JP2018531011A - 中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、神経発達疾患及び神経変性疾患を研究するために有用な中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法を提供する。神経上皮幹細胞は、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で、それらと分化培地とを接触させることによって脳オルガノイドを作製するための開始集団として役立つ。

Description

［背景技術］
中脳又は中頭は、視覚、聴覚、運動コントロール、睡眠／起床、覚醒状態（覚醒）及び温度レギュレーションに関連する中枢神経系の一部である。胚発生中、中脳は、神経管の中頭としても公知の２番目のベシクルから生じる。他の２つのベシクル（前脳及び後脳）とは異なり、中脳は、その後の神経発生では未分割のままである。

中脳はまた、神経伝達物質ドーパミン（ＤＡ）の大部分が産生される脳の領域である。ドーパミンは、とりわけ、ヒトから昆虫などの最も原始的な動物に至る種の動機付け及び習慣化において主要な役割を果たす。ＤＡを産生するニューロンの領域は被蓋から生じ、黒質緻密部（ＳＮｃ、Ａ９グループ）及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ、Ａ１０グループ）と称される。特に、ＳＮｃの中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンは、複数の脳機能のコントロールにおいて重要な役割を果たす。それらの軸索は皮質の背側線条体に吻側的に上行し、そこで、神経伝達物質ドーパミンを放出する（Abeliovich and Hammond, 2007; Gale and Li, 2008）。黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする進行性神経変性障害であるパーキンソン病（ＰＤ）では、この領域のｍＤＡニューロンが変性を選択的に受けるので、ＳＮｃは特に興味深い。ｍＤＡニューロンの喪失は、生理学的条件下における随意的な身体運動をコントロールする線条体におけるＤＡの欠如につながる（Abeliovich and Hammond, 2007）。ＰＤでは、ＤＡニューロンの変性及びそれに続く線条体におけるＤＡの欠如は、振戦、動作緩慢及び硬直を含む運動症候に関連する。複数の遺伝子の突然変異又は欠失がこの病状の素因であることが確認されている。

ドーパミン作動性系統へのニューロン分化は複雑なプロセスであり、特定の転写因子の逐次的活性化に大きく依拠する。哺乳動物では、ｍＤＡ前駆細胞は、Ｅ７．５において発生し始める。ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）（これらは両方とも、ＳＨＨシグナリングによって誘導される）は、ｍＤＡ分化の重要な決定因子である。ＬＭＸ１Ａの発現はドーパミン作動性分化をトリガーし、神経発生のネガティブレギュレーターの阻害因子であるＭＳＸ１／２をリクルートする。さらに、それは、ｍＤＡニューロンの適切な発生に必要な神経促進因子、例えばニューロゲニン２（ＮＧＮ２）の発現を誘導する（Gale and Li, 2008）。成熟すると、Ｅ１０．５〜Ｅ１１．５において、ｍＤＡ前駆体は遊走して増殖領域を出る。この段階において、ｍＤＡニューロン（mDA neuons）の表現型マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（ドーパミン合成の律速酵素）が誘導され、ｍＤＡ前駆細胞は、初期ニューロンマーカーであるβＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）を発現し始める（Abeliovich and Hammond, 2007）。

ＣＮＳの発生及び特異化の基礎研究の多くは、マウス胚及びニワトリ胚において行われている。機構の多くは、哺乳動物間で保存されている可能性があるが、マウス及びヒトの神経発生間には大きな違いがある。例えば、ヒトでは、皮質のサイズが著しく増加する。外側脳室下帯又は内側線維層などのいくつかの領域は、マウスでは全く存在しないが、ヒトでは存在する。特に、齧歯類は生来、ＰＤ及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害にかからない。神経発生の違いに加えて、明白であるが顕著な別の違いは会話能力である。

パーキンソン病は、黒質緻密部中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする。重度の細胞死に至る根本的な機構はほとんど理解されていない。特に、動物が罹患しない複雑な病状、例えば神経変性障害の場合には、マウスモデルは、in vivoで見られる表現型を再現し得ないことが多い。この理由により、ヒトと、in vivoモデル系として最も頻繁に使用されるマウスとの間の違い、及び２Ｄ細胞培養の欠点を考慮すると、特に神経発達疾患及び神経変性疾患の研究の観点から、ヒト脳発生のロバストなin vitroモデルに対する明白な必要性が存在する。

本出願の根底にある技術的問題は、この必要性に応じることである。前記技術的問題の解決策は、特許請求の範囲に反映されており、本明細書に記載されており、図面に示されており、本出願の実施例に例示されている中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法の提供である。

驚くべきことに、本発明者らは、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で神経上皮幹細胞を培養した場合、前記神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることによって、中脳オルガノイドを取得することができたことを観察した。具体的には、本発明者らは、ヒト神経上皮幹細胞（ｈＮＥＳＣ）と称されるヒト神経前駆細胞株を使用し、これが、中脳オルガノイドの作製のための開始集団として機能した。三次元細胞培養を可能にするマトリックスに単一コロニーを包埋した（前記マトリックスは、例えば、Matrigelの小滴である）。Matrigel小滴は、例えば、Lancaster and Knoblich (2014a)に記載されている。連続スピニングなどの撹拌条件下で、単一コロニーを培養した。分化に使用した培地は、とりわけ、本明細書に記載される中脳発生の誘導のためのシグナリング分子を含有していた。いくつかの時点において、中脳特異的構造への分化が実際に検出可能であるかを決定するために、免疫組織化学的染色を使用して、中脳オルガノイドを特性評価した。約３週間の分化後、中脳オルガノイドは、ドーパミン作動性ニューロン及び非対称組織化を含むいくつかの神経細胞型を発達させたが、これは、in vivoにおける脳発生と一致する。このような中脳オルガノイドは、例えば、神経発達疾患及び／又は神経変性疾患、例えばパーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病を研究するために使用され得る３Ｄモデルとして機能し得る。

研究中、本発明者らは、低接着表面を有する丸底プレート上に播種したＮＥＳＣが球状コロニーを形成し、これが急速に拡大したことを観察した（図４）。しかしながら、栄養素交換が限られていたので、これは、コロニーの中心における細胞死の増加を伴った。６日目〜１０日目の初期オルガノイドの切片化により、コア中の細胞の大部分が死滅していたことが明らかになった。しかしながら、驚くべきことに、３Ｄ構造を撹拌条件下に置いた場合、細胞死は有意に減少した。

三次元細胞培養を可能にするマトリックス（例えば、MATRIGEL）に包埋して撹拌条件下に置いたＮＥＳＣはさらに成長し、長い突起を急速に発達させ始め、これがＥＣＭ全体を通して遊走した（図４ｄ〜ｆ）。これらの突起はニューロンマーカーＴＵＪ１を発現し、ＭＡＰ２を部分的に発現した（これらは、軸索形成の指標である）（図６及び図７）。神経新生の際、幼若ニューロンは、前端突起及び後端突起を有する双極形態を採り、胚期１１〜１８日目において、これが最終的には軸索になる（Lewis et al., 2013）。細胞体は、コアに隣接して主に位置していた。維持条件下では、ｈＮＥＳＣは、神経前駆体マーカーＳＯＸ１、ＳＯＸ２及びネスチンを安定発現する（図３）。超低接着プレート上に播種した初期中脳オルガノイドでは、この発現パターンが保持される（図５）。２４日間の分化後において、いくつかのＳＯＸ２陽性細胞はオルガノイドの内部にとどまっており、ＴＨ陽性ＤＡニューロンに隣接していた（図７）。in vivoにおける中脳発生の経過中、中脳領域の神経上皮が肥厚して層状になる。いくつかの神経幹細胞は内層にとどまり、それらの増殖特性を保持するが、他の細胞は中間帯に遊走し、ｍＤＡニューロンに分化し始める。未成熟ニューロンは遊走し続けて、それらが成熟ニューロンになる辺縁帯に到達する。ｍＤＡニューロン前駆体は、ＬＭＸ１、ＦＯＸＡ２、ＴＨ及びニューロンマーカーＴＵＪ１を発現する（Ang, 2009; Gale and Li, 2008）。in vitroでは、中脳オルガノイドは類似の層構造を発達させるようであり、神経幹細胞は内部コアに依然として隣接しており、ｍＤＡニューロンは基底部に遊走する。分化条件下では、６日後に、ＤＡニューロンが発達し始めた。興味深いことに、ＤＡニューロン及び神経前駆体が特定領域に蓄積し、３０日目及び４４日目において組織全体に均等に分布していなかったが、これは、Ｄ−Ｖ軸に沿った中脳オルガノイドの自己パターン形成を示唆している（図６及び図７）。しかしながら、全てのＴＨ陽性細胞が必ずしもＤＡニューロンではない。ドーパミン、ノルアドレナリン及びアドレナリンを含む全てのカテコールアミンは、チロシンから合成される。ＴＨは、チロシンからＬ−ＤＯＰＡを生成する律速酵素である（Sharples et al., 2014）。ＴＨ^＋細胞が実際にＤＡニューロンであることを確認するために、ＤＡＴなどのさらなるマーカーを検討すべきである。重要なことに、in vivoにおける脳発生と同様に、中脳オルガノイドは、非対称極性構造を発達させた。この目的のために、本発明者らは、中脳オルガノイドを作製するための開始集団として神経上皮幹細胞を使用して、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養でそれらと分化培地とを接触させることによって、中脳オルガノイドを作製することに成功した。

したがって、一態様では、本発明は、中脳オルガノイドを作製する方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する方法を提供する。

別の態様では、本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な中脳オルガノイドを提供し、また別の態様では、前記中脳オルガノイドに対する細胞応答を誘発する能力について化合物を試験するための、本発明の中脳オルガノイドの使用及び適用方法を提供する。

さらに、さらなる態様では、本発明は、移植において使用するための、本明細書に記載される中脳オルガノイドを提供する。

本明細書に記載される中脳オルガノイドの作製のために神経上皮幹細胞を成功裏に使用し得ることを認識したので、またさらなる態様では、本発明はまた、中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用を提供する。

本発明の上記態様及びそれらの好ましい態様はまた、以下の項目に要約され得る：
（１）中脳オルガノイドを作製するための方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞（のみ）と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する、方法。
（２）前記神経上皮幹細胞がヒト神経上皮幹細胞であり、好ましくは、前記神経上皮細胞がＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びネスチンを発現する、項目１に記載の方法。
（３）前記神経上皮幹細胞がｈＮＥＳＣ−Ｋ７又はｓｍＮＰＣである、項目２に記載の方法。
（４）前記神経上皮幹細胞が、遺伝子改変されたものであるか、又は神経学的疾患を患っている患者から取得されたものである、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（５）遺伝子改変が突然変異、ノックアウト又はノックインを含む、項目４に記載の方法。
（６）神経学的疾患が、パーキンソン病、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病のような神経変性疾患である、項目４に記載の方法。
（７）前記神経上皮幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生産されたものである、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）ｉＰＳＣが、線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生産されたものであり、該線維芽細胞又はＰＢＭＣが、好ましくは患者から取得されたものである、項目７に記載の方法。
（９）ゲル、バイオリアクターで、超低接着条件又はマイクロチップ、好ましくはヒドロゲル及び／又はMatrigel小滴のようなヒドロゲル小滴で、三次元細胞培養を実施する、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（１０）マトリックスが細胞外マトリックスであり、並びに／又はマトリックスが、天然分子、合成ポリマー、生物学的合成ハイブリッド、金属、セラミック、生物活性ガラス及び／若しくはカーボンナノチューブの１つ以上を含む、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（１１）マトリックスが、コラーゲン、Matrigel、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、絹フィブリル、ＰＥＧのようなエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）及び／又はポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）を含み、好ましくは、マトリックスがMatrigelを含む、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（１２）前記分化培地（分化培地Ｉ）が、
（ｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；
（ｉｉ）少なくとも２つの異なるニューロトロフィン；及び
（ｉｉｉ）抗酸化剤
を含む、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３）前記分化培地（分化培地ＩＩ）が、
（ｉ）少なくとも２つの異なるニューロトロフィン；及び
（ｉｉ）抗酸化剤
を含む、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（１４）ＳＨＨ経路活性化剤が、パルモルファミン、ＳＨＨ、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ）、Ｈｈ−Ａｇ １．５及びＧｌｉ−２からなる群より選択され、好ましくは、ＳＨＨ経路活性化剤がパルモルファミンである、項目１２に記載の方法。
（１５）少なくとも２つのニューロトロフィンが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ及びＧＤＮＦからなる群より選択され、好ましくは、少なくとも２つのニューロトロフィンがＧＤＮＦ及びＢＤＮＦである、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
（１６）抗酸化剤が、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ２、スーパーオキシドジスムターゼ３、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンＥ及び尿酸からなる群より選択され、好ましくは、抗酸化剤がアスコルビン酸である、項目１２〜１５のいずれかに記載の方法。
（１７）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）が、アクチビン／トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリング経路の活性化剤をさらに含み、及び／又は分化培地ＩＩがＳＨＨ経路活性化剤を含まない、項目１２〜１６のいずれかに記載の方法。
（１８）アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ及びｎｏｄａｌからなる群より選択され、好ましくは、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤がＴＧＦβ３である、項目１７に記載の方法。
（１９）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）がｃＡＭＰ類似体をさらに含む、項目１２〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）ｃＡＭＰ類似体が、フォルスコリン、８−（４−クロロ−フェニルチオ）−２′−Ｏ−メチルアデノシン−３′，５′−サイクリックモノホスファート（８ＣＰＴ−２Ｍｅ−ｃＡＭＰ）、８−クロロ−ｃＡＭＰ（８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ）、ブクラデシン、Ｒｐ−アデノシン、３’，５’，−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩（Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ）、Ｓｐ−８−ヒドロキシアデノシン、３’，５’，−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩（Ｓｐ−８ＯＨ−ｃＡＭＰＳ）及びＲｐ８−ヒドロキシアデノシン、３’，５’，−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩（Ｒｐ−８ＯＨ−ｃＡＭＰＳ）及びｄｂｃＡＭＰからなる群より選択され、好ましくは、ｃＡＭＰ類似体がｄｂｃＡＭＰである、項目１９に記載の方法。
（２１）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）がＮ２Ｂ２７培地である、項目１２〜２０のいずれかに記載の方法。
（２２）Ｎ２Ｂ２７培地が、等量のNeurobasal培地及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む、項目２１に記載の方法。
（２３）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）が、ペニシリン及びストレプトマイシンをさらに含む、項目１２〜２２のいずれかに記載の方法。
（２４）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）が、グルタミン、好ましくはＬ−グルタミン、より好ましくは２mMの濃度のＬ−グルタミンをさらに含む、項目１２〜２３のいずれかに記載の方法。
（２５）分化培地が、好ましくは１：１００（サプリメント：培地）の濃度で、ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントをさらに含む、項目１２〜２４のいずれかに記載の方法。
（２６）分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）が、好ましくは１：２００（サプリメント：培地）の濃度で、Ｎ２サプリメントをさらに含む、項目１２〜２５のいずれかに記載の方法。
（２７）分化培地（分化培地Ｉ及び／又は分化培地ＩＩ）がＦＧＦ８を含まない、項目１２〜２６のいずれかに記載の方法。
（２８）細胞を分化培地Ｉ中に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地Ｉ中に６日間置き、及び／又は細胞を分化培地ＩＩ中に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２４日間、３８日間、４０日間、５０日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地ＩＩ中に１日間、２４日間若しくは３８日間置く、項目１２〜２７のいずれかに記載の方法。
（２９）６日間の分化後に、分化培地からＳＨＨ経路活性化剤を除外することによって、分化培地Ｉを分化培地ＩＩと交換する、項目２８に記載の方法。
（３０）
８日間の分化後に、ＦＧＦ８を分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）に追加する、項目２９に記載の方法。
（３１）神経上皮幹細胞を分化培地と接触させる前に、それらを維持培地と接触させる、項目１〜３０のいずれかに記載の方法。
（３２）維持培地が、
（ｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；
（ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；及び
（ｉｉｉ）抗酸化剤
を含む、項目３１に記載の方法。
（３３）維持培地が、項目２１〜２７のいずれか一項で定義されるＮ２Ｂ２７培地を含む、項目３１又は３２に記載の方法。
（３４）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤が、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−スポンジン２又はＷＮＴタンパク質からなる群より選択される、項目３２又は３３に記載の方法。
（３５）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤が、例えばｓｉＲＮＡを介してアキシン又はＡＰＣを遮断する、項目３２〜３４のいずれかに記載の方法。
（３６）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤がＧＳＫ−３阻害剤である、項目３２〜３４のいずれかに記載の方法。
（３７）ＧＳＫ−３阻害剤が、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＳＢ−２１６７６３、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム、タイドグルーシブ、ＧＳＫ−３阻害剤１、ＡＺＤ１０８０、ＴＤＺＤ−８、ＴＷＳ１１９、ＣＨＩＲ−９９０２１ ＨＣｌ、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ ４１５２８６、ＳＢ ２１６７６３、ＬＹ２０９０３１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８及びＩＭ−１２からなる群より選択され、好ましくは、ＧＳＫ−３阻害剤がＣＨＩＲ ９９０２１である、項目３６に記載の方法。
（３８）二次元細胞培養及び／又は三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を行う、項目３１〜３７に記載の方法。
（３９）三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間又はそれ以上実施し、好ましくは、三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を２日間実施する、項目３８に記載の方法。
（４０）神経上皮幹細胞がコロニー中に存在する、項目１〜３９のいずれかに記載の方法。
（４１）コロニーが細胞クローンのクラスタである、項目４０に記載の方法。
（４２）神経上皮幹細胞の前記コロニーが、項目３１〜３９のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間又はそれ以上培養することによって取得可能であり、好ましくは、項目３１〜３９のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を１０日間培養することによって取得可能である、項目４０又は４１に記載の方法。
（４３）少なくとも５０個、５００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、１１０００個、１２０００個、１３０００個、１４０００個、１５０００個、１６０００個又はそれ以上の神経上皮幹細胞、好ましくは約９０００個の神経上皮幹細胞を開始細胞集団として使用する、項目４２に記載の方法。
（４４）神経上皮幹細胞のコロニーが、丸底超低接着９６ウェルプレート及び／又は超低接着２４ウェルプレート及び／又は三次元細胞培養で神経上皮細胞を培養することによって取得可能である、項目４０〜４３のいずれかに記載の方法。
（４５）Matrigel小滴で神経上皮幹細胞のコロニーを少なくとも１日間培養する、項目４０〜４４のいずれかに記載の方法。
（４６）分化開始の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後又はそれ以上後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養し、好ましくは、分化開始の２日後又は４日後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養する、項目９〜４５のいずれかに記載の方法。
（４７）前記撹拌条件が、三次元細胞培養の振盪、スピニング、スターリング、移動及び／又は混合を含む、項目１〜４６のいずれかに記載の方法。
（４８）スピニングバイオリアクターを用いてスピニングを実施し、及び／又はオービタルシェーカーを用いて振盪を実施する、項目４７に記載の方法。
（４９）前記オービタルシェーカーを少なくとも４０rpm、５０rpm、６０rpm、７０rpm、８０rpm、９０rpm、１００rpm、１１０rpm又はそれ以上で振盪し、好ましくは、前記オービタルシェーカーを８０rpmで振盪する、項目４７又は４８に記載の方法。
（５０）（ｉ）神経上皮幹細胞と、項目３２〜３９のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること；
（ｉｉ）マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と、項目１２、１４〜３０のいずれか一項で定義される分化培地（Ｉ）とを接触させること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地Ｉ中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した０日後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後又はそれ以上後、好ましくは２日後又は４日後に開始される；
（ｉｉｉ）撹拌条件下で神経上皮幹細胞と、項目１３〜３０のいずれか一項で定義される分化培地（ＩＩ）とを接触させること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目１〜４９のいずれかに記載の方法。
（５１）（ｉ）神経上皮幹細胞と、項目３２〜３９のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること；
（ｉｉ）維持培地中で該神経上皮幹細胞を１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又はそれ以上培養すること；
（ｉｉｉ）神経上皮幹細胞と、項目１２、１４〜３０のいずれか一項で定義される分化培地（Ｉ）とを接触させること；
（ｉｖ）分化培地Ｉ中で工程（ｉｉｉ）の細胞を１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又はそれ以上培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地Ｉ中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した０日後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後又はそれ以上後、好ましくは２日後に開始される；
（ｖ）工程（ｉｖ）において取得した細胞と、項目１３〜３０のいずれか一項で定義される分化培地ＩＩとを接触させること；並びに
（ｖｉ）撹拌条件下、分化培地ＩＩ中で工程（ｖ）の細胞を１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目１〜５０のいずれかに記載の方法。
（５２）工程（ｉｉ）における神経上皮幹細胞の培養を９日間又は１０日間実施する、項目５１に記載の方法。
（５３）工程（ｉｖ）の細胞の培養を６日間実施する、項目５１又は５２に記載の方法。
（５４）工程（ｉｖ）の細胞の培養を１日間、２４日間又は３８日間実施する、項目５１〜５３のいずれかに記載の方法。
（５５）１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間又はそれ以上の分化後に、中脳オルガノイドが取得可能であり、好ましくは、分化を６日間、７日間、１６日間、３０日間又は４４日間実施する、項目１〜５４のいずれかに記載の方法。
（５６）前記中脳オルガノイドが初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドである、項目１〜５５のいずれかに記載の方法。
（５７）初期中脳オルガノイドが、１日間、２日間、３日間、４日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間又は２０日間分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、初期中脳オルガノイドが、６日間、７日間又は１６日間分化したものである、項目５６に記載の方法。
（５８）後期中脳オルガノイドが、少なくとも２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、５０日間、６０日間又はそれ以上分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、後期中脳オルガノイドが、３０日間、４４日間又は５１日間分化したものである、項目５６に記載の方法。
（５９）前記中脳オルガノイドが、
（ａ）神経前駆細胞；
（ｂ）幼若ニューロン；
（ｃ）幼若ドーパミン作動性ニューロン；
（ｄ）成熟ニューロン；
（ｅ）成熟ドーパミン作動性ニューロン；
（ｆ）中脳オルガノイドの非対称組織化；
（ｇ）オリゴデンドロサイト；
（ｈ）オリゴデンドロサイト前駆体；
（ｉ）アストロサイト；及び／又は
（ｊ）中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目１〜５８のいずれかに記載の方法。
（６０）初期中脳オルガノイドが、
（ａ）神経前駆細胞；
（ｂ）幼若ニューロン；及び／又は
（ｃ）Ｋｉ６７−陽性細胞 及び／又は
（ｄ）幼若ドーパミン作動性ニューロン
を含む、項目５６、５７又は５９のいずれかに記載の方法。
（６１）後期中脳オルガノイドが、
（ａ）神経前駆細胞；
（ｂ）幼若ニューロン；
（ｃ）幼若ドーパミン作動性ニューロン；
（ｄ）成熟ニューロン；
（ｅ）好ましくはドーパミンを含むか若しくは産生する成熟ドーパミン作動性ニューロン；
（ｆ）中脳オルガノイドの非対称組織化；
（ｇ）好ましくはＯ４及び／若しくはＣＮＰａｓｅを発現するオリゴデンドロサイト；
（ｈ）好ましくはＮＧ２を発現するオリゴデンドロサイト前駆体；
（ｉ）好ましくはＳ１００ｂ及び／若しくはＧＦＡＰを発現するアストロサイト；
（ｊ）オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化；及び／又は
（ｋ）中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目５６、５８又は５９のいずれかに記載の方法。
（６２）前記神経前駆細胞がマーカーＳＯＸ２及び／若しくはネスチンの発現を特徴とする、項目５９〜６１のいずれかに記載の方法。
（６３）
前記幼若ニューロンがマーカーＴＵＪ１の発現を特徴とする、項目５９〜６２のいずれかに記載の方法。
（６４）
前記幼若ドーパミン作動性ニューロンがマーカーＴＵＪ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現を特徴とする、項目５９〜６３のいずれかに記載の方法。
（６５）
前記成熟ニューロンがマーカーＭＡＰ２の発現を特徴とする、項目５９〜６４のいずれかに記載の方法。
（６６）
前記成熟ドーパミン作動性ニューロンがマーカーＭＡＰ２、ＴＨ、ＦＯＸＡ２の発現及び／若しくはマーカーＬＭＸ１Ａの発現を特徴とし、並びに／又は前記成熟ドーパミン作動性ニューロンが、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、ＮＵＲＲ１、ＡＡＤＣ及び／若しくはＴＨをコードするｍＲＮＡの発現を特徴とする、項目５９〜６５のいずれかに記載の方法。
（６７）中脳オルガノイドの非対称組織化が、ドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化及び／又は中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化である、項目５９〜６６のいずれかに記載の方法。
（６８）前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化が、
（ａ）成熟ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの最外部にあり；
（ｂ）幼若ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの内部にある
という局在性を特徴とする、項目５９〜６７のいずれかに記載の方法。
（６９）幼若ドーパミン作動性ニューロンが、成熟すると中脳オルガノイドの最外部に向かって遊走する、項目６８に記載の方法。
（７０）中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化が、神経前駆体が中脳オルガノイドの内部コア周辺の環状構造にあるという局在性を特徴とする、項目５９〜６９のいずれかに記載の方法。
（７１）前記オリゴデンドロサイトがマーカーＯ４の発現及び／又はマーカーＣＮＰａｓｅの発現を特徴とする、項目５９〜７０のいずれかに記載の方法。
（７２）前記オリゴデンドロサイト前駆体がマーカーＮＧ２の発現を特徴とする、項目５９〜７１のいずれかに記載の方法。
（７３）前記アストロサイトがマーカーＧＦＡＰ及び／又はＳ１００ｂの発現を特徴とする、項目５９〜７２のいずれかに記載の方法。
（７４）前記オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化が、中脳オルガノイドの特定領域における２個超、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のドーパミン作動性ニューロンの蓄積を特徴とする、項目５９〜７３のいずれかに記載の方法。
（７５）前記中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起が、０．１mm、０．２mm、０．３mm、０．４mm、０．５mm、０．６mm、０．７mm、０．８mm、０．９mm、１mm、１．１mm、１．２mm又はそれ以上の長さを有する、項目５９〜７４のいずれかに記載の方法。
（７６）神経上皮幹細胞が、
ａ）場合により、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を取得／提供すること；
ｂ）
（ｉ）アクチビン／トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリング阻害剤；
（ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
（ｉｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリング阻害剤；及び
（ｉｖ）ＳＨＨ経路活性化剤
を含む培地中で、前記ｉＰＳＣを培養すること；並びに
ｃ）
（ｉ）アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤；
（ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
（ｉｉｉ）ＢＭＰシグナリング阻害剤；及び
（ｉｖ）ＳＨＨ経路活性化剤
を含む培地中で、ｂ）において取得した細胞を培養すること；並びに
ｄ）
（ｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
（ｉｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；及び
（ｉｉｉ）抗酸化剤
を含む培地中で、ｃ）において取得した細胞をさらに培養すること
を含み、それにより、神経上皮幹細胞を取得する方法によって取得可能である、項目１〜７５のいずれかに記載の方法。
（７７）ｅ）
（ｉ）ＦＧＦシグナリング活性化剤；
（ｉｉ）ＥＧＦシグナリング活性化剤；及び
（ｉｉｉ）ＬＩＦシグナリング活性化
を含む培地中で、ｄ）において取得した細胞を維持することをさらに含む、項目７６に記載の方法。
（７８）項目１〜７７のいずれかに記載の方法によって取得可能な、中脳オルガノイド。
（７９）前記中脳オルガノイドに対する細胞応答を誘発するそれらの能力について化合物を試験するための、項目７８に記載の中脳オルガノイドの使用。
（８０）前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は（共培養）細胞である、項目７９に記載の使用。
（８１）前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目７９又は８０に記載の使用。
（８２）前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目８１に記載の使用。
（８３）細胞応答を誘発するその能力について目的の化合物を試験するための方法であって、
（ａ）項目７８に記載の中脳オルガノイドと前記目的の化合物とを接触させること；及び
（ｂ）前記目的の化合物が細胞応答を誘発するかを決定すること
を含む、方法。
（８４）前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は（共培養）細胞である、項目８３に記載の方法。
（８５）前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目８３又は８４に記載の方法。
（８６）前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目８５に記載の方法。
（８７）項目７８で定義される中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロンの分化及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を促進又は阻害する分子を同定するための方法であって、該中脳オルガノイドと目的の分子とを接触させることを含み、
コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を促進し、及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を阻害することを示し、コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の減少が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を阻害し、及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を誘導することを示す、方法。
（８８）神経突起伸長を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目８７に記載の方法。
（８９）ＴＨの発現を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目８７又は８８に記載の方法。
（９０）コントロールが、目的の分子と接触されていない中脳オルガノイドである、項目８７〜８９のいずれかに記載の方法。
（９１）項目７８に記載の中脳オルガノイドユニットを含む、組成物。
（９２）医薬組成物である、項目９１に記載の組成物。
（９３）中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用。
（９４）移植において使用するための、項目７８に記載の中脳オルガノイド。

特に、本明細書に記載される方法はまた、
（ｉ）神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される維持培地とを接触させること；
（ｉｉ）維持培地中で該神経上皮幹細胞を１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又はそれ以上培養し、好ましくは、維持培地中で該神経上皮幹細胞を１０日間培養し、場合により、８日後に、該神経上皮幹細胞をMatrigel小滴に移すこと；
（ｉｉｉ）神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される分化培地（Ｉ）とを接触させること；
（ｉｖ）分化培地Ｉ中で工程（ｉｉｉ）の細胞を１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又はそれ以上、好ましくは６日間培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地Ｉ中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した０日後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後又はそれ以上後、好ましくは４日後に開始される；
（ｖ）工程（ｉｖ）において取得した細胞と、本明細書で定義される分化培地ＩＩとを接触させること；並びに
（ｖｉ）撹拌条件下、分化培地ＩＩ中で工程（ｖ）の細胞を１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得し得る。

「オルガノイド」は、器官全体に似る。オルガノイドは、固有の自己組織化能力を示し、器官の細胞構成を形成する。診断用途及び治療用途について、オルガノイドは非常に有望である。本発明のオルガノイドは、好ましくは、中脳オルガノイドである。したがって、本発明の中脳オルガノイドは、中脳に似る。中脳は、神経伝達物質ドーパミン（ＤＡ）の大部分が産生される脳の領域である。好ましくは、本発明の中脳オルガノイドは、ＮＥＳＣ、好ましくはｈＮＥＳＣの単一コロニーに由来する。本発明の中脳オルガノイドは、好ましくは、中脳の表現型を有する。本発明の中脳オルガノイドは、初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドのいずれかである。本発明の中脳オルガノイドは、好ましくは、中脳の表現型を有する。このように、それは、中脳の典型的な細胞／細胞型を含む。したがって、本発明の中脳オルガノイドは、神経前駆細胞、幼若ニューロン、幼若ドーパミン作動性ニューロン、成熟ニューロン、成熟ドーパミン作動性ニューロン、非対称組織化、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト、及び／又は中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起を含む。これらの細胞型は、好ましくは、本明細書に記載されるマーカーを特徴とする。同様に、非対称組織化は、好ましくは本明細書に記載されるように、ドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化、及び中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起を特徴とする。本発明の中脳オルガノイドにおける細胞／細胞型の存在は、当技術分野で公知の及び本明細書に記載される手段及び方法によって試験され得る。同様に、前記細胞／細胞型又は非対称組織化による本明細書に記載されるマーカーの発現は、当技術分野で公知のように及び本明細書に記載されるように試験され得る。

オルガノイドは、変性及び発達性の疾患及び／又はガンをモデリングする能力を有し、遺伝性障害を研究するための、及び微妙な表現型を同定するための有益なツールである。患者由来の体細胞はｉＰＳＣに再プログラミングされ得、それに由来するオルガノイドは、薬物試験のための患者特異的モデルとして、又は臓器補充療法のための再生医療において使用され得る。ｈｉＰＳＣ由来オルガノイドにおける突然変異の挿入及び修正は、疾患機構の理解に役立ち得る。有利には、これは、本発明によって想定される（すなわち、本発明の中脳オルガノイドは、例えば、神経発達疾患及び／又は神経変性疾患、例えばパーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病を研究するために使用され得るモデルとして機能し得る）。

本発明の方法は任意の細胞培養で行われ得るが、しかしながら、三次元細胞培養が好ましい。培養条件は変動し得るが、細胞が培養される人工環境は常に、以下：必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、成長因子、ホルモン、ガス（Ｏ_２、ＣＯ_２）及び／又はレギュレーションされた物理化学的環境（ｐＨ、浸透圧、温度）を供給する基材又は培地の１つ以上を含む適切な容器からなる。本明細書に記載される細胞培養は、コントロールされた実験室環境における細胞の維持及び成長を指す。実験的細胞生物学的研究では、このようなin vitro細胞培養モデルは周知である。例えば、細胞は、固体基材又は半固体基材に接着させて培養され得る（接着培養又は単層培養）。細胞はまた、培養培地中で浮遊させて成長され得る（懸濁培養）。しかしながら、本発明の細胞は、撹拌条件下で培養されることが好ましい。

維持培地又は分化培地のような細胞培養のための培地は、本明細書の他の箇所、例えば上記項目に記載されている。

本発明の方法において適用される分化培地は、少なくとも２つの異なるニューロトロフィンを含む。本明細書で使用される「ニューロトロフィン」という用語は、ニューロンの生存、発生及び機能をレギュレーションするタンパク質のファミリーに関する。例示的なニューロトロフィンとしては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）並びにリガンドのＧＤＮＦファミリー及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられる。リガンドのＧＤＮＦファミリーとしては、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）及びペルセフィン（ＰＳＰＮ）が挙げられる。

したがって、「少なくとも２つの異なるニューロトロフィン」という用語は、列挙されている分子の２つ以上を指す。好ましくは、少なくとも２つの異なるニューロトロフィンは、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦである（遺伝子記号：それぞれＢＤＮＦ及びＧＤＮＦ）。ＢＤＮＦは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ２３５６０（１９９１年１０月３１日のバージョン１）のヒトＢＤＮＦタンパク質であり得る。ＧＤＮＦは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ３９９０５（１９９５年１月３１日のバージョン１）のヒトＧＤＮＦタンパク質であり得る。

ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦは両方とも互いに独立して、それぞれ約０．０００１〜約５０ng/μL、より好ましくはそれぞれ約０．００１〜約２５ng/μLの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量はそれぞれ約０．００１ng/μLの濃度である。ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦは、例えば、Peprotechから取得され得る。

本発明の方法において適用される分化培地は、抗酸化剤をさらに含み得る。抗酸化剤は、他の分子の酸化を阻害する分子である。「酸化」及び「抗酸化剤」という用語は当技術分野で周知であり、例えばNordberg J, Arner ES. (2001) “Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system.” Free Radic Biol Med. 31(11):1287-312に記載されている。要するに、酸化は、電子の喪失又は酸化状態の増加を伴う化学反応である。酸化反応は、フリーラジカルを生成し得る。次に、これらのラジカルが、連鎖反応を開始させ得る。細胞において連鎖反応が起こると、それは、細胞に損傷又は死を引き起こし得る。抗酸化剤は、フリーラジカル中間体を除去することによって、これらの連鎖反応を停止させ、他の酸化反応を阻害する。したがって、抗酸化剤は、細胞酸化プロセスに関与する分子の阻害剤を指す。

例示的な抗酸化剤としては、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ２、スーパーオキシドジスムターゼ３、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンＥ又は尿酸が挙げられる。したがって、抗酸化剤は、アスコルビン酸であり得る。

本明細書に記載される細胞培養のための任意の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有し得る。本明細書で使用される「ＲＯＣＫ阻害剤」は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼの阻害剤として作用する（すなわち、ＲＯＣＫ機能を低減又はさらには無効化にする）化合物である。ＲＯＣＫ阻害剤として作用する化合物の能力は、様々な手段によって、例えば、ＲＯＣＫに対する結合についてＡＴＰと競合するその能力を決定することによって、並びに／又はIshizaki T Mol Pharmacol. 2000 May;57(5):976-83に記載されているように細胞形態、Ｇ１−Ｓ移行及び細胞質分裂に対するその効果を評価することによって評価され得る。阻害剤は、ＲＯＣＫアイソフォームＲＯＣＫ１及び／又はＲＯＣＫ２のいずれかに非特異的又は特異的であり得る。当技術分野で公知のＲＯＣＫ阻害剤は、Liao et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2007 Jul; 50(1): 17-24に概説されており、ファスジル、Ｙ−２７６３２、チアゾビビン、Ｙ３９９８３、Ｗｆ−５３６、ＳＬｘ−２１１９、アザベンズイミダゾール−アミノフラザン、ＤＥ−１０４、オレフィン、イソキノリン、インダゾール、ピリジンアルケン誘導体、Ｈ−１１５２Ｐ、ＲＯＫα阻害剤、ＸＤ−４０００、４−（１−アミノアルキル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサン−カルボキサミド、ＨＭＮ−１１５２、ロストスタチン、ＢＡ−２１０、ＢＡ−２０７、ＢＡ−２１５、ＢＡ−２８５、ＢＡ−１０３７、Ｋｉ−２３０９５、ＶＡＳ−０１２が挙げられ、本発明の方法における使用について、、Ｙ−２７６３２又はチアゾビビンが特に想定される。

本発明の方法において適用される分化培地は、アクチビン／トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリング経路の活性化剤をさらに含み得る。アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路は当技術分野で公知であり、例えば、Heldin, Miyazono and ten Dijke (1997) “TGF-bold beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.” Nature 390, 465-471に記載されている。要するに、例えばＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ及び／又はＮＯＤＡＬを含むレセプターリガンドは、例えばＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ及び／又はＡＣＶＲ２Ｂを含む２つのＩ型レセプターキナーゼと、例えばＴＧＦＢＲ１、ＡＣＶＲ１ Ｂ及び／又はＡＣＶＲ１Ｃを含む２つのＩＩ型レセプターキナーゼとからなるヘテロ四量体レセプター複合体に結合する。この結合は、例えばＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３を含むＲ−ｓｍａｄと、例えばＳＭＡＤ４を含むＣｏ−ｓｍａｄとからなるヘテロマー複合体のリン酸化及び活性化をトリガーする。したがって、「アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか１つの活性化剤を指す。

アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の例示的な活性化剤としては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ又はｎｏｄａｌが挙げられる。したがって、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤は、ＴＧＦβ３であり得る。ＴＧＦβ３などのアクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤は、０．０００１ng/μl〜０．１ng/μlの量で、例えば０．００１ng/μlの量などで利用され得る。

本発明の方法において適用される分化培地は、ｃＡＭＰ類似体をさらに含み得る。このようなｃＡＭＰ類似体は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）と同様の物理的特性、化学的特性、生化学的特性又は薬理学的特性を有する化合物である。ｃＡＭＰは当業者に公知であり、例えば、Fimia GM, Sassone-Corsi P. (2001) “Cyclic AMP signalling.” J Cell Sci; 114(Pt 11):1971-2に記載されている。

本発明の方法において適用される分化培地は、さらに、（異なる化合物が希釈される）Ｎ２Ｂ２７培地であり得る。これは、培地がＮ２サプリメント及びＢ２７サプリメントを含むことを意味する。両サプリメントは当業者に周知であり、自由に入手可能である。Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントであり得る。このＢ２７は、１：１０〜１：１０００、例えば１：１００（サプリメント：培地）の濃度で使用され得る。Ｂ２７サプリメントは、例えば、Life technologiesから入手され得る。同様に、Ｎ２サプリメントもまた、例えば、Life technologiesから入手され得る。Ｎ２サプリメントは、１：２０〜１：２０００、例えば１：２００（サプリメント：培地）の濃度で使用され得る。

分化培地はまた、Neurobasal培地及び／又はＤＭＥＭ−Ｆ１２培地であり得る。両培地は、例えば、Life technologiesから入手され得る。Ｎ２Ｂ２７培地は、例えば、等量のNeurobasal培地及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含み得る。

本発明の方法において適用される分化培地は、抗生物質をさらに含み得る。

本発明の方法において適用される分化培地は、グルタミンをさらに含み得る。

本発明の方法において適用される分化培地は、約５０％ＤＭＥＭ−Ｆ１２（例えば、Life technologies製）／約５０％Neurobasal（例えば、Life technologies製）、約１：２００ Ｎ２サプリメント（例えば、Life technologies製）、ビタミンＡを欠く約１：１００ Ｂ２７サプリメント（例えば、Life technologies製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（例えば、Life technologies製）及び２mM Ｌ−グルタミン（例えば、Life technologies製）を含むＮ２Ｂ２７培地を含み得る。

加えて、細胞は、二次元細胞培養で培養され得る。この種類の細胞培養は、当業者に周知である。二次元（２Ｄ）細胞培養では、細胞は、プラスチック平皿、例えばペトリ皿、フラスコ及びマルチウェルプレート上で成長される。しかしながら、生物学的に誘導されたマトリックス（例えば、フィブリン、コラーゲン及び本明細書にさらに記載されるもの）及び合成ヒドロゲル（例えば、ＰＡＡ、ＰＥＧ及び本明細書にさらに記載されるもの）は、剛体表面上で発現されない特定の細胞表現型を誘発するために使用され得る。

しかしながら、本発明の方法は、好ましくは、三次元細胞培養で行われ得る。本明細書で使用される「三次元細胞培養」又は「３Ｄ細胞培養」は、３つの次元全てにおいて細胞が成長し又はその周辺と相互作用することを可能にする人工的に作られた環境で、細胞を成長させることを意味する。例えば、細胞培養の三次元特性を達成するために、細胞は、マトリックス又は足場で成長又は分化される。原則として、三次元細胞培養で使用され得る適切なマトリックス又は足場は、当業者に公知である。したがって、このようなマトリックス又は足場は、任意のマトリックス又は足場であり得る。例えば、マトリックス又は足場は、天然分子若しくは合成ポリマー、生物学的合成ハイブリッド、金属、セラミック及び生物活性ガラス又はカーボンナノチューブのいずれかを含む細胞外マトリックスであり得る。

例示的な天然細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、ラミニン又はフィブリンのような基底膜、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、絹フィブロイン、酢酸セルロース（cellulose actetate）、カゼイン、キチン、フィブリノーゲン、ゼラチン、エラスチン又はポリ−（ヒドロキシアルカノアート）が挙げられる。合成細胞外マトリックスポリマーとしては、改変型ヒアルロン酸（ＨＡ）、改変型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、自己集合タンパク質ヒドロゲル、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン又はＰＧＳが挙げられる。生物学的合成ハイブリッドとしては、例えば、ポリカプロラクトン−キトサン、ＰＬＬＡ−ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト−バイオガラス−セラミック、ポリ−（ヒドロキシアルカノアート）−バイオガラス、ヒドロキシアパタイトコラーゲン、ＰＣＬ−ゼラチン又はＰＣＬ−コラーゲンが挙げられ得る。例示的な金属としては、タンタラム、マグネシウム及びその合金、チタン及びその合金又はニチノール（ニッケルとチタンとの合金）が挙げられる。セラミック及び生物活性ガラスマトリックス／足場の例としては、チタン及びリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト及びリン酸三カルシウム、生物活性ケイ酸塩ガラス（ＳｉＯ２−Ｎａ２Ｏ−ＣａＯ−Ｐ２Ｏ５）、ヒドロキシアパタイト及びバイオガラス、リン酸カルシウムガラス又はリン酸ガラスが挙げられる。カーボンナノチューブは、０．４〜２nmの範囲のグラファイトを使用して構築され得る。カーボンナノチューブは、ＣＮＴ−ポリカプロラクトン、ＣＮＴ−セラミックマトリックス、４５Ｓ５バイオガラス−ＣＮＴ、ゼラチンヒドロゲルをスタッドしたＣＮＴ、ＣＮＴ−ＴｉＯ２、ＣＮＴ−ラミニン、ポリアクリル酸をグラフトしたＣＮＴ、又はＣＮＴ−ＴＧＦ−βを含み得る。

マトリックス又は足場はまた、Matrigelのようなヒドロゲル、フィブリンゲル又はアルギン酸塩ゲルであり得る。Matrigelは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫（細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍）から抽出された再構成基底膜調製物であり得る。Matrigelは、６０％ラミニン、３０％ＩＶ型コラーゲン及び８％エンタクチンから構成され得る。場合により、成長因子及び他の分子がMatrigelに追加され得る。Matrigelはまた、BD Matrigel（商標）（BD Biosciencesから入手可能）であり得る。

本明細書で言及される場合、神経上皮幹細胞（ＮＥＳＣ）は、神経発生のいくつかの異なる段階の実際の幹細胞から誘導され得る。神経上皮細胞は幹細胞のクラスであり、幹細胞と同様の特徴を有する。例えば、これらの細胞は、自己複製することができる。自己複製は、未分化状態を維持しながら、細胞分裂の多数の細胞周期を経る能力である。加えて、神経上皮幹細胞は、複数の種類の細胞、例えばニューロン、アストロサイト及び他のグリア細胞にさらに分化する能力を有する。したがって、これらの細胞はまた多分化能性である。それらは神経系統に限定され、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化し得る（Gage, 2000）。細胞が自己複製能力を有するか、及び細胞が多分化能性であるかを試験するための方法は、当業者に公知である。自己複製は、細胞を１０継代超、１１継代、１２継代、１３継代、１４継代、１５継代、１６継代、１７継代、１８継代、１９継代、２０継代、２１継代、２２継代、２３継代、２４継代、２５継代、２６継代、２７継代、２８継代、２９継代、３０継代又はそれ以上継代することによって試験され得る。継代は、単一細胞懸濁液としてそれらを再プレーティングする前に細胞の分割を含む。多分化能は、前記細胞を異なる系統、例えばアストロサイト、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化させることによって試験され得る。

さらに、神経上皮幹細胞は、ＰＡＸ６、Ｎｏｔｃｈ１、ネスチン、ＰＣＮＡ、Ｈｅｓ５及びＳｏｘ１などのマーカーを発現し得る。特に、本発明の方法において使用される神経上皮幹細胞は、国際公開公報第２０１３１０４７５２号に記載されている哺乳動物神経板境界幹細胞（ＮＰＢＳＣ）であり得る。さらに、本発明の方法において使用される神経上皮幹細胞はまた、国際公開公報第２０１３１０４７５２号に記載されているＮＰＢＳＣ（これらはまた、国際公開公報第２０１３１０４７５２号に記載されている方法によって取得される）であり得る。これらのＮＰＢＳＣは、ＦＯＲＳＥ１、ＭＳＸ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ネスチン、ＩＲＸ３、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ２、ＨＥＳ５、ＤＡＣＨ１、ＰＬＺＦ、ＬＭ０３、ＥＶＩ１及びＡＳＣＬ１からなる群より選択される少なくとも３つのマーカーの発現を特徴とし得る。さらに、これらの細胞は、マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＡＦＰ、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＥＯＭＥＳ、ＧＳＨ２、ＯＬＩＧ２、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＡ５、ＦＯＸＡ２及びＶＣＡＭ−１の少なくとも１つの発現の欠如を特徴とし得る。

本発明において使用される神経上皮幹細胞（ＮＥＳＣ）は、マーカーＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及び／又はネスチンを発現することがさらに想定される。加えて又はあるいは、本発明において使用されるＮＥＳＣは、５回超、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回又はそれ以上継代されたものである。本発明において使用されるＮＥＳＣは、２０回未満、１９回、１８回、１７回、１６回、１５回、１４回、１３回、１２回、１１回、１０回、９回、８回、７回、６回、５回、４回、３回又は２回継代されたものであることも想定される。本発明において使用されるＮＥＳＣは、２０回未満かつ２回超継代されたものであることも想定される。

注目すべきことに、ＮＥＳＣは、多能性幹細胞の三次元凝集体である胚様体の細胞とは異なる。これらの胚様体は、神経的に誘導され得る。しかしながら、このような誘導細胞は、中脳／後脳同一性に向かって十分にパターン形成され得ない。特に、開始集団としてのｉＰＳＣと比較して、ＮＥＳＣは、中脳／後脳同一性に向かって既にパターン形成されている。これにより、ＮＥＳＣは、本発明における使用に特に適切なものとなる。８日間の分化後に、ＦＧＦ８を本明細書に記載される培地（例えば、分化培地Ｉ及び／又は分化培地ＩＩ）に最初に追加することも想定される。この理由は、このようにしてドーパミン作動性ニューロンの作製効率を増加させ得るためである。

神経上皮幹細胞は、哺乳動物ＮＥＳＣであり得る。ＮＥＳＣは、ｈＮＥＳＣ−Ｋ７などのヒトＮＥＳＣ（ｈＮＥＳＣ）であることも本発明によって包含される。神経上皮幹細胞は、当業者に公知の異なる手段及び方法によって取得され得る。例えば、神経上皮幹細胞は、多能性細胞から誘導又は取得され得る。本発明のＮＥＳＣは遺伝子改変され得るか、又はＰＤなどの神経学的疾患を患っている患者から取得され得る。また、ＮＥＳＣは、本明細書に記載されるようにｉＰＳＣ、線維芽細胞又はＰＢＭＣから生産され得る。

全能性幹細胞（すなわち、「全てのものが可能」）は、栄養外胚葉の生殖系列を含む体の全ての細胞型を生じさせ得る（Weissman, 2000）。

本明細書で言及される場合、「多能性幹細胞」は、自己複製能力及び異なる細胞型への分化能力を有する細胞型に関する。多能性幹細胞は、ほぼ全ての細胞（すなわち、３つの主な胚葉：外胚葉、内胚葉及び中胚葉のいずれかに由来する細胞）に分化し得る。多能性幹細胞という用語はまた、胚盤胞として公知の初期胚の内部細胞塊に由来する幹細胞を包含する。

多分化能性幹細胞は組織又は器官に既に限定されており、全ての組織特異的細胞を生じさせ得る。

注目すべきことに、胚性幹細胞研究の最近の進歩は、例えば、胚の発生能力を妨げない割球生検ベースの技術を使用することによって、胚を破壊せずに新たな胚性幹細胞株を作り出す可能性をもたらした（Klimanskaya (2006) “Embryonic stem cells from blastomeres maintaining embryo viability.” Semin Reprod Med. 2013 Jan;31(1):49-55）。さらに、多数の樹立された胚性幹細胞株が当技術分野で利用可能である。したがって、胚の破壊を必要とせずに胚性幹細胞を扱うことが可能である。Takahashi及びYamanakaはこれらの懸念に対処し、体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を発表した（Takahashi and Yamanaka, 2006）。４つの所定の因子で皮膚線維芽細胞を誘導して、多能性状態に戻るように再プログラミングした。それらの幹細胞は、ＥＳＣと同じ本質的特徴を有する（図１）（Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006; Yu et al., 2007）。一実施態様では、多能性幹細胞は胚性幹細胞であり、ヒト胚の破壊によって取得されなかった。したがって、多能性幹細胞は、胚を破壊せずに胚から取得される胚性幹細胞である。

神経上皮幹細胞はまた、別の多能性細胞（すなわち、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））から誘導又は取得され得る。本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞の決定的特性を維持するために重要な遺伝子及び因子を強制的に発現させることによって、胚性幹細胞様状態に遺伝的に再プログラミングされた成体体細胞を指す。したがって、人工多能性幹細胞は、非多能性細胞から誘導される。

人工多能性幹細胞は、胚を使用せずに多能性幹細胞を取得することを可能にするので、幹細胞研究の重要な進歩である。マウスｉＰＳＣは２００６年に初めて報告され（Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors”. Cell 126 (4): 663-76）、ヒトｉＰＳＣは２００７年に初めて報告された（Takahashi et al. (2007) “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.” Cell; 131(5):861-72）。幹細胞マーカーを発現すること、３つの胚葉全てに由来する細胞を含有する腫瘍を形成すること、及び非常に初期の発生段階のマウス胚に注射した場合に多くの異なる組織に寄与することができることを含め、マウスｉＰＳＣは、多能性幹細胞の重要な特徴を示す。ヒトｉＰＳＣもまた幹細胞マーカーを発現し、３つの胚葉全てに特徴的な細胞を生成することができる。このような幹細胞マーカーとしては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）並びに幹細胞特異的抗原３及び４（ＳＳＥＡ３／４）が挙げられ得る。また、ｉＰＳＣのクロマチンメチル化パターンもまた、胚性幹細胞のものと同様である（Tanabe, Takahashi, Yamanaka (2014) “Induction of pluripotency by defined factors.” Proc. Jpn. Acad., 2014, Ser. B 90）。

加えて、ｉＰＳＣは、in vitroで自己複製して３つの胚葉全ての細胞に分化することができる。ｉＰＳＣの多能性又は異なる細胞型への分化能力は、例えば、神経細胞若しくはグリア細胞へのin vitro分化、又は胚盤胞注射による生殖系列キメラ動物の生産によって試験され得る。

ヒト人工多能性幹細胞の作製方法は、当業者に周知である。通常、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（並びにＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４）の強制発現は、線維芽細胞などの成体体細胞から人工多能性幹細胞を作製するために十分である。しかしながら、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４（及びＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣ）及びＫＬＦ４の組み合わせもまた、成体体細胞からｉＰＳＣを作製するために十分である。加えて、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の組み合わせもまた、再プログラミングのために効率的であった（Tanabe, Takahashi, Yamanaka (2014) “Induction of pluripotency by defined factors.” Proc. Jpn. Acad., 2014, Ser. B 90）。このため、通常、これらの遺伝子をレトロウイルスベクター及び導入遺伝子発現ウイルス粒子又はベクターにクローニングし、これを体細胞にコトランスダクションする。しかしながら、当業者に公知の他の技術もまた、その目的のために使用され得る。また、例えばタンパク質トランスダクション又はネイキッドなＤＮＡを介して、４つのベクター全てをヒト皮膚線維芽細胞にコトランスダクションし得る。

ｉＰＳＣを取得するためのさらなる方法もまた当業者に公知であり、例えば、国際公開公報第２００９１１５２９５号、国際公開公報第２００９１４４００８号又は欧州特許出願公開第２２１８７７８号に記載されている。したがって、当業者であれば、任意の方法によってｉＰＳＣを取得し得る。

原則として、人工多能性幹細胞は、（被験体の）任意の成体体細胞から取得され得る。例示的な体細胞としては、血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は皮膚組織生検から取得された線維芽細胞のような線維芽細胞が挙げられる。

したがって、ＮＥＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生産又は誘導又は取得されることが本発明によって想定される。ｉＰＣＳを神経上皮幹細胞に分化させる異なる方法が当業者に公知であり、例えば、国際公開公報第２０１３／１０４７５２号に記載されている。加えて、ｉＰＳＣは、線維芽細胞などの体細胞から生産され得ることが本発明によって想定される。さらに、ｉＰＳＣは、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）であり得る。

線維芽細胞などの体細胞は、被験体から取得されたものであることが本発明によってさらに包含される。「被験体」という用語はまた、ヒト又は動物を意味し得る。被験体はまた、パーキンソン病などの神経変性疾患を患っている被験体であり得る。特に、被験体は、家族性パーキンソン病に関連するＬＲＲＫ２−Ｇ２０１９Ｓ突然変異を含む被験体であり得る。被験体はまた、パーキンソン病などの神経変性疾患を患っていない被験体であり得る。被験体は健常被験体であることも本発明によって包含される。被験体は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、限定されないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、イヌ、ウマ、マウス及びラットが挙げられる。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどであり得る。したがって、一実施態様では、被験体は、脊椎動物である。被験体はまた、ヒト被験体であり得る。

本明細書で使用される場合、「撹拌」又は「撹拌する」は、細胞を動的状態下に置く（すなわち、細胞が本質的に表面に接着しないようにする）任意の技術を包含する。撹拌は、振盪、スピニング、スターリング、移動及び／又は混合を含む多くの方法で達成され得る。スピニングは、例えば、磁気パドル又はインペラーを含有するスピナーフラスコの使用によって達成され得る。あるいは、本発明の方法は、バイオリアクターで行われ得る。パドル又はインペラー及び回転壁バイオリアクターを使用して培地の撹拌を達成するバイオリアクターを含む多くの種類のバイオリアクターが利用可能である。回転壁バイオリアクターは、低重力（微小重力）の条件をシミュレーションするためにさらに使用され得る。本発明の方法の操作において細胞が経験する剪断力をモニタリング及び／又はコントロールすることも望ましい。例えば、撹拌に供される最適な培養条件は、過度の剪断力による細胞損傷を回避する必要性に対して、培養中の酸素及び栄養素の均一な分布のための要件をバランスすることを必要とする。

本明細書で使用される「活性化剤」という用語は、ターゲット分子又は経路の活性を増強又は達成する化合物／分子として定義される。活性化剤は、活性化すべきタンパク質をコードする遺伝子の転写を増強若しくは誘導し、及び／又は活性化すべきタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を増強することによって、この効果を達成し得る。活性化すべきタンパク質は、活性化剤の存在下で高い効率でその生化学的機能を発揮すること、又は活性化すべきタンパク質は、活性化剤の存在下で高い効率でその細胞機能を発揮することもあり得る。したがって、「活性化剤」という用語は、特定の経路に対する直接的な活性化効果を有する分子／化合物だけではなく、例えば前記経路をネガティブにレギュレーションする（例えば、抑制する）分子と相互作用することによって間接的に活性化する分子も包含する。活性化剤は、活性化すべき経路のアゴニストであり得る。化合物／分子がターゲット分子又は経路の活性を誘導又は増強することができるかを試験するための方法は、当業者に公知である。例えば、ＳＨＨ、ＷＮＴの活性化剤又は本明細書に記載される他の活性化剤は、例えば経路エフェクタータンパク質、例えばそれぞれＧｌｉタンパク質、ＬＥＦ１又はＴＣＦ１タンパク質の量のウエスタンブロット分析を実施することによって試験され得る。

活性化剤として使用され得る化合物／分子は、各経路を活性化し得るか又は活性化すべき経路のサプレッサーを阻害する任意の化合物／分子であり得る。例示的な活性化剤は、例えば、特定の経路のサプレッサーに対する適切な結合タンパク質を含み得る。

活性化剤は、活性化剤を追加しない又は活性化剤を追加する前の経路の活性と比較して、活性化すべき経路を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上増強し又は増加させ得る。

「ヘッジホッグシグナリング経路」又は「ＳＨＨ経路」は当技術分野で周知であり、例えば、et al. (2014) “Sonic hedgehog signalling pathway: a complex network.” Ann Neurosci. 21(1):28-31に記載されている。例えば、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ及び／又はデザートヘッジホッグを含むヘッジホッグリガンドは、例えば、下流シグナリングカスケードを誘導するＰａｔｃｈｅｄ又はｐａｔｃｈｅｄ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄレセプター複合体を含むレセプターに結合する。ＳＨＨシグナリングの下流ターゲット遺伝子としては、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２及び／又はＧＬＩ３が挙げられる。したがって、「ヘッジホッグシグナリング経路の活性化剤」という用語はまた、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか１つの活性化剤を指す。

ヘッジホッグシグナリング（ＳＨＨ）の例示的な活性化剤としては、パルモルファミン（ＰＭＡ；２−（１−ナフトキシ）−６−（４−モルホリノアニリノ）−９−シクロヘキシルプリン９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）；ＣＡＳ番号：４８３３６７−１０−８）、ＳＨＨ、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ；３−クロロ−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［［３−（４−ピリジニル）フェニル］メチル］−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド；ＣＡＳ番号：９１２５４５−８６−９）及びＨｈ−Ａｇ １．５（３−クロロ−４，７−ジフルオロ−Ｎ−（４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）−Ｎ−（３−（ピリジン−４−イル）ベンジル）ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミド；ＣＡＳ番号：６１２５４２−１４−０）並びにＧｌｉ−２が挙げられる。ＳＨＨ経路活性化剤はまた、パルモルファミン、ＳＨＨ、ＳＡＧ類似体及びＧｌｉ−２からなる群より選択され得る。したがって、ＳＨＨ経路活性化剤は、パルモルファミンであり得る。ＳＨＨ経路活性化剤はまた、例えばＳＨＨ Ｃ２４ＩＩなどのＳＨＨ経路活性化機能を保持するＳＨＨのリコンビナント又は短縮型であり得る。

パルモルファミンなどのＳＨＨシグナリング経路活性化剤は、約０．２５μM〜約１Ｍ、より好ましくは約０．４μM〜約０．５μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約０．５μMである。

ＳＨＨなどのＳＨＨシグナリング経路活性化剤はまた、約５０〜約１０００ng/mlで用いられ得る。ＳＨＨ Ｃ２４ＩＩなどのＳＨＨシグナリング経路活性化剤はまた、約１０〜約５００ng/mlの濃度で用いられ得る。ＳＡＧなどのＳＨＨシグナリング経路活性化剤は、約１〜約１００nMの濃度で用いられ得る。Ｈｈ−Ａｇ１．５などのＳＨＨシグナリング経路活性化剤はまた、約１〜約５０nMの濃度で用いられ得る。

加えて又はあるいは、本発明の方法において使用される培地は、カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤を含み得る。カノニカルＷｎｔシグナリング経路は当業者に公知であり、例えば、Logan and Nusse (Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (2004) 20:781-810)に記載されている。要するに、ＷｎｔリガンドはＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターに結合し、調節性ＡＰＣ／アキシン／ＧＳＫ−３β複合体からの多機能キナーゼＧＳＫ−３βの解離をトリガーする。Ｗｎｔシグナルの非存在下では（オフ状態）、ＣＫ１及びＡＰＣ／アキシン／ＧＳＫ−３β複合体による協調的リン酸化によってβ−カテニンがターゲティングされ、ユビキチン化され、β−ＴｒＣＰ／ＳＫＰ経路を介してプロテアソーム分解される。Ｗｎｔリガンドの存在下では（オン状態）、コレセプターＬＲＰ５／６は、Ｗｎｔ結合Ｆｒｉｚｚｌｅｄと複合体形成する。これは、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）の活性化をもたらし、ＡＰＣ／アキシンからＧＳＫ−３βが解離する。Ｗｎｔリガンドの転写効果は、β−カテニンのＲａｃ１依存性核移行とそれに続くＬＥＦ／ＴＣＦ ＤＮＡ結合因子（補助活性化因子）のリクルートによって媒介される。例示的なＷｎｔリガンドとしては、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ及び／又はＷｎｔ１１が挙げられる。

したがって、本明細書に記載される「カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか１つの活性化剤を指す。

例示的なカノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤としては、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−スポンジン２又はＷＮＴタンパク質が挙げられる。しかしながら、カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤はまた、アキシン又はＡＰＣを遮断し得る。これは、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ技術によって達成され得る。

したがって、例示的なカノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤としては、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−スポンジン２又はＷＮＴタンパク質が挙げられ得る。しかしながら、カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤はまた、アキシン又はＡＰＣを遮断し得る。これは、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ技術によって達成され得る。カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤はＧＳＫ−３阻害剤であることも本発明によって包含される。例示的なＧＳＫ−３阻害剤としては、ＣＨＩＲ ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；ＣＡＳ番号：２５２９１７−０６−９）、ＳＢ−２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ番号：２８０７４４−０９−４）、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＣＡＳ番号：ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、タイドグルーシブ（４−ベンジル−２−（ナフタレン−１−イル）−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＧＳＫ−３阻害剤１（ＣＡＳ番号：６０３２７２−５１−１）、ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ番号：６１２４８７−７２−６）、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン；ＣＡＳ番号：３２７０３６−８９−５）、ＴＷＳ１１９（３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］−フェノール；ＣＡＳ番号：６０１５１４−１９−６）、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７−０６−９）、ＣＨＩＲ−９８０１４（Ｎ６−［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］−３−ニトロ−２，６−ピリジンジアミン；ＣＡＳ番号：２５２９３５−９４−７）、ＳＢ ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）−アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ番号：２６４２１８−２３−７）、ＬＹ２０９０３１４（３−（９−フルオロ−２−（ピペリジン−１−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−［１，４］ジアゼピノ［６，７，１−ｈｉ］インドール−７−イル）−４−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ番号：６０３２８８−２２−８）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ′−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素；ＣＡＳ番号：４８７０２１−５２−３及び／又はＩＭ−１２（３−（４−フルオロフェニルエチルアミノ）−１−メチル−４−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ番号：１１２９６６９−０５−１）が挙げられる。したがって、ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。

ＣＨＩＲ９９０２１などのカノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤は、約０．０１μM〜約１Ｍ、より好ましくは約０．１μM〜約５μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約３μMである。ＣＨＩＲ９９０２１は、例えば、Axon Medchemから入手され得る。

本発明の方法において使用される培地は、例えば、アクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤を含み得る。

アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路は当技術分野で公知であり、例えば、Heldin, Miyazono and ten Dijke (1997) “TGF-bold beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.” Nature 390, 465-471に記載されている。要するに、例えばＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ及び／又はＮＯＤＡＬを含むレセプターリガンドは、例えばＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ及び／又はＡＣＶＲ２Ｂを含む２つのＩ型レセプターキナーゼと、例えばＴＧＦＢＲ１（ＡＬＫ５）、ＡＣＶＲ１Ｂ（ＡＬＫ４）及び／又はＡＣＶＲ１Ｃ（ＡＬＫ７）を含む２つのＩＩ型レセプターキナーゼとを含むヘテロ四量体レセプター複合体に結合する。この結合は、例えばＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３を含むＲ−ｓｍａｄと、例えばＳＭＡＤ４を含むＣｏ−ｓｍａｄとからなるヘテロマー複合体のリン酸化及び活性化をトリガーする。したがって、「アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか１つの活性化剤を指し、「アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路の阻害剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか１つの阻害剤を指す。加えて、このような活性化剤は、ＡＣＶＲ２Ａ及び／若しくはＡＣＶＲ１Ｂ（ＡＬＫ４）レセプターのアゴニスト、又はＴＧＦβＲＩＩレセプター及び／若しくはＡＬＫ５レセプターのアゴニストであり得る。このような阻害剤は、ＡＣＶＲ２Ａ及び／若しくはＡＣＶＲ１Ｂ（ＡＬＫ４）レセプターのアンタゴニスト、又はＴＧＦβＲＩＩレセプター及び／若しくはＡＬＫ５レセプターのアンタゴニストであり得る。原則として、アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング経路のこのような阻害剤／活性化剤は当業者に公知であり、市販されている。

本発明は、アクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤が、ＴＧＦ−β Ｉ型レセプターのアクチビンレセプター様キナーゼの阻害剤であることを企図する。アクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤は、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害することが本発明によってさらに想定される。アクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤の例示的だが非限定的な例は、Ａ−８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド；ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）、Ｄ４４７６（４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド；ＣＡＳ番号：３０１８３６−４３−１）、ＧＷ７８８３８８（４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド；ＣＡＳ番号：４５２３４２−６７−５）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン；ＣＡＳ番号：３９６１２９−５３−６）、Ｒ２６８７１２（４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール；ＣＡＳ番号：８７９４８７−８７−３）、ＳＢ−４３１５４２（４−（５−ベンゾｌ［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物；ＣＡＳ番号：ＣＡＳ番号３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物；ＣＡＳ番号：６９４４３３−５９−５）、ＳＤ２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジル）アミノ］プテリジン；ＣＡＳ番号：６２７５３６−０９−８）、ＳＢ−５２５３３４（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−キノキサリン；ＣＡＳ番号：３５６５５９−２０−１）及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ：４４６８５９−３３−２）である。したがって、アクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＢ−４３１５４２であり得る。

ＳＢ−４３１５４２などのアクチビン／ＴＧＦ−β阻害剤は、約０．０１μM〜約１Ｍ、より好ましくは約５μM〜約１５μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約１０μMである。例えば、ＳＢ−４３１５４２は、Ascent Scientificから入手され得る。

加えて又はあるいは、本発明の方法において使用される培地は、ＢＭＰシグナリング阻害剤を含み得る。ＢＭＰシグナリング経路は当業者に公知であり、例えば、Jiwang Zhanga, Linheng Lia (2005) BMP signaling and stem cell regulation Developmental Biology Volume 284, Issue 1, 1 August 2005, Pages 1-11に記載されている。

要するに、ＢＭＰは、レセプター媒介性細胞内シグナリングを介して機能し、続いて、ターゲット遺伝子の転写に影響を及ぼす。このプロセスでは、Ｉ型及びＩＩ型と称される２種類のレセプターが必要である。１つのＩＩ型ＢＭＰレセプター（ＢｍｐｒＩＩ）のみが存在する場合、３つのＩ型レセプター：Ａｌｋ２、Ａｌｋ３（Ｂｍｐｒ１ａ）及びＡｌｋ６（Ｂｍｐｒ１ｂ）が存在する。ＢＭＰシグナル伝達は、少なくとも２つのシグナリング経路で起こり得る。カノニカルＢＭＰ経路は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５又はＳｍａｄ８（Ｒ−Ｓｍａｄ）のレセプターＩ媒介性リン酸化によって媒介される。２つのリン酸化Ｒ−Ｓｍａｄは、共通のＳｍａｄ４（ｃｏ−Ｓｍａｄ）とヘテロ三量体複合体共凝集体を形成する。Ｓｍａｄヘテロ三量体複合体は核に移行し得、他の転写因子と協調してターゲット遺伝子発現をモデュレーションし得る。ＢＭＰシグナルの平行経路は、ＴＧＦβ１活性化チロシンキナーゼ１（ＴＡＫ１、ＭＡＰＫＫＫ）によって、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を介して媒介され、ＢＭＰ経路とＷｎｔ経路との間のクロストークにも関与する。

ＢＭＰシグナリングの阻害剤は、カノニカルＢＭＰ経路を遮断／低減し得るに過ぎないことが本発明によって想定される。したがって、ＢＭＰシグナリング阻害剤は、カノニカルＢＭＰシグナリング阻害剤であり得る。カノニカルＢＭＰシグナリング経路に選択的な１つのこのような阻害剤は、ドルソモルフィンである。ＢＭＰシグナリング阻害剤の例示的だが非限定的な例としては、コーディン、ノギン、ＤＭＨ１（ＣＡＳ １２０６７１１−１６−１）、Ｋ ０２２８８（３−［（６−アミノ−５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−３−ピリジニル］フェノール；ＣＡＳ番号：１４３１９８５−９２−０）、ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；ＣＡＳ番号：８６６４０５−６４−３）及びＬＤN １９３１８９（４−［６−［４−（１−ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１０６２３６８−２４−４）が挙げられる。ＢＭＰシグナリング阻害剤はまた、ドルソモルフィンであり得る。

ドルソモルフィンなどのＢＭＰシグナリング阻害剤は、約０．０１μM〜約１Ｍ、より好ましくは約０．１μM〜約５μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約０．１μMである。ドルソモルフィンは、例えば、Tocrisから入手され得る。

本発明によれば、「Ｍａｐ２」は、微小管関連タンパク質２（ヒトでは、ＭＡＰ２遺伝子によってコードされるタンパク質）を指す。Ｍａｐ２は、微小管関連タンパク質ファミリーに属する。このファミリーのタンパク質は、神経突起生成の必須工程である微小管集合に関与すると考えられる。ヒトＭＡＰ２ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿００１０３９５３８（配列番号：１）に示されている配列を含み得、及び／又はタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１１１３７（配列番号：２）から入手される配列を含み得る。Ｍａｐ２という用語は、任意のＭａｐ２核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、Ｍａｐ２の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＴＨ」は、チロシンヒドロキシラーゼ／チロシン３−モノオキシゲナーゼ／チロシナーゼ（ヒトでは、ＴＨ遺伝子によってコードされるタンパク質）を指す。ＴＨは、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）へのアミノ酸Ｌ−チロシンの変換の触媒に関与する酵素である。ヒトＴＨ ｍＲＮＡは、例えば、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿０００３６０（配列番号：３）に示されている配列及び／又はＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０７１０１（配列番号：４）のタンパク質配列を含み得る。ＴＨという用語は、任意のＴＨ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＴＨの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「βＩＩＩチューブリン」としても公知の「Ｔｕｊ１」は、ヒトではＴＵＢＢ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。タンパク質βＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ１）は、新たに生成された未成熟有糸分裂後ニューロン及び分化ニューロンに、並びにいくつかの有糸分裂的に活性なニューロン前駆体に存在する。ヒトＴｕｊ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿００６０８６．３（配列番号：５）に示されている配列を含み得、及び／又はタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１３５０９（配列番号：６）に示されている配列を含み得る。Ｔｕｊ１という用語は、任意のＴｕｊ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、Ｔｕｊ１の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、グリア線維酸性タンパク質としても公知の「ＧＦＡＰ」は、ヒトではＧＦＡＰ遺伝子によってコードされるタンパク質である。グリア線維酸性タンパク質は、中枢神経系（ＣＮＳ）の多数の細胞型（アストロサイトを含む）によって発現される中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質である。ヒトＧＦＡＰ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿００１１３１０１９（配列番号：７）に示されている配列を含み得、及び／又はタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１４１３６（配列番号：８）に示されている配列を含み得る。ＧＦＡＰという用語は、任意のＧＦＡＰ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＧＦＡＰの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂとしても公知の「Ｓ１００ｂ」又は「Ｓ１００β」は、ヒトではＳ１００遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｓ１００タンパク質は、広範囲の細胞の細胞質及び核に局在し、細胞周期進行及び分化などの多くの細胞プロセスのレギュレーションに関与する。ヒトＳ１００ｂ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照ＮＭ＿００６２７２（配列番号：９）に示されている配列を含み得、及び／又はタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０４２７１（配列番号：１０）に示されている配列を含み得る。Ｓ１００ｂという用語は、任意のＳ１００ｂ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、Ｓ１００ｂの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、無虹彩ＩＩ型タンパク質（ＡＮ２）又はｏｃｕｌｏｒｈｏｍｂｉｎとしても公知のペアボックスタンパク質Ｐａｘ−６とも称される「ＰＡＸ６」は、ヒトではＰＡＸ６遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｐａｘ６は、胚発生中に存在する転写因子である。コードされるタンパク質は、ＤＮＡに結合して遺伝子転写のレギュレーターとして機能することが公知の２つの異なる結合部位を含有する。それは、目及び脳の発生の重要な調節遺伝子である。ヒトＰＡＸ６ ｍＲＮＡは、配列番号：１１をコードする任意の配列を含み得る。ヒトＰＡＸ６はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２６３６７（配列番号：１１）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＰＡＸ６という用語は、任意のＰＡＸ６核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＰＡＸ６の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＳＯＸ１性決定領域Ｙ−ボックス１」とも称される「ＳＯＸ１」は、ヒトではＳＯＸ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＳＯＸ１（性決定領域Ｙ−ボックス１）は、Ｓｏｘタンパク質ファミリーの転写因子である。ヒトＳＯＸ１ ｍＲＮＡは、配列番号：１２をコードする任意の配列を含み得る。ＳＯＸ１はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００５７０（配列番号：１２）のタンパク質配列を含み得る。ＳＯＸ１という用語は、任意のＳＯＸ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＳＯＸ１の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「性決定領域Ｙ−ボックス２」としても公知の「ＳＯＸ２」は、ヒトではＳＯＸ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＳＯＸ２は、未分化胚性幹細胞の自己複製又は多能性を維持するために必須の転写因子である。Ｓｏｘ２は、胚性幹細胞及び神経幹細胞の維持において重要な役割を有する。ヒトＳＯＸ２ ｍＲＮＡは、配列番号：１３をコードする任意の配列を含み得る。ＳＯＸ２はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８４３１（配列番号：１３）のタンパク質配列を含み得る。ＳＯＸ２という用語は、任意のＳＯＸ２核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＳＯＸ２の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ネスチン」は、ヒトではＮＥＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ネスチンは、ＶＩ型中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質である。ヒトネスチンｍＲＮＡは、配列番号：１４をコードする任意の配列を含み得る。ネスチンはまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８６８１（配列番号：１４）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ネスチンという用語は、任意のネスチン核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ネスチンの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＬＭＸ１Ａ」（ＬＩＭホメオボックス転写因子１、アルファ）は、ヒトではＬＭＸ１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＬＭＸ１は、インスリンプロモーター中のＡ／Ｔリッチ配列に結合してインスリンの転写を刺激するＬＩＭホメオボックス転写因子である。ヒトＬＭＸ１Ａ ｍＲＮＡは、配列番号：１５をコードする任意の配列を含み得る。ＬＭＸ１Ａはまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ８ＴＥ１２（配列番号：１５）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＬＭＸ１Ａという用語は、任意のＬＭＸ１Ａ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＬＭＸ１Ａの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＦＯＸＡ２」は、ヒトではＦＯＸＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２は、ＤＮＡ結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。ヒトＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡは、配列番号：１６をコードする任意の配列を含み得る。ＦＯＸＡ２はまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９Ｙ２６１（配列番号：１６）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＦＯＸＡ２という用語は、任意のＦＯＸＡ２核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＦＯＸＡ２の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＬＭＸ１Ｂ」は、ヒトではＬＭＸ１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＬＭＸ１Ｂは、脊椎動物の四肢の背側−腹側パターン形成において中心的な役割を果たすＬＩＭホメオボックス転写因子である。ヒトＦＯＸＡ２ ｍＲＮＡは、配列番号：１７をコードする任意の配列を含み得る。ＬＭＸ１Ｂはまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ６０６６３（配列番号：１７）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＬＭＸ１Ｂという用語は、任意のＬＭＸ１Ｂ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＬＭＸ１Ｂの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＮＵＲＲ１」は、ヒトではＮＲ４Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＮＵＲＲ１は、細胞内転写因子の核内レセプターファミリーのメンバーである。ＮＵＲＲ１は、脳のドーパミン作動系の維持において重要な役割を果たす。ヒトＮＵＲＲ１ ｍＲＮＡは、配列番号：１８をコードする任意の配列を含み得る。ＮＵＲＲ１はまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４３３５４（配列番号：１８）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＮＵＲＲ１という用語は、任意のＮＵＲＲ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＮＵＲＲ１の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＡＡＤＣ」は、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼである。ヒトＡＡＤＣ ｍＲＮＡは、配列番号：１９をコードする任意の配列を含み得る。ＡＡＤＣはまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２０７１１（配列番号：１９）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＡＡＤＣという用語は、任意のＡＡＤＣ核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＡＡＤＣの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

本発明によれば、「ＥＮ１」は、ヒトではＥＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｅngｒａｉｌｅｄ（ＥＮ）は、多細胞発生の多くの態様に関与するホメオドメイン転写因子である。ヒトＥＮ１ ｍＲＮＡは、配列番号：２０をコードする任意の配列を含み得る。ＥＮ１はまた、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０５９２５（配列番号：２０）によって示されているタンパク質配列を含み得る。ＥＮ１という用語は、任意のＥＮ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ＥＮ１の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。

特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す数は全て、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語は、１０〜１５％内、好ましくは５〜１０％の範囲を意味する。したがって、特に反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値は、本発明によって得られると思われる望ましい特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定せず、各数値は、報告されている有効数字を考慮し、通常の丸め技術を使用することによって少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は本質的に、各試験測定値において見られる標準偏差から必ず生じる誤差を含有する。

本発明の説明との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。本明細書における値域の列挙は、該範囲に該当する別個の各値について個別に言及する簡単な方法として機能することを意図するに過ぎない。特に本明細書で指示がない限り、個々の各値は、それが本明細書で個別に列挙されているように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載される方法は全て、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例又は例示的文言（例えば、「など」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることを意図するに過ぎず、特許請求の範囲に別様に記載されている本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書における文言は、特許請求の範囲に記載されていない任意の要素であって、本発明の実施に必須の要素を指示すると解釈されるべきではない。

本明細書に開示される本発明の代替的な要素又は実施態様のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは個別に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書に見られる他の要素と組み合わせて言及および特許請求され得る。便宜上及び／又は特許性の理由により、グループの１つ以上のメンバーがグループに組み入れられ得るか、又はグループから削除され得る。任意のこのような組み入れ又は削除が生じた場合、本明細書は、改変されたグループを含有するので、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの記載要件を満たすと見なされる。

本発明の特定の実施態様は、本発明者が把握する本発明の最良の実施形態を含めて本明細書に記載される。当然のことながら、記載されているこれらの実施態様のバリエーションは、上記説明を読めば当業者には明らかであろう。本発明者は、当業者がこのようなバリエーションを適切に用いると予想し、本発明者は、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、適用法によって認められているように、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲において列挙されている主題の全ての改変物及び等価物を含む。また、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせは本発明によって包含される。

本明細書に開示される特定の実施態様は、からなる又はから本質的になるという文言を使用して特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時からあるか又は補正によって追加されたかにかかわらず、「からなる」という移行語は、特許請求の範囲において特定されていないいかなる要素、工程又は成分も排除する。「から本質的になる」という移行語は、請求項の範囲を特定の材料又は工程に、並びに基本的特徴及び新規特徴に重大な影響を及ぼさないものに限定する。そのようにして特許請求の範囲に記載されている本発明の実施態様は、本明細書において本来的に又は明示的に記載され、使用可能である。

さらに、本明細書を通して、特許及び刊行物に対して多数の言及がなされている。上記で引用される参考文献及び刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に個別に組み入れられる。

最後に、本明細書に開示される本発明の実施態様は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲である。したがって、限定されないが一例として、本発明の代替的な構成は、本明細書における教示にしたがって利用され得る。したがって、本発明は、示され記載されているのと全く同じものに限定されない。

本明細書では、以下の配列が言及されている：

ｈｉＰＳＣの作製及び適用。患者から採取した体細胞を培養する。４つの多能性因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣ及びＫＬＦ４を追加することによって、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングする。これらのｈｉＰＳＣは、患者特異的細胞補充療法、薬物スクリーニング試験において使用され得るか、又はヒト疾患モデルとして機能し得る（Yamanaka and Blau, 2010）。 MATRIGEL小滴を含有するパラフィルムの角材。神経上皮組織をパラフィルムの窪みの中央に置き、液体MATRIGELでカバーした。 二次元条件下で培養したｈＮＥＳＣの共焦点画像。ｈＮＥＳＣは、神経前駆細胞マーカーＳＯＸ１、ＳＯＸ２及びネスチンを発現した。ニューロンマーカーＴＵＪ１及びＤＣＸに対して生じた抗体を用いてＩＣＣによって、ｈＮＥＳＣの自発的分化能力を実証する。ＦＯＸＡ２染色は、腹側神経管マーカーの低い発現レベルを明らかにしている。ヘキストで核を対比染色する。スケールバー、２０μm。 ヒトＮＥＳＣからの中脳オルガノイド発生の進行。（ａ）６日後に丸底の超低接着プレートに播種したヒトＮＥＳＣのコロニー。コロニーは球状であり、明るい平滑縁を有する。（ｂ）MATRIGELに包埋した９日目のオルガノイドは、中央において暗い組織を示し、縁において明るい組織を示す。矢印は、オルガノイド周辺のMATRIGELを示す。（ｃ）１３日目（分化条件下で２日間）のオルガノイドの画像。小さい突起が表面全体で発達し始める。スケールバー、５００μm。（ｄ）組織から伸びる長い突起を示す３５日目の倍率５倍の中脳オルガノイド。（ｅ）倍率１０倍の同じオルガノイド。矢頭は、コロニーの外側の細胞体を示す。（ｆ）MATRIGELなしの場合のオルガノイド（左、矢印）、及びMATRIGELマトリックス全体から伸びる長い突起を示す、MATRIGELに包埋したオルガノイド（右、矢頭）。倒立顕微鏡を用いて明視野像を得た。スケールバー、５００μm（ａ〜ｄ）。 初期中脳オルガノイドの免疫蛍光染色。（ａ）神経前駆細胞（ＳＯＸ２）及び幼若ニューロン（ＴＵＪ１）のマーカーによる６日目の初期オルガノイドの画像。矢頭は、初期分化ニューロンを示す。（ｂ）神経前駆体マーカーネスチン及びＳＯＸ２を発現する７日目の初期オルガノイド。ヘキストで核を対比染色する。スケールバー、５０μm。 中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロン。（ａ）ＤＡニューロンに対する抗体を用いた、１６日目の初期オルガノイドの免疫蛍光染色（ＴＨ／ＴＵＪ１、矢頭）。（ｂ）ＤＡニューロンマーカーを発現する３０日目のオルガノイドのタイルスキャン。（ｃ）より高倍率のｂのタイルスキャン。ヘキストで核を対比染色する。スケールバー、５０μm（ａ、ｃ）、５００μm（ｂ）。 中脳オルガノイドにおける幼若ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロン。（ａ）神経前駆体マーカーＳＯＸ２及び幼若ＤＡニューロンマーカーＴＵＪ１／ＴＨを発現するオルガノイドのタイルスキャン。（ｂ）より高倍率のａのタイルスキャン。矢印は、増殖領域から基底部に離れる成熟ＤＡニューロンの推定遊走方向を示す。（ｃ）成熟ＤＡニューロンマーカーＭＡＰ２／ＴＨを発現するオルガノイドのタイルスキャン。破線は、神経前駆細胞を主に含有する頂端表面を示す。矢印：成熟時のＤＡニューロン遊走の推定方向（ｄ）より高倍率のｃのタイルスキャン。矢頭は、成熟ＤＡニューロンを示す。ヘキストで核を対比染色する。スケールバー、５００μm（ａ、ｃ）、５００μm（ｂ、ｄ）。 中脳オルガノイドにおけるグリア細胞の存在。（ａ）幼若ニューロン（ＴＵＪ１）、オリゴデンドロサイト（Ｏ４）及びアストロサイト（ＧＦＡＰ）のマーカーについて染色した中脳オルガノイドのタイルスキャン。（ｂ）より高倍率のａ。矢頭は、オリゴデンドロサイトを示すＯ４陽性及びＴＵＪ１陰性細胞を示す。（ｃ）Ｏ４陽性及びＴＵＪ１陰性細胞の染色を示す別のオルガノイドの６３倍画像（矢頭）。（ｄ）ＧＦＡＰ及びＯ４陽性並びにＴＵＪ１陰性細胞は、グリアの分化を示す。ヘキストで核を対比染色する。スケールバー、５００μm（ａ）、５０μm（ｂ〜ｄ）。 ヒト神経上皮幹細胞からの中脳特異的オルガノイドの誘導（ａ）中脳オルガノイド培養系の手順。詳細は、方法セクション（実施例の項目２．１）に記載されている。ｈＮＥＳＣ、ヒト神経上皮幹細胞；ＡＡ、アスコルビン酸、ＰＭＡ、パルモルファミン。（ｂ）オルガノイド培養の２７日目及び４４日目における細胞増殖マーカーＫｉ６７の免疫組織学的染色は、中脳オルガノイドにおける増殖細胞の量の減少を明らかにする。（ｃ）２７日目及び４４日目における神経幹細胞マーカーＳＯＸ２の免疫組織学的染色。後期では、ＳＯＸ２の発現はより局所的に限定されるようになる。１５０μm切片（ｃ、下のパネル）。スケールバー、２００μm（ｂ、ｃ）；２０μm（ｄ）。破線は、オルガノイドの周囲を示す。 中脳オルガノイドにおけるニューロン分化及び自己組織化。（ａ）ＤＮマーカーＴＵＪ１及びＴＨに関する、２７日目のオルガノイドの全載免疫組織学的染色。（ｂ）より高倍率の（ａ）。（ｃ）６１日目におけるｍＤＡニューロンマーカーＦＯＸＡ２及びＴＨの免疫組織学的染色は、ｈＮＥＳＣ由来オルガノイドの中脳同一性を明らかにする。（ｄ）より高倍率の（ｃ）。（ｅ）中脳特異的オルガノイドにおける高倍率のＬＭＸ１Ａ／ＴＨ陽性ｍＤＡニューロン。（ｆ〜ｇ）４８日目におけるｍＤＮマーカーＡＡＤＣ、ＴＨ、ＮＵＲＲ１（ｆ）及びＥＮ１、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ（ｇ）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。エラーバーは、３回の独立した培養からの標準偏差を示す。（ｈ〜ｉ）ＤＮの非対称分析。３Ｄ表面プロット（ｉ）を使用して蛍光強度に基づいて、ＴＵＪ１及びＴＨに関するＤＡニューロンの免疫染色（ｈ）を分析した。（ｊ）ドーパミン、ＭＡＰ２及びＴＨの免疫組織学的染色は、ドーパミン産生ニューロンの存在を明らかにする。１５０μm切片（ｃ、ｈ）。スケールバー、２００μm（ａ、ｃ、ｈ）、２０μm（ｂ、ｄ、ｅ、ｊ）。 グリア細胞への分化及びシナプス結合の形成。（ａ）初期（２７日目）及び後期（６１日目）オルガノイドにおけるアストロサイトマーカーＳ１００β及びＧＦＡＰの免疫組織学的染色。破線は、オルガノイドの周囲を示す。（ｂ）より高倍率の６１日目の（ａ）は、Ｓ１００β及びＧＦＡＰを発現するアストロサイトを示す。（ｃ）６１日目のオルガノイドの免疫組織学的染色は、ＣＮＰａｓｅ陽性オリゴデンドロサイトへのロバストな分化を明らかにする。共焦点ｚ−スタックの三次元表面再構成により、ＴＵＪ１陽性神経突起を包むミエリン鞘（矢頭）の形成及びランビエ絞輪（これは、ＣＮＰａｓｅ陽性経鞘の間隙の存在によって示唆される）の形成が視覚化された。（ｄ）６１日目における前シナプスマーカーシナプトフィジン及び後シナプスマーカーＰＳＤ９５の免疫組織学的染色。矢頭は、前シナプスと後シナプスとの間の直接接触を示す。破線の囲み枠は、倍率の範囲を示す。画像は、共焦点ｚ−スタックの３Ｄビューを示す。（ｅ）共焦点ｚ−スタックの三次元表面再構成は、それぞれ前シナプスマーカー及び後シナプスマーカーのシナプトフィジン及びＰＳＤ９５間のいくつかの直接接触（矢頭）によって示されているように、オルガノイドの異なる神経突起間のシナプス結合の形成を実証する。下のパネルは、いくつかのシナプス結合に関する高倍率の共焦点ｚ−スタックの３Ｄビュー及び対応する３Ｄ表面再構成を示す。スケールバー、２００μm（ａ）、２０μm（ｂ、ｃ、上のパネル、ｃ、下のパネル左、ｄ、上／中央のパネル左／中央）、２μm（ｃ、下のパネル右、ｄ、上／中央のパネル右、ｄ、下のパネル）。 中脳オルガノイドは、電気生理学的活性を示す。ａ）〜ｂ）Fluo-4AMベースのカルシウムイメージングを使用した、オルガノイドにおける自発電気生理学的活性のモニタリング。（ａ）自発活性を発現する２つのセグメント化ニューロンを有する中脳オルガノイドのカルシウムイメージングデータセットの平均蛍光フレーム。スケールバー、２０μm。（ｂ）（ａ）のセグメント化細胞体に対応する蛍光トレースは、歩調取り様形状を伴う発火パターンを示す。（ｃ）〜（ｆ）多電極アレイ（ＭＥＡ）システムを使用した、６０〜７０日後の中脳オルガノイドにおける自発活性の評価。（ｃ）４８ウェル組織培養プレート中の１６電極アレイ上に配置した中脳オルガノイドの代表的なスキーム。（ｄ）活性マップの代表的な画像。（ｅ）個々の電極によって検出された単相スパイク及び二相スパイクの例。（ｆ）時間的及び空間的にニューロンネットワーク活性を示すスパイクラスタプロットの代表的な画像。近いタイミングで複数の電極上で発生するスパイクは、赤色の線によって示されているネットワーク同期性を表す。

Ｉ．材料及び方法
１．細胞培養
層流フードを使用して滅菌条件下で、細胞培養作業を実施した。３７℃及び５％ＣＯ_２一定のインキュベーター内で、全ての細胞を培養した。２Ｄ条件下で成長させた細胞の場合、冷ノックアウトＤＭＥＭ（LIFE TECHNOLOGIES）に再懸濁したMATRIGEL（登録商標）(CORNING)で細胞培養プレート（NUNC（商標）, THERMO SCIENTIFIC（商標））をコーティングした。希釈MATRIGEL １．５mLを６ウェルプレートの各ウェルに追加した。プレートを室温（ＲＴ）で一晩保持した。コーティングプレートを４℃で最大１カ月間保存した。
２．脳オルガノイドの作製
Lancasterらによって確立されたプロトコール（Lancaster and Knoblich, 2014a; Lancaster et al., 2013）に若干の改変を加えて、脳オルガノイドを作製した。フィーダー依存性ｉＰＳＣに代えて、開始集団としてフィーダー非依存性ヒトｉＰＳ細胞を使用した。第１段階として、胚様体（ＥＢ）を作製した。イントロダクションのセクション１．１に記載されている胚発生と同様に、これらの３Ｄ凝集体は、３つの生殖系列（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）への分化を介して細胞特異化を受ける。次に、神経上皮組織の形成が始まり、細胞運命が神経系に限定された。神経上皮組織が発達すると、３Ｄ構造をMATRIGEL（これは構造支持を与え、組織が３Ｄ形状を維持するのを支援する）の小滴に移した。Ｅｎｇｅｌｂｒｏｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫に由来するこのマトリックスは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ニドゲン／エナクチン及びプロテオグリカンから構成されるので、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に似ている。ビタミンＡを含有するＮ２及びＢ２７を補充したNeurobasal培地を使用することによって、神経分化を促す培地中で、MATRIGEL包埋組織を培養した。細胞成長及び生存率を増加させるために、非必須アミノ酸及びGlutaMax（商標）を追加した。還元剤２−メルカプトエタノールは、有毒な酸素ラジカルレベルの形成を防止した。組織を動的条件下に置いて、組織が底部に接着するのを防止した。それは栄養素交換をさらに増加させ、老廃物交換をコントロールする。この目的のために、Lancasterらは、スピニングバイオリアクターを使用した。このプロジェクトでは、約８０rpmでスピニングしながら、オービタルシェーカー（IKA（登録商標））上の未処理１０cm細胞培養ペトリ皿（GREINER）に組織を置いた。
２．１ ヒト人工多能性幹細胞の維持
CORIELLの野生型ヒト人工多能性幹細胞株を細胞培養６ウェルプレートに播種し、Essential8（商標）培地（LIFE TECHNOLOGIES）中で培養した。７０〜８０％コンフルエンスで、最後の播種後１週間以内に、細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を吸引し、０．５mM ＥＤＴＡ（INVITROGEN）を追加した。３７℃及び５％ＣＯ_２における４分間のインキュベーション時間後、ＥＤＴＡを吸引した。ＰＢＳで細胞を洗浄し、Essential8（商標）培地に再懸濁した。細胞を新たなコーティング６ウェルプレートに１：３〜１：６の比で播種した。培地を毎日交換した。
２．２ ｈｉＰＳＣの免疫細胞化学的特性評価
ヒトｉＰＳ細胞を２４ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション２．１に記載されている条件下で培養した。３日後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって細胞を４℃で４０分間固定し、ＰＢＳで５分間にわたって３回洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００によって細胞膜を室温で１０分間透過処理した。０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液による３回の洗浄工程後、２％ＮＧＳ＋２％ＢＳＡの０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液によって細胞を室温で６０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで一次抗体を希釈した（表１を参照のこと）。ウェットチャンバー内のパラフィルム上に、一次抗体溶液 ３５μl滴を調製した。カバースリップをこの小滴の上に載せ、４℃で一晩インキュベーションした。

翌日、３回交換したＰＢＳでカバースリップを５分間洗浄した。一次抗体に対する二次抗体（表２）をヘキスト色素（INVITROGEN、１：１００００）と一緒に希釈し、前述のようにパラフィルム上に小滴を調製した。カバースリップを室温で１時間インキュベーションし、次いで、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｈ_２Ｏで１回洗浄し、蛍光封入剤を使用してガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡（ZEISS LSM 710）を使用して、染色を分析した。

２．３ ＥＢの作製
ＥＢの作製では、ＰＢＳでコロニーを１回洗浄し、０．５mM ＥＤＴＡ（INVITROGEN）を使用して分離した。３７℃における４分間のインキュベーション期間後、ＥＤＴＡを予熱StemPro（登録商標）Accutase（登録商標）(LIFE TECHNOLOGIES) １mlと交換し、細胞を３７℃でさらに４分間インキュベーションした。Essential8（商標）培地(LIFE TECHNOLOGIES) １mlを含む１mlピペットチップを使用して、ディッシュからコロニーを分離した。単一細胞懸濁液を作るために、細胞懸濁液をファルコンチューブに移してトリチュレートした。細胞計数のために、２回反復分の５μlを収集した。細胞を室温、２７０ｇで５分間遠心分離し、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター（Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES）を使用して、細胞を計数した。遠心分離後、上清を吸引し、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するｌｏｗ−ＦＧＦ２ ｈＥＳＣ培地（表３） １mlに細胞を再懸濁した。次に、１５０μl当たり生細胞 ９０００個を得るために、ｌｏｗ−ＦＧＦ２ ｈＥＳＣ培地を追加した。最後に、１５０μlを丸底超低接着９６ウェルプレート（CORNING）（これは、細胞を沈降させてＥＢの形成を促す）の各ウェルにプレーティングした。３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベーター内で、細胞を培養した。培地の半分を新鮮ｌｏｗ−ＦＧＦ２ ｈＥＳＣ培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。ＲＯＣＫ阻害剤及びｌｏｗ−ＦＧＦ２を４日間だけ追加した。

２．４ 神経誘導
６日後、カットピペットチップを用いて、境界において明るい平滑縁を有するＥＢを、神経誘導培地（表４）を含有する超低接着２４ウェルプレート（CORNING）に移し、４日間培養した。

２．５ MATRIGEL小滴への神経上皮組織の移動
MATRIGEL小滴を作製するために役立つ基材を調製するために、パラフィルムの角材を２００μlピペットチップ用の空のチップトレイに置き、手袋をした指でパラフィルムを穴に押し込むことによって、小さい窪みを作った。窪んだパラフィルムにエタノールを再度噴霧し、層流フード下、ペトリ皿中で乾燥させた。パラフィルムが乾燥したら、神経上皮組織を各窪みに移し、培地を徐々に除去した。次に、MATRIGEL ３０μlを慎重に追加し、組織を小滴の中央に置いた（図２．１）。MATRIGELを重合させるために、それを３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション時間後、ビタミンＡを含まない脳オルガノイド分化培地 １５ml中に小滴を収集した（表５）。パラフィルムからMATRIGEL小滴を除去するために、小滴が落ちるまでディッシュを穏やかに振盪しながら、滅菌鉗子を使用してシートを保持した。ディッシュを静止条件下のインキュベーター内に置き、４８時間後に培地を交換した。静置培養で４日後、培地を、ビタミンＡを含有する新鮮分化培地と再度交換した。最後に、約８０rpmで振盪しながら、インキュベーター内に設置したオービタルシェーカー上にディッシュを置き、培地を３日ごと又は４日ごとに交換した。

３．中脳オルガノイドの作製
３．１ ヒト神経上皮幹細胞
中脳オルガノイドを作製するために、ヒト神経上皮幹細胞（ｈＮＥＳＣ）は開始集団として機能した。これらの神経前駆細胞は、ロバストな不死性のエクスパンションが可能であり、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含むＣＮＳの細胞に分化し得、神経堤系統にも分化し得るので、幹細胞の特性を有する。自己複製及びエクスパンションのために、それらは小分子を専ら必要とする。非神経ＢＭＰ及び背側ＴＧＦ−βシグナリングの阻害を介して、神経誘導を開始した。不死自己複製状態を維持するために、ＷＮＴ及びＳＨＨシグナルをトリガーした。ＷＮＴシグナリングは、神経板の外側縁において細胞の形成を誘導し、そのアンタゴニストＳＨＨは、腹側神経管運命を規定する。ＣＨＩＲ９９０２１を使用してカノニカルＷＮＴシグナリング経路を刺激し、パルモルファミン（ＰＭＡ）を追加してＳＨＨ経路を刺激した。ｈＮＥＳＣは、運動ニューロン及びｍＤＡに効率的に分化し得るので、初期ヒト発生及び神経変性疾患を研究するための強力なツールになる。
３．２ ヒト神経上皮幹細胞の維持
ヒト人工多能性幹細胞から誘導した野生型ヒト神経上皮幹細胞株（ｈＮＥＳＣ−Ｋ７）は、開始集団として機能した（Reinhardt et al., 2013）。新鮮補充Ｎ２Ｂ２７維持培地（表６及び表７）中で、細胞を培養した。最後の播種後１週間以内に、８０〜９０％コンフルエンスで細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を温StemPro（登録商標）Accutase（登録商標）(LIFE TECHNOLOGIES) ７００μlと交換し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で４〜６分間インキュベーションした。細胞を温ＤＭＥＭ／Ｆ１２（LIFE TECHNOLOGIES） ５mlに再懸濁し、２００ｇで３分間遠心分離した。上清を吸引した後、ペレットを補充Ｎ２Ｂ２７維持培地に再懸濁し、コンフルエンスに応じて、細胞を新たなプレートに１：１０〜１：２０の比で播種した。培地を隔日で交換した。


３．３ ｈＮＥＳＣの免疫細胞化学的特性評価
ｈＮＥＳＣを２４ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション３．２に記載されている条件下で培養した。３日後、４％ＰＦＡで細胞を４℃で４０分間固定し、ＰＢＳで５分間かけて３回洗浄した。セクション２．２に記載されているプロトコールにしたがって、異なる一次抗体（表８）及び対応する二次抗体（表２）を用いて、ＩＣＣを実施した。

３．４ 三次元ｈＮＥＳＣコロニーの作製及びエクスパンション
単一３Ｄ ｈＮＥＳＣコロニーを作製するために、セクション３．２に記載されているようにｈＮＥＳＣを継代した。遠心分離してＮ２Ｂ２７維持培地 １mlに再懸濁した後、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター（Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES）を使用して、細胞を計数した。１５０μl当たり生細胞 ９０００個を得るために、Ｎ２Ｂ２７維持培地を追加した。１５０μlを丸底超低接着９６ウェルプレート（CORNING）（これは、細胞が１ウェル当たり１つの単一コロニーを形成することを可能にする）の各ウェルにプレーティングした。培地の半分を新鮮Ｎ２Ｂ２７維持培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。６日後、副次的なコロニーを除去して組織をエクスパンションするために、コロニーを超低接着２４ウェルプレート（CORNING）に移した。２日後、セクション２．５に記載されているのと同じ方法で、コロニーをMATRIGEL小滴に包埋した。１０cmペトリ皿中、静止維持条件下で、MATRIGEL包埋コロニーを２日間以上培養してから、１０日目に、ＰＭＡを含有するＮ２Ｂ２７分化培地（表９）を用いて分化を開始した。Reinhardt et al. 2013から若干の改変を加えて分化プロトコールを適合した。ＦＧＦ８は、ｍＤＡニューロンへの分化効率を減少させるので、最初の８日間はＦＧＦ８を追加しなかった。分化条件下で２日後、ディッシュをオービタルシェーカー上に置き、約８０rpmの動的条件下に置いた。培地を３日ごと又は４日ごとに交換した。分化の最初の６日間のみ、ＰＭＡを追加した。

４．ヒト大脳オルガノイド及び中脳オルガノイドの免疫組織化学的特性評価
脳発生中に、細胞はそれら自身を再編成し、異なる機能領域及び相互依存領域を形成する。同時に、神経上皮細胞は、ＣＮＳの様々なニューロン及び支持グリア細胞に分化する。脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが、発生中のヒト脳に特徴的な異なる細胞型及び脳領域を発達させるかを分析するために、免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を実施した。神経前駆細胞、幼若ニューロン及び成熟ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ドーパミン作動性ニューロンの存在を分析した。また、免疫蛍光染色を実施して、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが中脳同一性を確立したかを検証した。
４．１ 切片化
６日目（ｎ＝３）、７日目（ｎ＝３）、１６日目（ｎ＝３）、３０日目（ｎ＝３）及び４４日目（ｎ＝８）に、シェーカー上で、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドを４％ＰＦＡによって室温で一晩固定した。ＩＨＣの前に、９００μm超の直径を有するより大きいオルガノイドを切片化した。ＰＢＳで固定組織を１５分間かけて３回洗浄し、温３％低融点アガロースに包埋し、固体になるまで冷却した。次いで、アガロースのブロックをトリミングし、金属ブロックホルダー上に接着し、０．５mm／秒の速度及び７０Hzの周波数でビブラトーム（LEICA, VT100 S）を使用して厚さ１５０μmに切片化した。
４．２ ＩＨＣ
ＴＢＳ＋＋＋（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％アジ化ナトリウム、０．１％クエン酸ナトリウム及び５％ウシ胎児血清又は正常ヤギ血清を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）を含有する２４ウェルプレートに浮遊アガロース切片を収集し、シェーカー上、室温で少なくとも１時間ブロッキング／透過処理した。ＴＢＳ＋＋＋で一次抗体（表１０を参照のこと）を希釈し、抗体溶液 ３００μlを各ウェルに追加した。シェーカー上で切片を４℃で４８時間インキュベーションし、その後、３回交換したＴＢＳで１５分間洗浄した。シェーカー上、ＴＢＳ＋＋＋で希釈した二次抗体（表１１を参照のこと）で切片を室温で２時間インキュベーションし、続いて、ＴＢＳによる３回の洗浄工程を１５分間行った。最後に、Ｈ_２Ｏで切片をリンスし、封入剤を用いてガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡（ZEISS LSM 710）を使用して、染色を分析した。


ＩＩ．結果
中脳オルガノイドの作製
１．１ ｈＮＥＳＣの免疫細胞化学的特性評価
ヒト神経上皮幹細胞のＩＣＣにより、維持条件下における神経前駆体マーカーＳＯＸ２及びネスチンの安定発現が明らかになった。ｈＮＥＳＣでは、別の神経前駆体マーカーＳＯＸ１も発現していたが、蛍光強度が変動した。ｈＮＥＳＣでは、ＦＯＸＡ２（腹側神経管のマーカー）がわずかに発現していた。初期分化時には、少数のｈＮＥＳＣが、ニューロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリン（ＴＵＪ１）及びダブルコルチン（ＤＣＸ）（これらは、初期ニューロンの指標である）を発現するニューロンに分化する（図３）。
１．２ 中脳オルガノイドの発生
中脳オルガノイドの作製のために、開始集団として野生型ｈＮＥＳＣ株Ｋ７を使用した。丸底超低接着プレート上に播種したヒトＮＥＳＣは高密度の球状コロニーを形成し、周辺の死細胞はごくわずかであった。いくつかのウェルでは、小さい副次的なコロニーが発達し、数日後、これは主要コロニーと一体化した。最初の３日以内に、コロニーは明るくなり始め、維持条件下で平滑縁を示した（これは、組織が健康であることを示す）。しかしながら、８日目の初期オルガノイドは、中央において暗いコアを発達させた（これは、細胞死を示す）（図４ａ、ｂ）。２日間の分化後、オルガノイドは、組織の表面に沿って小さい突起を発達させた（図４ｃ）。３週間以内に、突起は伸びて約１mmの長さに達し、コロニーの外側の細胞体はごくわずかであった。MATRIGEL支持がないコロニーでは、これは観察されなかった（図４ｄ〜ｆ）。

１．３ ヒト中脳オルガノイドの免疫組織化学的特性評価

維持条件下における６日目及び７日目の初期中脳オルガノイドを切片化せずに染色した。発生中の三次元ヒトＮＥＳＣコロニーは、神経前駆体マーカーＳＯＸ２及びネスチンの安定発現、並びに初期分化幼若ニューロンを示した（図５）。コロニー全体にわたって、放射状に組織化された前駆細胞によって取り囲まれた小さい空洞が発達した。

分化条件下における後期の中脳オルガノイドは高密度のニューロンネットワークを発達させ、これは、肉眼的な形態学的変化と一致して徐々に複雑化した。ドーパミン作動性ニューロンのマーカー（ＴＵＪ１／ＴＨ）を用いた免疫蛍光染色により、１６日目において既にいくつかのＤＡニューロンが発達し、後期には密度が増加することが明らかになった。注目すべきことに、ＤＡニューロンは別個の領域に位置していたが、これは、in vivoにおける脳発生と一致して、３Ｄ構造の非対称極性組織化を示唆している（図６、図７）。中脳オルガノイドにおけるＤＡニューロンをさらに分析するために、ＴＨと一緒に成熟ニューロンマーカーＭＡＰ２の染色を実施した。同じオルガノイドの異なる切片の染色により、成熟ニューロンはオルガノイドの最外部に位置し、幼若ＴＵＪ１陽性ニューロンは内部コアにおいてより豊富であったことが明らかになった（図７ａ、ｃ）。興味深いことに、成熟ニューロンの一部もＴＨを発現していたが、これは、中脳オルガノイドにおける成熟ＤＡニューロンの存在を示している。加えて、神経前駆体マーカーＳＯＸ２の染色により、後期において、いくつかの神経前駆細胞がオルガノイドの内部コアを取り囲んでいたことが示された。ＴＨ陽性ＤＡニューロンは、神経前駆細胞の層に隣接して位置していた（図７）。

中脳オルガノイドの細胞構成をさらに調べるために、ＧＦＡＰ（アストロサイト）及びＯ４（オリゴデンドロサイト）を含むグリア細胞マーカーの染色を実施した。中脳オルガノイドのいくつかの領域では、Ｏ４陽性及びＴＵＪ１陰性細胞が同定されたが、これは、後期中脳オルガノイドにおけるオリゴデンドロサイトの発生を示している（図８ａ〜ｃ）。中脳オルガノイドでは、アストロサイトはほとんど見られなかった。しかしながら、組織全体にわたって（図８ｃ）、及び少数のＧＦＡＰ陽性細胞（図８ｄ）において、関連細胞体を有しないいくつかのＧＦＡＰ陽性突起が観察された。

最後に、中脳マーカーＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２及びＥＮ１について、後期の中脳オルガノイドを染色した。分析した切片及びオルガノイド内では、これらの転写因子を発現する細胞は見られなかった。いくつかの細胞はＬＭＸ１Ａ発現の証拠を示したが、それは核内には存在せずに散在しており、非特異的結合を潜在的に示している。全体として、このデータは、中脳オルガノイドが様々な神経細胞型を発達させ、非対称極性の組織を示すことを示している。

２．ヒト中脳特異的オルガノイドのさらなる作製

２．１ 材料及び方法

２．１．１ 中脳オルガノイドの培養

以前に記載されているように（Reinhardt, et al. “Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.” PloS one 8, e59252）、ｈｉＰＳＣ由来ｈＮＥＳＣを培養した。オルガノイド培養の０日目に、アキュターゼを用いて２０継代未満のｈＮＥＳＣを３７℃で５分間処理し、続いて、穏やかにピペッティングして単一細胞を得た。合計９０００個の細胞を超低接着９６ウェル丸底プレート（Corning）の各ウェルに播種し、３μM ＣＨＩＲ−９９０２１（Axon Medchem）、０．７５μMパルモルファミン（Enzo Life Science）及び１５０μMアスコルビン酸（Sigma）を補充したＮ２Ｂ２７培地（Ｎ２Ｂ２７維持培地と称される）中で培養した。Ｎ２Ｂ２７培地は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Invitrogen）／Neurobasal（Invitrogen）５０：５０と、１：２００ Ｎ２サプリメント（Invitrogen）、ビタミンＡを欠く１：１００ Ｂ２７サプリメント（Invitrogen）、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）とからなる。培地を６日間にわたって隔日で交換し、次いで、３Ｄコロニーを超低接着２４ウェルプレート（Corning）に移し、Ｎ２Ｂ２７維持培地中で培養した。

オルガノイド培養の８日目に、以前に記載されているように（Lancaster and Knoblich (2014) “Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.” Nature protocols 9, 2329-2340）、３ＤコロニーをhESC-qualified Matrigel (BD Bioscience)の小滴に移した。短期培養の場合には１０cmペトリ皿、又は長期培養の場合には１滴／ウェルの超低接着２４ウェルプレート（Corning）において、Ｎ２Ｂ２７維持培地中でこの小滴を培養した。１０日目に、１０ng/ml ｈＢＤＮＦ（Peprotech）、１０ng/ml ｈＧＤＮＦ（Peprotech）、５００μM ｄｂｃＡＭＰ（Peprotech）、２００μMアスコルビン酸（Sigma）及び１ng/ml ＴＧＦ−β３（Peprotech）を補充したＮ２Ｂ２７培地を用いて、分化を開始させた。加えて、１μMパルモルファミン（Enzo Life Science）をこの培地にさらに６日間追加した。オルガノイド培養の１４日目に、インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）内のオービタルシェーカー（IKA）（８０rpmで回転）上にプレートを置き、オルガノイドを培養状態に保ち、培地を２日ごと又は３日ごとに交換した。

２．１．２ 免疫組織化学的分析

４％パラホルムアルデヒドを用いてオルガノイドを室温で一晩固定し、ＰＢＳで１時間にわたって３回洗浄した。その後、それらをＰＢＳ中３％低融点アガロースに包埋し、３７℃で１５分間インキュベーションし、続いて、室温で３０分間インキュベーションした。固体アガロースブロックをＰＢＳでカバーし、４℃で一晩置いた。特に指示がない場合、ビブラトーム（Leica VT1000s）を使用して５０μm切片を切断し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液で切片を透過処理し、２．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１％アジ化ナトリウムを含む２．５％正常ヤギ又はロバ血清でブロッキングした。シェーカー上で、以下の希釈のブロッキングバッファー中、切片を一次抗体と共に４℃で４８〜７２時間インキュベーションした：ウサギ抗ＴＨ（１：１０００、Abcam）、ニワトリ抗ＴＨ（１：１０００、Abcam）、ウサギ抗ＴＨ（１：１０００、Santa Cruz Biotechnology）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：２００、R&D Systems）、ウサギ抗ＳＯＸ２（１：１００、Abcam）、ヤギ抗ＳＯＸ１（１：１００、R&D Systems）、マウス抗ネスチン（１：２００、BD）、マウス抗Ｋｉ６７（１：２００、BD）、ウサギ抗ＣＣ３（１：２００、Cell Signalling）、マウス抗ＦＯＸＡ２（１：２５０、Santa Cruz Biotechnology）、ウサギ抗ＬＭＸ１Ａ（１：２００、Abcam）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Millipore）、マウス抗Ｓ１００β（１：１０００、Abcam）、マウス抗ＴＵＪ１（１：６００、Covance）、ウサギ抗ＴＵＪ１（１：６００、Covance）、ニワトリ抗ＴＵＪ１（１：６００ Millipore）、ウサギ抗ＰＡＸ６（１：３００、Covance）、マウス抗シナプトフィジン（１：５０ Abcam）、ウサギ抗ＰＳＤ−９５（１：３００、Invitrogen）、マウス抗ＭＡＰ２（１：２００、Millipore）、マウス抗ＣＮＰａｓｅ（１：２００、Abcam）及びマウス抗Ｏ４（１：４００、Sigma）。一次抗体と共にインキュベーションした後、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で切片を３回洗浄し、シェーカー上、室温で３０分間ブロッキングし、続いて、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中二次抗体（１：１０００）と共にインキュベーションした。全ての二次抗体（Invitrogen）をAlexa Fluor蛍光色素にコンジュゲートした。製造業者のプロトコールにしたがってSTAINperfect Immunostaining Kit (ImmuSmol)を使用して、ドーパミンを検出した。ニワトリ抗ＴＨ一次抗体（Abcam）で切片を共染色し、Hoechst 33342(Invitrogen)で核を対比染色した。切片をFluoromount-G封入剤（Southern Biotech）にマウントし、共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss LSM 710）を用いて分析した。Zenソフトウェア(Zeiss)及びImageJを用いて、画像をさらに加工した。Imarisソフトウェア（Bitplane）を使用して、共焦点ｚ−スタックの三次元表面再構成を作った。ImageJ Interactive３Ｄ表面プロットプラグインを用いて蛍光強度に基づいて、ＤＮの非対称分布を評価した。

２．１．３ 定量的リアルタイムＰＣＲ

４８日齢のオルガノイドから、全ＲＮＡを単離した。典型的には、１回の単離のために、５つのオルガノイドをプールした。解離のために、ＰＢＳでオルガノイドを１回洗浄し、QIAzol溶解試薬（Qiagen）で溶解し、針を３回通過させ、QIAshredderカラム（Qiagen）でホモジナイズした。製造業者の説明書にしたがってRNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用して、ＲＮＡを単離した。続いて、High Capacity RNA to DNA Kit (Thermo Fisher Scientific)のプロトコールにしたがって、単離したＲＮＡを逆転写した。Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific)を用いて、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。以下のようにAriaMx Real-time PCR System (Agilent Technologies)によって、ｃＤＮＡ １μgの増幅を実施した：初期変性工程、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長。比較Ｃｔ法２−ΔΔＣｔを使用して、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３７Ａの発現に対して、発現レベルを正規化した。中脳オルガノイドの発現パターンを評価するために、この値をｈＮＥＳＣの発現レベルと比較し、これを１に設定した。融解曲線分析によって、ＰＣＲ産物の品質を評価した。

２．１．４ 電気生理学的活性の評価

カルシウムイメージング及び多電極アレイ（ＭＥＡ）記録を使用して、それぞれ５０〜５２日目及び６０〜７０日目におけるオルガノイドの自発活性を分析した。濃度５μMの細胞浸透Fluo-4 AM (Life Technologies)のneurobasal培地をウェルに追加し、オービタルシェーカー上、３７℃で４５分間インキュベーションした。CMOSカメラ(Orca Flash 4.0, Hamamatsu)を備える生細胞回転盤共焦点顕微鏡（Zeiss）を使用して、蛍光画像を取得した。カルシウム時系列を５Hzで約２分間取得し、単一の画像として保存した。ADINAツールボックス(Diego et al. (2013) “Automated identification of neuronal activity from calcium imaging by sparse dictionary learning.” Proceedings of the IEEE 10th International Symposium on Biomedical Imaging, pp. 1058-1061)（これは、個々の細胞体を自動的にセグメント化し、重複するものを分けるために開発された公的に入手可能なソフトウェアである）を使用して、これらの画像を分析した。次いで、セグメント化した細胞体について、蛍光強度（ΔＦ／Ｆ）の相対変化として表される蛍光トレースを測定した。

Axion BioSystemsのMaestroシステムを使用して、ＭＥＡ記録を行った。１ウェル当たり１６電極アレイを含有する４８ウェルＭＥＡプレートを０．１mg/mlポリ−Ｄ−リジン臭化水素酸塩（Sigma-Aldrich）によってプレコーティングし、続いて、１０μg/mlラミニン（Sigma-Aldrich）によって室温（ＲＴ）で１時間コーティングした。６０〜７０日後に、中脳オルガノイドをアレイ上に置いた。カバースリップを上に置いて、浮遊オルガノイドを電極と確実に接触させた。ニューロン成熟培地中、５分間〜最大５日間にわたって１２．５kHzのサンプリング速度で、自発活性を３７．５℃で記録した。Axion Integrated Studio (AxIS 2.1)を使用して、２００〜３０００Hzのカットオフ周波数及び６×ＳＤの閾値を有するButterworthバンドパスフィルタを、偽陽性及び検出ミスの両方を最小化するように設定した。Neural Metric Tool (Axion BioSystems)を使用して、スパイクラスタプロットを分析した。平均が５スパイク／分以上の電極を活性と定義した。記録から作成したスパイクカウントファイルを使用して、スパイク数／活性電極／測定を計算した。ＭＥＡシステムに関するさらなる詳細は、以前に記載されている（Bardy et al. (2015) “Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, E2725-2734）。

２．２ 結果

以前に記載されている神経上皮幹細胞（Reinhardt et al. “Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.” PloS one 8, e59252）を、ヒト中脳オルガノイドの作製のための開始集団として使用した。開始集団としてのｉＰＳＣと比較して、ＮＥＳＣは、中脳／後脳同一性に既にパターン形成されている。

典型的には、オルガノイド作製の前に、ＮＥＳＣは、神経前駆体マーカーＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びネスチンを発現する。細胞が三次元コロニーを形成することを可能にする丸底超低接着９６ウェルプレートに細胞を播種した。ＧＳＫ３ｂ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の存在下でそれらを培養してカノニカルＷＮＴシグナリング経路を刺激し、パルモルファミン（ＰＭＡ）を使用してＳＨＨ経路を活性化した。８日目に、構造支持のために、三次元ＮＥＳＣコロニーをMATRIGELの小滴に包埋し、２日後、培地を分化培地に交換することによって、中脳オルガノイドへの特異化を開始させた。本発明者らは、オルガノイドを、短期培養の場合には１０cmペトリ皿に、又は長期培養の場合には超低接着２４ウェルプレートに置き、約８０rpmで回転するオービタルシェーカー上にそれらを置いた（図９Ａ）。

約２７日間の全手順の後（中脳オルガノイドへの約１６日間の分化後）、初期中脳オルガノイドは細胞増殖マーカーＫｉ６７を広く発現していたが、これは成熟時には減少した（図９Ｂ）。さらに、これらのオルガノイドは神経前駆体マーカーＳＯＸ２を発現したが、これも成熟中には減少し、幹細胞ニッチの形成に似てより局所限定的になる（図９Ｃ）。重要なことに、ＮＥＳＣからの中脳オルガノイドの作製は再現可能であり、有意な変動はなかった。

２．１ ヒト神経上皮幹細胞由来中脳オルガノイドの神経細胞分化及び自己組織化

増殖の減少及び幹細胞同一性を示した後、中脳ドーパミン作動性ニューロン（ｍＤＮ）のニューロン分化及び特異化を評価した。ＴＵＪ１陽性ニューロン及びＴＨ陽性ＤＮへのロバストな分化を観察することができた。これらの染色により、複雑なニューロンネットワークの形成が明らかになった（図１０Ａ、２Ｂ）。成熟ニューロンマーカーＭＡＰ２／ＴＨの二重陽性染色により、オルガノイド内のＤＮの成熟が実証された。ＮＥＳＣ由来オルガノイドは、中脳同一性を有するＤＮへの分化を受けるかをさらに調べた。後期オルガノイドでは、ＴＨ、ＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２陽性ニューロンの大集団が観察された（図１０Ｃ〜Ｅ）。ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＥＮ１、ＮＵＲＲ１、ＡＡＤＣ及びＴＨを含むｍＤＮ分化マーカーのアップレギュレーションがさらに明らかになった（図１０Ｆ、１０Ｇ）。これらのデータは、得られたドーパミン作動性ニューロンが実際に中脳同一性を有することを示している。

ＮＥＳＣ由来中脳オルガノイドにおける空間的組織化の程度を調べるために、本発明者らは、ＤＡニューロンマーカーＴＵＪ１／ＴＨの分布パターンを評価し、表面プロットを使用して結果を示した。印象的なことに、本発明者らは、ＤＡニューロンが、中脳オルガノイド内で明確な特定クラスタを形成することを見出した（図１０Ｈ、１０Ｉ）。

ＴＨ陽性ニューロンの同一性がドーパミン作動性であることをさらに実証するために、本発明者らは、神経伝達物質ドーパミンを産生するそれらの能力を分析した。成熟オルガノイドの免疫染色により、ドーパミン及びＴＨ二重陽性細胞の存在が実証された（図１０Ｊ）。これらの結果により、ＮＥＳＣ由来オルガノイドのｍＤＮが、空間的にパターン形成された複雑かつ機能的な神経組織に自己組織化することが示された。

３．中脳オルガノイドにおけるグリア分化

胎児ヒト脳の発生中、神経管由来細胞はニューロンに分化するだけではなく、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞にも分化する。したがって、中脳オルガノイドにおけるこれらのグリア細胞の存在を調査した。時間的には神経分化の後にグリア分化が起こる脳発生とよく一致して、（全手順の２７日目、すなわち、中脳オルガノイド／初期オルガノイドへの分化開始の１６日後の）オルガノイドでは、有意な量のグリア細胞は検出されなかった。しかしながら、（全手順の６１日目、すなわち、中脳オルガノイドへの約５１日間の分化後の）より成熟したオルガノイドでは、本発明者らは、マーカーＳ１００β及びＧＦＡＰについて陽性のアストロサイトを観察した。興味深いことに、休止状態（ＧＦＡＰ陰性）及び反応状態（ＧＦＡＰ発現を特徴とする）の両方のアストロサイトの集団が得られた（図１１Ａ、Ｂ）。

また、全手順の４４日目（中脳オルガノイドへの分化の約３４日目）に、Ｏ４陽性オリゴデンドロサイトに分化した細胞分画が検出された。さらに、興味深いことに、これらのオリゴデンドロサイトは、典型的には、オルガノイド内で空間的非対称分布を示した（示さず）。中枢神経系では、成熟オリゴデンドロサイトはミエリン鞘（これは軸索を包んで、軸索に沿った活動電位の伝達を促進する）を形成する。中脳オルガノイド内のオリゴデンドロサイトがそれらの実際の機能（すなわち、ミエリン鞘の形成）を実行することができるかを分析するために、本発明者らは、ニューロンマーカーＴＵＪ１と一緒に２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）（ミエリン関連酵素）に対する免疫蛍光染色を実施した。これらの染色の３Ｄ表面再構築により、ＣＮＰａｓｅ陽性オリゴデンドロサイトのミエリン鞘によって覆われた多数のＴＵＪ１陽性神経突起が明らかになった（図１１Ｃ）。興味深いことに、これらの神経突起は、多くの場合、ランビエ絞輪（これは、跳躍的な高速のニューロン伝達を可能にする）の形成に似た鞘形成の間隙を示した（図１１Ｃ）。

４．中脳オルガノイドの機能性

ニューロン伝達の１つの重要な要件は、シナプス結合の形成を介した成熟ニューロンネットワークの発達である。したがって、６１日目（中脳オルガノイドへの５１日間の分化）に、前シナプスマーカーのシナプトフィジン及び後シナプスマーカーのＰＳＤ９５に対する免疫組織学的染色を使用して、シナプス接続を調査した。その後の３Ｄ表面再構築により、多数の前シナプス斑点及び後シナプス斑点の形成だけではなく複数のシナプス結合も実証された（図１１Ｄ）。シナプトフィジン陽性の前シナプスとＰＳＤ９５陽性の後シナプスとの直接接触によって示されているように、異なる神経突起間でシナプス結合が形成されていた（図１１Ｅ）。したがって、中脳オルガノイドは、シナプス結合を介してシグナルを送る能力を示すので、電気生理学的に機能的であるための前提条件を満たす。
それらの機能性及びニューロンネットワーク活性をさらに確認するために、本発明者らは、オルガノイド全体に対してFluo-4AMカルシウムイメージングを実施した。本発明者らは、活動電位によって誘発されたカルシウム移行に基づいて自発ニューロン活性を測定した（図１２Ａ、Ｂ）。注目すべきことに、蛍光トレースのいくつかは規則的な発火パターン（これは、緊張性電気生理学的活性の指標である）を示し、ドーパミン作動性ニューロンのペースメーカー活性に似ていた（Moreno et al. (2015), “Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture.” Lab on a chip 15, 2419-2428; Cummings et al. (2014)” Alzheimer’s disease drug-development pipeline: few candidates, frequent failures.” Alzheimer’s research & therapy 6, 37）。カルシウムイメージングに加えて、多電極アレイ（ＭＥＡ）システムを使用して、電気生理学的活性を調べた。この方法論は、活動電位によって生成される細胞外電場電位の非侵襲的記録を可能にする。６０〜７０日目（５０〜６０の分化）に、４８ウェル組織培養プレート中で、中脳オルガノイドを１６電極のグリッド上に置いた（図１２Ｃ）。単相スパイク及び二相スパイクの形態の個々の電極によって、自発活性を数日間にわたって検出した（２６．１２±５．１スパイク／活性電極（ｎ≧３）、図１２Ｄ、Ｅ）。さらに、スパイクは、近いタイミングで複数の電極上で発生したが、これは、ニューロンネットワーク同期性を表す（図１２Ｆ）。これらの知見は、中脳オルガノイドが機能的シナプス結合を発達させ、自発ニューロン活性を示すことを示している。
参考文献

Claims (53)

1. 中脳オルガノイドを作製するための方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する、方法。
2. 前記神経上皮幹細胞がヒト神経上皮幹細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記神経上皮幹細胞がｈＮＥＳＣ−Ｋ７又はｓｍＮＰＣである、請求項２に記載の方法。
4. 前記神経上皮幹細胞が、遺伝子改変されたものであるか、又は神経学的疾患を患っている患者から取得されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 遺伝子改変が突然変異、ノックアウト又はノックインを含む、請求項４に記載の方法。
6. 神経学的疾患が、パーキンソン病、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病のような神経変性疾患である、請求項４に記載の方法。
7. 前記神経上皮幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生産されたものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ｉＰＳＣが、線維芽細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生産されたものであり、該線維芽細胞又はＰＢＭＣが、好ましくは患者から取得されたものである、請求項７に記載の方法。
9. ゲル、バイオリアクターで、超低接着条件又はマイクロチップ、好ましくはヒドロゲル及び／又はMatrigel小滴のようなヒドロゲル小滴で、三次元細胞培養を実施する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. マトリックスが細胞外マトリックスであり、並びに／又はマトリックスが、天然分子、合成ポリマー、生物学的−合成ハイブリッド、金属、セラミック、生物活性ガラス及び／若しくはカーボンナノチューブの１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. マトリックスが、コラーゲン、好ましくはコラーゲンＩＶ、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン、Matrigel、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、絹フィブリル、ＰＥＧのようなエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）及び／又はポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）を含み、好ましくは、マトリックスが、コラーゲンＩＶ、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン又はMatrigelを含み、場合により、前記マトリックスが、幹細胞の生存、増殖及び／又は分化のための成長因子をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記分化培地（分化培地Ｉ）が、
    （ｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；
    （ｉｉ）少なくとも２つの異なるニューロトロフィン；及び
    （ｉｉｉ）抗酸化剤
    を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記分化培地（分化培地ＩＩ）が、
    （ｉ）少なくとも２つの異なるニューロトロフィン；及び
    （ｉｉ）抗酸化剤
    を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
14. ＳＨＨ経路活性化剤が、パルモルファミン、ＳＨＨ、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト（ＳＡＧ）、Ｈｈ−Ａｇ １．５及びＧｌｉ−２からなる群より選択され、好ましくは、ＳＨＨ経路活性化剤がパルモルファミンである、請求項１２に記載の方法。
15. 少なくとも２つのニューロトロフィンが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ及びＧＤＮＦからなる群より選択され、好ましくは、少なくとも２つのニューロトロフィンがＧＤＮＦ及びＢＤＮＦである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 抗酸化剤が、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ２、スーパーオキシドジスムターゼ３、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンＥ及び尿酸からなる群より選択され、好ましくは、抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）が、アクチビン／トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリング経路の活性化剤をさらに含み、及び／又は分化培地ＩＩがＳＨＨ経路活性化剤を含まない、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）がｃＡＭＰ類似体をさらに含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ８日間の分化後に、ＦＧＦ８を分化培地（分化培地Ｉ及び／又はＩＩ）に追加する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 神経上皮幹細胞を分化培地と接触させる前に、それらを維持培地と接触させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 維持培地が、
    （ｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；
    （ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；及び
    （ｉｉｉ）抗酸化剤
    を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 二次元細胞培養及び／又は三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を行う、請求項２１に記載の方法。
23. 神経上皮幹細胞がコロニー中に存在する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. コロニーが細胞クローンのクラスタである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記撹拌条件が、三次元細胞培養の振盪、スピニング、スターリング、移動及び／又は混合を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. スピニングバイオリアクターを用いてスピニングを実施し、及び／又はオービタルシェーカーを用いて振盪を実施する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記オービタルシェーカーを少なくとも４０rpm、５０rpm、６０rpm、７０rpm、８０rpm、９０rpm、１００rpm、１１０rpm又はそれ以上で振盪し、好ましくは、前記オービタルシェーカーを８０rpmで振盪する、請求項２６に記載の方法。
28. （ｉ）神経上皮幹細胞と、請求項２１で定義される維持培地とを接触させること；
    （ｉｉ）マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と、請求項１２、１４〜１９のいずれか一項で定義される分化培地（Ｉ）とを接触させることを含み、
    ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
    該撹拌が、分化培地Ｉ中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した０日後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後又はそれ以上後、好ましくは２日後に開始される；
    （ｉｉｉ）撹拌条件下で神経上皮幹細胞と、請求項１３〜２７のいずれか一項で定義される分化培地（ＩＩ）とを接触させること
    を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. １週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間又はそれ以上の分化後に、中脳オルガノイドが取得可能である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記中脳オルガノイドが初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 初期中脳オルガノイドが、１日間、２日間、３日間、４日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間又は２０日間分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、初期中脳オルガノイドが、６日間、７日間又は１６日間分化したものである、請求項３０に記載の方法。
32. 後期中脳オルガノイドが、少なくとも２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、５０日間、６０日間又はそれ以上分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、後期中脳オルガノイドが、３０日間又は４４日間分化したものである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記中脳オルガノイドが、
    （ａ）神経前駆細胞；
    （ｂ）幼若ニューロン；
    （ｃ）幼若ドーパミン作動性ニューロン；
    （ｄ）成熟ニューロン；
    （ｅ）成熟ドーパミン作動性ニューロン；
    （ｆ）中脳オルガノイドの非対称組織化；
    （ｇ）オリゴデンドロサイト；
    （ｈ）オリゴデンドロサイト前駆体；
    （ｉ）アストロサイト；及び／又は
    （ｊ）中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
    を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 初期中脳オルガノイドが、
    （ａ）神経前駆細胞；
    （ｂ）幼若ニューロン；及び／又は
    （ｃ）幼若ドーパミン作動性ニューロン
    を含む、請求項３０、３１又は３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 後期中脳オルガノイドが、
    （ａ）神経前駆細胞；
    （ｂ）幼若ニューロン；
    （ｃ）幼若ドーパミン作動性ニューロン；
    （ｄ）成熟ニューロン；
    （ｅ）成熟ドーパミン作動性ニューロン；
    （ｆ）中脳オルガノイドの非対称組織化；
    （ｇ）オリゴデンドロサイト；
    （ｈ）オリゴデンドロサイト前駆体；
    （ｉ）アストロサイト；
    （ｊ）中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化；及び／又は
    （ｋ）中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
    を含む、請求項３０、３２又は３３のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記神経前駆細胞がマーカーＳＯＸ２及び／若しくはネスチンの発現を特徴とし、
    前記幼若ニューロンがマーカーＴＵＪ１の発現を特徴とし、
    前記幼若ドーパミン作動性ニューロンがマーカーＴＵＪ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現を特徴とし、
    前記成熟ニューロンがマーカーＭＡＰ２の発現を特徴とし、
    前記成熟ドーパミン作動性ニューロンがマーカーＭＡＰ２及びＴＨの発現を特徴とし、
    前記オリゴデンドロサイトがマーカーＯ４の発現を特徴とし、
    前記オリゴデンドロサイト前駆体がマーカーＮＧ２の発現を特徴とし、並びに／又は
    前記アストロサイトがマーカーＧＦＡＰ及び／若しくはＳ１００ｂの発現を特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 中脳オルガノイドの非対称組織化が、ドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化及び／又は中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化である、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化が、
    （ａ）成熟ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの最外部にあり；及び／又は
    （ｂ）幼若ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの内部にある
    という局在性を特徴とする、請求項３７に記載の方法。
39. 幼若ドーパミン作動性ニューロンが、成熟すると中脳オルガノイドの最外部に向かって遊走する、請求項３７又は３８に記載の方法。
40. 中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称極性組織化が、神経前駆体が中脳オルガノイドの内部コア周辺の環状構造にあるという局在性を特徴とする、請求項３７に記載の方法。
41. 前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化が、中脳オルガノイドの特定領域における２個超、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のドーパミン作動性ニューロンの蓄積を特徴とする、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起が、０．１mm、０．２mm、０．３mm、０．４mm、０．５mm、０．６mm、０．７mm、０．８mm、０．９mm、１mm、１．１mm、１．２mm又はそれ以上の長さを有する、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、中脳オルガノイドユニット。
44. 細胞応答を誘発するその能力について目的の化合物を試験するための方法であって、
    （ａ）請求項４３に記載の中脳オルガノイドと前記目的の化合物とを接触させること；及び
    （ｂ）前記目的の化合物が細胞応答を誘発するかを決定すること
    を含む、方法。
45. 請求項４３で定義される中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロンの分化及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を促進又は阻害する分子を同定するための方法であって、該中脳オルガノイドと目的の分子とを接触させることを含み、
    コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を促進し、及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を阻害することを示し、コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の減少が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を阻害し、及び／又はドーパミン作動性ニューロンの死を誘導することを示す、方法。
46. 前記目的の化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は（共培養）細胞である、請求項４４又は４５に記載の方法。
47. 前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、請求項４４に記載の方法。
48. 神経突起伸長を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、請求項４５に記載の方法。
49. ＴＨの発現を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、請求項４５又は４８に記載の方法。
50. コントロールが、目的の分子と接触されていない中脳オルガノイドである、請求項４５、４８又は４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 請求項４３に記載の中脳オルガノイドユニットを含む、組成物。
52. 中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用。
53. ａ）場合により、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を取得／提供すること；
    ｂ）
    （ｉ）アクチビン／トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリング阻害剤；
    （ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
    （ｉｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリング阻害剤；及び
    （ｉｖ）ＳＨＨ経路活性化剤
    を含む培地中で、前記ｉＰＳＣを培養すること；並びに
    ｃ）
    （ｉ）アクチビン／ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤；
    （ｉｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
    （ｉｉｉ）ＢＭＰシグナリング阻害剤；及び
    （ｉｖ）ＳＨＨ経路活性化剤
    を含む培地中で、ｂ）において取得した細胞を培養すること；並びに
    ｄ）
    （ｉ）カノニカルＷＮＴシグナリング活性化剤；
    （ｉｉ）ＳＨＨ経路活性化剤；及び
    （ｉｉｉ）抗酸化剤
    を含む培地中で、ｃ）において取得した細胞をさらに培養すること
    を含み、それにより、神経上皮幹細胞を取得する方法によって、神経上皮幹細胞を取得する、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。