标还通过如上定义的具有选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3至8的氨基酸序列的HBV或HDV受体来解决。
本发明的目标还通过编码如上定义的HBV或HDV受体的分离的核酸序列、优选DNA序列来解决。
本发明的目标还通过包含如上定义的核酸序列的载体来解决。
在一个实施方案中，所述载体是病毒转移载体，优选选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。慢病毒载体允许产生稳定细胞系，腺病毒载体和AAV可用于体外转导原代肝细胞或体内转导小鼠，并且使它们瞬时易受HBV和/或HDV感染。
本发明的目标还通过包含如上定义的载体或包含如上定义的核酸序列的宿主细胞来解决，所述载体或核酸序列已被人为引入所述宿主细胞。
在一个实施方案中，术语“人为引入”是指这样的事实，所述核酸序列在非内源性启动子，例如天然不与所述宿主细胞中的所述核酸序列联系的启动子的控制下表达。
根据本发明的特别优选的细胞是癌细胞系、干细胞系和原代肝细胞，其中，优选地，所述癌细胞系选自肝细胞瘤细胞系，例如人、小鼠或大鼠肝细胞瘤细胞系。优选的人肝细胞瘤细胞系包括HuH7、HepG2和HepaRG。优选的小鼠肝细胞瘤细胞系包括Hep56.1D和Hepa1-6。在一个实施方案中，将所述原代肝细胞永生化。
本发明的目标还通过包含一种或多种转基因的转基因细胞或细胞系来解决，其中所述一种或多种转基因之一是如上定义的核酸序列，从而
使所述转基因细胞或细胞系易受HBV和/或HDV感染或
增加所述转基因细胞或细胞系对HBV和/或HDV感染的易感性，或者允许所述转基因细胞或细胞系结合HBV和/或HDV。
本发明的目标还通过包含如上定义的一种或多种转基因细胞或细胞系或包含一种或多种转基因的非人转基因动物来解决，其中所述一种或多种转基因之一是如上定义的核酸序列，从而
使所述转基因动物易受HBV和/或HDV感染或
增加所述转基因动物对HBV和/或HDV感染的易感性。
根据本发明的优选的非人转基因动物选自小鼠、大鼠、兔、豚鼠和非人灵长类动物，诸如食蟹猴和恒河猴。特别优选的转基因动物是小鼠。
在一个实施方案中，所述非人转基因动物具有免疫能力。
本发明的目标还通过从如上定义的非人转基因动物分离的肝细胞来解决。
本发明的目标还通过用于产生细胞的方法来解决，所述细胞易受HBV和/或HDV感染，或具有对HBV和/或HDV感染的增加的易感性，或者能够结合HBV和/或HDV，所述方法包括以下步骤
- 提供细胞，所述细胞不易受HBV和/或HDV感染，或者具有对HBV和/或HDV感染的低易感性，或者不能结合HBV和/或HDV；和
- 用如上定义的核酸序列或用如上定义的载体转染或转导所述细胞。
在一个实施方案中，所述细胞不易受HBV和/或HDV感染或不能结合HBV和/或HDV。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤
- 在所述转染或转导所述细胞的步骤之前，将细胞周期停滞或分化诱导剂添加至所述细胞。
在一个实施方案中，所述细胞周期停滞或分化诱导剂是DMSO，其中，优选地，添加DMSO至0.1至5% (v/v)、更优选0.5至2.5% (v/v)的范围中的最终浓度。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤
- 敲除或敲低所述细胞的一个或多个内源基因。
在一个实施方案中，所述细胞的所述内源基因是编码所述细胞的天然NTCP/SCL10A1多肽(即人NTCP/SCL10A1的同源物，其无法使所述细胞易受HBV和/或HDV感染和/或无法允许所述细胞结合HBV和/或HDV)的基因。此类敲除或敲低有助于防止内源(非人)基因的显性负效应。
在一个实施方案中，所述敲除或敲低所述细胞的一个或多个内源基因借助shRNA-载体来实现。在一个实施方案中，如上定义的核酸序列和shRNA两者都包含在单一载体中。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤
- 将所述细胞永生化，以获得所述细胞的稳定的细胞系。
在一个实施方案中，所述细胞选自肝细胞瘤细胞系，例如人肝细胞瘤细胞系，诸如HuH7、HepG2和，特别是，HepaRG。在另一个实施方案中，所述细胞是原代肝细胞。
本发明的目标还通过产生易受HBV和/或HDV感染的细胞的方法来解决，所述方法包括以下步骤
- 提供不易受HBV和/或HDV感染的细胞；和
- 通过同源重组修饰所述细胞的对应于编码SEQ ID NO:1的人基因的内源基因，以便
用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸192至200、优选氨基酸194至197替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸192至200、优选氨基酸194至197的氨基酸，和/或
用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸155至165、优选氨基酸156至162替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸155至165、优选氨基酸156至162的氨基酸。
不希望受某种理论束缚，本发明人相信对应于氨基酸155至165、且特别是氨基酸157和158 (Gly)的区域参与HBV和/或HDV的结合，而对应于氨基酸192至200、且特别是氨基酸195至197 (Ile-Leu-Leu)的区域参与HBV和/或HDV感染(例如通过介导细胞进入步骤，诸如膜融合)。
本发明的目标还通过由上述方法获得的细胞和通过包含至少一种此类细胞的非人转基因动物，例如小鼠(诸如uPA/Scid小鼠)来解决。
本发明的目标还通过以下作为HBV或HDV的受体的用途来解决
(a) SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列，或
(b) 包含以下的氨基酸序列，
SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2至少90％、优选至少91％、更优选至少92％相同的氨基酸序列，和
具有通式Pro-Tyr-X-Gly-Ile [SEQ ID NO:11]的氨基酸序列，其中X选自Lys、Arg和Val。
在本发明的优选实施方案中，“SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列”是指与SEQ ID NO:1至少90％、优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少95%或99%相同或与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。
也可以使用如上定义的氨基酸序列(b)的其他实施方案。
在一个实施方案中，所述用途包括以下步骤
- 将表达所述氨基酸序列的第一细胞暴露于已知结合所述HBV或HDV的受体的化合物且测量所述细胞的响应；
- 将表达所述氨基酸序列的所述第一细胞的相同类型的第二细胞暴露于怀疑结合所述HBV或HDV的受体的候选化合物且测量所述第二细胞的响应；和
- 将所述细胞的响应和所述第二细胞的响应进行比较，且基于此类比较确定所述候选化合物是否结合所述HBV或HDV的受体。
已知结合所述HBV或HDV的受体的化合物包括某些HBV preS-衍生脂肽，如，例如，WO 2009/092611 A1中所定义。
本发明的目标还通过用于鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的化合物的方法来解决，所述方法包括鉴定结合如上定义的HBV和/或HDV受体和/或抑制HBV和/或HDV与如上定义的HBV和/或HDV受体的结合的化合物的步骤。
本发明的目标还通过用于治疗HBV和/或HDV感染的结合如上定义的HBV和/或HDV受体和/或抑制HBV和/或HDV与如上定义的HBV和/或HDV受体的结合的化合物来解决，其中所述化合物不是HBV L-蛋白衍生脂肽或所述HBV和/或HDV受体的天然底物或结合伴侣(例如天然存在的胆汁盐，诸如牛磺胆酸钠)。
本发明的目标还通过如上定义的化合物在制备用于治疗HBV和/或HDV感染的药物中的用途来解决。
本发明的目标还通过治疗HBV和/或HDV感染的方法来解决，所述方法包括将如上定义的化合物施用于有需要的主体。
在一个实施方案中，所述化合物选自(多)肽、抗体、适配体和有机化合物，诸如小分子和拟肽化合物(peptidomimetic compound)。有用的有机化合物也可包括胆汁盐的衍生物。
如本文所使用的术语“小分子”意指非聚合的低分子量有机化合物。
在一个实施方案中，所述化合物在约对应于SEQ ID NO:1的氨基酸155至165、优选氨基酸156至162的位点结合如上定义的HBV和/或HDV受体。
本发明的目标还通过以下用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子或宿主依赖因子的用途来解决
如上定义的宿主细胞，或
如上定义的转基因细胞或细胞系，或
如上定义的肝细胞，或
如上定义的细胞，或
如上定义的非人转基因动物。
SEQ ID NO:1至10是指以下序列：
SEQ ID NO:1 (人NTCP)
SEQ ID NO:2 (人NTCP的氨基酸265至291)
SEQ ID NO:3 (黑猩猩NTCP)
SEQ ID NO:4 (猩猩NTCP)
SEQ ID NO:5 (缅甸树鼩/树鼩NTCP)
SEQ ID NO:6 (小鼠NTCP)
SEQ ID NO:7 (大鼠NTCP)
SEQ ID NO:8 (狗NTCP)
SEQ ID NO:9 (食蟹猴NTCP)
SEQ ID NO:10 (猪NTCP)
本发明人已经鉴定了在乙型肝炎病毒(HBV)和/或丁型肝炎病毒(HDV)感染中发挥关键作用的新颖HBV preS1-特异性受体，人牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP/SLC10A1。该受体或某些非人对应物的表达允许将先前不能结合HBV和/或HDV和/或不易受HBV和/或HDV感染的细胞转化为能够结合HBV和/或HDV和/或易受HBV和/或HDV感染的细胞。已经易受HBV和/或HDV感染的细胞(例如，HepaRG细胞)显示NTCP表达后显著增加的易感性。
此外，来自各种物种的NTCP/SLC10A1序列的比对揭示推测负责HBV和/或HDV结合且赋予对HBV和/或HDV感染的易感性的特定氨基酸序列。可以例如通过同源重组将这些特定氨基酸序列引入不表现HBV和/或HDV结合或感染易感性或表现出低HBV和/或HDV结合或感染易感性的细胞/生物体的内源NTCP/SLC10A1基因中，以便赋予或增加HBV和/或HDV结合能力和/或感染易感性。
这些令人惊讶的发现允许开发HBV和/或HDV易感细胞、细胞系和非人动物，其可用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子和宿主依赖因子。此外，该重要受体的鉴定将允许鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的新颖化合物。
现在参考附图，其中
图1显示来自不同物种的牛磺胆酸钠协同转运多肽NTCP/SLC10A1的序列比对。描绘了支持肽结合和HBV感染的物种(人、黑猩猩、猩猩、缅甸树鼩)、有能力结合HBV-preS-衍生脂肽、但不支持感染的物种(小鼠、大鼠、狗)和不能结合且不支持感染的物种。相同的氨基酸以黄色突出显示。非保守的氨基酸改变无阴影显示。在非结合物种食蟹猴和猪中不同的两个氨基酸(157和158)(Meier等人, Hepatology 2012; Schieck等人, Hepatology 2012，出版中)表明必需结合位点(通过框突出显示)；
图2显示将人NTCP和小鼠NTCP瞬时转染入HuH7细胞中赋予Atto645-标记的HBV preS-脂肽(称为Myrcludex B, MyrB)的结合。HuH7细胞用编码GFP的质粒(左)、编码GFP连同人NTCP的质粒(中)和编码GFP和小鼠NTCP的质粒瞬时转染。转染后3天，将细胞与荧光标记的HBV preS-脂肽孵育、洗涤且通过荧光显微镜分析。GFP荧光显示在左上角，细胞显示在左下角，肽结合显示在右上角小图；转染的且能够结合的细胞的合并图显示在右下角小图；
图3显示表达人或小鼠NTCP的稳定转导的HepG2细胞特异性结合HBV preS-脂肽。HepG2细胞用hNTCP(上图)或mNTCP(下图)稳定转导，且与500 nM Atto-标记的野生型HBV preS-脂肽(左图)或相同浓度的在必需HBV受体结合结构域中具有氨基酸改变的相应突变体肽(右图)孵育。肽的结合通过荧光显微镜可视化；
图4显示稳定转导的小鼠肝细胞瘤细胞(Hep56.1D和Hepa1-6)特异性结合HBV preS-脂肽。HepG2、Hep56.1D和Hepa1-6细胞用hNTCP稳定转导，且与500 nM Atto-标记的野生型HBV preS-脂肽孵育。肽的结合通过荧光显微镜可视化；
图5显示用人NTCP转染的HuH7细胞易受HDV感染。含有HDV的人血清接种的HuH7在接种后4天不显示HDV感染的任何标志物(左图)。在用人NTCP表达质粒转染后，观察到HDV δ抗原特异性染色(右图)；
图6显示Hep56.1D小鼠细胞系中人NTCP的内源表达使得它们易受HDV感染。单独(模拟)或用人NTCP(hNTCP)转染的Hep56.1D小鼠肝细胞瘤细胞系用含有HDV的血清感染(右图)。在感染后5天计数表达丁型肝炎抗原的细胞。作为第二对照，人HuH7细胞用人NTCP或小鼠NTCP转染且用HDV感染(左图)；
图7显示人NTCP、但非小鼠NTCP的转染使得HuH7细胞易受丁型肝炎病毒(HDV)感染。HuH7细胞用编码小鼠NTCP(左小图)或人NTCP(右侧4个小图，2种不同的放大率)的表达载体瞬时转染。在汇合时，将细胞与含有HDV的患者血清孵育。感染后4天，细胞用检测核δ抗原的抗血清染色；
图8显示NTCP(人)转染的小鼠Hep56.1D细胞在用丁型肝炎病毒感染后的免疫荧光分析。Hep56.1D小鼠肝细胞瘤细胞系用小鼠NTCP(左侧的2个小图)或人NTCP (hNTCP)(右侧的4个小图，2种不同的放大率)转染，用含有HDV的血清感染，且用丁型肝炎抗原特异性抗体染色。
图9显示稳定表达人NTCP的HepG2和HuH7细胞变得易受乙型肝炎病毒(HBV)感染。hNTCP稳定转导的HepG2和HuH7细胞系在不同浓度的诱导分化过程的DMSO下用HBV接种。在感染后第5天收集培养基且定量HBeAg。作为感染的特定对照，使用HBV preS-衍生脂肽(MyrB)(左侧柱)。与HepG2细胞相比，HuH7细胞产生较少量的病毒复制标志物，其指示限制步骤的存在。
本发明现在借助以下实施例进一步描述，所述实施例意在说明本发明，而不是限制其范围。
实施例
材料与方法
NTCP的序列
来自不同物种的NTCP的蛋白序列从Ensemble (www.ensemble.org)获得。
比对
来自不同物种的NTCP的蛋白的比对通过使用Vector NTI 9.0 (Invitrogen)生成。
质粒和肽
含有人NTCP (hNTCP)的构建体(pCMV6-XL4-hNTCP)购自Origene (USA)。hNTCP和NTCP的开放阅读框通过PCR扩增，并且插入用于瞬时(pWPI-GFP)或稳定表达(pWPI-puro)的pWPI慢病毒载体。
用于抑制HBV感染的肽先前已经描述为Myrcludex B (MyrB)。它是N-肉豆蔻酰化的肽，其包含HBV L蛋白的47个氨基酸。ATTO 645和ATTO 488 (ATTO-TEC, Germany)是用于标记用于结合测定的肽的荧光染料。在必需结合位点(氨基酸11-15)中具有丙氨酸取代的突变体肽被用作结合特异性的对照。
慢病毒转导
为了产生重组慢病毒，在转染前一天接种HEK 293T细胞。将3μg包膜蛋白表达构建体pczVSV-G、9μg HIV Gag-Pol表达构建体pCMVΔR8.74和9μg慢病毒载体pWPI与25μg聚乙烯亚胺混合，然后添加至293T细胞。将含有慢病毒假颗粒(pseudoparticles)的上清液收获，且通过超速离心浓缩。将沉淀的慢病毒颗粒重新悬浮在细胞培养基中。
对于瞬时表达，将肝细胞与慢病毒在4% PEG8000存在的情况下孵育。过夜孵育后去除接种物。将细胞用PBS洗涤一次，并且培养3天，用于表达目标蛋白。为了建立稳定的细胞系，添加2.5μg/ml嘌呤霉素以选择稳定转导的细胞。通常，与未转导的细胞相比，90％肝细胞在选择后存活，而没有显著形态差异。
细胞
在该工作中使用四种肝细胞。它们中的两种衍生自人(HuH-7和HepG2)，且另外两种衍生自小鼠(Hep56.1D和Hepa1-6)。HEK 293T细胞用于慢病毒产生。
使用荧光标记的肽的结合测定
为了测定肝细胞的结合能力，将瞬时或稳定转导的细胞与200-500 nM荧光标记的肽在细胞培养基中孵育15-60分钟。然后将细胞用PBS洗涤3次，并且通过荧光显微镜分析。
HBV和HDV感染测定
HBV颗粒从HepAD38细胞获得。对于HBV或HDV感染，将细胞用含有4% PEG 8000和10-20 μl病毒(100x病毒储液)的培养基在37℃接种过夜。此后，将细胞用PBS洗涤三次，并且进一步培养5天。分泌到培养上清液中的乙型肝炎病毒抗原(HBeAg)的存在通过Abbott HBeAg测定(Abbott Laboratories)确定。HDV感染通过用抗HDV血清免疫染色HDV感染的细胞来确定。
结果
HepaRG细胞系的发明导致衍生自大(L)病毒表面蛋白的N端preS1结构域的肽受体配体的鉴定，其特异性结合至HBV-易感细胞且有效地阻断感染。肽内的必需位点的定位揭示脂质部分的要求和保守序列9-NPLGFFP-15 [SEQ ID NO:14]的完整性。放射性和荧光标记肽配体，其应用于分析preS/受体复合物小鼠、大鼠、狗、食蟹猴和黑猩猩的生物分布和各物种的原代肝细胞或肝细胞瘤细胞系的表达模式和周转动力学。结果揭示，所述受体：(i) 在肝脏中特异性表达，(ii) 在HepaRG细胞的分化过程中变得受诱导，(ii) 在PMH和PRH的去分化后下调，(iii) 显示与细胞骨架的关联，允许质膜内的较少横向移动，(iv) 显示内吞作用的有限速率，(v) 专门分选至基底外侧膜，(vi) 在人、小鼠、大鼠、狗、黑猩猩，但不是猪和食蟹猴中的保守结合结构域。
基于这些结果，本发明人进行基于差异affimetrix的表达筛选。将经历DMSO诱导分化的HepaRG细胞中的上调基因从在DMSO不存在的情况下的去分化过程中的PMH中的下调基因中减去。将两次筛选中最突出的命中组合，并且经受上述定义的标准。牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP，SLC10A1)是唯一符合这些标准的适当候选： NTCP，整合的多跨膜蛋白在分化肝细胞的基底外侧膜上排他表达。它几乎不在HepG2、HuH7和许多其它肝细胞瘤细胞系上表达。在以对应于Myrcludex B的饱和水平的水平的DMSO处理后，NTCP在HepaRG细胞中被立即诱导。它与细胞骨架关联，并且经历缓慢和受调节(PKC依赖性)的内吞作用。
通过来自三组宿主的NTCP(其感染和结合能力不同)的序列比对(图1)，本发明人定义了NTCP的两个关键氨基酸(氨基酸157至158)。共有序列(KG)存在于最易感和能够结合的宿主中。相反，不能结合的宿主如食蟹猴和猪不含有该基序。
本发明人将hNTCP或mNTCP转导至HuH-7细胞中，并且进行肽结合测定(图2)。与具有空载体的对照(模拟)相比，人和小鼠衍生的NTCP两者都结合至肽。结合的肽的这些信号与共表达的GFP的量相关，这表明NTCP的表达水平。
本发明人进一步生成稳定表达hNTCP或mNTCP的四种肝细胞(HuH-7、HepG2、Hep56.1D和Hepa1-6)。所述细胞显示与野生型(WT)肽(但不与突变体肽)的同质结合(图3)。表达hNTCP或mNTCP的小鼠肝细胞瘤细胞同样显示与所述肽的强结合(图4)。
尽管转染效率低(~20%)，但用hNTCP转染的HuH-7细胞可以被HDV感染(图5)。通过hNTCP获得的对HDV感染的易感性也可以在人和小鼠细胞两者中观察到(图6)。hNTCP的瞬时转导赋予HuH-7细胞对HDV感染的易感性(图7)，而支持肽结合的mNTCP蛋白不支持HDV感染。用hNTCP转导后，小鼠细胞系Hep56.1D 支持HDV感染(图8)。
通过NTCP获得的对HBV感染的易感性可以在稳定表达hNTCP的HepG2细胞中观察到(图9)。该感染可以由肽Myrcludex B (MyrB)特异性抑制，并且通过将DMSO添加至培养基而增强。表达hNTCP的HuH-7细胞似乎支持较低水平的HBV感染，表明与HepG2细胞相比，在HuH-7细胞中不存在支持HBV感染的未知辅因子。
本说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特征可以，单独和以其任何组合，是用于以其各种形式实现本发明的材料。
Claims (24)
1.乙型肝炎病毒(HBV)或丁型肝炎病毒(HDV)受体，其具有
(a) SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列，其是与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列，或
(b) 包含以下的氨基酸序列
SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列，和
具有通式Pro-Tyr-X-Gly-Ile的氨基酸序列，其中X选自Lys、Arg和Val。
2.根据权利要求1的HBV或HDV受体，其具有选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3至8的氨基酸序列，和/或其中氨基酸序列(b)进一步包含氨基酸序列Gly-Met-Ile-Ile-Ile-Leu-Leu。
3.分离的核酸序列，优选DNA序列，其编码根据权利要求1或2的HBV或HDV受体。
4.载体，其包含根据权利要求3的核酸序列。
5.根据权利要求4的载体，所述载体是病毒转移载体，优选选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。
6.宿主细胞，其包含根据权利要求4或5的载体或包含根据权利要求3的核酸序列，所述载体或核酸序列已被人为引入所述宿主细胞。
7.根据权利要求6的宿主细胞，所述宿主细胞选自癌细胞系、干细胞系和原代肝细胞，其中，优选地，所述癌细胞系选自肝细胞瘤细胞系。
8.包含一种或多种转基因的转基因细胞或细胞系，其中所述一种或多种转基因之一是根据权利要求3的核酸序列，从而
使所述转基因细胞或细胞系易受HBV和/或HDV感染或
增加所述转基因细胞或细胞系对HBV和/或HDV感染的易感性，或者允许所述转基因细胞或细胞系结合HBV和/或HDV。
9.包含根据权利要求8的一种或多种转基因细胞或细胞系或包含一种或多种转基因的非人转基因动物，其中所述一种或多种转基因之一是根据权利要求3的核酸序列，从而
使所述转基因动物易受HBV和/或HDV感染或
增加所述转基因动物对HBV和/或HDV感染的易感性。
10.根据权利要求9的非人转基因动物，所述非人转基因动物选自小鼠、大鼠、兔、豚鼠和非人灵长类动物，诸如食蟹猴和恒河猴。
11.从根据权利要求9或10的非人转基因动物分离的肝细胞。
12.用于产生细胞的方法，所述细胞易受HBV和/或HDV感染，或者具有对HBV和/或HDV感染的增加的易感性，或者能够结合HBV和/或HDV，所述方法包括以下步骤
- 提供细胞，所述细胞不易受HBV和/或HDV感染，或者具有对HBV和/或HDV感染的低易感性，或者不能结合HBV和/或HDV；和
- 用根据权利要求3的核酸序列或用根据权利要求4或5的载体转染或转导所述细胞。
13.根据权利要求12的方法，所述方法进一步包括以下步骤
- 在所述转染或转导所述细胞的步骤之前，将细胞周期停滞或分化诱导剂添加至所述细胞。
14.根据权利要求12或13的方法，所述方法进一步包括以下步骤
- 敲除或敲低所述细胞的一个或多个内源基因。
15.根据权利要求12-14中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤
- 将所述细胞永生化，以获得所述细胞的稳定细胞系。
16.产生易受HBV和/或HDV感染的细胞的方法，所述方法包括以下步骤
- 提供不易受HBV和/或HDV感染的细胞；和
- 通过同源重组修饰所述细胞的对应于编码SEQ ID NO:1的人基因的内源基因，以便
用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸192至200、优选氨基酸194至197替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸192至200、优选氨基酸194至197的氨基酸，和/或
用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸155至165、优选氨基酸156至162替代对应于SEQ ID NO:1的氨基酸155至165、优选氨基酸156至162的氨基酸。
17.通过根据权利要求12-16中任一项的方法获得的细胞。
18.非人转基因动物，其包含一种或多种根据权利要求17的细胞。
19.(a) SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列，其是与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列，或
(b) 包含以下的氨基酸序列
SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列，和
具有通式Pro-Tyr-X-Gly-Ile的氨基酸序列，其中X选自Lys、Arg和Val，
作为HBV或HDV的受体的用途。
20.根据权利要求19的用途，其中所述用途包括以下步骤
- 将表达所述氨基酸序列的第一细胞暴露于已知结合所述HBV或HDV的受体的化合物且测量所述细胞的响应；
- 将表达所述氨基酸序列的所述第一细胞的相同类型的第二细胞暴露于怀疑结合所述HBV或HDV的受体的候选化合物且测量所述第二细胞的响应；和
- 将所述细胞的响应和所述第二细胞的响应进行比较，并基于此类比较确定所述候选化合物是否结合所述HBV或HDV的受体。
21.用于鉴定可用于治疗HBV和/或HDV感染的化合物的方法，所述方法包括鉴定结合根据权利要求1或2的HBV或HDV受体和/或抑制HBV或HDV与根据权利要求1或2的HBV或HDV受体的结合的化合物的步骤。
22.结合根据权利要求1或2的HBV或HDV受体和/或抑制HBV或HDV与根据权利要求1或2的HBV或HDV受体的结合的化合物，其用于治疗HBV和/或HDV感染，其中所述化合物不是HBV L-蛋白衍生脂肽或所述HBV或HDV受体的天然底物或结合伴侣。
23.根据权利要求22的化合物，所述化合物选自(多)肽、抗体、适配体和有机化合物，诸如小分子和拟肽化合物。
24.根据权利要求6或7的宿主细胞，或
根据权利要求8的转基因细胞或细胞系，或
根据权利要求11的肝细胞，或
根据权利要求17的细胞，或
根据权利要求9、10和18中任一项的非人转基因动物，
用于免疫学研究和/或用于筛选药物、进入后限制因子或宿主依赖因子的用途。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261725144P | 2012-11-12 | 2012-11-12 | |
| US61/725144 | 2012-11-12 | ||
| PCT/EP2013/073602 WO2014072526A1 (en) | 2012-11-12 | 2013-11-12 | Development of hbv- and/or hdv-susceptible cells, cell lines and non-human animals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104955837A true CN104955837A (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=49622802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380059075.0A Pending CN104955837A (zh) | 2012-11-12 | 2013-11-12 | Hbv和/或hdv易感细胞、细胞系和非人动物的开发 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10618947B2 (zh) |
| EP (1) | EP2917230B1 (zh) |
| JP (1) | JP6445447B2 (zh) |
| CN (1) | CN104955837A (zh) |
| HK (1) | HK1213911A1 (zh) |
| WO (1) | WO2014072526A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108137675A (zh) * | 2015-10-07 | 2018-06-08 | 胡默波斯生物医学公司 | 强力地中和乙型肝炎病毒的抗体和其用途 |
| CN113684186A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-23 | 复旦大学 | 一种可支持乙肝病毒复制和感染的细胞模型及建立方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3181146A1 (en) | 2015-12-16 | 2017-06-21 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Cyclic ntcp-targeting peptides and their uses as entry inhibitors |
| EP3189850A1 (en) | 2015-12-16 | 2017-07-12 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Liver targeting of cyclic pres-derived peptides of hbv |
| EP3392267A1 (en) * | 2017-04-18 | 2018-10-24 | Myr GmbH | Therapy of atherosclerosis, primary biliary cirrhosis and nrlp3 inflammasome-associated disease by htcp inhibitors |
| CN107988260B (zh) * | 2017-11-29 | 2021-02-09 | 立沃生物科技（深圳）有限公司 | 一种利用猪原代肝细胞和hNTCP重组慢病毒建立乙肝病毒感染细胞模型的方法 |
| WO2019131938A1 (ja) * | 2017-12-27 | 2019-07-04 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター | 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法 |
| WO2019243564A1 (en) * | 2018-06-21 | 2019-12-26 | Technische Universitaet Muenchen | Hepatitis b and/or hepatitis d-permissive cells and animals |
| KR102664147B1 (ko) * | 2018-10-25 | 2024-05-10 | 연세대학교 산학협력단 | 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법 |
| JPWO2021070883A1 (zh) * | 2019-10-07 | 2021-04-15 | ||
| EP3804750A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-14 | Universität Heidelberg | Conjugate compounds for preventing and/or treating hbv and/or hdv infections, liver diseases and for targeting ntcp |
| CN117431216B (zh) * | 2023-12-18 | 2024-03-08 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种α疱疹病毒钝感单克隆细胞株及其制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070105128A1 (en) * | 2000-12-27 | 2007-05-10 | Yusuke Nakamura | Detection of genetic polymorphisms |
| CN102083967A (zh) * | 2007-07-20 | 2011-06-01 | 塞拉提斯股份公司 | 经由定型内胚层(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干细胞的新肝细胞群体 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT672136E (pt) * | 1992-07-08 | 2000-08-31 | Innogenetics Nv | Polipeptidos derivados da endonexina 2 tendo actividade receptora do virus da hepatite b e sua utilizacao em diagnostico e composicoes farmaceuticas |
| US6217858B1 (en) * | 1997-02-11 | 2001-04-17 | Hadasit & Medical Research Services & Development Company, Ltd. | Pharmaceutical composition for treating hepatitis B virus (HBV) infection |
| US6689600B1 (en) * | 1998-11-16 | 2004-02-10 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
| WO2009092396A1 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Universitätsklinikum Heidelberg | Hydrophobic modified pres-derived peptides of hepatitis b virus (hbv) and their use as hbv and hdv entry inhibitors |
| NZ598457A (en) * | 2009-08-03 | 2014-06-27 | Recombinetics Inc | Methods and compositions for targeted gene modification |
| CN109354623B (zh) * | 2012-04-25 | 2022-06-24 | 华辉安健（北京）生物科技有限公司 | 乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用 |
| CA2967222C (en) * | 2014-11-12 | 2023-10-31 | Rinat Neuroscience Corp. | Inhibitory chimeric antigen receptors |
-
2013
- 2013-11-12 CN CN201380059075.0A patent/CN104955837A/zh active Pending
- 2013-11-12 JP JP2015541181A patent/JP6445447B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-11-12 WO PCT/EP2013/073602 patent/WO2014072526A1/en active Application Filing
- 2013-11-12 EP EP13792883.4A patent/EP2917230B1/en active Active
- 2013-11-12 US US14/442,279 patent/US10618947B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-02-17 HK HK16101702.9A patent/HK1213911A1/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070105128A1 (en) * | 2000-12-27 | 2007-05-10 | Yusuke Nakamura | Detection of genetic polymorphisms |
| CN102083967A (zh) * | 2007-07-20 | 2011-06-01 | 塞拉提斯股份公司 | 经由定型内胚层(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干细胞的新肝细胞群体 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| BIJSMANS, I.T. ET AL.: "sodium/bile acid cotransporter [Homo sapiens]，GENBANK ACCESSION NO: NP_003040", 《GENBANK》 * |
| CUI, J.Y. ET AL.: "sodium/bile acid cotransporter isoform 1 [Mus musculus]，GENBANK ACCESSION NO: NP_001171032", 《GENBANK》 * |
| MIURA, T. ET AL.: "sodium/bile acid cotransporter [Rattus norvegicus]，GENBANK ACCESSION NO: NP_058743", 《GENBANK》 * |
| NCBI PREDICTED: "sodium/bile acid cotransporter [Pan troglodytes]，GENBANK ACCESSION NO: XP_510035", 《GENBANK》 * |
| NCBI PREDICTED: "sodium/bile acid cotransporter [Pongo abelii]，GENBANK ACCESSION NO: XP_002824936", 《GENBANK》 * |
| NCBI PREDICTED: "sodium/bile acid cotransporter isoform 1 [Canis lupus familiaris]，GENBANK ACCESSION NO: XP_537494", 《GENBANK》 * |
| 佚名: "钠离子-牛磺胆酸钠共转运多肽是人类乙肝和丁肝病毒的功能性受体", 《中国基础科学》 * |
| 李文辉: "我国科学家发现乙肝和丁肝病毒的功能性受体", 《中国基础科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108137675A (zh) * | 2015-10-07 | 2018-06-08 | 胡默波斯生物医学公司 | 强力地中和乙型肝炎病毒的抗体和其用途 |
| CN108137675B (zh) * | 2015-10-07 | 2022-03-22 | 胡默波斯生物医学公司 | 中和乙型肝炎病毒的抗体和其用途 |
| CN113684186A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-23 | 复旦大学 | 一种可支持乙肝病毒复制和感染的细胞模型及建立方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6445447B2 (ja) | 2018-12-26 |
| US10618947B2 (en) | 2020-04-14 |
| JP2015535524A (ja) | 2015-12-14 |
| HK1213911A1 (zh) | 2016-07-15 |
| EP2917230A1 (en) | 2015-09-16 |
| EP2917230B1 (en) | 2018-07-18 |
| US20150299289A1 (en) | 2015-10-22 |
| WO2014072526A1 (en) | 2014-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104955837A (zh) | Hbv和/或hdv易感细胞、细胞系和非人动物的开发 | |
| Ni et al. | Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes | |
| Raaben et al. | NRP2 and CD63 are host factors for Lujo virus cell entry | |
| McCaffrey et al. | The variable regions of hepatitis C virus glycoprotein E2 have an essential structural role in glycoprotein assembly and virion infectivity | |
| Tsuge et al. | HBx protein is indispensable for development of viraemia in human hepatocyte chimeric mice | |
| Noyce et al. | Nectin 4 is the epithelial cell receptor for measles virus | |
| Counihan et al. | Trafficking of hepatitis C virus core protein during virus particle assembly | |
| Blondot et al. | Intracellular transport and egress of hepatitis B virus | |
| Evans et al. | Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry | |
| Himmelsbach et al. | Life cycle and morphogenesis of the hepatitis E virus | |
| Yan et al. | Molecular determinants of hepatitis B and D virus entry restriction in mouse sodium taurocholate cotransporting polypeptide | |
| CN104662036B (zh) | 乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用 | |
| Sun et al. | Stable HepG2-and Huh7-based human hepatoma cell lines for efficient regulated expression of infectious hepatitis B virus | |
| Ploen et al. | TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles | |
| Liang et al. | TRIM26 is a critical host factor for HCV replication and contributes to host tropism | |
| Fu et al. | Woodchuck sodium taurocholate cotransporting polypeptide supports low-level hepatitis B and D virus entry | |
| Masuda et al. | Viral determinants that control the neuropathogenicity of PVC-211 murine leukemia virus in vivo determine brain capillary endothelial cell tropism of the virus in vitro | |
| CA2943047C (en) | Tagged hepadnavirus e antigen and its use in screening antiviral substances | |
| Ou et al. | The genotype (A to H) dependent N-terminal sequence of HBV large surface protein affects viral replication, secretion and infectivity | |
| Dylla et al. | Altering α-dystroglycan receptor affinity of LCMV pseudotyped lentivirus yields unique cell and tissue tropism | |
| JP6986263B2 (ja) | 抗ウイルス薬 | |
| Guo et al. | In vitro cell culture models to study hepatitis B and D virus infection | |
| Fénéant et al. | Claudin-6 and occludin natural variants found in a patient highly exposed but not infected with hepatitis C virus (HCV) do not confer HCV resistance in vitro | |
| Sun et al. | The hepatitis B surface antigen binding protein: an immunoglobulin G constant region-like protein that interacts with HBV envelop proteins and mediates HBV entry | |
| von Hahn et al. | The novel immunosuppressive protein kinase C inhibitor sotrastaurin has no pro-viral effects on the replication cycle of hepatitis B or C virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150930 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |