WO2018207789A1 - 疾患ｉＰＳ細胞を用いた神経毒性評価モデル系及びその使用 - Google Patents

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WO2018207789A1
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mitochondrial
cell
neurotoxicity
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治久 井上
恵子 今村
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国立大学法人京都大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a drug neurotoxicity evaluation model system using nerve cells derived from an induced pluripotent stem cell (iPS cell) derived from a patient with Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), and a drug using the model system
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • CMT Charcot-Marie-Tooth disease
  • the present invention relates to a method for evaluating neurotoxicity.
  • predicting the toxicity of a candidate drug is an essential step.
  • the safety and effectiveness of candidate drugs are verified through clinical studies targeting humans through animal experiments, etc., but the effects of drugs may differ between animals and humans, and candidates that have advanced to clinical research
  • the reality is that about 40% of drugs are forced to stop development due to unexpected side effects. Therefore, in recent years, research has been conducted to predict drug toxicity by investigating candidate drugs using human cells prepared from iPS cells at an early stage of development, so that drug development can be performed more efficiently and at low cost. Toxicity evaluation systems using iPS cell-derived cardiomyocytes and hepatocytes have been reported so far. Neurotoxicity is an important item to be evaluated in drug discovery, along with cardiotoxicity and hepatotoxicity.
  • Non-Patent Document 1 a major type of drug-induced neurotoxicity, axonal degeneration, is caused by certain anticancer drugs but was tested for anticancer drug-induced neurotoxicity using an in vitro model.
  • Non-Patent Document 1 it has not yet been clarified which evaluation system using iPS cell-derived neurons is an evaluation system reflecting actual clinical side effects.
  • the neurotoxicity evaluation model system can be established by identifying neuronal phenotypes that well reflect clinical symptoms by cell assays using human iPS cell-derived neurons. Is eager to do.
  • an object of the present invention is to identify a cell assay system using human iPS cell-derived neurons that well reflects the clinical side effects of drug-induced neurotoxicity, and to identify cell phenotypes that serve as an index of evaluation.
  • the present inventors used iPS cells prepared from a CMT patient that is highly sensitive to an anticancer agent and easily exhibits neuropathy as a side effect.
  • CMT is the most common inherited peripheral neurological disease, affecting approximately 1 in 2,500 people worldwide.
  • CMT causes progressive muscle wasting, weakness, sensory disturbances and foot deformities.
  • the present inventors prepared iPS cells from a CMT patient having a mutation in the gene encoding mitochondrial protein Mitofusin-2 (MFN2), differentiated into nerve cells including motor neurons, and created a neurotoxicity evaluation model. .
  • MFN2 mitochondrial protein Mitofusin-2
  • CMT-N CMT patient iPS cell-derived neurons
  • control healthy human iPS cells-derived neurons
  • CMT-N CMT patient iPS cell-derived neurons
  • mitochondria in neurites are morphologically short and have low mobility.
  • administration of an anticancer drug known to cause neurotoxicity in the neurosphere assay resulted in mitochondrial aggregation with ATP deficiency in the neurites in both CMT-N and control. It was revealed that CMT-N was more prominent. Based on these findings, the present inventors have concluded that the present cell model is useful as a novel neurotoxicity evaluation system, and have completed the present invention.
  • a method for evaluating neurotoxicity of a compound to humans comprising the following steps (1) to (3): (1) A step of contacting a test compound with a neuron differentiated from CMT human iPS cells (2) The following (a) to (c) in the neuron: (A) Mitochondrial condition in neurite (b) ATP level in neurite (c) Step of assaying one or more phenotype selected from the group consisting of MFN2 protein level (3) No contact with test compound Selecting a test compound that exacerbates the phenotype of (2) as a compound that may cause neurotoxicity to humans compared to the control [2] expression tested in step (2) The method according to [1], wherein the type is the phenotype of (a) and / or (b).
  • Steps (1) and (2) are further performed using control neurons differentiated from healthy human iPS cells instead of neurons induced from CMT human iPS cells, Compared with control neurons, test compounds in which the phenotype of (2) showed a tendency to exacerbate in neurons differentiated from CMT human iPS cells are more likely to cause neurotoxicity to humans
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein CMT has a mutation in the MFN2 gene.
  • the mutation in the MFN2 gene is H128Y or R94Q.
  • the method according to any one of [1] to [7] wherein the neurotoxicity is axonal degeneration.
  • the present invention provides an in-vitro neurotoxicity evaluation model that well reflects the clinical side effects of neurotoxicity caused by drugs. Therefore, it is possible to predict human neurotoxicity of a candidate drug with higher accuracy than before by performing toxicity evaluation of the drug candidate drug in a cell assay system using the model.
  • FIG. 1 It is a figure which shows preparation of the iPS cell from the CMT patient which has a MFN2 gene mutation.
  • A iPS cells and healthy control cells prepared from CMT patients with MFN2 gene mutation showed ES cell-like morphology (phase contrast micrograph) and expressed pluripotent stem cell markers Nanog and SSEA4 . Scale bar is 100 ⁇ m.
  • B The CMT cell line had an M1282 gene mutation of H128Y or R94Q.
  • Red mitochondria stained with Mitotracker
  • blue neurite stained with ⁇ III tubulin.
  • A, b Exposure to 1 ⁇ M paclitaxel for 24 hours increased mitochondrial aggregation in CMT neurons compared to control neurons.
  • red indicates mitochondria stained with Mitotracker
  • blue indicates ⁇ III-tubulin positive neurites.
  • the present invention relates to a method for evaluating the neurotoxicity of a test compound using a neuron obtained by inducing differentiation of a CMT human iPS cell, preferably an iPS cell derived from a CMT patient having a mutation in the MFN-2 gene.
  • CMT human iPS cells are not only iPS cells established from somatic cells derived from CMT patients, but also somatic cells derived from humans who have not developed CMT and have a genetic mutation that correlates with the disease. It is also used to include iPS cells established from the above.
  • the CMT individual from which somatic cells are collected is not particularly limited as long as it is a CMT patient or an undeveloped human individual having a gene mutation correlated with CMT.
  • CMT demyelinating type
  • type 2 CMT axon type
  • somatic cells derived from any patient can be used.
  • Preferred is a human having a mutation in the MFN2 gene, and more preferred is a human having a mutation in the coding region of MFN2.
  • MFN2 is associated with mitochondrial fusion and mitochondrial axonal transport.
  • a mutation of the MFN2 gene for example, a mutation in which the 128th histidine in the amino acid sequence of MFN2 is converted, preferably a mutation in which the 128th histidine is replaced with another amino acid, preferably tyrosine (H128Y), or the 94th Examples include, but are not limited to, mutations in which arginine is converted, preferably a mutation in which 94th arginine is replaced with another amino acid, preferably glutamine (R94Q).
  • Somatic cell refers to any human cell except germline cells or totipotent cells such as eggs, oocytes, ES cells. Somatic cells include, but are not limited to, fetal somatic cells, neonatal somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells, passaged cells, and Any cell line is encompassed.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreatic cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
  • iPS cells can be produced by introducing a specific reprogramming factor into somatic cells in the form of DNA or protein, for example, almost the same characteristics as ES cells, such as pluripotency And an artificial stem cell derived from a somatic cell having the ability to proliferate by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131 : 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666 ).
  • the reprogramming factor is a gene that is specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, or a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, Or you may be comprised by the low molecular weight compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [for example, small molecule inhibitors such as valproate (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg , Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNApoolSmartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901), Glycogen synthase kinase-3 inhibitors (eg, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2, Nucleic acid expression inhibitors such as
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vector (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (WO 2010/008054) and the like.
  • Artificial chromosome vectors include, for example, human artificial chromosome cage (HAC), yeast artificial chromosome cage (YAC), bacterial artificial chromosome cage (BAC, PAC) cage and the like.
  • HAC human artificial chromosome cage
  • YAC yeast artificial chromosome cage
  • BAC bacterial artificial chromosome cage
  • plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, polyadenylation site, etc. so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • the above vector has a loxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
  • RNA form it may be introduced into somatic cells by, for example, lipofection, microinjection, etc., and RNA containing 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) ® is used to suppress degradation. Yes (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • Examples of the culture solution for iPS cell induction include DMEM, DMEM / F12 or DME culture solution containing 10-15% FBS (these culture solutions include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L- Glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. may be included as appropriate.) Or commercially available culture broth [eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES Cell culture medium (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology)), etc.
  • culture medium for mouse ES cell culture TX-WES culture medium, Thrombo X
  • primate ES Cell culture medium primaryate ES / iPS cell culture medium, Reprocell
  • serum-free medium mTeSR, Stemcell Technology
  • the somatic cell and the reprogramming factor are contacted on DMEM or DMEM / F12 containing 10% FBS for about 4 to 7 days. Then, re-spread the cells on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and use bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact of the somatic cells with the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 10% FBS-containing DMEM culture medium including LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 5% CO 2 at 37 ° C. can be suitably included with puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.
  • ES-like colonies after about 25 to about 30 days or more .
  • somatic cells to be reprogrammed themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin- 5 (WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)) are exemplified.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845).
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate can do.
  • a neuron refers to a cell expressing at least ⁇ III-tubulin and / or a MAP2 neuron marker, preferably SMI-32 and / or Isl1 It is a motor neuron that expresses.
  • a method for inducing differentiation of a neuron from the aforementioned iPS cells is not particularly limited, but is a method for inducing differentiation by high-density culture on a fibroblast feeder layer (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-201792), or by co-culture with stromal cells.
  • Differentiation induction methods SDIA method
  • SFEB method differentiation induction methods by suspension culture (SFEB method)
  • SFEB method suspension culture
  • an adhesion culture method in which iPS cells are adhered to a coated culture dish, and the additives are appropriately changed and cultured in an arbitrary medium.
  • Examples of the coating agent used in the adhesion culture method include Matrigel, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, fibronectin, laminin, and combinations thereof. A combination of poly-L-lysine and laminin is preferable.
  • Examples of the medium used in the adhesion culture method include those obtained by appropriately adding additives to a basic medium.
  • a basic medium for example, Neurobasal medium, Neural Progenitor Basal medium, NS-A medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium , ⁇ MEM medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof are not particularly limited as long as they can be used for animal cell culture. More preferably, it is a mixture of Neurobasal medium and DMEM / F12.
  • Additives include serum, serum replacement (KSR) (Invitrogen), retinoic acid (RA), BMP inhibitor, TGF ⁇ family inhibitor, Sonic Hedgehog (SHH), bFGF (FGF-2), FGF-8, EGF, HGF, LIF, BDNF, GDNF, NT-3, amino acids, vitamins, interleukins, insulin, transferrin, heparin, heparan sulfate, collagen, fibronectin, progesterone, selenite, B27-supplement, N2-supplement, ITS-supplement, Antibiotics and mercaptoethanol are listed.
  • Noggin, chordin, follistatin, Dorsomorphin LDN-193189, etc. are illustrated as a BMP inhibitor.
  • TGF ⁇ family inhibitors examples include SB431542, SB202190, SB505124, NPC30345, SD093, SD908, SD208, LY2109761, LY364947, LY580276, and A-83-01. These additives can be used in appropriate combination.
  • Preferred additive combinations include (1) Nogin and SB431542, (2) Nogin, B27-supplement and N2-supplement, (3) Retinoic acid, Sonic Hedgehog, B27-supplement and N2-supplement or (4) BDNF , GDNF, NT-3, B27-supplement and N2-supplement. These combinations can also be used in combination.
  • the concentration of iPS cells at the start of culture can be appropriately set so as to efficiently form neurons.
  • the concentration of iPS cells at the start of culture is not particularly limited, and is, for example, about 1 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably about 1 ⁇ 10 4 to about 5 ⁇ 10 5 cells / ml. .
  • culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • a modified SFEBq method in which a neurosphere is formed and adhered to a culture dish that has been coated and then cultured in an arbitrary medium while appropriately changing additives.
  • a cell non-adhesive incubator As a non-cell-adhesive incubator, the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells, or artificial
  • a coating treated with adhesion eg, polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA)
  • Lipidure eg, Lipidure
  • culture can be performed using the above basic medium and additives.
  • Preferred media include DMEM / F12 mixtures or Neurobasal media.
  • preferable additive combinations include (1) Dorsomorphin and SB431542 or (2) retinoic acid, Sonic Hedgehog, FGF-2 and B27-supplement. These combinations can also be used in combination.
  • the cell concentration at the start of formation of the neurosphere can be appropriately set so as to efficiently form the neurosphere.
  • the concentration of cells at the start of the culture is not particularly limited, and is, for example, about 1 ⁇ 10 4 to about 5 ⁇ 10 6 cells / ml, preferably about 5 ⁇ 10 5 to about 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • any of the above-mentioned coating agents can be used, but preferably Matrigel.
  • the culture can be performed using the basic medium and additives described above.
  • a preferred medium is Neurobasal medium.
  • BDNF, GDNF, and NT-3 are mentioned as a preferable combination of additives.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • neuronal cells thus induced can be isolated and purified using, for example, antibodies against neuronal markers such as ⁇ III-tubulin and MAP2 or motor neuron markers such as SMI-32 and Isl1. .
  • the present invention is a method in which a neuron derived from a human iPS cell of CMT obtained by the above-described method is brought into contact with a test compound, and the neurotoxicity of the test compound is determined by using each index.
  • a method for evaluation evaluation method of the present invention is provided.
  • the evaluation method of the present invention includes the following steps (1) to (3).
  • a step of contacting a test compound with a neuron (CMT-N) induced to differentiate from human iPS cells of CMT (2) The following (a) to (c) in the neuron: (A) Mitochondrial condition in neurite (b) ATP level in neurite (c) Step of assaying one or more phenotype selected from the group consisting of MFN2 protein level (3) No contact with test compound Selecting a test compound that exacerbates the phenotype of (2) as a compound that may cause neurotoxicity to humans as compared with the control
  • the contact between CMT-N and the test compound in the step (1) can be performed, for example, by adding the test compound to the maintenance medium of CMT-N.
  • test compounds include cell extracts, cell culture supernatants, microbial fermentation products, marine organism extracts, plant extracts, purified proteins or crude proteins, peptides, non-peptide compounds, synthetic low molecular compounds, natural compounds Etc.
  • it is a drug candidate compound.
  • Test compounds are also (1) biological libraries, (2) synthetic library methods using deconvolution, (3) “one-bead one-compound” library methods, and ( 4) can be obtained using any of a number of approaches in combinatorial library methods known in the art, including synthetic library methods using affinity chromatography sorting.
  • Biological library methods using affinity chromatography sorting are limited to peptide libraries, but other approaches can be applied to small molecule compound libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the addition concentration of the test compound can be appropriately selected according to the type of the compound, but in the case of a drug candidate compound, it can be selected based on the concentration at which the target drug effect can be sufficiently exerted.
  • the time during which CMT-N is contacted with the test compound is not particularly limited.
  • various phenotypes that serve as indicators of neurotoxicity in step (2) are more prominent than those in healthy human iPS cell-derived neurons (control).
  • the time to become For example, when the test compound is vincristine, paclitaxel, etc., about 10 minutes to about 6 hours, preferably about 20 minutes to about 3 hours, more preferably about 30 minutes to about 2 hours (eg, about 1 hour). It can be illustrated.
  • the above-mentioned steps (1) and (2) are similarly performed on healthy human iPS cell-derived neurons (control), and the control is performed in CMT-N.
  • whether or not a phenotype showing neurotoxicity is more prominent can be used as a further evaluation index of neurotoxicity.
  • neuronal phenotypes that are indicators of neurotoxicity include (a) mitochondrial status in neurites, (b) ATP levels in neurites, and (c) MFN2 protein levels. It is done. Preferably, the phenotype (a) or (b) is used as an indicator.
  • mitochondrial status in neurites include mitochondrial length, mitochondrial morphology, mitochondrial aggregation, mitochondrial mobility, and mitochondrial number. Mitochondrial length and morphology can be assayed by electron microscopy.
  • mitochondrial aggregation and mitochondrial mobility can be achieved by, for example, introducing a construct in which a mitochondrial transition signal sequence is linked to a fluorescent protein gene under the control of a motor neuron-specific promoter (eg, HB9 promoter) into a neuron. It can be carried out by visualizing and observing mitochondria. The number of mitochondria can be counted by staining mitochondria with Mitotracker or the like. Measurement of ATP level in neurites and measurement of MFN2 protein level in nerve cells can be performed by conventional methods.
  • a motor neuron-specific promoter eg, HB9 promoter
  • neurospheres are made from differentiated neurons to exclude mitochondria in the neural body, and this is used as an extracellular matrix (eg, laminin, matrigel, fibronectin) , Retronectin, etc. (preferably laminin), seeded in a culture vessel and cultured until adhesion of neurospheres is observed from adhering neurospheres, and if necessary, the core of neurospheres is removed by pipetting, etc. It is preferable to implement.
  • extracellular matrix eg, laminin, matrigel, fibronectin
  • Retronectin preferably laminin
  • step (3) the CMT-N phenotype when contacted with the test compound tested in step (2) is compared with the phenotype when the compound is not contacted.
  • mitochondrial aggregation in neurites is shorter when mitochondrion length in neurites is shorter and mitochondrial form in neurites is shorter than when not in contact with test compounds
  • High degree of mitochondrial mobility in neurites decreased mitochondrial number in neurites, decreased ATP levels in neurites, MFN2 protein levels in neurons
  • the test compound can be selected as a compound that has or is likely to cause neurotoxicity to humans. If the test compound is a pharmaceutical candidate compound, the selected compound can be excluded from the development candidates.
  • test compound if there is no significant difference in the above phenotype when contacted with a test compound compared to when not contacted, the test compound is not likely to cause neurotoxicity to humans. Or it is judged that the possibility is low, and drug discovery research can be continued as a development candidate.
  • Neurotoxicity can be classified into axonal degeneration, nerve cell damage, and myelinopathy according to the site of damage, but the evaluation method of the present invention is an evaluation model system for axonal degeneration.
  • the CMT-N of the present invention was used to evaluate the sensitivity of an existing drug compound in an individual patient (or a group of patients having the same causative gene mutation). (Patient group classification (eg, responders and non-responders)). Furthermore, the present invention can be applied to identify drug sensitivity marker genes by comparing the results of comprehensive gene expression analysis among classified patient groups.
  • iPS cells have OCT3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, dominant negative p53, or OCT3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, p53-shRNA
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CMT1 and CMT2 CMT1 and CMT2 gene mutation
  • control 1 and control 2 Human iPS cells were prepared (Table 1).
  • Genotyping of single nucleotide mutations in the MFN2 gene was performed by PCR amplification and direct sequencing of genomic DNA (3500 ⁇ L Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Waltham, Mass.).
  • Neurons with adherent embryoid bodies supplemented with brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (10 ng / ml), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) (10 ng / ml) and NT-3 (10 ng / ml) P2 stage culture was performed in basal medium. They were peeled from the culture vessel by Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, Calif.) And dissociated into small clumps or single cells. In the P3 maturation phase, the cells were cultured on the 35th day in a 24-well culture vessel coated with Matrigel so that the number of cells was 500,000 per well.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • NT-3 10 ng / ml
  • iPS cell-derived neurons For Western blotting iPS cell-derived neurons, differentiated cells were treated with cytosine arabinoside (Ara C) (Sigma Aldrich). Three days after removing Ara C, cells were harvested and lysed. Cells (iPS cell-derived nerve cells) are mixed with TS buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 5 mM ethylene glycol bis ( ⁇ -amino) containing 1% Triton X-100. Ethyl ether) -N, N, N, N-tetraacetic acid and protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland)) for 10 minutes on ice.
  • TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 5 mM ethylene glycol bis ( ⁇ -amino) containing
  • Live cell images were acquired on the 50th day of live imaging of axonal mitochondrial mobility .
  • HB9 Turbo RFP-mito positive neurons were selected, and mitochondrial mobility in neurites was observed by time-lapse photography. Viable cells were photographed using a Carl Zeiss LSM710 microscope equipped with a x60 lens and incubation chamber. Cells were kept at 37 ° C. and 5% CO 2 during imaging. Cells into which nucleic acid had been introduced were selected, and mitochondrial mobility in neurites was observed by time-lapse photography. Images were taken every 3 seconds for 5 minutes and analyzed by chromograph. Chymographs were created using Meta Morph Software (Molecular Device, Sunnyvale, CA). Migrating mitochondria were classified as either migrating or stationary based on whether there was 2 ⁇ m migration. In each chromograph, mitochondria migrating were counted.
  • Motor neurons were purified by flow cytometry according to the method reported in electron microscope observation . All sorting procedures were performed using FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). On day 50 after infection with HB9 :: GFP lentivirus, differentiated cells were dissociated into single cells by Accutase (Innovative Cell Technologies) for cell sorting. HB9 :: GFP positive cells (about 2% of all sorted cells) were selected and seeded on a 96-well plate coated with Matrigel at 20,000 to 30,000 cells per well. The next day, purified motor neurons were fixed with paraformalin (PFA) and 2% glutaraldehyde adjusted to 4% with PBS at room temperature and incubated overnight at 4 ° C. Ultrathin section analysis was performed at 80 kV with a transmission electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan, H7650). Mitochondrial length in neurites was measured with 7 random images using ImageJ.
  • PFA paraformalin
  • the neurosphere assay was introduced to exclude mitochondria from neurites.
  • Day 60 neurons are dissociated with Accutase, collecting 25,000 cells per well in a U-bottom 96-well plate, containing 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, and 10 ng / ml NT-3 Cultured in neurobasal medium.
  • Neurospheres were formed after 24 hours and cultured for 7 days. The formed neurospheres were seeded on a culture container coated with laminin, and neurites derived from adherent neurospheres were elongated for 3 days.
  • ATP measurement in neurites was seeded in 24-well plates so that 10 neurospheres per hole were obtained, and cultured for 7 days. After removing the neurosphere core by pipetting, the media was removed from the wells and ATP levels in the neurites were measured using the CellTitier-Glo fluorescent cell viability assay (Promega, Fitchburg, WI). The protein concentration in the cell lysate used for ATP measurement was measured by BCA assay, thereby correcting the ATP level.
  • IPS cells prepared from CMT patients iPS cells were prepared from two CMT patients having a mutation of H128Y or R94Q in the MFN2 gene and two healthy individuals (FIG. 1a, Table 1). Next, motor neurons were prepared from iPS cells. IPS cells derived from CMT patients and motor neurons produced therefrom had mutations in the MFN2 gene (FIG. 1b).
  • MFN2 Biochemical properties were examined by Western blot analysis. An increase in MFN2 was observed in a group of neurons derived from iPS cells of CMT patients (FIGS. 2a and b). This indicates that the mutation of the gene encoding MFN2 changes the biochemical properties of the MFN2 protein.
  • MFN2 is known to function in mitochondrial fusion. It has already been reported that calf nerve biopsy in CMT patients showed abnormalities such as small, round and aggregated mitochondria in the axon. Therefore, CMT patients with mutations in the MFN2 gene were known to exhibit damage in motor neurons, and the mitochondrial length in the neurites of purified CMT motor neurons was examined. The mitochondrial length in neurites of CMT neurons was shorter than that in healthy subjects, and was clearly aggregated in neurites, along with abnormal mitochondria lacking a raised part (Fig. 2c, d). These data suggest that CMT neurons do not undergo mitochondrial fusion and reproduce the pathological features seen in CMT patient biopsy samples.
  • a neurosphere assay system was established and the number of mitochondria in neurites was analyzed.
  • This assay system allowed efficient evaluation of mitochondria in neurites, excluding mitochondria from the neuronal body.
  • neurospheres were prepared from differentiated neurons on day 60, seeded in culture containers coated with laminin, and cultured for 3 days. This was followed by neurite outgrowth from the neurosphere with slight neuronal movement (Figure 3b).
  • the number of mitochondria stained with Mitotracker was analyzed by a multifunctional analyzer. As a result, it was found that the number of neurite-stained spots was decreased in CMT neurons compared to control neurons (FIGS. 3c and d).
  • ATP levels in neurites collected after removal of the neurosphere core were evaluated. Compared to control neurons, CMT neurons showed a decrease in ATP levels (FIG. 3e).
  • the evaluation method of the present invention uses a cell assay using iPS cell-derived neurons of CMT patients, and an evaluation model that well reflects clinical symptoms of neurotoxicity caused by drugs by using mitochondrial abnormalities in neurites as indicators. Useful as a system.

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Abstract

本発明は、以下の（１）～（３）の工程を含む、化合物のヒトに対する神経毒性の評価方法を提供する。 （１）CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞（CMT-N）と試験化合物とを接触させる工程 （２）当該神経細胞における、以下の（ａ）～（ｃ）：　（ａ）神経突起中のミトコンドリアの状態　（ｂ）神経突起中のATPレベル　（ｃ）MFN2タンパク質レベル からなる群より選択される1以上の表現型を検定する工程 （３）試験化合物と接触させなかった対照と比較して、（２）の表現型を増悪させた試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がある化合物として選択する工程

Description

疾患ｉＰＳ細胞を用いた神経毒性評価モデル系及びその使用
　本発明は、シャルコー・マリー・トゥース病（CMT）患者由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）から誘導した神経細胞を用いた、薬剤の神経毒性評価モデル系、並びに当該モデル系を用いた薬剤の神経毒性評価方法に関する。
　医薬品の開発において、候補薬の毒性予測は不可欠のステップである。実際には、動物実験などを経て、ヒトを対象とした臨床試験で候補薬の安全性や有効性を検証するが、動物とヒトで薬剤の作用が異なる場合があり、臨床研究まで進んだ候補薬の約40%が予期せぬ副作用により開発中止を余儀なくされているのが現実である。
　そこで近年では、開発の早い段階で、iPS細胞から作製したヒト細胞を用いて候補薬を調べることにより毒性を予測し、創薬開発をより効率的かつ低コストで行えるようにしようとする研究が注目されており、これまでに、iPS細胞由来の心筋細胞や肝細胞を用いた毒性評価系が報告されている。
　神経毒性は心毒性や肝毒性と並び、創薬において評価すべき重要な項目である。例えば、薬剤誘導性の神経毒性において主要な型である軸索変性症は、ある種の抗がん剤によって引き起こされるが、in vitroモデルを用いて抗がん剤誘導性の神経毒性を試験したことが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、iPS細胞由来の神経細胞を用いたどのような評価系が実際の臨床的副作用を反映した評価系なのかは未だ明らかになっていない。数多ある細胞アッセイ系と表現型の中から、臨床症状をよく反映する神経細胞の表現型を、ヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた細胞アッセイにより同定することが、神経毒性評価モデル系を確立するために切望されている。
Nakamura, H. et al. J Pharmacol Sci. 128, 170-178 (2015)
　従って、本発明の課題は、薬剤による神経毒性の臨床的副作用をよく反映するヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた細胞アッセイ系及び評価の指標となる細胞の表現型を同定し、in vitroの神経毒性評価モデル系を確立することであり、当該モデル系を用いて、高確度に医薬品候補薬剤のヒト神経毒性を予測する手段を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を達成するために、抗がん剤に対して高感受性で、副作用として神経障害を示しやすいCMT患者から作製したiPS細胞を使用した。CMTは、最も一般的な遺伝性の末梢神経疾患であり、世界中で2,500人のうち約1人が罹患している。CMTは、徐々に進行する筋萎縮、衰弱、感覚障害および足変形を引き起こす。本発明者らは、ミトコンドリアタンパク質のMitofusin-2（MFN2）をコードする遺伝子に変異を有するCMT患者からiPS細胞を作製し、運動神経を含む神経細胞に分化させて、神経毒性評価モデルを作製した。
　次いで、本発明者らは、CMT患者iPS細胞由来神経細胞（CMT-N）と健常人iPS細胞由来神経細胞（対照）との間で表現型を比較分析し、CMT-Nでは、対照に比べて、神経突起におけるミトコンドリアが形態的に短く、移動性が低いことを見出した。また、ニューロスフェア・アッセイにおいて、神経毒性を引き起こすことが知られている抗がん剤を投与すると、CMT-Nと対照の両方で、神経突起内でATP欠乏を伴うミトコンドリアの凝集が生じたが、CMT-Nでより顕著であることが明らかとなった。
　本発明者らは、これらの知見に基づいて、本細胞モデルが新規な神経毒性評価系として有用であると結論し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　以下の（１）～（３）の工程を含む、化合物のヒトに対する神経毒性の評価方法。
（１）CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞と試験化合物とを接触させる工程
（２）当該神経細胞における、以下の（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）神経突起中のミトコンドリアの状態
　（ｂ）神経突起中のATPレベル
　（ｃ）MFN2タンパク質レベル
からなる群より選択される1以上の表現型を検定する工程
（３）試験化合物と接触させなかった対照と比較して、（２）の表現型を増悪させた試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がある化合物として選択する工程
［２］　工程（２）において検定される表現型が、（ａ）及び／又は（ｂ）の表現型である、［１］記載の方法。
［３］　神経突起中のミトコンドリアの状態が、ミトコンドリア長、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの凝集、ミトコンドリアの移動性、ミトコンドリア数から選択される、［１］又は［２］記載の方法。
［４］　神経細胞が、神経突起を伸長させた付着性ニューロスフェアである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞の代わりに、健常人のiPS細胞から分化誘導された対照神経細胞を用いて、（１）及び（２）の工程をさらに行い、該対照神経細胞に比べて、CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞において、（２）の表現型が増悪傾向を示した試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がより高い化合物として選択することを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］　CMTがMFN2遺伝子に変異を有するものである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　MFN2遺伝子の変異がH128Y又はR94Qである、［６］記載の方法。
［８］　神経毒性が軸索変性症である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、薬剤による神経毒性の臨床的副作用をよく反映するin vitroの神経毒性評価モデルが提供される。よって、当該モデルを用いた細胞アッセイ系にて医薬品候補薬剤の毒性評価を実施することにより、従来よりも高確度に、候補薬のヒト神経毒性を予測することが可能となる。
MFN2遺伝子変異を有するCMT患者からのiPS細胞の作製を示す図である。（ａ）MFN2遺伝子変異を有するCMT患者から作製したiPS細胞及び健康な対照細胞は、ES細胞様の形態を示し（位相差顕微鏡像）、多能性幹細胞マーカーのNanogとSSEA4を発現していた。スケールバーは100μm。（ｂ）CMT細胞株は、H128Y又はR94QのMFN2遺伝子変異を有していた。（ｃ、ｄ）分化した神経細胞を神経細胞マーカーのβIIIチューブリン、および運動神経細胞マーカーのSMI32で染色した。スケールバーは100μm。分化における特徴は対照細胞株とCMT細胞株の間で異なることはなかった（n=6）。 ミトコンドリア形態と、CMT患者から作製したiPS細胞に由来する運動神経細胞の神経突起中でのミトコンドリアの移動性に変化が見られたことを示す図である。（ａ、ｂ）MFNタンパク質レベルがCMT神経細胞で増加していることをウェスタンブロット分析で確認した（n=3, one-way ANOVE; p<0.05, post-hoc test; *p<0.05）。（ｃ、ｄ）電子顕微鏡によって分析した精製したCMT運動神経細胞の神経突起中のミトコンドリア長。スケールバーは500nm。CMT神経細胞のミトコンドリア長は、対照神経細胞と比べると短かった（1つの細胞株当たりn=38～67ミトコンドリア, one-way ANOVE; p<0.05, post-hoc test; *p<0.05）。矢印は異常なミトコンドリアを示す。（ｅ、ｆ）低速度撮影によって測定した神経突起におけるミトコンドリアの移動度。ミトコンドリア・ターゲティング配列に融合させたHB9::turbo RFPで運動神経細胞をラベルし、分析した。キモグラフの典型的データを（ｅ）に示す。CMT神経細胞の移動しているミトコンドリア数は、対照神経細胞と比べると減少していた（1つの細胞株当たりn=20～44, one-way ANOVE; p<0.05, post-hoctest; *p<0.05）。 CMT神経細胞の神経突起において、ATP欠乏を伴うミトコンドリア数の減少が起きていることを示す図である。（ａ）ニューロスフェアは、60日目に生じた。スケールバーは100μm。（ｂ）接着性ニューロスフェアから神経突起が伸長した（βIIIチューブリンで染色）。神経突起中のミトコンドリアを評価した。スケールバーは100μm。（ｃ、ｄ）Mitotrackerでミトコンドリアを染色した。スケールバーは15μm。βIIIチューブリン陽性神経突起中の非凝集ミトコンドリア数を計数した。CMT神経細胞の神経突起においては、対照神経細胞と比べ、ミトコンドリア数が減少していた（n=12～18フィールド, one-way ANOVE; p<0.05, post-hoc test; *p<0.05）。（ｅ）CMT神経細胞の神経突起においては、対照神経細胞と比べ、ATPレベルが減少していた（n=6, one-way ANOVE; p<0.05, post-hoc test; *p<0.05）。 神経障害の原因となる薬剤による神経突起中のミトコンドリア凝集体形成を示す図である。（ａ、ｂ）1μMのビンクリスチンに1時間曝したことで、CMT神経細胞にミトコンドリアの凝集体が生じた。1μMのビンクリスチンに24時間曝したことで、CMT神経細胞と対照神経細胞にミトコンドリアの凝集体が生じた。赤：Mitotrackerで染色したミトコンドリア、青：βIIIチューブリンで染色した神経突起。スケールバーは15μm（n=36フィールド, two-way ANOVE; p<0.05, post-hoc test; *p<0.05）。 パクリタキセルによる神経突起中のミトコンドリア凝集体形成を示す図である。（ａ、ｂ）1μM パクリタキセルに24時間曝露すると、対照神経細胞に比べて、CMT神経細胞においてミトコンドリアの凝集が増大した。図５ａ中、赤色はMitotrackerで染色されたミトコンドリアを、青色はβIII-チューブリン陽性の神経突起を示す。スケールバー = 15 μm (n = 36 視野, one-way ANOVA; p < 0.05, post hoc test; * p < 0.05)。
　本発明は、CMTのヒトiPS細胞、好ましくは、MFN-2遺伝子に変異を有するCMT患者由来のiPS細胞を分化誘導して得られた神経細胞を用いて、試験化合物の神経毒性を評価する方法を提供する。
　尚、本明細書において「CMTのヒトiPS細胞」とは、CMT患者由来の体細胞から樹立されたiPS細胞だけでなく、当該疾患と相関する遺伝子変異を有するCMT未発症のヒト由来の体細胞から樹立されたiPS細胞をも包含する意味で用いられる。
　本発明において、体細胞を採取する由来となるCMT個体は、CMT患者又はCMTと相関する遺伝子変異を有する未発症のヒト個体であれば特に制限されない。CMTの臨床においては、脱髄型（1型CMT）及び軸索型（2型CMT）に分けられるが、いずれの患者由来の体細胞も用いることができる。好ましくは、MFN2遺伝子に変異を有するヒトであり、より好ましくは、MFN2のコーディング領域に変異を有するヒトである。MFN2はミトコンドリアの融合及びミトコンドリアの軸索輸送と関連する。MFN2遺伝子の変異として、例えば、MFN2のアミノ酸配列における128番目のヒスチジンが変換される変異、好ましくは128番目のヒスチジンが他のアミノ酸、好ましくはチロシンに置換される変異（H128Y）、あるいは94番目のアルギニンが変換される変異、好ましくは94番目のアルギニンが他のアミノ酸、好ましくはグルタミンに置換される変異（R94Q）が挙げられるが、それらに限定されない。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆるヒト細胞をいう。体細胞には、非限定的に、胎児の体細胞、新生児の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞 (膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
I. iPS細胞の製造方法
　iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標） (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター (Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体 (HAC)、酵母人工染色体 (YAC)、細菌人工染色体 (BAC、PAC) などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる (Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子 (例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、βグルクロニダーゼ (GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にloxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies) を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15% FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液 [例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）] などが含まれる。
　培養法の例としては、たとえば、37℃、5% CO2存在下にて、10% FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上で10% FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1%以上、15%以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100 cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
II. 神経細胞の分化誘導法
　本発明において、神経細胞とは、少なくともβIII-チューブリン及び／又はMAP2の神経細胞マーカーを発現している細胞を言い、好ましくはさらにSMI-32及び／又はIsl1を発現する運動神経細胞である。
　前述のiPS細胞から、神経細胞を分化誘導する方法として、特に限定されないが、線維芽細胞フィーダー層上での高密度培養による分化誘導法（特開2008-201792）、ストローマ細胞との共培養による分化誘導法（SDIA法）（例えば、WO2001/088100、WO/2003/042384）、浮遊培養による分化誘導法（SFEB法）（WO2005/123902）およびそれらの組み合わせによる方法を利用することができる。
　他の態様として、コーティング処理された培養皿にiPS細胞を接着させて、任意の培地中で適宜添加物を変えて培養する接着培養法が例示される。
　当該接着培養法で用いるコーティング剤としては、例えば、マトリゲル、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－L－リジン、ポリ－D－リジン、フィブロネクチン、ラミニンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、ポリ－L－リジンとラミニンの組み合わせである。
　当該接着培養法で用いる培地としては、基本培地へ添加剤を適宜加えたものを挙げることができる。基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。より好ましくは、Neurobasal培地およびDMEM/F12の混合物である。添加剤として、血清、血清代替物（KSR）(Invitrogen)、レチノイン酸（RA）、BMP阻害剤、TGFβファミリー阻害剤、Sonic Hedgehog（SHH）、bFGF（FGF-2）、FGF-8、EGF、HGF、LIF、BDNF、GDNF、NT-3、アミノ酸、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、B27-サプリメント、N2-サプリメント、ITS-サプリメント、抗生物質、メルカプトエタノールが挙げられる。
　ここで、BMP阻害剤として、Noggin、chordin、follistatinおよびDorsomorphin LDN-193189などが例示される。また、TGFβファミリー阻害剤として、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LY580276およびA-83-01などが例示される。これらの添加剤は、適宜組み合わせて用いることができる。好まし添加剤の組み合わせとしては、（１）NoginおよびSB431542、（２）Nogin、B27-サプリメントおよびN2-サプリメント、（３）レチノイン酸、Sonic Hedgehog、B27-サプリメントおよびN2-サプリメントまたは（４）BDNF、GDNF、NT-3、B27-サプリメントおよびN2-サプリメントが挙げられる。これらの組み合わせを、さらに組み合わせて用いることもできる。
　培養開始時のiPS細胞の濃度は、効率的に神経細胞を形成させるように適宜設定できる。培養開始時のiPS細胞の濃度は、特に限定されないが、例えば、約1×103～約1×106細胞/ml、好ましくは約1×104～約5×105細胞/mlである。
　培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
　他の態様として、ニューロスフェアの形成後コーティング処理された培養皿に接着させて、任意の培地中で適宜添加物を変えて培養する改変SFEBq法が例示される。当該改変SFEBq法でのニューロスフェアの形成においては、細胞非接着性の培養器を用いることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA））またはLipidure（NOF）によるコーティング処理したものを使用できる。好ましくは、コーティング剤は、Lipidureである。
　当該改変SFEBq法においてニューロスフェアを形成させるために、上記の基本培地ならびに添加剤を用いて培養することができる。好ましい培地として、DMEM/F12の混合物またはNeurobasal培地が挙げられる。また、好ましい添加剤の組み合わせとして、（１）DorsomorphinおよびSB431542または（２）レチノイン酸、Sonic Hedgehog、FGF-2およびB27-サプリメントが挙げられる。これらの組み合わせを、さらに組み合わせて用いることもできる。
　ニューロスフェアの形成開始時の細胞濃度は、効率的にニューロスフェアを形成させるように適宜設定できる。培養開始時の細胞の濃度は、特に限定されないが、例えば、約1×104～約5×106細胞/ml、好ましくは約5×105～約2×106細胞/mlである。
　当該改変SFEBq法において得られたニューロスフェアを培養皿へ接着させるためには、上述したいずれのコーティング剤も用いることができるが、好ましくは、マトリゲルである。
　また、当該改変SFEBq法において接着培養を行う場合、上述した基本培地ならびに添加剤を用いて培養することができる。好ましい培地として、Neurobasal培地が挙げられる。また、好ましい添加剤の組み合わせとして、BDNF、GDNFおよびNT-3が挙げられる。
　当該改変SFEBq法において、温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。
　このように誘導された神経細胞は、例えば、βIII-チューブリン、MAP2等の神経細胞マーカー、あるいは、SMI-32、Isl1等の運動神経細胞マーカーに対する抗体を用いて、単離精製することができる。
III. 薬剤による神経毒性の評価方法
　本発明は、前述の方法によって得られたCMTのヒトiPS細胞由来の神経細胞と試験化合物とを接触させ、各指標を用いることで該試験化合物の神経毒性を評価する方法（本発明の評価方法）を提供する。
　一実施態様において、本発明の評価方法は以下の（１）～（３）の工程を含む。
（１）CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞（CMT-N）と試験化合物とを接触させる工程
（２）当該神経細胞における、以下の（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）神経突起中のミトコンドリアの状態
　（ｂ）神経突起中のATPレベル
　（ｃ）MFN2タンパク質レベル
からなる群より選択される1以上の表現型を検定する工程
（３）試験化合物と接触させなかった対照と比較して、（２）の表現型を増悪させた試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がある化合物として選択する工程
　工程（１）におけるCMT-Nと試験化合物との接触は、例えば、CMT-Nの維持培地中に試験化合物を添加することにより行うことができる。
　試験化合物としては、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物等が挙げられる。好ましくは、医薬品候補化合物である。
　試験化合物はまた、（1）生物学的ライブラリー、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願公開第2002/0103360号）として作製され得る。
　試験化合物の添加濃度は、化合物の種類に応じて適宜選択され得るが、医薬品候補化合物の場合、目的の薬効が十分に発揮され得る濃度を目安にして選択することができる。
　CMT-Nを試験化合物に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは、健常人iPS細胞由来神経細胞（対照）に比べて、工程（２）において神経毒性の指標となる各種表現型が顕著となる時間が挙げられる。例えば、試験化合物がビンクリスチンやパクリタキセル等の場合には、約10分～約6時間、好ましくは約20分～約3時間、より好ましくは約30分～約2時間（例えば、約1時間）を例示することができる。
　この意味において、本発明の評価方法の好ましい一実施態様においては、健常人iPS細胞由来神経細胞（対照）について、同様に前記工程（１）及び（２）を行い、CMT-Nにおいて、対照に比べて、神経毒性を示す表現型がより顕著である場合か否かを神経毒性のさらなる評価指標とすることができる。
　工程（２）において、神経毒性の指標となる神経細胞の表現型としては、（ａ）神経突起中のミトコンドリアの状態、（ｂ）神経突起中のATPレベル、及び（ｃ）MFN2タンパク質レベルが挙げられる。好ましくは、（ａ）又は（ｂ）の表現型が指標として用いられる。
　ここで「神経突起中のミトコンドリアの状態」としては、例えば、ミトコンドリア長、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの凝集、ミトコンドリアの移動性、ミトコンドリア数が挙げられる。ミトコンドリアの長さや形態は、電子顕微鏡観察により検定することができる。また、ミトコンドリアの凝集、ミトコンドリアの移動性は、例えば、運動神経細胞特異的プロモーター（例：HB9プロモーター）の制御下にある蛍光タンパク質遺伝子にミトコンドリア移行シグナル配列を連結したコンストラクトを、神経細胞に導入し、ミトコンドリアを可視化して観察することにより実施することができる。ミトコンドリア数は、Mitotracker等でミトコンドリアを染色して計数することができる。
　神経突起中のATPレベルの測定や神経細胞中のMFN2タンパク質レベルの測定は、常法により行うことができる。
　神経突起中のミトコンドリアの状態やATPレベルを測定する場合、神経体中のミトコンドリアを除外するために、分化した神経細胞からニューロスフェアを作製し、これを細胞外マトリクス（例えば、ラミニン、マトリゲル、フィブロネクチン、レトロネクチン等、好ましくはラミニン）でコーティングした培養容器に播種して付着性ニューロスフェアから神経突起の伸長が認められるまで培養し、必要に応じて、ピペッティング等によりニューロスフェアのコアを除去した後、実施することが好ましい。
　工程（３）において、工程（２）で検定した試験化合物と接触させた場合のCMT-Nの表現型を、該化合物を接触させなかった場合の該表現型と比較する。比較の結果、試験化合物と接触させた場合に、接触させなかった場合に比べて、神経突起中のミトコンドリア長が短い、神経突起中のミトコンドリアの形態が異常である、神経突起中のミトコンドリアの凝集度が高い、神経突起中でミトコンドリアの移動性が低下している、神経突起中のミトコンドリア数が減少している、神経突起中のATPレベルが低下している、神経細胞中のMFN2タンパク質レベルが高い場合、該試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性があるか、その可能性が高い化合物として選択することができる。試験化合物が医薬品候補化合物である場合、当該選択された化合物を、開発候補から除外することができる。言い換えれば、試験化合物と接触させた場合に、接触させなかった場合と比べて、上記の表現型に有意な差がない場合、該試験化合物は、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がないか、可能性が低いと判定し、開発候補として創薬研究を継続することができる。
　神経毒性は、損傷を生じる部位によって、軸索変性症、神経細胞損傷、及び髄鞘障害に分類することができるが、本発明の評価方法は、軸索変性症の評価モデル系である。
　医薬候補化合物の毒性評価系としての用途を強調して記載したが、本発明のCMT-Nは、既存の医薬品化合物の、個々の患者（あるいは同じ原因遺伝子変異を有する患者群）における感受性の評価（患者群の分類（例、レスポンダーと非レスポンダー））にも使用可能である。さらに、分類された患者群間における網羅的遺伝子発現解析結果を比較することにより、薬剤感受性マーカー遺伝子を同定するのにも応用可能である。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
＜材料及び方法＞
iPS細胞の作製と細胞培養
　既報の方法に従って、OCT3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28、ドミナントネガティブp53、又はOCT3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28、p53-shRNAを有するエピソーマルベクターを用いて、MFN2遺伝子変異を有するCMT患者（CMT1及びCMT2）及びMFN2に変異を有しない健常人（control 1及びcontrol 2）由来の末梢血単核細胞（PBMC）またはTリンパ球からヒトiPS細胞を作製した（表１）。4ng/mlのベーシック線維芽細胞増殖因子（FGF；Wako Chemicals、Osaka、Japan）およびペニシリン/ストレプトマイシンを含んだヒトiPS細胞培地（霊長類胚性幹細胞培地；ReproCELL、Yokohama、Japan）を用いて、SNLフィーダー層上で細胞を培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
ジェノタイピング
　ゲノムDNAのPCR増幅およびダイレクトシーケンシング（3500xL Genetic Analyzer、Applied Biosystems、Waltham、MA）によってMFN2遺伝子における一塩基変異のジェノタイピングを行った。
急速胚様体凝集法（SFEBq）による運動神経細胞の誘導
　ヒトiPS細胞を単細胞に解離し、100％エタノールで2％濃度に調整したPluronic（シグマ・アルドリッチ、St. Louis、MO）で予め被覆した再懸濁培養用のU底96穴プレート（Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany）で、急速に再凝集させた。胚様体の凝集塊は、5％DFK培地（Dulbecco's改変Eagle's培地/Ham's F12；サーモフィッシャーサイエンティフィック、Pittsburgh、PA）、5％KSR（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、NEAA（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、L-グルタミン（シグマアルドリッチ）、0.1Mの2-ME（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、2mMのドルソモルフィンと共に、神経細胞誘導段階（P1）で12日間培養した。ビタミンAを含まない2％B27（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、1mMレチノイン酸、Smoothenedアゴニスト（Sonic Hedgehogシグナル活性化剤）（100ng/ml）、およびFGF 2（12.5ng/ml）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したニューロベーサル培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でパターニングを行った後、凝集塊を22日目にMatrigel（コーニング、Tewksbury、MA）でコーティングした培養容器に付着させた。
　接着性の胚様体を、脳由来神経栄養因子（BDNF）（10ng/ml）、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）（10ng/ml）およびNT-3（10ng/ml）を添加したニューロベーサル培地で、P2段階の培養を行った。それらをアキュターゼ（Innovative Cell Technologies、San Diego、CA）によって培養容器から剥がし、小さな塊または単一細胞に解離させた。P3成熟期においては、35日目にMatrigelでコーティングした24穴培養容器で、１穴あたり500,000細胞となるようにして培養した。
ウェスタンブロッティング
　iPS細胞由来神経細胞に関して、分化した細胞をシトシン・アラビノシド（Ara C）（シグマアルドリッチ）で処理した。Ara Cを除去して3日後、細胞を回収し、溶解した。
　細胞（iPS細胞由来神経細胞）を、１％トライトンX-100を含む、TS緩衝液（50mM Tris-HCl, pH7.5、0.15M NaCl、5mMエチレンジアミンテトラ酢酸、5mMエチレングリコール・ビス（β-アミノエチルエーテル）-N,N,N,N-テトラ酢酸、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ、Basel、Switzerland））中で、10分間氷上で溶解した。試料を4℃で10,000×gで15分間遠心分離し、上清を保存した。上清のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて測定した。それぞれの等量のタンパク質を各レーンにロードし、SDS-PAGE（10-20％ポリアクリルアミドゲル、BIO CRAFT、Tokyo、Japan）で電気泳動し、ポリビニリデン・ジフルオライド（PVDF）膜（ミリポア、Billerica、MA）に転写した。当該膜を室温で1時間、5％BSAでブロックし、一次抗体を添加して一晩インキュベートした後、適切な二次抗体を加えた。ECL Prime試薬（GEヘルスケア、Chicago、IL）を検出に使用した。画像はLAS 4000（GEヘルスケア）で取得した。このアッセイで使用した一次抗体は、MFN2（Abcam、Cambridge、UK、1：1,000）およびβ-アクチン（シグマアルドリッチ、1：5,000）であった。
軸索ミトコンドリア移動性のライブイメージング
　50日目に生細胞の画像を取得した。HB9::Turbo RFP-mito陽性神経細胞を選択し、低速度撮影によって神経突起におけるミトコンドリアの移動性を観察した。生細胞は、x60レンズとインキュベーションチャンバーを備えたCarl Zeiss LSM710顕微鏡を用いて撮影した。撮影の間、細胞を37℃、5％CO2に保った。核酸導入された細胞を選択し、低速度撮影よって神経突起におけるミトコンドリアの移動性を観察した。5分間3秒毎に画像を撮り、キモグラフ分析を行った。キモグラフは、Meta Morph Software（Molecular Device、Sunnyvale、CA）を用いて作成した。移動しているミトコンドリアを、2μmの移動があったかどうかに基づいて、移動または静止のいずれかとして分類した。各キモグラフにおいて、移動しているミトコンドリアを計数した。
電子顕微鏡観察
　既報の方法に従って、フローサイトメトリーにより運動神経細胞を精製した。全ての選別手順は、FACS AriaII（BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ）を用いて行った。HB9::GFPレンチウイルスで感染させた後、50日目に、分化した細胞を細胞選別のためにアキュターゼ（Innovative Cell Technologies）により単一細胞に解離させた。HB9::GFP陽性細胞（全選別細胞の約2％）を選別し、マトリゲルでコートした96穴プレート上に、1穴当たり20,000～30,000細胞となるように播種した。翌日、精製された運動神経細胞を室温でPBSで4％に調整したパラホルマリン（PFA）および2％グルタルアルデヒドで固定し、4℃で一晩インキュベートした。超薄切片解析は、透過型電子顕微鏡（日立、東京、日本、H7650）で80kVで行った。神経突起中のミトコンドリア長は、ImageJを用いて7枚のランダムな画像で測定した。
ニューロスフェア・アッセイの開発と神経突起中のミトコンドリア解析
　神経体のミトコンドリアを除外して、神経突起中のミトコンドリアを効率的に評価するために、ニューロスフェア・アッセイを導入した。60日目の神経細胞をアキュターゼを用いて解離させ、U底96穴プレートに1穴当たり25,000細胞を集め、10ng/mlのBDNF、10ng/mlのGDNF、および10ng/mlのNT-3を含むニューロベーサル培地で培養した。ニューロスフェアは24時間後に形成され、7日間培養した。形成されたニューロスフェアをラミニンでコートした培養容器上に播種し、付着性ニューロスフェアに由来する神経突起を3日間伸長
させた。ミトコンドリアを染色するために、細胞を37℃で500nMのMitotrackerと共に30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を4％PFAで固定し、抗βIIIチューブリン抗体で免疫染色した。IN Cell Analyzer 6000（GEヘルスケア）を使用して、細胞画像を撮影した。IN Cell Developerツールボックス・ソフトウェア1.92（GEヘルスケア）を用いて、ニューロスフェア領域を除いた後に、βIIIチューブリン染色された神経突起と共に局在するMitotracker染色された斑点を計数することによって、ミトコンドリア数を評価した。非凝集ミトコンドリアの評価においては、10μm2以下の小さい斑点数をプログラムされたプロトコールによって自動計数し、神経突起の面積で補正した。神経毒性試験の分析では、10μm2よりも大きい斑点数を凝集ミトコンドリアとしてプログラムされたプロトコールによって自動計数し、神経突起の面積で補正した。
神経突起におけるATP測定
　１穴あたり10個のニューロスフェアとなるように24穴プレートに播種し、7日間培養した。ピペットで吸引することによってニューロスフェアのコアを除去した後、培地をウェルから除き、神経突起におけるATPレベルをCellTitier-Glo蛍光細胞生存アッセイ（Promega、Fitchburg、WI）を用いて測定した。ATP測定に用いた細胞溶解物中のタンパク質濃度をBCAアッセイによって測定し、それによってATPレベルを補正した。
統計分析
　全てのデータは平均±標準誤差で示している。群の比較は、一元配置又は二元配置のANOVAを用いて行い、続いてScheffeの多重比較検定によって、事後検定を行った。p<0.05を統計的に有意とみなした。
＜結果＞
CMT患者から作製したiPS細胞
　MFN2遺伝子にH128Y又はR94Qの変異を有する2人のCMT患者、及び２人の健常者からiPS細胞を作製した（図1a、表1）。次にiPS細胞から運動神経細胞を作製した。CMT患者由来のiPS細胞及びそれから作製した運動神経細胞は、MFN2遺伝子に変異を有していた（図1b）。
CMT患者から作製したiPS細胞に由来する運動神経細胞において、神経突起中のミトコンドリア形態及び移動性に異常が見られた
　CMT患者のiPS細胞に由来する運動神経細胞を含む神経細胞群において、MFN2の生化学的特性を、ウェスタンブロット分析によって調べた。CMT患者のiPS細胞に由来する神経細胞群においては、MFN2の増加が見られた（図2a,b）。このことは、MFN2をコードする遺伝子の変異によって、MFN2タンパク質の生化学的性質が変化していることを示す。
　MFN2は、ミトコンドリアの融合において機能することが知られている。CMT患者のふくらはぎ神経の生検では、軸索内においてミトコンドリアが小さく、丸く、そして凝集しているなどの異常が見られたことは、既に報告されている。そのため、MFN2遺伝子に変異を有するCMT患者は運動神経細胞における障害を示すことが知られていたことから、精製したCMT運動神経細胞の神経突起におけるミトコンドリア長を調べた。CMT神経細胞の神経突起におけるミトコンドリア長は、健常者のものと比べて短く、盛り上がった部分を欠く異常なミトコンドリアと共に、神経突起内で明らかに凝集していた（図2c,d）。これらのデータから、CMT神経細胞ではミトコンドリアの融合が起こらず、CMT患者の生検サンプルで見られた病的特徴を再現していることが示唆された。
　次に、低速度撮影によって、CMT神経細胞の神経突起においてミトコンドリアの移動が損なわれているかを調べた。生きた運動神経細胞においてミトコンドリアを可視化するために、分化36日目において赤色蛍光タンパク質（turbo RFP）を発現するレンチウイルスを、運動神経細胞に導入した。turbo RFPは、HB9プロモーターの制御下にあるミトコンドリア・ターゲティング配列に融合させた（HB9::turbo RFP）。そして50日目に、低速度撮影を行った。5分間、3秒ごとにイメージを撮影した。運動神経細胞のミトコンドリアの代表的なキモグラフは、CMT神経細胞においては、移動しているミトコンドリア数が、対照と比べて、有意に減少していることを示していた（図2e）。定量分析によって、CMT神経細胞においては、対照と比べて、移動しているミトコンドリアの割合が、有意に少ないことが示された。対照神経細胞では移動しているミトコンドリアが40-50%を占めるのに対し、CMT神経細胞では約20%であった（図2f）。
　更には、ニューロスフェアのアッセイ系を確立し、神経突起中のミトコンドリア数を分析した。このアッセイ系によって、神経体のミトコンドリアを除外して、神経突起中のミトコンドリアを効率的に評価することが可能となった。神経体から神経突起を分けるために、60日目の分化した神経細胞からニューロスフェアを作製し、ラミニンでコートした培養容器に播種し、3日間培養した。それに引き続いて、神経体の僅かな移動を伴って、ニューロスフェアから神経突起の伸長が起こった（図3b）。神経突起内で、Mitotrackerで染色したミトコンドリア数を、多機能分析装置によって分析した。それによって、対照神経と比べて、CMT神経細胞では神経突起の染色された斑点数が減少していることが分かった（図3c、d）。また、ニューロスフェアのコアを除去した後に集めた、神経突起におけるATPレベルを評価した。対照神経細胞と比べて、CMT神経細胞ではATPレベルの低下が見られた（図3e）。これらの結果から、CMT神経細胞は神経突起中のミトコンドリアの機能不全を呈していることが示唆される。
神経障害を起こすことが知られている薬剤による神経突起中のミトコンドリア凝集体形成
　CMT患者は、抗癌剤の投与後、深刻な薬剤性の神経障害を起こす。抗癌剤ビンクリスチンがCMT神経細胞に及ぼす影響を調べた。ニューロスフェアに由来する神経突起を、1μＭのビンクリスチンに曝し、ミトコンドリアを染色することでその影響を評価した。長時間ビンクリスチンに曝露した場合、CMT神経細胞と対照神経細胞の両方において、神経突起中のミトコンドリア凝集体が見られた。しかし、短時間の曝露においては、CMT神経細胞は対照神経細胞に比べて、その毒性に対する、より高い感受性を示した（図4a、b）。1μＭのパクリタキセルも、対照神経細胞に比べて、CMT神経細胞においてミトコンドリア凝集体を増加させた（図5a、5b）。多機能分析システムによって、興味の対象を認識することができ、自動でそれらの大きさを分析することができる。そのシステムを凝集ミトコンドリアの評価にも用いた。
　これらの結果は、遺伝子的な影響の受けやすさが、薬剤性の神経障害という形で、神経突起中のミトコンドリア異常を促進することを示唆している。そして、CMT患者と健常者間で、薬剤毒性に対する感受性の違いが見られることが、このアイデアを支持している。細胞の多数の表現型の中でも、神経突起内でみられたミトコンドリアの異常は、適切な細胞アッセイ系であり、ヒトiPS細胞を用いた医薬品の神経毒性を予測するための表現型を代表するものである。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。よって、本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。即ち、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる。
　本発明の評価方法は、CMT患者のiPS細胞由来神経細胞を用いた細胞アッセイを用い、神経突起中のミトコンドリアの異常を指標とすることにより、薬剤による神経毒性の臨床症状をよく反映する評価モデル系として有用である。
（関連出願の表示）
　本出願は、2017年5月9日付で日本国に出願された特願2017-93450を基礎としており、ここで言及することによりそれらの内容は全て本明細書に包含される。

Claims (8)

  1. 　以下の（１）～（３）の工程を含む、化合物のヒトに対する神経毒性の評価方法。
    （１）CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞と試験化合物とを接触させる工程
    （２）当該神経細胞における、以下の（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）神経突起中のミトコンドリアの状態
    　（ｂ）神経突起中のATPレベル
    　（ｃ）MFN2タンパク質レベル
    からなる群より選択される1以上の表現型を検定する工程
    （３）試験化合物と接触させなかった対照と比較して、（２）の表現型を増悪させた試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がある化合物として選択する工程
  2. 　工程（２）において検定される表現型が、（ａ）及び／又は（ｂ）の表現型である、請求項１記載の方法。
  3. 　神経突起中のミトコンドリアの状態が、ミトコンドリア長、ミトコンドリアの形態、ミトコンドリアの凝集、ミトコンドリアの移動性、ミトコンドリア数から選択される、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　神経細胞が、神経突起を伸長させた付着性ニューロスフェアである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞の代わりに、健常人のiPS細胞から分化誘導された対照神経細胞を用いて、（１）及び（２）の工程をさらに行い、該対照神経細胞に比べて、CMTのヒトiPS細胞から分化誘導された神経細胞において、（２）の表現型が増悪傾向を示した試験化合物を、ヒトに対して神経毒性を引き起こす可能性がより高い化合物として選択することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　CMTがMFN2遺伝子に変異を有するものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　MFN2遺伝子の変異がH128Y又はR94Qである、請求項６記載の方法。
  8. 　神経毒性が軸索変性症である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008149807A1 (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Kumamoto University Es細胞の分化誘導方法
WO2011133661A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Research Development Foundation Methods and compositions related to dopaminergic neuronal cells
US20150153325A1 (en) * 2012-05-11 2015-06-04 Patrick McNutt Toxin detection using stem cell derived neurons
US20160186137A1 (en) * 2014-12-31 2016-06-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Derivation of human microglia from pluripotent stem cells
WO2016109813A2 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Human pluripotent stem cell-based models for predictive developmental neural toxicity
US20160271182A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Food Industry Research And Development Institute Isolation of human neural stem cells from amniotic fluid of patients with neural tube defects
JP2017501743A (ja) * 2013-11-11 2017-01-19 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 人工多能性幹細胞を腎近位尿細管細胞様細胞に分化させるための方法
JP2017029116A (ja) * 2015-08-05 2017-02-09 国立大学法人京都大学 運動ニューロン疾患の検査方法及び治療剤のスクリーニング方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008149807A1 (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Kumamoto University Es細胞の分化誘導方法
WO2011133661A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Research Development Foundation Methods and compositions related to dopaminergic neuronal cells
US20150153325A1 (en) * 2012-05-11 2015-06-04 Patrick McNutt Toxin detection using stem cell derived neurons
JP2017501743A (ja) * 2013-11-11 2017-01-19 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 人工多能性幹細胞を腎近位尿細管細胞様細胞に分化させるための方法
US20160186137A1 (en) * 2014-12-31 2016-06-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Derivation of human microglia from pluripotent stem cells
WO2016109813A2 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Human pluripotent stem cell-based models for predictive developmental neural toxicity
US20160271182A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Food Industry Research And Development Institute Isolation of human neural stem cells from amniotic fluid of patients with neural tube defects
JP2017029116A (ja) * 2015-08-05 2017-02-09 国立大学法人京都大学 運動ニューロン疾患の検査方法及び治療剤のスクリーニング方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IMAMURA, KEIKO: "Potential of dementia model using iPS cells: Regrading iPS cell model and mouse model", SYMPOSIUM 26, vol. 30, no. 4, 15 October 2016 (2016-10-15), pages 525 *
IMAMURA, KEIKO: "Regrading neurotoxicity test model for side effects of medicine using iPS cells", THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 137, March 2017 (2017-03-01), pages S15 - 3 *
IMAMURA, KEIKO: "The Research of Dementia Using iPS Cells", THE MEDICAL FRONTLINE, vol. 71, no. 11, 10 November 2016 (2016-11-10), pages 2146 - 2149 *
INOUE, HARUHISA: "Identification of drug- development target for neurodegenerative disease by reassessment of existing drugs using iPS cells", RECENT ADVANCES IN CLINICAL PHARMACOLOGY, 25 June 2015 (2015-06-25), pages 126 - 135 *
KASHYAP, MAHENDRA P.: "Differentiating neurons derived from human umbilical cord blood stem cells work as a test system for developmental neurotoxicity", MOL NEUROBIOL, vol. 51, no. 2, 24 May 2014 (2014-05-24), pages 791 - 807, XP055563274 *
OHARA, RYO: "Establishment of Charcot-Marie-Tooth disease model using patient's iPS cells", PERIPHERAL NERVE, vol. 26, no. 2, 1 December 2015 (2015-12-01), pages 289 *
WILSON, MELINDA S.: "Multiparametric High Content Analysis for assessment of neurotoxicity in differentiated neuronal cell lines and human embryonic stem cell -derived neurons", NEUROTOXICOLOGY, vol. 42, 3 April 2014 (2014-04-03), pages 33 - 48, XP028850770 *

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