JP2024503454A - 胚盤胞様細胞凝集物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）および栄養膜細胞の凝集物をＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む、細胞の凝集および培養によって芽球様細胞または胚盤胞様構造を生成する方法；上記方法およびその使用によって得られる芽球様細胞および胚盤胞様細胞凝集物；同様に、胚盤胞の発育および着床を促進する体外受精のための胚盤胞の同様の治療；同様に、胚盤胞の発育および着床を減少させるヒト胚の同様の避妊治療を提供する。

Description

本発明は、細胞の凝集および培養による胚盤胞様構造の生成に関する。

研究されたヒト胚の数が少ないこと、およびそれらを物理的および遺伝的に実験的に操作することが困難であるため、ヒトの初期胚の発生および着床に関する理解は非常に限られている。これらの初期発生および着床メカニズムを研究するために、他の実験モデル生物、通常はマウスが使用されている。しかし現在では、形態学および関与する分子の点でヒトと他の種との間に重要な違いがあることが明らかになっており、ヒトの胚発生の研究が必要となっている。

欧州特許出願第ＥＰ２９８６７１１Ａ１号は、少なくとも１つの栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）および少なくとも一つの多能性細胞を使用する芽球様細胞の生成に関する。

国際公開第２０１８／１７５６９１ Ａｌ号は、全能性細胞の生成に関するものである。

国際公開第２０２０／２６２５３１ Ａｌ号は、胚盤胞を培養することによって原始内胚葉幹細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を生成することを記載している。

ＲＯＮＧＨＵＩ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｖｏｌ．１７９（３），２０１９：６８７は、単一の幹細胞型からの胚盤胞様構造の生成を記載している。

ＲＩＶＲＯＮ Ｎｉｃｏｌａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｊｏｕｒｎ． Ｌｔｄ．， Ｖｏｌ．５５７（７７０３）， ２０１８： １０６－１１１は、栄養膜細胞および胚性幹細胞からの胎生期３．５日目の胚盤胞の生成を記載している。

ＶＲＩＪ Ｅｒｉｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ｂｉｏＲｘｉｖ， ＤＯＩ：１０．１１０１／５１０３９６は、胚様体を迅速に誘導して三次元の原始内胚葉／エピブラスト様のニッチを形成するための、タンパク質、ＧＰＣＲリガンド、および小分子の組み合わせスクリーニングについて記載している。

ＫＩＭＥ Ｃｏｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １３（３），２０１９：４８５－４９８は、マウス多能性幹細胞培養物から生成された誘導自己組織化３Ｄ胚盤胞様シスト（ｉＢＬＣ）について記載している。

要するに、研究のためのヒト胚の使用に代わるインビトロの代替手段に対する切実な必要性が依然として存在する。広く利用可能であり、簡単な遺伝子操作およびハイスループットの薬物スクリーニングに適したモデルが必要である。

したがって、本発明の目的は、そのようなモデルを提供することである。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）および栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む、芽球様細胞または胚盤胞様細胞凝集物を生成する方法を提供する。これらの芽球様細胞は、医薬品開発におけるハイスループットの遺伝子スクリーニングまたは医薬品スクリーニングのために使用することができる。この方法は妊娠を誘発するためにも使用することができる。芽球様細胞の使用によって明らかにされる培地の成分および分子は、たとえば体外受精処置中に胚盤胞の発達および着床を改善するために、胚盤胞の挙動を調節するために使用することもできる。

本発明はさらに、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ－β阻害剤を含む、芽球様細胞の培養に適したキットを提供する。これらの化合物の一つ以上を、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養するための培地中で組み合わせることができる。

本発明はさらに、上記方法によって取得可能な芽球様細胞および胚盤胞様細胞凝集物を提供する。

少なくとも一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞（好ましくは、たとえばＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現を特徴とする）およびハイポブラスト様細胞（好ましくは、たとえばＧＡＴＡ４の発現を特徴とする）を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞（好ましくは、たとえばＧＡＴＡ３およびＣＤＸ２の発現を特徴とする）の外側上皮単層（ｏｕｔｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を含み、ここで、該外側上皮単層は、ＮＲ２Ｆ２を発現する極性様栄養膜（ｐｏｌａｒ－ｌｉｋｅ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）を含む、芽球様細胞および胚盤胞様細胞凝集物も提供される。

本発明はさらに、Ｗｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９および／またはＬＦ３で子宮内膜を刺激する工程、芽球様細胞または胚盤胞を刺激された子宮内膜細胞の層と接触させる工程を含む、芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層に移植する潜在能力を増大させる、または試験するインビトロ法をさらに提供する； この試験方法では、栄養膜、芽球様細胞、または胚盤胞への付着、侵入、および子宮内膜細胞への分化のレベルをさらに測定する。

本発明はさらに、胚盤胞を子宮内または子宮内膜に移植する前に、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程、またはＷｎｔ阻害剤で子宮内膜を刺激する工程を含む、たとえば体外受精処置中に胚盤胞着床の確率を増大させる方法において使用するためのＷｎｔ阻害剤を提供する。

これに関連して、本発明は、胚盤胞を子宮内または子宮内膜に移植する前に、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程、またはＷｎｔ阻害剤で子宮内膜を刺激する工程を含む、たとえば体外受精処置中に胚盤胞着床の確率を増大させる方法を提供する。

また、たとえば胚盤胞を子宮内または子宮内膜に移植する前に、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程、またはＷｎｔ阻害剤で子宮内膜を刺激する工程を含む、体外受精処置中に胚盤胞移植を媒介するための医薬組成物を製造するためのＷｎｔ阻害剤の使用も提供される。

さらに、桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理する工程、および桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む、たとえば体外受精中の胚盤胞の質を改善するための、着床に適した胚盤胞を作製する方法において使用するためのＨＩＰＰＯ経路阻害剤が提供される。

これに関連して、本発明は、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理する工程、および桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む、胚盤胞の作製方法を提供する。１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、または１６細胞期は、卵割期とも呼ばれる。また、たとえば、体外受精処置中の胚盤胞の発生能を改善するための、着床に適した胚盤胞を作製するための医薬組成物の製造のための、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤の使用も提供され、それは１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む。

本発明のすべての態様は関連しており、一つの態様に関する特定の実施形態の開示は他の態様にも関連する。たとえば、インビトロでの芽球様細胞、または胚盤胞様細胞凝集物の処理の開示は、体外受精処置およびそれに先行する処理段階における調製のための胚盤胞の調製のためのインビボでの処理についても行うことができる。本発明の方法に関して記載された任意の化合物がキットの一部であってもよい。キットの構成要素およびキットは、本発明の方法および処理に使用することができる。

ヒト芽球様細胞の形成。 Ａ．ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を単一細胞に解離し、マイクロウェルアレイに播種する。特定の条件下では、５日以内にｈＰＳＣが凝集して芽球様細胞を形成する。 Ｂ．芽球様細胞を含むマイクロウェルの割合は、マイクロウェル内に最初に播種される細胞の初期数に依存する。 小分子および遺伝的アプローチを使用したＨｉｐｐｏ経路の調節は、ヒトの芽球様細胞の形成を制御する。 Ｈｉｐｐｏ経路はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＮＡＥＰＡを使用して阻害することができる、およびベルテポルフィンを使用してＹＡＰ－ＴＥＡＤ複合体を抑制することができる。それぞれがヒトの芽球様細胞の形成を増加および減少させる。Ｈｉｐｐｏ経路の阻害は、ヒトの芽球様細胞の形成を増加させるＹＡＰ－ＷＴ、ＹＡＰ－５ＳＡ（構成的活性型）の遺伝的過剰発現を使用して模倣することができる。Ｈｉｐｐｏ経路の活性化は、ヒトの芽球様細胞の形成を減少させるＹＡＰ－５ＳＡ＋Ｓ９４Ａ（ＴＥＡＤ結合欠損）を使用してＹＡＰ－ＴＥＡＤ複合体の形成を抑制することによって模倣することができる。ＹＡＰタンパク質の免疫蛍光染色では、栄養外胚葉様細胞のみに核局在が示され、エピブラスト様細胞（Ｎａｎｏｇ陽性細胞）およびハイポブラスト様細胞では核局在が示されなかった。 芽球様細胞の形成中の細胞数および全体的な凝集物のサイズの変化。 Ａ．ナイーブｈＰＳＣをマイクロウェルアレイに播種すると、各マイクロウェルは平均４５個の細胞を含む。 Ｂ．２４時間後、細胞凝集物は平均４５個の細胞を含んでおり、そのすべてがエピブラスト転写因子Ｏｃｔ４を発現している。この時点では、細胞は栄養膜転写因子ＧＡＴＡ３を発現していない。 Ｃ．２４時間から８４時間の間に、細胞数は平均４５個から平均８０個に増加し、ＧＡＴＡ３を発現する栄養膜細胞が出現する。 Ｄ．芽球様細胞は、以下の３つの創始細胞（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）系統のアナログを生成することにより、１２０時間までに完全に形成される：ＯＣＴ４＋エピブラスト様細胞、ＧＡＴＡ４＋ハイポブラスト様細胞、ＧＡＴＡ３＋栄養外胚葉様細胞。ヒトの胚盤胞と同様に、細胞の平均総数は１２０個で、最も豊富な系統は栄養膜細胞である。 Ｅ，Ｆ．芽球様細胞の形成中の細胞凝集物の全体的なサイズの進化。２４時間後、細胞凝集物の全体の直径は６５マイクロメートルになる。この平均直径は、１２０時間後には２００マイクロメートルまで徐々に増加する（Ｅ）。２４時間、８４時間、および１２０時間で核色素ヘキストで染色した一つの代表的な凝集物の写真（Ｆ）。 芽球様細胞の形成中の細胞数および全体的な凝集物のサイズの変化（続き）。 Ｇ．ひとたび形成されると、ヒト芽球様細胞は３つの創始系統（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｌｉｎｅａｇｅ）のアナログで構成される。エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の内部クラスターが形成され、それぞれＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ、ならびにＧａｔａ４の発現を特徴とする。ヒト芽球様細胞の外層は、Ｇａｔａ３およびＣｄｘ２の発現を特徴とする栄養外胚葉様細胞の単層によって形成される。 Ｈ．ヒト芽球様細胞を５日間培養すると、極性栄養膜（ｐｏｌａｒ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）と呼ばれる、内部クラスターと接触している栄養膜がＮＲ２Ｆ２を発現し始めるが、壁細胞はそれを発現しない。極性栄養膜は、ヒト胚盤胞の子宮への最初の付着を媒介することが知られている。スケールバーは２５マイクロメートルである。 芽球様細胞形成中の細胞凝集物の構造の進化。 Ａ．２４時間後、細胞凝集物の全体の直径は６５マイクロメートルで、すべて転写因子Ｏｃｔ４を発現する細胞を含む（図３Ｂも参照）。凝集物の周囲の細胞は、頂端部のマーカーであるＰＫＣをより高いレベルで発現する。 Ｂ．８４時間後、外側の細胞はＰＫＣを発現する膜ドメインの形成を強化したが、内側の細胞はそのようなドメインを形成しなかった。上段は凝集物の断面を示す。下段は、凝集物の完全な３Ｄ投影を示している。 Ｃ，Ｄ．ＰＫＣを発現する膜ドメインの形成は、栄養膜転写因子Ｃｄｘ２を発現する細胞の出現および液体で満たされた小さい空洞の形成と一致し（Ｃ）、１２０時間後に合体して最終的にユニークな空洞を形成する（Ｄ）。 内部クラスターの形成を妨げることによるｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成。 Ａ．小分子ＳＣ１４４を使用したＳＴＡＴ経路の阻害、または小分子ＸＭＵ－ＭＰ－１を使用したＨｉｐｐｏ経路の阻害により、内部細胞クラスターがほとんどまたはまったく含まれない芽球様細胞が形成されるが、液体で満たされた空洞を有するシストを形成する栄養外胚葉様細胞は生成される。これは、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の数のバランス化または維持におけるこれらの経路の重要性を示している。 Ｂ～Ｄ．３μＭのＳＴＡＴ阻害剤ＳＣ１４４を４日間使用すると、芽球様細胞形成が減少し、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を全くまたはほとんど含まないｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成が増加する。２μＭのＨｉｐｐｏ阻害剤ＸＭＵ－ＭＰ－１を４日間使用すると、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含まないか、またはほとんど含まないｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅが形成される。 オープンフェイス子宮内膜オルガノイドの形成および着床の窓を模倣するためのその刺激。 Ａ．オープンフェイス子宮内膜オルガノイドは、以前に発表されたように、まず３Ｄマトリゲル培養を使用してヒト子宮内膜オルガノイドを拡張することによって形成される。これらのヒト子宮内膜オルガノイドは、エストロゲン、プロゲステロン、および環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の組み合わせに曝露すると、着床の窓（ＷＯＩ）の分子特徴を再現することが知られている。この組み合わせはＥＰＣと呼ばれる。第２工程では、オルガノイドを解離して２Ｄに播種し、子宮内膜細胞のオープンフェイス単層を形成する。このオープンフェイス単層により、胚盤胞または芽球様細胞の堆積が容易になり、インビトロでの着床の態様を再現する可能性を評価することができる。 Ｂ．ＸＡＶ９３９（ＸＡＶ）または（ＰＫＦ１１８－３１０）ＰＫＦのいずれかによるＷｎｔ阻害により、子宮内膜細胞は、ＷＯＩの既知のマーカーである遺伝子ＰＡＥＰの発現を増加させる。 Ｃ．ＬＩＦおよびＳＰＰ１を含むＷＯＩの追加のマーカーの発現も、ＥＰＣ刺激単独と比較して、Ｗｎｔ阻害およびＥＰＣ刺激によって上方制御される。 オープンフェイス子宮内膜オルガノイドの形成および着床の窓を模倣するためのその刺激（続き）。 Ｄ．免疫蛍光は、オープンフェイス子宮内膜オルガノイドには、繊毛細胞（アセチル化αチューブリン陽性細胞）、（Ｅ）腺細胞（ＦＯＸＡ２＋細胞）、および（Ｆ）増殖細胞（ＥｄＵ取り込み陽性細胞）の亜集団が含まれていることを示す。 Ｇ．ＥＰＣおよびＷｎｔ阻害剤で刺激された子宮内膜細胞は、刺激されていないオルガノイドと比較して、タンパク質レベルでより高いレベルのＰＡＥＰを発現する。 ヒト芽球様細胞とオープンフェイス子宮内膜オルガノイドのインビトロの組み合わせは、子宮への胚盤胞着床の特徴を再現している。 Ａ，Ｂ．ヒト芽球様細胞とオープンフェイスオルガノイドの間の相互作用は、子宮内膜細胞を刺激することを必要とする。ヒト芽球様細胞は、着床の窓（ＷＯＩ）を模倣しない刺激されていない子宮内膜細胞には付着および侵入することができないが（上）、刺激された子宮内膜細胞には付着および侵入することができる（下）。 Ｂ．ＥＰＣ刺激と阻害剤ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、およびＬＦ３を使用したＷｎｔ阻害の組み合わせにより、子宮内膜細胞がヒト芽球様細胞と相互作用する可能性が増大される。 Ｃ～Ｅ．ヒト芽球様細胞とオープンフェイス子宮内膜オルガノイドの間の相互作用は、特定の栄養膜の状態を必要とする。ヒト芽球様細胞形成中にＳＴＡＴ阻害剤ＳＣ１４４が存在すると、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞が限られているか、まったく存在しないｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成が誘導される。ヒト芽球様細胞形成中にＨｉｐｐｏ阻害剤ＸＭＵ－ＭＰ－１が存在すると、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞が限られているか、まったく存在しないｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成が誘導される。ヒト栄養膜幹細胞（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．１１．００４）は、移植後の段階を反映する栄養膜細胞層凝集物を形成することができる。ＳＣ１４４－ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ、ＸＭＵ－ＭＰ－１－ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ、および栄養膜細胞層凝集物は、刺激された子宮内膜細胞に付着および侵入することができない（Ｃ、Ｄ）。逆に、ヒト芽球様細胞は刺激された子宮内膜細胞に付着および侵入することができ、極性領域を介して付着する（Ｄ、Ｅ）。 Ｆ．付着および侵入すると、臨床妊娠を評価するために使用されるホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧＢ）が、２４時間後および４８時間後に培地中に検出される（それぞれ中央および右側の妊娠検査ストリップ）。ヒト芽球様細胞が刺激されていない子宮内膜細胞に付着および侵入しない場合、レベルは検出できない（左の検査ストリップ）。 ヒト芽球様細胞とオープンフェイス子宮内膜オルガノイドのインビトロの組み合わせは、子宮への胚盤胞着床の特徴を再現している（続き）。 Ｇ．免疫染色は、ホルモンｈＣＧＢは、付着した芽球様細胞の一部の細胞によってのみ産生されることを示している。免疫染色はまた、付着した芽球様細胞が極性栄養膜および移植後の栄養膜のマーカーであるＮＲ２Ｆ２が陽性の多数の細胞を形成していることも示している。これらの栄養膜は、エピブラストに特徴的なＯｃｔ４陽性細胞とは異なる。付着したヒト芽球様細胞は、移植後の栄養膜細胞のマーカーであるＣＫ７を発現する栄養膜細胞を含む。 Ｈ．子宮内膜細胞に付着および侵入すると、芽球様細胞はエピブラストマーカーＯｃｔ４、Ｋｌｆ１７、Ｎａｎｏｇ、およびＩＦＩ１６に対して陽性の細胞を形成する。 三重に阻害されたナイーブｈＰＳＣは、３つの創始系統のアナログを含むヒト胚盤胞様構造を効率的に形成する。 ａ．これによりモデル化されたヒトの着床前発生（ｐｅｒｉ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の時間枠の概略図。Ｍ／ＭＣ／Ｂ＝桑実胚（Ｍｏｒｕｌａ）／コンパクションした桑実胚（Ｍｏｒｕｌａ Ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）／胚盤胞（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）。 ｂ．ヒト芽球様細胞形成のワンステッププロトコル。Ｎ２Ｂ２７：無血清培地。ＰＡＬＬＹ：ＰＤ０３２５９０１、Ａ８３－０１、ｈＬＩＦ、ＬＰＡ、Ｙ－２７６３２。 ｃ．９６時間後に非接着性ハイドロゲルマイクロウェルアレイ上に形成されたヒト胚盤胞様構造の位相差画像。各マイクロウェルの直径は２００μｍである。スケールバー：４００μｍ。 ｄ．マイクロウェルから採取された代表的なヒト胚盤胞様構造の位相差画像。スケールバー：２００μｍ（上）および１００μｍ（下）。 ｅ．ＬＰＡ濃度を最適化したＰＡＬＬＹ条件で培養したさまざまなナイーブｈＰＳＣ株について、ヒト胚盤胞様構造を含むマイクロウェルの割合の定量化（胚盤胞様構造の収率（％）；方法の胚盤胞様構造の形態計測的定義も参照。ｎ＝３マイクロウェルアレイ；平均値±標準偏差。 ｆ，ｇ．ヒト胚盤胞様構造におけるエピブラスト（ＥＰＩ）マーカー（黄色）ＮＡＮＯＧ（ｆ）およびＯＣＴ４（ｇ）；ＴＥマーカー（シアン）ＣＤＸ２（ｆ）およびＧＡＴＡ３（ｇ）；および原始内胚葉マーカー（マゼンタ）ＳＯＸ１７（ｆ）およびＧＡＴＡ４（ｇ）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｈ．免疫蛍光染色に基づく、ＯＣＴ４、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４陽性細胞の絶対数の定量化（左）、および胚盤胞様構造（９６時間）における総細胞数のパーセンテージとして表される個々の系統に属する細胞の割合（右）。 ｉ．代表的なヒト胚盤胞様構造におけるタイトジャンクション分子ＺＯ－１（黄色）、アドヘレンスジャンクション分子ＣＤＨ１（マゼンタ）、および頂端部分子ａＰＫＣ（シアン)の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ヒト胚盤胞様構造は、３つの着床前系統のアナログを形成する。 ａ，ｂ．胚盤胞様構造（２４、６０、９６時間）、ナイーブｈＰＳＣ、準備刺激されたｈＰＳＣ、およびｈＴＳＣ（移植後の栄養膜細胞層を表す）に由来する単一細胞のトランスクリプトームのＵＭＡＰ；個々の細胞は、その起源（ａ）または教師なしクラスタリングの所属（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）（ｂ）に基づいて色付けされる。 ｃ．各胚盤胞系統（栄養外胚葉（ＴＥ）、エピブラスト（ＥＰＩ）、および原始内胚葉（ＰｒＥ））のマーカーの発現レベル。 ｄ．クラスター０、１、および３（ＵＭＡＰで定義されている（ｂを参照））に富む上位３０遺伝子を使用して生成された教師なし距離マップ。 ヒト胚盤胞様構造は、３つの着床前系統のアナログを形成する（続き）。 ｅ，ｆ．胚盤胞様構造、ナイーブｈＰＳＣ、および準備刺激されたｈＰＳＣ由来の細胞の単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰを、着床前、着床前後（インビトロ培養胚盤胞）、および原腸形成ステージ（ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ）（カーネギーステージ７、すなわちＥ１６～１９）のヒト胚の公開されたデータセットと統合した。個々の細胞は、ヒト胚（ｅ）、胚盤胞様構造または幹細胞（ｆ）の起源に基づいて色付けされている。 胚盤胞発生の順序および時間に従って３つの系統が形成される。 ａ．ヒト胚盤胞の一連の系統特定を示す概略図。 ｂ．ＰＡＬＬＹ培地で６０時間培養したナイーブｈＰＳＣの凝集物におけるＹＡＰ１（黄色）およびＧＡＴＡ２（シアン）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｃ．芽球様細胞の収量に対するＬＰＡの用量依存的効果。ｎ＝３の独立したマイクロウェルアレイ；平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定、＊＊はＰ＝０．００１６。＊＊＊＊はＰ＜０．０００１である。 ｄ．初期芽球様細胞における空洞形成イベントに対するＹＡＰ１の様々なバリアントの過剰発現の影響の測定。ｎ＝３ 実験；平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定、ｎｓは有意ではない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、＊＊＊はＰ＝０．０００４である；＊＊＊＊はＰ＝０．００００４である。 胚盤胞発生の順序および時間に従って３つの系統が形成される。 ｅ．発生の３つの時点（２４、６０、９６時間）における、発生中の芽球様細胞における系統ごとの総細胞数の定量化。エラーバー：標準偏差、ｎ：Ｅｐｉ：２４時間、６８時間、および９６時間で１１個の芽球様細胞。ＴＥ：２４時間、４８時間、および９６時間でそれぞれ８個、１４個、および１５個の芽球様細胞；ＰｒＥ：２４時間、４８時間、および９６時間でそれぞれ９個、３７個および９個の芽球様細胞。 ｆ．代表的なＢ４ステージのヒト胚盤胞（左）および芽球様細胞（中央）におけるＤＸ２（シアン） ＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）およびＮＡＮＯＧ（黄色）の免疫蛍光染色。優先的に壁性の（ｍｕｒａｌ）ＮＲ２Ｆ２発現パターン（反転軸）と比較した、優先的に極性のＮＲ２Ｆ２発現パターン（軸）を有する芽球様細胞の割合の定量化（右）。各実験で４～１２個の芽球様細胞を使用したｎ＝４の独立した実験。平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定、＊はＰ＜０．０５；＊＊＊は Ｐ＜０．００１である。スケールバー：５０μｍ。エラーバー：標準偏差。 ヒト芽球様細胞は着床の態様を再現している。 ａ．モデル化された移植時間の概略図（左）。移植アッセイとして、受容性のためにＥＰＣ／ＸＡＶ９３９による準備刺激を行ったオープンフェイス子宮内膜層（ＯＦＥＬ）（右）。Ｅ２：ベータエストラジオール。ＥＰＣ：Ｅ２、プロゲステロン、ｃＡＭＰ。 ｂ．刺激されていないＯＦＥＬ（左上）または刺激されたＯＦＥＬ（左下）上に堆積してから２４時間後の芽球様細胞（ＧＦＰ^＋）の代表的な位相差画像。スケールバー：１００μｍ。ヒト芽球様細胞の付着効率（右）。３人の異なるドナーからのｎ＝７の独立した実験；平均値±標準偏差；対応のない両側ｔ検定、＊＊＊＊はＰ＝４．５ｅ－８である。 ｃ．最近付着したヒト芽球様細胞の代表的な画像（１２±４時間）。点線は、ＧＦＰ^＋ナイーブｈＰＳＣから形成された芽球様細胞の内部クラスターの輪郭を示す（上）。スケールバー：１００μｍ。付着直後の芽球様細胞におけるＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）およびＯＣＴ４（黄色）の免疫蛍光染色のＸ－Ｚ面（下）。スケールバー：５μｍ。 ヒト芽球様細胞は着床の態様を再現している（続き）。 ｄ．付着直後の芽球様細胞における免疫蛍光染色（ＮＲ２Ｆ２、ＯＣＴ４）の強度プロファイル。ｎ＝１０。 ｅ．３μＭ ＳＣ１４４（上）または２μＭ ＸＭＵ－ＭＰ－１（中央）を使用して形成されたｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ、および刺激されたＯＦＥＬ上に堆積したｈＴＳＣの凝集物（下）の代表的な位相差画像。スケールバー：１００μｍ。取り付け効率（右）。ｎ＝３の独立した実験；平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１である。 ｆ．結合していない芽球様細胞を有する未刺激のＯＦＥＬおよび結合された芽球様細胞を有する刺激されたＯＦＥＬの培地へのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧβ）分泌を検出する妊娠検査ストリップ（ＯＦＥＬで４８時間、また図２１ｂのＥＬＩＳＡアッセイも参照）。 ｇ．移植後培養条件で４日間増殖させたヒト胚盤胞（左）または芽球様細胞（右）におけるＯＣＴ４（黄色）およびａＰＫＣ（灰色）の免疫蛍光染色。Ｆ－アクチン（シアン）を標識するファロイジンで対比染色する。スケールバー：１００μｍ。 ｈ．移植後培養条件で６日間増殖させた芽球様細胞におけるＯＣＴ４、ＧＡＴＡ３、およびＧＡＴＡ４陽性細胞の数（時間相当＝１３日目）。ｎ＝５。平均値±標準偏差。 ナイーブｈＰＳＣは、３つの創始系統のアナログを含むヒト胚盤胞様構造を形成する。 ａ．ＰＸＧＬ培地およびＭＥＦフィーダー層上で培養されたナイーブｈＰＳＣの位相差画像。スケールバー：５０μｍ。 ｂ．ＬＰＡなし（ＰＡＬＹ培地、上）または５００ｎＭ ＬＰＡあり（ＰＡＬＬＹ培地、下）のいずれかでマイクロウェルアレイ内で培養されたナイーブｈＰＳＣ凝集物の経時位相差画像。スケールバー：２００μｍ。 ナイーブｈＰＳＣは、３つの創始系統のアナログを含むヒト胚盤胞様構造を形成する（続き）。 ｃ．胚盤胞様構造の収量に対するマイクロウェルアレイあたりの初期細胞数の影響の定量化。ｎ＝１ マイクロウェルアレイ。 ｄ．胚盤胞様構造の収率に対するナイーブｈＰＳＣの連続継代の影響の定量化。ｎ＝３ マイクロウェルアレイ。平均値±標準偏差。 ｅ．播種時およびマイクロウェルアレイあたり３．０×１０^４細胞で細胞を播種した場合の９６時間後の胚盤胞様構造におけるマイクロウェルあたりの細胞数の定量化。ｎ＝１９０ マイクロウェル（播種）およびｎ＝１２ 胚盤胞様構造（９６時間）。 ｆ．ヘキストを使用した、胚盤胞様構造の形成過程で凝集した代表的なナイーブｈＰＳＣにおけるＤＮＡの蛍光染色（９６時間、左）。スケールバー：５０μｍ。 胚盤胞様構造の形成過程における構造の分布直径の測定（右）。０、６０、９６時間では、それぞれｎ＝１５、３１、１１。 ｇ．ＴＥマーカーＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＣＤＸ２、およびＴＡＣＳＴＤ２の発現を示すヒト着床前発生の擬似系列解析（Ｐｓｅｕｄｏｔｉｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）。遺伝子発現解析は公開データ解析ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｒｄ２ｃｌｕｓｔｅｒ．ｕｎｉｖ－ｎａｎｔｅｓ．ｆｒ／ｄｅｍｏ／ＰｓｅｕｄｏＴｉｍｅＵＩ／）を用いて実施した。 ナイーブｈＰＳＣは、３つの創始系統のアナログを含むヒト胚盤胞様構造を形成する（続き）。 ｈ．５つの代表的な胚盤胞様構造における、代表的なＢ４ステージのヒト胚盤胞におけるＥＰＩマーカーＮＡＮＯＧ（黄色）、ＴＥマーカーＣＤＸ２（シアン)、および原始内胚葉マーカーＧＡＴＡ４（マゼンタ）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｉ．ＥＰＩマーカー（黄色）ＮＡＮＯＧ（上）およびＯＣＴ４（下）；ＴＥマーカー（シアン)ＣＤＸ２（上）およびＧＡＴＡ３（下）；および原始内胚葉マーカー（マゼンタ）ＧＡＴＡ４の免疫蛍光染色。ＤＮＡを標識するヘキスト（灰色）で対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｊ．胚盤胞様構造におけるＥＰＩマーカーＯＣＴ４（黄色）およびＴＥマーカーＧＡＴＡ２（シアン）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｋ．胚盤胞様構造におけるＴＥマーカーＧＡＴＡ３（シアン）およびＴＲＯＰ２（マゼンタ）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｌ．胚盤胞様構造におけるＴＥマーカーＧＡＴＡ３（シアン）およびＧＡＴＡ４（マゼンタ）およびＰｒＥマーカーＰＤＧＦＲａ（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ナイーブｈＰＳＣは、３つの創始系統のアナログを含むヒト胚盤胞様構造を形成する（続き）。 ｍ．代表的なヒト胚盤胞様構造におけるタイトジャンクション分子ＺＯ－１（黄色）、アドヘレンスジャンクション分子ＣＤＨ１（マゼンタ）、および頂端部分子ａＰＫＣ（シアン)の免疫蛍光染色画像の単一光学切片。スケールバー：５０μｍ。 ｎ．空洞の膨張と収縮のサイクルを示しながら胚盤胞様構造に空洞形成するナイーブ細胞凝集物のタイムラプス画像の代表的な時点（左）－明確な膨張と収縮の頻度を示す胚盤胞様構造の定量化（右）。ｎ＝１ マイクロウェルアレイ。スケールバー：１００μｍ。 ｏ．なるナイーブｈＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ株から形成された胚盤胞様構造を示す、マイクロウェルアレイの代表的な領域の位相差画像。ｎ＞３。スケールバー：１００μｍ。 ｐ．ナイーブｈＰＳＣおよび準備刺激されたＨ９ ｈＰＳＣから得られた胚盤胞様構造の収率の定量化。ｎ＝３ マイクロウェルアレイ。平均値±標準偏差。 ヒト胚盤胞様構造は、着床前系統のアナログを形成する。 ａ．胚盤胞様構造から単離され、系統特異的表面マーカーＰＤＧＦＲａ（ＰｒＥ）および ＴＲＯＰ２（ＴＥ）について染色された細胞のフローサイトメトリー分析プロット。ゲートは、ＥＰＩ（ダブルネガティブ）、ＴＥ（ＴＲＯＰ２^ｈｉｇｈ）、およびＰｒＥ（ＰＤＧＦＲα^ｈｉｇｈ）のアナログを分類するために使用され、その後、単一細胞ＲＮＡシークエンシングの処理が行われる。ゲートはセルを除外しなかったことに注意されたい。この分析は、すべての細胞タイプの表現を保証しながら、ＲＮＡ測定値を相関させるために実行された。 ｂ．胚盤胞様構造から単離された単一細胞のトランスクリプトームのＵＭＡＰで、３つの胚盤胞系統（ＴＥ－栄養外胚葉、ＥＰＩ－エピブラスト、およびＰｒＥ－原始内胚葉）のそれぞれに特異的な遺伝子の発現レベルを示す。 ｃ～ｇ．胚盤胞様構造とＥ３からＥ１９までの胚の両方から単離された単一細胞のＵＭＡＰ。 ｃ．３日目（Ｅ３）から７日目（Ｅ７）に単離された体外受精（ＩＶＦ）胚に由来する細胞の色。この期間は着床前段階の胚のみを含む。 ｄ．６日目（Ｅ６）から１２日目（Ｅ１２）に単離された体外受精胚に由来する細胞の色。これらの胚盤胞（Ｅ６）をインビトロで培養した。この注釈は、発生段階ではなく文化における日数を反映していることに注意されたい。 ｅ．１７日目（Ｅ１７）から１９日目（Ｅ１９）に単離された原腸形成段階の胚に由来する細胞の色。 ｆ．３つの胚盤胞系統（ＥＰＩ、ＴＥ、およびＰｒＥ）のそれぞれに特異的な遺伝子の発現レベル。 ｇ．教師なしクラスタリングの所属（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ）を示す細胞の色付け。 ヒト胚盤胞様構造およびナイーブヒト多能性幹細胞におけるオフターゲット細胞の生成の測定。 ａ，ｂ．胚盤胞様構造から単離された細胞から形成されたクラスターのＵＭＡＰ（図２ｂと比較して１、×５０の高解像度クラスター化）（ａ）、羊膜系統に特異的な遺伝子の発現レベルを表示（ｂ）。 ｃ．クラスター１１を構成する細胞の起源。 ｄ～ｈ．ナイーブｈＰＳＣ、準備刺激されたｈＰＳＣ、胚盤胞様構造から単離された細胞、およびＣＳ７期のヒト胚から単離された細胞のＵＭＡＰ。 ｄ．胚細胞の着色。 ｅ．幹細胞の起源に基づく色分け。 ｆ．３つの胚盤胞系統（ＥＰＩ－エピブラスト、ＴＥ－栄養外胚葉、およびＰｒＥ－原始内胚葉）のそれぞれに特異的な遺伝子の発現レベルの表示。 ヒト胚盤胞様構造およびナイーブヒト多能性幹細胞におけるオフターゲット細胞の生成の測定（続き）。 ｇ．教師なしクラスターの所属に基づいた個々のセルの色付け。 ｈ．以前にクラスター１１として識別されたセルの色付け（ａ、ｂを参照）。 ｉ．ナイーブｈＰＳＣ （左）と胚盤胞様構造から単離された細胞（右）の両方について、ｈのＵＭＡＰ内の位置（上）と細胞のアノテーション（下）に基づいて異常として識別された細胞の割合の定量化。同様の結果が、ＵＭＡＰ内の位置に基づいて得られた（図１３ｃ～ｅ）。ｊ．胚盤胞様構造および原腸形成段階の胚の細胞内で差次的に発現される、様々な系統のマーカーのヒートマップ。 ヒト胚盤胞様構造内の細胞は、転写的には着床前の系統と類似している。 ａ．胚盤胞様構造（ＥＰＩ、ＴＥ、およびＰｒＥ）の；幹細胞株：ナイーブｈＰＳＣおよび準備刺激されたｈＰＳＣ；ｈＴＳＣ：胚盤胞由来ｈＴＳＣ（ｂＴＳ５）、準備刺激されたｈＰＳＣ来ｈＴＳＣ（ＢＡＰおよびＴＭ４プロトコル）；ＰｒＥ様幹細胞株（ＲＡＣＬまたはｎＥＮＤ細胞）；ナイーブＰＳＣおよび胚盤胞様構造から再誘導されたＴＳＣ（拡張された方法を参照)の個々の系統のバルクトランスクリプトームの上位５００の可変遺伝子を使用して計算された、ＰＣ１対ＰＣ２（上）またはＰＣ１対ＰＣ３（下）の主成分分析（ＰＣＡ）プロット。 ｂ．胚盤胞様構造のＴＥアナログ（ＴＲＯＰ２＋）とバルク トランスクリプトーム内のｈＴＳＣの間で差次的に発現される主要な胚盤胞および着床後系統マーカーのヒートマップ。 ｃ．ヒト成熟ＴＥマーカーＣＧＢ５、ＣＧＢ７、ＣＧＢ８およびＣＧＡの疑似時系列解析。遺伝子発現解析は、公開データ分析ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｒｄ２ｃｌｕｓｔｅｒ．ｕｎｉｖ－ｎａｎｔｅｓ．ｆｒ／ｄｅｍｏ／ＰｓｅｕｄｏＴｉｍｅＵＩ／）を使用して行った。ｄ．主要な多能性関連遺伝子のヒートマップは、胚盤胞様構造のＥＰＩアナログ（ＰＤＧＦＲ－／ＴＲＯＰ２－）と準備刺激されたｈＰＳＣの間で差次的に発現される。 ｅ．胚盤胞様構造、ナイーブＰＳＣ由来ＰｒＥ様細胞およびｎＥＮＤ細胞におけるＰｒＥアナログ（ＰＤＧＦＲα＋）の間で差次的に発現される主要な多分化能関連遺伝子またはＰｒＥマーカーのヒートマップ。 ヒト胚盤胞様構造は幹細胞株の誘導を可能にする。 ａ．ナイーブｈＰＳＣ対照（上）および胚盤胞様構造由来のナイーブｈＰＳＣ（下）における、多能性因子ＮＡＮＯＧ（黄色）、ＯＣＴ４（マゼンタ）、ＳＯＸ２（シアン）、およびナイーブ多能性因子ＫＬＦ１７（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｂ．３つの再派生（ｒｅｄｅｒｉｖｅｄ）ナイーブｈＰＳＣ株から形成されたマイクロウェルアレイ上の胚盤胞様構造の位相差画像。スケールバー：２００μｍ。 ｃ．代表的な第２世代胚盤胞様構造におけるＥＰＩマーカー（ＮＡＮＯＧ）、ＴＥマーカー（ＣＤＸ２）および原始内胚葉マーカー（ＧＡＴＡ４）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｄ．ｂＴＳ５ ｈＴＳＣ（上）および胚盤胞様構造由来のｈＴＳＣ（下）におけるＧＡＴＡ３（シアン）、移植後栄養膜マーカーＣＫ７（マゼンタ）およびＣＤＸ２（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｅ．胚盤胞様構造に由来する３つのｈＴＳＣ株由来の６日目のＥＶＴ分化の位相差画像。スケールバー：１５０μｍ。 ｆ．胚盤胞様構造に由来する、３つのｈＴＳＣ株由来の６日目ＥＶＴアナログの栄養膜マーカーＧＡＴＡ３（シアン）およびＥＶＴマーカーＨＬＡ－Ｇ（黄色）およびＣＧβ（マゼンタ）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｇ．胚盤胞様構造に由来する、３つのｈＴＳＣ株から分化した、３日目のＳＣＴアナログの位相差画像。スケールバー：１５０μｍ。 ｈ．胚盤胞様構造に由来するｈＴＳＣ 株（クローン１）から形成された３日目のＳＣＴアナログの栄養膜マーカーＧＡＴＡ３（シアン）およびＳＣＴマーカーＳＤＣ１（黄色）およびＣＧβ（マゼンタ）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｉ．胚盤胞様構造由来のｈＴＳＣ株（クローン１）から形成された６日目の栄養膜オルガノイドの、アクチンとＤＮＡをそれぞれマーキングするファロイジン（シアン）とヘキストで対比染色したＣＧβ（マゼンタの免疫蛍光染色（左）、ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色したＳＤＣ（黄色）、ＣＫ７（マゼンタ）、ＣＫ７（マゼンタ）（右）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｊ．胚盤胞様構造に由来するそれぞれの未分化ｈＴＳＣ株の６日目ＥＶＴ（上）および３日目ＳＣＴアナログ（下）のＲＴ－ＰＣＲで測定した相対発現レベル。発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化された。ｎ＝１ ３つの個別のクローンの生物学的反復（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）。 ヒト栄養外胚葉アナログの発生は、ａＰＫＣおよびＨｉｐｐｏエレメントに依存する。 ａ．Ｂ２ステージのヒト胚盤胞の経時的顕微鏡検査法によるフレーム（左）。発生中の胚盤胞の内細胞および外細胞における示差的なＨｉｐｐｏ活性およびＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の分子調節因子を示す概略図（右）。 ｂ．ＰＡＬＬＹ培地で２４時間（上）および６０時間（下）培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＦ－アクチンのファロイジン蛍光（シアン）染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｃ．ＰＡＬＬＹ培地で２４時間（上）および６０時間（下）培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるａＰＫＣ（シアン）およびＹＡＰ１（黄色）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ヒト栄養外胚葉アナログの発生は、ａＰＫＣおよびＨｉｐｐｏエレメントに依存する（続き）。 ｄ．ＰＡＬＬＹ培地で２４時間培養したナイーブｈＰＳＣの凝集物におけるＹＡＰ１（黄色）およびＧＡＴＡ２（シアン）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｅ．ＰＡＬＬＹ培地で２４時間（左）および６０時間（右）培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＹＡＰ１（黄色）およびＧＡＴＡ３（シアン）（上）、ならびにＹＡＰ１（黄色）およびＮＡＮＯＧ（シアン）（下）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｆ．ａＰＫＣ阻害剤なし（上）またはａＰＫＣ阻害剤あり（２μＭ ＣＲＴ０１０３３９０、下）で培養した芽球様細胞におけるＹＡＰ１（黄色）およびＧＡＴＡ３（シアン）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキスト（赤）で対比染色する。挿入図：単一の光学セクションのＹＡＰ１およびＧＡＴＡ３の個別チャネルおよびマージ チャネル、ならびにすべての光学セクションの最大強度投影。スケールバー：５０μｍ。 ｇ．ＰＡＬＬＹ培地またはａＰＫＣ阻害剤（２μＭ ＣＲＴ０１０３３９０）を補充したＰＡＬＬＹ培地での培養における芽球様細胞収量の定量化。ｎ＝３の独立したマイクロウェルアレイ。平均値±標準偏差； 両側対応のないｔ検定。＊＊＊はＰ＝０．０００２である。 ｈ．ＰＡＬＬＹ培地またはａＰＫＣ阻害剤（２μＭ ＣＲＴ０１０３３９０）を補充したＰＡＬＬＹ培地で培養した構造におけるＧＡＴＡ３^＋細胞のパーセンテージの定量化。ＰＡＬＬＹ培地で培養した群ではｎ＝７の芽球様細胞、ＣＲＴ０１０３３９０を補充したＰＡＬＬＹ培地で培養した群ではｎ＝１２の凝集物。３つの独立した実験からの代表的な結果。平均値±標準偏差；対応のない両側ｔ検定。＊＊＊＊は Ｐ＝１．７９ｅ－０８である。 ヒト栄養外胚葉アナログの発生は、ａＰＫＣおよびＨｉｐｐｏエレメントに依存する（続き）。 ｉ．芽球様細胞の収量に対するＬＰＡ受容体アゴニストＮＡＥＰＡの用量依存的効果の定量化。ＰＡＬＹ培地（したがってＬＰＡを含まない）にはＮＡＥＰＡが補充された。ｎ＝３の独立したマイクロウェルアレイ。平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。＊＊＊＊はＰ＜０．０００１である。 ｊ．ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したＰＡＬＬＹ培地で７２時間培養し、ＹＡＰ１の様々なバリアントを過剰発現させた代表的なナイーブｈＰＳＣ凝集物の位相差画像。ナイーブｈＰＳＣ凝集物は、ＬＰＡ濃度（５ｎＭ）の減量を特徴とする調整されたＰＡＬＬＹ培地で培養された。スケールバー：１００μｍ。 ｋ．芽球様細胞の収量に対するベルテポルフィン（ＹＡＰ１－ＴＥＡＤ複合体の抑制剤）の効果の測定。ｎ＝３の独立したマイクロウェルアレイ。平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定。＊＊はｐ＝０．００１０、＊＊＊はｐ＝０．０００１９、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１である。 ｌ．ＰＡＬＬＹ培地で６０時間培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＦ－アクチン（シアン）のファロイジン蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。黄色の矢印：空洞の形成。スケールバー：５０μｍ。 ｍ．ＰＡＬＬＹ培地で３６時間（左）または９６時間（右、芽球様細胞期）培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるアクアポリン３（ＡＱＰ３、シアン）およびＯＣＴ４（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 芽球様細胞は、胚盤胞の発生中に発生する系統の連続的な特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を再現する。 ａ．芽球様細胞ＴＥアナログの形成時のＴＥ遺伝子の発現における平均カウント値のヒートマップ。 ｂ～ｄ．ＰＡＬＬＹ培地で２４時間（上）または６０時間（下）培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＧＡＴＡ３（シアン）およびＯＣＴ４（黄色）（ｂ）、またはＣＤＸ２（シアン）およびＮＡＮＯＧ（黄色）（ｃ）、またはＣＤＸ２（シアン）およびＫＬＦ１７（黄色）（ｄ）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｅ．遺伝子に対応付けされた遺伝子オントロジーターム（Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｔｅｒｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ）、初期ＴＥ（クラスター２）と比較して、芽球様細胞の後期ＴＥアナログ（クラスター１０）で差次的に制御される。 芽球様細胞は、胚盤胞の発生中に発生する系統の連続的な特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を再現する（続き）。 ｆ．クラスター４（ナイーブｈＰＳＣ）、１０、２、および５（ＴＥアナログ）、ならびに７（ＴＳＣ）の細胞におけるＷｎｔ、ＴＧＦ－β、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達関連遺伝子の平均カウント値のヒートマップ。 ｇ．芽球様細胞から単離され、極性栄養外胚葉特異的遺伝子ＮＲ２Ｆ２の発現レベルを示す単一細胞のＵＭＡＰ。 ｈ．芽球様細胞におけるＣＤＸ２（シアン）、ＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）、およびＮＡＮＯＧ（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｉ．芽球様細胞から単離され、極性栄養外胚葉特異的遺伝子ＣＣＲ７の発現レベルを示す単一細胞のＵＭＡＰ。 ｊ．芽球様細胞におけるＣＣＲ７（シアン）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｋ．クラスター４（ナイーブｈＰＳＣ)、０（ＥＰＩアナログ)、および９（準備刺激されたｈＰＳＣ）の細胞における、差次的に制御されている上位遺伝子の平均カウント値のヒートマップ。 芽球様細胞は、胚盤胞の発生中に発生する系統の連続的な特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を再現する（続き）。 ｌ．芽球様細胞における、ＫＬＦ１７（シアン）およびＯＣＴ４（黄色）、もしくはＫＬＦ４（シアン）およびＯＣＴ４（黄色）（上）、ならびにＳＵＳＤ２（シアン）およびＮＡＮＯＧ（黄色）、もしくはＩＦＩ１６（シアン）およびＫＬＦ１７（黄色）（下）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：１００μｍ。 ｍ．芽球様細胞から単離され、Ｘ染色体活性化関連遺伝子ＸＡＣＴの発現レベルを示す単一細胞のＵＭＡＰ。 ｎ．ＰＡＬＬＹ培地で６０時間培養し、系統特異的表面マーカーＰＤＧＦＲａ（ＰｒＥ）およびＴＲＯＰ２（ＴＥ）で染色した胚盤胞様構造から単離した細胞のフローサイトメトリー分析プロット。 ｏ．ｐ，ＰＡＬＬＹ培地で６０時間培養したナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＯＴＸ２（シアン）、ＧＡＴＡ４（マゼンタ）、およびＯＣＴ４（黄色）（ｏ）、ならびにＳＯＸ１７（シアン）、およびＧＡＴＡ４（マゼンタ）（ｐ）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｑ．芽球様細胞ＰｒＥアナログの形成時のＰｒＥ遺伝子発現における平均カウント値のヒートマップ。 ｒ．クラスター１、６（ＥＰＩアナログ）および８（ＰｒＥアナログ）の細胞におけるＳＭＡＤ、ＭＡＰＫ、およびＷｎｔシグナル伝達関連遺伝子の平均カウント値のヒートマップ。 ヒト芽球様細胞は着床の態様を再現している。 ａ．ＯＦＥＬにおけるＣＤＨ１（マゼンタ）および繊毛細胞マーカーのアセチル化α－チューブリン（黄色）の免疫蛍光染色（左）。Ｙ－Ｚ平面は繊毛の頂端の位置を示す（右）。スケールバー：５０μｍ。 ｂ．ＯＦＥＬの子宮内膜腺細胞を示すＦＯＸＡ２の免疫蛍光染色（黄色）。スケールバー：５０μｍ。 ｃ．刺激していないＯＦＥＬ（左）および刺激したＯＦＥＬ（右）におけるＰＡＥＰ（黄色）の免疫蛍光染色。 ｄ．異なる培地で培養したＯＦＥＬにおける着床の窓マーカーの発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ測定。Ｃｔｒｌ：対照培地、Ｅ：エストラジオール、Ｐ：プロゲステロン、Ｃ：ｃＡＭＰ、Ｘ：ＸＡＶ－９３９。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよび対照条件に対して正規化された。ｎ＝２の独立した実験。色は３人の異なるドナー由来のデータを示す。 ｅ．バルクトランスクリプトームにおける刺激されたＯＦＥＬと刺激されていないＯＦＥＬの間で差次的に発現される主要な細胞周期および分泌上皮遺伝子のヒートマップ。 ｆ．刺激されたＯＦＥＬにおける細胞増殖を反映する、取り込まれたＥｄＵの染色（赤色）（左）。スケールバー：５０μｍ。刺激されていないＯＦＥＬおよび刺激されたＯＦＥＬにおけるＥｄＵ^＋細胞の数の定量化（右）。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。ｎ＝４の独立した実験。平均値±標準偏差；対応のない両側ｔ検定、＊＊＊はＰ＝０．０００９である。 ｇ．３人の異なるドナー由来の子宮内膜オルガノイドを使用して調製されたＯＦＥＬへの芽球様細胞付着の定量化。ドナー１についてはｎ＝３の独立した実験、ドナー２および３についてはｎ＝２の独立した実験。平均値±標準偏差；対応のない両側ｔ検定、＊＊はＰ＝０．００１１である。 ｈ．ＧＦＰ＋芽球様細胞が付着している（ＯＦＥＬ上に堆積後４８時間）、受容期の子宮内膜の内腔上皮表面で高度に発現する糖タンパク質であるＭＵＣ１（マゼンタ）の免疫蛍光染色。破線は、栄養膜細胞が子宮内膜細胞を忌避した（ｒｅｐｅｌｌｅｄ）領域を示す。スケールバー：２００μｍ。 ｉ．刺激されていないＯＦＥＬ、刺激されたＯＦＥＬ、および避妊薬レボノルゲストレル（ＬＮＧ、１０μＭ）にさらに曝露されたＯＦＥＬへの芽球様細胞付着の定量化。ｎ＝３の独立した実験。平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定、＊はＰ＝０．０２１１、＊＊＊はＰ＝０．０００６である。 栄養外胚葉の状態は、着床時の子宮内膜との相互作用にとって重要である。 ａ．ＯＦＥＬに付着した直後のヒト芽球様細胞の代表的な画像。点線は、ＧＦＰ^＋ナイーブｈＰＳＣを使用して形成された芽球様細胞の内部クラスターの輪郭を示す（上）。ＯＦＥＬへの付着直後の芽球様細胞におけるＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）およびＯＣＴ４（黄色）の免疫蛍光染色（下）。 ｂ．ＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）およびＯＣＴ４（黄色）の免疫蛍光染色、およびＯＦＥＬへの付着直後の代表的な芽球様細胞のそれぞれの蛍光強度プロファイル。プロファイルは付着面に垂直に測定された（右）。線幅、１０μｍ。Ｙ軸は正規化された強度を示す。 ｃ．ＮＲ２Ｆ２およびＯＣＴ４の蛍光強度プロファイルの最初のピーク間の距離の定量化。ｎ＝１０の付着した芽球様細胞。平均値±標準偏差。 ｄ．ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＧＰ１３０、およびＳＴＡＴ３の発現を示すヒト着床前発生の擬似系列解析。遺伝子発現解析は、公開データ解析ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｒｄ２ｃｌｕｓｔｅｒ．ｕｎｉｖ－ｎａｎｔｅｓ．ｆｒ／ｄｅｍｏ／ＰｓｅｕｄｏＴｉｍｅＵＩ／）を使用して実行される。 ｅ．芽球様細胞の収量に対するＬＩＦの用量依存的効果の定量化。ｎ＝２（Ｌｉｆなし）およびｎ＝３（他のすべての条件）の独立した実験。平均±標準偏差。 ｆ．ＳＣ１４４に暴露された芽球様細胞から形成された代表的なｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅにおけるＮＡＮＯＧ（黄色）およびＣＤＸ２（シアン）（左）、ＯＣＴ４ （黄色）およびＧＡＴＡ３（シアン）（中央）、ならびにＣＤＸ２（シアン）およびＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）（右）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 ｇ．ＸＭＵ－ＭＰ－１に曝露された芽球様細胞から形成された代表的なｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅにおけるＮＡＮＯＧ（黄色）およびＣＤＸ２（シアン）（左）、ＯＣＴ４（黄色）およびＧＡＴＡ３（シアン）（右）の免疫蛍光染色。スケールバー：５０μｍ。 栄養外胚葉の状態は、着床時の子宮内膜との相互作用にとって重要である（続き）。 ｈ．ナイーブｈＰＳＣと比較した、芽球様細胞（ＴＲＯＰ２陽性細胞）、ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ（ＳＣ１４４またはＸＭＵ）およびＴＳＣ（２Ｄまたは３Ｄ）の栄養外胚葉のバルクトランスクリプトームで差次的に発現された主要な系統特異的遺伝子のヒートマップ。 栄養外胚葉の状態は、着床時の子宮内膜との相互作用にとって重要である（続き）。 ｉ．芽球様細胞、ｈＰＳＣ（ナイーブ、準備刺激された、または芽球様細胞再派生ナイーブ細胞株）、ＴＳＣ（ｂＴＳ５、胚盤胞再派生株またはヒト幹細胞由来ＴＳＣ様細胞)、および多能性幹細胞由来原始内胚葉様細胞（ＲＡＣＬまたはＮＡＣＬ細胞）のバルクトランスクリプトームを使用して計算されたＰＣＡプロット。 ｊ．ｂＴＳ５ ｈＴＳＣから形成された凝集物におけるＣＤＸ２（シアン）（左）、ＣＫ７（マゼンタ）およびＧＡＴＡ３（シアン）（右）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。 ｋ．刺激されたＯＦＥＬ上に堆積したナイーブｈＰＳＣの凝集物の代表的な位相差画像。スケールバー：１００μｍ。 ｌ．極性栄養外胚葉と子宮内膜上皮細胞の間のクロストークに関与する、選択された推定上のリガンド－受容体ペアのリスト。このリストは、Ｃｅｌｌｉｎｋｅｒを使用して、極性栄養外胚葉および刺激されたＯＦＥＬに豊富に含まれる遺伝子のインシリコリガンド受容体分析によって生成された。 ヒト芽球様細胞は、１３日目までの着床前後の進行の態様を再現している。 ａ．移植後の培養条件で低付着プレート上でさらに４日間培養したヒト芽球様細胞（９６時間）の明視野画像（左）。各行は、４日間の個々の芽球様細胞の時系列を示す。ＰＡＬＬＹを含むＮ２Ｂ２７培地と比較して浸透圧が異なるＩＶＣ培地に移すと、芽球様細胞は少なくとも２日間は安定に空洞を保持することに留意されたい（移植後の培地の組成については拡張された方法を参照）。スケールバー：２００μｍ。移植後段階の培養の各日における空洞を保持する芽球様細胞のパーセンテージの定量化（右）。ｎ＝２の独立した実験。 ｂ．刺激されたＯＦＥＬ上に付着したＧＦＰ^＋芽球様細胞（堆積後４８時間）における合胞体栄養細胞関連マーカーＣＧβ（マゼンタ）の免疫蛍光染色（左）。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：５０μｍ。結合していない芽球様細胞を有する刺激されていないＯＦＥＬおよび結合した芽球様細胞を有する刺激されたＯＦＥＬの培地中に分泌されたタンパク質ＣＧβの濃度のＥＬＩＳＡ測定（２４時間および４８時間）（右）。ｎ＝３の独立した実験。平均値±標準偏差；一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定、＊＊＊＊はＰ＝０．００００６である。 ｃ．着床後培養条件で４日間増殖させた芽球様細胞における ＣＤＸ２（シアン）、ＮＲ２Ｆ２（マゼンタ）、およびＳＯＸ２（黄色）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｄ．移植後培養条件で４日間増殖させた芽球様細胞におけるＯＣＴ４（黄色）、ＣＫ７（シアン）、およびＧＡＴＡ４（マゼンタ）の免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ。 ｅ，ｆ．４日間（ｅ）または６日間（ｆ）、移植後培養条件で増殖させた芽球様細胞におけるＣＧβ（マゼンタ）およびＮＲ２Ｆ２(シアン)（ｅ）またはＨＬＡ－Ｇ（マゼンタ）およびＧＡＴＡ３（シアン）（ｆ）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。矢印はＨＬＡ－Ｇ陽性ＥＶＴ様細胞を指す。スケールバー：１００μｍ。 ｇ．移植後培養条件で６日間増殖させた芽球様細胞におけるＣＤ２４（マゼンタ）およびＳＯＸ２（黄色）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：１００μｍ。 ｈ．移植後培養条件で４日間増殖させた芽球様細胞におけるＰＯＤＸＬ（マゼンタ）および ＳＯＸ２（黄色）の免疫蛍光染色。Ｆ－アクチン（シアン）をマーキングするファロイジンで対比染色する。矢頭は原始羊膜様腔（ｐｒｏ－ａｍｎｉｏｔｉｃ－ｌｉｋｅ ｃａｖｉｔｙ）を指す。スケールバー：１００μｍ。 ｉ～ｋ．移植後培養条件で４日間増殖させた芽球様細胞におけるＳＯＸ２（黄色）、ＧＡＴＡ３（シアン）およびＣＤＸ２（マゼンタ）（ｉ）、ＳＯＸ２（黄色）、ＣＤＸ２（マゼンタ）およびＴＦＡＰ２Ｃ（シアン）（ｊ）、ＯＣＴ４（黄色）、ＧＡＴＡ４（マゼンタ）およびＯＴＸ２（シアン）（ｋ）の免疫蛍光染色。ＤＮＡをマーキングするヘキストで対比染色する。スケールバー：１００μｍ。 ｌ．ガラスまたはＯＦＥＬ上で移植後培養条件で４日間培養した芽球様細胞におけるＥＰＩ、ＴＥ、またはＰｒＥ系統に属する細胞の数の定量化。ｎ＝７の生物学的反復。平均値±標準偏差。 ｍ．培養ヒト胚盤胞の１３日目に相当する時間に相当する、移植後培養条件で６日間増殖させた芽球様細胞におけるＯＣＴ４（黄色）、ＧＡＴＡ３（シアン）、およびＧＡＴＡ４（マゼンタ）の免疫蛍光染色（左）。スケールバー：１００μｍ。 ＬＰＡ、およびＰＤ０３２５９０１、およびＡ８３－０１（三重阻害）で刺激した、または刺激しなかった凝集したナイーブｈＰＳＣから形成されたヒト胚盤胞様構造を含むマイクロウェルの割合の定量化。 ２つの異なるＴＧＦｂシグナル伝達阻害剤１μＭ Ａ８３－０１（上）または１μＭ ＳＢ４３１５４２ （下、略称「ＳＢ４３」）とＰＬＬＹを組み合わせた４日間の処理によって形成された芽球様細胞を示す、マイクロウェルアレイの代表的な領域の位相差画像。芽球様細胞構造の収量の定量化。点線は、標準プロトコル（ＰＡＬＬＹを２日間、ＬＹを２日間）での芽球様細胞の収量を表す。ｎ＝３のマイクロウェルアレイ。エラーバー：標準偏差。ＰＬＬＹ：１μＭ ＰＤ０３２５９０１、５００ｎＭ ＬＰＡ、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＬＩＦ、１０μＭ Ｙ－２７６３２。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から、一般に芽球様細胞と呼ばれる胚盤胞様細胞凝集物を形成する方法を含む。生体内の胚盤胞とは対照的に、芽球様細胞は大量に生成することができ、遺伝的スクリーニングおよび薬物スクリーニングに適しているが、人工の胚盤胞様細胞凝集物および芽球様細胞がヒト胚を形成またはヒト胚に発育することができないことを考慮すると、ヒト胚の操作に関連する倫理的懸念の一部が軽減される。

胚盤胞様細胞凝集物および芽球様細胞は、薬剤の安全性／有効性または妊娠初期の治療（たとえば、体外受精の処置および避妊法の改善）等の生物医学的知見にとって重要な可能性を秘めたヒト胚モデルである。

本発明の芽球様細胞は第一軸を形成することができ、そのエピブラストは極性栄養外胚葉の成熟を誘導し、その結果、ホルモン刺激された子宮内膜細胞に特異的に付着する可能性を獲得する。このようなヒト芽球様細胞は、ヒトへの移植および発生を調査するための、正確でスケーラブルで多用途かつ倫理的なモデルである。

本明細書で使用される場合、胚盤胞様細胞凝集物、胚盤胞様構造および芽球様細胞という用語は、真の胚盤胞ではなく胚盤胞をモデル化する本発明の方法によって取得可能な組織を反映するために互換的に使用される。胚盤胞という用語はそのような胚を指す。

芽球様細胞は、生物全体を形成する３つの基礎系統、すなわち栄養外胚葉、エピブラスト、およびハイポブラストを反映する組織の付随的な特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および空間構成を含む、ヒト胚盤胞の三次元形態学的および分子的特徴を再現する。

ヒト胚盤胞の高忠実度かつ高効率モデルは、科学および医学の進歩をサポートするであろう。しかし、その予測能力は、自然な発育ペースに従って胚盤胞の細胞的特異化（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および形態形成の順序を正確に再現する能力に依存する。正確なモデリングにより、胚盤胞期のみを反映した細胞の形成が保証されるだけでなく、着床および着床前後の発生の態様をインビトロで再現することもできる。

本発明はまた、たとえば体外受精（ＩＶＦ）処置中、または妊娠の可能性を改善するために自然妊娠後の患者を治療する際に、着床の確率を改善するために調製するために（ヒト）胚盤胞を処理することについても記載する。このような処理は、ヒトの胎児またはレシピエントの母親を治療するための本質的に医学的または治療的なものであり得る。このような方法に関して、本発明はまた、治療用の化合物（たとえば、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤）または治療に使用するための上記化合物を含む医薬組成物の製造にも関する。ヒト胚そのもの、あるいは産業的または商業的目的でのその使用は、本発明の一部ではない可能性がある。

中心的な態様として、本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む、芽球様細胞または胚盤胞様細胞凝集物を生成する方法を提供する。好ましくは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は栄養膜細胞に囲まれているか、または栄養膜細胞に囲まれるようになる。

本発明によれば、本発明による芽球様細胞の形成は、ｈＰＳＣの三次元凝集物を形成し、ＨＩＰＰＯ経路の活性を調節することを達成し、それが胚－非胚軸の形成とともに、エピブラスト、栄養外胚葉、およびハイポブラスト様細胞の同時特異化（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および三次元自己組織化を引き起こす。したがって、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、芽球様細胞を生成するための本発明の中心的な態様として使用される。

本発明は、ｈＰＳＣからの（ｉ）エピブラスト様細胞、（ｉｉ）栄養外胚葉様細胞、および（ｉｉｉ）ハイポブラスト様細胞の３つの細胞型の同時形成の誘導、ならびにヒト胚盤胞と形態学的かつ分子的に類似した構造へのそれらの自己組織化を初めて提供し、それによって、栄養外胚葉、エピブラスト、およびハイポブラストを反映する、同時の細胞系統の分離、形態形成、および組織の成熟によって制約される３Ｄ形態学的変化を再現する。

結果として生じる芽球様細胞は、たとえばエストロゲン、プロゲステロン、ｃＡＭＰ、およびＷｎｔ阻害剤ＸＡＶ９３９および／またはＬＦ３による刺激により受容性が高められると、インビトロで子宮内膜細胞の層またはインビボで子宮の内膜細胞である子宮内膜と活発に相互作用することができる。胚盤胞と同様に、芽球様細胞の子宮内膜細胞への付着、侵入、および分化は主に極性栄養外胚葉、つまりエピブラスト細胞と隣接する栄養膜を介して起こる。着床すると、芽球様細胞の極性栄養膜が増殖、分化し、臨床妊娠を示すために使用されるホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピンを産生する。

したがって、本発明の方法は、以下の用途に有用である。
１．妊娠初期の理解および管理のための遺伝子スクリーニングおよび薬物スクリーニング；
２．避妊薬および不妊治療薬の開発；
３．体外受精の培養条件の開発；
４．医薬品開発のためのインビトロ毒性／安全性アッセイ；
５．インビトロアッセイおよびインビボ移植のための特定の細胞、組織、および器官のインビトロ形成。

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養する工程を含む。好ましくは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、この方法工程において栄養膜細胞によって取り囲まれるか、またはヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、たとえば、前工程、たとえばＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養する任意の工程であって、ｈＰＳＣの周囲に栄養膜細胞が形成され得る工程を通じて栄養膜細胞によって取り囲まれる。

「ＨＩＰＰＯ経路阻害剤」および「ＨＩＰＰＯ経路アンタゴニスト」という用語は、本明細書では互換的に使用される。この用語は、ＨＩＰＰＯ経路の活性を低下させる化合物を指す。ＨＩＰＰＯ経路はＧｕｍｂｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１４） １２７，７０９－７１７（参照により、本明細書に組み込まれる）でレビューされている。ＨＩＰＰＯ経路は、Ｈｉｐｐｏ－Ｙｅｓ関連タンパク質（ＹＡＰ）が核に移動する能力に対して阻害作用を発揮する。そのような阻害作用の１つは、ＹＡＰのリン酸化によるもので、ＹＡＰが核に入るのを阻害する。したがって、細胞内のＹＡＰリン酸化を防止または低減する化合物は、適切なＨＩＰＰＯ経路阻害剤である。ＨＩＰＰＯ経路を阻害することにより、ＹＡＰに対する阻害が除去または軽減され、核内のＹＡＰの活性が増加し、その結果、通常は細胞増殖が引き起こされる（たとえば、Ｇｕｍｂｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍの図４を参照）。したがって、本発明のＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、ＹＡＰ活性化剤でもあり得、すなわち、核内のＹＡＰ活性の増加をもたらす。したがって、ＨＩＰＰＯ経路阻害はＹＡＰ活性化を含み、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤はＹＡＰ活性化剤を含む。ＹＡＰ活性化の例は、たとえば、ＹＡＰ活性化剤として、ＹＡＰを発現する組換え核酸を使用することなどによる、細胞におけるＹＡＰの過剰発現である。このような核酸は、ＹＡＰ活性化のために、たとえばベクターを使用して細胞に投与することができる。１つのＨｉｐｐｏ経路阻害剤はＸＭＵ－ＭＰ－１であり（Ｔｒｉａｓｔｕｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１９；１７６：３９５６－３９７１）、本発明の芽球様細胞の調製方法および子宮内膜に移植するための芽球様細胞または胚盤胞の調製方法に従って低濃度で使用することが好ましい。ＸＭＵ－ＭＰ－１は、非常に強力なＨｉｐｐｏ経路阻害剤である。培地中のたとえば１μＭ超または約２μＭ以上の大量のＸＭＵ－ＭＰ－１は、栄養外胚葉様細胞の形成を誘導し、限られた数の内部細胞を有する芽球様細胞、または内部細胞を有しない芽球様細胞（いわゆるｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ）を形成するために使用される可能性がある。ＸＭＵ－ＭＰ－１は、ＬＰＡよりも強力で長期にわたる効果を持つＨｉｐｐｏ経路の強力な阻害剤である。その結果、凝集物は大部分が栄養膜を形成し、エピブラスト細胞およびハイポブラスト細胞の形成が犠牲になる。内部細胞を伴う芽球様細胞は、培地中のＸＭＵ－ＭＰ－１の量がより少なく、たとえば約１μＭ以下でも形成される。Ｈｉｐｐｏ経路阻害剤の濃度、Ｈｉｐｐｏ阻害剤への細胞の曝露の長さ、Ｈｉｐｐｏ阻害剤と追加分子の組み合わせ、および初期の細胞数を最適化することで、概して結果を制御することができる。ＸＭＵ－ＭＰ－１はＭＳＴ１／２の阻害剤である。本発明は、子宮内膜細胞に付着したり侵入したりする可能性のないｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ（内部細胞を欠く可能性がある）を生成する方法における、ＸＭＵ－ＭＰ－１またはＭＳＴ１／２阻害剤の使用を提供する －この方法は、インビトロであってもよい；および／または避妊方法におけるものであってもよい。ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅを得るには、十分な量のＸＭＵ－ＭＰ－１、およびＸＭＵ－ＭＰ－１への細胞の曝露時間を使用し、たとえば２μＭ以上で４日以上の曝露を行うことができる。また、避妊薬として使用するためのＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１も提供される。

好ましいＨＩＰＰＯ経路阻害剤はリゾホスファチジン酸受容体（ＬＰＡＲ）のリガンドであり、特に好ましくはリゾホスファチジン酸自体（ＬＰＡ、たとえば１－オレオイルリゾホスファチジン酸）である。さらに好ましいＨＩＰＰＯ経路阻害剤およびリゾホスファチジン酸受容体のリガンドは、ＮＡＥＰＡまたはＯＥＡ－Ｐ（オレオイルエタノールアミドホスフェート）、Ｎ－［２－（ホスホノオキシ）エチル］－９Ｚ－オクタデセンアミドである。これらはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）ミメティックである。ＬＰＡＲのリガンドは、ＬＰＡＲの活性化剤またはアゴニストであってもよい。さらなるまたは代替のＬＰＡリガンドとして、ＬＰＡの任意の誘導体を使用することができる。ＬＰＡの誘導体は、好ましくは式１の化合物である：

式中、Ｒは、Ｃ_８～Ｃ_２４－アルキル、Ｃ_８～Ｃ_２４－アルケニル、またはＣ_８～Ｃ_２４－アルキニルである。好ましくは、Ｒは、Ｃ_９－、Ｃ_１０－、Ｃ_１１－、Ｃ_１２－、Ｃ_１３－、Ｃ_１４－、Ｃ_１５－、Ｃ_１６－、Ｃ_１７－、Ｃ_１８－、Ｃ_１９－、Ｃ_２０－、Ｃ_２１－、Ｃ_２２－、Ｃ_２３－アルケニル、－アルキル、または－アルキニルである。

好ましい化合物は、（２－ヒドロキシ－３－ホスホノオキシプロピル）（Ｚ）－オクタデカ－９－エン酸塩である。

ＬＰＡＲは、好ましくはＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ２、ＬＰＡＲ３、ＬＰＡＲ４、ＬＰＡＲ５、またはＬＰＡＲ６である。特に好ましいＬＰＡＲはＬＰＡＲ２である。

さらなるＬＰＡＲリガンドは、国際公開第２０１４／０３６０３８Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＧＲＩ９７７１４３およびその任意の誘導体である。このようなリガンドは、式２の化合物を含む：

式中、Ａは、

式中、ＲはＨ、または置換もしくは非置換のフェニルであり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６は独立して、Ｈ、ＮＯ_２、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＯＣＨ_３であり；
ＢはＣ_２～Ｃ_８－アルキルまたは－アルケニルである；およびＣは

であり、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＣＨ_３、ＣＯ_２Ｈ、またはフェニルで置換されている。たとえば、化合物は、２－（（９－オキソ－９Ｈ－フルオレン－２－イル）カルバモイル）安息香酸、２－（（３－（１，３－ジオキソ－１Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン－２（３Ｈ）－イル）プロピル）チオ）安息香酸、４，５－ジクロロ－２－（（９－オキソ－９Ｈ－フルオレン－２－イル）カルバモイル）安息香酸または２－（（９，１０－ジオキソ－９，１０－ジヒドロアントラセン－２－イル）カルバモイル）安息香酸であってもよい。

代替または組み合わせ可能なＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、Ｍｓｔ１阻害剤、Ｍｓｔ２阻害剤、またはＭｓｔ１およびＭｓｔ２の組み合わせ阻害剤、たとえば、ＸＭＵ－ＭＰ－１（Ｔｒｉａｓｔｕｔｉ ｅｔ ａｌ．、前出）、またはＬａｔｓキナーゼ阻害剤、たとえば、ＴＲＵＬＩ（Ｋａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， ｂｉｏＲｘｉｖ， ２０２０， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．１１．９４４１５７）であってもよい。Ｌａｔｓキナーゼ阻害剤は、ＬａｔｓキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤であってもよい。ＬａｔｓキナーゼはＹＡＰリン酸化に関与しており（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ、前出）、したがってＬａｔｓ活性の阻害はリン酸化によるＹＡＰ不活化を減少させ、核内のＹＡＰ活性を増加させる。

ＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、ＹＡＰ活性化剤、特にＹＡＰリン酸化を減少または防止する、および／または細胞核へのＹＡＰの侵入を促進するＹＡＰ活性化剤であってもよい。本発明に従って使用するためのさらに好ましいＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、ベルテポルフィンである。

３Ｄ培養は、三次元すべてで組織の発生を可能にする培養である。これとは対照的に、２Ｄ培養では、細胞は表面に付着して増殖するように誘導され、上記表面から離れて増殖することは阻止されるが、そのような増殖は必ずしも排除されるわけではない。２Ｄ培養は、単層、二重層もしくは多層等の細胞層形成および／または二次元細胞増殖を誘導する可能性がある； ３Ｄ培養では通常、全方向への均等な増殖が可能であり、もちろん細胞組織はそれ自体で組織の方向性や軸を発達させることができる。２Ｄ培養における層形成は、重力および／または細胞間または表面への接着によって誘発される可能性がある。２Ｄおよび３Ｄ培養の条件は、表面の種類、２Ｄ培養の場合は付着表面、３Ｄ培養の場合は非付着表面、培地、欠如（２Ｄ）または存在（３Ｄ）、または足場となるゲル構造等の３Ｄマトリックス、たとえばハイドロゲルによって影響を受ける可能性がある。２Ｄ培養物は、付着表面としてフィーダー細胞を含む場合がある。

細胞および組織を増殖させるための培地により、阻害されずに芽球様細胞まで発生することが可能になる。培地は、一つ以上の炭水化物、アミノ酸および塩等の栄養素を含んでもよい。培地の例は、Ｂ２７Ｎ２培地である（Ｓｕｅｎｗｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０，２０１７：３０５）。培地はインスリンを含むことが好ましい。あるいは、または組み合わせて、培地は、ホロトランスフェリン（ｈｏｌｏｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ）、亜セレン酸塩、コルチコステロンまたはプロゲステロン、レチノール、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。このような培地も本発明のキットとともに提供されてもよい。

本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物を提供することを含む。ｈＰＳＣは、栄養外胚葉様組織、エピブラスト様組織、およびハイポブラスト様組織に分化することができる多能性細胞である。接尾辞「様」は、組織がそれぞれ栄養外胚葉、エピブラスト、およびハイポブラストに似ているが、本発明の芽球様細胞は依然として人工構築物であるため、これらの組織は通常、生体内状況においてと同様に発生しないことを示す。しかしながら、本発明の芽球様細胞の「様」組織は、通常、生体内対応物と同様の発現マーカーを発現し、同様に同定することができる。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物は、国際公開第２０１４／１７１８２４ Ａ１号またはＯｋａｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２， ２０１８： ５０－６３（両方とも引用により本明細書に組み込まれる）に開示されているような一般的な技術によって提供することができる。本発明による好ましい方法において、ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物は、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤から選択されるいずれか一つを含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養することによって生成することができる。好ましくは、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤が使用される。好ましくは、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤も使用される。

特に好ましい実施形態では、（上記のような）ＨＩＰＰＯ経路、ＭＥＫ／ＥＲＫ、およびＴＧＦ－βの「三重阻害」が、本発明の芽球様細胞の生成に使用される。特に、本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む。三重阻害では、ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物は、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤を含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養することによって生成されることが好ましく、この段階でＨＩＰＰＯ経路阻害剤も含むことが特にさらに好ましい。

Ｈｉｐｐｏ、ＴＧＦ－β、およびＭＥＫ／ＥＲＫ経路が阻害されたナイーブヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、以下に示すように、胚盤胞発生の順序およびペースに従って、３つの創始系統（＞９７％の栄養外胚葉、エピブラスト、および原始内胚葉）を有する芽球様細胞を効率的に（＞７０％）形成する。

三重阻害により、凝集した細胞の対称性が崩れ、栄養膜シストの片側に付着したまま残る、エピブラストおよび原始内胚葉細胞のユニークな内部クラスターの形成が引き起こされる。直接的な結果として、このユニークな内部クラスターの存在によってシスト内に生じる非対称性は、極性栄養膜の局所的成熟を誘導し、子宮内膜細胞への付着の向きを決定する。したがって、本発明の芽球様細胞は、栄養膜シストの片側に付着した、エピブラストおよび原始内胚葉細胞の局在型の内部クラスターを一つ有する可能性がある。

Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０， ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．０４．９３３８１２に開示されているように、たとえばＭＥＫ阻害剤による、ＭＥＫ（ＥＲＫとも呼ばれる）阻害は、ｈＰＳＣからの栄養膜の形成を誘導するために使用することができる。栄養膜細胞を含む細胞凝集物がすでに提供されている場合は、ＭＥＫ阻害は必要ない。栄養膜細胞が存在しない場合は、ＭＥＫ阻害剤を使用して栄養膜細胞を形成することができる。ＭＥＫ阻害剤はＭＡＰＫ阻害剤、たとえばＳＢ２０２１９０であってもよい。

ＭＥＫ阻害剤は、好ましくはＰＤ０３２５９０１である。ＰＤ０３２５９０１は、式３の化合物であってもよい：

さらなるまたは代替のＭＥＫ阻害剤は、セルメチニブ、ミルダメチニブ、トラメチニブ、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０）、ＰＤ９８０５９、ピマセルチブ（Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）、ＴＡＫ－７３３、ＡＺＤ８３３０（ＡＲ－ＲＹ７０４）、ビニメチニブ、ＰＤ３１８０８８、ＳＬ３２７、レファメチニブ、ＧＤＣ－０６２３（Ｇ－８６８）、コビメチニブから選択することができる。

ＴＧＦ－β阻害剤は、ＴＧＦ－βＩ型受容体の阻害剤であってもよい。ＴＧＦ－β阻害剤は、好ましくはＡ８３－１（Ａ８３－０１、Ａ－８３－０１）である。Ａ８３－１は式４の化合物である：

さらなるまたは代替のＴＧＦ－β阻害剤は、ＳＤ－２０８、ＧＷ７８８３８８、ＳＲＩ－０１１３８１、ＴＰ０４２７７３６、ＲｅｐＳｏｘ（Ｅ－６１６４５２、ＳＪＮ ２５１１）、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＢＩＢＦ－０７７５、ＬＹ ３２００８８２、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、バクトセルチブ（ＴＥＷ－７１９７、ＥＷ－７１９７）、ＬＹ３６４９４７（ＨＴＳ ４６６２８４）、ＳＢ５２５３３４、ＩＴＤ－１、またはＳＢ４３１５４２から選択することができる。ＳＢ４３１５４２が特に好ましい。

凝集したｈＰＳＣ（ｈＰＳＣと栄養膜細胞の凝集物を生成する上記の工程のため）は、ｈＰＳＣを播種し、増殖培地中で培養することによって播種されたｈＰＳＣを凝集させることによって形成することができる。播種されるｈＰＳＣは、解離したｈＰＳＣであることが好ましい。ｈＰＳＣは、たとえば、トリプシン処理により解離する。解離したｈＰＳＣは一つの結合組織に凝集しない。しかしながら、本発明の方法では、後で発生中にそれらを凝集させることができる。

本発明の芽球様細胞形成中に異なる段階および中間体を生成するためのこれらの方法工程は、たとえばｈＰＳＣと栄養膜細胞の凝集物をｉｎ ｓｉｔｕで生成することが望ましい場合、組み合わせることができる。したがって、芽球様細胞は１回の培養でｈＰＳＣから形成される。増殖と栄養供給には同じ基本培地（Ｂ２７Ｎ２等）を使用することができるが、異なる工程では異なる追加の化合物が使用される。本発明の方法は、以下の工程の組み合わせを含むことができる。
（ｉ）ｈＰＳＣを播種し、増殖培地中で培養することにより播種されたｈＰＳＣを凝集させて凝集したｈＰＳＣを形成する工程、
（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤を含む培地中で、凝集したｈＰＳＣを培養して、ｈＰＳＣおよび栄養膜細胞を生成する工程；場合により、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤も工程（ｉｉ）で使用される；
（ｉｉｉ）ｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養して、芽球様細胞または胚盤胞様細胞凝集物を生成する工程。

本発明は、工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせを含むが、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせも含み、後者の場合は、たとえば凝集したｈＰＳＣを提供できる場合（工程（ｉｉｉ）の開始点である周囲の栄養膜細胞なしで）である。

工程（ｉｉｉ）では、ＭＥＫ阻害剤および／またはＴＧＦ－β阻害剤は使用されなくてもよい。工程（ｉ）または工程（ｉｉ）では、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を使用しなくてもよい。また、工程（ｉ）では、代替的に、または組み合わせて、ＭＥＫ阻害剤および／またはＴＧＦ－β阻害剤は使用されなくてもよい。工程（ｉｉ）において、ＴＧＦ－β阻害剤およびＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の使用は、工程（ｉｉｉ）で芽球様細胞を形成するのに十分である。

凝集したｈＰＳＣ（ｈＰＳＣと栄養膜細胞の凝集物を生成する工程）は、好ましくは、ｈＰＳＣを播種し、増殖培地中で０～６４時間、または０～１２時間、または工程（ｉ）の好ましいものとしては、１２～６４時間培養することによって播種されたｈＰＳＣを凝集させることによって形成される。この方法はこの工程なしでも機能するため、播種されたｈＰＳＣの凝集は任意の工程である。工程（ｉ）の好ましい実施形態では、組み合わせ可能または代替として、増殖培地はＲＯＣＫ阻害剤を含む。好ましいＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２（Ｙ－２７６３２）である。さらなるまたは代替のＲＯＣＫ阻害剤は、ＺＩＮＣ００８８１５２４、チアゾビビン、ファスジル、（ＨＡ－１０７７）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＨＯ－１５）、ＲＫＩ－１４４７、アザインドール１（ＴＣ－Ｓ ７００１）、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ（ＧＳＫ２６９９６２Ｂ、ＧＳＫ２６９９６２）、ヒドロキシファスジル （Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ；ＨＡ－１１００）、ネタルスジル（ＡＲ－１３３２４）、リパスジル（Ｋ－１１５）、Ｙ－３９９８３（Ｙ－３３０７５）、ＫＤ０２５（ＳＬｘ－２１１９）から選択してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、播種されたｈＰＳＣの凝集を増加または改善する。

好ましくは、増殖培地中での播種されたｈＰＳＣの培養（たとえば、上述の工程（ｉ））は、容器内で１～２００個のｈＰＳＣ、好ましくは２０～１５０個のｈＰＳＣ、特に好ましくは３０～１２０個のｈＰＳＣ、さらにより好ましくは３０～６０個のｈＰＳＣを播種する工程、および上記播種されたｈＰＳＣを増殖培地中で増殖させる工程を含む。この細胞数は、後の工程での最適な芽球様細胞形成につながる。

好ましい実施形態では、播種されたｈＰＳＣの処理および／または増殖は、２Ｄ培養環境で行われているか、または行われる（ｉｓ ｏｒ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｏｎｅ）。２Ｄ培養は、前述のように二次元の細胞増殖を引き起こす可能性がある。

好ましくは、２Ｄ培養中（３Ｄ培養前）のｈＰＳＣは、たとえばＧｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１７， ｄｏｉ： １０．１２４２／ｄｅｖ．１４６８１１に記載されているように、ＭＥＫ阻害剤および／またはＰＫＣ阻害剤で処理されている。Ｗｎｔ阻害剤およびＳＴＡＴ活性化剤はまた、組み合わせて、または上記のように代替的に使用することもできる。

好ましい実施形態では、ＰＫＣ阻害剤は、Ｇｏｅ６９８３（ＧＯＥ６９８３）およびＲｏ－３１－８４２５、またはそれらの組み合わせから選択される。さらなるまたは代替のＰＫＣ阻害剤は、エンザスタウリン（ＬＹ３１７６１５）、ソトラスタウリン（ＡＥＢ０７１）、ミトキサントロン（ＮＳＣ－３０１７３９）、スタウロスポリン（ＣＧＰ ４１２５１）、ビスインドリルマレイミドＩ（ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＧＯ ６８５０）、ビスインドリルマレイミドＩＸ（Ｒｏ ３１－８２２０）、ＬＸＳ－１９６ （ＩＤＥ－１９６）、ＶＴＸ－２７、ミドスタウリン（ｐｋｃ４１２、ＣＧＰ ４１２５１）、チェレリスリン、Ｇｏ６９７６ （ＰＤ４０６９７６）、ＣＲＴ０１０３３９０から選択してもよい。

好ましい実施形態では、２Ｄ培養ｈＰＳＣはさらに、Ｗｎｔ阻害剤および／またはＳＴＡＴアゴニストで処理されているか、またはそれらで処理される（ｉｓ ｏｒ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ）。このような処理により、よりナイーブなｈＰＳＣまたは基底状態のｈＰＳＣが生成される。このようなナイーブまたは基底状態のｈＳＰＣは、好ましくは、工程（ｉ）の本発明の方法においてｈＰＳＣとして使用される。よりナイーブなまたは基底状態のｈＰＳＣを生成するためのこのような処理は、たとえばＴａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １５８（６），２０１４：１２５４－１２６９または国際公開第２０１６／０２７０９９ Ａ２号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＳＴＡＴアゴニストは、好ましくはＳＴＡＴ３アゴニスト、たとえば、ＬＩＦである。

Ｗｎｔ阻害剤の例はＸＡＶ９３９である。ＸＡＶ９３９は、式（５）の化合物であってもよい：

さらなるまたは代替のＷｎｔ阻害剤は、ＬＦ３、ＰＫＦ１１８－３１０、Ｗｎｔ３Ａ、Ａｄａｖｉｖｉｎｔ （ＳＭ０４６９０）、ＣＣＴ２５１５４５、ＰＮＵ－７５６５４、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ｉＣＲＴ３、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、ＸＡＶ－９３９ （ＮＶＰ－ＸＡＶ９３９）、ＬＧＫ－９７４ （ＮＶＰ－ＬＧＫ９７４、ＷＮＴ９７４）、ＭＳＡＢ、ＫＹＡ１７９７Ｋ、ＪＷ５５、またはそれらの組み合わせから選択してもよい。ＬＦ３および／またはＸＡＶ９３９が特に好ましい。本発明のすべての実施形態にとって特に好ましいＷｎｔ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＰＮＵ７４６５４、およびＬＦ３である。

特に好ましい実施形態では、ｈＰＳＣは、たとえばＧｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１７， ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１４６８１１およびＴａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されているように、ＭＥＫ、Ｗｎｔ、ＰＫＣの阻害剤、およびＳＴＡＴに対する阻害剤（ａｇａｉｎｓｔ）またはＳＴＡＴの活性化剤（たとえば、ＬＩＦ）を含む培地中で前処理してもよい。ＰＸＧＬと呼ばれる培地は、ｈＰＳＣをよりナイーブな状態に維持する。このよりナイーブな状態により、芽球様細胞形成が改善される。ｈＰＳＣをナイーブにするための多くの培養条件は当技術分野で知られており、たとえば国際公開第２０１６／０２７０９９ Ａ２号に記載されている通り、本発明に従って使用することができる。

好ましい実施形態では、凝集した細胞（たとえば、上述の工程（ｉｉ））は、少なくとも１日間、好ましくは少なくとも２日間培養される。

上記の実施形態は好ましくは組み合わされ、たとえば一例において、ｈＰＳＣから開始する培養は、細胞を少なくとも５日間培養することを含む：最初の０～２４時間または初日は、小分子阻害剤を含まない（ＭＥＫ阻害剤（たとえばＰＤ０３２５９０１）、ＴＧＦ－β阻害剤（たとえば、Ａ８３－０１）、ＳＴＡＴの活性化剤（たとえば、ＬＩＦ）、およびＨＩＰＰＯ経路阻害剤（たとえば、ＬＰＡ）を含まない）培地中で行われる（細胞の凝集を促進するＲＯＣＫ阻害剤、たとえばＹ２７６３２を除く）これは工程（ｉ）の例であり、工程（ｉ）について上記で述べたことはすべてここにも当てはまる。０～２４時間の間、または２日目に、ＭＥＫ阻害剤（例：ＰＤ０３２５９０１）、ＴＧＦ－β阻害剤（例：Ａ８３－０１）、ＳＴＡＴの活性化剤（例：ＬＩＦ）、ＲＯＣＫ経路阻害剤、およびＨＩＰＰＯ経路阻害剤（例：ＬＰＡ）での処理が開始される。これは工程（ｉｉ）の例であり、工程（ｉｉ）について上記で述べたことはすべてここにも当てはまる。同じ培地を３日目に使用する（工程（ｉｉ））。４日目に、細胞／凝集物を、議論された小分子阻害剤のうちのＲＯＣＫ経路阻害剤およびＨＩＰＰＯ経路阻害剤（たとえば、ＬＰＡ）のみを含む培地中で培養する。たとえば、ＭＥＫ阻害剤（たとえば、ＰＤ０３２５９０１）、ＴＧＦ－β阻害剤（たとえば、Ａ８３－０１）、ＳＴＡＴの活性化剤（たとえば、ＬＩＦ）はもう使用されない。これは工程（ｉｉｉ）の例であり、工程（ｉｉｉ）について上記で述べたことはすべてここにも当てはまる。通常、芽球様細胞は５日目に完全に形成される。この方法は、たとえば、体外受精で生じた胚盤胞の発生を促進するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／または。妊娠の最初の数週間の妊孕性を高める方法において使用することができる。Ｈｉｐｐｏ阻害剤、好ましくはＬＰＡまたはＮＡＥＰＡは、胚盤胞の発生および可能性を増強するために使用することができる。また、妊孕性増強剤として使用するための、Ｈｉｐｐｏ阻害剤、好ましくはＬＰＡまたはＮＡＥＰＡも提供される。Ｈｉｐｐｏ阻害剤、好ましくはＬＰＡまたはＮＡＥＰＡは、受胎後１～１２日、好ましくは受胎後２～９日、特に好ましくは受胎後３～７日で患者に投与することができる。

増殖条件を変更することにより、各工程の好ましい時間は変化する可能性がある。好ましい実施形態では、工程（ｉ）は１８～４８時間である；好ましくは、工程（ｉｉ）は３６～９２時間である；好ましくは、工程（ｉｉｉ）は１８～４８時間である。これらの時間は、ステップ（ｉ）またはステップ（ｉ）および（ｉｉ）が行われない場合、たとえば、凝集したｈＰＳＣ、またはｈＰＳＣと栄養膜細胞の凝集物が開始点として使用される場合の好ましい実施形態でもある。

ｈＰＳＣ（ヒト多能性幹細胞）は、好ましくはヒト全能性細胞ではない、すなわち、ヒト胚ではない。

ｈＰＳＣは任意の細胞株由来のものであってもよい。 好ましくは、細胞株は、ｈＥＳＣ Ｈ９、Ｓｈｅｆ６、ＨＮＥＳ１、ｈｉＰＳＣ ｃＲ－ＮＣＲＭ２、およびｈｉＰＳＣ ｎｉＰＳＣ１６．２．ｂから選択される。

好ましくは、独立して選択された細胞、凝集したｈＰＳＣＳ、またはｈＰＳＣと栄養膜細胞の凝集物は、マイクロウェルに播種または配置される。マイクロウェルは細胞数を制御するために使用される場合がある。マイクロウェルは、複数の平行した芽球様細胞形成を可能にするアレイ状であってもよい。好ましくは、少なくとも２個、たとえば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上、たとえば５０個以上の芽球様細胞が、本発明の方法によって並行して作成される。

好ましくは、３Ｄ培養、たとえば、ｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の凝集物の培養は、非接着容器内で培養することによって、好ましくはマイクロウェル内で培養することによって行われ、特に好ましくはヒドロゲルで作られた非接着表面を含むマイクロウェルによって行われる。

好ましい実施形態では、３Ｄ培養における培養、特にｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の凝集物の培養（上述の工程（ｉｉｉ）等）のための培地、および／または凝集したｈＰＳＣの培養（上述の工程（ｉｉ）等）のための培地は、ＳＴＡＴ３アゴニストをさらに含む。ＳＴＡＴ３アゴニストは、好ましくは白血病阻害因子（ＬＩＦ）である。ＬＩＦは、好ましくはヒトＬＩＦである。

好ましい実施形態では、ｈＰＳＣおよび栄養膜（たとえば、上記の工程（ｉｉｉ））は、少なくとも１６時間、好ましくは少なくとも２０時間、さらにより好ましくは少なくとも１日間、可能であれば少なくとも２日間培養される。

好ましくは、細胞、特にｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の培養は、少なくともｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物から栄養外胚葉様組織、エピブラスト様組織、およびハイポブラスト様組織が形成されるまでである。あるいは、または組み合わせて、培養は、少なくとも胚－非胚軸が形成されるまで行うことができる。

あるいは、細胞、特にｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の培養は、栄養膜の形成を促進し、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の形成または維持を妨げるＭＳＴ１／２阻害剤ＸＭＵ－ＭＰ－１の存在下で行われ、十分な濃度のＸＭＵ－ＭＰ－１が含まれている場合、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞のより小さな内部クラスターを含むか、またはエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の内部クラスターを含まない栄養膜シストが形成されるまで行われる。これらの栄養膜シストは、ＸＭＵ－ＭＰ－１－Ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅと呼ばれる。

本発明は、ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ（内部細胞を欠いている可能性がある）を生成する方法におけるＸＭＵ－ＭＰ－１またはＭＳＴ１／２阻害剤の使用を提供する－ この方法はインビトロでもよい；および／または避妊法における方法であってもよい。ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１は、避妊のために使用することができる。また、避妊薬として使用するためのＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１も提供される。ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１は、受胎後１～９日、好ましくは受胎後２～７日、特に好ましくは受胎後３～６日で患者に投与することができる。

あるいは、細胞、特にｈＰＳＣおよび栄養膜細胞の培養は、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の内部クラスターを含まない、または減少した数のエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む養膜シストが形成されるまで、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の形成および維持を妨げるＳＴＡＴ阻害剤ＳＣ１４４の存在下で行われる。これらの栄養膜シストは、ＳＣ１４４－Ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅと呼ばれる。上述のように、ＳＴＡＴアゴニストは、本発明の方法の特定の工程で使用することができる。内部細胞による芽球様細胞形成を防止または制限するには、ＳＣ１４４等のＳＴＡＴ阻害剤を使用することができる。ＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４は、避妊のために使用することができる。避妊薬として使用するためのＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４も提供される。ＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４は、受胎後１～９日、好ましくは受胎後２～７日、特に好ましくは受胎後３～６日で患者に投与することができる。

栄養膜は、胚盤胞または芽球様細胞の外層を形成する細胞であり、生体内では胎盤の大部分に発達する。栄養外胚葉という用語は、胚盤胞の外層を形成する上皮嚢胞組織（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｙｓｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）を指す。芽球様細胞においては、外側の組織がこのような栄養外胚葉に似ており、栄養外胚葉様組織と呼ばれる。

エピブラストは、哺乳動物の胚盤胞の内部細胞塊から生じる２つの異なる層のうちの１つである。原腸形成中に、外胚葉、中胚葉、内胚葉という３つの主要な胚葉への分化を通じて、胚そのものを導き出す。芽球様細胞では、このようなエピブラストに似た内部組織が発達しており、エピブラスト様組織と呼ばれる。

ハイポブラストは、哺乳動物の胚盤胞の内部細胞塊から生じる２つの異なる層のうちの１つである。ハイポブラストは卵黄嚢を生じ、次に卵黄嚢は絨毛膜を生じる。芽球様細胞では、このようなハイポブラストに似た内部組織が発達しており、ハイポブラスト様組織と呼ばれる。

エピブラスト様細胞、栄養膜様細胞、およびハイポブラスト様細胞の発現パターンは、図９ｄに示すようにクラスター化されている。エピブラスト様細胞の発現マーカーは、たとえば、ＴＤＧＦ１、ＧＤＦ３、ＳＵＳＤ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＲＤＭ１４、ＤＰＰＡ４、および／またはＤＮＭＴ３Ｌである。栄養膜様細胞の発現マーカーは、たとえば、ＫＲＴ１９、ＣＬＤＮ４、ＧＡＴＡ２、ＫＲＴ１８、および／またはＨＡＮＤ１である。ハイポブラスト様細胞の発現マーカーは、たとえばＰＤＧＦＲＡ、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＧＡＴＡ６および／またはＬＡＭＡ１である。遺伝子名および遺伝子記号は、HUGO 遺伝子命名委員会（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｎａｍｅｓ．ｏｒｇ）によって規定されている遺伝子のものである。発現パターンは、たとえばｍＲＮＡ発現を測定することによって決定することができる。

胚－非胚軸の形成は、エピブラスト／ハイポブラストの内部凝集物を並置する栄養膜を介した胚盤胞および芽球様細胞移植として好ましい実施形態である。これらのいわゆる極性栄養膜は、ＮＲ２Ｆ２＋および／またはＣＣＲ７＋の発現を特徴とする。好ましくは、本発明の芽球様細胞は、ＮＲ２Ｆ２＋および／またはＣＣＲ７＋を発現する極性栄養膜を含む。

好ましくは、細胞、特にｈＰＳＣおよび栄養膜細胞は、少なくとも全径が少なくとも１００μｍ、好ましくは少なくとも１４０μｍ、さらにより好ましくは１８０μｍ～２２０μｍの三次元細胞凝集物が、一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層によって形成されるまで培養される。本発明の芽球様細胞は、これらの特性のいずれかまたはすべてを含み得る。

さらなる実施形態では、本発明の方法によって生成された芽球様細胞は、子宮内膜細胞の層上に播種してもよい。播種は、好ましくはインビトロで行われる。芽球様細胞は、子宮内膜細胞の層の中または上に移植することができる。この着床は、人為的に阻害されない限り、芽球様細胞が自ら行うことができるプロセスである。

子宮内膜細胞の層は単層であってもよい。

好ましくは、体外受精法における子宮内膜細胞または子宮内膜は、エストロゲン、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール、１７α－エチニルエストラジオール、メストラノール、プロゲステロン、プロゲスチン、ｃＡＭＰ、およびＷｎｔ阻害剤（好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２（ＩＷＰ－２とも呼ばれる）、ＰＮＵ－７４６５４、およびＬＦ３）から選択される化合物で処理されている。このような処理は、子宮内膜細胞内または子宮内膜細胞上への芽球様細胞または胚盤胞の着床に対する受容性（ｒｅｃｅｐｔｉｖｅｎｅｓｓ）を改善する。特に好ましいのは、Ｗｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、または上記のＷｎｔ阻害剤のいずれかによる治療である。Ｗｎｔ阻害剤によるによるこの治療法は、エストロゲン、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール、１７α－エチニルエストラジオール、メストラノール、プロゲステロン、プロゲスチンおよび／またはｃＡＭＰによる治療と組み合わせることができる。

特に好ましいのは、芽球様細胞または胚盤胞の移植のための体外受精の過程で子宮の子宮内膜細胞の層または子宮内膜を調製するためのＷｎｔの阻害である。それは、子宮内膜細胞または子宮内膜の着床に対する受容性を高める。

子宮内膜細胞の層への芽球様細胞の播種は、着床の品質、有効性、および／または阻害に対する影響を研究するために使用することができる。一般に、本発明の方法の任意の段階を使用して、胚盤胞発生のモデルとして、または胚盤胞、あるいは能力もしくは特性のモデルとして、芽球様細胞の発生もしくは能力もしくは特性を研究することができる。

本発明の方法は、芽球様細胞形成および／または子宮内膜細胞層への芽球様細胞の移植に影響を及ぼす候補化合物および／または候補遺伝子変異、および／または温度等の環境影響を試験またはスクリーニングするために使用することができる。このような方法は、凝集物を少なくとも一つの候補化合物で処理すること、および／または凝集物に少なくとも一つの候補遺伝子改変を与えること、および本発明の方法を実施することを含んでもよい。この方法の効果は、対照比較として、それぞれ少なくとも一つの候補化合物および／または少なくとも一つの候補遺伝子変異および／または変化した環境影響を含まない方法と比較することができる。それ以外の場合、少なくとも一つの候補化合物および／または少なくとも一つの候補遺伝子変異および／または環境影響のみの効果を評価するために、対照比較は対照に一般的であるのと同様に実行される。

移植が成功し、その後の発生が起こるためには、栄養膜シストの両側に別個の組織（極性栄養膜および壁性栄養膜細胞）が形成される。これらの組織は、子宮内膜および子宮組織との相互作用中に異なる役割（たとえば、接着、増殖の誘導）を果たしていると考えられている。したがって、ヒト胚盤胞は極組織（ｐｏｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ）を介して移植される。本発明の方法は、これらの異なる組織の発生およびそれによる着床を研究するために使用することができる。候補化合物および／または候補遺伝子変異および／または環境影響は、それらがこの組織形成またはその着床に影響を与える場合に研究することができる。

着床が成功し、その後の発生が起こるために、エピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の内側のクラスターが、外側の栄養膜を誘導する分子を分泌する。これらの分子誘導は、栄養膜に子宮内膜および子宮組織と相互作用する能力を与えるために、様々な役割（たとえば、増殖、分化、機械的作用）を果たしていると考えられている。したがって、ヒト胚盤胞は極組織を介して移植される。本発明の方法は、栄養膜に子宮内膜および子宮組織との相互作用を与える際の分子誘導因子の役割を研究するために使用することができる。候補分子誘導物質および／または候補遺伝子変異および／または環境影響は、それらがこれらの分子誘導物質および栄養膜またはその移植に対するそれらの効果に影響を与える場合に研究することができる。

本発明はまた、本発明の方法により取得可能な芽球様細胞も提供する。本発明は、少なくとも一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層を含む芽球様細胞を提供し、ここで該外側上皮単層は、ＮＲ２Ｆ２を発現する極性栄養膜（ｐｏｌａｒ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）を含む。上述の特性、細胞型、組織型のいずれも、液体で満たされた空洞等の本発明の芽球様細胞の一部であってもよく、固定化された細胞がなくてもよい。それはまた、播種された細胞を含まなくてもよく、あるいは播種された細胞を含んでもよい。

本発明はさらに、芽球様細胞の培養に適したキットを提供する。上述の任意の成分またはそれらの組み合わせがキットに含まれていてもよい。キットは、好ましくは、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および／またはＴＧＦ－β阻害剤を含んでもよい。これらの化合物は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用の培地中で組み合わせることが好ましい。化合物は、上記のいずれの工程でも使用することができる。キットは、好ましくは、Ｗｎｔ阻害剤、たとえばＸＡＶ－９３９をさらに含む。上述の阻害剤のいずれも使用することができ、示された好ましい阻害剤も本発明のキットに好ましい。特に好ましいＨＩＰＰＯ経路阻害剤はＬＰＡである。

キットは、それぞれＭＥＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、およびＴＧＦ－β阻害剤の好ましい例として、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、Ｇｏ６９８３（ＰＫＣ阻害剤）、ＸＡＶ－９３９（Ｗｎｔ阻害剤）、Ａ８３－０１（ＴＧＦ－β阻害剤）、またはそれらの組み合わせから選択される任意の化合物を含み得る。

キットはまた、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでもよい。

キットはまた、ＬＩＦ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、またはそれらの組み合わせから選択される任意の増殖因子を含んでもよい。ＬＩＦは、上述のように使用してもよい。ＩＧＦ－１および／またはＩＬ－６および／またはＩＬ－１１および／またはＦＧＦ２および／またはＦＧＦ４は、段階（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、またはそれらの組み合わせのいずれか一つにおいて、本発明の培地における凝集細胞の増殖を改善するために使用してもよい。

キットには、上記のような培地も記載していてもよい。特に好ましくは、キットはインスリンを含む。

上で論じたように、本発明は、Ｗｎｔ阻害剤の使用により、子宮内膜細胞の層への芽球様細胞の着床が改善されることを示した。したがって、本発明は、芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層に着床する可能性を増大させるインビトロの方法を提供し、この方法は、該芽球様細胞または胚盤胞をＷｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９で処理する工程、および該芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層と接触させる工程を含む。この方法はまた、上記と同様の少なくとも一つの候補化合物および／または少なくとも一つの候補遺伝子変異および／または環境影響を試験して、着床時、または着床後の芽球様細胞の発生、または着床後の子宮内膜細胞に対するそれらの影響を、たとえば少なくとも一つの候補化合物および／または少なくとも一つの候補遺伝子変異および／または環境影響等を含まない対照と比較して試験するために使用することもできる。

Ｗｎｔ阻害剤の使用による改善は、体外受精（ＩＶＦ）法の際に、生体内および／またはインビトロで使用することもできる。

Ｗｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させることを含む、体外受精中の胚盤胞着床の確率を増加させる方法において使用するためのＷｎｔ阻害剤が提供される；好ましくはここで、子宮内膜は局所的に、全身的に、または胚盤胞と一緒にＷｎｔ阻害剤と接触される。これに関連して、本発明は、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程を含む、体外受精中の胚盤胞着床の確率を高める方法を提供する。また、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程を含む、体外受精中の胚盤胞着床を媒介するための医薬組成物を製造するためのＷｎｔ阻害剤の使用も提供される。

体外受精は子宮内膜と胚を接触させることを含んでおり、胚はインビトロで胚盤胞期まで成長している可能性がある。インビトロでの成長中、または胚盤胞と子宮内膜との接触中もしくは接触直後に、着床の確率を高めるために胚盤胞または子宮内膜にＷｎｔ阻害剤が投与される。

また、議論されたＨＩＰＰＯ経路阻害剤は、芽球様細胞に関して上で議論されたのと同様に、体外受精または妊娠の確率を改善する。体外受精の場合、妊娠の確率を高めるため、または一般的に胚盤胞の調製のため、上記胚盤胞または任意のその前の段階、たとえば１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚をＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理することができる。本発明は、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で、特に好ましくはＮＡＥＰＡまたはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンドで、さらにより好ましくはＬＰＡで、処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚を、より可能性のある（ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ）もしくはより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む、体外受精に適した、または妊娠の確率を高めるのに適した胚盤胞を作製する方法に使用するためのＨＩＰＰＯ経路阻害剤を提供する。それに関して、本発明は、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を、可能性のある（ｐｏｔｅｎｔ）もしくは成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、または胚盤胞期の胚を、より可能性のある（ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ）もしくはより成熟した胚盤胞期まで成長させる工程を含む、初期段階で胚を処理することを含む、体外受精に適した、または妊娠の確率を高めるのに適した胚盤胞を作製する方法を提供する。また、体外受精に適した、または妊娠の確率を増大させるのに適した胚盤胞を生成するための医薬組成物を製造するためのＨＩＰＰＯ経路阻害剤の使用であって、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を、可能性のある（ｐｏｔｅｎｔ）もしくは成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、または胚盤胞期の胚を、より可能性のある（ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ）もしくはより成熟した胚盤胞期まで成長させる工程を含む、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤の使用も提供される。たとえば、Ｈｉｐｐｏ阻害剤は、たとえば受胎後数日かつ着床前（たとえば０～１２日目、または１～１２日目、好ましくは６～９日目）にＨＩＰＰＯ経路阻害剤を服用することにより、子宮内での胚盤胞の発育を改善することにより妊娠の確率を高めるために患者が使用することができる可能性がある。上述したように、妊娠の確率を高めるために、Ｈｉｐｐｏ阻害剤、好ましくはＬＰＡまたはＮＡＥＰＡを、受胎後０～１２日目、好ましくは受胎後２～９日、特に好ましくは受胎後３～７日で患者に投与することができる。妊娠の確率は、本発明に従って胚盤胞の発育を促進することによって増大し、これにより、より高い着床能力を発達させ、従って、妊娠に至る可能性がある。Ｈｉｐｐｏ阻害剤は子宮内に投与してもよい。

前段落の代替として、またはそれに追加して、芽球様細胞の上清または培養物は、体外受精処置に適した、または体外受精処置中に、または妊娠の確率を高めるのに適した胚盤胞を作製するこの方法において、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤の代わりにまたはそれに追加して使用することができる。欧州特許公開第２４７１５３８ Ａ１号に示されているように、胚盤胞培養上清はＬＰＡを生成することにより胚盤胞移植における妊娠を促進し、同様のことが芽球様細胞上清でも可能である。したがって、本発明はまた、体外受精処置に適した、または妊娠の確率を増大させるのに適した胚盤胞を作製する方法において使用するための、本発明の芽球様細胞の培養上清を提供し、ここでこの方法は１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を、成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で、特に好ましくはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンドで、さらにより好ましくはＬＰＡで、処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、または胚盤胞期の胚を、より成熟した胚盤胞期まで成長させる工程を含む。さらに提供されるのは、芽球様細胞培養上清を使用して体外受精を目的とした胚盤胞を培養する、または体外受精のために芽球様細胞培地上清を子宮腔内に移す、または体外受精によってであれ、自然妊娠の確率を高めるためであれ、妊娠の確率を高めるための方法である。胚盤胞は、上記子宮に移植され、子宮腔内の芽球様細胞培地上清またはその成分と接触することができる。芽球様細胞の上清または培養物は、受胎後１～１２日、好ましくは受胎（卵細胞の受精）後２～９日、特に好ましくは受胎後３～７日後に患者に投与することができ、妊娠の確率を増大させる。妊娠の確率は、本発明に従って胚盤胞の発育を促進することによって増大し、これにより、より高い着床能力を発達させ、従って、妊娠に至る可能性がある。芽球様細胞の上清または培養物を子宮に投与してもよい。

また、本発明の芽球様細胞を培養する工程、および培養物、好ましくは培養物の上清から上記ＬＰＡを収集する工程を含む、ＬＰＡの製造方法も提供される。本発明の芽球様細胞は、欧州特許公開第２４７１５３８ Ａ１号に記載されているＬＰＡ産生胚盤胞と同様の特性を有するため、欧州特許公開第２４７１５３８ Ａ１号に胚盤胞について記載されているのと同じ使用が本発明の芽球様細胞で可能である。

生成されるＬＰＡは、ＬＰＡ－Ｃ１６：０、ＬＰＡ－Ｃ１６：１、ＬＰＡ－Ｃ１８：０、ＬＰＡ－Ｃ１８：１、ＬＰＡ－Ｃ１８：２、またはそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。これらのＬＰＡのいずれも、本発明のＨＩＰＰＯ経路阻害剤として使用することができる。

Ｗｎｔ阻害剤またはＨｉｐｐｏ経路阻害剤等の本明細書に記載の任意の活性薬剤は、たとえば、（１）インビボでおよび全身的に、または（２）子宮への移植前に胚を活性薬剤に曝露することによってインビトロで、または（３）子宮移植の際に分子を胚と同時移植することにより、子宮内で投与することができる。全身投与は、たとえば、経口的（たとえば、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、錠剤、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、トローチ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、丸剤、ガム、散剤、または飲料液剤（ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））、非経口的（たとえば、注射、たとえば静脈内、または経皮パッチとして）であってもよい。芽球様細胞の上清または培養物は、好ましくは、（２）子宮への移植前に胚を活性薬剤に曝露することによってインビトロで、または（３）子宮移植時に分子を胚と同時移植することによって子宮内で投与される。

投与は、医薬担体、賦形剤、ベクター、添加剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか一つを含む製剤中で行うことができる。「担体」という用語は、希釈剤を指し、たとえば、水、生理食塩水、賦形剤、またはビヒクルであり、これらと一緒に組成物を投与することができる。固体または流体組成物の場合、医薬組成物中の担体または添加剤は、ＳｉＯ_２、ＴｉＯ_２、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物、アルギン酸、 トウモロコシ（コーン）デンプン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム等の潤滑剤または界面活性剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースおよびサッカリン等の甘味料を含んでもよい。好ましくは、製剤は、たとえばクエン酸、酢酸、フマル酸、塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸、酒石酸、またはそれらの組み合わせから選択される緩衝剤またはｐＨ調整剤を含む。

「より可能性のある、またはより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｏｒ ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）」という表現は、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤による発生および成熟の改善を指す。この改善は、本発明に従って使用されるＨＩＰＰＯ経路阻害剤の欠如を除き、同じ条件下で維持または増殖された対照または比較としての胚盤胞に対するものである。

以下の番号が付けられた実施形態は、本発明によれば好ましいものである。
１．ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および栄養膜細胞の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む、芽球様細胞または胚盤胞様細胞凝集物を生成する方法。
２．ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物が、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤、好ましくはＨＩＰＰＯ経路阻害剤も含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養することによって生成される、１に記載の方法。
３．凝集したｈＰＳＣが、ｈＰＳＣを播種すること、増殖培地中で培養すること、好ましくは０～６４時間、または１２～６４時間増殖培地中で培養することによって播種されたｈＰＳＣを凝集させることによって形成される、および／または好ましくは、ここで増殖培地はＲＯＣＫ阻害剤を含み、特に好ましくはＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である、２に記載の方法。
４．播種されたｈＰＳＣが、３Ｄ培養の前に、好ましくは２Ｄ培養中に、ＭＥＫ阻害剤および／またはＰＫＣ阻害剤で処理されており、好ましくはＷｎｔ阻害剤および／またはＳＴＡＴアゴニストをさらに含み、好ましくはここで処理は２Ｄ培養中である、３に記載の方法。
５．ＰＫＣ阻害剤がＧｏｅ６９８３およびＲｏ－３１－８４２５から選択される、４に記載の方法。
６．ＨＩＰＰＯ経路阻害剤が、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンド、好ましくはＬＰＡおよび／またはＮＡＥＰＡ、またはベルテポルフィンである；および／またはＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１である；および／またはＴＧＦ－β阻害剤はＡ８３－１またはＳＢ４３１５４２である、１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．実施形態２に記載の３Ｄ培養で培養するための培地および/または凝集したｈＰＳＣを培養するための培地が、ＳＴＡＴ３アゴニスト、好ましくは白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む、１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．３Ｄ培養が、非付着性容器内で培養することにより、好ましくはマイクロウェル内で培養することにより、特に好ましくはヒドロゲルで作られた非付着性表面を含むマイクロウェル内で培養することによる、１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．実施形態３の増殖培地中でのｈＰＳＣの培養が、１～２００個のｈＰＳＣ、好ましくは２０～１５０個のｈＰＳＣ、特に好ましくは３０～１２０個のｈＰＳＣ、さらにより好ましくは３０～６０個のｈＰＳＣを容器内に入れ、上記播種したｈＰＳＣを増殖培地中で増殖させることを含む、３～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ｈＰＳＣおよび栄養膜を少なくとも１日間、好ましくは少なくとも２日間培養する、１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．実施形態２に記載の凝集細胞を少なくとも１日間、好ましくは少なくとも２日間培養する、２～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物から少なくとも栄養外胚葉様組織、エピブラスト様組織、およびハイポブラスト様組織が形成されるまで、好ましくはさらに少なくとも胚-非胚軸が形成されるまで細胞を培養することを含む、１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層によって形成される、全径が少なくとも１００μｍ、好ましくは少なくとも１４０μｍ、さらにより好ましくは１８０μｍ～２２０μｍの三次元細胞凝集物が形成されるまで細胞を培養することを含む、１～１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．芽球様細胞を子宮内膜細胞上に播種する工程、および芽球様細胞を子宮内膜細胞内または子宮内膜細胞上に着床させる工程をさらに含む、１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．子宮内膜細胞が、エストロゲン、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール、１７α－エチニルエストラジオール、メストラノール、プロゲステロン、プロゲスチン、ｃＡＭＰ、およびＷｎｔ阻害剤（好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、および／またはＬＦ３）から選択される化合物で処理されている、１４記載の方法。
１６．少なくとも一つの候補化合物で処理する工程、および／または少なくとも一つの候補遺伝子改変を有する凝集物を提供する工程、および実施形態１～１５のいずれか一つに記載の方法を実施する工程を含む、芽球様細胞形成および／または子宮内膜細胞の層への芽球様細胞の移植に影響を与える候補化合物および／または候補遺伝子変異を試験またはスクリーニングするための、１～１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．ＨＩＰＰＯ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ－β阻害剤を含む、芽球様細胞の培養に適したキット；好ましくはヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用の培地に組み込まれている。
１８．１～１６のいずれか一つに記載の方法により得られる芽球様細胞。
１９．少なくとも一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層を含み、ここで、該外側上皮単層は、ＮＲ２Ｆ２を発現する極性栄養膜（ｐｏｌａｒ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）を含む、芽球様細胞。
２０．芽球様細胞または胚盤胞をＷｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、および／またはＬＦ３で処理する工程、および該芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層と接触させる工程を含む、芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層に移植する潜在能力を増大させるインビトロ法。
２１．たとえば体外受精中または自然妊娠中に、胚盤胞着床の確率を増大させる方法において使用するためのＷｎｔ阻害剤であって、Ｗｎｔ阻害剤の存在下で胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程、または胚盤胞の非存在下で子宮内膜細胞をＷｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、および／またはＬＦ３で刺激する工程を含むＷｎｔ阻害剤；ここで好ましくは、子宮内膜は局所的に、全身的に、または胚盤胞と一緒にＷｎｔ阻害剤と接触される、Ｗｎｔ阻害剤。
２２．体外受精に適した、または妊娠の確率を増大させるのに適した胚盤胞を作製する方法において使用するためのＨＩＰＰＯ経路阻害剤であって、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で、特に好ましくはＮＡＥＰＡまたはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンドで、さらにより好ましくはＬＰＡで、処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む、使用のためのＨＩＰＰＯ経路阻害剤。
２３．体外受精に適した、または妊娠の確率を増加させるのに適した胚盤胞を作製する方法において使用するための、実施形態１８または１９に記載の芽球様細胞の培養上清であって、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、芽球様細胞の培養由来の上清で処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期まで成長させる工程を含む、芽球様細胞の培養上清。
２４．実施形態１８または１９に記載の芽球様細胞を培養し、培養物、好ましくは培養上清から上記ＬＰＡを収集することを含む、ＬＰＡを産生する方法。
２５．ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４の存在下でｈＰＳＣを培養する工程を含む、ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅを形成する方法。
２６．実施形態１から１６のいずれか一つに記載のようにさらに実行される、２５に記載の方法。
２７．ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４を患者に投与すること、および／または胚にインビボでＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４を接触させることを含む、避妊方法。
２８．ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４が、受胎後１～９日後、好ましくは受胎後２～７日後、特に好ましくは受胎後３～６日後に患者に投与される、２７に記載の方法。
２９．好ましくは実施形態２７または２８による、避妊方法に使用するための、ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４。
３０．避妊薬の製造に使用するための、ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４。

本開示全体を通して、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。

本明細書で使用される場合、「約」、「実質的な」、または「実質的に」等の近似の言葉は、これらに限定されないが、そのように変更された場合、必ずしも絶対的または完全であるとは限らないが、当業者にとってはその状態が存在するものとして呼ぶのに十分に近いとみなされる状態を指す。記載がどの程度変化するかは、どの程度大きな変更を導入して、変更された特徴が未修正の特徴の必要な特性および能力を依然として有するものとして当業者に認識させることができるかによって決まる。一般に、前述の議論の対象となるが、「約」等の類義語によって修飾される本明細書の数値は、記載された値から、たとえば±１０％異なる場合がある。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等の含むの任意の形式）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」等の有するの任意の形式）、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等の任意の形式）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」等の任意の形式）という語は包括的または無制限であり、追加の言及されていない要素または方法工程を除外するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現は、その要素の特定の値の数値範囲と組み合わせて要素について使用される場合、要素がその範囲に限定されることを意味するが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は依然として他の要素の任意の存在に関連する。たとえば、範囲を有する要素には、その範囲外の量でのその要素の存在を除外するという暗黙の条件が適用される場合がある。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現は、特定の整数または工程、ならびに請求された発明の性質または機能に実質的に影響を与えないものを必要とする。本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という限定された用語は、列挙された要素のみが存在することを示すために使用される。

本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明のこれらの実施形態に限定されるものではない。

実施例
実施例１：ｈＰＳＣの凝集物の形成。
芽球様細胞の形成は、最適な数のｈＰＳＣの凝集に依存する。これは、非接着性ヒドロゲルで作られ、たとえば２００マイクロメートルの多数のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイ上に特定の数のｈＰＳＣを播種することによって達成することができる（図１Ａ）。ヒト芽球様細胞が２０～１００個の細胞の凝集物から優先的に形成され、これが空洞を形成することができる凝集物の形成に有利であることを観察した（図１Ｂ）。この現象は、空洞を形成する構造の数、およびユニークな液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞で構成される内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層によって形成される、全径が１８０～２２０マイクロメートルの三次元構造として定義される芽球様細胞の数を測定することによって定量化する。凝集物の分子刺激のタイミングも、この凝集物内の細胞の特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および自己組織化のレベルを決定する。Ｂ２７Ｎ２培地中で細胞を最初に凝集させ、２４～４８時間後にＡ８３－１、ＰＤ０３２５９０１、ＬＩＦを含むＢ２７Ｎ２培地に培地を交換することで、凝集物が３つの細胞型、およびエピブラスト細胞およびハイポブラスト細胞の単一の内部細胞クラスターを含む、外側の栄養膜シストを形成するには十分であることを観察した。これらの条件下では、ヒト芽球様細胞は５日以内に形成される（図１Ｂ）。

実施例２：小分子または遺伝学的アプローチのいずれかの使用によるＨＩＰＰＯ経路の阻害。
ＨＩＰＰＯ経路の活性は芽球様細胞形成に不可欠である。ＨＩＰＰＯ経路活性の阻害剤である小分子ＬＰＡまたはＮＡＥＰＡを使用してｈＰＳＣ凝集物を刺激すると、固形の細胞凝集物から、単一の液体で満たされた空洞を含むシスト構造への移行が引き起こされる。この液体で満たされた空洞は、ＣＤＸ２およびＧＡＴＡ３を含む、栄養外胚葉マーカーを発現する細胞で裏打ちされており、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４を含むエピブラストのマーカーを発現する細胞、およびＧＡＴＡ４を含むハイポブラストのマーカーを発現する細胞の単一クラスターで構成される。芽球様細胞を形成するためにＨＩＰＰＯ経路の活性を調節する必要性は、ＹＡＰ 特異的阻害剤であるベルテポルフィンによるｈＰＳＣ凝集物の処理時に観察される効果によっても評価される。この小分子は空洞の形成を完全に阻止する（１μＭ）（図２Ｃ）。ヒト芽球様細胞形成におけるＨＩＰＰＯ経路の役割に従って、ＨＩＰＰＯ経路エフェクターＹＡＰは外側の栄養外胚葉様細胞の核に移行するが、内側の細胞クラスターの核には移行しない（図２Ｅ）。最後に、野生型および構成的活性型YＡＰ（ＹＡＰ ５ＳＡ）の過剰発現は、芽球様細胞形成の初期段階（２日目）における空洞の形成を促進する（図２Ｄ）。逆に、ＨＩＰＰＯ標的遺伝子の活性化を阻害することが知られているＴＥＡＤ結合部位 （ＹＡＰ Ｓ９４Ａ）に変異を伴うＹＡＰの過剰発現は、空洞形成についてプラスの効果を示さない。したがって、小分子を使用して生成されたデータと一致して、栄養外胚葉プログラムの遺伝的活性化および胞胚腔様空洞の形成には、ＨＩＰＰＯ経路の調節が必要である。

実施例３：栄養外胚葉様、エピブラスト様、およびハイポブラスト様組織の同時特異化および形態形成。
化学阻害剤ＳＣ－１４４の処理によるＬＩＦ－ＳＴＡＴ経路の阻害は、エピブラスト様細胞／ハイポブラスト様細胞の内部クラスターを形成しない単層の空洞形成凝集物の形成を誘導した。外側栄養外胚葉細胞の系統特異化の成熟もＳＣ－１４４処理によって損なわれ、これは芽球様細胞形成における３つの系統間の細胞間コミュニケーションの重要な役割を示している。

実施例４：胚－非胚軸の自発的形成。
ヒトの後期胚盤胞では、エピブラストに隣接する極栄養外胚葉が転写因子ＮＲ２Ｆ２の発現を開始し、子宮への着床を媒介する領域を標識する。同様に、インビトロ培養すると、芽球様細胞の栄養外胚葉様組織は、ＮＲ２Ｆ２の発現を特徴とする別個の領域を自発的に形成する。逆に、液体で満たされた空洞の反対側の壁性栄養外胚葉はＮＲ２Ｆ２を発現しない（図３Ｈ）。したがって、胚盤胞と同様に、芽球様細胞は着床を媒介する領域を自発的に形成し、軸を形成することができる。

実施例５：子宮内膜細胞の、着床の窓を模倣した受容細胞への分化。
インビトロで胚盤胞の着床をモデル化するために、オルガノイド由来の子宮内膜細胞を２Ｄ培養プレートに堆積させ、着床時に子宮の内側を覆う細胞に分化させる分子で刺激できる条件（いわゆる着床の窓、ＷＯＩ）を定義した。ホルモン（エストラジオール、プロゲステロン）と同様に、複数の小分子を使用したＷｎｔシグナル伝達経路の阻害が、ＷＯＩ中に高度に発現される遺伝子の発現の上方制御を誘導することを発見した（図６）。ＸＡＶ９３９とともに培養した子宮内膜細胞のＲＴｑＰＣＲを使用して見られるように、Ｗｎｔの阻害によりＰＡＥＰ、ＳＰＰ１、ＬＩＦ、およびＤＰＰ４の発現が増加する。免疫蛍光を使用して示されるように、刺激された子宮内膜細胞はタンパク質レベルでもＰＡＥＰを発現し、ＥｄＵの取り込みによって見られるように、細胞は増殖している。子宮内膜細胞は、免疫蛍光を使用して見られるように、アセチル化αチューブリンを特異的に発現する繊毛細胞の亜集団、およびＦＯＸＡ２を特異的に発現する腺細胞も含む。

実施例６：受容性子宮内膜オルガノイドへのヒト芽球様細胞の移植。
ＥＰＣ／ＸＡＶ９３９処理子宮内膜細胞上にヒト芽球様細胞が堆積すると、芽球様細胞が付着し、その細胞が子宮内膜層に侵入する（図７）。付着および侵入すると、芽球様細胞は多能性転写因子Ｏｃｔ４の発現を維持する。子宮内膜細胞がＥＰＣ／ＸＡＶ９３９で刺激されない場合、芽球様細胞はほとんど付着することができず、子宮内膜層に侵入することができない。芽球様細胞がエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞の内部クラスター（ＳＣ１４４－Ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＸＭＵ－ＭＰ－１－Ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成することがほとんどできない場合、それらは子宮内膜層に付着して侵入することがほとんどできない。着床後の栄養膜細胞層を反映するヒト栄養膜幹細胞から形成された凝集物（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ． ２０１８）は、子宮内膜層に付着して侵入することができない。

実施例７：拡張方法。
ヒトナイーブ多能性幹細胞の培養
実験は次のｈＰＳＣ株を使用して行った； ｈＥＳＣ株：Ｈ９、Ｓｈｅｆ６およびＨＮＥＳ１．ｈｉＰＳＣ株：ｃＲ－ＮＣＲＭ２およびｎｉＰＳＣ １６．２．ｂ。ナイーブ状態のＨ９およびＨ９－ＧＦＰ株は、高島康弘の研究室から提供された。他のナイーブｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣは、Ａｕｓｔｉｎ Ｓｍｉｔｈの研究室から提供された。ナイーブｈＰＳＣを、ＰＸＧＬ培地中のガンマ線照射マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層を含むゼラチンコートプレート上で培養した。ＰＸＧＬ培地は、ＰＤ０３２５９０１（１μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１０２５４）、ＸＡＶ－９３９（１μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１５１４７）、Ｇｏｅ ６９８３（２μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１３６８９）、およびヒト白血病抑制因子（ｈＬＩＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、自社製）を補充したＮ２Ｂ２７基本培地を使用して調製される。Ｎ２Ｂ２７基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（５０％、自社製)、Ｎｅｕｒａｂａｓａｌ（商標）培地（５０％、自社製）、Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７５０２０４８）、Ｂ－２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７５０４０４４）、ＧｕｌｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５０５０－０３８）、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール（１００μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３５００１０）、およびウシ血清アルブミン溶液（０．４５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ７９７９－５０ＭＬ）を含んでいた。細胞は、３～４日ごとに単一細胞としてルーチン的に継代した。

準備刺激された多能性ＥＳＣの培養
準備刺激されたＨ９細胞を、ビトロネクチンＸＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１８０）でコーティングされたプレート（１．０μｇ／ｃｍ^２）上で、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地を使用して培養した。

マイクロウェルアレイ
直径２００μｍのマイクロウェルからなるマイクロウェルアレイを９６ウェルプレートにインプリントした。

芽球様細胞およびｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの誘導
ナイーブｈＰＳＣまたは準備刺激されたｈＰＳＣの培養物をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｂｉｏｚｙｍ、Ｂ４２３２０１）で３７℃で５分間処理し、続いてピペットを使用して穏やかに機械的に解離させた。遠心分離後、細胞ペレットをＹ－２７６３２（１０μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１０５８３）を補充したＰＸＧＬ培地に再懸濁した。ＭＥＦを排除するために、細胞懸濁液をゼラチンでコーティングしたプレートに移し、３７℃で７０分間インキュベートした。ＭＥＦ排除後、ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびトリパンブルー染色を使用して細胞数を測定し、細胞生存率を評価した。次いで細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２を含むＮ２Ｂ２７培地（凝集培地）に再懸濁し、３．０×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートのウェルに含まれるマイクロウェルアレイ上に播種した。細胞株に応じて、またその凝集傾向に基づいて、０～２４時間の範囲で、細胞をマイクロウェル内で凝集物を形成させた。続いて、凝集培地を、ＰＡＬＬＹ培地－ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）、Ａ ８３－０１（１μＭ、Ｍｅｄ－ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１０４３２）、ｈＬＩＦ （１０ｎｇ／ｍｌ）、１－オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩（ＬＰＡ）、（５００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、３８５４）およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＮ２Ｂ２７に交換した。ＰＡＬＬＹ培地は２４時間ごとに更新した。４８時間後、ＰＡＬＬＹ培地を５００ｎＭ ＬＰＡおｙび１０μＭ Ｙ－２７６３２を含む N2B27 培地に交換した。９６時間時点で、芽球様細胞はＢ６段階のヒト胚盤胞との形態学的類似性に基づいて、一つの内部細胞塊を含む全径１５０～２５０μｍの単層シストからなる構造として定義される。また、形態を超えて、芽球様細胞が胚盤胞発生の連続的かつタイムリーな方法で３つの胚盤胞細胞系統のアナログを形成することを検証した。芽球様細胞は高効率で再現性よく形成され、ＰＸＧＬ培養条件でのリセット後の継代数に基づく差異は観察されなかった。芽球様細胞形成の収率に対するＬＰＡ、ＮＡＥＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ０９１２）およびベルテポルフィン（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｌｃ、Ｓ１７８６）の影響は、０～９６時間後まで毎日分子を添加したＰＡＬＹ培地でナイーブｈＰＳＣ凝集物を培養することによって評価された。ベルテポルフィン処理は光に暴露せずに行った。ａＰＫＣ阻害剤ＣＲＴ０１０３３９０（Ｋａｔｈｙ Ｎｉａｋａｎの研究室からのギフト）の効果は、２μＭ ＣＲＴ０１０３３９０を補充したＰＡＬＬＹ培地でナイーブｈＰＳＣ凝集物を毎日０～９６時間培養することによって評価された。ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成は、２μＭ ＸＭＵ－ＭＰ－１（Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＨＹ－１００５２６）または３μＭ ＳＣ－１４４（Ａｘｏｎ、２３２４）を補充した ＰＡＬＬＹ培地でナイーブｈＰＳＣ凝集物を毎日０～９６時間後まで培養することによって誘導した。ＢＳＡ濃度は、芽球様細胞およびｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅの形成に使用される個々の細胞株に対して０～０．３％の範囲内で滴定された。

ヒト芽球様細胞からの細胞株の誘導
前のセクションで記載したように、９６時間培養した芽球様細胞を用いて誘導実験を行った。芽球様細胞は、ガンマ線照射されたＭＥＦのフィーダー層を備えた、ゼラチンでコーティングされた９６ウェルプレートに個別に移植された。ナイーブｈＰＳＣはＰＸＧＬ培地で誘導された。ｈＴＳＣはヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳＣ）培地で誘導された（Ｏｋａｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２， ５０－６３．ｅ６ （２０１８））。フィーダー上で２４時間培養した後、芽球様細胞が付着し、１週間以内にコロニーが形成された。芽球様細胞移植後３継代後に誘導が成功したとみなされた。免疫蛍光アッセイでは、ナイーブｈＰＳＣをＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（０．５μＬ／ｃｍ^２）でコーティングしたカバーガラスに移し、ｈＴＳＣをフィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０８０１２）に移した。

栄養膜オルガノイドの形成
オルガノイド形成は、芽球様細胞由来ｈＴＳＣ株を用いて行った。オルガノイドは、いくつかの改変を加えて、以前に記載されているように（Ｔｕｒｃｏ， Ｍ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ５６４， ２６３－２６７ （２０１８））培養した。１×トリプシンを３７℃で５分間使用して、ｈＴＳＣのコロニーを単一細胞に解離させた。遠心分離後、２００，０００個の細胞を１５０μｌのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６２３１）に再懸濁した。ウェルあたり２０μｌの液滴を、予熱した４８ウェル細胞培養プレートに配置し、逆さまにしてインキュベーターに２０分間置いた。オルガノイドを２５０μｌのＴＯＭ培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ－Ｆ１２、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメントマイナスビタミンａ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（１．２５ｍＭ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、Ａ８３－０１（５００ｎＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（１．５ｕＭ）、組換えヒトＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ １馴化培地、組換えヒトＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２（２．５．μＭ））中で培養した。培地は一日おきに交換した。ＳＣＴ形成のためにオルガノイドを７日目までＴＯＭ培地で維持した。

２Ｄ栄養膜の分化
芽球様細胞由来ｈＴＳＣの分化は、いくつかの改変を加えて、以前に記載されているように（Ｏｋａｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２， ５０-６３．ｅ６ （２０１８））行った。実験前に、ｈＴＳＣ株をフィブロネクチンコーティング（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０８０１２）に少なくとも３継代適応させた。ＥＶＴおよびＳＣＴの分化のために、細胞を３７℃で５分間ＴｒｙｐＬＥで解離させ、細胞を１２ウェルプレート上に５５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。ＳＣＴ分化のために、プレートを１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでプレコートし、ＳＣＴ培地（０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ＩＴＳ－Ｘサプリメント、７．５ｍＭ Ａ８３－０１、２．５ｍＭ Ｙ２７６３２、４％ノックアウト血清代替物、および２ ｍＭフォルスコリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で３日間培養した。ＥＶＴ分化のために、プレートをマトリゲルでプレコートし、細胞をＥＶＴ培地（０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ＩＴＳ－Ｘサプリメント、２％マトリゲル、７．５ｍＭ Ａ８３－０１、２．５ｍＭ Ｙ２７６３２、４％ノックアウト血清代替物、および１００ｎｇ／ｍｌ ＮＲＧ１を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養した。３日後、培地を、０．５％マトリゲルを含み、ＮＲＧ１を含まないＥＶＴ培地に交換した。細胞を６日目まで培養した。

ヒト着床前胚の培養
ヒト胚をメーカーの指示に従って解凍した（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ：Ｓｙｄｎｅｙ ＩＶＦ Ｔｈａｗｉｎｇ ｋｉｔ（緩慢冷却法用）、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ： ＲａｐｉｄＷａｒｍＣｌｅａｖｅまたはＲａｐｉｄＷａｒｍＢｌａｓｔ（ガラス化法用））。８細胞期で凍結したヒト胚を、ミネラルオイル（Ｏｒｉｇｉｏ：流動パラフィン）下のノンシーケンシャル培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ２ ｐｌｕｓ）を含む１２ウェルディッシュ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ：Ｅｍｂｒｙｏｓｌｉｄｅ Ｉｂｉｄｉ）に５％ Ｏ_２／６％ ＣＯ_２中３７℃で、５分間ロードした。

プラスミド構築
ｈＹＡＰ１、ｈＹＡＰ１ ５ＳＡ、およびｈＹＡＰ１ ５ＳＡ＋Ｓ９４ＡのｃＤＮＡ配列を、それぞれｐＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ、ｐＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ－５ＳＡ、ｐＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ－Ｓ９４Ａプラスミドから増幅した。これらのＹＡＰプラスミドは、Ｋｕｎｌｉａｎｇ Ｇｕａｎからのギフトであった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃３３０９１、＃３３０９３、および＃３３０９４）（Ｚｈａｏ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２１，２７４７－２７６１（２００７））。個々のｃＤＮＡ配列をｐＤＯＮＲ２１１にクローニングし、続いてＧａｔｅｗａｙ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）クローニング戦略を使用してＰＢ－ＴＡＣ－ＥＲＰ２にクローニングした。ＰＢ－ＴＡＣ－ＥＲＰ２は、Ｋｎｕｔ Ｗｏｌｔｊｅｎ （Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８０４７８） からのギフトであった（Ｋｉｍ， Ｓ．－Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３５７，１１１－１３１（２０１６））。

ヒトナイーブＰＳＣにおける細胞トランスフェクション
ｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅ（５μｇ）およびＰＢ－ＴＡＣ－ＹＡＰ１－ＥＲＰ（５μｇ）を、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーション（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ Ｃｏ． Ｌｔｄ）によって、単一細胞懸濁液中の５×１０^４細胞にトランスフェクトした。エレクトロポレーションされたナイーブｈＰＳＣを、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を含むＰＸＧＬ培地を含むＧｅｌｔｒｅｘ（０．５μＬ／ｃｍ^２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａ１４１３３０２）でコーティングされた６ウェルプレート上にプレーティングした。ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ７２５５）を１日目から３～４日目までＰＸＧＬ培地に添加して、形質転換細胞を選択した。ｐＣＡＧ－ＰＢａｓｅはＫｎｕｔ Ｗｏｌｔｊｅｎからのギフトであった。

ナイーブｈＰＳＣ凝集物におけるＹＡＰの過剰発現
ナイーブｈＰＳＣ凝集物は、上のセクションで説明したように、ドキシサイクリン誘導性カセットと統合されたナイーブＨ９細胞株から形成された。凝集物を、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンとともに、ＬＰＡ濃度を低下させた（５ｎＭ）ＰＡＬＬＹ培地中で０時間～４８時間培養した。ＬＰＡ濃度が高いと、ＹＡＰ１バリアントの遺伝的過剰発現の影響が遮蔽された。空洞形成が発生した凝集物の数を７２時間後に計測した。

単一細胞ＲＮＡ配列ライブラリの調製およびシーケンシング
ＴＥ細胞の過剰表現を避けるために、芽球様細胞を収集、解離し、それぞれ栄養膜細胞および原始内胚葉を標識するＴＲＯＰ２およびＰＤＧＦＲａに対する抗体を使用して細胞懸濁液を染色した。９６時間の時点では、上記の形態学的基準に従って、解離前に芽球様細胞をマイクロウェルアレイから選択的に採取した。細胞を、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２用の溶解バッファーを含む３８４ウェルプレートにＦＡＣＳで分類し、すぐに凍結した。抗体染色は、特定の数のＴＲＯＰ２＋、ＰＤＧＦＲａ＋、およびダブルネガティブ細胞を収集するために利用した。隣接する（ａｂｕｔｅｄ）ＦＡＣＳゲート（ＤｉＶａ ９．０．１）はスペクトル全体をカバーし、芽球様細胞は排除されなかった。ＭＥＦ上で培養したＨ９ナイーブ細胞をＳＵＳＤ２に対する抗体を使用して染色し、ＦＡＣＳで分類した。死細胞はＤＡＰＩ染色により除外した。Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２ライブラリは、マイナーな最適化を加えて前述のように生成された（Ｐｉｃｅｌｌｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ９， １７１-１８１ （２０１４））。Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（３Ｕ／反応、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＥＰ０７５１）をｃＤＮＡ合成に使用した。調製したライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ機器を５０ ｂｐペアエンドモードで使用して、Ｓ１またはＳＰフローセル上で配列決定した。

単一細胞ＲＮＡ配列データ解析
Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑトランスクリプトームシーケンシング実験は、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＧＲＣｈ３８リリース１０３のゲノム配列および遺伝子アノテーションを参照として使用して分析した。

遺伝子発現の定量化のために、最初にｔｒｉｍ－ｇａｌｏｒｅ ｖ０．６．６を使用してＲＮＡ配列リードをトリミングし、その後、ｈｉｓａｔ２ ｖ２．２．１を使用してヒトゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＧＲＣｈ３８ ｒｅｌｅａｓｅ １０３）にアラインメントした。遺伝子内の一意にマッピングされたリードは、パラメータ－ｓ ｎｏ．を指定した ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ ｖ０．１３．５を使用して定量化した。ＴＰＭ推定値は、パラメータ－ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｐｒｉｏｒを指定したＲＳＥＭ ｖ１．３．３を使用して取得した。

さらなる分析は、Ｓｅｕｒａｔ ｖ４．０．１を使用したＲ ｖ４．０．３で実行した。細胞ごとの品質管理メトリクスの初期評価および中央値絶対偏差アルゴリズムを使用した外れ値の特定に基づいて、検出された遺伝子が２０００個以下、またはミトコンドリア遺伝子の割合が１２．５％以上の細胞を除外した。少なくとも５つの細胞で検出された遺伝子のみを保持した。カウントデータは対数正規化し、変動性の高い上位３０００個を選択し、Ｓｅｕｒａｔの ＮｏｒｍａｌｉｚｅＤａｔａ、ＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＦｅａｔｕｒｅ、およびＳｃａｌｅＤａｔａデータ関数を使用して細胞全体にわたる遺伝子ごとの発現値の標準化を行った。標準化された可変性の高い特徴に基づく主成分分析（ＰＣＡ）が線形次元削減に使用され、次元削減されたデータに基づいてｓｈａｒｅｄ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ （ＳＮＮ）グラフが構築され、グラフは、デフォルト設定でＳｅｕｒａｔのＲｕｎＰＣＡ、ＦｉｎｄＮｅｉｇｈｂｏｒｓ、およびＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを使用し、様々な解像度でＳＮＮモジュール最適化ベースのクラスタリング アルゴリズムを使用して分割された。クラスターマーカー遺伝子は、ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数を使用したＷｉｌｃｏｘ尤度比検定で特定された。視覚化にはＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ （ＵＭＡＰ）が使用された。

複数のソースからのＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ実験を統合するために、前述の手順に従った（Ｚｈａｏ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２１．０５．０７．４４２９８０）。Ｅ－ＭＴＡＢ－３９２９（胎生期３日目から７日目までのヒト着床前胚）からの公開データＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ｖｏｌ． １６７ ２８５ （２０１６））、ＧＳＥ１０９５５５（インビトロ培養胚盤胞）がダウンロードされ、カーネギー ステージ７胚からのデータは著者の厚意により提供された（Ｔｙｓｅｒ， Ｒ． Ｃ． Ｖ． ｅｔ ａｌ． ｂｉｏＲｘｉｖ （２０２０） ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０７．２１．２１３５１２）。ＧＳＥ１０９５５５の場合、著者の指示（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＷＲｕｉ／Ｐｏｓｔ＿Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に従ってＵＭＩおよびＣＢ情報に対応するための適応を含む、芽球様細胞について記載したのと同じプロトコルを使用して、すべてのデータを前処理して遺伝子ごとのリード数を取得した。ＧＳＥ１０９５５５では、元の刊行物に記載されている３１８４個の高品質単一細胞からランダムにサブサンプリングした１０００個の細胞を使用した。造血性内皮前駆細胞および赤芽球に属する細胞を除外した。細胞ごとの品質管理指標を評価した後、検出された遺伝子の数が２０００を超え、かつミトコンドリア遺伝子の割合が１２．５％未満の細胞を保持した。どのデータセットでも少なくとも５つの細胞で検出された遺伝子を保持した。対数正規化は、ｓｃｒａｎパッケージｖ１．１８．７のｃｏｍｐｕｔｅＳｕｍＦａｃｔｏｒｓを使用して実行し、バッチごとのスケーリング正規化は、ｂａｔｃｈｅｌｏｒ ｖ１．６．３のｍｕｌｔｉ－ＢａｔｃｈＮｏｒｍを使用して実行した。データセットは、対数正規化されたバッチ調整された式の値を使用するＳｅｕｒａｔＷｒａｐｐｅｒｓ ｖ０．３．０経由のｆａｓｔＭＮＮアプローチを使用して整列した。次に、ＭＮＮの低次元座標を、Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ （ＵＭＡＰ）によるクラスタリングおよび視覚化に使用した。

ヒト栄養膜幹細胞の培養および凝集物形成
実験は有馬隆博研究室から提供されたヒト胚盤胞由来ｈＴＳＣ株ｂＴＳ５を用いて行った。細胞は、前述のように、ラミニン５１１（５μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＬａｍｉｎａ、ＬＮ５１１）でコーティングされたプレート上でｈＴＳＣ培地中で培養した。ｈＴＳＣの凝集物は以下のように形成した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を３７℃で５分間使用して、コロニーを単一細胞に解離させた。細胞を１０μＭ Ｙ－２７６３２を含むｈＴＳＣ培地に再懸濁し、３．０×１０^４個の細胞を９６ウェルプレートのウェルにインプリントされたマイクロウェルアレイに播種した。同じ培地（Ｏｋａｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２， ５０－６３．ｅ６ （２０１８））を毎日更新した。７２時間後、凝集物を特性評価および移植実験の両方に使用した。

子宮内膜オルガノイド培養
凍結保存されたヒト子宮内膜オルガノイドは、協力協定の枠組みの中でホセイン・バハーヴァンド研究室（ロイアン研究所）から提供された。ヒト子宮内膜オルガノイドは、いくつかの改変を加えて以前に記載されたプロトコル（Ｂｏｒｅｔｔｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４， １７７５－１７８６ （２０１７））に従って健康なヒトのドナーから樹立された。簡単に説明すると、オルガノイドは、１×Ｎ２サプリメント、１×Ｂ２７サプリメント、１×インスリン－トランスフェリン－を－セレン（自社）、グルタマックス（１μＭ）、Ｎ－アセチルシステイン（１．２５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ７２５０）、ニコチンアミド（２．５ ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、７２３４０）、ＥＧＦ（５０ ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－４７）、ｂＦＧＦ （２ ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－１８Ｂ）、ＨＧＦ（１０ ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３１５－２３）、ＦＧＦ１０（１０ ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－２６）、Ａ８３－０１（５００ｎＭ）、および ＳＢ２０２１９０（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、１２６４）を補充した １０％ Ｒｓｐｏ１馴化培地（自社製）および１０％ノギンＦｃ馴化培地（Ｈｅｉｊｍａｎｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ３， １１２８－１１３９ （２０１３））で構成されるヒト子宮内膜拡大培地で培養した。アポトーシスを防ぐために、継代後の最初の２日間にＹ－２７６３２（１０μＭ）を使用した。培地を２日ごとに交換し、オルガノイドをＴｒｙｐＬＥで継代し、その後７～９日ごとに機械的解離を行った。

子宮内膜オルガノイドおよびＯＦＥＬ培養のホルモン刺激
子宮内膜オルガノイドは、前のセクションで記載したように継代した。解離した細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を補充したマトリゲルに再懸濁し、細胞懸濁液を４８ウェルプレートに堆積させ、子宮内膜拡張培地で２日間培養した。オルガノイドを最初にＥ２（１０ ｎＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅ２７５８）で２日間刺激し、続いてＥ２（１０ ｎＭ）、Ｐ４（１μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８７８３）、およびｃＡＭＰ（２５０μＭ、Ｂｉｏｌｏｇ、Ｂ ００７）をＸＡＶ９３９（１０μＭ）（それぞれＥＰＣまたはＥＰＣＸ）の有無にかかわらず４日間投与した。ＯＦＥＬ培養では、氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２と機械的なピペッティングを使用してマトリゲル液滴からオルガノイドを回収した。ＴｒｙｐＬＥを使用してオルガノイドを解離し、機械的に粉砕して単一細胞を生成し、９６ウェルガラス底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ、Ｐ９６－１．５Ｈ－Ｎ）に１ウェルあたり３～４．５×１０^４細胞の密度で播種し、刺激を与えながら２～３日間培養した。避妊処理のために、レボノルゲストレル（ＬＮＧ）（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＨＲ１８５０）をホルモン刺激の２日後に培地に毎日添加し、実験の終了まで続けた。

インビトロ移植アッセイ
コンフルエントなＯＦＥＬは、ＯＦＥＬをＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄し、ＩＶＣ培地を添加することにより（Ｘｉａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ５７７， ５３７-５４２ （２０２０））、芽球様細胞、ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ、ナイーブｈＰＳＣ、またはｈＴＳＣ凝集物の堆積の少なくとも２時間前に移植アッセイ用に準備した。次に、倒立顕微鏡下でマウスピペットを使用して構造をＯＦＥＬ上に転写した。２４～４８時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドを使用して室温で３０分間固定し、続いて免疫蛍光染色のために処理した。付着した構造の割合は、移動した構造全体の割合としてレポートされた。

移植後条件におけるヒト芽球様細胞のインビトロ培養
マウスピペットを使用してヒト芽球様細胞を選択し、ＣＭＲＬ１０６６培地で洗浄し、以下のように若干の変更を加えてサル胚盤胞培養物（Ｍａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６６， （２０１９）．）から適合させた、予め平衡化した培地を含むマトリゲルでコーティングした懸濁培養プレートまたは９６ウェルプレートに移した。初日は、培養培地は１０％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、１ｍＭ ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｎ２サプリメント、１×Ｂ２７サプリメント、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、および１０μＭ Ｙ２７６３２を補充したＣＭＲＬ１０６６であった。２４時間後、培地の半分を５％マトリゲルを含む新しい培地と交換した。４８時間後、培地の５０％を、２０％（ｖ／ｖ） ＦＢＳおよび５％マトリゲルを補充した新しい培地と交換した。７２時間後、培地の半分を、３０％（ｖ／ｖ） ＫＳＲおよび５％マトリゲルを補充した新しい培地と交換した。その後、培地の半分を毎日交換し、芽球様細胞を最大６日間培養した。上述したように、４％ＰＦＡを用いたインビトロ培養の４日および６日後に、培養物を染色のために固定した。

比較例のヒト着床前胚
体外受精治療の余剰として研究に提供されたヒト胚の使用は、承認番号ＲＥ１３－０１０およびＲＥ１８－０１０で、フランスの胚研究監視委員会：Ａｇｅｎｃｅ ｄｅ ｌａ Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅによって許可された。この研究で使用されたすべてのヒト着床前胚は、Ａｇｅｎｃｅ ｄｅ ｌａ Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅの承認番号ＡＧ１１０１２６ＡＭＰに基づいて、研究のために胚を収集することが認可されているフランスのナント大学病院の生殖補助医療ユニットから入手され、そこで培養された。使用された胚は、当初、明確な生殖目的を持った生殖補助サイクルの状況で作成され、その後、患者が生殖ニーズを満たしたり、単一遺伝子性疾患の存在が検査で陽性となった後に、自発的に研究のために提供されたものである。

ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、およびｑＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）を使用してＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００９３）酵素を使用してｃＤＮＡ合成を行った。ｑＰＣＲ反応は、CＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－ｒａd）上でＧｏＴａｑ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ６００１）を使用して実行した。定量化は、比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を適用することにより、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌを使用して実行した。相対発現レベルはＧＡＰＤＨに対して正規化した。

ＣＧβ検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ
付着していないまたは付着している芽球様細胞を含むウェルからの培地を収集し、遠心分離して破片を除去し、使用するまで－８０℃で保管した。上清は、ＣＧβ標準と並行して、メーカーの指示に従ってＣＧβ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７８６３３）に供した。

リガンド－受容体解析
極性ＴＥおよび子宮内膜上皮細胞の間の推定上の受容体－リガンド相互作用を予測するために、Ｃｅｌｌｉｎｋｅｒウェブプラットフォームを使用した。後期ＴＥのＮＲ２Ｆ２モジュール内の遺伝子、極性ＴＥの濃縮遺伝子、刺激されたＯＦＥＬ中で上方制御された遺伝子とともに、月経周期の第４相への移行を標識する子宮内膜上皮細胞の遺伝子モジュールを、データベース内でリガンドおよび受容体を検索するためのクエリとして使用した。

免疫組織化学
試料を４％ホルムアルデヒドで室温で３０分間固定した。固定後、ホルムアルデヒド溶液を除去し、試料をＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中の０．３％トリトン－Ｘ１００および１０％正常ロバ血清を使用して、試料を少なくとも６０分間透過処理し、ブロックした。次いで、試料を、フレッシュなブロッキング／透過化溶液で希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。試料を、０．１％トリトン－Ｘ１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で少なくとも３回、それぞれ１０分間洗浄した。次に、洗浄バッファーを、ＰＢＳＴで室温、暗所で３０分間希釈した核染色色素（ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｅ）Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２（２Ｄまたは３Ｄ試料でそれぞれ１：５００または１：３００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５７０）とともにＡｌｅｘａｆｌｕｏｒタグ付き二次抗体（ＡｂｃａｍまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と入れ替えた。次いで、試料をＰＢＳＴで３回、それぞれ１０分間洗浄した。ヒト胚盤胞の場合、試料はＧａｒｄｎｅｒおよびＳｃｈｏｏｌｃｒａｆｔが提案した等級付けシステムに従ってＢ４またはＢ６段階、またはＢ３またはＢ４＋７２時間のインビトロ培養で固定した。胚を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定し、ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した。０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ１００および１０％ ＦＢＳを含むＰＢＳ中で胚を室温で６０分間透過処理し、ブロックした。試料を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。二次抗体とのインキュベーションを、ヘキスト対比染色とともに室温で２時間実施した。試料を、イメージングのためにガラス底マイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ、８１５０７）のウェル内のＰＢＳにマウントした。ＥｄＵ染色は、メーカーの指示に従ってＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４ イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ１０６４０）を使用して行った。

顕微鏡検査および画像解析
位相差画像は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＶＯＳ細胞イメージングシステムおよび倒立広視野顕微鏡Ａｘｉｏ ＶｅｒｔＡ１を使用して取得した。芽球様細胞または空洞化構造の数を各ウェルについて手動で計数した。９６時間後、前のセクションで記載したように、形態学的パラメータに基づいて芽球様細胞が定義される。蛍光画像およびタイムラプス画像は、横河Ｗ１スピニングディスクを備えたオリンパスＩＸ８３顕微鏡（ソフトウェア：ＣｅｌｌＳｅｎｓｅ２．３、カメラ：浜松Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ（登録商標）４．０）または横河Ｗ１スピニングディスクを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ Ｅ倒立顕微鏡（ソフトウェア：Ｖｉｓｉｖｉｅｗ ４．５．０．７、カメラ：Ａｎｄｏｒ Ｉｘｏｎ Ｕｌｔｒａ ８８８ ＥＭＣＣＤ）で取得した。共焦点画像を解析し、ＦＩＪＩ １．５３ｋまたは Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｍａｒｉｓ ９．７．０ソフトウェアを使用して表示画像をエクスポートした。細胞計数には、Ｂｉｔｐｌａｎｅ Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用した。ボクセルのサイズおよび蛍光強度に合わせて細胞数パラメータを設定し、Ｉｍａｒｉｓのスポット機能を使用して各画像の全体的な細胞数データを取得した。芽球様細胞内の大きな空洞はイメージングフィールドの深さを増し、深くに位置する細胞からの信号が低下することに留意されたい。したがって、図８Ｈの計数データは、特に栄養外胚葉細胞の場合、過小評価された値である可能性がある。ＮＲ２Ｆ２軸を形成する芽球様細胞の割合の定量化は手動で行わった。そうするために、ＮＲ２Ｆ２発現を検出するために染色された芽球様細胞を、共焦点スピニングディスク顕微鏡を使用して画像化した。映像はＦＩＪＩの３Ｄプロジェクト機能を利用して投影した。ＮＲ２Ｆ２発現がその極側半分に限定されており、壁側半分では発現がない、または発現レベルが低い場合、芽球様細胞は軸を有すると分類された。ＮＲ２Ｆ２発現の反転パターンは反転軸として分類された。極側半分および壁側半分の両方にＮＲ２Ｆ２発現がある芽球様細胞は、軸を有しないと分類された。ヒト胚盤胞の共焦点免疫蛍光画像は、Ｎｉｋｏｎ共焦点顕微鏡および２０×Ｍｉｍまたは ２５×Ｓｉｌｉｃｏｎ対物レンズを使用して取得された。厚さ１μｍの光学切片を採取した。画像は、Ｆｉｊｉ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ）および Ｖｏｌｏｃｉｔｙ ６．３視覚化ソフトウェアを使用して処理した。Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアを使用して核を検出し、計数した。

統計および再現性
方法および図の凡例に特に記載がない限り、すべての実験は少なくとも３回の生物学的反復で行った。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ８．１．１ （３３０）を使用して実行した。

実施例８：三重阻害（Ｈｉｐｐｏ／ＥＲＫ／ＴＧＦ）。
胚盤胞は、受胎産物である３つの創始系統（ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔｕｓ ３ ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｌｉｎｅａｇｅｓ）、すなわちエピブラスト（ＥＰＩ、胚）、栄養外胚葉（ＴＥ、胚体外）、および原始内胚葉（ＰｒＥ、胚体外）を生成することによって３～４日以内に形成される（図８ａ）。末梢細胞はＨｉｐｐｏ経路を阻害することでＴＥになる。また、ナイーブｈＰＳＣ（ＰＸＧＬ中で培養）は、ＴＧＦ－βおよびＥＲＫ経路の阻害により効率的にＴＥアナログを形成する。したがって、本発明者らは、非接着ヒドロゲルマイクロウェル内でナイーブｈＰＳＣを凝集させ、これらの３つの経路を阻害した（図８ｂおよび図１２ａ～ｃ）。ＬＩＦ（ＳＴＡＴ活性化剤）およびＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含む既知組成培地中でリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ、Ｈｉｐｐｏ経路阻害剤），Ａ８３－０１（ＴＧＦ－βファミリー受容体阻害剤）およびＰＤ０３２５９０１（ＥＲＫ阻害剤）に曝露した場合、胚盤胞様構造が効率的に形成され（図８ｃ～ｅ、＞７０％、１５０＜φ＜２５０μｍ、拡張方法における完全な形態計測基準を参照）、そして一貫して形成された（図１２ｄ、＞２０継代）。ＬＰＡは効率を大幅に向上させた（図１２ｂ～ｄ）。５日以内に、細胞数（４７＋／－９個から１２９＋／－２７個）および全体のサイズ（６５μｍから２００μｍ）は、５～７日目の胚盤胞（段階Ｂ３～６）の範囲と同様に増加した（図１２ｅ、ｆ）。ＴＥ細胞アナログ（ＧＡＴＡ２^＋／ＧＡＴＡ３^＋／ＣＤＸ２^＋／ＴＲＯＰ２^＋）は、膨張と収縮のサイクルを経験しながら（図１２ｎ）、形成され、増殖し（図８ｆ～ｈおよび図１２ｇ～ｌ）、接着結合（上皮カドヘリン（ＣＤＨ１））が確立され、頂端底極性（ａｐｉｃａｌ－ｂａｓａｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ；ａＰＫＣ局在）および緊密な結合（ＺＯ－１^＋、図８ｉおよび図１２ｍ）が形成された。驚くべきことに、すべての胚盤胞様構造は、ＥＰＩ（ＯＣＴ４＋；平均＝２７＋／－１３個の細胞；全細胞の２６％）およびＰｒＥ（ＧＡＴＡ４^＋／ＳＯＸ１７^＋／ＰＤＧＦＲａ^＋平均 ＝７＋／－５個の細胞；全細胞の７％）（図８ｆ～ｈおよび図１２ｉ、ｊ、ｌ）を反映するユニークな内部細胞塊を分離し、これは細胞凝集物形成後の対称性の破壊を示している。複数の系統のナイーブｈＥＳＣ（Ｓｈｅｆ６、Ｈ９、ＨＮＥＳ１）およびｈｉＰＳＣ（ｎｉＰＳＣ １６．２．ｂ、ｃＲ－ＮＣＲＭ２）は、同等の高い効率でそのような構造を形成した（図８ｅおよび図１２ｏ）が、移植後のＥＰＩを反映する準備刺激されたｈＰＳＣは形成しなかった（図１２ｐ）。ヒト細胞に基づく空洞を有する芽球様細胞の発生には、Ｈｉｐｐｏ経路の阻害（たとえばＬＰＡによる）、ＭＥＫ／ＥＲＫ（たとえばＰＤ０３２５９０１による）、およびＴＧＦ－ｂ（たとえばＡ８３－０１による）の三重阻害が必要であった（図２２）。図２３は、代替ＴＧＦ－ｂ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）も機能することを示している。

実施例９：胚盤胞アナログのみの形成。
単一細胞トランスクリプトーム解析により、胚盤胞様構造が、ＧＡＴＡ２／ＧＡＴＡ３（ＴＥ）、ＰＯＵ５Ｆ１／ＫＬＦ１７（ＥＰＩ）、およびＧＡＴＡ４／ＳＯＸ１７（ＰｒＥ）を含む３つの創始系統に特異的な遺伝子によって特徴づけられる３つの主要なトランスクリプトーム状態（図９ａ、ｂ、および図１３ａ）を形成することが示された（図９ｃ、ｄ、および図１３ｂ）。胚盤胞、インビトロ培養胚盤胞、および原腸形成段階の胚由来の細胞との比較により、細胞は転写的に胚盤胞の状態と類似しており、着床後の状態とは異なることが明らかになった（図９ｅ、ｆおよび図１３ｃ～ｇ）。高解像度クラスタリング分析（×５０）により、移植後の組織（ＧＡＢＲＰ、ＩＳＬ１、ＡＰＬＮＲ、ＣＲＡＢＰ２）を思わせる（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）遺伝子発現パターンを有する非胚盤胞様細胞の１つのクラスターが単離され（図１４ａ～ｃ）、それは羊膜（非神経外胚葉とアノテートされている）および中胚葉と転写的に類似しているように見えた（図１４ｄ～ｊ）。この亜集団は細胞の３％未満を構成した（図１４ｉ）。注目すべきことに、ナイーブｈＰＳＣ培養物は同様に分化した細胞の５．６％を含んでいた（図１４ｉ）。バルクＲＮＡシーケンシング分析は、単離された栄養膜アナログ（フローサイトメトリーによるＴＲＯＰ２^＋）が、ナイーブｈＰＳＣと移植後様栄養膜細胞（ｈＴＳＣ）との間の中間トランスクリプトームを有することを示した（図１５ａ）。さらに、栄養膜は、胚盤胞段階のＴＥ転写物（ＥＳＲＲＢ、ＧＲＨＬ１、ＯＶＯＬ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ３、ＫＲＴ１９、ＣＧＡ、ＣＧＢ５、ＣＧＢ７）に富んでいたが、一部の着床後マーカー（ＳＩＧＬＥＣ６、ＤＰＰ４）には富んでいなかった（図１５ｂ、ｃ）。単離されたＥＰＩアナログ（ＴＲＯＰ２^－／ＰＤＧＦＲａ^－）のトランスクリプトームは、ナイーブｈＰＳＣのトランスクリプトームに似ており（図1５ａ）、胚盤胞期ＥＰＩに特異的なマーカー（ＫＬＦ１７、ＡＴＧ２Ａ、ＳＵＳＤ２、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＺＦＰ５７、ＤＰＰＡ２、ＵＴＦ１、 ＰＲＤＭ１４）に富んでおり、準備刺激されたｈＰＳＣのトランスクリプトームとは異なっていた（図１５ａ、ｄ）。最後に、単離されたＰｒＥアナログ（ＰＤＧＦＲａ^＋）は、ナイーブｈＰＳＣと胚体外内胚葉細胞株（ｎＥＮＤ細胞）との間の中間トランスクリプトームを有し（図１５ａ）、胚盤胞段階のＰｒＥマーカー（初期胚盤胞：ＧＡＴＡ６、ＭＳＸ２、ＨＮＦ４Ａ。後期胚盤胞：ＰＤＧＦＲＡ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１Ｂ、ＦＯＸＡ２）、および胚盤胞と同様に下方制御されたＥＰＩ遺伝子（ＡＲＧＦＸ、ＰＲＤＭ１４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＰＯＵ５Ｆ１）に富んでいた（図１５ｅ）。胚盤胞は幹細胞株を確立する能力を有する。同様に、胚盤胞様構造により、第２世代胚盤胞様構造（図１６ｂ、ｃ）を形成することができるナイーブｈＰＳＣ（ＮＡＮＯＧ^＋／ＳＯＸ２^＋／ＯＣＴ４^＋／ＫＬＦ１７^＋）（図１６ａ）、ならびに合胞体栄養細胞（ＳＣＴ）および絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）（３～６日、図１６ｅ～ｊ）への迅速な分化能力を備えたｈＴＳＣ（ＣＤＸ２^－／ＧＡＴＡ３^＋／ＣＫ７^＋）（図１６ｄ）の新規誘導が可能になった。注目すべきことに、ヒト胚盤胞からのＰｒＥ細胞株の誘導はこれまでに報告されていない。全体として、このモデルは形態学的に胚盤胞に似ており（拡張方法の判定基準を参照）、胚盤胞段階を転写的に反映し、胚盤胞の連続的かつタイムリーな方法で発生する３つの系統のアナログを生成したため、発明者らはそれらを芽球様細胞と呼んだ。

実施例１０：Ｈｉｐｐｏ阻害。
ヒトの胚盤胞系統の分離に関する知識は限られている（図１０ａ）。しかし、Ｈｉｐｐｏ経路の阻害は、頂端ドメインの獲得時に末梢細胞で起こり、栄養膜の特異化に必要である（図１７ａ）。発明者らは、芽球様細胞がこのメカニズムを採用するかどうかを試験した。驚くべきことに、非定型プロテインキナーゼＣ（ａＰＫＣ）およびＦ－アクチン発現ドメインは、核内にＨｉｐｐｏ下流エフェクターＹＡＰ１も蓄積する外側細胞で同時整列しているように見えた（図１７ｂ、ｃ）。ＹＡＰ１の核位置はＧＡＴＡ２／３発現と相関し、ＮＡＮＯＧ発現とは対照的であり、ＴＥアナログに限定されるようになった（図１０ｂおよび図１７ｄ、ｅ）。ａＰＫＣ阻害剤（ＣＲＴ０１０３３９０）は、ＹＡＰ１核蓄積を大幅に防止し、ＧＡＴＡ３^＋細胞数を減少させ、芽球様細胞形成を防止した（図１７ｆ～ｈ）。逆に、Ｈｉｐｐｏ経路を阻害するＬＰＡ受容体のリガンド（ＬＰＡおよびＮＡＥＰＡ）は芽球様細胞形成を増強した（図１０ｃおよび図１７ｉ）。Ｈｉｐｐｏ経路の阻害によりＹＡＰ１が核に入ることができるようになるため、遺伝子操作されたＹＡＰ１のレベルと機能が形態形成に影響を与えるかどうかを試験した。野生型または構成的活性型のＹＡＰ１（５ＳＡ）の過剰発現は、空洞形成を促進した（図１０ｄ）。ＹＡＰ１転写因子とＴＥＡＤ転写因子間の相互作用は、下流の遺伝子制御に必要である。したがって、ＴＥＡＤ結合部位（Ｓ９４Ａ）に変異を含むＹＡＰ１の過剰発現は空洞形成に影響を与えず（図１０ｄおよび図１７ｊ）、ＹＡＰ１－ＴＥＡＤ相互作用を破壊する薬剤であるベルテポルフィンは芽球様細胞形成を防止した（図１７ｋ）。空洞の形態形成は、複数の液体で満たされた空洞の見かけ上の癒合を通じて発生した（図１７ｌ）。ヒト胚盤胞で最も高度に発現される水トランスポーターであるアクアポリン３（ＡＱＰ３）は、最初はすべての細胞で観察され（３６時間）、その後ＴＥアナログに限定された（９６時間）（図１７ｍ）。したがって、ヒトの胚盤胞と同様に、芽球様細胞の栄養膜の特異化および形態形成は、ａＰＫＣ、Ｈｉｐｐｏ経路の阻害、ＹＡＰ１の核移行、およびそのＴＥＡＤ転写因子に結合する能力に依存する。

実施例１１：適切な発生順序
胚盤胞では、栄養膜が最初に出現し（５～６日目、ＧＡＴＡ２^＋／ＤＡＢ２^＋）、ＰｒＥ細胞が最後に出現する（６～７日目、ＧＡＴＡ６^＋／ＡＤＭ^＋）。この順序は、ＰＫＣおよびＨｉｐｐｏシグナル伝達に関連する転写レベル（ＡＫＡＰ１２、ＣＡＰＺＢ、ＵＬＫ４、ＭＯＢ１ａ、ＡＭＯＴ、ＡＭＯＴＬ２、ＬＡＴＳ２、ＴＥＡＤ１）を変化させながら、最初に栄養膜が形成される芽球様細胞で再現される（＜２４時間、ＤＡＢ２^＋、ＣＤＸ２^＋、およびＧＡＴＡ２^＋／３^＋、図１０ｅおよび図１８ａ）。タンパク質レベルでは、初期ＴＥ様細胞は最初にＹＡＰ１^核／ＧＡＴＡ２^＋（２４時間)、次にＣＤＸ２^＋／ＧＡＴＡ３^＋を出現させたが、一方でＫＬＦ１７／ＯＣＴ４発現は維持したがＮＡＮＯＧ発現は維持しなかった（６０時間）（図１８ｂ～ｄ）。その後、ＯＣＴ４は検出できなくなった（図８ｇおよび図１２ｉ）。ＳＭＡＤ、ＥＲＫ、Ｎｏｔｃｈ、およびＷｎｔシグナル伝達経路に関連する遺伝子は、このプロセス中に調節された（図１８ｅ、ｆ）。最後に、極性栄養膜アナログは、ＯＶＯＬ１、ＧＲＥＭ２、ＣＣＲ７、ＳＰ６、およびＮＲ２Ｆ２の発現（図１０ｆおよび図１８ｇ～ｊ）、ＮＲ２Ｆ２およびＣＣＲ７の上方制御、およびＣＤＸ２の下方制御（１０ｆおよび図１８ｈ、ｊ）によって特徴づけられるように成熟した。ＥＰＩアナログのトランスクリプトームは、コア胚盤胞マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、ＳＵＳＤ２、ＫＬＦ４、ＡＲＧＦＸ、ＧＤＦ３）（図１０ｅおよび図１８ｋ、ｌ）を維持しながら、Ｎｏｄａｌ（ＮＯＤＡＬ、ＬＥＦＴＹ１／２）、およびｍＴＯＲシグナル伝達関連遺伝子（ＬＡＭＴＯＲ１／４／５、ＸＢＰ１、ＳＥＣ１３、ＭＬＳＴ８）ならびにＸ染色体活性化関連遺伝子ＸＡＣＴの制御を特徴とする時間経過に伴う進行（ｏｖｅｒｔｉｍｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を経た（図１８ｋ～ｍ）。その後、ＰｒＥアナログが出現し（＜６０時間）、ＧＡＴＡ４、ＯＴＸ２、およびＳＯＸ１７が検出された（７２時間）（図１０ｅおよび図１８ｎ～ｐ）。初期のＰｒＥマーカー遺伝子（ＧＡＴＡ６、ＬＢＨ、ＡＤＭ、およびＬＡＭＡ１）はＰｒＥアナログ間で均一に発現したが、一部の後期ＰｒＥマーカー遺伝子（ＣＴＳＥ、ＡＰＯＡ１、ＰＩＴＸ２、およびＳＬＣＯ２Ａ１）は亜集団でのみ発現し、このことは後期胚盤胞状態への進行を示唆している（図１８ｑ）。９６時間までに、成熟ＰｒＥアナログはＳＭＡＤ（ＮＯＤＡＬ、ＢＭＰ２／６、ＧＤＦ３、ＩＤ１／２）およびＷｎｔシグナル伝達関連転写物（ＷＮＴ３、ＲＳＰＯ３、ＬＢＨ）を制御しており、細胞外マトリックス組織、内皮および上皮の分化を制御する転写物（ＬＡＭＡ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＣＯＬ４Ａ１／２）に富んでいた（図１８ｑ、ｒ）。全体として、芽球様細胞系統は胚盤胞発生の順序に従って特異化し、進行した。

実施例１２：子宮内膜細胞との特異的な相互作用（ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）
ヒト胚盤胞は、極性ＴＥの受容期の（ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ）子宮内膜への対置および付着を介して、子宮内（７～９日目）で着床を開始する（図１１ａ、左）。発明者らは、芽球様細胞がこの相互作用をモデル化することができるかどうか疑問に考えた。発明者らは、子宮内膜オルガノイド（Ｂｏｒｅｔｔｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４，１７７５－１７８６（２０１７））を２Ｄで播種して、芽球様細胞の堆積を促進するオープンフェイス子宮内膜層（ＯＦＥＬ）を形成した（図１１ａ、右）。亜集団は、繊毛上皮細胞を標識するアセチル化αチューブリン（図１９ａ）および腺上皮細胞を標識するＦＯＸＡ２（図１９ｂ）について陽性であった。エストロゲン（Ｅ２）およびプロゲステロン（Ｐ４）への曝露およびＷｎｔ阻害により、着床の窓が開く。したがって、ＯＦＥＬは、分泌期中期の子宮内膜を特徴づける遺伝子の発現を上方制御し（図１９ｃ～ｅ）、増殖を減少させる（図１９ｅ、ｆ）ことによって、Ｅ２、Ｐ４、ｃＡＭＰ、およびＸＡＶ９３９に応答した。注目すべきことに、非刺激ＯＦＥＬ上に堆積した芽球様細胞は付着しなかったが、一方、芽球様細胞は、子宮内で起こるように、子宮内膜細胞に付着し、次いで反発する（ｒｅｐｕｌｓｅ）ことによって、刺激されたＯＦＥＬと相互作用した（図１１ｂ及び図１９ｇ、ｈ）。避妊薬レボノルゲストレルは芽球様細胞の付着を障害した（図１９ｉ）。発明者らは、ヒトの芽球様細胞はホルモンによって受容性が高められた子宮内膜と相互作用することができると結論付けた。

実施例１３：エピブラストはゲートキープ相互作用を示す（ｓｉｇｎａｌ）。
ヒト胚盤胞は、ＥＰＩとの接触によって規定される極性栄養外胚葉を介して子宮内膜に付着する。同様に、芽球様細胞はこの領域を介して付着を開始した（図１１ｃ、ｄおよび図２０ａ～ｃ）。発明者らは、次に、ｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅ（ＥＰＩを含まない）を形成することにより、極性／ＥＰＩ界面の重要性を試験した。ＩＬ６は極性ＴＥで高度に発現され、その受容体（ＩＬ６Ｒ、ＧＰ１３０）およびエフェクター（ＳＴＡＴ３）の転写物がＥＰＩに豊富に存在する（図２０ｄ）。ＥＰＩにおけるＳＴＡＴシグナル伝達の役割と一致して、芽球様細胞形成効率はＬＩＦ濃度とともに増加した（図９ｅ）一方、ＧＰ１３０阻害剤（ＳＣ１４４）の添加によりｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅが得られた（図１１ｅおよび図２０ｆ）。ＨｉｐｐｏキナーゼＭＳＴ１／２の強力な阻害剤（ＸＭＵ－ＭＰ－１）の存在によってもｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅが得られた（図１１ｅおよび図２０ｇ）。これらのｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅのトランスクリプトームは、それぞれ初期胚盤胞栄養膜および後期胚盤胞栄養膜を反映していた（図２０ｈ、ｉ）。両方のｔｒｏｐｈｏｓｐｈｅｒｅタイプはＯＦＥＬに付着することができず（図１１ｅ）、移植後の栄養膜細胞層（ＣＤＸ２^－／ＣＫ７^＋）を反映するｈＴＳＣの凝集物またはナイーブｈＰＳＣの凝集物も同様であった（図１１ｅおよび図２０ｊ、ｋ）。発明者らは、ＥＰＩからのシグナルが極性栄養膜の成熟を確実にし、それによって子宮内膜細胞との相互作用が可能になると結論づけた。トランスクリプトーム分析および子宮内データに基づいて、発明者らは、子宮内膜細胞の刺激および極性栄養膜の成熟により転写物がより豊富になる分子のいくつかのペアを提唱する（図２０ｌ）。これらは、胚盤胞と子宮の間のファーストタッチを仲介する可能性がある。全体として、我々は、成熟がＥＰＩ誘導に依存する着床前の極性様状態が、胚盤胞と子宮内膜との相互作用をゲートキープしていると結論付けた。

実施例１４：ポストステージのモデリング（１３日目）。
芽球様細胞の形態は、着床前培養（ｐｅｒｉ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）条件において２日間安定であった（図２１ａ）。臨床妊娠は、絨毛性ゴナドトロピンβ（ＣＧβ）ホルモンの検出によって特徴付けられる。付着すると、芽球様細胞は、標準的な妊娠検査およびＥＬＩＳＡを使用して検出可能なレベルでＣＧβを発現する栄養膜を形成した（図１１ｆおよび図２１ｂ）。ＮＲ２Ｆ２^＋極性栄養膜アナログは、着床前遺伝子サイトケラチン７（ＣＫ７）を上方制御しながら増殖し、ＣＤＸ２発現を減少させた（図２１ｃ、ｄ）。一部の栄養膜は、それぞれＣＧβおよびＨＬＡ－Ｇを発現するＳＣＴおよびＥＶＴにさらに分化した（図２１ｅ、ｆ）。ＥＰＩアナログは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２を維持し、準備刺激された多能性マーカーＣＤ２４を上方制御し（図１１ｇおよび図２１ｇ）、ＥＰＩ上皮化中と同様に皮質Ｆ－アクチンをパターン化し、一部の芽球様細胞はＦ－アクチン／ＰＯＤＸＬ^＋／ａＰＫＣ^＋が豊富な原始羊膜様腔（ｐｒｏ－ａｍｎｉｏｔｉｃ－ｌｉｋｅ ｃａｖｉｔｙ）を形成した（図１１ｇおよび図２１ｈ）。また、ＥＰＩアナログの周辺の亜集団は、ＳＯＸ２またはＴＦＡＰ２ＣとともにＣＤＸ２を発現し、これは初期の羊膜アナログを示唆した（図２１ｉ、ｊ）。ＰｒＥアナログは、ＯＴＸ２の限定された発現によって特徴づけられた（図１８ｏ、２１ｋ）。長期培養（最大６日間）すると、３つの系統は１３日目に相当する時間まで一貫して増殖した（図１１ｈおよび図２１ｌ、ｍ）が、胚盤胞と同様に、それらの組織はその発生段階を反映していなかった。

考察。
このモデルの忠実度、効率、拡張性、多用途性により、ヒトの胚盤胞の発生および着床の研究は重要である。本発明の芽球様細胞は、治療標的の同定を補助し、前臨床モデリングに貢献する（たとえば、候補ＬＰＡ／ＮＡＥＰＡ等の体外受精培地補体、または候補ＳＣ１４４等の避妊薬）。ヒト発生学のつり合い（利益と害のバランス）および補完性（道徳的に最も問題の少ない手段を使用して目標を追求すること）を考慮すると、芽球様細胞は胚を使用した研究を補完する倫理的な機会となる。

驚くべきことに、３つの阻害剤によるｈＰＳＣ凝集物の刺激は、栄養膜細胞の形成を引き起こすだけでなく、空間的に組織化された栄養膜、エピブラスト、および原始内胚葉細胞の同時形成も引き起こす。これら３種類の細胞の自発的組織化は、外層および液体で満たされた内腔を形成する栄養膜シストの形成、ならびに栄養膜シストの片側に付着したままの、エピブラストおよび原始内胚葉細胞のユニークな内部クラスターの形成によって特徴づけられる。直接的な結果として、このユニークな内部クラスターの存在によってシスト内に生じた非対称性は、極性栄養膜の局所的成熟を誘導し、子宮内膜細胞への付着の向きを決定する。

Claims (17)

1. ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）および栄養膜細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）の凝集物を、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤を含む培地中で３Ｄ培養で培養することを含む、芽球様細胞または胚盤胞様細胞凝集物を生成する方法であって、ここで該ｈＰＳＣおよび栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）の凝集物は、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦ－β阻害剤を含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養することによって生成される、方法。
2. 前記ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物が、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤をさらに含む培地中で凝集したｈＰＳＣを培養することによって生成される、請求項１に記載の方法。
3. 前記凝集したｈＰＳＣが、ｈＰＳＣを播種すること、および該播種されたｈＰＳＣを増殖培地中で培養することによって、好ましくは増殖培地中で０～６４時間、特に好ましくは１２～６４時間培養することによって凝集させることによって形成され、および／または好ましくは、増殖培地はＲＯＣＫ阻害剤を含み、特に好ましくはＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記播種されたｈＰＳＣが、好ましくはＷｎｔ阻害剤および／またはＳＴＡＴアゴニストをさらに含むＭＥＫ阻害剤および／またはＰＫＣ阻害剤で処理されており、好ましくは２Ｄ培養で処理される、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＰＫＣ阻害剤がＧｏｅ６９８３およびＲｏ－３１－８４２５から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＨＩＰＰＯ経路阻害剤が、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンド、好ましくはＬＰＡもしくはＮＡＥＰＡ、またはベルテポルフィンである；および／または前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である；および／または前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－１またはＳＢ４３１５４２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 少なくとも、前記ｈＰＳＣおよび栄養膜の凝集物から栄養外胚葉様組織、エピブラスト様組織、およびハイポブラスト様組織が形成されるまで、好ましくはさらに少なくとも胚－非胚軸が形成されるまで、細胞を培養する工程；および／または少なくとも液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層によって形成される、少なくとも１００μｍ、好ましくは少なくとも１４０μｍ、さらに好ましくは１８０μｍ～２２０μｍの全径を有する三次元細胞凝集物が形成されるまで細胞を培養する工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. エストロゲン、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール、１７α－エチニルエストラジオール、メストラノール、プロゲステロン、プロゲスチン、ｃＡＭＰ、およびＷｎｔ－阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、またはＬＦ３から選択される化合物で子宮内膜細胞を刺激する工程、および刺激された子宮内膜細胞の層上に芽球様細胞を播種して、芽球様細胞が子宮内膜細胞の層に付着および侵入することができるようにする工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 芽球様細胞の形成および／または子宮内膜細胞の層への芽球様細胞の移植に影響を与える候補化合物および／または候補遺伝子変異を試験またはスクリーニングするための、前記凝集物を少なくとも一つの候補化合物で処理すること、および／または前記凝集物に少なくとも一つの候補遺伝子改変を与えること、および請求項１～８のいずれか一項に記載の方法を実行することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. ＨＩＰＰＯ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ－β阻害剤を含む；好ましくは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）用の培地と組み合わせる、芽球様細胞の培養に適したキット。
11. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法により得られる芽球様細胞。
12. 少なくとも一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層を含み、ここで、該外側上皮単層は、ＮＲ２Ｆ２を発現する極性栄養膜（ｐｏｌａｒ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）を含む、請求項１１に記載の芽球様細胞。
13. 少なくとも一つの液体で満たされた空洞およびエピブラスト様細胞およびハイポブラスト様細胞を含む少なくとも一つの内部細胞塊を取り囲む栄養膜様細胞の外側上皮単層を含み、ここで、該外側上皮単層は、ＮＲ２Ｆ２を発現する極性栄養膜（ｐｏｌａｒ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）を含む、芽球様細胞。
14. 芽球様細胞または胚盤胞をＷｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、および／またはＬＦ３で処理する工程、および該芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層と接触させる工程を含む、芽球様細胞または胚盤胞を子宮内膜細胞の層に移植する潜在能力を増大させるインビトロ法。
15. Ｗｎｔ阻害剤、好ましくはＸＡＶ９３９、ＩＷＰ－２、ＰＮＵ－７４６５４、および／またはＬＦ３の存在下で前記胚盤胞を子宮内膜と接触させる工程を含む、または胚盤胞を子宮内膜に移植する前に、Ｗｎｔ阻害剤で子宮内膜を刺激する工程を含む；好ましくはここで該子宮内膜は、局所的に、全身的に、または胚盤胞と一緒にＷｎｔ阻害剤と接触される、胚盤胞着床の確率を増大させる方法において使用するためのＷｎｔ阻害剤。
16. １細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期、または胚盤胞期から選択される初期段階の胚を成熟胚盤胞期まで、ＨＩＰＰＯ経路阻害剤で、特に好ましくはＮＡＥＰＡまたはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体のリガンドで、さらにより好ましくはＬＰＡで、処理する工程、および１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期、もしくは１６細胞期、または桑実胚期の胚を胚盤胞期まで成長させる工程、もしくは胚盤胞期の胚をより成熟した胚盤胞期（ｍｏｒｅ ｍａｔｕｒｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｔａｇｅ）まで成長させる工程を含む、胚盤胞の作製方法。
17. ＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４を患者に投与する工程、および／または胚をインビボでＭＳＴ１／２阻害剤、好ましくはＸＭＵ－ＭＰ－１、および／またはＳＴＡＴ阻害剤、好ましくはＳＣ１４４と接触させる工程を含む、避妊方法。