WO2022039250A1 - ヒト人工多能性幹細胞の培養方法、ヒト人工多能性幹細胞培養物、及び脳オルガノイドの製造方法 - Google Patents

ヒト人工多能性幹細胞の培養方法、ヒト人工多能性幹細胞培養物、及び脳オルガノイドの製造方法 Download PDF

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誠司 塩澤
栄之 岡野
充 石川
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    • C12N2527/00Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing human induced pluripotent stem cells, a human induced pluripotent stem cell culture, and a method for producing brain organoids.
  • in vitro-formed brains (cerebral organoids) is being attempted to develop therapeutic and diagnostic agents for brain diseases.
  • a method of culturing a cell mass of human induced pluripotent stem cells under high oxygen partial pressure conditions (Patent Document 1) or a method of culturing human induced pluripotent stem cells in an extracellular matrix (Patent Document 2).
  • Patent Document 1 a method of culturing a cell mass of human induced pluripotent stem cells under high oxygen partial pressure conditions
  • Patent Document 2 a method of culturing human induced pluripotent stem cells in an extracellular matrix
  • the neural stem cells immediately after the closure of the neural tube derived from the ectoderm take the form of layered budding of neural epithelial cells, and then produce nerve cells by asymmetric division. do. That is, it is necessary for the formation of brain organoids to form cell aggregates having layered germinated neuroepithelial cells.
  • human induced pluripotent stem cells have different properties depending on the cell line type and the number of passages.
  • human induced pluripotent stem cells it is considered preferable to keep the properties of the cells constant and to make them suitable for the formation of cell aggregates having layered germinated neuroepithelial cells in the production of brain organoids.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a method for culturing human induced pluripotent stem cells suitable for the formation of cell aggregates having layered germinated neuroepithelial cells in the production of brain organoids, humans.
  • an artificial pluripotent stem cell culture and a method for producing a brain organoid using the human induced pluripotent stem cell culture.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a human having a step of seeding human induced pluripotent stem cells in a medium at a seeding density of 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 in an incubator and culturing them in two dimensions.
  • a culture of human induced pluripotent stem cells obtained by the method for culturing human induced pluripotent stem cells according to any one of (1) to (5) is used as a BMP inhibitor and a transforming factor.
  • Step 1 of culturing in a medium containing a ⁇ (TGF ⁇ ) inhibitor to form cell aggregates and Step 2 of culturing the cell aggregate in a medium containing a Wnt signaling pathway enhancer and an extracellular matrix, and Step 3 in which the culture obtained in the above step 2 is stirred and cultured, and A method for producing a brain organoid.
  • TGF ⁇
  • a human induced pluripotent stem cell culture that produces 3 or more metabolites selected from the group consisting of the metabolites shown in Table 1 below, and the amount of the metabolites produced is within the range shown in Table 1 below. ..
  • a method for culturing human induced pluripotent stem cells that forms human induced pluripotent stem cells suitable for the formation of neuroepithelial cells in the production of brain organoids. be able to.
  • FIG. 1 is a diagram showing a bright-field observation image and morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing criteria for morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a bright-field observation image and morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR in Experimental Example 4.
  • FIG. 5 is a diagram showing an immunostaining image of a human iPS culture of sample A1 (low seeding density: 1.4 ⁇ 103 ce lls / cm2) in Experimental Example 4.
  • FIG. 1 is a diagram showing a bright-field observation image and morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing criteria for morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a bright-field observation image and morphological evaluation of each cell aggregate in Experimental Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of quantitative
  • FIG. 6 is a diagram showing an immunostaining image of a human iPS culture of sample A5 (high seeding density: 34.3 ⁇ 103c ells / cm2) in Experimental Example 4.
  • FIG. 7A is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7B is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7C is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7D is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7E is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7F is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • FIG. 7G is a HeatM ap by HCA of the metabolome analysis in Experimental Example 5.
  • each component exemplified in the present specification for example, a component contained in a medium or a component used in each step, may be used alone or in combination of two or more. Can be done.
  • medium containing substance X and "in the presence of substance X” mean a medium to which an exogenous substance X is added, a medium containing an exogenous substance X, or an exogenous substance X. It means the presence of substance X. That is, when a cell or tissue present in the medium expresses, secretes or produces the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X and is an exogenous substance. A medium that does not contain X does not fall under the category of "medium containing substance X" even if it contains an intrinsic substance X.
  • human induced pluripotent stem cells are 1.0 ⁇ with respect to a culture vessel (hereinafter, also referred to as “incubator”). It has a step of collecting seeds on a medium at a seeding density of 10 4 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 and culturing them in two dimensions.
  • the seeding density of human induced pluripotent stem cells is within the above range, so that neuroepithelial cells can be produced in the production of brain organoids.
  • Human induced pluripotent stem cell cultures suitable for the formation of can be produced.
  • the method for culturing human induced pluripotent stem cells of the present embodiment suggests that cell-cell communication is important in the two-dimensional culture of human induced pluripotent stem cells.
  • the seeding density of human induced pluripotent stem cells is less than the above lower limit, the distance between human induced pluripotent stem cells is large until the human induced pluripotent stem cells proliferate, and cell-cell communication is sufficient. It is estimated that it cannot be done.
  • the seeding density of human induced pluripotent stem cells is less than the above lower limit, the distance between each human induced pluripotent stem cell varies in the process of proliferation of human induced pluripotent stem cells, and as a result, It is presumed that localization occurs in the concentration of intercellular transmitters and the like, and that intercellular information cannot be transmitted uniformly.
  • the seeding density of human induced pluripotent stem cells exceeds the above upper limit, it is presumed that the time to confluence is shortened and cell-cell communication cannot be sufficiently performed.
  • Genetically modified human induced pluripotent stem cells are also included in human induced pluripotent stem cells.
  • Genetically modified human induced pluripotent stem cells can be produced by transfecting human induced pluripotent stem cells with an artificial nuclease, ZFN, TALEN, or CRISPR.
  • the artificial nuclease introduces a double-stranded DNA break (DSB: double strand break) into the target gene, and inserts and deletes mutations by non-homologous end binding (NHEJ: non-homologous end joining), which is one of the DSB repair mechanisms. Can be introduced.
  • DSB double-stranded DNA break
  • NHEJ non-homologous end binding
  • Human induced pluripotent stem cells mean cells in which pluripotency has been induced by reprogramming somatic cells by a known method or the like.
  • differentiated somatic cells such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells, and lymphocytes are referred to as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog. , Sall4, Lin28, Esrrb and the like, and examples thereof include cells that have been reprogrammed to induce pluripotency by expression of any combination of a plurality of genes selected from the reprogramming gene group.
  • the number of passages of human induced pluripotent stem cells is usually 1 to 100 times, preferably 5 to 80 times, more preferably 10 to 40 times.
  • Two-dimensional culture is a culture method in which cells are cultured two-dimensionally in a state of being adhered to the culture surface of the incubator or the extracellular matrix formed on the culture surface by surface processing.
  • the two-dimensional culture of this embodiment proliferates human induced pluripotent stem cells
  • the two-dimensional culture can also be referred to as expansion culture.
  • the seeding density of human induced pluripotent stem cells in the medium was 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , and 2.0 ⁇ 10 4 to 9.0 ⁇ . 10 5 cells / cm 2 is preferable, and 3.0 ⁇ 10 4 to 8.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is more preferable.
  • the seeding density can be calculated by dividing the number of cells to be seeded (unit: cells) by the area of the culture surface of the incubator (cm 2 ).
  • the culture surface is a surface-treated incubator for improving cell adhesion.
  • Surface treatments for improving adhesion include, for example, coating treatment of extracellular matrix such as laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1, laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1, laminin 511E8, entactin, collagen, gelatin, vitronectin, polylysine, and polyornithin. , And positive charge processing.
  • the form of the incubator includes, for example, a flask, a flask for tissue culture, a culture dish (dish), a dish for tissue culture, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multi-plate, a multi-well plate, a chamber slide, a petri dish, and a tube. , Tissues, culture bags, microcarriers, stack plates, spinner flasks and the like.
  • a feeder-free medium As the medium used in the two-dimensional culture (hereinafter, also referred to as "expansion culture medium"), a feeder-free medium is preferable.
  • the feeder-free medium include known media such as hES9 medium, hES9a medium, and hESF-FX medium, and commercially available products such as TeSR-E8 (STEMCELL Technologies product name) and StemFit (registered trademark). Can be mentioned.
  • Rho kinase was added to the feeder-free medium before culturing in the feeder-free medium in order to maintain the differentiation potential, improve the proliferation ability, and suppress cell death of human artificial pluripotent stem cells. It can be cultured in a medium containing an inhibitor (ROCK inhibitor). That is, the two-dimensional culture can include a step of culturing in a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the culture period may be at most 5 days, and then in a feeder-free medium containing no ROCK inhibitor, usually 1 day or more, preferably 3 days. Incubate for more than a day.
  • the two-dimensional culture can further include a step of culturing in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the two-dimensional culture preferably includes a step of culturing in a medium containing a ROCK inhibitor and a step of culturing in a medium containing no ROCK inhibitor in this order.
  • ROCK inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 129830-38-2), Derivative / HA1077 (CAS number: 105628-07-7), H-1152 (CAS number: 871543-07-6), and the like. And Wf-536 (CAS No .: 539857-64-2), and derivatives thereof.
  • the concentration of the ROCK inhibitor contained in the medium containing the ROCK inhibitor is usually 0.1 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less, preferably 1 ⁇ M or more and 80 ⁇ M or less, and 5 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less. More preferably, it is an amount.
  • the temperature inside the container in which the incubator is placed is usually 30 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, preferably 32 ° C. or higher and 48 ° C. or lower, and more preferably 34 ° C. or higher and 46 ° C. or lower.
  • the carbon dioxide content in the container containing the incubator is usually 1% by volume or more and 15% by volume or less, preferably 2% by volume or more and 14% by volume or less, and more preferably 3% by volume or more and 13%.
  • the atmosphere is less than% by volume.
  • Dispersion means that cells are separated into a cell population of 100 or less, preferably a cell population of 50 or less, and more preferably a single cell by a dispersion treatment such as enzyme treatment or physical treatment.
  • a dispersion treatment such as enzyme treatment or physical treatment.
  • the dispersal treatment include a mechanical dispersion treatment, a cell dispersion liquid treatment, and a cell protective agent addition treatment. These processes can be combined. Among these, cell dispersion treatment is preferable.
  • Examples of the cell dispersion used for the cell dispersion treatment include a solution containing any of enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain; and a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid. Can be mentioned. Examples of commercially available cell dispersions include TrypLE Select and TrypLE Express manufactured by Thermo Fisher Scientific. Examples of the mechanical dispersion treatment include a pipetting treatment and a scraping operation with a scraper. The dispersion treatment can be performed by combining the cell dispersion liquid treatment and the mechanical dispersion treatment.
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • the confluency (cell occupied area) after the two-dimensional culture is preferably 70 to 100 area%, more preferably 75 to 100 area%, and even more preferably 80 to 100 area%. When the confluency is within the above range, a cell culture having more uniform properties can be obtained.
  • the confluency here is the ratio of the occupied area of the human induced pluripotent stem cell culture after the two-dimensional culture step to the total area of the culture surface of the incubator.
  • the human induced pluripotent stem cell culture of the present embodiment can be produced by the method for culturing human induced pluripotent stem cells of the present embodiment.
  • the human artificial pluripotent stem cell culture of the present embodiment produces three or more metabolites selected from the group consisting of the metabolites shown in Table 2 below, and the amount of the metabolites produced is within the range shown in Table 1 below.
  • the metabolites and their production amounts can be confirmed by metabolome analysis.
  • the metabolite candidates shown in Table 2 are hierarchical cluster analysis (Hierarchical Cluster) of the results of metabolite analysis of human induced pluripotent stem cell cultures obtained at low seeding density and pluripotent stem cell cultures of the present embodiment. It can be extracted by Analysis, abbreviated as "HCA").
  • Adenylosuccinic acid, Inosine monophosphate (IMP), and Adenosine monophosphate (AMP), which are related to purine metabolism, are particularly characteristic metabolites in the human induced pluripotent stem cell culture of the present embodiment.
  • a human induced pluripotent stem cell culture in which at least one or more of these three is the yield shown in Table 2 is preferable.
  • the human artificial pluripotent stem cell culture obtained by the above-mentioned method for culturing the human artificial pluripotent stem cell culture is used as a BMP inhibitor and a transforming factor ⁇ (TGF ⁇ ).
  • Step 1 of culturing in a medium containing an inhibitor hereinafter, also referred to as “medium 1” to form a cell aggregate, and using the cell aggregate as a Wnt signal transduction pathway enhancer and an extracellular matrix (hereinafter, “ECM”). It has a step 2 of culturing in a medium containing (also referred to as “medium 2”) and a step 3 of stirring and culturing the culture of the step 2.
  • a cell aggregate having layered germinated neuroepithelial cells is formed in the culture of step 2.
  • brain organoids in which telencephalic markers such as FOXG1 and SIX3 are fully expressed can be formed.
  • the culture in steps 1 and 2 is preferably suspension culture.
  • Suspension culture refers to culturing while maintaining the state in which cultured cells are suspended in the culture solution, and the method of culturing the culture.
  • Suspension culture refers to culture performed under the condition that the cultured cells are not adhered to the culture surface of the incubator.
  • the culture surface is a cell non-adhesive incubator.
  • Incubators with non-adhesive culture surfaces include flasks, tissue culture flasks, culture dishes (dish), tissue culture dishes, multi-dish, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, and chamber slides. , Petri dishes, tubes, trays, culture bags, microcarriers, beads, stack plates, spinner flasks, roller bottles, etc., which have been subjected to cell non-adhesive treatment such as MPC polymer, and those which have been shaped with irregularities. Can be mentioned.
  • Step 1 a human induced pluripotent stem cell culture is cultured in medium 1 to form cell aggregates.
  • a cell aggregate indicates a state in which two or more cells adhere to each other to form an aggregate, and is also referred to as a neurosphere.
  • an incubator having a narrow culture space can be used so that the cultured cells can aggregate with each other.
  • Examples of the incubator having a narrow culture space include a 24-well plate (area is 1.88 cm2 in terms of flat bottom), a 48-well plate (area is 1.0 cm2 in terms of flat bottom), and a 96-well plate (area is 0 in terms of flat bottom).
  • a 3 cm2) V-bottom plate or the like can be mentioned.
  • Medium 1 contains a BMP inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor.
  • Medium 1 is usually prepared by adding a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, or the like to a basal medium.
  • basal medium examples include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glassgow MEM (GMM) medium, Applied MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, and F-12.
  • GMM Glassgow MEM
  • IMDM medium Applied MEM Zinc Option medium
  • IMDM medium Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, and F-12.
  • DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, and Fisher's medium and medium of these mixed media; and medium in which components related to nerve differentiation are reduced from these media, etc.
  • a medium having a reduced component related to neural differentiation is preferable.
  • BMP inhibitor examples include cordin, nogin, follistatin, dolsomorphin, (6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine), DMH1 (4- [6- (4-isopropoxyphenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] quinoline, 4- [6- [4- (1-methylethoxy)] ) Pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] -quinoline), and LDN193189, (4- (6- (4- (piperidine-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] Pyrimidine-3-yl) quinoline) can be mentioned. Among these, dolsomorphine and LDN193189 are preferable.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway inhibitor contained in the medium 1 is preferably 0.5 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, more preferably 0.75 ⁇ M or more and 5 ⁇ M or less, and further preferably 1 ⁇ M or more and 3 ⁇ M or less. preferable.
  • the TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the signal transduction pathway transmitted by the Smad family, and examples of the TGF- ⁇ inhibitor include A83-01 (CAS number: 909910-43-6) and SB-431542 (CAS number: :). 301836-41-9), SB-505124 (CAS number: 694433-59-5), SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364497 (CAS number: 396129-53-6), SD-208 (CAS number: 627536-09-8), SJN2511 (CAS number: 446859-33-2) and the like can be mentioned. Among these, A83-01 and SB-431542 are preferable.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor contained in the medium 1 is preferably 0.5 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, more preferably 0.75 ⁇ M or more and 5 ⁇ M or less, and further preferably 1 ⁇ M or more and 3 ⁇ M or less.
  • Medium 1 can further contain neurobiological supplements, medium supplements, serum, serum substitutes, antibacterial agents, serum-derived proteins such as insulin and albumin, and the like.
  • Neurobiological supplements include biotin, cholesterol, linolenic acid, linolenic acid, progesterone, putresin, retinol, retinyl acetate, sodium selenite, triiodothyronine (T3), DL- ⁇ -tocopherol (vitamin E), albumin.
  • B27 supplements containing insulin and transferase (Thermofisher product name); and N2 supplements containing human transferase, bovine insulin, progesterone, putresin, and sodium selenite.
  • a glutamic acid-containing supplement such as "GlutaMax series” (product name of Thermo Fisher Co., Ltd.) containing L-glutamic acid and a dipeptide obtained from L-glutamic acid, "MEM Non-Essential Amino Acids Solution” (thermo).
  • GlutaMax series product name of Thermo Fisher Co., Ltd.
  • MEM Non-Essential Amino Acids Solution thermo
  • amino acid aqueous solutions such as Fisher's product name
  • 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
  • antibacterial agent examples include penicillin antibiotics, cephem antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, phosphomycin antibiotics, aminoglycoside antibiotics, and new quinolone antibiotics.
  • the culture period is usually 1 day or more, preferably 3 days or more and 14 days or less, and more preferably 4 days or more and 12 days or less.
  • the incubator during culturing is usually at a temperature of 30 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, preferably 32 ° C. or higher and 48 ° C. or lower, and more preferably 34 ° C. or higher and 46 ° C. or lower.
  • the carbon dioxide content in the container is usually 1% by volume or more and 15% by volume or less, preferably 2% by volume or more and 14% by volume or less, and more preferably 3% by volume or more and 13% by volume or less. It is under the atmosphere.
  • a human induced pluripotent stem cell culture can be dispersed before culturing in medium 1.
  • the dispersion treatment method is the same as the dispersion treatment method described in the above two-dimensional culture step.
  • step 2 the cell aggregate obtained in step 1 is cultured in medium 2 to form a cell aggregate having layered germinated neuroepithelial cells (hereinafter, also referred to as “cell aggregate in step 2”). ..
  • the step 2 may be continuously performed by replacing only the medium without removing the cell aggregates of the step 1, or may be performed after removing the cell aggregates of the step 1.
  • the culture period is usually 1 day or more, preferably 3 days or more and 14 days or less, and more preferably 4 days or more and 12 days or less.
  • the temperature inside the container in which the incubator is placed is usually 30 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, preferably 32 ° C. or higher and 48 ° C. or lower, and more preferably 34 ° C. or higher and 46 ° C. or lower.
  • the carbon dioxide content in the container containing the incubator is usually 1% by volume or more and 15% by volume or less, preferably 2% by volume or more and 14% by volume or less, and more preferably 3% by volume or more and 13%.
  • the atmosphere is less than% by volume.
  • Medium 2 is a medium containing a Wnt signaling pathway enhancer and ECM for stem cell proliferation and maintenance of undifferentiated state.
  • Medium 2 is usually prepared by adding a Wnt signaling pathway enhancer, ECM, or the like to the basal medium.
  • basal medium examples include BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, GMEM (thermofisher product name), Immoved MEM Zinc Option medium (thermofisher product name), IMDM medium, Medium 199 (thermofisher product name). , Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, ham medium, ham F-12 medium, and RPMI1640 medium, and a mixture thereof.
  • Wnt signaling pathway enhancer examples include GSK-3 ⁇ inhibitors, Wnt proteins, Wnt agonists and the like. Of these, GSK-3 ⁇ inhibitors and Wnt proteins are preferred.
  • concentration of the Wnt signaling pathway enhancer contained in the medium 2 is usually 0.1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M, and preferably 0.2 ⁇ M or more and 5 ⁇ M or less.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), Kenpaullone (CAS number: 142273-20-9), and 6-Bromodyrubin-3'-oxime (BIO, CAS number: 667463-62). -9) and the like. Among these, CHIR99021 is preferable.
  • the Wnt protein is preferably a mammalian-derived Wnt protein.
  • mammalian Wnt proteins include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, and Wnt16. ..
  • Wnt3a is preferable, and Wnt3a is more preferably a complex with afamin.
  • Examples of the method of culturing in a medium containing ECM include a method of culturing the cell aggregate of step 1 by embedding it in ECM, a method of culturing the cell aggregate of step 1 in a medium mixed with ECM, and the like. Among these, the method of culturing the cell aggregate in step 1 in a medium mixed with ECM is preferable.
  • the volume of ECM is usually 1% by volume or more, preferably 5% by volume or more and 100% by volume or less, more preferably 10% by volume or more, based on the volume of components other than ECM in the medium. It can be prepared by mixing an amount of 90% by volume or less.
  • Examples of the method of mixing ECM include a pipetting method on an ice bath. Miscibility means a state in which ECM is not visually observed in the medium.
  • ECM examples include components contained in the basement membrane and glycoproteins present in the intercellular spaces.
  • the components contained in the basement membrane include type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • As the ECM a commercially available product containing the ECM can be used.
  • the glycoprotein present in the intercellular space include collagen, laminin, entactin, fibronectin, heparin sulfate and the like.
  • Examples of commercially available products containing ECM include Matrigel (Corning's product name) and human laminin (Sigma's product name).
  • Medium 2 preferably further contains a TGF ⁇ inhibitor.
  • TGF ⁇ inhibitor examples include the same as the above-mentioned medium 1.
  • SB-431542 or SC-203294 which can selectively inhibit the kinase activity of ALK5, is preferable.
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor contained in the medium 2 is usually 0.1 or more and 20 ⁇ M or less, and preferably 0.1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
  • Medium 2 can further contain neurobiological supplements, medium supplements, serum-derived proteins such as insulin and albumin, serum, serum substitutes and the like.
  • the details of the neurobiological supplement and the medium supplement include the same as those exemplified in the above-mentioned medium 1.
  • step 3 the cell aggregates of step 2 are matured by stirring culture to form glial cells and form brain organoids.
  • the medium used for stirring culture is referred to as medium 3.
  • step 3 the cell agglomerates of step 2 can be continuously cultured by replacing only the medium from the medium 2 with the medium 3 without taking out the cell agglomerates from the incubator, or the cell agglomerates of the step 2 can be taken out from the incubator and separately cultured. It is also possible to incubate in the medium 3 after transferring to the incubator of.
  • the culture period is usually 1 day or more, preferably 2 days or more and 700 days or less, and more preferably 10 days or more and 365 days or less.
  • the temperature inside the container in which the incubator is placed is usually 30 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, preferably 32 ° C. or higher and 48 ° C. or lower, and more preferably 34 ° C. or higher and 46 ° C. or lower.
  • the carbon dioxide content in the container containing the incubator is usually 1% by volume or more and 15% by volume or less, preferably 2% by volume or more and 14% by volume or less, and more preferably 3% by volume or more and 13%.
  • the atmosphere is less than% by volume.
  • a cell non-adhesive incubator is usually used as the incubator used for stirring culture.
  • Medium 3 usually contains a basal medium.
  • the medium 3 is usually prepared by adding a neurobiological supplement, a medium supplement, a serum-derived protein such as insulin and albumin, and other components such as serum and serum substitute to the basal medium.
  • the basal medium the same as those exemplified in the above-mentioned medium 2 can be mentioned.
  • the medium 3 contains substantially no ECM.
  • substantially free of ECM means that ECM is not intentionally added to the medium 3, and ECM mixed as an unavoidable impurity is acceptable.
  • Medium 3 can further contain at least one selected from the group consisting of neurobiological supplements, medium supplements, serum-derived proteins such as insulin and albumin, serum, and serum substitutes.
  • the details of the neurobiological supplement and the medium supplement include the same as those of the medium 1 described above.
  • the brain organoid produced by the method for producing a brain organoid of the present embodiment preferably contains a telencephalon or a telencephalic part-like tissue.
  • examples of the telencephalic partial-like tissue include the cerebral cortex, the basal ganglia, the hippocampus, and the choroid plexus.
  • it can be morphologically determined whether or not the brain organoid contains the telencephalon and the telencephalic part-like tissue.
  • the expression of a marker gene or marker protein characteristic of each tissue can be measured and determined.
  • telencephalic marker examples include FOXG1, SIX3 and the like.
  • cerebral cortex marker examples include CTIP2, which is a V-layer marker of the cerebral cortex, SATB2, which is a II / III layer marker of the cerebral cortex, and the like.
  • a basal ganglia marker for example, NKX2.1, GSH2 and the like can be mentioned.
  • hippocampal marker examples include KA1, ZBTB2, and the like.
  • a choroid plexus marker for example, TTR, LMX1A and the like can be mentioned.
  • the brain organoid has suppressed expression of OTX2, which is a forebrain and midbrain marker.
  • Cerebral organoids can contain more end-brain or end-brain partial-like tissues by extending the culture period in step 3.
  • the drug efficacy evaluation method includes a step of bringing the above-mentioned brain organoid into contact with a test substance (hereinafter, also referred to as “step A”) and a step of verifying the effect of the test substance on the brain organoid (hereinafter, also referred to as “step B”). And have.
  • examples of the test substance include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
  • Existing drugs include, for example, AZD2858, methylthioninium chloride hydrate and the like.
  • a new drug can be used as the test substance.
  • step B the effect of the test substance on brain organoids can be assayed (evaluated) by Western blotting, ELISA, immunostaining, or the like.
  • step A it is possible to have a step of transplanting a brain organoid into the brain of a mammal (hereinafter, also referred to as "step a").
  • step a a step of transplanting a brain organoid into the brain of a mammal
  • the efficacy of the test substance can be evaluated in an environment closer to the living body suffering from Alzheimer's disease by having the step a.
  • the incubator was a 60 mm dish (Iwaki, for cell culture) coated with a human recombinant laminin fragment (product name "iMatrix-511", manufactured by Nippi) containing only the active site of Laminin-511, and the medium was A medium obtained by adding Y27632 (ROCK inhibitor, concentration in medium: 10 ⁇ M) to a basal medium (StemFit AK02N medium, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used.
  • the medium was replaced with a medium containing only the basal medium (StemFit AK02N medium, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) containing no Y27632. After that, the medium was replaced with a medium containing only the basal medium every day and cultured for 7 days to obtain each human iPS cell culture.
  • a medium containing only the basal medium StemFit AK02N medium, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Example 2 (Formation of cell aggregates with layered germinated neuroepithelial cells)
  • the human iPS cell culture obtained in Experimental Example 1 was treated with a cell dispersion using TripLE Select (trade name of Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), and further dispersed into single cells by a pipetting operation.
  • Dispersed human iPS cells are shown in Table 4 of 100 ⁇ L / well on a 96-well culture plate (product name “Prime Surface 96V bottom plate”, manufactured by Sumitomo Bakelite) so as to have a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells / well. Seeds were collected in medium 1 having a composition and cultured in an incubator (37 ° C., 1 atm, CO2 concentration: 5 v / v%) for 7 days (7 days from the start of human iPS cell culture) to obtain aggregates.
  • Medium 1 was removed, medium 2 having the composition shown in Table 5 was added at an amount of 150 ⁇ L / well, and agglomerates of human iPS cells were added in the incubator (37 ° C., CO 2 concentration: 5 v / v%) for another 7 days (). (14th day from the start of human iPS cell culture) The cells were suspended and cultured with stirring to form cell aggregates.
  • FIG. 1 shows bright-field images taken by an optical microscope on the 7th and 14th days after the start of human iPS cell culture, and morphological evaluation of cell aggregates.
  • the morphological evaluation of the cell agglomerates was performed according to the criteria shown in FIG. 2 using a bright-field image taken with an optical microscope 14 days after the start of human iPS cell culture.
  • Example 3 (Effects of passage number of human iPS cells)
  • neuroepithelial cells were produced by the same operations as in Experimental Example 1 and Experimental Example 2 except that the human iPS cells having the passage number shown in FIG. 4 were used.
  • the bright field image by the optical microscope and the morphological evaluation of the cell aggregate are shown in FIG.
  • FIG. 3 in the human iPS cell culture in which the seeding density was 34.3 ⁇ 10 3 cells / cm 2 regardless of the passage number of human iPS cells, the morphology of cell aggregates was observed. The evaluation was +1 or more, which was good.
  • RNA of brain organoids was extracted using a commercially available kit (product name "RNeasy PlusMini Kit", Qiagen).
  • concentration of total RNA was measured using NanoDrop (the product name of Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.).
  • NanoDrop the product name of Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • total RNA was reverse transcribed with RT Master Mix (product name of Toyobo Co., Ltd.) and Nuclease free water to synthesize cDNA.
  • Premix Ex Taq product name of Takara Bio Inc.
  • ROX Reference Dye II product name of Takara Bio Inc.
  • RT-qPCR analysis of the above reaction solution was performed using a real-time PCR system (product name "ViiA7", Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), and regional markers (final brain: FOXG1, retina: OTX2), cerebral cortex.
  • the expression levels of the neural cell markers (SATB2, CTIP2) and the neural stem cell markers (PAX6) were measured. The measurement results are shown in FIG.
  • the expression level is sample A5 (high seeding density: 34.3 ⁇ 10 3 cells) with the expression level of brain organoids derived from human iPS culture of sample A1 (low seeding density: 1.4 ⁇ 10 3 cells / cm 2 ) as 1. / Cm 2 ) shows the expression level of brain organoids derived from human iPS culture.
  • the FOXG1 expression level is sample A1 (low seeding density: 1.4 ⁇ 10 3 cells / cm 2).
  • OTX2 was low, while it was higher than the brain organoids derived from the human iPS culture of cm 2 ). This suggests that differentiation into the retina is not as advanced as in brain organoids derived from human iPS cultures with low seeding density, and differentiation into the telencephalon is progressing.
  • the expression levels of SATB2 and CTIP2 were higher and the expression levels of PAX6 were lower than those of the brain organoids derived from the human iPS culture having a low seeding density. This suggests that there are more cells differentiated into the cerebral cortex and fewer cells differentiated into neural stem cells than brain organoids derived from human iPS cultures with low seeding density.
  • the expression level of the protein is similar to that of the mRNA, and the brain organoids derived from the human iPS culture having a high seeding density are the brain organoids derived from the human iPS culture having a low seeding density.
  • the expression levels of SATB2 and CTIP2 were high and the expression levels of PAX6 were low.
  • Tables 8-1 to 8-14 show sample names in Experimental Example 5, "30-3-13", “30-3-14”, “30-3-15”, “33-72-16", and Total metabolite data of candidate compounds for metabolome analysis of each human iPS cell culture of "33-72-17” and "33-72-18".
  • Table 9 shows the results of calculating the metabolites having fluctuations in Tables 8-1 to 8-14.
  • ID consists of an acronym for measurement mode and a serial number
  • C indicates a cation mode
  • A indicates an anion mode.
  • ND is an abbreviation for Not Detected, and indicates an analysis target, but below the detection limit.
  • NA is an abbreviation for Not Variable, and indicates a calculation target, but cannot be calculated due to lack of data.
  • the ratio of the detected mean values between the two groups was calculated with the latter as the denominator.
  • Welch's t-test p-value and its range were ** 0.05, ** ⁇ 0.01, *** ⁇ 0.001.
  • the ID consists of an acronym for the measurement mode and a serial number
  • C indicates a cation mode
  • A indicates an anion mode.
  • Compound name” of “HMT DB” is a candidate compound obtained by collating the detection peak m / z and MT with the HMT database.
  • Standardized Relevive Area is a standardized value of Reactive Area of the detection peak, and eps (2-52) was substituted for the ND of the original data in order to calculate the distance.
  • the method for culturing human induced pluripotent stem cells of the present embodiment it is possible to form a human induced pluripotent stem cell culture suitable for forming seedling aggregates having layered germinated neuroepithelial cells.

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Abstract

ヒト人工多能性幹細胞の培養方法は、ヒト人工多能性幹細胞を培養器に対して1.0×10~1.0×10cells/cmの播種密度で培地に採種し、二次元培養する工程を有する。脳オルガノイドの製造方法は、前記ヒト人工多能性幹細胞の培養方法によって得られたヒト人工多能性幹細胞の培養物を、BMP阻害剤、及び形質転換因子β(TGFβ)阻害剤を含有する培地で培養し、細胞凝集塊を形成する工程1と、前記細胞凝集塊を、Wntシグナル伝達経路増強剤、及び細胞外マトリックスを含有する培地で培養する工程2と、前記工程2で得られた培養物を攪拌培養する工程3と、を有する。

Description

ヒト人工多能性幹細胞の培養方法、ヒト人工多能性幹細胞培養物、及び脳オルガノイドの製造方法
 本発明は、ヒト人工多能性幹細胞の培養方法、ヒト人工多能性幹細胞培養物、及び脳オルガノイドの製造方法に関する。
 脳疾患の治療薬や診断薬の開発には、インビトロで形成された脳(脳オルガノイド)の利用が試みられている。例えば、ヒト人工多能性幹細胞の細胞塊を高酸素分圧条件下で培養する方法(特許文献1)や、ヒト人工多能性幹細胞を細胞外マトリックス中で培養する方法(特許文献2)により、脳オルガノイドを得る方法が知られている。
米国特許出願公開第2016/0289635号明細書 米国特許第10407664号明細書
 脳の発生過程において、外胚葉に由来する神経管の閉鎖直後の神経幹細胞は、神経上皮細胞が層状に発芽(budding)になった形態をとっており、その後、非対称分裂により、神経細胞を産生する。つまり、層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊を形成することが脳オルガノイドの形成には必要である。
 ところで、ヒト人工多能性幹細胞は、その細胞株種や継代数の違いによって大きく性質が異なるため、ヒト人工多能性幹細胞から脳オルガノイドを安定的に得るためには、ヒト人工多能性幹細胞の性質を一定にし、脳オルガノイドの製造で、層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊の形成に適した状態にすることが好ましいと考えられる。
 本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、脳オルガノイドの製造で、層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊の形成に適したヒト人工多能性幹細胞の培養方法、ヒト人工多能性幹細胞培養物、及び前記ヒト人工多能性幹細胞培養物を用いた脳オルガノイドの製造方法を提供する。
 すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
(1) ヒト人工多能性幹細胞を培養器に対して1.0×10~1.0×10cells/cmの播種密度で培地に採種し、二次元培養する工程を有する、ヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
(2) 前記二次元培養する工程が、Rhoキナーゼ阻害剤を含有する培地で培養する工程を含む、(1)に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
(3) 前記二次元培養する工程が、Rhoキナーゼ阻害剤を含有しない培地で培養する工程を含む、(1)又は(2)に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
(4) 前記二次元培養する工程の後の、コンフルエンシーが70~100面積%である、(1)~(3)のいずれか一つに記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
(5) 前記培養器が、細胞接着性を向上させる表面加工を施した培養器である、(1)~(4)のいずれか一つに記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
(6) (1)~(5)のいずれか一つに記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法によって得られたヒト人工多能性幹細胞の培養物を、BMP阻害剤、及び形質転換因子β(TGFβ)阻害剤を含有する培地で培養し、細胞凝集塊を形成する工程1と、
 前記細胞凝集塊を、Wntシグナル伝達経路増強剤、及び細胞外マトリックスを含有する培地で培養する工程2と、
 前記工程2で得られた培養物を攪拌培養する工程3と、
を有する、脳オルガノイドの製造方法。
(7) 前記工程3における攪拌培養が、細胞外マトリックスを含まない培地での攪拌培養である、(6)に記載の脳オルガノイドの製造方法。
(8) 下記表1に示す代謝産物からなる群より選ばれる3以上の代謝産物を産生し、前記代謝産物の産生量が下記表1に示す範囲内である、ヒト人工多能性幹細胞培養物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
(9) 前記代謝産物が、Adenylosuccinic acidを含む、(8)に記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
(10) 前記代謝産物が、Inosine monophosphateを含む、(8)又は(9)に記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
(11) 前記代謝産物が、Adenosine monophosphateを含む、(8)~(10)のいずれか一つに記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
 上記態様のヒト人工多能性幹細胞の培養方法によれば、脳オルガノイドの製造で神経上皮細胞の形成に適したヒト人工多能性幹細胞を形成するヒト人工多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。
図1は、実験例2における各細胞凝集塊の明視野観察像及び形態評価を示す  図である。 図2は、実験例2における各細胞凝集塊の形態評価の基準を示す図である。 図3は、実験例3における各細胞凝集塊の明視野観察像及び形態評価を示す  図である。 図4は、実験例4における定量的RT-PCRの結果を示すグラフである。 図5は、実験例4におけるサンプルA1(低播種密度:1.4×103ce  lls/cm2)のヒトiPS培養物の免疫染色像を示す図である。 図6は、実験例4におけるサンプルA5(高播種密度:34.3×103c  ells/cm2)のヒトiPS培養物の免疫染色像を示す図である。 図7Aは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Bは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Cは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Dは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Eは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Fは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。 図7Gは、実験例5におけるメタボローム解析のHCAによるHeatM  apである。
 以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
 本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ1種単独で用いることができ、又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
 本明細書で、「A~B」等の数値範囲を表す表記は、「A以上、B以下」と同義であり、A及びBをその数値範囲に含むものとする。
 本明細書において、「物質Xを含む培地」、「物質Xの存在下」とは、外来性(exogenous)の物質Xが添加された培地、外来性の物質Xを含む培地、又は外来性の物質Xの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Xを内在的(endogenous)に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Xは外来性の物質Xとは区別され、外来性の物質Xを含んでいない培地は内在的な物質Xを含んでいても「物質Xを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
<ヒト人工多能性幹細胞の培養方法>
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC:human induced pluripotent stem cellの培養方法は、ヒト人工多能性幹細胞を培養用容器(以下、「培養器」ともいう)に対して1.0×10~1.0×10cells/cmの播種密度で培地に採種し、二次元培養する工程を有する。
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞の培養方法では、後述する実施例に示すように、ヒト人工多能性幹細胞の播種密度が上記範囲内であることで、脳オルガノイドの製造で神経上皮細胞の形成に適したヒト人工多能性幹細胞培養物を製造することができる。
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞の培養方法では、ヒト人工多能性幹細胞の二次元培養において、細胞間情報伝達が重要であることを示唆するものである。
 ヒト人工多能性幹細胞の播種密度が上記下限値未満であると、ヒト人工多能性幹細胞が増殖するまで、ヒト人工多能性幹細胞間の距離が離れており、細胞間情報伝達が十分に行えないと推定される。また、ヒト人工多能性幹細胞の播種密度が上記下限値未満であると、ヒト人工多能性幹細胞が増殖する過程で、各ヒト人工多能性幹細胞間の距離にばらつきが生じ、その結果、細胞間伝達物質の濃度等に局在が生じ、均一に細胞間情報伝達が行えないと推定される。
 一方、ヒト人工多能性幹細胞の播種密度が上記上限値超であると、コンフルエントまでの時間が短くなり、細胞間情報伝達が十分に行えないと推定される。
 つまり、ヒト人工多能性幹細胞の播種密度が上記範囲内であることで、細胞間情報伝達が十分に行え、細胞間伝達物質の濃度の局在化を防ぎ、その結果、脳オルガノイドの製造で神経上皮細胞の形成に適したヒト人工多能性幹細胞培養物を製造することができるものと推定される。
 遺伝子改変されたヒト人工多能性幹細胞もヒト人工多能性幹細胞に包含される。遺伝子改変されたヒト人工多能性幹細胞は、人工ヌクレアーゼである、ZFN、TALEN、又はCRISPRをヒト人工多能性幹細胞にトランスフェクションすることにより、作製することができる。人工ヌクレアーゼは、標的遺伝子に二本鎖DNA切断(DSB:double strand break)を導入し、DSB修復機構の一つである非相同末端結合(NHEJ:non-homologous end joining)により挿入欠失変異を導入することができる。
 ヒト人工多能性幹細胞は、体細胞を、公知の方法等により初期化(reprogramming)することにより、多能性を誘導した細胞を意味する。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球あるいはリンパ球等の分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。
 ヒト人工多能性幹細胞の継代数は、通常、1~100回であり、5~80回が好ましく、10~40回がより好ましい。継代数が上記範囲内であるヒト人工多能性幹細胞を用いることで、脳オルガノイドの製造で神経上皮細胞の形成により適したヒト人工多能性幹細胞培養物を製造することができる。
 二次元培養とは、細胞と培養器の培養面、又は表面加工により培養面に形成した細胞外マトリックスと接着した状態で、二次元的に培養する培養方法である。
 本実施形態の二次元培養は、ヒト人工多能性幹細胞を増殖させるため、二次元培養を、拡大培養ということもできる。
 二次元培養において、ヒト人工多能性幹細胞の培地への播種密度は、1.0×10~1.0×10cells/cmであり、2.0×10~9.0×10cells/cmが好ましく、3.0×10~8.0×10cells/cmがより好ましい。多能性幹細胞の播種密度が上記範囲内であることで、脳オルガノイドの製造で神経上皮細胞の形成に適したヒト人工多能性幹細胞培養物を製造することができる。
 播種密度は、播種する細胞数(単位:cells)を培養器の培養面の面積(cm)で除することで算出することができる。
 培養器としては、培養面が細胞接着性を向上させるための表面加工を施した培養器であることが好ましい。接着性を向上させるための表面加工としては、例えば、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα1β1γ1、ラミニン511E8等のラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン(Vitronectin)、ポリリジン、及びポリオルニチン等の細胞外マトリックスのコーティング処理、並びに正電荷処理が挙げられる。
 培養器の形態としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、スタックプレート、スピナーフラスコ等が挙げられる。
 二次元培養において用いられる培地(以下、「拡大培養培地」ともいう)としては、フィーダーフリーの培地が好ましい。フィーダーフリーの培地としては、例えば、hES9培地、hES9a培地、及びhESF-FX培地等の公知の培地、並びに、TeSR-E8(STEMCELL Technologyes社製品名)、StemFit(登録商標)等の市販品等が挙げられる。
 拡大培養培地には、ヒト人工多能性幹細胞の、分化能の維持、増殖能の向上、および細胞死の抑制のため、前記フィーダーフリーの培地で培養する前に、前記フィーダーフリー培地にRhoキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)を含有する培地で培養することができる。すなわち、二次元培養は、ROCK阻害剤を含有する培地で培養する工程を含むことができる。フィーダーフリー培地にROCK阻害剤を添加した培地を用いた場合、その培養期間は、多くとも5日間でよく、その後、ROCK阻害剤を含まないフィーダーフリー培地にて、通常1日間以上、好ましくは3日以上、培養する。すなわち、二次元培養は、さらに、ROCK阻害剤を含有しない培地で培養する工程を含むことができる。
 二次元培養は、ROCK阻害剤を含有する培地で培養する工程と、ROCK阻害剤を含有しない培地で培養する工程と、をこの順で含むことが好ましい。
 ROCK阻害剤としては、例えば、Y-27632(CAS番号:129830-38-2)、Fasudil/HA1077(CAS番号:105628-07-7)、H-1152(CAS番号:871543-07-6)、及びWf-536(CAS番号:539857-64-2)、並びにこれらの誘導体が挙げられる。
 ROCK阻害剤を含有する培地に含まれるROCK阻害剤の濃度は、通常、0.1μM以上100μM以下となる量であり、1μM以上80μM以下となる量であることが好ましく、5μM以上50μM以下となる量であることがより好ましい。
 培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の温度が、通常、30℃以上50℃以下、好ましくは32℃以上48℃以下、より好ましくは34℃以上46℃以下の温度下である。培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の二酸化炭素含有割合が、通常、1体積%以上15体積%以下、好ましくは2体積%以上14体積%以下、より好ましくは3体積%以上13体積%以下の雰囲気下である。
 二次元培養を行う前に、ヒト人工多能性幹細胞を分散することができる。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、100個以下の細胞集団、好ましくは50個以下の細胞集団、より好ましくは単一細胞に分離させることをいう。分処処理としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、及び細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理は組み合わせることができる。これらの中でも、細胞分散液処理が好ましい。
 細胞分散液処理に用いる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、及びパパイン等の酵素類;並びにエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤;のいずれかを含む溶液等が挙げられる。市販の細胞分散液としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のTrypLE Select、TrypLE Expressが挙げられる。機械的分散処理としては、ピペッティング処理及びスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。分散処理は、細胞分散液処理と機械的分散処理を組み合わせて行うことができる。
 ヒト人工多能性幹細胞を分散する前に、細胞死を防ぐために、細胞保護剤で処理することができる。細胞保護剤としては、例えば、線維芽細胞増殖因子(Fibroblast growth factor、以下、「FGF」ともいう)、ヘパリン、ROCK阻害剤、インスリン様成長因子(Insulin-like growth factor、以下「IGF」ともいう)、血清、及び血清代替物が挙げられる。
 二次元培養の後のコンフルエンシー(細胞占有面積)は70~100面積%であることが好ましく、75~100面積%であることがより好ましく、80~100面積%であることがさらに好ましい。コンフルエンシーが上記範囲内であることで、性質がより均一な細胞培養物を得ることができる。
 なお、ここでいるコンフルエンシーは、培養器の培養面の総面積に対する、二次元培養工程の後のヒト人工多能性幹細胞培養物の占有面積の割合の百分率である。
<ヒト人工多能性幹細胞培養物>
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞培養物は、本実施形態のヒト人工多能性幹細胞の培養方法によって製造することができる。
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞培養物は、下記表2に示す代謝産物からなる群より選ばれる3以上の代謝産物を産生し、前記代謝産物の産生量が下記表1に示す範囲内である、代謝産物及びその産生量はメタボローム解析により確認することができる。表2に示す代謝産物候補は、低播種密度で得られたヒト人工多能性幹細胞培養物と、本実施形態の多能性幹細胞培養物のメタボローム解析の結果を、階層的クラスタ分析(Hierarchical Cluster Analysis、略して「HCA」)によって抽出することができる。
 表2に示す代謝産物の中でも、プリン代謝に関係する、Adenylosuccinic acid、Inosine monophosphate(IMP)、及びAdenosine monophosphate(AMP)が本実施形態のヒト人工多能性幹細胞培養物において特に特徴的な代謝産物であり、これら3つのうち少なくとも1つ以上が、表2に示す産出量であるヒト人工多能性幹細胞培養物が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
<脳オルガノイドの製造方法>
 本実施形態の脳オルガノイドの製造方法は、上述したヒト人工多能性幹細胞培養物の培養方法によって得られたヒト人工多能性幹細胞培養物を、BMP阻害剤、及び形質転換因子β(TGFβ)阻害剤を含有する培地(以下、「培地1ともいう」で培養し、細胞凝集塊を形成させる工程1と、細胞凝集塊を、Wntシグナル伝達経路増強剤、及び細胞外マトリックス(以下、「ECM」ともいう)を含有する培地(以下、「培地2」ともいう)で培養する工程2と、前記工程2の培養物を攪拌培養する工程3と、を有する。
 本実施形態の脳オルガノイドの製造方法によれば、工程2で、工程2の培養物は、層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊が形成される。また、FOXG1、SIX3等の終脳マーカーが十分に発現した脳オルガノイドを形成することができる。
 工程1及び工程2における培養は、浮遊培養であることが好ましい。
 浮遊培養とは、培養細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法をいう。浮遊培養は、培養細胞を培養器の培養面に接着させない条件で行われる培養をいう。
 浮遊培養に用いる培養器としては、培養面が細胞非接着性の培養器であることが好ましい。培養面が細胞非接着性の培養器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ、及びローラーボトル等の表面を、MPCポリマー等の細胞非接着性処理がなされたもの、及び凹凸で形状加工したものが挙げられる。
[工程1]
 工程1では、ヒト人工多能性幹細胞培養物を、培地1で培養し、細胞凝集塊を形成する。細胞凝集塊とは、2個以上の細胞が接着して凝集塊を形成している状態を示し、ニューロスフィアともいう。
 培地1での培養に用いる培養器は、培養した細胞同士が凝集できるように、培養空間が狭い培養器を用いることができる。培養空間が狭い培養器としては、例えば、24ウェルプレート(面積が平底換算で1.88cm2)、48ウェルプレート(面積が平底換算で1.0cm2)、96ウェルプレート(面積が平底換算で0.3cm2)のV底プレート等が挙げられる。
 培地1は、BMP阻害剤、及びTGFβ阻害剤を含有する。培地1は、通常、基礎培地に、BMP阻害剤、及びTGFβ阻害剤等を添加して調製する。
 基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM(GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、及びFischer’s培地;並びにこれらの混合培地の培地;並びにこららの培地から神経分化に関する成分を低減した培地、等が挙げられる。これらの中でも神経分化に関する成分を低減した培地が好ましい。
 BMP阻害剤としては、例えば、コーディン、ノギン、フォリスタチン、ドルソモルフィン、(6-[4-(2-ピペリジン-1-イル-エトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イル-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン)、DMH1(4-[6-(4-イソプロポキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン、4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、及びLDN193189、(4-(6-(4-(ピペリジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)が挙げられる。これらの中でも、ドルソモルフィン、及びLDN193189が好ましい。
 培地1中に含まれるBMPシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、0.5μM以上10μM以下であることが好ましく、0.75μM以上5μM以下であることがより好ましく、1μM以上3μM以下であることがさらに好ましい。
 TGFβ阻害剤は、Smadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質であり、TGF-β阻害剤としては、A83-01(CAS番号:909910-43-6)、SB-431542(CAS番号:301836-41-9)、SB-505124(CAS番号:694433-59-5)、SB-525334(CAS番号:356559-20-1)、LY364947(CAS番号:396129-53-6)、SD-208(CAS番号:627536-09-8)、及びSJN2511(CAS番号:446859-33-2)等が挙げられる。これらの中でも、A83-01、及びSB-431542が好ましい。
 培地1中に含まれるTGFβ阻害剤の濃度は、0.5μM以上10μM以下であることが好ましく、0.75μM以上5μM以下であることがより好ましく、1μM以上3μM以下であることがさらに好ましい。
 培地1は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、血清、血清代替物、抗菌剤、並びにインスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質等を含有することができる。
 神経生物系サプリメントとしては、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン(T3)、DL-α-トコフェロール(ビタミンE)、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリンを含むB27サプリメント(サーモフィッシャー社製品名);並びにヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸ナトリウムを含むN2サプリメント等が挙げられる。
 培地サプリメントとしては、例えば、L-グルタミン酸、及びL-グルタミン酸から得たジペプチドを含有する「GlutaMaxシリーズ」(サーモフィッシャー社製品名)等のグルタミン酸含有サプリメント、「MEM Non-Essential Amino Acids Solution」(サーモフィッシャー社製品名)等のアミノ酸水溶液、並びに2-メルカプトエタノールが挙げられる。
 抗菌剤としては、例えば、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ニューキノロン系抗生物質が挙げられる。
 培養期間は、通常、1日間以上であり、3日間以上14日間以下であることが好ましく、4日間以上12日間以下であることがより好ましい。
 培養中の培養器は、通常、30℃以上50℃以下、好ましくは32℃以上48℃以下、より好ましくは34℃以上46℃以下の温度下である。培養中の培養器は、容器内の二酸化炭素含有割合が、通常、1体積%以上15体積%以下、好ましくは2体積%以上14体積%以下、より好ましくは3体積%以上13体積%以下の雰囲気下である。
 培地1で培養を行う前に、ヒト人工多能性幹細胞培養物を分散することができる。分散の処理方法については、上記二次元培養工程で記載した分散の処理方法と同じである。
[工程2]
 工程2では、工程1で得られた細胞凝集塊を、培地2で培養し、層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊(以下、「工程2の細胞凝集塊」ともいう)を形成する。
 工程2は、工程1の細胞凝集塊を取り出さずに培地だけを入れ替えて連続して行うことも、工程1の細胞凝集塊を取り出してから行うこともできる。
 培養期間は、通常、1日間以上であり、3日間以上14日間以下であることが好ましく、4日間以上12日間以下であることがより好ましい。
 培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の温度が、通常、30℃以上50℃以下、好ましくは32℃以上48℃以下、より好ましくは34℃以上46℃以下の温度下である。培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の二酸化炭素含有割合が、通常、1体積%以上15体積%以下、好ましくは2体積%以上14体積%以下、より好ましくは3体積%以上13体積%以下の雰囲気下である。
 培地2は、幹細胞の増殖や未分化性の維持に関する、Wntシグナル伝達経路増強剤、及びECMが含有する培地である。培地2は、通常、基礎培地に、Wntシグナル伝達経路増強剤、及びECM等を添加して調製する。
 基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、GMEM(サーモフィッシャー社製品名)、Improved MEM Zinc Option培地(サーモフィッシャー社製品名)、IMDM培地、Medium 199(サーモフィッシャー社製品名)、イーグルMEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、ハムF-12培地、及びRPMI1640培地、並びにこれらを混合した培地が挙げられる。
 Wntシグナル伝達経路増強剤としては、GSK-3β阻害剤、Wntタンパク質、Wntアゴニスト等が挙げられる。これらの中でもGSK-3β阻害剤及びWntタンパク質が好ましい。培地2中に含まれるWntシグナル伝達経路増強剤の濃度は、通常、0.1μM以上10μMであり、0.2μM以上5μM以下であることが好ましい。
 GSK-3β阻害剤としては、CHIR99021(CAS番号:252917-06-9)、Kenpaullone(CAS番号:142273-20-9)、及び6-Bromoindirubin-3’-oxime(BIO、CAS番号:667463-62-9)等が挙げられる。これらの中でも、CHIR99021が好ましい。
 Wntタンパク質としては、哺乳動物由来のWntタンパク質であることが好ましい。哺乳動物のWntタンパク質としては、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及びWnt16等が挙げられる。これらの中でもWnt3aが好ましく、Wnt3aはアファミンとの複合体であることがより好ましい。
 ECMを含む培地で培養する方法としては、工程1の細胞凝集塊をECMに包埋して培養する方法、工程1の細胞凝集塊をECMが混和した培地で培養する方法等が挙げられる。これらの中でも、工程1の細胞凝集塊をECMが混和した培地で培養する方法が好ましい。
 ECMが混和した培地は、培地中のECM以外の成分の体積に対して、ECMの体積が、通常、1体積%以上、好ましくは5体積%以上100体積%以下、より好ましくは10体積%以上90体積%以下となる量を混ぜ合わせて調製することができる。ECMを混和させる方法としては、氷浴上でピペッティング方法が挙げられる。混和とは、目視で培地中にECMが観察されない状態を意味する。
 ECMとしては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等が挙げられる。ECMとしては、ECMを含む市販品を用いることができる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。ECMを含む市販品としては、例えば、マトリゲル(コーニング社製品名)、ヒト型ラミニン(シグマ社製品名)等が挙げられる。
 培地2は、TGFβ阻害剤を更に含有することが好ましい。TGFβ阻害剤としては、上述の培地1と同様のものが挙げられる。これらの中でも、ALK5のキナーゼ活性を選択的に阻害することができるSB-431542、又はSC-203294が好ましい。培地2中に含まれるTGF-β阻害剤の濃度は、通常、0.1以上20μM以下であり、0.1μM以上10μM以下であることが好ましい。
 培地2は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、血清代替物等を含有することができる。神経生物系サプリメント、及び培地サプリメントの詳細については、上述の培地1に例示したものと同じものが挙げられる。
[工程3]
 工程3では、工程2の細胞凝集塊を攪拌培養により成熟させてグリア細胞を形成させ、脳オルガノイドを形成する。ここで攪拌培養に用いる培地を培地3とする。
 工程3は、工程2の細胞凝集塊を培養器から取り出さずに培地だけを培地2から培地3に入れ替えて連続して培養することも、工程2の細胞凝集塊を培養器から取り出して、別の培養器に移してから培地3で培養することもできる。
 培養期間は、通常、1日間以上であり、2日間以上700日間以下であることが好ましく、10日間以上365日間以下であることがより好ましい。培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の温度が、通常、30℃以上50℃以下、好ましくは32℃以上48℃以下、より好ましくは34℃以上46℃以下の温度下である。培養中の培養器は、培養器を入れる容器内の二酸化炭素含有割合が、通常、1体積%以上15体積%以下、好ましくは2体積%以上14体積%以下、より好ましくは3体積%以上13体積%以下の雰囲気下である。
 攪拌培養に用いる培養器としては、通常、細胞非接着性の培養器を用いる。
 培地3は、通常、基礎培地を含有する。また、培地3は、通常、基礎培地に、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、血清代替物等のその他成分を添加して調製する。基礎培地については、上述の培地2において例示したものと同様のものが挙げられる。
 培地3は、ECMを実質的に含有しないことが好ましい。「ECMを実質的に含有しない」とは、培地3にECMを意図的に添加しないことを意味し、不可避不純物として混入するECMは許容される。
 培地3は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、及び血清代替物からなる群より選ばれる少なくとも1種を含有することができる。神経生物系サプリメント、及び培地サプリメントの詳細については、上述の培地1と同様のものが挙げられる。
 本実施形態の脳オルガノイドの製造方法により製造される脳オルガノイドは、終脳又は終脳部分様組織を含むことが好ましい。ここで、終脳部分様組織としては、大脳皮質、大脳基底核、海馬、脈絡叢等が挙げられる。ここで、脳オルガノイドが、終脳、終脳部分様組織を含むか否かは、形態的に判断することができる。あるいは、各組織に特徴的なマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現を測定して判断することもできる。
 終脳マーカーとしては、例えば、FOXG1、SIX3等が挙げられる。また、大脳皮質マーカーとしては、例えば、大脳皮質の第V層マーカーであるCTIP2、大脳皮質の第II/III層マーカーであるSATB2等が挙げられる。また、大脳基底核マーカーとしては、例えば、NKX2.1、GSH2等が挙げられる。また、海馬マーカーとしては、例えば、KA1、ZBTB2等が挙げられる。また、脈絡叢マーカーとしては、例えば、TTR、LMX1A等が挙げられる。
 脳オルガノイドは、前脳及び中脳マーカーであるOTX2の発現が抑制されていることが好ましい。
 脳オルガノイドは、工程3の培養期間を延ばすことで、より終脳又は終脳部分様組織をより多く含むことができる。
<薬効評価方法>
 薬効評価方法は、上述した脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程(以下、「工程A」ともいう)と、被験物質が脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程(以下、「工程B」ともいう)と、を有する。
 工程Aにおいて、被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。既存薬には、例えばAZD2858、メチルチオニニウム塩化物水和物等が含まれる。また、被験物質としては、新薬を用いることができる。
 工程Bにおいて、被験物質が脳オルガノイドに及ぼす影響は、ウエスタンブロッティング、ELISA、免疫染色等により検定(評価)することができる。
 さらに、工程Aの前に、脳オルガノイドを哺乳動物の脳に移植する工程(以下、「工程a」ともいう)を有することができる。脳オルガノイドがアルツハイマー病様の病態を呈する場合に、工程aを有することで、よりアルツハイマー病を罹患した生体に近い環境で被験物質の薬効を評価することができる。
 以下、本実施形態を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
[実験例1]
(ヒトiPS細胞の培養)
 ヒトiPS細胞(PChiPS771株、Lot.A01QM28、リプロセル社製)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて洗浄後、TrypLE Select(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて単一細胞に分散した。分散したヒトiPS細胞を、表3に示す播種密度で培地に播種し、培養器をインキュベーター内(37℃、1atm、CO濃度:5v/v%)に入れて培養した。
 培養器は、ラミニン-511の活性部位のみを含むヒト組換え型ラミニンフラグメント(製品名「iMatrix-511」、ニッピ社製)をコートした60mmディッシュ(イワキ社製、細胞培養用)、培地は、基礎培地(StemFit AK02N培地、味の素社製)にY27632(ROCK阻害剤、培地中濃度:10μM)を加えた培地を用いた。
 培養開始から1日後に、Y27632を含まない基礎培地(StemFit AK02N培地、味の素社製)のみの培地に培地を交換した。以降、1日毎に基礎培地のみの培地に培地を交換し7日間培養して、各ヒトiPS細胞培養物を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
[実験例2]
(層状に発芽した神経上皮細胞を有する細胞凝集塊の形成)
 実験例1で得られたヒトiPS細胞培養物を、TrypLE Select(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名)を用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作により単一細胞に分散した。分散されたヒトiPS細胞を96穴培養プレート(製品名「PrimeSurface 96V底プレート」、住友ベークライト社製)に、1×10cells/ウェルの細胞密度となるように100μL/ウェルの表4に示す組成の培地1に採種し、インキュベーター内(37℃、1atm、CO2濃度:5v/v%)で7日間(ヒトiPS細胞培養開始から7日目)培養し、凝集塊を得た。
 培地1を取り除き、表5に示す組成の培地2を150μL/ウェルの量で添加し、ヒトiPS細胞の凝集塊をインキュベーター内(37℃、CO濃度:5v/v%)でさらに7日間(ヒトiPS細胞培養開始から14日目)攪拌しながら浮遊培養し細胞凝集塊を形成した。
 ヒトiPS細胞培養開始から7日目、及び14日目の光学顕微鏡による明視野画像と、細胞凝集塊の形態評価を図1に示す。
 なお、細胞凝集塊の形態評価は、ヒトiPS細胞培養開始から14日目の光学顕微鏡による明視野画像により、図2に示す基準にて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 図1から、播種密度が17.1×10cells/cm及び34.3×10cells/cmであったヒトiPS細胞培養物では、細胞凝集塊の形態評価が+1以上であり、良好であった。
[実験例3]
(ヒトiPS細胞の継代数の影響について)
 実験例1において、図4に示す継代数のヒトiPS細胞を用いた以外は実験例1及び実験例2と同様の操作にて、神経上皮細胞を製造した。その光学顕微鏡による明視野画像と、細胞凝集塊の形態評価を図3に示す。
 図3に示すように、いずれの継代数のヒトiPS細胞を用いた場合においても、播種密度が34.3×10cells/cmであったヒトiPS細胞培養物では、細胞凝集塊の形態評価が+1以上であり、良好であった。
[実験例4]
(RT-qPCRによる脳オルガノイドの製造及びその発現遺伝子の測定)
 実験例1で得られたサンプルA1(低播種密度:1.4×10cells/cm)及びサンプルA5(高播種密度:34.3×10cells/cm)のヒトiPS培養物を、実験例2と同様の操作にて、細胞凝集塊を形成した。
 続いて、ウェルの内容物を10mLのPBSが入ったFalconTMコニカルチューブ50mL(コーニング社製)に移した。続いて、5回転倒混和し、上清を除去することにより、培地2を除去し、細胞凝集塊を回収した。回収した細胞凝集塊30個、及び30mLの表6に示す組成の培地3をシングルユースバイオリアクター(ABLE社)に加え、攪拌しながら浮遊培養して、脳オルガノイドを製造した。培地は4日おきに交換した。
 脳オルガノイドの全RNAを、市販のキット(製品名「RNeasy PlusMiniキット」、キアゲン社)を用いて抽出した。また、NanoDrop(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名)を用いて全RNAの濃度を測定した。続いて、全RNAを、RT Master Mix(東洋紡社製品名)とNuclease free waterにより逆転写して、cDNAを合成した。
 上記cDNAに、Premix Ex Taq(タカラバイオ社製品名)、ROX Reference Dye II(タカラバイオ社製品名)を加え、反応溶液を調製した。続いて、リアルタイムPCRシステム(製品名「ViiA7」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて上記反応溶液のRT-qPCR解析を行い、領域性マーカー(終脳:FOXG1、網膜:OTX2)、大脳皮質の神経細胞マーカー(SATB2、CTIP2)、及び神経幹細胞マーカー(PAX6)の発現量を測定した。測定結果を図4((A):FOXG1、(B):OTX2、(C):SATB2、(D):CTIP2、(E):PAX6)に示す。発現量はサンプルA1(低播種密度:1.4×10cells/cm)のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの発現量を1としてサンプルA5(高播種密度:34.3×10cells/cm)のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの発現量を示す。
 サンプルA5(高播種密度:34.3×10cells/cm)のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの場合、FOXG1発現量が、サンプルA1(低播種密度:1.4×10cells/cm)のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドに比べ高い一方で、OTX2は低かった。このことから、網膜への分化は低播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドに比べ進んでおらず、終脳への分化が進んでいることが示唆された。また、高播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドでは、低播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドに比べて、SATB2及びCTIP2の発現量が高く、PAX6の発現量が少なかった。このことから、低播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドに比べ大脳皮質に分化した細胞が多く、神経幹細胞に分化した細胞が少ないことが示唆された。
 さらに、サンプルA1(低播種密度:1.4×10cells/cm)及びサンプルA5(高播種密度:34.3×10cells/cm)のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの切片の蛍光免疫染色により、SATB2、CTIP2、及びPAX6のタンパク質の発現について確認した(図5:低播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの蛍光免疫染色像、図6:高播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドの蛍光免疫染色像、参照)。
 図5及び図6に示すように、タンパク質の発現量もmRNAの発現量と同様に、高播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドでは、低播種密度のヒトiPS培養物由来の脳オルガノイドに比べて、SATB2及びCTIP2の発現量が高く、PAX6の発現量が少ないことが確かめられた。
[実験例5]
(メタボローム解析による多能性幹細胞培養物の代謝産物の測定)
 下記表7に示す継代数及び播種密度で播種した以外は実験例1と同様の操作にて、試料名「30-3-13」、「30-3-14」、「30-3-15」、「33-72-16」、「33-72-17」、及び「33-72-18」の各ヒトiPS細胞培養物を準備した。
 各ヒトiPS細胞培養物のメタボローム解析を行い、代謝産物量(表8-1~表8-14及び表9)、HCAによるHeatMapの作成(図7A~図7G)を行った。表8-1~表8-14は、実験例5における試料名、「30-3-13」、「30-3-14」、「30-3-15」、「33-72-16」、「33-72-17」、及び「33-72-18」の各ヒトiPS細胞培養物のメタボローム解析に候補化合物の全代謝産物データである。表9は、表8-1~表8-14において変動がある代謝産物を算出した結果である。表8-1~表8-14及び表9において、IDは測定モードの頭文字と通し番号からなり、Cはカチオンモード、Aはアニオンモードを示す。「N.D.」は、Not Detectedの略であり、解析対象であるが、検出限界以下であったものを示す。「N.A.」は、Not Availableの略であり、計算対象であるが、データ不足のため計算不可であったものを示す。2群間の検出平均値の比は、後者を分母として算出した。Welchのt-検定のp-valueとその範囲は、*<0.05、**<0.01、***<0.001であった。また、図7A~図7Gにおいて、IDは測定モードの頭文字と通し番号からなり、Cはカチオンモード、Aはアニオンモードを示す。「HMT DB」の「Compound name」は、検出ピークのm/zとMTからHMTデータベースに照合し得られた候補化合物である。「Standardized Relative Area」は、検出ピークのRelative areaを標準化した値であり、距離の算出を行うため、オリジナルデータのNDにはeps(2-52)を代用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 各ヒトiPS細胞培養物では、表9に示すような各種代謝産物を産生していることが確かめられた。
 本実施形態のヒト人工多能性幹細胞の培養方法によれば、層状に発芽した神経上皮細胞を有する採苗凝集塊の形成に適したヒト人工多能性幹細胞培養物を形成することができる。

Claims (11)

  1.  ヒト人工多能性幹細胞を培養器に対して1.0×10~1.0×10cells/cmの播種密度で培地に採種し、二次元培養する工程を有する、ヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
  2.  前記二次元培養する工程が、Rhoキナーゼ阻害剤を含有する培地で培養する工程を含む、請求項1に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
  3.  前記二次元培養する工程が、Rhoキナーゼ阻害剤を含有しない培地で培養する工程を含む、請求項1又は2に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
  4.  前記二次元培養する工程の後の、コンフルエンシーが70~100面積%である、請求項1~3のいずれか一項に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
  5.  前記培養器が、細胞接着性を向上させる表面加工を施した培養器である、請求項1~4のいずれか一項に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法。
  6.  請求項1~5のいずれか一項に記載のヒト人工多能性幹細胞の培養方法によって得られたヒト人工多能性幹細胞の培養物を、BMP阻害剤、及び形質転換因子β(TGFβ)阻害剤を含有する培地で培養し、細胞凝集塊を形成する工程1と、
     前記細胞凝集塊を、Wntシグナル伝達経路増強剤、及び細胞外マトリックスを含有する培地で培養する工程2と、
     前記工程2で得られた培養物を攪拌培養する工程3と、
    を有する、脳オルガノイドの製造方法。
  7.  前記工程3における攪拌培養が、細胞外マトリックスを含まない培地での攪拌培養である、請求項6に記載の脳オルガノイドの製造方法。
  8.  下記表1に示す代謝産物からなる群より選ばれる3以上の代謝産物を産生し、前記代謝産物の産生量が下記表1に示す範囲内である、ヒト人工多能性幹細胞培養物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  9.  前記代謝産物が、Adenylosuccinic acidを含む、請求項8に記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
  10.  前記代謝産物が、Inosine monophosphateを含む、請求項8又は9に記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
  11.  前記代謝産物が、Adenosine monophosphateを含む、請求項8~10のいずれか一項に記載のヒト人工多能性幹細胞培養物。
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