JPWO2018225751A1 - 大腸がん幹細胞の維持増幅方法、及び大腸がんオルガノイドの誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 大腸がん幹細胞をカルシニューリン阻害薬の存在下で培養することを含む、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導方法。
[2] 出発大腸がん幹細胞が、外来性の初期化因子を導入した大腸がん細胞を、胚性幹(ES)細胞を維持し得ない条件下で培養することにより誘導されたものである、[1]に記載の方法。
[3] 出発大腸がん幹細胞が、外来性の初期化因子を導入していない大腸がん細胞の薬剤排除能を抑制するのに有効な濃度のABCトランスポーター阻害薬の存在下で、薬剤排除能を有するものである、[2]に記載の方法。
[4] 大腸がん幹細胞を接着培養する工程を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 大腸がん幹細胞を三次元培養する工程を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 接着培養工程の後に三次元培養工程を行う、[5]に記載の方法であって、前記両工程の一方又は両方がカルシニューリン阻害薬の存在下で行われる、方法。
[7] 少なくとも接着培養工程がカルシニューリン阻害薬の存在下で行われる、[6]に記載の方法。
[8] 三次元培養工程が間葉系幹/前駆細胞及び血管内皮細胞との共培養により行われる、[5]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] カルシニューリン阻害薬の添加期間が5〜25日間である、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] カルシニューリン阻害薬がFK506である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] [1]〜[10]のいずれかに記載の方法により維持増幅された大腸がん幹細胞又は誘導された大腸がんオルガノイドと、被検物質とを接触させ、該幹細胞又は該オルガノイドの維持又は増殖に及ぼす該被検物質の効果を検定することを含む、抗がん剤のスクリーニング方法。
[12] [1]〜[10]のいずれかに記載の方法において、カルシニューリン阻害薬の存在下での培養を、被検物質の共存下で行い、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導に及ぼす該被検物質の効果を検定することを含む、抗がん剤のスクリーニング方法。
[13] カルシニューリン阻害薬を含有してなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導剤。
[14] カルシニューリン阻害薬がFK506である、[13]に記載の剤。
[15] [13]又は[14]に記載の剤と、外来性の初期化因子を導入した大腸がん細胞由来であって、外来性の初期化因子を導入していない大腸がん細胞の薬剤排除能を抑制するのに有効な濃度のABCトランスポーター阻害薬の存在下で、薬剤排除能を有する、大腸がん幹細胞とを含んでなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導用キット。
[16] 抗がん剤のスクリーニングのための、[15]に記載のキット。
[17] [1]〜[10]のいずれかに記載の方法により誘導された大腸がんオルガノイド。
本発明は、大腸がん幹細胞をカルシニューリン阻害薬の存在下で培養することを含む、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導方法(以下「本発明の方法」と略記する。)を提供する。
大腸がん幹細胞の由来となる動物は特に制限されないが、本発明のスクリーニング法が目的とする抗がん剤の投与対象と同一種であることが望ましい。例えば、哺乳動物(例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト等)が挙げられるが、本発明のスクリーニング法の目的に照らせば、好ましくはヒトである。
一方、細胞増殖速度、抗がん薬に対する耐性、及び/又は薬剤排除能を指標とする場合、通常の大腸がん細胞と比較して、細胞増殖速度が遅い、抗がん剤に対する耐性が高い、及び/又は薬剤排徐能が高い等の特性を有する細胞を、大腸がん幹細胞として使用することができる。
従って、FK506又はシクロスポリンA以外のカルシニューリン阻害薬を用いても、同様に大腸がん幹細胞の特性を亢進し得る。
中でも、本発明に使用されるカルシニューリン阻害薬として、CaN-NFAT経路を特異的に阻害する(望ましくないoff-target効果が十分に低い)ものが好ましい。そのようなCaN-NFAT経路に対する特異性の高い阻害薬として、例えば、FK506及びシクロスポリンAを挙げることができる。
本発明は、前述のように維持増幅された大腸がん幹細胞、又は誘導された大腸がんオルガノイド(以下「増幅大腸がん幹細胞等」と略記する場合がある。)を用いて、抗がん剤をスクリーニングする方法(以下「本発明のスクリーニング方法」と略記する。)を提供する。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記増幅大腸がん幹細胞等を試験物質の存在下又は非存在下で培養した後、該増幅大腸がん幹細胞等に及ぼす該被験物質の効果を検定することを含む。そのような被験物質の効果としては、例えば、増幅大腸がん幹細胞等の殺傷効果、大腸がん幹細胞の増殖抑制効果、大腸がん幹細胞の非幹細胞への分化誘導効果などが挙げられる。増幅大腸がん幹細胞等の殺傷効果の検討による抗がん剤の選別は、例えば、被験物質を添加した場合の該細胞等の生存度を測定し、被験物質の非存在下で培養した場合と比較して、試験物質の存在下で培養した場合において、当該細胞の生存度が低下した場合に、当該試験物質は抗がん作用を有すると判定することにより行われ得る。大腸がん幹細胞の増殖抑制効果の検討による抗がん剤の選別は、例えば、被験物質を添加した場合の該細胞の増殖率を測定し、被験物質の非存在下で培養した場合と比較して、試験物質の存在下で培養した場合において、当該細胞の増殖率が低下した場合に、当該試験物質は抗がん作用を有すると判定することにより行われ得る。大腸がん幹細胞の非幹細胞への分化誘導効果の検討による抗がん剤の選別は、例えば、被験物質を添加した場合の細胞集団における、上述した大腸がん幹細胞のマーカーとして報告のある遺伝子/タンパク質の発現レベルを測定し、被験物質の非存在下で培養した場合と比較して、試験物質の存在下で培養した場合において、該細胞集団における該がん幹細胞のマーカーの発現レベルが低下した場合に、当該試験物質は抗がん作用を有すると判定することにより行われ得る。
本発明は、カルシニューリン阻害薬を含有してなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導剤(以下「本発明の剤」と略記する。)を提供する。
本発明はまた、本発明の剤と、誘導型大腸がん幹細胞とを含んでなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導用キット(以下「本発明のキット」と略記する。)を提供する。
<細胞培養>
ATCCコレクション及びCell Biolabs(San Diego、CA、USA)から、ヒト大腸がん細胞株(SW480)及びPlat-A アンホトロピックレトロウイルスパッケージング細胞をそれぞれ入手した。10%ウシ胎仔血清(FBS)(Life Technologies)、ペニシリン(100 Units/ ml)及びストレプトマイシン(100 μg/ml)(Life Technologies)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Nacalai Tesque、Kyoto、Japan)中で、37℃、加湿5%CO2インキュベーター内で両方の細胞を培養した。Plat-A培養において、1 μg/mlのピューロマイシン(Nacalai Tesque)及び10 μg/mlのブラストサイジン(Funakoshi)を添加した。HUVEC(Lonza)及びヒトMSC(Lonza)は、内皮増殖培地(Lonza)中で、37℃、加湿5%CO2インキュベーター内で維持した。細胞をFK506(Sigma、25 μM)、VPA(WAKO、1 mM)又はCHIR99021(Funakoshi、3 mM)で5日間処理した。その後、細胞を酵素処理によって培養皿より剥離、分散し、Countessシステム(Invitrogen)を用いて細胞数を数えた。
コントロールとして用いたヒト人工多能性幹(hiPS)細胞は、実験室でヒト末梢血単核細胞から作製した。
pMXをベースにしたベクターにおいて、OCT3/4、SOX2又はKLF4を別々にコードするレトロウイルスベクター(pMXs-OCT3/4, pMXs-SOX2, pMXs-KLF4)は、Addgeneから入手した。さらに、これらのベクターを用いて、OCT3/4、KLF4及びSOX2をコードするポリシストロニックレトロウイルスベクター(pMXs-OKS)を設計した。即ち、上記の各ベクターを鋳型とし、ヒトOCT3/4、KLF4及びSOX2を、Thosea asignaウイルスの2A配列(T2A)を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅し、In-fusion HDクローニングシステム(Clontech)を用いてpMXベクターのEcoRI部位にクローニングした。pMXs-NFATc3-GFPコンストラクトを作製するために、HA-NFAT4(3-407)-GFP(Addgeneから購入 #21664)を鋳型として用いて、NFATc3-GFP cDNAをPCRで増幅し、pMXsベクター(Aramburu J, et al., Science 1999, 285:2129-2133)のEcoRI-NotIサイトにクローニングした。
トランスフェクションの1日前に、Plat-Aパッケージング細胞を、60mmディッシュ当たり1×106細胞で播種した。翌日、メーカーの説明書に従い、Fugene HDトランスフェクション試薬(Promega)を用いて3μgのpMXベクターで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、Plat-A培地を交換した。一方、SW480を60mmディッシュ当たり7×105細胞で播種した。24時間後、これらのPlat-A培養物に由来するウイルス含有上清を、0.45mm酢酸セルロースフィルター(Whatman)で濾過し、4μg/mlポリブレン(Nacalai Tesque)を補充し、pMXs-OKSウイルス含有上清又はpMXs-OCT3/4、pMXs-SOX2及びpMXs-KLF4ウイルス含有上清の等量混合物を速やかに標的細胞に添加した。感染24時間〜36時間後に、ウイルス含有培地を新しい培地と交換した。
初期化因子導入後のSW480細胞の培養及び誘導型大腸がん幹細胞(以下、「大腸iCSC」ともいう。)富化細胞集団の単離及び大腸がんオルガノイドの誘導は、図6に記載のスケジュールで実施した。大腸iCSCの樹立培養及び大腸iCSC富化細胞集団のソーティングは、上記非特許文献3に記載される方法(50μM ベラパミル存在下でのHoechst33342排除能を利用したフローサイトメトリー)に従って行った。以下、1回目のソーティングにより得られた大腸iCSC富化細胞集団(50μM ベラパミル存在下でHoechst33342により標識されない細胞集団;V50細胞)を1st V50細胞(又は1st V50-OKS細胞)、2回目のソーティングにより得られたV50細胞を2nd V50細胞(又は2nd V50-OKS細胞)と、それぞれ略記する場合がある。一方、50μM ベラパミル存在下でHoechst33342により標識される細胞集団を非V50(又はnon V50、non V50-OKS)細胞と略記する場合がある。大腸がんオルガノイドの誘導は、後述のスフェア形成アッセイに記載の方法にて行った。
Trizol(Life Technologies)を用いて細胞の全RNAを抽出した。Prime ScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)を用いて、500ngのRNAをcDNAに逆転写し、SYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM II(Takara)を用いたLightCycler(登録商標)480リアルタイムPCRシステム(Roche)で定量PCR分析を行った。PCRプライマーを表1に挙げる。
細胞をM-PER哺乳動物タンパク質抽出試薬(Thermo Fisher Scientific)で溶解した。細胞可溶化物を用いてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った。タンパク質の電気泳動転写後、マウス抗OCT3/4抗体(BD Transduction LaboratoriesTM)、ウサギ抗KLF4抗体(abcam)、及びヤギ抗SOX2抗体(abcam)、マウス抗β-アクチン抗体(Sigma Aldrich)を、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を用いて、イムノブロッティングを行った。LAS 3000イメージングシステム(Fuji Film)を使用してシグナルを検出した。
培養細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した。一次抗体として、マウス抗OCT3/4抗体(611202、1:200で希釈、BD transduction LaboratoriesTM)、ヤギ抗SOX2抗体(sc-17320、1:100で希釈、Santa Cruz)を用いた。免疫蛍光のために、フルオロフォア結合した(Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594)二次抗体を用いてシグナルを視覚化した。
色素流出活性分析は、公知の方法(Zhou S. et al., Nat Med 2001;7:1028-34、Patrawala L. et al., Cancer Res 2005;65:6207-19)に従い行った。細胞を、2%FBS及びHoechst33342(Life Technologies)を5μg/ ml含有する1mM HEPESを含むDMEM中で、ベラパミル(Sigma-Aldrich)を50又は250μMで共投与して、又は共投与せずに、37℃で90分間インキュベートし、30分ごとに静かに転倒させた。インキュベーション後、細胞を2%FBS及び1mM HEPESを含むPBSに再懸濁した。細胞を、死細胞を標識するために2μg/ mlのPIで対比染色し、35μmのメッシュフィルターに通し、フローサイトメトリー及び選別のために氷上に保持した。細胞をFACS Aria III装置(BD Bioscience)で分析及び選別した。Hoechst色素を紫色レーザー(405 nm)で励起し、450/40フィルター(Hoechst Blue)と610/20フィルター(Hoechst Red)の両方で蛍光を測定した。
0、1、50 μg/ mlの5-フルオロウラシル(5-FU、Kyowa Kirin)をそれぞれ含有するDMEMを含む12ウェルプレートに合計6×104細胞を播種した。72時間のインキュベーション後、5-FU曝露後の細胞の生存能力を、Countess(Invitrogen)システムによって測定した。
パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理した細胞を37℃で5分間Hoechst33342で染色し、次いで細胞をFACS Aria III (Henderson L, et al., Am J
Physiol Cell Physiol 2013, 304:C927-38)で分析した。
10 ng/mlのbFGF(WAKO)、10 μg/mlのヒトインスリン(CST)、100 μg/mlのヒトトランスフェリン(Roche)及び100 μg/mlのBSA(Nacalai Tesque)を含有する無血清DMEMを有するUltra Low Attachmentプレート(Corning)に細胞を移し、37℃、5%CO2インキュベーターで10日間インキュベートした。スフェアの数は、100μmより大きいスフェアのサイズに基づいて計算した。培地にFK506(25μM)、VPA(1 mM)又はCHIR99021(3 μM)を添加し、次いでスフェアを10日間処理した。
5×105 親SW480細胞又はiCSCを、5×104HUVEC及び2×105 MSCと共にスフェア形成培地に再懸濁し、低接着24ウェルのフラットプレート(Prime Surface(登録商標) 24F、 Sumitomo Bakelite)に蒔いた。10日後、集合細胞(collective cell)のスフェアを病理学的に解析した。
スフェアをパラフィンブロックに包埋し、厚さ5μmで切片化した。切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン及びエオシン(HE)、抗ヒトサイトケラチン20(CK20)マウスモノクローナル抗体(クローン:Ks20.8、1:50で希釈、Dako)、抗ヒトサイトケラチン7(CK7)マウスモノクローナル抗体(クローン:OV-TL 12/30、1:50で希釈、Dako)、抗CDX2マウスモノクローナル抗体(CM226、1:50で希釈、Biocare Medical)、抗Ki67マウスモノクローナル抗体(クローン:MIB-1、1:50で希釈、Dako)、抗αSMAマウスモノクローナル抗体(クローン:1A4、1:50で希釈、Dako)及び抗CD31マウスモノクローナル抗体(クローン:JC70A、1:50で希釈、Dako)で染色した。免疫組織化学は、XT ultraView Universal DAB検出キット(Ventana Medical Systems, Inc)を用い、Benchmark XT(Roche)autostainerを用いて行った。
Mock-SW480細胞、1st V50-OKS細胞由来の非50細胞及び2nd V50-OKS細胞のRNAを、ソート後5日目に回収した。遺伝子発現プロファイリングを、メーカーのプロトコールに従い、SurePrint G3 human GE microarray(Agilent Technologies)用いて行った。GeneSpring 13.0ソフトウェアプログラム(Agilent Technologies)を用いてデータを分析した。データ処理は、次のように行った:(i)閾値生シグナルを1.0に設定し、(ii)ログベース2変換を行い、(iii)標準化アルゴリズムとして75パーセンタイル正規化を選択した(http://genespringsupport.com/faq/normalization)。フラグの設定は、次のように行った:特徴は、not positive and significant (not detected)、not uniform (compromised)、 not above background (not detected)、 saturated (compromised)、又はpopulation outlier(compromised)とした。コントロールプローブを除去し、全ての試料中の少なくとも1つの試料中に存在する「検出された」プローブのみをさらなる分析に使用した。分析に使用したプローブの数は50,739であった。
SW480細胞又は2nd V50細胞を、FK506(Sigma)の存在下で5〜15日間平面接着培養した後、Countess(Invitrogen)システムを用いて細胞数をカウントした。あるいは、該細胞をFK506の存在下もしくは非存在下で平面接着培養した後、FK506の存在下もしくは非存在下で浮遊培養してスフェアを形成させた。Countess(Invitrogen)システムを用いてスフェア数をカウントした。特に断らない限り、本実施例では、FK506は25μMの濃度で用いた。
すべてのデータは、jstatソフトウェアプログラムを使用して分析した。データ値は、3回の独立した実験の平均±標準誤差(SEM)として表した。2群間の平均値の差を、両側対応t検定を用いて分析した。その差は、P値<0.05(*)及び<0.01(**)である場合に、統計的に有意であるとみなした。
二本鎖ステルスsiRNA(Invitrogen)を参考例に使用し、メーカーの説明書に従って細胞に形質導入した。用いたsiRNAに関する配列情報は以下の通りである:GSK3a-CCAAGGCCAAGUUGACCAUCCCUAU(配列番号23); GSK3b - GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU(配列番号24); RCAN2-HSS#173486;スクランブル - AAUUCUCCGAACGUGUCACGUGAGA(配列番号25)。
3回の独立した実験で作製した2ndVP50細胞を、2 x 103 細胞/ウェルの密度で、6ウェルプレートに播種した。翌日、培地を化合物を添加していない培地、あるいは1 mMのVPA、3μMのCHIR又は25 μMのFK506を添加した培地に交換した。以後、培地を2日又は3日毎に交換した。12日目に、細胞をメタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、実体顕微鏡を用いてコロニーをカウントした。
以前の研究(非特許文献3)では、SW480ヒト大腸がん細胞株からiCSCを作製するためにOCT3/4、SOX2又はKLF4を別々に有する3種類のウイルスベクターを使用した。そのため、形質導入された細胞には、3つのウイルスベクターのすべて、2つ、1つ、又は全く含まれない様々な集団が含まれていた。従って、iCSCの分子サインの同定を妨げ得る不均一さを避けるため、OCT3/4、KLF4及びSOX2をコードする3つのcDNAがT2A配列と連結したポリシストロニックレトロウイルスベクター(pMXs-OKS)を構築した(図1A)。
次いで、OKS融合遺伝子産物が効率的に個々のタンパク質にプロセシングされ得ることを確認した。このポリシストロニックベクターをPLAT-Aパッケージング細胞にトランスフェクトすることによりレトロウイルスを作成し、該レトロウイルスをSW480細胞にトランスフェクトした(OKS-SW480)。モック(空)ベクターでトランスフェクトしたSW480細胞(Mock-SW480)をネガティブコントロールとして、pMX-OCT3/4、pMX-SOX2及びpMX-KLF4の混合物でトランスフェクトしたSW480細胞(O+S+K-SW480)をポジティブコントロールとして、それぞれ使用した。ウエスタンブロット分析により、OKS-SW480細胞及びO+S+K-SW480細胞の両方において、OCT3/4、KLF4及びSOX2タンパク質が適切な分子量で検出されたが、KLF4発現レベルは、Mock-SW480細胞と比較して、実質的に変化しなかった(図1B)。定量的逆転写ポリメラーゼ反応(qRT-PCR)により、OKS-SW480細胞において、O(OCT3/4)、K(KLF4)、S(SOX2)転写物の合計のレベルも上昇していることが示された(図1C)。さらに、予想通り、免疫蛍光染色分析により、ほとんど全てのOKS-SW480細胞がOCT3/4及びSOX2についてダブルポジティブ又はダブルネガティブであったが、OCT3/4-又はSOX2-シングルポジティブ細胞はO+S+K-SW480において顕著であった(図1D)。
無血清培地を用いた低接着培養皿で培養した場合、CSCが高いスフェア形成する能力を有することが以前報告されている(Ricci-Vitiani L. et al., Nature 2007;445:111-51、Sato T. et al., Gastroenterology 2011;141:1762-72)。これらの細胞のスフェア形成能を調べるために、スフェア形成アッセイを行った。
以前の異種移植実験では、免疫組織化学的所見から、親細胞株ではなく大腸iCSCも、実際のヒト大腸がん組織に類似した組織をin vivoで再構成できることが実証された(非特許文献3)。しかし、大腸iCSCがin vitroで同じ現象を示すことができるかどうかは依然として不明であった。そこで、親SW480細胞及び2nd V50-OKS細胞由来のスフェアを免疫組織化学的に評価した。2nd V50-OKS細胞由来のスフェアは、CK20及びCDX2が陽性であり、CK7は陰性であり(図3B)、これは典型的な大腸がん組織における染色パターンと一致する(Bayrak R et al., Diagn Pathol 2012;7:9)。一方、親SW480細胞由来のスフェアはCK20が陰性であった(図3B)。このことは、in vivoのみならずin vitroでも、大腸iCSC由来組織が天然のヒト大腸がん組織様の構造(大腸がんオルガノイド)を再構築できること、並びにこの組織再構築能はがん幹細胞特異的であることを示している。従って、これらのiCSCの組織再構築能の指標として、スフェア形成能を評価することができると考えられる。
CSCsの特性を促進する分子メカニズムを同定するために、ソーティングから5日後のMock-SW480細胞、1stV50-OKS細胞由来の非V50細胞及び2ndV50-OKS細胞における網羅的遺伝子発現パターンを、マイクロアレイによって比較した。まず、Mock-SW480と2nd V50-OKS細胞間の遺伝子発現を比較し、3914のプローブがそれらの発現において有意差を有することを同定した(t検定、偽陽性率(FDR)<0.05及びFold Change>2)(図5A)。次に、2ndV50-OKS細胞の遺伝子発現プロファイルを、1st V50-OKS細胞由来の非V50細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した(図5B)。FDR <0.05であり、Fold Change>2である56個のプローブを同定した。次に、非V50、Mockよりも2ndV50においてより高く発現するプローブ、及び非V50、Mockよりも2ndV50においてより低く発現するプローブのベン図を描き、ベン図で重なる8個のプローブを選択した(図5C)。これら8個のプローブのうち、各細胞における発現レベルとスフェア形成能がパラレルの関係にある、セマフォリン 6A(SEMA6A)、FAM105A(family with a sequence similarity 105 member A)、及びRCAN2(regulator of calcineurin 2)を含む3個のプローブに絞り込んだ(図5D、5E)。
FK506は、親SW480培養において細胞の数を有意に減少させたが、これはカルシニューリンの阻害がin vitroで大腸がん細胞株の増殖を阻害するという報告と一致する(Peuker K. et al., Nat Med 2016;22:506-15)。一方で、2nd V50-OKS培養において、FK506の細胞数に対する有意な効果は観察されなかった(図7A)(継代±FK506添加5日後)。さらに、2ndV50-OKS細胞において顕著に観察された形態又はドーム型コロニーは、FK506を用いることでより顕著になったが、親SW480の細胞形態はFK506を用いても変化しなかった(図7B)(継代±FK506添加5日後)。これらのデータにより、FK506が大腸iCSC及び親SW480細胞に対して異なる作用を有することが示唆された。
FK506有り又は無しでの大腸iCSCの組織再構築能の指標として、スフェア形成能を評価した。FK506は、2nd V50-OKS細胞においてスフェアの数を有意に増加させたが、親SW480細胞では増加しなかった(図7C、7D)。免疫組織化学分析により、FK506処置を受けた2nd V50-OKS細胞のスフェアは、CK20及びCDX2が陽性であり、CK7が陰性であり、FK506を用いないスフェアと同じパターンであった(図7E)。また、FK506存在下で15日間接着培養を行った2nd V50細胞を、次いで7日間浮遊培養し、スフェアを形成させた。その結果、図7と同様に、2nd V50細胞のスフェアは、CK20及びCDX2が陽性であり、CK7が陰性であった(図10)。
カルシニューリンは、NFATの核移行を促進することが他の細胞で報告されていた。逆に、NFATの核から細胞質への移行を促進する分子としてGSK3が知られていた。そこで、大腸がん幹細胞に対して、GSK3を阻害すれば、カルシニューリン阻害薬FK506とは逆の効果があるという仮説のもとに本実験を行った。
まず、GSK3α及びGSK3βに対するsiRNAを用いて、GSK3を阻害した。その結果、平面接着培養において、GSK3αに対するsiRNAとGSK3βに対するsiRNAの両者を添加することで、iCSCの形態的特徴(ドーム状のコロニー)は抑制されて平坦となり、細胞数も減少した(図14A)。単独のsiRNAでは効果が見られなかったことから、大腸がんにおいてはGSK3αとGSK3βとの間には機能的なリダンダンシーがあることが示唆された。
次に、GSK3αおよびβ両者の阻害薬であるバルプロ酸(VPA)やCHIR99021(CHIR)添加によりsiRNAと同様の効果があるか否かを調べた。その結果、図14Bに示すとおり、いずれのGSK3阻害薬でも、siRNAと同様の効果が認められた。さらに、実施例4と同様に、スフェア形成能の及ぼすこれら阻害薬の効果を調べたところ、いずれのGSK3阻害薬も大腸iCSC(2nd V50)のスフェア形成能力を有意に抑制した。注目すべきことに、2ndV50-OKS細胞におけるiCSCの組織再構築能の尺度であるスフェア形成能は、VPAおよびCHIRの添加によって有意に抑制された(図14C)。
さらに、インビトロでの2ndV50細胞を用いたコロニー形成アッセイにおいて、二次ドーム形状のコロニーの数は、VPAおよびCHIR99021では減少し、FK506では増加した(図15)。この結果は、これらの化合物がiCSCの自己複製に影響することを示している。
最後に、iCSCにおけるFK506、VPA及びCHIRの処置後のNFATの細胞内局在を試験した。GFPに融合したNFATc3(NFATc3-GFP; Aramburu J, et al., Science, 1999 ;285:2129-33、Peuker K, et al., Nat Med, 2016, 22:506-15)を2ndV50-OKS細胞にレトロウイルスで導入した。いずれの化合物も添加しなかった2nd VP50-OKS細胞、又はFK506を添加した2nd VP50-OKS細胞では、NFATc3-GFPが細胞質に局在することが観察された。対照的に、VPA又はCHIRで処理した2nd V50-OKS細胞の核において、NFATc3-GFPの局在が見出された(図16)。これらの結果から、GSK3の阻害がiCSCに影響を及ぼすことが示唆されるが、このことはNFATの細胞質-核移行を介したカルシニューリン阻害とは反対である。この結果は、図17で示した参考図を裏付けるものである。
Claims (17)
- 大腸がん幹細胞をカルシニューリン阻害薬の存在下で培養することを含む、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導方法。
- 出発大腸がん幹細胞が、外来性の初期化因子を導入した大腸がん細胞を、胚性幹(ES)細胞を維持し得ない条件下で培養することにより誘導されたものである、請求項1に記載の方法。
- 出発大腸がん幹細胞が、外来性の初期化因子を導入していない大腸がん細胞の薬剤排除能を抑制するのに有効な濃度のABCトランスポーター阻害薬の存在下で、薬剤排除能を有するものである、請求項2に記載の方法。
- 大腸がん幹細胞を接着培養する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 大腸がん幹細胞を三次元培養する工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 接着培養工程の後に三次元培養工程を行う、請求項5に記載の方法であって、前記両工程の一方又は両方がカルシニューリン阻害薬の存在下で行われる、方法。
- 少なくとも接着培養工程がカルシニューリン阻害薬の存在下で行われる、請求項6に記載の方法。
- 三次元培養工程が間葉系幹細胞及び血管内皮細胞との共培養により行われる、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- カルシニューリン阻害薬の添加期間が5〜25日間である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- カルシニューリン阻害薬がFK506である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により維持増幅された大腸がん幹細胞又は誘導された大腸がんオルガノイドと、被検物質とを接触させ、該幹細胞又は該オルガノイドの維持又は増殖に及ぼす該被検物質の効果を検定することを含む、抗がん剤のスクリーニング方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法において、カルシニューリン阻害薬の存在下での培養を、被検物質の共存下で行い、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドオの誘導に及ぼす該被検物質の効果を検定することを含む、抗がん剤のスクリーニング方法。
- カルシニューリン阻害薬を含有してなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドの誘導剤。
- カルシニューリン阻害薬がFK506である、請求項13に記載の剤。
- 請求項13又は14に記載の剤と、外来性の初期化因子を導入した大腸がん細胞由来であって、外来性の初期化因子を導入していない大腸がん細胞の薬剤排除能を抑制するのに有効な濃度のABCトランスポーター阻害薬の存在下で、薬剤排除能を有する、大腸がん幹細胞とを含んでなる、大腸がん幹細胞の維持増幅又は大腸がんオルガノイドオルガノイドの誘導用キット。
- 抗がん剤のスクリーニングのための、請求項15に記載のキット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により誘導された大腸がんオルガノイド。
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