JP2017501743A

JP2017501743A - 人工多能性幹細胞を腎近位尿細管細胞様細胞に分化させるための方法

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Publication number: JP2017501743A
Application number: JP2016553203A
Authority: JP
Inventors: ダニエレジンク; ジャッキーワイ．イン
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2017-01-19
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: US20160281062A1; WO2015069192A1; EP3068871A1; JP6587627B2; EP3431583B1; EP3431583A1; SG11201603414YA; EP3068871B1; CN106029872A; US10351827B2; EP3068871A4; CN106029872B

Abstract

人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる方法を提供する。前記方法は、1種類または複数種の細胞外マトリックス(ECM)分子、骨形成タンパク質2(BMP2)、および骨形成タンパク質7(BMP7)の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程を含む。分化したPTC様細胞の細胞集団ならびにこの細胞集団の使用および使用方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年11月11日に出願されたシンガポール特許仮出願第201308341-5号の恩典を主張し、同第201308341-5号からの優先権を主張する。シンガポール特許仮出願第201308341-5号の内容は参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、人工多能性幹細胞を分化させることによって腎近位尿細管細胞様細胞を作製するための方法に関する。

背景
腎上皮細胞は腎臓障害の治療において有用な場合がある。これは、失われた臓器機能を取り替えるか、または補うためにバイオ人工腎臓装置に適用することを含む。従って、腎上皮細胞が十分に供給されることが必要である。様々な腎臓機能を果たす腎近位尿細管細胞(PTC)への関心が特に高い。

腎近位尿細管細胞は薬物の輸送および代謝において機能し、従って、インビトロ腎毒物学においても特に関心が高い。この細胞タイプは腎臓における薬物誘導性毒性の主な標的である。抗癌剤、抗生物質、免疫抑制剤、および放射性造影剤を含む、広く用いられている多くの市販薬物は腎毒性をもつ傾向があり、従って、腎臓の近位尿細管細胞を傷つける可能性がある。薬物誘導性腎毒性は急性腎傷害(AKI)の主な原因である。

にもかかわらず、創薬中に腎毒性を予測することは依然として難しい。典型的に、化合物の腎毒性は創薬後期にしか検出されない。前臨床動物モデルが予測の成功を制限してきた。強力な予測能力を示す、腎毒性をアッセイするためのインビトロモデルの開発は困難であった。ほとんどの既存のインビトロアッセイ系は樹立細胞株に基づいてきた。初代腎近位尿細管細胞は少量でしか入手できず、ドナー間のばらつきとインビトロ培養中および継代中の機能変化の影響を受けることがある。

以前の技術では、ヒト胚性幹細胞(hESC)をアクアポリン(AQP)-1発現細胞に分化させるための方法が説明された。AQP-1は腎臓の近位尿細管細胞に特異的に発現している。hESC由来細胞の約30％はAQP-1を発現し、さらなる分析から、hESC由来細胞は、インビトロ培養したヒト初代腎近位尿細管細胞(HPTC)と遺伝子発現パターンおよびタンパク質発現パターンならびに形態学的特徴および機能的特徴の点で似ていることが分かった。hESCベースの技術は倫理上の問題および関連する法律上の問題の影響を受け、これが実用化に支障を来すかもしれない。また、hESC由来HPTC様細胞の割合が比較的少ない(30％)ことが問題であり、いかなる実際の用途でも、このようなHPTC様細胞が役に立つためには精製手順が必要となるだろう。さらに、hESC由来細胞は、有機アニオン輸送体(OAT)3のような、いくつかの主な薬物輸送体を非常に低レベルで発現しており、これがインビトロ腎毒物学における、このような細胞の利用に支障を来すかもしれない。

概要
本発明は、ヒト初代腎近位尿細管細胞(HPTC)様細胞を含む腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞を作製するための、ヒトiPSC(hiPSC)を含む人工多能性幹細胞(iPSC)の使用に関する。

一部の態様では、前記方法によって作製された分化細胞の集団において、細胞の約90％以上がPTC様細胞になるように分化し得る。

このように分化細胞タイプの純度が高いということは、細胞集団を、さらなる処理も収集も精製も分取もすることなく、いくつかの用途において直接用い得ることを意味する。

従って、前記方法は、HPTC様細胞を含むPTC様細胞の集団を作製するための迅速な一段階プロトコールを提供し得る。次いで、PTC毒性を予測するために、創薬研究中を含めて、このプロトコールをインビトロ毒物学アッセイなどの様々な用途において使用することができる。このようなインビトロ研究では機械学習アルゴリズムが用いられることがあり、従って、PTC毒性の予測に関して精度の高い結果が得られることがある。

一局面において、本発明は、人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる方法であって、1種類または複数種の細胞外マトリックス(ECM)分子、骨形成タンパク質2(BMP2)、および骨形成タンパク質7(BMP7)の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程を含む、方法を提供する。

iPSCは、哺乳動物iPSCまたはヒトiPSCを含む任意のタイプのiPSCであり得る。

培養する工程の前に、iPSCは、最初に、ROCK阻害剤の存在下ならびにBMP2およびBMP7の非存在下で播種されてもよい。iPSCは、約5000〜約10000生細胞/cm²または約8000生細胞/cm²の初期密度で播種されてもよい。

1種類または複数種のECM分子は、一部の態様では、増殖因子低減型マトリゲルマトリックスを含むマトリゲルマトリックスを含んでもよい。

腎上皮細胞培養培地は腎上皮細胞増殖培地を含んでもよい。

BMP2およびBMP7は、iPSCを最初に播種して約12〜約24時間後に腎上皮細胞培養培地に添加されてもよい。BMP2は、培養中に、約1ng/ml〜約25ng/mlまたは約2.5ng/ml〜約15ng/mlの濃度で存在してもよい。BMP7は、培養中に、約0.25ng/ml〜約10ng/mlまたは約1ng/ml〜約5ng/mlの濃度で存在してもよい。

一部の態様において、iPSCはヒトiPSCであり、前記方法は、増殖因子低減型マトリゲルマトリックスでコーティングされた培養支持体に未分化iPSCが付着できるように、BMP2およびBMP7を含まず、かつ約5μM〜約15μMのROCK阻害剤を含む腎上皮細胞増殖培地中に、未分化iPSCを約8000生細胞/cm²の密度で約12時間〜約24時間、播種する工程;腎上皮細胞増殖培地を、ROCK阻害剤を含まず、約2.5ng/ml〜約15ng/mlのBMP2および約1ng/ml〜約5ng/mlのBMP7を含む新鮮な腎上皮細胞増殖培地と交換する工程;BMP2およびBMP7を含む腎上皮細胞増殖培地中で、iPSCを約8〜約10日の期間にわたって約37℃の温度および約5％CO₂の下で、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程を含む。

別の局面において、本発明は、約7〜約10日の期間にわたって、1種類または複数種の細胞外マトリックス分子、骨形成タンパク質2、および骨形成タンパク質7の存在下で腎上皮細胞培養培地に約5000〜約10000生細胞/cm²の密度で播種した人工多能性幹細胞(iPSC)集団から分化したPTC様細胞集団を提供する。

細胞集団は本発明の方法に従って調製することができる。

一部の態様において、細胞集団おいて細胞の約90％以上がAQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する。

一部の態様において、細胞集団は、バイオ人工腎臓装置の中空繊維バイオリアクター、ヒドロゲル、または生物工学的に作製された移植片の中に含まれてもよい。

従って、別の局面において、本発明は、本発明の細胞集団が播種されたマトリックスを含む生物工学的に作製された組織移植片を提供する。前記マトリックスは脱細胞化マトリックスでもよく、3D腎臓マトリックスでもよい。

別の局面において、本発明は、化合物の腎毒性をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、試験化合物を本発明の細胞試験集団と接触させる工程;および試験化合物と接触していない細胞対照集団と比較して試験化合物の効果を確かめる工程を含む、方法を提供する。

試験集団は、細胞生存率、細胞数、マーカー遺伝子の発現、細胞形態、細胞骨格成分の配置、細胞因子の移行、ATP枯渇、ミトコンドリア損傷、グルタチオン(GSH)枯渇、膜損傷、活性酸素種の発生、またはDNA損傷に対する試験化合物の効果について評価されてもよい。

前記方法の一部の態様において、細胞試験集団を本発明の方法に従って調製することができ、接触させる工程の前に収集することなく、分化させて約8〜約10日後に、この試験集団に対して接触させる工程が行われる。

別の局面において、本発明は、バイオ人工腎臓装置を調製する方法であって、装置に本発明の細胞集団を播種する工程を含む、方法を提供する。

別の局面において、本発明は、対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、本発明の細胞集団を含むバイオ人工腎臓装置を外部接続する工程を含む、方法を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療するための、本発明の細胞集団を含むバイオ人工腎臓装置の使用を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療するためのバイオ人工腎臓装置を製造するための本発明の細胞集団の使用を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象における腎臓関連障害の治療において使用するための、本発明の細胞集団を含むバイオ人工腎臓装置を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、有効量の本発明の細胞集団または本発明の生物工学的に作製された組織移植片を、対象の、PTC様細胞が必要とされる部位に移植する工程を含む、方法を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療するための有効量の本発明の細胞集団または本発明の生物工学的に作製された組織移植片の使用を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療するための本発明の生物工学的に作製された組織移植片を製造するための有効量の細胞集団の使用を提供する。

別の局面において、本発明は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象における腎臓関連障害の治療において使用するための有効量の本発明の細胞集団または本発明の生物工学的に作製された組織移植片を提供する。

前記方法および使用の一部の態様において、腎臓関連障害は、急性腎傷害、慢性腎臓病、末期腎臓病、腎症、糖尿病性腎症、ネフローゼ、ブライト病、腎機能不全、糸球体炎、糸球体硬化症、または腎炎を含む。

本発明の他の局面および特徴は、本発明の特定の態様の以下の説明と添付の図面を見れば当業者に明らかになるだろう。

図面は、本発明の態様を例として示しているのにすぎず、以下の通りである。

分化手順とそれに続く薬物試験のための前記方法の一態様を図示したフローチャート。 hiPSC由来HPTC様細胞の数に及ぼす薬物処理の影響。分化中のiPS(Foreskin)-4由来細胞のマーカー発現パターンの変化。 iPS IMR90-4由来細胞およびiPS DF19-9-11T.H由来細胞のマーカータンパク質発現。免疫染色およびFACSによるhiPSC由来d8細胞の特徴付け。 iPS(Foreskin)-4由来d8細胞の特徴付け。 hiPSC由来細胞のGGT活性およびOCT2活性。輸送体を介した薬物取り込みならびにIL6およびIL8の薬物誘導性発現。 hiPSC由来細胞におけるマーカー発現。 HPTCおよびiPSC由来HPTC様細胞の予測性能。

詳細な説明
本発明は、hiPSCをHPTC様細胞に分化させる方法を含む、iPSCを腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させるための分化方法、この分化方法によって作られた細胞集団、ならびにこのような細胞集団を使用する方法およびこのような細胞集団の使用に関する。

ヒトまたはマウスの胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)を腎臓系列に分化させるために、以前に様々なプロトコールが開発されている。これらの以前のアプローチの一部は胚腎臓発生を再現するように設計され、様々なステージを模倣するための複数の段階がある間接的分化を含んでいた。このようなプロトコールから胚腎臓前駆体が作製され、典型的には、異なる腎臓細胞タイプの混合物が得られた。これらの結果は再生医療における用途について興味深いが、薬物スクリーニングへの適用可能性は限定的である。これらのアプローチに基づく薬物毒性への応用はまだ確立していない。

さらに、多段階プロトコールでないhESCベースのアプローチが以前に説明されている(Narayanan et al., Kidney Int., 2013)。Narayananらの方法によって得られたHPTC様細胞はインビトロ毒物学アッセイに用いられている(Li et al., Mol. Pharm., 2014)。

以前に、ヒト胚性幹細胞(hESC)を分化させAQP-1発現細胞にしたが、胚性幹細胞の使用は議論の的になることがある。しかしながら、ヒトiPSCは、hESCが直面する同じ倫理上および法律上の問題の影響を受けない。従って、hiPSCに由来する腎上皮細胞の潜在的な用途には薬物スクリーニングおよびインビトロ毒物学が含まれる。

本発明の前には、iPSCからPTC様細胞を得るための信頼性の高い、よく特徴付けられた方法はなかった。本明細書に記載のように、今や、これらの方法と細胞が手に入った。本発明のPTC様細胞はPTCの多くの特徴を有することが見出されており、腎毒性アッセイを含む、PTCを用い得る用途において、ならびにバイオ人工腎臓装置を含む腎臓の欠陥および障害への治療用途において有用であり得る。

前記方法は、iPSCからPTC様細胞に直接分化させることを伴う。このことは、胚様体(EB)を形成することなくPTC様細胞への分化が起こることを意味する。EBは、胚に匹敵する、分化を促進することができる細胞凝集物であり、従って、3種類全ての胚葉、つまり外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞を含有し得る。間接的分化では、最初に、ES細胞を凝集させてEBを形成し、次いで、腎臓前駆細胞への分化を促進する条件にEBを曝露する。EB形成によって複数種の細胞タイプが形成されるので、EBを用いる間接的分化は、不均質な分化細胞集団と低い腎臓前駆細胞収率をもたらす。従って、本発明の方法は比較的均一な細胞環境と均質な分化細胞集団を可能にし、従って、EB形成を伴う方法より高いPTC様細胞収率を提供する可能性が高い。

簡単に述べると、本発明の分化方法から得られるPTC様細胞は、iPSCから直接分化し、かつ1種類または複数種の腎臓特異的細胞マーカーまたはPTC特異的細胞マーカーを発現する細胞である。従って、前記方法において得られるPTC様細胞はiPSCに「由来」するか、またはiPSCから「分化」している。腎臓特異的細胞マーカーまたはPTC特異的細胞マーカーには、HPTCを含むPTCにおいて発現しており、ヒトiPSCを含むiPSCでは発現していないか、または低い程度で発現している細胞遺伝子またはタンパク質が含まれる。このようなマーカーは、特定の細胞がiPSC細胞から分化してPTC様細胞になったことを示すものとして用いられる場合がある。このようなマーカーには、例えばVITD3、SLC34A1、NBC1、Na⁺/K⁺ATPアーゼ、KSP-CAD、AQP1、GGT、CD13、OAT1、MEG、OAT3、OCT2、OCTN2、PEPT1、GLUT1、GLUT5、SGLT1、SGLT2、URO-10、またはZO-1(完全な遺伝子およびタンパク質の名前については表1を参照されたい)が含まれる。一部の態様において、前記方法におけるiPSCに由来するPTC様細胞はOAT3を発現してもよい。一部の態様において、前記方法におけるiPSCに由来するPTC様細胞は、AQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現してもよい。一部の態様において、前記方法におけるiPSCに由来するPTC様細胞は、Na⁺/K⁺ATPアーゼ、AQP1、PEPT1、OAT3、SGLT2、URO10、ZO-1、およびGLUT1を発現してもよい。側底薬物取り込み輸送体であるOAT1、OAT3、およびOCT2がiPSC由来PTC様細胞において発現していてもよい。主なリン酸取り込み輸送体であるSLC34A1がiPSC由来PTC様細胞において発現していてもよい。

従って、iPSCをPTC様細胞に分化させる方法を提供する。本明細書に記載の方法は直接的な分化方法であり、一部の態様では迅速な一段階プロトコールとして用いることが可能である。すなわち、いくつかの用途の場合、さらなる細胞収集も細胞分取も必要なく、分化期間が終了したらすぐに、例えば、インビトロ毒性アッセイにおいて分化細胞集団を使用することができる。

従って、前記方法は、人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる工程を含む。簡単に述べると、前記方法は、骨形成タンパク質2および骨形成タンパク質7の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8日〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程を含む。

本明細書で使用する「細胞」という用語は、iPSC細胞またはPTC様細胞の文脈で用いられた時を含めて、文脈から可能な場合、1個の細胞ならびに複数の細胞または細胞集団を指すことが意図される。同様に、「細胞」という用語は、文脈から可能な場合、1個の細胞を指すことも意図される。前記細胞は、バッチ培養で、または組織培養プレートで増殖した細胞でもよく、懸濁されていてもよく、培養支持体表面に付着していてもよい。

本明細書で使用するiPSCは、最初の非多能性細胞、例えば、適切な条件ならびに転写因子または多能性細胞において遺伝子発現プロファイルを調節する他のタンパク質因子、例えばSox2、Oct4、c-Myc、およびKlf4に曝露されることで多能性になるように誘導することができる、部分的に分化した細胞または完全に分化した細胞から多能状態に誘導された多能性幹細胞である。多能性を誘導する方法は公知であり、例えば、Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (2006), 663-676に記載されている。従って、iPSCは、最初の非多能性細胞に由来し、かつ胚性幹細胞でない多能性細胞である。

人工多能性幹細胞、すなわちiPSCは、ヒトiPSCを含む哺乳動物iPSCを含む動物iPSCを含む任意のタイプのiPSCでよい。iPSCは、樹立したiPSC培養物または供給源、例えば、市販のiPSC源からのものでもよい。ヒトiPSCは正常な対象から得られもよく、患者から得られもよい。患者は腎臓病に罹患していてもよく、薬物の有害作用を含む薬物作用に対して感受性があってもよい。ヒトiPSCはまた、このような患者の親類から得られてもよい。iPSCは、特に、使用のすぐ前または使用直前を含めて本明細書に記載の方法において使用するために非多能性細胞から多能性になるように誘導されてもよく、本明細書に記載の分化方法において使用する前に、ある期間にわたって培養状態で保管または維持されてもよい。

分化のために播種する前に、iPSCは未分化状態で維持または増殖されてもよい。一般的に、未分化状態で細胞を維持するようにiPSCを培養する方法は公知であり、従って、iPSCは、iPSC用の公知の方法を用いて未分化状態で維持されてもよい。iPSCは、分化を誘導しない適切な培地、例えば、mTeSR1培地中で維持されてもよい。一般的に、mTeSR1は、hESCおよびiPSCのフィーダーフリー培養に使用することができる限定培地である。一部の態様において、mTeSR1は、ウシ血清アルブミン、rhbFGF、rhTGFβ、塩化リチウム、ピペコリン酸、およびGABAを含有する。mTeSR1限定培地は市販されている場合があるが、この培地は公知であり、当業者が日常的な実験方法(Ludwig et al., Nature Methods, 2006a, 3 :637-646; Ludwig et al.. Nature Biotechnology, 2006b, 24: 185-187.)を用いてmTeSR1を容易に調製できるプロトコールを利用することができる。分化方法において使用する前にiPSCを維持または増殖するために、同様に幹細胞分化を誘導しない他の培地が用いられてもよい。

iPSCを分化させるために、未分化iPSCは、適切な容器、例えば、組織培養プレートの培養表面に播種される。前記細胞は、適切な密度、例えば分裂し、かつ分化させて約6日目〜約10日目までに、または分化させて約6日目もしくは約7日目までにコンフルエントな単層、またはほぼコンフルエントな単層、例えば、約80％〜約90％コンフルエンスを形成するのに十分な密度で播種されてもよい。例えば、iPSCは、約5000生細胞/cm²〜約10000生細胞/cm²、または約7000生細胞/cm²〜約9000生細胞/cm²、または約8000生細胞/cm²の密度で播種されてもよい。

播種のために懸濁している時に、iPSCと共にRhoキナーゼ(ROCK)阻害剤(Y-27632, Calbiochem, Merck, Darmstadt, Germany)が含まれてもよい。例えば、分化前にiPSCを播種する時に、iPSC懸濁液と共に約1μM〜約25μM、約5μM〜約15μM、または約10μMのROCK阻害剤が含まれてもよい。多能性幹細胞の単一細胞懸濁液が播種される時に、ROCK阻害剤はiPSCの生存を改善する可能性がある。

分化を誘導するために、未分化iPSCは腎上皮細胞培養培地と共に分化のために培養される。腎上皮細胞培養培地は、腎上皮細胞の増殖を支持するように設計され、かつ腎上皮細胞の付着、増殖(growth)、および増殖(proliferation)を維持するのに必要な栄養分および因子を含有する任意の増殖培地であり得る。腎上皮細胞培養培地は、腎臓細胞培養物の増加および生存が可能になるように選択された必須の因子、例えば、PTC、例えば、ウシ胎児血清(FCS)、増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)、インシュリン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ならびにトリヨードチロニン(T3)およびトランスフェリンを含有してもよい。

腎上皮細胞培養培地は公知であり、腎上皮細胞基本培地(REBM)および腎上皮細胞増殖培地(Lonza Bioscience,Singaporeから入手可能なREGM BulletKit)を含めて市販されている場合がある。

例えば、0.5ml hEGF; 0.5mlヒドロコルチゾン; 0.5mlエピネフリン; 0.5mlインシュリン; 0.5mlトリヨードチロニン; 0.5mlトランスフェリン; 0.5ml GA-1000;および2.5 ml FBSが加えられた腎上皮細胞基本培地500mlを含む、Lonza Bioscience REGM(商標)BulletKit(商標)(CC-3190)が用いられてもよい。

例えば、1.00μMエピネフリン、10ng/ml組換えhEGF、5μg/ml組換えヒトインシュリン、10nMトリヨードチロニン、100ng/mlヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、2.4mM L-Ala-L-Gln、および5μg/mlトランスフェリンが加えられた腎上皮細胞基本培地を含むATCC腎上皮細胞増殖キット(ATCC PCS-400-040)が用いられてもよい。

腎上皮細胞培養培地に加えて、PTC様細胞に分化するように未分化iPSCを誘導するために細胞外マトリックス(ECM)分子が増殖条件に入れられる。

従って、iPSCは、上皮基底膜を模倣するように1種類または複数種のECM分子でコーティングした培養表面に播種されてもよい。1種類または複数種のECM分子はそれぞれ、腎上皮細胞培養培地中でiPSCの増殖および分化を支持するどのECM分子でもよい。例えば、ECM分子は、フィブロネクチン、ラミニン、IV型コラーゲン、またはMATRIGEL(商標)(BD Biosciences)でもよい。MATRIGEL(商標)Matrixは、EHSマウス肉腫から抽出した可溶化基底膜調製物であり、ラミニン、コラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチンを含む、上皮組織の確立を促進することが分かっている様々な基底膜成分および結合増殖因子を含む。一部の態様において、ECM分子は、増殖因子低減型MATRIGEL(商標)Matrixを含むMATRIGEL(商標)Matrixである。

1種類または複数種のECM分子を培養表面に添加する前に、ECM分子をREBMなどの腎上皮細胞培養培地で希釈してもよい。例えば、ECM分子を、培養表面にコーティングされる前に約10倍〜約50倍に希釈してもよい。ECM分子を、冷却した(例えば、氷冷)腎上皮細胞培養培地を用いて希釈してもよい。

播種されたiPSCは、コーティングされた培養表面に付着する。付着後に、例えば、播種して約12〜約24時間後に、または播種して約12〜約16時間後に、または播種して約16時間後に腎上皮細胞培養培地は新鮮な培地と交換される。細胞が付着したら、新鮮な培地はROCK阻害剤を含まなくてもよい。

さらに、iPSCが付着した後に、ECM分子コーティング培養表面に添加される新鮮な腎上皮細胞培養培地には、骨形成タンパク質BMP2およびBMP7が加えられる。BMP2およびBMP7は、PTC様細胞タイプへのiPSC分化の方向付けにおいて役割を果たしている可能性があり、従って、分化方法中に得られるPTC様細胞の数を増加させ得る。

例えば、約1ng/ml〜約25ng/mlもしくは約2.5ng/ml〜約15ng/mlまたは約10ng/mlのBMP2を培養培地に入れてもよい。

例えば、約0.25ng/ml〜約10ng/mlもしくは約1ng/ml〜約5ng/mlまたは約2.5ng/mlのBMP7を培養培地に入れてもよい。

iPSCは、ECM分子の存在下で腎上皮細胞培養培地中で約8〜約10日の期間にわたって、培養物に存在するiPSCの少なくとも一部がPTC様細胞に分化するのを誘導するのに十分な温度で、かつ増殖条件下で増殖される。例えば、ヒトiPSCの場合、前記細胞を、37℃、5％CO₂で分化させてもよい。分化期間中に、前記細胞は、1種類または複数種のECM分子でコーティングされている培養表面に付着すると考えられ、増えかつ増殖して、最終的に単層を形成すると考えられる。この単層は約80％〜約100％コンフルエントになる可能性がある。

分化のために播種されたら、分化したPTC様細胞を得るために、iPSCはこれ以上継代することなく培養される。すなわち、理想的には、分化期間の前に、または分化期間が終わるまでに、培養物は約80％〜約100％コンフルエントまたは約90％〜約100％コンフルエントになるはずである。例えば、培養物は、分化させて6日目または7日目までに約80％〜約100％コンフルエントになる可能性がある。どんな理論にも限定されないが、コンフルエントな状態またはほぼコンフルエントな状態は分化の促進に関与する可能性がある。

分化期間中に培養物はこれ以上継代されないが、分化期間全体を通して腎上皮細胞培養培地を新鮮培地と交換してもよい。例えば、培地は毎日または1日おきに交換されてもよい。新鮮培地は前記のようにBMP2およびBMP7を含んでもよい。

分化期間に用いられる正確な条件は、iPSCが得られた生物に左右される場合があることが理解されるだろう。ヒトiPSCの場合、例えば、分化期間中に、細胞は10日まで、例えば、8〜10日間、37℃、2〜10％CO₂または5％CO₂で培養されてもよい。

初回iPSCの播種は0日目とみなされる。BMP2およびBMP7を加えた培地の添加は分化1日目である。分化期間の終了は約8日目〜約10日目である。コンフルエントな状態またはほぼコンフルエントな状態は、分化期間が終了する前に、例えば、約6日目〜約8日目または約6日目〜約7日目に得られるはずである。

前記で示したように、iPSC集団が分化するにつれて、培養中の細胞によってPTC特異的マーカーが発現されると考えられる。

hiPSCが用いられる時、特に注目に値するのは、本明細書に記載の方法に従ってhiPSCから得られるHPTC様細胞において観察される比較的高いOAT3発現レベルである。このタンパク質は、腎近位尿細管細胞にある主な薬物輸送体の1つであり、インビトロ腎毒性研究に重要であろう。

OAT3はインビボでヒトPTCにおいて発現しているが、通常、インビトロではHPTCにおいてインビボよりかなり低いレベルで発現しており、インビトロ培養した、このような初代細胞においてOAT3発現をインビボ発現レベルと同様のレベルまで増強する公知の方法は現在ない。OAT3はまた20日目hESC由来HPTC様細胞において極めて低いレベルでしか発現していない。

前記方法における分化期間の長さは重要なようであり、得られる最終的な分化細胞の特徴に影響を及ぼすようである。すなわち、以前に説明されたプロトコールを用いてhESCから得られるHPTC様細胞は、分化させて20日目になってようやく収集され得るのに対して、本明細書において説明された方法によって得られるヒトiPSC由来HPTC様細胞は、分化させて約8〜10日目にHPTC様表現型を示す。

分化期間が短すぎたら細胞は分化せず、PTC様にならない。他方で、細胞分化が長すぎたら、細胞は分化転換し始める可能性があり、この分化転換は、例えば、OAT3を含むPTCマーカーの発現低下と、他の非PTCマーカー、例えば筋線維芽細胞マーカー、例えばα-平滑筋アクチン(αSMA)の発現増加を示す。典型的に、単層は破壊され、一部の細胞は凝集物を形成し、尿細管様構造さえも形成する。

ヒトiPSCを用いた時に、分化させて約8〜10日超が過ぎた後にiPSC由来培養物はPTC特異的マーカーの発現減少を示す傾向があり、間葉マーカーの発現増加を示し、細胞が筋線維芽細胞マーカーαSMAを高レベルで発現し始めることが観察されている。HPTC様細胞ならびにHPTCは、インビトロ条件下では、常に、αSMAおよび間葉マーカーをある程度まで発現するようにみえることに留意しなければならない。10日目の後の間葉マーカーおよびαSMAの発現増加は上皮から間葉への移行と筋線維芽細胞様細胞への分化転換と一致している。PTCと比較して、筋線維芽細胞様細胞に分化転換する時に細胞が経る多数の移行段階がある。低レベルのPTC特異的マーカーしか発現しない顕著な筋線維芽細胞様表現型をもつ細胞は、PTCを必要とする用途には有用でない。それに加えて、筋線維芽細胞様細胞に分化転換する細胞は凝集物を形成する傾向があり、次いで、この凝集物は尿細管形成に関連するプロセスにおいて(例えば、14日目に)単層を破壊する。このような構造は、例えば、バイオ人工腎臓または薬物試験におけるハイコンテンツスクリーニングなどの用途と適合しないと考えられる。

すなわち、約8日後に、前記集団では、細胞の大部分(例えば、約90％以上)がPTCに特有の細胞マーカーを発現している可能性がある。マーカー発現は約8〜10日目に最適であり、この時点の後に急速に悪化し始める可能性がある。例えば、12日目〜14日目でも、マーカー発現プロファイルは既に著しく悪化し始めている可能性があり、これらの後の時点でαSMA発現レベルは大きく上昇する。

HPTCについて分化転換と、これに続く支持表面での尿細管形成が以前に述べられている(Zhang et al., Biomaterials 30 (2009) 2899;およびZhang et al., J Cell Mol Med 15 (2011) 1287)。本発明の方法において、hiPSCに由来するHPTC様細胞も、分化転換と、これに続く支持表面での尿細管様構造形成を経るようにみえる。このことも、これらの細胞とHPTCとの類似性を強調している。前記で示したように、分化させて20日目でもhESC由来HPTC様細胞は収集されることがある。対照的に、20日目までにはhiPSC由来細胞の大部分はもはやHPTC様状態にない。

従って、HPTC様細胞を作製するためにヒトiPSCを使用する時に、特に播種中に約8000細胞/cm²の播種密度とROCK阻害剤を使用する時に、約8〜約10日の分化期間が最適なようである。分化の初日(d1)は、前記のようにBMP2およびBMP7を培養物に初めて添加した日とみなした。分化期間のタイミングは初回培養の播種密度の影響を受ける場合があることに留意しなければならない。従って、分化させて8日目にHPTC様細胞を得るためには、hiPSCは、約8000生細胞/cm²の密度とROCK阻害剤を用いて播種され得る。

前記方法が細胞培養物などの細胞集団に対して行われた時に、集団または培養物の中にある全ての細胞がPTC様細胞に分化するとは限らないことが理解されるだろう。従って、集団または培養物の中にある一部の細胞は分化せず、iPSCの性質を保持する場合があるのに対して、同じ集団または培養物の中にある他の細胞は分化し、PTC様になるように誘導される。

従って、本発明の方法はiPSC集団をPTC様細胞に分化させることができ、このPTC様細胞は、例えば、KSP-CAD、AQP-1、PEPT1、OAT3、および/またはGLUT1を発現してもよい。

例えば、分化期間の後に、細胞の少なくとも30％がPTC特異的マーカーを発現してもよく、集団中の細胞の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％がPTC特異的マーカーを発現してもよい。例えば、PTC様細胞集団中の細胞の、約30％〜約95％、または約50％〜約90％のPTC様細胞、または約80％以上、約85％以上、約90％以上、または約95％以上が、例えば、OAT3を含むPTC特異的マーカーを発現してもよい。一態様において、前記細胞の約90％以上が、例えば、OAT3を含むPTC特異的マーカーを発現する。

PTC様細胞への分化の程度は、特定のマーカー遺伝子およびタンパク質の発現を確認するために、以下の実施例に記載の方法、例えば、免疫組織化学的技法、蛍光標識細胞分取(FACS)、ウエスタンブロット法、およびqPCR法を含む標準的な方法を用いて当業者により容易に求めることができる。さらに、本発明の前記方法によって作製された分化細胞集団とヒト初代腎近位尿細管細胞との類似性は、輸送体活性、薬物応答、酵素活性、副甲状腺ホルモンに対する応答性を試験することによって、および他の機能アッセイによって証明することができる。

図1は、分化方法と、それに続くインビトロ毒物学方法での分化細胞集団の使用の一態様を表すフローチャートを図示する。図1に図示した態様では、0日目にhiPSCがマルチウェルプレートに播種される。1日目に、BMP2およびBMP7を含有する分化培地が添加される。翌週の間に、細胞はHPTC様細胞に分化し、8日目の夕方に薬物試験に使用することができる。薬物に一晩曝露させた後に、qPCRによってIL6レベルおよびIL8レベルを確かめるために、9日目の朝に細胞溶解物を収集する。図1に図示した工程に加えて、分化方法は他のやり方で毒性スクリーニングと組み合わされてもよい。例えば、8日目に薬物曝露を開始してもよく、さらに長期間行ってもよく、および/または薬物曝露の後にさらなるアッセイを行ってもよい。さらに、分化細胞を、例えば、リン酸の再吸収および薬物効力を含む毒性スクリーニング以外の他のアッセイにおいて直接用い得る。

従って、一部の態様において、ヒトiPSCを含むiPSCを分化させるために、以下の条件およびプロトコールの一部または全てを用いてもよい。

以前に報告された分化プロトコールと比較して、hiPSCを含むiPSCは、以下の条件が分化プロトコールに取り入れられた場合に、(例えば、腎臓特異的マーカーおよびPTC特異的マーカーを示す細胞のパーセントによって、ならびに発現しているマーカーまたは発現していないマーカーのサブセットによって求められた時に)最適な分化を示す可能性があることが見出された。使用される細胞外マトリックス成分は、冷却した(例えば、氷冷)腎上皮細胞基本培地(REBM; 例えば、Lonza Bioscienceから入手可能)で希釈した増殖因子低減(GFR)型マトリゲルでもよい。前記で示したように、未分化状態でのiPSCの増殖はmTeSR1培地中で行われてもよい。分化状態へのiPSCの移行は、Accutaseなどの酵素を含有する細胞剥離培地と、例えば約4分間インキュベートすることによって行われてもよい。細胞播種中に、および細胞が懸濁されている時に、ROCK阻害剤が含まれてもよい。iPSCは分化培地中に約8000生細胞/cm²の密度で播種される。増殖用表面に細胞が付着した後に、播種して約12〜16時間後に、分化条件に細胞因子である骨形成タンパク質BMP2およびBMP7が添加されてもよい。前記細胞を約8〜約10日の期間にわたって分化させる。

前記方法の一態様において、分化プロトコールの前に、iPSCを、mTeSR1培地を用いて未分化状態で増殖させてもよい。HPTC様細胞に分化させるために、iPSCの単一細胞懸濁液を、例えば、StemPro(商標)Accutase(Life Technologies)などの酵素を含有する細胞剥離培地を用いて、37℃で4分間インキュベートすることによって調製してもよい。次いで、懸濁液を腎上皮細胞増殖培地(REGM)で洗浄し、腎上皮細胞増殖培地(REGM)に再懸濁してもよい。細胞が懸濁液中にある時はいつも、10μM ROCK阻害剤(Y-27632, Calbiochem)を添加することができる。ROCK阻害剤を、細胞播種に用いられる懸濁液にもまた添加してもよい。コーティング前に氷冷腎上皮細胞基本培地(REBM; Lonza Bioscience)で1:50に希釈した増殖因子低減型マトリゲル上に、約8000生細胞/cm²の密度で、6ウェルプレートに細胞を播種してもよい(コーティングのために、希釈したGFRマトリゲル1mlを組織培養プレートの各ウェルに37℃で1時間、添加してもよい)。細胞を一晩(約12〜16時間)付着させた後に、培地を、10ng/mlのBMP2および2.5ng/mlのBMP7を加えたREGMと交換してもよく、この時を分化1日目とする。培地を1日おきに新鮮培地と交換してもよい。細胞は約8日目に収集されてもよい。

従って、前記で示したように、前記方法によって、iPSCに由来する分化したPTC様細胞を含む細胞集団が得られる。

集団中のPTC様細胞は、VITD3、SLC34A1、NBC1、Na⁺/K⁺ATPアーゼ、KSP-CAD、AQP1、GGT、CD13、OAT1、MEG、OAT3、OCT2、OCTN2、PEPT1、GLUTl、GLUT5、SGLT1、SGLT2、URO-10、およびZO-1の1つまたは複数を含む、インビボでPTCが発現する1種類または複数種のマーカーを発現する。一部の態様において、集団中のPTC様細胞はOAT3を発現する。一部の態様において、集団中のPTC様細胞はAQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する。一部の態様において、集団中のPTC様細胞はKSP-CAD、AQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する。一部の態様において、集団中のPTC様細胞は、Na⁺/K⁺ATPアーゼ、AQP1、PEPT1、OAT3、SGLT2、URO10、ZO-1、およびGLUT1を発現する。

前記集団は、PTC様細胞になるように分化している大多数の細胞を含有する可能性がある。例えば、前記集団は、少なくとも30％のPTC様細胞、少なくとも40％のPTC様細胞、少なくとも50％のPTC様細胞、少なくとも60％のPTC様細胞、少なくとも70％のPTC様細胞、少なくとも80％のPTC様細胞、または少なくとも90％のPTC様細胞を含有してもよい。前記集団は、約30％〜約95％、または約50％〜約90％のPTC様細胞、または約80％以上、約85％以上、約90％以上、または約95％以上のPTC様細胞を含有してもよい。

前記集団は、iPSCから生じた細胞を含有する。従って、PTC様細胞に加えて、前記集団は、分化していないiPSC、部分的に分化したiPSC、ならびにいくつかの分化転換細胞、例えば、αSMAなどの筋線維芽細胞マーカーの発現が増加した細胞も含有する可能性がある。好ましくは、前記集団はごくわずかな分化転換細胞を含有するか、または分化転換細胞を含有しない。

インビトロ培養したPTCと比較した時に、iPSC由来PTC様細胞は同様のインビトロ条件下で同様の特徴を示す可能性がある。

ヒトiPSCを用いた時に、分化した集団において細胞の大部分がhiPSC由来HPTC様細胞であるようであり、場合によっては、以下の実施例に記載のように、8日目までに約90％以上の細胞が、AQP-1を含む様々な腎臓マーカーおよびHPTCマーカーを発現することが見出された。通常、HPTC培養物の方が、ばらつきが大きい。特に、インビトロHPTCは、主な薬物輸送体であるOAT3を極めて低いレベルで発現することが多い。OAT3は、例えば、qPCRおよび免疫染色結果によって定量された時に、本明細書において開示された方法によってhiPSCから得られたHPTC様細胞において発現している傾向がある。発現している様々なマーカーのレベルは、使用したiPSC株に左右される場合があることに留意しなければならない。例えば、OAT3は、iPS(Foreskin)-4由来細胞中のHPTCのOAT3、例えば、以下の実施例2において使用したHPTCのOAT3より高いレベルで発現している場合がある。異なるiPSC株に由来する他のHPTC様細胞のOAT3レベルの方が低い場合がある。異なるPTC特異的マーカーを用いて同様の結果が観察されることがある。それに加えて、hiPSC由来HPTC様細胞のGGT発現および活性はHPTCと比較して低い場合がある。

比較すると、hESCの分化から得られたHPTC様細胞集団は典型的に約30％のAQP1発現の範囲にある(Narayanan et al., 2013)。このことから、hESCに由来するHPTC様集団は、異なる細胞タイプの多種多様な混合物を含有し、この混合物はさらに精製する必要があり得ることが示唆される。

従って、iPSCを用いて、分化したPCT様細胞集団を生じさせることによって、インビボおよびインビトロの両方で様々な用途のための優れた細胞源が得られる。これらの細胞は、インビボでPTCに対して直接の毒性がある腎臓毒に対して感受性があり、腎毒物学のインビトロモデルにおいて適用することができる。

本発明の細胞集団は、初代細胞培養物と関連することがある困難、例えば、ヒト腎臓試料の不足、異なるドナーから得られる細胞集団間のばらつき、および継代中に初代細胞において生じる機能変化を、減らすか、または回避し得る。それに加えて、本明細書に記載の方法によってiPSCから分化した細胞集団は、胚性幹細胞から分化した集団に関連する問題を減らすか、または回避し得る。ヒト胚性幹細胞の使用は倫理上および法律上の考慮すべき事項に直面する可能性がある。それに加えて、胚性幹細胞が関与する方法の方が、時間が長くかかる傾向があり、分化細胞のパーセントが低くなる可能性がある。

前記集団中のiPSC由来PTC様細胞の純度が高いため、前記集団をインビトロアッセイにおいて直接用い得る。例えば、iPSCをPTC様細胞に分化させるのに用いられた組織培養プレートを、細胞を収集し再プレーティングする必要なしに腎毒物学研究に用い得る。

前記で示したように、前記細胞は、処理も収集も精製も分取もする必要なく、様々な異なるインビトロアッセイにおいて直接用い得る。約8日目〜約10日目から、前記細胞を、毒性スクリーニングなどのインビトロアッセイ、または例えば、リン酸再吸収および薬物効力などの他のアッセイにおいて使用することができる。前記細胞は、連続したアッセイ、例えば、インビトロ毒性スクリーニングと、これに続くさらなるアッセイにおいて用いられてもよい。

従って、分化方法は、後に続くインビトロアッセイを念頭に置いて設計されてもよい。分化が8日間行われたら、細胞分化と、それに続く一晩の薬物試験手順を終える時間の合計は9日、と短くなる可能性がある。図1に図示したように、細胞はPTC様細胞に分化し、8日目の夕方までに薬物試験に使用することができる。薬物に一晩曝露された後に、分析のために、例えばqPCRによってIL6レベルおよびIL8レベルを求めるために、9日目の朝に細胞溶解物を収集し得る。

以下の実施例に記載のように、前記方法を例示するためにヒトiPSCを使用した。分化すると、分化した細胞はヒト腎臓細胞およびヒト初代腎近位尿細管細胞(HPTC)に典型的なマーカーを発現した。hiPSC由来HPTC様細胞をインビトロ腎毒物学モデルにおいて試験した。このデータから、hiPSC由来HPTC様細胞がインビトロ腎毒物学モデルに適用された時に、これらのモデルの予測可能性が高いことが示唆された。hiPSC由来細胞を用いて得られた結果は、少なくとも、HPTCおよびhESC由来HPTC様細胞を用いて得られた結果と同じくらい良好なようであった。従って、hiPSC由来腎臓細胞は、現在に至るまで、インビトロ腎毒物学、腎臓組織工学、および再生医療における用途に最も適した細胞タイプであり得る。

従って、化合物の腎毒性をスクリーニングする方法を提供する。簡単に述べると、前記方法は、説明したようにiPSCから分化したPTC様細胞の試験集団を接触させる工程、および細胞試験集団を、近位尿細管(PT)毒性について評価しようとする試験化合物を用いて調べる工程を含む。接触後に、細胞集団の特定の特徴または表現型を観察および/または測定し、試験化合物と接触していない細胞対照集団の同じ特徴または表現型と比較する。

例えば、細胞を、ある特定の期間にわたって試験化合物に曝露し、次いで、処理後に細胞生存率または細胞数を観察してもよい。他の特徴、表現型、またはエンドポイント、例えば、特定の遺伝子、例えば、インターロイキン(IL)-6およびIL-8の発現、ならびに細胞形態および細胞骨格成分の変化、ならびに核内因子(NF)κBの移行、ATP枯渇およびミトコンドリア損傷、グルタチオン(GSH)枯渇、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の漏出(膜損傷)、活性酸素種(ROS)の発生、ならびにDNA損傷(遺伝毒性)を評価してもよい。

試験化合物の効果は、インビボでPTCに対して直接毒性がある公知の毒、または腎毒性があるもののインビボでPTCに対して直接毒性がない公知の毒、または腎毒性がない公知の毒による処理と比較されてもよい。

好都合なことに、さらに継代も収集することもなく、細胞試験集団を分化方法から直接用い得る。このアプローチは便利であり、優れたPTC様細胞品質と、まだ分化転換し始めていない高い割合の細胞も提供し得る。収集および再播種がPTC特異的マーカー発現の低下につながる可能性があることに留意しなければならない。

または、前記細胞は収集され、分けられ、次いで、コンフルエントな単層、サブコンフルエントな単層、コンフルエントな上皮、オルガノイド培養、コンフルエント2D培養、インビトロ尿細管、3Dオルガノイド培養、または静置3D培養もしくはマイクロ流体条件下に保たれた3D培養を含む3D培養を含む任意の形式で培養されてもよい。

一部の態様において、前記細胞を、コンフルエントな単層またはサブコンフルエントな単層などの単層で増殖させる。コンフルエントな単層の細胞密度で、良好な細胞分化を実現できることに留意しなければならない。

例えば、分化細胞を、マルチウェルプレートに高密度(例えば、50000細胞/cm²)で播種し、次いで、分化した上皮を形成する時間を細胞に与えるために、化合物と接触させる前に3日間培養してもよい。この分化した上皮は、(他の態様において用い得るサブコンフルエントまたは多層とは対照的に)コンフルエントな単層上皮の形をとると考えられる。上述したように、収集および再播種は、PTC特異的マーカー発現が低下した細胞につながる可能性がある。

一部の態様において、前記細胞を、コンフルエントな単層またはコンフルエントな2D上皮の形を含めてマイクロ流体バイオリアクター中で直接、分化または増殖させてもよい。マイクロ流体バイオリアクターは、本明細書に記載のように長期培養および試験化合物への反復曝露に有用な場合がある。この形式は培養物中に化合物濃度の勾配を生じさせるのに有用な場合がある。

前記アッセイ方法では、インビトロ培養した細胞を、インビボでのPTCに対する潜在的な毒性について試験しようとする化合物と接触させる。

試験化合物は、PT毒性について評価しようとする任意の化合物であり得る。試験化合物は、対象が吸収する化合物または対象が摂取する化合物を含む、対象と接触すると予想される任意の化合物であり得る。例えば、試験化合物は、薬学的化合物、有機化合物、農薬、環境毒物、重金属含有化合物、有機溶媒、食品添加物、化粧品成分、またはナノ粒子であり得る。

接触させる工程は、化合物を、細胞が培養されている組織培養培地に添加することによって行われてもよい。

接触させる工程は、ある期間にわたって、例えば、試験しようとする化合物を培養中の細胞とインキュベートすることによって行ってもよい。接触させる工程は、約8時間以上、約16時間以上、24時間以上、72時間以上行われてもよい。試験化合物と接触させる工程は、一晩、例えば、約8時間〜16時間またはこれより長く行われてもよい。

試験しようとする試験化合物の濃度は変更されてもよく、試験しようとする化合物によって決まることがある。典型的に、インビトロでPTC様細胞において約1μg/ml〜約1000μg/mlの濃度で毒性が観察される時、このような毒性は、臨床に関連する濃度でインビボでのPTC毒性を予測するものとなる傾向がある。

例えば、試験化合物を、約0.001μg/ml以上、約0.01μg/ml以上、約0.1μg/ml以上、約1μg/ml以上、約10μg/ml以上、約100μg/ml以上、または約1000μg/ml以上の濃度で、細胞試験集団と接触させてもよい。試験化合物を、約0.001μg/ml〜約1000μg/ml、約0.005μg/ml〜約1000μg/ml、または約0.01μg/ml〜約500μg/mlの濃度で、細胞集団と接触させてもよい。

理解されるように、分化したPTC様細胞の対照集団は、試験化合物とは接触しないが、陰性対照溶液、例えば、試験集団と接触させるために試験化合物を溶解するのに用いられる溶媒または溶液(ビヒクル対照)とは接触してもよい。

接触させる工程は繰り返されてもよい。例えば、接触させる工程は、ある特定の期間にわたって2回以上、3回以上、4回以上、または5回以上繰り返されてもよい。

例えば、接触させる工程の最初の期間が完了した後に、組織培養培地を、化合物を含有する新鮮な培地と交換してもよい。または、培地を、試験化合物を含有しない新鮮な培地と交換してもよく、接触がない期間の後、次に、試験化合物を細胞試験集団と再び接触させてもよい。

従って、接触させる工程は(最初の接触段階を過ぎて)さらに一回または複数回、例えば、約3〜約28日間にわたって繰り返されてもよい。接触させる期間の間に、試験化合物の接触(すなわち、新鮮培地への細胞の曝露)がない期間が、例えば、1日〜14日間続いてもよい。

接触させる工程は、観察および/または測定する工程のすぐ前または直前に繰り返されてもよい。

様々な異なる腎毒物学アッセイが公知であり、このアッセイ方法では任意の特徴、表現型、または腎毒物学インビトロアッセイからのエンドポイントを評価することができる。前記で示したように、観察および/または測定される特徴または表現型は、例えば、細胞生存率、細胞数、IL-6および/またはIL-8の発現を含む遺伝子発現レベル、細胞形態の変化、細胞骨格成分の配置、NF-κBの移行を含む細胞因子の移行、ATP枯渇、ミトコンドリア損傷、グルタチオン枯渇、LDH漏出量を含む膜損傷、活性酸素種の発生でもよく、またDNA損傷でもよい。

従って、創薬中に9日と短い期間で、細胞集団をiPSCから分化させ、次いで、潜在的な薬物候補を含む試験化合物の毒性を迅速に評価するために使用することができる。以下の実施例2において証明したように、本明細書に記載の方法を使用してhiPSC由来HPTC様細胞を用いて行ったアッセイの感受性、特異性、および平衡化した正確度(balanced accuracy)の値は、それぞれ、例えば、約85％、91％、および88％になる場合がある(表4を参照されたい)。

比較のために、本発明の方法より前の、近位尿細管マーカーを発現する幹細胞由来細胞を作製するための最も迅速な代替プロトコールは、播種後、約12日の期間に及ぶ。この以前のプロトコールは、本明細書に記載したプロトコールと比較して様々な工程と5倍の播種密度を必要とする。代替プロトコールを用いて作製された腎臓系列の高分化型幹細胞由来細胞の純度または品質の結果は述べられておらず、このような細胞に基づく応用例は開発されていない。

iPSC由来PTC様細胞の純度はhESC由来細胞より高く、その結果、iPSC PTC様細胞を用いて予測可能性全体を改善し得る。例えば、hESC由来細胞を用いて得られた平衡化した正確度は0.76であったのに対して、以下の実施例2に示したように、ここでは本発明者らは平衡化した正確度0.88を得た。

この予測可能性の改善は細胞の品質だけではなく、インビトロモデルと機械学習の組み合わせによるものであるかもしれない。

すなわち、本明細書に記載のPTC様細胞を用いたインビトロアッセイ方法が機械学習法と組み合わされた時に、PTC毒性の予測レベルを改善し得る。

機械学習は薬物誘導性毒性の予測においてますます重要な役割を果たしている。サポートベクタマシン(SVM)分類器方法ならびにパターン認識、分類、および回帰分析を伴う学習アルゴリズムは公知であり、SVM分類器は価値のあるツールと確認されている。この分類器を用いて、手動による介入を行うことなく大きなデータセットを効率的に分析することができる。この方法は、偏りを起こしやすい他の方法と比較して好ましい。他の知見と一致して、本発明のアッセイ方法において用いられた時に、SVMベースの分類は、以下の実施例2に記載のように正確度を高めることが示された。

説明されたインビトロアッセイ方法に加えて、PTC様細胞は、PT機能に取って代わるために、かつインビトロでゲル中または二次元(2D)表面に作製されたヒト尿細管を含む尿細管を作製するためにバイオ人工腎臓に適用されてもよい。

本発明は、iPSCから分化したPTC様細胞を含むバイオ人工腎臓を提供する。この装置は、失われた腎臓機能を治療するために用い得る。

一般的に、バイオ人工腎臓は2つの中空繊維カートリッジを備える。一方の中空繊維カートリッジは血液濾過に用いられるのに対して、他方の中空繊維カートリッジは、腎臓細胞を含むバイオリアクターである。このような装置は当技術分野において公知であり、血液透析または血液濾過装置と同じように患者に接続されてもよい。

例えば、このような装置の中には、細胞増殖用の足場として、膜表面のある中空糸血液濾過カートリッジが用いられてもよい。iPSCを内面または外面に播種し、前記のように分化させることができる。または、分化したiPSC由来細胞を表面に播種することができる。

従って、装置を調製する方法であって、細胞を中空繊維装置に播種する前に、または細胞を中空繊維装置に播種した後に、前記のようにiPSCをPTC様細胞に分化させる工程を含む、方法を提供する。

このような装置の中に本明細書に記載の細胞を入れることによって、人工免疫障壁としての半透膜を介して血液循環と隔てられて、免疫拒絶反応または他の免疫合併症のリスクならびに未分化幹細胞が血流に入った時に起こり得る、可能性のある腫瘍形成のリスクを下げながら、前記細胞を臨床用途において用い得る。

前記のバイオ人工腎臓を、腎臓関連障害をもつ対象を治療するために用い得る。バイオ人工腎臓内にある細胞はPTC機能を果たし、従って、罹病した腎臓において、損なわれたPTC機能または存在しないPTC機能に取って代わるかまたはこれらを補う可能性がある。

従って、対象において腎臓関連障害を治療する方法も本明細書において提供する。前記方法は、腎臓関連障害の治療を必要とする対象に本発明のバイオ人工腎臓を接続する工程を含む。

腎臓関連障害を治療する、とは、有益なまたは望ましい臨床結果を含む結果を得るためのアプローチを指す。有益なまたは望ましい臨床結果には、1つまたは複数の症状または状態の軽減または回復、障害または疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化、障害または疾患の発症の阻止、障害または疾患の蔓延の阻止、障害または疾患の進行の遅延または緩徐化、障害または疾患の開始の遅延または緩徐化、障害または疾患の状態の回復または緩和、および(部分寛解か完全寛解かに関係なく)寛解が含まれ得るが、これに限定されない。「治療する」とは、対象の生存時間を、治療の非存在下で予想される生存期間より長く延ばすことも意味することがある。「治療する」とは、障害または疾患の進行を阻害すること、障害または疾患の進行を一時的に緩徐化することも意味することがあるが、より好ましくは、障害または疾患の進行を永久に止めることを含む。

対象は、腎臓関連障害があるか、または腎臓関連障害の治療を必要とする任意の対象でよい。腎臓関連障害とは、急性腎傷害、慢性腎臓病、末期腎臓病、腎症、糖尿病性腎症、ネフローゼ、ブライト病、腎機能不全、糸球体炎、糸球体硬化症、または腎炎を含む、恒常的もしくは一過的な腎臓機能低下、腎臓変性、もしくは腎不全の原因となる場合があるか、恒常的もしくは一過的な腎臓機能低下、腎臓変性、もしくは腎不全をもたらすか、または恒常的もしくは一過的な腎臓機能低下、腎臓変性、もしくは腎不全に関連する任意の疾患、障害、または状態を指す。

上述のように、このような装置およびこのような装置の使用は当技術分野において公知である。一般的に、前記装置は従来の血液透析装置または血液濾過装置と同様に用いられる。前記装置は対象ならびに対象の血液に外部接続され、(最初の中空糸カートリッジの中で生じた)血液濾液は装置を通って、反対側に細胞が播種されている膜を通り過ぎ、次いで、最終的には対象に戻される。対象からの血液および血液濾液が装置を通過する時に、細胞は近位尿細管機能(前記を参照されたい)を果たす。

対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、腎臓関連障害の治療を必要とする対象において本発明の細胞を移植する工程を含む、方法も本明細書において提供する。

前記細胞は標準的な外科的方法または注射方法を用いて移植されてもよい。腎臓関連障害の治療的処置を提供するために、前記細胞は、対象の適切な部位、例えば、腎臓皮質または近位尿細管にある部位を含む、腎上皮細胞が必要とされる部位に移植されてもよい。前記細胞は、罹病した腎臓の皮質に移植されてもよい。

一態様において、細胞は、送達ビヒクル、例えば支持用ヒドロゲルの中に埋め込まれてもよい。例えば、ヒドロゲル、3D腎臓マトリックス、または細胞足場、例えばポリマー細胞支持体を含む、生細胞を移植するための送達ビヒクルが公知である。このような送達ビヒクルは生体適合性かつ生分解性でもよく、合成材料、生体材料、またはその組み合わせを含んでもよい。

前記細胞はまた、細胞を3D腎臓マトリックスに播種することによって作製される生物工学的に作製された移植片にも適している可能性がある。例えば、3D腎臓マトリックスは、1種類または複数種の合成化合物または天然化合物からなって、ヒト腎臓のマトリックスを模倣するように設計されてもよい。ヒト腎臓の形状、サイズ、および構造を反映するマトリックスを作製するために3Dプリンティングなどの技法を使用することができる。本明細書に記載の方法に従って、未分化iPSをマトリックスに播種し、マトリックス内で分化させてもよい。または、分化したiPS由来PTC様細胞をマトリックスに播種してもよい。iPSまたはPTC様細胞を単独で、または他の腎臓特異的細胞タイプおよび血管細胞タイプなどの他の細胞タイプと一緒に播種してもよい。

脱細胞化腎臓(Song et al., Nature Medicine, 2013, 19(5), 646-51)などの脱細胞化マトリックスが用いられてもよい。ブタ腎臓に由来するマトリックスのサイズはヒトへの移植に適している。例えば、本明細書に記載の手順に従って、未分化iPSCを脱細胞化マトリックスに播種し、マトリックス内で分化してもよい。または、分化したiPS由来PTC様細胞を脱細胞化マトリックスに播種することができる。iPSまたはPTC様細胞を単独で、または他の腎臓特異的細胞タイプおよび血管細胞タイプなどの他の細胞タイプと一緒に播種することができる。

生物工学的に作製された移植片を、化合物効力試験および安全性スクリーニングを含む様々な用途のために臓器培養において用い得る。このような用途にはサイズが小さな移植片が好ましいことがある。例えば、腎臓病モデルとして、皮質または近位尿細管などの腎臓の一部にしか相当しない移植片を用い得る。

それに加えて、末期腎臓病のヒトまたは動物に移植するために生物工学的に作製された移植片を用い得る。

バイオリアクターまたは生物工学的に作製された移植片の中にある細胞を含む有効量のPTC様細胞が対象に投与される。本明細書で使用する「有効量」という用語は、望ましい結果を得るために、例えば腎臓関連障害を治療するために必要な投与および期間で有効な量を意味する。

投与される総数細胞の数は、腎臓関連障害の重篤度およびタイプ、投与方法、ならびに対象の年齢および健康状態を含む、いくつかの要因に応じて変化する。

さらに、本明細書に記載のように得られたPTC様細胞は、例えば、インビトロ尿細管または尿細管様構造の作製を含む他のインビトロ用途において用い得る。例えば、以前にPCT公開出願WO2010/064995において方法が説明されている。

本明細書に記載の方法、細胞集団、装置、および使用は、以下の非限定的な実施例としてさらに例示される。

実施例1
2種類の試験薬物(リファンピシンおよびパラコート。両方ともPTCに対して直接毒性がある腎臓毒である)によるhiPSC由来HTPC様細胞の処理は2012年11月5日に開始した。インターロイキン-6/インターロイキン-8発現に基づく腎毒物学インビトロモデル(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362)を用いて薬物応答を試験した。データから、PTC特異的腎臓毒で処理した後にIL-6発現(およびリファンピシンの場合はIL-8発現)が増加することが明らかになった。このことから、PTC特異的腎臓毒による処理は陽性応答をもたらすことが分かった。

材料および方法
無菌法を用いて全手順を行った。

試薬:
mTeSR1培地キット: STEM CELL Technologies, カタログ番号05850; BD Matrigel(商標)Basement Membrane Matrix, 増殖因子低減(GFR)型, BD Biosciences, カタログ番号356230; Rock阻害剤(Y-27632) Calbiochem, カタログ番号688000; 腎上皮細胞基本培地(REBM), Lonza Bioscience, カタログ番号CC-3191; StemPro(登録商標)Accutase(登録商標) Cell Dissociation Reagent, 100ml, Lifetech, カタログ番号A11105-01; 腎上皮細胞増殖培地(REGM), Bulletkit, Lonza Bioscience, カタログ番号CC-3190; BMP2, R&D systems, カタログ番号355-BM-010; BMP7 R&D systems, カタログ番号354-BP-010; Definedグレードの胎仔ウシ血清 (FBS), Thermo Scientific Hyclone, カタログ番号SH30070.03; ジメチルスルホキシド(DMSO) Sigma, カタログ番号D2650。

未分化iPSCの増殖:
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)培養物を、(製造業者の説明書に従って)mTeSR1培地が入っている6ウェルのGFRマトリゲルコーティングプレート上で増殖させ、培地交換を毎日行った。mTeSR1培地キット: STEM CELL Technologies, カタログ番号05850; BD Matrigel(商標)Basement Membrane Matrix, 増殖因子低減(GFR)型, BD Biosciences, カタログ番号356230。

iPSCの分化:
未分化hiPSC培養物が約80％コンフルエントであった5〜6日までに、腎臓分化条件を適用した。

増殖因子低減(GFR)型マトリゲルコーティングプレートの調製
GFR-マトリゲルを、氷冷REBM(腎上皮細胞基本培地, Lonza)で50倍希釈して、コーティング用のワーキング溶液(6ウェルプレートの各ウェルに1mlのGFR-マトリゲルワーキング溶液)にした。プレートをコーティングする時に、希釈したマトリゲルは低温であった(10℃未満)。コーティングは、プレートを37℃で1時間インキュベートすることによって行った。

マトリゲルコーティング時間の後に、hiPSC培養物を継代した。古いmTeSR1培地をhiPSC培養ディッシュから除去し、滅菌1xPBSで2回リンスし、予め温めたAccutaseと37℃で4分間インキュベートした(6ウェルプレート1ウェルあたり1ml)。プロセス中に泡が入るのを避けながら、1mlマイクロピペットで上下に何回もピペッティングすることによってコロニーを単一細胞に解離した。

細胞懸濁液を、10μM Rock阻害剤を含有するREGMが入っている50mlファルコンチューブに移し、体積を5倍にした(すなわち、4mlのREGMと一緒に1mlの細胞懸濁液を添加した)。総細胞数を求めるために細胞懸濁液のアリコートを採取した。細胞が懸濁されている時はいつでも、および付着のために細胞を播種して最初の12〜16時間だけ、Rock阻害剤は溶液中に存在する。

細胞をペレット化するために、(スイングバケット遠心機を用いて)細胞懸濁液を300gで5分間、遠心分離した。遠心中に、再懸濁した総体積中にある総細胞数を計算した。細胞を約8000細胞/cm²の濃度まで再懸濁するのに必要なREGMを、10μM Rock阻害剤を含めて調製した。

遠心分離後、チューブから上清の培地を除去し、細胞を再懸濁するために、調製されたREGMを添加した。6ウェルプレートの場合、必要とされるREGMの体積は1ウェル2mlであった。細胞を、必要とされる密度および体積でプレートに播種し、次いで、可能な限り素早く37℃、CO₂インキュベーターに移した。攪拌によって、分化のために必要な細胞密度の付着が阻止されるので、インキュベーターでかき乱すことは避けた。細胞播種密度を厳密に維持し、細胞生存率の損失を回避するために可能な限り素早く細胞を播種した後に、プレートをインキュベーターに入れた。

細胞を一晩付着させた後に、培地を、10ng/mlのBMP2および2.5ng/mlのBMP7を加えたREGMと交換した。

分化を、10ng/mlのBMP2および2.5ng/mlのBMP7を含むREGM中で行い、培地を1日おきに交換した。培地にBMP2およびBMP7を新しく加えた後に、細胞に添加した。

分化の初日は、BMP2およびBMP7を細胞培養物に初めて添加した日とみなした。8日目〜10日目まで分化状態を適用した。3日目が終わるまでに細胞密度は増加し、6日目が終わるまでに細胞は単層を形成した。この段階で単層が形成されなければ、細胞は線維芽細胞様細胞に分化する可能性がある。7日目〜8日目までに、細胞は、上皮形態のコンフルエントな単層を形成するはずである。

凍結保存:
標準的な手順に従って分化細胞を凍結保存した。以下:40％高品質defineグレードFBS;50％REGM;10％DMSOの通りに凍結保存培地を調製した。細胞を2x10⁶細胞/ml/クライオバイアルで凍結保存した。最適な凍結状態のために、標準的な凍結保存容器を使用した。最初に、細胞を-80℃に保ち、翌日、液体窒素保管容器の気相に移した。

薬物処理:
クライオバイアルを急速解凍し、10μMのRock阻害剤を含有するREGMに添加した。細胞をペレット化し、補充剤BMP2およびBMP7ならびにRock阻害剤を含有する新鮮なREGMに懸濁した。24ウェルプレートの1cm²あたり1x10⁵個の細胞数で、10ng/mlのBMP2および2.5ng/mlのBMP7を加えたREGMに細胞を播種し、3日間培養した後に、薬物処理を開始した(初代HPTCと同様のプロトコールに従った; Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362)。薬物を、それぞれの溶媒に添加し、例えば、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、および1000μg/mlでREGMに添加した。

凍結保存細胞を使用する代わりに、薬物処理に使用したマルチウェルプレートにiPSCを播種し、このプレート中で、以前に概説されたプロトコールを用いてHPTC様細胞に分化させることができる。細胞は8日目〜10日目には薬物処理する用意ができている。

図2.hiPSC由来HPTC様細胞の数に及ぼす薬物処理の影響
iPS(Foreskin)-4細胞からHPTC様細胞を得た。HPTC様細胞をマルチウェルプレートに播種し、播種後3日間にわたって様々な薬物濃度(x軸)で処理した。細胞をPTC特異的腎毒素(上パネル)または非腎毒性薬物(下パネル)で一晩処理した。薬物曝露後に、ハイコンテンツスクリーニング(HCS)によって細胞数を求めた。全データをビヒクル対照(100％)に対して正規化した。HPTC様細胞を非腎毒性薬物で処理した時に細胞数は減少しなかった。対照的に、HPTC様細胞をPTC特異的腎毒素で処理した時に細胞数は減少した。HPTCを用いて行った同様の実験では、ゲンタマイシンおよびパラコートで処理した後に細胞数の減少は観察されなかった(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013) 352-362)。このことは、hiPSC由来HPTC様細胞はHPTCより感受性が高いことを示しているのかもしれない。

結果
以前に概説された分化プロトコールが適用された時、約8日後に、集団は、大部分(例えば、約90％以上)の細胞が、PTCに特有の細胞マーカーを発現することを示した。分化培養期間の最適な範囲を確かめるために、免疫染色データを用いて経時変化を追った。α平滑筋アクチン(SMA)を除く試験したマーカーの全てが腎近位尿細管細胞に特有のものであった。腎近位尿細管細胞が筋線維芽細胞様細胞に分化転換する時にSMAが発現するようになる。このような筋線維芽細胞様細胞はPTC様細胞培養物において望ましくない。結果から、マーカー発現は約8〜10日目で最適であり、この後に急速に悪化することが分かった。12日目〜14日目でも、マーカー発現プロファイルは既に著しく悪化している。これらの後の時点でSMA発現は大幅に上昇することが観察された。

以前に説明されたプロトコールを用いてhESCから得られるHPTC様細胞は、分化させて20日目になってようやく収集し得るのに対して、本明細書において説明された方法によって得られるhiPSC由来HPTC様細胞は、分化させて8日目〜10日目に最適な特徴を示す。

8〜10日間、分化させた後に、iPSC由来培養物はPTC特異的マーカーの発現低下を示し、細胞は筋線維芽細胞様細胞に分化転換し始めた。

マーカーの1つは、腎臓でのみ転写される腎臓特異的カドヘリン(KSP-CAD)であった。さらに、以下の近位尿細管(PT)特異的マーカー:アクアポリン1(AQP1)、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、および有機アニオン輸送体3(OAT3)を使用した。筋線維芽細胞マーカーα-SMAも含めた。

KSP-CADが発現していたことでhiPSC由来細胞が腎臓に分化したことが確かめられた。qPCRの結果は、PTC特異的マーカー発現に関する免疫染色データおよび機能アッセイにおいて観察された、比較的低いレベルのGGT活性と一致した。両hiPSC株に由来するHPTC様細胞は、マーカー遺伝子のほぼ同じ上方制御パターンまたは下方制御パターンを示した。どちらの場合も、これらのパターンはhESC由来細胞を用いて得られるパターンと異なった。

α-平滑筋アクチン(αSMA)は、10日目の後に上方制御されるようにみえる筋線維芽細胞マーカーである。PTCと比較して、筋線維芽細胞様細胞に分化転換している時に多数の移行段階細胞がある。筋線維芽細胞様段階に入っている細胞は、PTCを必要とする用途に使用することができない。それに加えて、筋線維芽細胞様細胞に分化転換する細胞は凝集物を形成する傾向があり、次いで、この凝集物は尿細管形成に関連するプロセスにおいて(14日目に)単層を破壊する。このような構造は、バイオ人工腎臓または薬物試験中のハイコンテンツスクリーニングにおける用途とは適合しないだろう。

特に注目に値するのは、iPSCから得られるHPTC様細胞において8〜10日目に観察されるOAT3発現である。OAT3はインビボでヒトPTCにおいて発現しているが、通常、インビトロではHPTCにおいてインビボよりかなり低いレベルで発現している。インビトロ培養したこのような初代細胞において、OAT3発現をインビボ発現レベルと同様のレベルまで増強する公知の方法は現在ない。OAT3は20日目hESC由来HPTC様細胞でも極めて低いレベルでしか発現していない(例えば、Narayanan et al., 2013, 図3を参照されたい)。

説明された方法によって得られたHPTC様細胞集団の大部分は分化する傾向がある。一部の実験では、iPSC由来HPTCの約93％は8日目にOAT3を発現し(AQP1 98％)、他のHPTC特異的マーカーも>90％であることがFACSによって確かめられている。これは、典型的にAQP1発現が約30％の範囲にある、hESCの分化に由来するHPTC様細胞集団と比較される(Narayanan et al., 2013)。このことから、hESCに由来するHPTC様集団は異なる細胞タイプの多種多様な混合物を含有することが示唆され、さらに精製する必要があるかもしれない。

hiPSC由来HPTC様細胞の93％は8日目にOAT3を発現し(AQP1 98％)、他のHPTC特異的マーカーも>90％であることがFACSによって確かめられている。d20 hESC由来細胞を用いた最適な結果は約30％のAQP1発現の範囲にあることに留意されたい(Narayanan et al., 2013 ;この刊行物ではFACSによって他のマーカーはチェックされなかったが、他のマーカーの免疫染色データは、iPSC由来細胞を用いて得られた免疫染色データほど一貫性がなかった)。従って、ここでの結果から、hESCに由来するHPTC様集団(Narayanan et al.に記載)と、本明細書に記載のhiPSCに由来するHPTC様集団との間には大きな定量的および定性的な差違があることが分かる。

実施例2
hiPSCをHPTC様細胞に分化させるための一段階プロトコールを、前もって細胞を収集することなく、すぐに薬物を試験するために使用した。30種類の化合物に対する応答を評価することによってhiPSC由来細胞の予測性能を確かめた。サポートベクタマシンアルゴリズムによって結果を自動分類した。このようにして、ヒトにおけるPTC毒性を高い正確度で予測し得る。従って、一段階分化プロトコールと機械学習を組み合わせると、ヒトにおけるPTC毒性を正確に予測するための効率的な方法が得られる可能性がある。

材料および方法
hiPSCの増加および分化:
iPS(Foreskin)-4細胞、iPS IMR90-4細胞、およびiPS DF19-9-11T.H細胞は、WiCell Research Institute (Madison, WI, USA)から入手した。これらのhiPSC株を用いた研究はシンガポール国立大学の治験審査委員会によって認可された(NUS-IRBレファレンスコード: 13-437)。未分化細胞を、増殖因子低減型マトリゲル(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)でコーティングしたマルチウェルプレート中でmTeSR1培地(Stemcell Technologies, Singapore)を用いて増やした。分化のために、増殖因子低減型マトリゲルでコーティングした24ウェルプレートに8000細胞/cm²の密度でhiPSCを播種した(0日目)。StemPro Accutase(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いて単一細胞懸濁液を調製した。

10μm Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤(Y-27632, Calbiochem, Merck, Darmstadt, Germany)を加えた市販の腎臓上皮増殖培地(REGM BulletKit; Lonza Bioscience, Singapore)に、細胞を再懸濁および播種した。1日目に、培地を、10ng/mlのBMP2および2.5ng/mlのBMP7(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を加えたREGMと交換した。BMPを加えた培地はROCK阻害剤を含有しなかった。培地を1日おきに交換した。

8日目に化合物処理を行い、細胞が分化している同じプレートを化合物試験に使用し続けた。分化手順と、それに続く薬物試験のフローチャートを図1に示した。

蛍光標識細胞分取(FACS)および免疫蛍光:
以前に概説されたように(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362; Narayanan et al., Kidney Int. 83 (2013), 593-603)、FACSおよび免疫蛍光を行った。

走査型電子顕微鏡(SEM)ならびにg-グルタミルトランスフェラーゼ1(GGT)および薬物輸送体活性の測定:
以前に概説されたように(Tiong et al. Mol. Pharm. 11 (2014), 1933-1948; Narayanan et al., Kidney Int. 83 (2013), 593-603)、これらの手順を行った。

化合物処理およびならびにIL6およびIL8発現レベルの測定:
化合物処理を16時間行った。アリストロキン酸を除く全化合物が以前の研究において用いられており、ヒト腎毒性に関する詳細な情報が提供されている(Li et al., Toxicol. Res. 2(2013), 352-362; Li et al. Mol. Pharm. 11 (2014), 1982-1990)。アリストロキン酸(アリストロキン酸IとIIの1:1混合物)は、EMD Millipore(Billerica, MA, USA)から購入した。アリストロキン酸は、ヒトにおいて、腎臓近位尿細管への直接毒性に関連する急性腎傷害、または慢性腎臓病および尿路上皮癌につながる可能性がある、よく特徴付けられた腎毒素である(Yang et al., Nephrol. Dial. Transplant. 27 (2012 292-298)。

全化合物を1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、および1000μg/mlの濃度(それぞれ3回繰り返した)で試験し、以前の研究と同様に結果を全てビヒクル対照に対して正規化した。プレートは全て、対照として、100μg/mlデキサメタゾン(陰性対照)および100μg/mlピューロマイシン(正の対照)を含有した(それぞれ3回繰り返した)。説明されたように(Zhang et al. J. Biomol. Screen 4 (1999), 67-73)、Z'値を計算し、Z'値が>0.5のプレートを組み入れた。同じプライマー(表1)を用いることによって前と同じように、定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)でIL6およびIL8のmRNAレベルを求めた。全データを2つの参照遺伝子(GAPDHおよびPPIA)に対して正規化した。

以下の表1はqPCRに使用したマーカーの詳細を示す。この表には、qPCRに使用した全マーカーを列挙した。使用した頭字語をアルファベット順に列挙した。遺伝子のIDおよび説明はHUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)の命名法に従う。qPCRに使用したプライマー対(F:フォワード、R:リバース)および塩基対(bp)単位のアンプリコンサイズを示した。

（表１）qPCRプライマー

マーカー発現レベルの測定:
説明されたように(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362)、qPCRによってマーカー発現レベルを求めた。プライマーおよびアンプリコンの詳細を上記の表1に示した。

計算および統計:
本明細書に記載の計算解析の一部ではない計算および統計は全て、Microsoft Office Excel 2010を用いて行った。統計には独立t検定(Microsoft Office Excel 2010)を使用した。SigmaStat(3.5)(Systat Software Inc., Chicago, IL, USA)を用いてデータの正規分布が確かめられた。

計算解析:
各薬物について、全用量で測定したIL6またはIL8の発現値を、それぞれのビヒクル対照に対して正規化した。次いで、結果として得られた比にlog2変換を適用した。下限=0の3パラメータ対数ロジスティック(log-logistic)モデルを用いて、シグモイド用量反応曲線を得た(Ritz and Streibig, J. Stat. Software 12 (2005), 1-22)。このモデルは、以下の形:

を有する。

上記の式において、xは薬物濃度であり、eは上限dと0の中間の応答であり、bはeの付近での相対的な傾きである。概算された用量反応曲線から、最大試験薬物投与量での応答値(IL6レベルまたはIL8レベル)を求めた(IL6maxまたはIL8max)。3つのHPTCバッチにおけるIL6およびIL8の発現に関するデータが以前に得られており(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362)、ここで再解析した。

薬物誘導性腎毒性を予測するためにサポートベクタマシン(SVM)(Cortes, C. and Vapnik, V., Machine Learning 20 (1995), 273-297)と放射基底関数カーネルを使用した。SVMには、2つのパラメータ: 正則化/コスト(regularization /cost)パラメータ(C)および放射基底関数カーネルの幅(width of the radial basis function kernel)(γ)がある。C=10-5〜105およびγ=10-5〜105に対する網羅的グリッドサーチ(exhaustive grid search)(C.-W. Hsu, C.-C. Chang and C.-J. Lin, A practical guide to support vector classification. National Taiwan University, 2003)を用いて、これらのパラメータを最適化した。

最後に、3分割交差検定法を用いて分類性能を評価した(Hastie et al. (eds) The Elements of Statistical Learning: Data Mining, Inference, and Prediction, 2^nd Ed, (2009), Springer Science + Business Media LLC, Philadelphia, PA, USA)。

全データセットを無作為に、3つのほぼ等しく、かつ層別化された分割部分(fold)に分け、このうちの2つを用いてSVMを訓練し、残りの分割部分を用いて、訓練されたSVMを試験した。この手順全体を10回繰り返した。これらの10回の試験から得られた分類性能測定値を全て平均した。以下の3つの分類性能測定値を使用した。
感度=TP/TP+FNx100％
特異度=TN/TN+FPx100％
平衡正確度=感度+特異度/2x100％

TPは真の陽性の数であり、TNは真の陰性の数であり、FPは偽陽性の数であり、FNは偽陰性の数である。分析は全て、Intel Core i7-3770KプロセッサおよびWindows7オペレーティングシステムを備えるパーソナルコンピュータにおいてR統計環境(v3.0.2)下で「e1071」ライブラリー(v1.6-1)を用いて行った。

図3.分化中のiPS(Foreskin)-4由来細胞のマーカー発現パターン変化
(a)マーカー発現レベルを15日間にわたって1日おきにqPCRで求めた(灰色のバー)。分化プロトコールを1日目に適用した。バーは平均+/-標準偏差(s.d., n=3)を示す。マーカー発現レベルを、未分化iPS(Foreskin)-4細胞(0日目)におけるそれぞれのマーカーの発現レベルに対して正規化した。未分化hiPSCにおける平均発現レベルを1に設定した。黒色のバーはHPTCにおける発現レベルを示す(場合によっては発現レベルは非常に低く、バーは目に見えない)。調べたマーカーならびにそのインビボ発現パターン(PSC、中胚葉、間葉腎臓前駆体、ネフロン前駆体、PTC)を示した。qPCRで調べたマーカーの遺伝子ID、説明、および頭字語を全て表1にまとめた。(b)PTC特異的マーカーが免疫染色によって8日目、10日目、12日目、および14日目に検出された(緑色;細胞核:青色)。以下のマーカー:AQP1、溶質キャリヤーファミリー5(ナトリウム/グルコース共輸送体),メンバー2(SGLT2)、溶質キャリヤーファミリー2(促進グルコース輸送体(facilitated glucose transporter)),メンバー1(GLUT)1、有機アニオン輸送体(OAT)3、アラニル(膜)アミノペプチダーゼ(CD13)、尿路上皮糖タンパク質(URO)10、zonula occludens(ZO)-1、および平滑筋アクチン(SMA)が検出された。高レベルのSMAを発現する細胞凝集物を矢先で示した。スケールバー:50μm.

図4.iPS IMR90-4由来細胞およびiPS DF19-9-11T.H由来細胞のマーカータンパク質発現
(a)iPS IMR90-4細胞を様々な期間にわたって分化させた。8日目、10日目、12日目、および14日目に試験した細胞を用いて得られた結果を示した。免疫蛍光によって検出されたマーカー(緑色)を左に示した。細胞核を青色で表示した。10日目の後に、ほとんどのPTCマーカーの発現が低下した。後の時点で、αSMAが強く染まった細胞凝集物(矢先)が生じた。スケールバー:50μm。(b)iPS DF19-9-11T.H由来d8細胞を用いて得られたFACS結果。示したマーカーが陽性であった細胞のパーセントを表示した。

図5.免疫染色およびFACSによるhiPSC由来d8細胞の特徴付け
左側のパネルは、iPS(Foreskin)-4細胞およびiPS IMR90-4細胞に由来するd8細胞の上皮を示す。左側に示したPTC特異的マーカーは免疫蛍光によって検出された(緑色;細胞核:青色)。スケールバー:100μm。右側のパネルは、iPS(Foreskin)-4由来d8細胞またはiPS IMR90-4由来d8細胞を用いて得られたFACS結果を示す。右側に示したマーカーが陽性であった細胞のパーセントを、表示した。FACS結果は免疫染色データと一致し、ほとんどの場合で、細胞の>90％が陽性であったことを示した。

図6.iPS(Foreskin)-4由来d8細胞の特徴付け
(a〜c)組織培養プラスチック(TCPS)上で培養した細胞によってドーム(dome)が形成された。異なる焦点面をパネル(a)および(b)に表示した。(c)GLUT1(緑色)が免疫蛍光によって検出された。スケールバー: 100μm。(d)細胞は先端刷子縁をともなって極性化された(スケールバー: 5μm)。マトリゲル(e)またはTCPS(f)の表面に培養した細胞によって尿細管が発生した。スケールバー:100μm。(g)31種類のマーカーの発現レベルを、iPS(Foreskin)-4由来HPTC様d8細胞(灰色のバー)およびHPTC(黒色のバー)においてqPCRで求めた。バーは平均+/-s.d.(n=3)を示す。下に示したように、マーカーをその機能またはインビボ発現パターンに従ってグループ分けした。

図7.hiPSC由来細胞のGGT活性およびOCT2活性
(a〜c)相対GGT活性を、BALB/c 3T3線維芽細胞(陰性対照、黒色のバー)、HPTC(正の対照、白色のバー)、およびhiPSC由来細胞(灰色のバー)において求めた。hiPSC由来細胞を、x軸に示したように異なる時点で試験した。バーは平均+/-標準偏差(s.d., n=3)を示す。結果を全て、BALB/c 3T3細胞を用いて得られた結果に対して正規化した。BALB/c 3T3細胞を用いて得られた結果を1に設定した。iPS(Foreskin)-4由来細胞(パネルa)、iPS IMR90-4由来細胞(パネルb)、およびiPS DF19-9-11T.H由来細胞(パネルc)を用いて得られた結果を示した。(d)hiPSC由来細胞のOCT2活性。iPS(Foreskin)-4由来d8細胞およびiPS IMR90-4由来d8細胞を、ビヒクル(DMSO)含有細胞培養培地、または50μmのOCT2阻害剤テトラペンチルアンモニウムを含有する細胞培養培地とインキュベートした。5分間インキュベートした後に、25μmの蛍光OCT2基質ASP⁺(ヨウ化4-(4-(ジメチルアミノ)スチリル)-N-メチルピリジニウム)を添加した。30分後に、細胞生存率をモニタリングするためにヨウ化プロピジウムを添加し、細胞をFACSで分析した。図は、阻害剤処理試料(灰色)およびビヒクル対照(白色)の細胞蛍光強度(n=3)を示す。両グラフとも、iPS IMR90-4由来細胞の場合、かなりの程度まで重なっている。このことからOCT2阻害剤処理試料とビヒクル対照との間には差違がないことが分かる。このことから、これらの細胞にはOCT2活性が欠如していることが分かる。iPS(Foreskin)-4由来細胞の場合、阻害剤処理細胞は蛍光強度の減少を示した。これは、OCT2阻害剤の存在下で蛍光OGT2基質の取り込みが減少することと一致する。データ分析から>25のMDR活性係数(MAF)値が得られた。MAF値>25の試料を輸送体活性陽性(星印)とみなした。

図8.輸送体を介した薬物取り込みならびにIL6およびIL8の薬物誘導性発現
iPS(Foreskin)-4由来d8 HPTC様細胞を100μg/mlの(a)シトリニンまたは(b)リファンピシンで処理した。薬物処理細胞におけるIL6およびIL8の発現レベルを濃い灰色のバーで示した。バーは平均+/-s.d.を示す(n=3)。全発現レベルをビヒクル対照に対して正規化し、ビヒクル対照を1に設定した。PTCによるシトリニン取り込みはOAT1およびOAT3によって媒介され、これらの輸送体はプロベネシドによって阻害される。シトリニンおよびプロベネシドへの曝露(パネルaの薄い灰色のバー)によって、シトリニン誘導性IL6発現レベルは31％低減した。PTCによるリファンピシン取り込みはOCT2によって媒介され、OCT2はシメチジンによって阻害される。リファンピシンおよびシメチジンへの曝露によって、リファンピシン誘導性のIL6発現レベルおよびIL8発現レベルは、それぞれ、40％および26％低減した(パネルbの薄い灰色のバー)。これらの阻害剤は単独ではビヒクル対照と比べてIL6およびIL8の発現レベルを有意に変えなかった(白色のバー; 両阻害剤とも2mMの濃度で使用した)。薬物で処理した試料と薬物+阻害剤で処理した試料との間の有意差を星印で示した。

図9.hiPSC由来細胞におけるマーカー発現
iPS(Foreskin)-4由来d8細胞では、PAX2、WT1、およびJAG1が免疫蛍光(赤色;左側のパネル)によって検出された。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色細胞核を青色で示した(中央)。右側のパネルは合成を示す。スケールバー:200μm。(b)x軸に示した14種類のマーカーの発現レベルを、hiPSC由来d8細胞およびHPTCにおいてqPCRで求めた。細胞タイプを、示したように異なる色で表した。全発現レベルをGAPDH発現の％として表示した。バーは平均+/-s.d.(n=3)を示す。

図10.HPTCおよびHPTC様細胞の予測性能
(a)グループ1(白色;ヒトにおいてPTCに対して毒性がある)およびグループ2(黒色;ヒトにおいてPTCに対して毒性がない)の化合物によって誘導されたHTPC様細胞のIL6遺伝子発現レベルおよびIL8遺伝子発現レベルの変化を示した散布図。それぞれの点は化合物を表している。これらの特徴を用いて、サポートベクタマシン(SVM)分類器を訓練した。(b)HPTC様細胞(赤色)ならびに3つのHPTCバッチ(HPTC1-青色、HPTC2-紫色、およびHPTC3-緑色)から収集した全データに対して訓練した最終SVMの受信者動作特性(ROC)曲線。赤色のグラフ、青色のグラフ、および紫色のグラフは重複している。挿入図は、分類器の曲線下面積(AUC_final)および平衡正確度(正確度_final)の値を示す。HPTC様細胞ならびにHPTCバッチ1および2に基づくSVMは30種類の化合物を完全に分離することができる。

結果
分化中の遺伝子およびタンパク質の発現:
材料および方法のセクション(hiPSCの増加および分化)に記載のプロトコールを用いて、よく特徴付けられた3種類のhiPSC株であるiPS(Foreskin)-4、iPS IMR90-4、およびiPS DF19-9-11T.Hを分化させた。iPS(Foreskin)-4由来細胞における遺伝子発現パターンの変化を15日間にわたってモニタリングした(図3a)。1日目(d)の後に、OCT3/4、NANOG、SOX2、およびDNMT3Bは下方制御された。これらの「幹細胞性(stemness)」マーカーが下方制御された後に、d3にTの一過的なパルス(pulse)が続いた(図3a)。Tは、腎臓の起源である脊椎動物胚の初期中胚葉において一過的に発現される。典型的には、多能性幹細胞(PSC)が腎臓系列に分化する時に「幹細胞性」マーカーが下方制御され、Tの初期の一過的なパルスが起こることが観察されている。

ここでは、Tは5〜13日目に低レベルで再発現した。OSR1はd7〜d9に強力に上方制御された(図3a)。胚発生中に、OSR1は腎臓前駆体集団15の発生全体を通して絶えず発現している。d7〜d9に、ネフロン前駆体マーカーおよびPTCマーカーも強力に上方制御された(図3a)。これらは、ネフロン前駆体マーカーSIX2、WT1、およびGDNFならびに後腎発生を規定するHOXD11を含んだ。d7〜d9に上方制御されたPTCマーカーはKSP-CAD、AQP1、およびGGTであった。KSP-CADの発現は腎臓特異的であり、尿細管上皮細胞に限定される。AQP1およびGGTの発現は近位尿細管上皮細胞の特徴である。

これらの結果からd7〜d9に大きく変化することが分かり、d9に、細胞は高レベルの試験した全てのネフロン前駆体マーカーおよびPTCマーカーを発現した。ネフロン前駆体マーカーはインビボで成熟ヒトPTCにおいて発現していないが、典型的にはインビトロ条件下で再発現される。このことは、成人ヒト腎臓から単離したHPTCのインビトロ培養物(図3a; 黒色のバー)がd9にhiPSC由来細胞とほぼ同じネフロン前駆体マーカーパターンおよびPTCマーカーパターンを発現したことを示す、ここで得られた結果によって確かめられた。免疫染色から、3種類全てのhiPSC株に由来する細胞が、d8に、タイトジャンクションならびに正しいPTC特異的タンパク質の発現および局在化をもつコンフルエントな上皮を形成したことが明らかになった(図3b、図4a、および図5)。

幹細胞性マーカーの初期下方制御、Tの一過的なピーク、ならびにそれに続くOSR1およびネフロン前駆体マーカーの上方制御を含む、ここで観察された遺伝子発現変化は、腎臓系列にPSCを分化させるために多段階プロトコールを適用した最近の先行研究の結果に一致した。これらの研究のほとんどでは、高度に分化した腎臓細胞において発現するマーカーの上方制御も観察され、本件でも同じことが観察された。

ここでは、d9の後にPTC特異的マーカー遺伝子の発現が段々と低下し、d11の後にネフロン前駆体マーカーの発現が低下することが観察された(図3a)。これらのqPCR結果は、d10に(iPS DF19-9-11T.H由来細胞)またはd10の後に(iPS(Foreskin)-4由来細胞およびiPS IMR90-4由来細胞)、PTCマーカータンパク質および上皮マーカータンパク質の発現低下を示す免疫染色結果と一致した(図3bおよび図4)。

後の時点でPTCマーカーおよび上皮マーカーは下方制御され、d15には比較的低いレベルで発現していたのに対して(WT1を除く)、この時点で中胚葉マーカーおよび間葉マーカーであるTおよびOSR1は強く上方制御された(図3a)。また、筋線維芽細胞マーカーであるSMAも後の時点で細胞凝集物中に漸増レベルで発現していた(図3bおよび図4)。HPTCをインビトロで長期間培養した時に同様のプロセスが以前に観察されており、SMAの上方制御がPTCの上皮間葉移行(EMT)と関連づけられた。TはEMTにおいて重要な役割を果たすことが示されている。後の時点でのT、OSR1、およびSMAの上方制御(図3)は、長期間培養した後に(HPTCと同様に)hiPSC由来HPTC様細胞でも起こるEMTと一致する。高度に分化した近位尿細管細胞は高度の柔軟性を維持し、上皮状態と間葉状態を容易に切り替えることができることに気付くことが重要である。この柔軟性は組織再生におけるその役割と関連しているようにみえる。

hiPSC由来d8細胞の特徴付け:
これらの結果から、d7〜d9にhiPSC由来細胞は代表的なPTC特異的マーカー遺伝子を上方制御し(図3a)、コンフルエントな上皮を形成し、d8にPTC特異的なマーカータンパク質パターンを発現することが明らかになったので(図3bおよび図4)、d8細胞をさらに調べた。独立して得られた分化細胞バッチを用いて繰り返した免疫染色実験から、d8に、iPS(Foreskin)-4由来細胞およびiPS IMR90-4由来細胞はコンフルエントな腎臓上皮を形成することが確かめられた(図5)。ほぼ全ての細胞が、AQP1、Na⁺/K⁺ATPアーゼ、OAT3、PEPT1、SGLT1、GLUT1、URO10、およびZO-1を含むPTC特異的マーカータンパク質を発現していた(図5)。FACS実験から、マーカータンパク質は、ほとんどの場合において、細胞の90％超で発現していたことが明らかになった。このことは、3種類全てのhiPSC株に由来する細胞に当てはまった(図4および図5)。従って、インビトロ用途のために、これらの細胞をこれ以上精製することは必要ないと考えられる。

iPS(Foreskin)-4由来d8細胞はHPTCの典型的な形態学的特徴および機能的特徴を有し、ドーム形成、先端刷子縁をともなう極性化、および管形成を示した(図6a〜f; HPTCおよびhESC由来HPTC様細胞を用いて、マトリゲルおよび組織培養プラスチック上での同様の管形成プロセスが観察された)。さらに、3種類全てのhiPSC株に由来する細胞がGGT活性を示したが、hiPSC由来細胞のGGT活性はHPTCより低かった(図7)。他の結果(図3)と一致して、iPS(Foreskin)-4由来細胞およびiPS IMR90-4由来細胞においてGGT活性は後の時点で低下した。これらの2種類のhiPSC株に由来するd8細胞の輸送体活性を試験した時に、どちらの場合も、排出輸送体(efflux transporter)(MDR1、MRP2、BCRP)は不活性であることが判明した。しかしながら、有機カチオン取り込み輸送体OCT2はiPS(Foreskin)-4由来d8細胞において活性があった(図7d)。有機アニオン取り込み輸送体OAT3は、このような細胞のかなりの割合で発現していた(図5)。従って、さらなる特徴付けを行うためにiPS(Foreskin)-4由来細胞を選択した。

iPS(Foreskin)-4由来d8細胞のマーカー発現パターンをqPCRで詳細に特徴付けた。このようなHPTC様細胞の独立して分化させた別のバッチとHPTCにおいて31種類のマーカーの発現レベルを求めた(図6g)。これらの結果から、KSP-CADは両細胞タイプにおいて発現していたことが確かめられ、SLC34A1も同様に確かめられた。この遺伝子は、完全に分化したPTCでしか発現しないII型ナトリウム/リン酸共輸送体をコードする。ナトリウム、重炭酸塩、およびグルコースの輸送に関与する他のPTC特異的輸送体(NBC1、SGLT2、およびGLUT5)も発現していた。さらに、試験した薬物輸送体が全て発現していた。主な有機アニオン取り込み輸送体であるOAT1およびOAT3の発現レベルは、それぞれ、HPTC様細胞では(HPTCと比較して)約15倍(P=0.0004)または約5倍(P=0.0157)であった。OCT2の場合、約2倍の発現レベルが観察された(P=0.0005)。これは、シスプラチンを含む、PTCによる様々な腎臓毒の取り込みに重要である。PEPT1およびMEGは、HPTC様細胞では約2倍(P=0.0001)および約26倍(P=0.0041)のレベルで発現していた。MEGは腎毒性をもつアミノグリコシド系抗生物質の取り込みに重要である。有機カチオン取り込み輸送体OCTN2は両細胞タイプにおいて同様のレベルで発現し(P=0.1608)、排出輸送体MDR1はHPTCの方が高レベルで発現していた(約39倍;P=0.0003)。これは、iPS(Foreskin)-4由来HPTC様細胞では、取り込み輸送体とは対照的に排出輸送体には、検出可能な活性がなかったという観察に一致した(図7および図8)。

他の結果と一致して、このiPS(Foreskin)-4由来HPTC様細胞バッチとHPTCにおいて様々な他のPTC特異的マーカー(AQP1、CD13、GGT、VITD3、Na+K+ATPアーゼ)も発現し、同様に上皮マーカー(ZO-1、N-CAD、E-CAD; 図6g)も発現していた。PAX2およびWT1も同様に発現していた。これらの2種類のマーカーは腎臓前駆体およびネフロン前駆体ならびにインビトロ培養したHPTCにおいて発現している。PAX2、WT1、および腎臓小胞マーカーJAG131の発現が免疫染色によって確かめられた(図9)。さらに、腎臓損傷マーカー(NGAL、KIM-1、VIM)およびSMAの発現が観察された(図6g)。また、腎臓損傷マーカーの発現ならびにE-CADおよびSMAの発現(経時的に増加する)もインビトロ条件下のPTCにおいて起こる。注目すべきことに、PAX2およびNGALは、それぞれ、HPTC様細胞では約1/34(P=0.00003)または1/122(P=0.0002)のレベルで発現し、KIM-1およびVIMも、この細胞タイプでは(HPTCと比較して)約1/4(P=2.4x10-7)〜1/3(P=0.0002)のレベルで発現していた。

両細胞タイプとも、インビボ条件下で他の腎上皮細胞タイプに特異的なマーカー: PODXL(糸球体上皮細胞)、NCCT(遠位尿細管)、NKCC2(太いヘンレ係蹄上行脚(thick ascending limb of Henle's loop))、UMOD(タム・ホースフォール(Tamm-Horsfall)糖タンパク質、太いヘンレ係蹄上行脚)、およびAQP3(集合管; 図6g)を発現した。また、これは、通常、インビトロ条件下で起こり、HPTCおよびhESC由来HPTC様細胞において以前に観察されている。ここでは、PTCマーカーAQP1および集合管マーカーAQP3は同じ細胞において共発現していることが免疫染色によって確かめられた(データは示さず)。従って、入り混じったマーカー発現パターンは異なる細胞集団の存在によるものではなかった。このことは、ほとんどの場合において、細胞の>90％がPTC特異的マーカーを発現していたという事実と一致する(図5)。

比較のために、14種類の選択されたマーカーの発現レベルがiPS IMR90-4由来d8細胞およびiPS DF19-9-11T.H由来d8細胞でも確かめられ、3種類全てのhiPSC株およびHPTCに由来するd8細胞の結果を図9に表示した。これらの結果から、全マーカーが4種類全ての細胞タイプにおいて発現していたことが分かった。iPS(Foreskin)-4由来細胞は、ほとんどの場合において最も高い発現レベルを示した。

薬物の取り込みおよび薬物誘導性インターロイキンの発現:
PTCに対して毒性がある化合物は、HPTCおよびhESC由来HPTC様細胞においてIL6および/またはIL8の発現を特異的に増加させる。この特徴的なIL6/IL8発現増加に基づいて、ヒトにおいてPTC毒性を予測するための方法を以前に開発した。ここでは、PTCに対して毒性がある化合物がiPS(Foreskin)-4由来d8細胞においてIL6および/またはIL8の発現を増加させるかどうか試験した。通常通り、細胞をマルチウェルプレート中で分化させ、8日目の夕方に、PTC特異的腎臓毒であるシトリニンおよびリファンピシンで16時間処理した。その後に、IL6レベルおよびIL8レベルをqPCRで求めた(手順のフローチャートを図1に示した)。リファンピシンはIL6発現を約17倍増加させ、IL8発現を約18倍増加させた(図8)。シトリニンはIL6発現を約6倍増加させたのに対して、IL8発現の増加は観察されなかった(図8)。以前の結果から、シトリニンはhESC由来HPTC様細胞でもIL8を誘導しなかったことが明らかになった。通常、全ての薬物が両インターロイキンを誘導するとは限らない。

PTCによるシトリニン取り込みはOAT1およびOAT3によって媒介される。これらの輸送体はプロベネシドによって阻害される。シトリニンおよびプロベネシドと共にインキュベートすると、シトリニン誘導性IL6発現レベルは大きく約31％低減した(図8)。この結果から、OAT1およびOAT3がiPS(Foreskin)-4由来d8細胞において発現することと一致して、これらの輸送体によってシトリニン取り込みが媒介されることが明らかになった(図5および図6g)。

同様の実験をリファンピシンを用いて行った。PTCによる、この薬物の取り込みはOCT2によって媒介され、OCT2はシメチジンによって阻害される。シメチジンと共にインキュベートすると、リファンピシン誘導性のIL6発現増加およびIL8発現増加がそれぞれ40％および26％低減した(図8)。これらの結果から、リファンピシン誘導性のIL6誘導およびIL8誘導は輸送体を介した薬物取り込みに依存することが示唆された。これらの結果はiPS(Foreskin)-4由来d8細胞におけるOCT2の発現(図6g)および活性(図7)と一致した。

予測性能:
次に、hiPSC由来HPTC様細胞を用いて薬物のPTC特異的腎毒性を予測できるかどうかに取り組んだ。この問題には、IL6/IL8ベースのアッセイ(全体の手順については図1を参照されたい)を用いて取り組んだ。簡単に述べると、iPS(Foreskin)-4由来d8細胞を30種類の化合物(表2および表3)に一晩曝露した。これらを2つのグループに分けることができた。グループ1は、ヒトにおいてPTCに対して直接、毒性がある18種類の腎臓毒を含んだ(表2および表3)。グループ2は、ヒトにおいてPTCに対して毒性がない化合物を含んだ。このグループは、4種類の非腎毒性化合物と、PTCを直接傷つけることのない8種類の腎臓毒を含んだ(表2および表3)。PTCを傷つける化合物であるアリストロキン酸を除く全化合物を、以前に報告された研究において使用した。ヒトにおける、これらの化合物の腎毒性に関する詳細な情報が提供されている(Li et al., Toxicol. Res. 2 (2013), 352-362; Li et al. Mol. Pharm. 11 (2014), 1982-1990)。一晩曝露させた後に、IL6レベルおよびIL8レベルの変化をqPCRで求めた。表2および表3は、試験した全濃度の30種類全ての化合物を対象にしたIL6発現レベルおよびIL8発現レベルに関する結果を示す。試験中、全化合物を盲検化した。

（表２）iPS(Foreskin)-4由来d8細胞における化合物誘導性IL6発現

（表３）iPS(Foreskin)-4由来d8細胞における化合物誘導性IL8発現

d8の夕方に、細胞を、表2および表3の左側に列挙した化合物で処理した。グループ1(PTCに対して直接、毒性がある腎臓毒)は化合物1〜18を含む。グループ2(PTCに対して毒性がない化合物)は化合物19〜30を含む。化合物19〜26は、PTCを直接傷つけることのない腎臓毒であり、化合物27〜30はヒトにおいて腎毒性がない。各化合物を1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、および1,000μg/mlの濃度で適用した。0はビヒクル対照(化合物濃度:0μg/ml)を表す。d9の朝にIL6およびIL8の発現レベルをqPCRで求めた。場合によっては、大量の細胞死のためにIL6またはIL8の発現レベルを求めることができなかった(ND)。結果は平均+/-s.d.(n=3)を示す。結果を全て、それぞれのビヒクル対照に対して正規化し、ビヒクル対照の平均を1に設定した。

次いで、各化合物について、対数ロジスティックモデルを用いてIL6およびIL8の用量反応曲線を推定した。推定された曲線から試験最大用量での応答が確かめられた(IL6maxおよびIL8max、図10a)。これらの特徴に基づいて、サポートベクタマシン(SVM)と呼ばれる自動分類器を用いて化合物をグループ1およびグループ2に分類した。

最後に、交差検定法を用いて、全化合物を2つの重複しないサブセットに無作為に分け、サブセットの一方に対して分類器を訓練し、訓練された分類器を他方の未使用のサブセットに対して試験した。HPTC様細胞は、HPTCを用いて得られた平均値とほぼ同じ予測正確度を有することが見出された(交差検定された平衡正確度=88％対87％、表4)。本発明者らはまた全化合物を用いて最終SVM分類器を訓練し、HPTC様細胞および3つのHPTCバッチのうちの2つの場合、この分類器が2つのグループを完全に分離できることを見出した(最終正確度=100％、図10b)。

（表４）交差検定された腎毒性予測性能

標準的な3分割交差検定法と10回の無作為な試験を用いてSVM分類器の性能を評価した。示した平均値は、異なるドナーから得られた3つのHPTCバッチ(HPTC1、HPTC2、HPTC3)の平均である。比較を容易にするために、HPTCの平均値と、HPTC様細胞を用いて得られた値を太字で印刷した。

まとめると、これらの結果から、hiPSC由来HPTC様細胞とSVM分類器の組み合わせを用いて薬物のPTC特異的腎毒性を予測できたことが分かる。

本明細書で引用された全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられるように詳細かつ個々に示されるように参照により本明細書に組み入れられる。どの刊行物の引用も出願日前の刊行物を開示することを目的としており、先行発明に基づいて本発明がこのような刊行物に先行する権利がないことが認められると解釈してはならない。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によってはっきりと規定されていない限り複数への言及を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「含む(comprise)」、「含む(comprising)」、「含む(comprises)」という用語およびこれらの用語の他の形は非限定的で包括的な(inclusive)意味をなす、すなわち、他の要素も成分も排除することなく、列挙された特定の要素または成分を含むことが意図される。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、与えられた範囲またはリストは全て、任意の中間の値もしくは範囲またはその中に含まれる任意のサブリストを表すことが意図される。特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

前述の発明は、はっきりと理解できるようにするために例示および実施例としていくらか詳細に説明されたが、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲を逸脱することなく、ある特定の変化および変更を加えることができることは本発明の開示を考慮すれば当業者に容易に明らかである。

参考文献

Claims

人工多能性幹細胞(iPSC)を腎近位尿細管細胞(PTC)様細胞に分化させる方法であって、
1種類または複数種の細胞外マトリックス(ECM)分子、骨形成タンパク質2(BMP2)、および骨形成タンパク質7(BMP7)の存在下で腎上皮細胞培養培地中で、未分化iPSCを約8〜約10日の期間にわたって、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含む、方法。
iPSCがヒトiPSCである、請求項1記載の方法。
1種類または複数種のECM分子が増殖因子低減型マトリゲルマトリックスを含む、請求項1または請求項2記載の方法。
腎上皮細胞培養培地が腎上皮細胞増殖培地を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
iPSCが最初に約5000〜約10000生細胞/cm²の密度で播種される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
iPSCが最初に約8000生細胞/cm²の密度で播種される、請求項5記載の方法。
培養する工程の前に、iPSCが最初に、ROCK阻害剤の存在下かつBMP2およびBMP7の非存在下で播種される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
培養する工程中に、BMP2が約1ng/ml〜約25ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
培養する工程中に、BMP7が約0.25ng/ml〜約10ng/mlの濃度で存在する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
iPSCを最初に播種して約12〜約24時間後に、BMP2およびBMP7が腎上皮細胞培養培地に添加される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
増殖因子低減型マトリゲルマトリックスでコーティングされた培養支持体に未分化iPSCが付着できるように、BMP2およびBMP7を含まずかつ約5μM〜約15μMのROCK阻害剤を含む腎上皮細胞増殖培地中に、未分化iPSCを約8000生細胞/cm²の密度で約12時間〜約24時間、播種する工程;
腎上皮細胞増殖培地を、ROCK阻害剤を含まずかつ約2.5ng/ml〜約15ng/mlのBMP2および約1ng/ml〜約5ng/mlのBMP7を含む新鮮な腎上皮細胞増殖培地と交換する工程;
BMP2およびBMP7を含む腎上皮細胞増殖培地中で、iPSCを約8〜約10日の期間にわたって約37℃の温度および約5％CO₂の下で、iPSCからPTC様細胞への分化を誘導するのに十分な条件下で培養する工程
を含み、iPSCがヒトiPSCである、請求項1記載の方法。
約7〜約10日の期間にわたって1種類または複数種の細胞外マトリックス分子、骨形成タンパク質2、および骨形成タンパク質7の存在下で腎上皮細胞培養培地に約5000〜約10000生細胞/cm²の密度で播種した人工多能性幹細胞(iPSC)の集団から分化した、PTC様細胞集団。
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法によって調製された、請求項12記載の細胞集団。
細胞の約90％以上がAQP1、PEPT1、OAT3、およびGLUT1を発現する、請求項12または13記載の細胞集団。
バイオ人工腎臓装置の中空繊維バイオリアクターの中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
ヒドロゲルの中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
生物工学的に作製された組織の中に含まれる、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団。
請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団が播種されたマトリックスを含む、生物工学的に作製された組織移植片。
マトリックスが脱細胞化マトリックスである、請求項18記載の組織移植片。
マトリックスが生物工学的に作製された3D腎臓マトリックスである、請求項18記載の組織移植片。
化合物の腎毒性をスクリーニングするためのインビトロ方法であって、以下の工程を含む、方法:
試験化合物を、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞試験集団と接触させる工程;および
試験化合物と接触していない細胞対照集団と比較して、試験化合物の効果を確かめる工程。
細胞生存率、細胞数、マーカー遺伝子の発現、細胞形態、細胞骨格成分の配置、細胞因子の移行、ATP枯渇、ミトコンドリア損傷、グルタチオン(GSH)枯渇、膜損傷、活性酸素種の発生、またはDNA損傷に対する試験化合物の効果について試験集団が評価される、請求項21記載の方法。
細胞試験集団が、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法に従って調製され、接触させる工程の前に収集することなく、分化させて約8〜約10日後に、接触させる工程が該試験集団に対して行われる、請求項21または22記載の方法。
バイオ人工腎臓装置を調製する方法であって、装置に、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団を播種する工程を含む、方法。
対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、請求項12〜14のいずれか一項記載の細胞集団を含むバイオ人工腎臓装置を外部接続する工程を含む、方法。
腎臓関連障害の治療を必要とする対象において腎臓関連障害を治療する方法であって、有効量の請求項12〜14、16、および17のいずれか一項記載の細胞集団または請求項18〜20のいずれか一項記載の生物工学的に作製された組織移植片を、対象の、PTC様細胞が必要とされる部位に移植する工程を含む、方法。
腎臓関連障害が、急性腎傷害、慢性腎臓病、末期腎臓病、腎症、糖尿病性腎症、ネフローゼ、ブライト病、腎機能不全、糸球体炎、糸球体硬化症、または腎炎を含む、請求項25または26記載の方法。