JP2018531011A6 - 中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、神経発達疾患及び神経変性疾患を研究するために有用な中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法を提供する。神経上皮幹細胞は、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で、それらと分化培地とを接触させることによって脳オルガノイドを作製するための開始集団として役立つ。
Description
[背景技術]
中脳又は中頭は、視覚、聴覚、運動コントロール、睡眠/起床、覚醒状態(覚醒)及び温度レギュレーションに関連する中枢神経系の一部である。胚発生中、中脳は、神経管の中頭としても公知の2番目のベシクルから生じる。他の2つのベシクル(前脳及び後脳)とは異なり、中脳は、その後の神経発生では未分割のままである。
中脳又は中頭は、視覚、聴覚、運動コントロール、睡眠/起床、覚醒状態(覚醒)及び温度レギュレーションに関連する中枢神経系の一部である。胚発生中、中脳は、神経管の中頭としても公知の2番目のベシクルから生じる。他の2つのベシクル(前脳及び後脳)とは異なり、中脳は、その後の神経発生では未分割のままである。
中脳はまた、神経伝達物質ドーパミン(DA)の大部分が産生される脳の領域である。ドーパミンは、とりわけ、ヒトから昆虫などの最も原始的な動物に至る種の動機付け及び習慣化において主要な役割を果たす。DAを産生するニューロンの領域は被蓋から生じ、黒質緻密部(SNc、A9グループ)及び腹側被蓋領域(VTA、A10グループ)と称される。特に、SNcの中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンは、複数の脳機能のコントロールにおいて重要な役割を果たす。それらの軸索は皮質の背側線条体に吻側的に上行し、そこで、神経伝達物質ドーパミンを放出する(Abeliovich and Hammond, 2007; Gale and Li, 2008)。黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする進行性神経変性障害であるパーキンソン病(PD)では、この領域のmDAニューロンが変性を選択的に受けるので、SNcは特に興味深い。mDAニューロンの喪失は、生理学的条件下における随意的な身体運動をコントロールする線条体におけるDAの欠如につながる(Abeliovich and Hammond, 2007)。PDでは、DAニューロンの変性及びそれに続く線条体におけるDAの欠如は、振戦、動作緩慢及び硬直を含む運動症候に関連する。複数の遺伝子の突然変異又は欠失がこの病状の素因であることが確認されている。
ドーパミン作動性系統へのニューロン分化は複雑なプロセスであり、特定の転写因子の逐次的活性化に大きく依拠する。哺乳動物では、mDA前駆細胞は、E7.5において発生し始める。LIMホメオボックス転写因子1α(LMX1A)及びフォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)(これらは両方とも、SHHシグナリングによって誘導される)は、mDA分化の重要な決定因子である。LMX1Aの発現はドーパミン作動性分化をトリガーし、神経発生のネガティブレギュレーターの阻害因子であるMSX1/2をリクルートする。さらに、それは、mDAニューロンの適切な発生に必要な神経促進因子、例えばニューロゲニン2(NGN2)の発現を誘導する(Gale and Li, 2008)。成熟すると、E10.5〜E11.5において、mDA前駆体は遊走して増殖領域を出る。この段階において、mDAニューロン(mDA neuons)の表現型マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)(ドーパミン合成の律速酵素)が誘導され、mDA前駆細胞は、初期ニューロンマーカーであるβIIIチューブリン(TUJ1)を発現し始める(Abeliovich and Hammond, 2007)。
CNSの発生及び特異化の基礎研究の多くは、マウス胚及びニワトリ胚において行われている。機構の多くは、哺乳動物間で保存されている可能性があるが、マウス及びヒトの神経発生間には大きな違いがある。例えば、ヒトでは、皮質のサイズが著しく増加する。外側脳室下帯又は内側線維層などのいくつかの領域は、マウスでは全く存在しないが、ヒトでは存在する。特に、齧歯類は生来、PD及びアルツハイマー病(AD)などの神経変性障害にかからない。神経発生の違いに加えて、明白であるが顕著な別の違いは会話能力である。
パーキンソン病は、黒質緻密部中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする。重度の細胞死に至る根本的な機構はほとんど理解されていない。特に、動物が罹患しない複雑な病状、例えば神経変性障害の場合には、マウスモデルは、in vivoで見られる表現型を再現し得ないことが多い。この理由により、ヒトと、in vivoモデル系として最も頻繁に使用されるマウスとの間の違い、及び2D細胞培養の欠点を考慮すると、特に神経発達疾患及び神経変性疾患の研究の観点から、ヒト脳発生のロバストなin vitroモデルに対する明白な必要性が存在する。
本出願の根底にある技術的問題は、この必要性に応じることである。前記技術的問題の解決策は、特許請求の範囲に反映されており、本明細書に記載されており、図面に示されており、本出願の実施例に例示されている中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法の提供である。
驚くべきことに、本発明者らは、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で神経上皮幹細胞を培養した場合、前記神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることによって、中脳オルガノイドを取得することができたことを観察した。具体的には、本発明者らは、ヒト神経上皮幹細胞(hNESC)と称されるヒト神経前駆細胞株を使用し、これが、中脳オルガノイドの作製のための開始集団として機能した。三次元細胞培養を可能にするマトリックスに単一コロニーを包埋した(前記マトリックスは、例えば、Matrigelの小滴である)。Matrigel小滴は、例えば、Lancaster and Knoblich (2014a)に記載されている。連続スピニングなどの撹拌条件下で、単一コロニーを培養した。分化に使用した培地は、とりわけ、本明細書に記載される中脳発生の誘導のためのシグナリング分子を含有していた。いくつかの時点において、中脳特異的構造への分化が実際に検出可能であるかを決定するために、免疫組織化学的染色を使用して、中脳オルガノイドを特性評価した。約3週間の分化後、中脳オルガノイドは、ドーパミン作動性ニューロン及び非対称組織化を含むいくつかの神経細胞型を発達させたが、これは、in vivoにおける脳発生と一致する。このような中脳オルガノイドは、例えば、神経発達疾患及び/又は神経変性疾患、例えばパーキンソン病(PD)、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病を研究するために使用され得る3Dモデルとして機能し得る。
研究中、本発明者らは、低接着表面を有する丸底プレート上に播種したNESCが球状コロニーを形成し、これが急速に拡大したことを観察した(図4)。しかしながら、栄養素交換が限られていたので、これは、コロニーの中心における細胞死の増加を伴った。6日目〜10日目の初期オルガノイドの切片化により、コア中の細胞の大部分が死滅していたことが明らかになった。しかしながら、驚くべきことに、3D構造を撹拌条件下に置いた場合、細胞死は有意に減少した。
三次元細胞培養を可能にするマトリックス(例えば、MATRIGEL)に包埋して撹拌条件下に置いたNESCはさらに成長し、長い突起を急速に発達させ始め、これがECM全体を通して遊走した(図4d〜f)。これらの突起はニューロンマーカーTUJ1を発現し、MAP2を部分的に発現した(これらは、軸索形成の指標である)(図6及び図7)。神経新生の際、幼若ニューロンは、前端突起及び後端突起を有する双極形態を採り、胚期11〜18日目において、これが最終的には軸索になる(Lewis et al., 2013)。細胞体は、コアに隣接して主に位置していた。維持条件下では、hNESCは、神経前駆体マーカーSOX1、SOX2及びネスチンを安定発現する(図3)。超低接着プレート上に播種した初期中脳オルガノイドでは、この発現パターンが保持される(図5)。24日間の分化後において、いくつかのSOX2陽性細胞はオルガノイドの内部にとどまっており、TH陽性DAニューロンに隣接していた(図7)。in vivoにおける中脳発生の経過中、中脳領域の神経上皮が肥厚して層状になる。いくつかの神経幹細胞は内層にとどまり、それらの増殖特性を保持するが、他の細胞は中間帯に遊走し、mDAニューロンに分化し始める。未成熟ニューロンは遊走し続けて、それらが成熟ニューロンになる辺縁帯に到達する。mDAニューロン前駆体は、LMX1、FOXA2、TH及びニューロンマーカーTUJ1を発現する(Ang, 2009; Gale and Li, 2008)。in vitroでは、中脳オルガノイドは類似の層構造を発達させるようであり、神経幹細胞は内部コアに依然として隣接しており、mDAニューロンは基底部に遊走する。分化条件下では、6日後に、DAニューロンが発達し始めた。興味深いことに、DAニューロン及び神経前駆体が特定領域に蓄積し、30日目及び44日目において組織全体に均等に分布していなかったが、これは、D−V軸に沿った中脳オルガノイドの自己パターン形成を示唆している(図6及び図7)。しかしながら、全てのTH陽性細胞が必ずしもDAニューロンではない。ドーパミン、ノルアドレナリン及びアドレナリンを含む全てのカテコールアミンは、チロシンから合成される。THは、チロシンからL−DOPAを生成する律速酵素である(Sharples et al., 2014)。TH+細胞が実際にDAニューロンであることを確認するために、DATなどのさらなるマーカーを検討すべきである。重要なことに、in vivoにおける脳発生と同様に、中脳オルガノイドは、非対称極性構造を発達させた。この目的のために、本発明者らは、中脳オルガノイドを作製するための開始集団として神経上皮幹細胞を使用して、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養でそれらと分化培地とを接触させることによって、中脳オルガノイドを作製することに成功した。
したがって、一態様では、本発明は、中脳オルガノイドを作製する方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する方法を提供する。
別の態様では、本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な中脳オルガノイドを提供し、また別の態様では、前記中脳オルガノイドに対する細胞応答を誘発する能力について化合物を試験するための、本発明の中脳オルガノイドの使用及び適用方法を提供する。
さらに、さらなる態様では、本発明は、移植において使用するための、本明細書に記載される中脳オルガノイドを提供する。
本明細書に記載される中脳オルガノイドの作製のために神経上皮幹細胞を成功裏に使用し得ることを認識したので、またさらなる態様では、本発明はまた、中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用を提供する。
本発明の上記態様及びそれらの好ましい態様はまた、以下の項目に要約され得る:
(1)中脳オルガノイドを作製するための方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞(のみ)と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する、方法。
(2)前記神経上皮幹細胞がヒト神経上皮幹細胞であり、好ましくは、前記神経上皮細胞がSOX1、SOX2、PAX6及びネスチンを発現する、項目1に記載の方法。
(3)前記神経上皮幹細胞がhNESC−K7又はsmNPCである、項目2に記載の方法。
(4)前記神経上皮幹細胞が、遺伝子改変されたものであるか、又は神経学的疾患を患っている患者から取得されたものである、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(5)遺伝子改変が突然変異、ノックアウト又はノックインを含む、項目4に記載の方法。
(6)神経学的疾患が、パーキンソン病、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病のような神経変性疾患である、項目4に記載の方法。
(7)前記神経上皮幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)から生産されたものである、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(8)iPSCが、線維芽細胞又は末梢血単核細胞(PBMC)から生産されたものであり、該線維芽細胞又はPBMCが、好ましくは患者から取得されたものである、項目7に記載の方法。
(9)ゲル、バイオリアクターで、超低接着条件又はマイクロチップ、好ましくはヒドロゲル及び/又はMatrigel小滴のようなヒドロゲル小滴で、三次元細胞培養を実施する、項目1〜8のいずれかに記載の方法。
(10)マトリックスが細胞外マトリックスであり、並びに/又はマトリックスが、天然分子、合成ポリマー、生物学的合成ハイブリッド、金属、セラミック、生物活性ガラス及び/若しくはカーボンナノチューブの1つ以上を含む、項目1〜9のいずれかに記載の方法。
(11)マトリックスが、コラーゲン、Matrigel、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、絹フィブリル、PEGのようなエチレングリコール、ポリ(ビニルアルコール)及び/又はポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリラート)を含み、好ましくは、マトリックスがMatrigelを含む、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
(12)前記分化培地(分化培地I)が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(13)前記分化培地(分化培地II)が、
(i)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(ii)抗酸化剤
を含む、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
(14)SHH経路活性化剤が、パルモルファミン、SHH、smoothenedアゴニスト(SAG)、Hh−Ag 1.5及びGli−2からなる群より選択され、好ましくは、SHH経路活性化剤がパルモルファミンである、項目12に記載の方法。
(15)少なくとも2つのニューロトロフィンが、NGF、BDNF、NT−3、NT−4、CNTF及びGDNFからなる群より選択され、好ましくは、少なくとも2つのニューロトロフィンがGDNF及びBDNFである、項目12〜14のいずれかに記載の方法。
(16)抗酸化剤が、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ1、スーパーオキシドジスムターゼ2、スーパーオキシドジスムターゼ3、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンE及び尿酸からなる群より選択され、好ましくは、抗酸化剤がアスコルビン酸である、項目12〜15のいずれかに記載の方法。
(17)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング経路の活性化剤をさらに含み、及び/又は分化培地IIがSHH経路活性化剤を含まない、項目12〜16のいずれかに記載の方法。
(18)アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤が、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB及びnodalからなる群より選択され、好ましくは、アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤がTGFβ3である、項目17に記載の方法。
(19)分化培地(分化培地I及び/又はII)がcAMP類似体をさらに含む、項目12〜18のいずれかに記載の方法。
(20)cAMP類似体が、フォルスコリン、8−(4−クロロ−フェニルチオ)−2′−O−メチルアデノシン−3′,5′−サイクリックモノホスファート(8CPT−2Me−cAMP)、8−クロロ−cAMP(8−Cl−cAMP)、ブクラデシン、Rp−アデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Rp−cAMPS)、Sp−8−ヒドロキシアデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Sp−8OH−cAMPS)及びRp8−ヒドロキシアデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Rp−8OH−cAMPS)及びdbcAMPからなる群より選択され、好ましくは、cAMP類似体がdbcAMPである、項目19に記載の方法。
(21)分化培地(分化培地I及び/又はII)がN2B27培地である、項目12〜20のいずれかに記載の方法。
(22)N2B27培地が、等量のNeurobasal培地及びDMEM/F12培地を含む、項目21に記載の方法。
(23)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、ペニシリン及びストレプトマイシンをさらに含む、項目12〜22のいずれかに記載の方法。
(24)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、グルタミン、好ましくはL−グルタミン、より好ましくは2mMの濃度のL−グルタミンをさらに含む、項目12〜23のいずれかに記載の方法。
(25)分化培地が、好ましくは1:100(サプリメント:培地)の濃度で、ビタミンAを含まないB27サプリメントをさらに含む、項目12〜24のいずれかに記載の方法。
(26)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、好ましくは1:200(サプリメント:培地)の濃度で、N2サプリメントをさらに含む、項目12〜25のいずれかに記載の方法。
(27)分化培地(分化培地I及び/又は分化培地II)がFGF8を含まない、項目12〜26のいずれかに記載の方法。
(28)細胞を分化培地I中に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地I中に6日間置き、及び/又は細胞を分化培地II中に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、15日間、20日間、24日間、38日間、40日間、50日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地II中に1日間、24日間若しくは38日間置く、項目12〜27のいずれかに記載の方法。
(29)6日間の分化後に、分化培地からSHH経路活性化剤を除外することによって、分化培地Iを分化培地IIと交換する、項目28に記載の方法。
(30)
8日間の分化後に、FGF8を分化培地(分化培地I及び/又はII)に追加する、項目29に記載の方法。
(31)神経上皮幹細胞を分化培地と接触させる前に、それらを維持培地と接触させる、項目1〜30のいずれかに記載の方法。
(32)維持培地が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、項目31に記載の方法。
(33)維持培地が、項目21〜27のいずれか一項で定義されるN2B27培地を含む、項目31又は32に記載の方法。
(34)カノニカルWNTシグナリング活性化剤が、Norrin、R−スポンジン2又はWNTタンパク質からなる群より選択される、項目32又は33に記載の方法。
(35)カノニカルWNTシグナリング活性化剤が、例えばsiRNAを介してアキシン又はAPCを遮断する、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
(36)カノニカルWNTシグナリング活性化剤がGSK−3阻害剤である、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
(37)GSK−3阻害剤が、CHIR 99021、SB−216763、6−ブロモインジルビン−3’−オキシム、タイドグルーシブ、GSK−3阻害剤1、AZD1080、TDZD−8、TWS119、CHIR−99021 HCl、CHIR−98014、SB 415286、SB 216763、LY2090314、AR−A014418及びIM−12からなる群より選択され、好ましくは、GSK−3阻害剤がCHIR 99021である、項目36に記載の方法。
(38)二次元細胞培養及び/又は三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を行う、項目31〜37に記載の方法。
(39)三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間又はそれ以上実施し、好ましくは、三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を2日間実施する、項目38に記載の方法。
(40)神経上皮幹細胞がコロニー中に存在する、項目1〜39のいずれかに記載の方法。
(41)コロニーが細胞クローンのクラスタである、項目40に記載の方法。
(42)神経上皮幹細胞の前記コロニーが、項目31〜39のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間又はそれ以上培養することによって取得可能であり、好ましくは、項目31〜39のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を10日間培養することによって取得可能である、項目40又は41に記載の方法。
(43)少なくとも50個、500個、1000個、2000個、3000個、4000個、5000個、6000個、7000個、8000個、9000個、10000個、11000個、12000個、13000個、14000個、15000個、16000個又はそれ以上の神経上皮幹細胞、好ましくは約9000個の神経上皮幹細胞を開始細胞集団として使用する、項目42に記載の方法。
(44)神経上皮幹細胞のコロニーが、丸底超低接着96ウェルプレート及び/又は超低接着24ウェルプレート及び/又は三次元細胞培養で神経上皮細胞を培養することによって取得可能である、項目40〜43のいずれかに記載の方法。
(45)Matrigel小滴で神経上皮幹細胞のコロニーを少なくとも1日間培養する、項目40〜44のいずれかに記載の方法。
(46)分化開始の少なくとも1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後又はそれ以上後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養し、好ましくは、分化開始の2日後又は4日後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養する、項目9〜45のいずれかに記載の方法。
(47)前記撹拌条件が、三次元細胞培養の振盪、スピニング、スターリング、移動及び/又は混合を含む、項目1〜46のいずれかに記載の方法。
(48)スピニングバイオリアクターを用いてスピニングを実施し、及び/又はオービタルシェーカーを用いて振盪を実施する、項目47に記載の方法。
(49)前記オービタルシェーカーを少なくとも40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm又はそれ以上で振盪し、好ましくは、前記オービタルシェーカーを80rpmで振盪する、項目47又は48に記載の方法。
(50)(i)神経上皮幹細胞と、項目32〜39のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と、項目12、14〜30のいずれか一項で定義される分化培地(I)とを接触させること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは2日後又は4日後に開始される;
(iii)撹拌条件下で神経上皮幹細胞と、項目13〜30のいずれか一項で定義される分化培地(II)とを接触させること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
(51)(i)神経上皮幹細胞と、項目32〜39のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)維持培地中で該神経上皮幹細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養すること;
(iii)神経上皮幹細胞と、項目12、14〜30のいずれか一項で定義される分化培地(I)とを接触させること;
(iv)分化培地I中で工程(iii)の細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは2日後に開始される;
(v)工程(iv)において取得した細胞と、項目13〜30のいずれか一項で定義される分化培地IIとを接触させること;並びに
(vi)撹拌条件下、分化培地II中で工程(v)の細胞を1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目1〜50のいずれかに記載の方法。
(52)工程(ii)における神経上皮幹細胞の培養を9日間又は10日間実施する、項目51に記載の方法。
(53)工程(iv)の細胞の培養を6日間実施する、項目51又は52に記載の方法。
(54)工程(iv)の細胞の培養を1日間、24日間又は38日間実施する、項目51〜53のいずれかに記載の方法。
(55)1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間又はそれ以上の分化後に、中脳オルガノイドが取得可能であり、好ましくは、分化を6日間、7日間、16日間、30日間又は44日間実施する、項目1〜54のいずれかに記載の方法。
(56)前記中脳オルガノイドが初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドである、項目1〜55のいずれかに記載の方法。
(57)初期中脳オルガノイドが、1日間、2日間、3日間、4日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間又は20日間分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、初期中脳オルガノイドが、6日間、7日間又は16日間分化したものである、項目56に記載の方法。
(58)後期中脳オルガノイドが、少なくとも25日間、30日間、35日間、40日間、50日間、60日間又はそれ以上分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、後期中脳オルガノイドが、30日間、44日間又は51日間分化したものである、項目56に記載の方法。
(59)前記中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)オリゴデンドロサイト;
(h)オリゴデンドロサイト前駆体;
(i)アストロサイト;及び/又は
(j)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目1〜58のいずれかに記載の方法。
(60)初期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;及び/又は
(c)Ki67−陽性細胞 及び/又は
(d)幼若ドーパミン作動性ニューロン
を含む、項目56、57又は59のいずれかに記載の方法。
(61)後期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)好ましくはドーパミンを含むか若しくは産生する成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)好ましくはO4及び/若しくはCNPaseを発現するオリゴデンドロサイト;
(h)好ましくはNG2を発現するオリゴデンドロサイト前駆体;
(i)好ましくはS100b及び/若しくはGFAPを発現するアストロサイト;
(j)オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化;及び/又は
(k)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目56、58又は59のいずれかに記載の方法。
(62)前記神経前駆細胞がマーカーSOX2及び/若しくはネスチンの発現を特徴とする、項目59〜61のいずれかに記載の方法。
(63)
前記幼若ニューロンがマーカーTUJ1の発現を特徴とする、項目59〜62のいずれかに記載の方法。
(64)
前記幼若ドーパミン作動性ニューロンがマーカーTUJ1及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の発現を特徴とする、項目59〜63のいずれかに記載の方法。
(65)
前記成熟ニューロンがマーカーMAP2の発現を特徴とする、項目59〜64のいずれかに記載の方法。
(66)
前記成熟ドーパミン作動性ニューロンがマーカーMAP2、TH、FOXA2の発現及び/若しくはマーカーLMX1Aの発現を特徴とし、並びに/又は前記成熟ドーパミン作動性ニューロンが、LMX1A、LMX1B、EN1、NURR1、AADC及び/若しくはTHをコードするmRNAの発現を特徴とする、項目59〜65のいずれかに記載の方法。
(67)中脳オルガノイドの非対称組織化が、ドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化及び/又は中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化である、項目59〜66のいずれかに記載の方法。
(68)前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化が、
(a)成熟ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの最外部にあり;
(b)幼若ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの内部にある
という局在性を特徴とする、項目59〜67のいずれかに記載の方法。
(69)幼若ドーパミン作動性ニューロンが、成熟すると中脳オルガノイドの最外部に向かって遊走する、項目68に記載の方法。
(70)中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化が、神経前駆体が中脳オルガノイドの内部コア周辺の環状構造にあるという局在性を特徴とする、項目59〜69のいずれかに記載の方法。
(71)前記オリゴデンドロサイトがマーカーO4の発現及び/又はマーカーCNPaseの発現を特徴とする、項目59〜70のいずれかに記載の方法。
(72)前記オリゴデンドロサイト前駆体がマーカーNG2の発現を特徴とする、項目59〜71のいずれかに記載の方法。
(73)前記アストロサイトがマーカーGFAP及び/又はS100bの発現を特徴とする、項目59〜72のいずれかに記載の方法。
(74)前記オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化が、中脳オルガノイドの特定領域における2個超、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又はそれ以上のドーパミン作動性ニューロンの蓄積を特徴とする、項目59〜73のいずれかに記載の方法。
(75)前記中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起が、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm又はそれ以上の長さを有する、項目59〜74のいずれかに記載の方法。
(76)神経上皮幹細胞が、
a)場合により、人工多能性幹細胞(iPSC)を取得/提供すること;
b)
(i)アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)骨形成タンパク質(BMP)シグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、前記iPSCを培養すること;並びに
c)
(i)アクチビン/TGF−βシグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)BMPシグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、b)において取得した細胞を培養すること;並びに
d)
(i)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(ii)SHH経路活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む培地中で、c)において取得した細胞をさらに培養すること
を含み、それにより、神経上皮幹細胞を取得する方法によって取得可能である、項目1〜75のいずれかに記載の方法。
(77)e)
(i)FGFシグナリング活性化剤;
(ii)EGFシグナリング活性化剤;及び
(iii)LIFシグナリング活性化
を含む培地中で、d)において取得した細胞を維持することをさらに含む、項目76に記載の方法。
(78)項目1〜77のいずれかに記載の方法によって取得可能な、中脳オルガノイド。
(79)前記中脳オルガノイドに対する細胞応答を誘発するそれらの能力について化合物を試験するための、項目78に記載の中脳オルガノイドの使用。
(80)前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は(共培養)細胞である、項目79に記載の使用。
(81)前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目79又は80に記載の使用。
(82)前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目81に記載の使用。
(83)細胞応答を誘発するその能力について目的の化合物を試験するための方法であって、
(a)項目78に記載の中脳オルガノイドと前記目的の化合物とを接触させること;及び
(b)前記目的の化合物が細胞応答を誘発するかを決定すること
を含む、方法。
(84)前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は(共培養)細胞である、項目83に記載の方法。
(85)前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目83又は84に記載の方法。
(86)前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目85に記載の方法。
(87)項目78で定義される中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロンの分化及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を促進又は阻害する分子を同定するための方法であって、該中脳オルガノイドと目的の分子とを接触させることを含み、
コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を促進し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を阻害することを示し、コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の減少が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を阻害し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を誘導することを示す、方法。
(88)神経突起伸長を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目87に記載の方法。
(89)THの発現を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目87又は88に記載の方法。
(90)コントロールが、目的の分子と接触されていない中脳オルガノイドである、項目87〜89のいずれかに記載の方法。
(91)項目78に記載の中脳オルガノイドユニットを含む、組成物。
(92)医薬組成物である、項目91に記載の組成物。
(93)中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用。
(94)移植において使用するための、項目78に記載の中脳オルガノイド。
(1)中脳オルガノイドを作製するための方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞(のみ)と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する、方法。
(2)前記神経上皮幹細胞がヒト神経上皮幹細胞であり、好ましくは、前記神経上皮細胞がSOX1、SOX2、PAX6及びネスチンを発現する、項目1に記載の方法。
(3)前記神経上皮幹細胞がhNESC−K7又はsmNPCである、項目2に記載の方法。
(4)前記神経上皮幹細胞が、遺伝子改変されたものであるか、又は神経学的疾患を患っている患者から取得されたものである、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(5)遺伝子改変が突然変異、ノックアウト又はノックインを含む、項目4に記載の方法。
(6)神経学的疾患が、パーキンソン病、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病のような神経変性疾患である、項目4に記載の方法。
(7)前記神経上皮幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)から生産されたものである、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(8)iPSCが、線維芽細胞又は末梢血単核細胞(PBMC)から生産されたものであり、該線維芽細胞又はPBMCが、好ましくは患者から取得されたものである、項目7に記載の方法。
(9)ゲル、バイオリアクターで、超低接着条件又はマイクロチップ、好ましくはヒドロゲル及び/又はMatrigel小滴のようなヒドロゲル小滴で、三次元細胞培養を実施する、項目1〜8のいずれかに記載の方法。
(10)マトリックスが細胞外マトリックスであり、並びに/又はマトリックスが、天然分子、合成ポリマー、生物学的合成ハイブリッド、金属、セラミック、生物活性ガラス及び/若しくはカーボンナノチューブの1つ以上を含む、項目1〜9のいずれかに記載の方法。
(11)マトリックスが、コラーゲン、Matrigel、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、絹フィブリル、PEGのようなエチレングリコール、ポリ(ビニルアルコール)及び/又はポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリラート)を含み、好ましくは、マトリックスがMatrigelを含む、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
(12)前記分化培地(分化培地I)が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(13)前記分化培地(分化培地II)が、
(i)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(ii)抗酸化剤
を含む、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
(14)SHH経路活性化剤が、パルモルファミン、SHH、smoothenedアゴニスト(SAG)、Hh−Ag 1.5及びGli−2からなる群より選択され、好ましくは、SHH経路活性化剤がパルモルファミンである、項目12に記載の方法。
(15)少なくとも2つのニューロトロフィンが、NGF、BDNF、NT−3、NT−4、CNTF及びGDNFからなる群より選択され、好ましくは、少なくとも2つのニューロトロフィンがGDNF及びBDNFである、項目12〜14のいずれかに記載の方法。
(16)抗酸化剤が、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ1、スーパーオキシドジスムターゼ2、スーパーオキシドジスムターゼ3、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンE及び尿酸からなる群より選択され、好ましくは、抗酸化剤がアスコルビン酸である、項目12〜15のいずれかに記載の方法。
(17)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング経路の活性化剤をさらに含み、及び/又は分化培地IIがSHH経路活性化剤を含まない、項目12〜16のいずれかに記載の方法。
(18)アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤が、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB及びnodalからなる群より選択され、好ましくは、アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤がTGFβ3である、項目17に記載の方法。
(19)分化培地(分化培地I及び/又はII)がcAMP類似体をさらに含む、項目12〜18のいずれかに記載の方法。
(20)cAMP類似体が、フォルスコリン、8−(4−クロロ−フェニルチオ)−2′−O−メチルアデノシン−3′,5′−サイクリックモノホスファート(8CPT−2Me−cAMP)、8−クロロ−cAMP(8−Cl−cAMP)、ブクラデシン、Rp−アデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Rp−cAMPS)、Sp−8−ヒドロキシアデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Sp−8OH−cAMPS)及びRp8−ヒドロキシアデノシン、3’,5’,−サイクリックモノホスホロチオアートナトリウム塩(Rp−8OH−cAMPS)及びdbcAMPからなる群より選択され、好ましくは、cAMP類似体がdbcAMPである、項目19に記載の方法。
(21)分化培地(分化培地I及び/又はII)がN2B27培地である、項目12〜20のいずれかに記載の方法。
(22)N2B27培地が、等量のNeurobasal培地及びDMEM/F12培地を含む、項目21に記載の方法。
(23)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、ペニシリン及びストレプトマイシンをさらに含む、項目12〜22のいずれかに記載の方法。
(24)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、グルタミン、好ましくはL−グルタミン、より好ましくは2mMの濃度のL−グルタミンをさらに含む、項目12〜23のいずれかに記載の方法。
(25)分化培地が、好ましくは1:100(サプリメント:培地)の濃度で、ビタミンAを含まないB27サプリメントをさらに含む、項目12〜24のいずれかに記載の方法。
(26)分化培地(分化培地I及び/又はII)が、好ましくは1:200(サプリメント:培地)の濃度で、N2サプリメントをさらに含む、項目12〜25のいずれかに記載の方法。
(27)分化培地(分化培地I及び/又は分化培地II)がFGF8を含まない、項目12〜26のいずれかに記載の方法。
(28)細胞を分化培地I中に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地I中に6日間置き、及び/又は細胞を分化培地II中に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、15日間、20日間、24日間、38日間、40日間、50日間若しくはそれ以上置き、好ましくは、細胞を分化培地II中に1日間、24日間若しくは38日間置く、項目12〜27のいずれかに記載の方法。
(29)6日間の分化後に、分化培地からSHH経路活性化剤を除外することによって、分化培地Iを分化培地IIと交換する、項目28に記載の方法。
(30)
8日間の分化後に、FGF8を分化培地(分化培地I及び/又はII)に追加する、項目29に記載の方法。
(31)神経上皮幹細胞を分化培地と接触させる前に、それらを維持培地と接触させる、項目1〜30のいずれかに記載の方法。
(32)維持培地が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、項目31に記載の方法。
(33)維持培地が、項目21〜27のいずれか一項で定義されるN2B27培地を含む、項目31又は32に記載の方法。
(34)カノニカルWNTシグナリング活性化剤が、Norrin、R−スポンジン2又はWNTタンパク質からなる群より選択される、項目32又は33に記載の方法。
(35)カノニカルWNTシグナリング活性化剤が、例えばsiRNAを介してアキシン又はAPCを遮断する、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
(36)カノニカルWNTシグナリング活性化剤がGSK−3阻害剤である、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
(37)GSK−3阻害剤が、CHIR 99021、SB−216763、6−ブロモインジルビン−3’−オキシム、タイドグルーシブ、GSK−3阻害剤1、AZD1080、TDZD−8、TWS119、CHIR−99021 HCl、CHIR−98014、SB 415286、SB 216763、LY2090314、AR−A014418及びIM−12からなる群より選択され、好ましくは、GSK−3阻害剤がCHIR 99021である、項目36に記載の方法。
(38)二次元細胞培養及び/又は三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を行う、項目31〜37に記載の方法。
(39)三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間又はそれ以上実施し、好ましくは、三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を2日間実施する、項目38に記載の方法。
(40)神経上皮幹細胞がコロニー中に存在する、項目1〜39のいずれかに記載の方法。
(41)コロニーが細胞クローンのクラスタである、項目40に記載の方法。
(42)神経上皮幹細胞の前記コロニーが、項目31〜39のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間又はそれ以上培養することによって取得可能であり、好ましくは、項目31〜39のいずれか一項で定義される維持培地中で前記神経上皮幹細胞を10日間培養することによって取得可能である、項目40又は41に記載の方法。
(43)少なくとも50個、500個、1000個、2000個、3000個、4000個、5000個、6000個、7000個、8000個、9000個、10000個、11000個、12000個、13000個、14000個、15000個、16000個又はそれ以上の神経上皮幹細胞、好ましくは約9000個の神経上皮幹細胞を開始細胞集団として使用する、項目42に記載の方法。
(44)神経上皮幹細胞のコロニーが、丸底超低接着96ウェルプレート及び/又は超低接着24ウェルプレート及び/又は三次元細胞培養で神経上皮細胞を培養することによって取得可能である、項目40〜43のいずれかに記載の方法。
(45)Matrigel小滴で神経上皮幹細胞のコロニーを少なくとも1日間培養する、項目40〜44のいずれかに記載の方法。
(46)分化開始の少なくとも1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後又はそれ以上後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養し、好ましくは、分化開始の2日後又は4日後に、撹拌条件下で前記Matrigel小滴を培養する、項目9〜45のいずれかに記載の方法。
(47)前記撹拌条件が、三次元細胞培養の振盪、スピニング、スターリング、移動及び/又は混合を含む、項目1〜46のいずれかに記載の方法。
(48)スピニングバイオリアクターを用いてスピニングを実施し、及び/又はオービタルシェーカーを用いて振盪を実施する、項目47に記載の方法。
(49)前記オービタルシェーカーを少なくとも40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm又はそれ以上で振盪し、好ましくは、前記オービタルシェーカーを80rpmで振盪する、項目47又は48に記載の方法。
(50)(i)神経上皮幹細胞と、項目32〜39のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と、項目12、14〜30のいずれか一項で定義される分化培地(I)とを接触させること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは2日後又は4日後に開始される;
(iii)撹拌条件下で神経上皮幹細胞と、項目13〜30のいずれか一項で定義される分化培地(II)とを接触させること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目1〜49のいずれかに記載の方法。
(51)(i)神経上皮幹細胞と、項目32〜39のいずれか一項で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)維持培地中で該神経上皮幹細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養すること;
(iii)神経上皮幹細胞と、項目12、14〜30のいずれか一項で定義される分化培地(I)とを接触させること;
(iv)分化培地I中で工程(iii)の細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは2日後に開始される;
(v)工程(iv)において取得した細胞と、項目13〜30のいずれか一項で定義される分化培地IIとを接触させること;並びに
(vi)撹拌条件下、分化培地II中で工程(v)の細胞を1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、項目1〜50のいずれかに記載の方法。
(52)工程(ii)における神経上皮幹細胞の培養を9日間又は10日間実施する、項目51に記載の方法。
(53)工程(iv)の細胞の培養を6日間実施する、項目51又は52に記載の方法。
(54)工程(iv)の細胞の培養を1日間、24日間又は38日間実施する、項目51〜53のいずれかに記載の方法。
(55)1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間又はそれ以上の分化後に、中脳オルガノイドが取得可能であり、好ましくは、分化を6日間、7日間、16日間、30日間又は44日間実施する、項目1〜54のいずれかに記載の方法。
(56)前記中脳オルガノイドが初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドである、項目1〜55のいずれかに記載の方法。
(57)初期中脳オルガノイドが、1日間、2日間、3日間、4日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間又は20日間分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、初期中脳オルガノイドが、6日間、7日間又は16日間分化したものである、項目56に記載の方法。
(58)後期中脳オルガノイドが、少なくとも25日間、30日間、35日間、40日間、50日間、60日間又はそれ以上分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、後期中脳オルガノイドが、30日間、44日間又は51日間分化したものである、項目56に記載の方法。
(59)前記中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)オリゴデンドロサイト;
(h)オリゴデンドロサイト前駆体;
(i)アストロサイト;及び/又は
(j)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目1〜58のいずれかに記載の方法。
(60)初期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;及び/又は
(c)Ki67−陽性細胞 及び/又は
(d)幼若ドーパミン作動性ニューロン
を含む、項目56、57又は59のいずれかに記載の方法。
(61)後期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)好ましくはドーパミンを含むか若しくは産生する成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)好ましくはO4及び/若しくはCNPaseを発現するオリゴデンドロサイト;
(h)好ましくはNG2を発現するオリゴデンドロサイト前駆体;
(i)好ましくはS100b及び/若しくはGFAPを発現するアストロサイト;
(j)オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化;及び/又は
(k)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、項目56、58又は59のいずれかに記載の方法。
(62)前記神経前駆細胞がマーカーSOX2及び/若しくはネスチンの発現を特徴とする、項目59〜61のいずれかに記載の方法。
(63)
前記幼若ニューロンがマーカーTUJ1の発現を特徴とする、項目59〜62のいずれかに記載の方法。
(64)
前記幼若ドーパミン作動性ニューロンがマーカーTUJ1及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の発現を特徴とする、項目59〜63のいずれかに記載の方法。
(65)
前記成熟ニューロンがマーカーMAP2の発現を特徴とする、項目59〜64のいずれかに記載の方法。
(66)
前記成熟ドーパミン作動性ニューロンがマーカーMAP2、TH、FOXA2の発現及び/若しくはマーカーLMX1Aの発現を特徴とし、並びに/又は前記成熟ドーパミン作動性ニューロンが、LMX1A、LMX1B、EN1、NURR1、AADC及び/若しくはTHをコードするmRNAの発現を特徴とする、項目59〜65のいずれかに記載の方法。
(67)中脳オルガノイドの非対称組織化が、ドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化及び/又は中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化である、項目59〜66のいずれかに記載の方法。
(68)前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化が、
(a)成熟ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの最外部にあり;
(b)幼若ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの内部にある
という局在性を特徴とする、項目59〜67のいずれかに記載の方法。
(69)幼若ドーパミン作動性ニューロンが、成熟すると中脳オルガノイドの最外部に向かって遊走する、項目68に記載の方法。
(70)中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化が、神経前駆体が中脳オルガノイドの内部コア周辺の環状構造にあるという局在性を特徴とする、項目59〜69のいずれかに記載の方法。
(71)前記オリゴデンドロサイトがマーカーO4の発現及び/又はマーカーCNPaseの発現を特徴とする、項目59〜70のいずれかに記載の方法。
(72)前記オリゴデンドロサイト前駆体がマーカーNG2の発現を特徴とする、項目59〜71のいずれかに記載の方法。
(73)前記アストロサイトがマーカーGFAP及び/又はS100bの発現を特徴とする、項目59〜72のいずれかに記載の方法。
(74)前記オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化が、中脳オルガノイドの特定領域における2個超、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又はそれ以上のドーパミン作動性ニューロンの蓄積を特徴とする、項目59〜73のいずれかに記載の方法。
(75)前記中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起が、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm又はそれ以上の長さを有する、項目59〜74のいずれかに記載の方法。
(76)神経上皮幹細胞が、
a)場合により、人工多能性幹細胞(iPSC)を取得/提供すること;
b)
(i)アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)骨形成タンパク質(BMP)シグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、前記iPSCを培養すること;並びに
c)
(i)アクチビン/TGF−βシグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)BMPシグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、b)において取得した細胞を培養すること;並びに
d)
(i)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(ii)SHH経路活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む培地中で、c)において取得した細胞をさらに培養すること
を含み、それにより、神経上皮幹細胞を取得する方法によって取得可能である、項目1〜75のいずれかに記載の方法。
(77)e)
(i)FGFシグナリング活性化剤;
(ii)EGFシグナリング活性化剤;及び
(iii)LIFシグナリング活性化
を含む培地中で、d)において取得した細胞を維持することをさらに含む、項目76に記載の方法。
(78)項目1〜77のいずれかに記載の方法によって取得可能な、中脳オルガノイド。
(79)前記中脳オルガノイドに対する細胞応答を誘発するそれらの能力について化合物を試験するための、項目78に記載の中脳オルガノイドの使用。
(80)前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は(共培養)細胞である、項目79に記載の使用。
(81)前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目79又は80に記載の使用。
(82)前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目81に記載の使用。
(83)細胞応答を誘発するその能力について目的の化合物を試験するための方法であって、
(a)項目78に記載の中脳オルガノイドと前記目的の化合物とを接触させること;及び
(b)前記目的の化合物が細胞応答を誘発するかを決定すること
を含む、方法。
(84)前記化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は(共培養)細胞である、項目83に記載の方法。
(85)前記細胞応答が、特定の種類の細胞の頻度又は生存である、項目83又は84に記載の方法。
(86)前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、項目85に記載の方法。
(87)項目78で定義される中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロンの分化及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を促進又は阻害する分子を同定するための方法であって、該中脳オルガノイドと目的の分子とを接触させることを含み、
コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を促進し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を阻害することを示し、コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の減少が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を阻害し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を誘導することを示す、方法。
(88)神経突起伸長を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目87に記載の方法。
(89)THの発現を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、項目87又は88に記載の方法。
(90)コントロールが、目的の分子と接触されていない中脳オルガノイドである、項目87〜89のいずれかに記載の方法。
(91)項目78に記載の中脳オルガノイドユニットを含む、組成物。
(92)医薬組成物である、項目91に記載の組成物。
(93)中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用。
(94)移植において使用するための、項目78に記載の中脳オルガノイド。
特に、本明細書に記載される方法はまた、
(i)神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)維持培地中で該神経上皮幹細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養し、好ましくは、維持培地中で該神経上皮幹細胞を10日間培養し、場合により、8日後に、該神経上皮幹細胞をMatrigel小滴に移すこと;
(iii)神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される分化培地(I)とを接触させること;
(iv)分化培地I中で工程(iii)の細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上、好ましくは6日間培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは4日後に開始される;
(v)工程(iv)において取得した細胞と、本明細書で定義される分化培地IIとを接触させること;並びに
(vi)撹拌条件下、分化培地II中で工程(v)の細胞を1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得し得る。
(i)神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)維持培地中で該神経上皮幹細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上培養し、好ましくは、維持培地中で該神経上皮幹細胞を10日間培養し、場合により、8日後に、該神経上皮幹細胞をMatrigel小滴に移すこと;
(iii)神経上皮幹細胞と、本明細書で定義される分化培地(I)とを接触させること;
(iv)分化培地I中で工程(iii)の細胞を1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又はそれ以上、好ましくは6日間培養すること、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは4日後に開始される;
(v)工程(iv)において取得した細胞と、本明細書で定義される分化培地IIとを接触させること;並びに
(vi)撹拌条件下、分化培地II中で工程(v)の細胞を1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間又はそれ以上培養すること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得し得る。
「オルガノイド」は、器官全体に似る。オルガノイドは、固有の自己組織化能力を示し、器官の細胞構成を形成する。診断用途及び治療用途について、オルガノイドは非常に有望である。本発明のオルガノイドは、好ましくは、中脳オルガノイドである。したがって、本発明の中脳オルガノイドは、中脳に似る。中脳は、神経伝達物質ドーパミン(DA)の大部分が産生される脳の領域である。好ましくは、本発明の中脳オルガノイドは、NESC、好ましくはhNESCの単一コロニーに由来する。本発明の中脳オルガノイドは、好ましくは、中脳の表現型を有する。本発明の中脳オルガノイドは、初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドのいずれかである。本発明の中脳オルガノイドは、好ましくは、中脳の表現型を有する。このように、それは、中脳の典型的な細胞/細胞型を含む。したがって、本発明の中脳オルガノイドは、神経前駆細胞、幼若ニューロン、幼若ドーパミン作動性ニューロン、成熟ニューロン、成熟ドーパミン作動性ニューロン、非対称組織化、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト、及び/又は中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起を含む。これらの細胞型は、好ましくは、本明細書に記載されるマーカーを特徴とする。同様に、非対称組織化は、好ましくは本明細書に記載されるように、ドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化、及び中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起を特徴とする。本発明の中脳オルガノイドにおける細胞/細胞型の存在は、当技術分野で公知の及び本明細書に記載される手段及び方法によって試験され得る。同様に、前記細胞/細胞型又は非対称組織化による本明細書に記載されるマーカーの発現は、当技術分野で公知のように及び本明細書に記載されるように試験され得る。
オルガノイドは、変性及び発達性の疾患及び/又はガンをモデリングする能力を有し、遺伝性障害を研究するための、及び微妙な表現型を同定するための有益なツールである。患者由来の体細胞はiPSCに再プログラミングされ得、それに由来するオルガノイドは、薬物試験のための患者特異的モデルとして、又は臓器補充療法のための再生医療において使用され得る。hiPSC由来オルガノイドにおける突然変異の挿入及び修正は、疾患機構の理解に役立ち得る。有利には、これは、本発明によって想定される(すなわち、本発明の中脳オルガノイドは、例えば、神経発達疾患及び/又は神経変性疾患、例えばパーキンソン病(PD)、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病を研究するために使用され得るモデルとして機能し得る)。
本発明の方法は任意の細胞培養で行われ得るが、しかしながら、三次元細胞培養が好ましい。培養条件は変動し得るが、細胞が培養される人工環境は常に、以下:必須栄養素(アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル)、成長因子、ホルモン、ガス(O2、CO2)及び/又はレギュレーションされた物理化学的環境(pH、浸透圧、温度)を供給する基材又は培地の1つ以上を含む適切な容器からなる。本明細書に記載される細胞培養は、コントロールされた実験室環境における細胞の維持及び成長を指す。実験的細胞生物学的研究では、このようなin vitro細胞培養モデルは周知である。例えば、細胞は、固体基材又は半固体基材に接着させて培養され得る(接着培養又は単層培養)。細胞はまた、培養培地中で浮遊させて成長され得る(懸濁培養)。しかしながら、本発明の細胞は、撹拌条件下で培養されることが好ましい。
維持培地又は分化培地のような細胞培養のための培地は、本明細書の他の箇所、例えば上記項目に記載されている。
本発明の方法において適用される分化培地は、少なくとも2つの異なるニューロトロフィンを含む。本明細書で使用される「ニューロトロフィン」という用語は、ニューロンの生存、発生及び機能をレギュレーションするタンパク質のファミリーに関する。例示的なニューロトロフィンとしては、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、ニューロトロフィン−4(NT−4)並びにリガンドのGDNFファミリー及び毛様体神経栄養因子(CNTF)が挙げられる。リガンドのGDNFファミリーとしては、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)及びペルセフィン(PSPN)が挙げられる。
したがって、「少なくとも2つの異なるニューロトロフィン」という用語は、列挙されている分子の2つ以上を指す。好ましくは、少なくとも2つの異なるニューロトロフィンは、BDNF及びGDNFである(遺伝子記号:それぞれBDNF及びGDNF)。BDNFは、例えば、Uniprot/SwissprotアクセッションナンバーP23560(1991年10月31日のバージョン1)のヒトBDNFタンパク質であり得る。GDNFは、例えば、Uniprot/SwissprotアクセッションナンバーP39905(1995年1月31日のバージョン1)のヒトGDNFタンパク質であり得る。
BDNF及びGDNFは両方とも互いに独立して、それぞれ約0.0001〜約50ng/μL、より好ましくはそれぞれ約0.001〜約25ng/μLの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量はそれぞれ約0.001ng/μLの濃度である。BDNF及びGDNFは、例えば、Peprotechから取得され得る。
本発明の方法において適用される分化培地は、抗酸化剤をさらに含み得る。抗酸化剤は、他の分子の酸化を阻害する分子である。「酸化」及び「抗酸化剤」という用語は当技術分野で周知であり、例えばNordberg J, Arner ES. (2001) “Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system.” Free Radic Biol Med. 31(11):1287-312に記載されている。要するに、酸化は、電子の喪失又は酸化状態の増加を伴う化学反応である。酸化反応は、フリーラジカルを生成し得る。次に、これらのラジカルが、連鎖反応を開始させ得る。細胞において連鎖反応が起こると、それは、細胞に損傷又は死を引き起こし得る。抗酸化剤は、フリーラジカル中間体を除去することによって、これらの連鎖反応を停止させ、他の酸化反応を阻害する。したがって、抗酸化剤は、細胞酸化プロセスに関与する分子の阻害剤を指す。
例示的な抗酸化剤としては、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ1、スーパーオキシドジスムターゼ2、スーパーオキシドジスムターゼ3、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンE又は尿酸が挙げられる。したがって、抗酸化剤は、アスコルビン酸であり得る。
本明細書に記載される細胞培養のための任意の培地は、ROCK阻害剤を含有し得る。本明細書で使用される「ROCK阻害剤」は、Rho関連タンパク質キナーゼの阻害剤として作用する(すなわち、ROCK機能を低減又はさらには無効化にする)化合物である。ROCK阻害剤として作用する化合物の能力は、様々な手段によって、例えば、ROCKに対する結合についてATPと競合するその能力を決定することによって、並びに/又はIshizaki T Mol Pharmacol. 2000 May;57(5):976-83に記載されているように細胞形態、G1−S移行及び細胞質分裂に対するその効果を評価することによって評価され得る。阻害剤は、ROCKアイソフォームROCK1及び/又はROCK2のいずれかに非特異的又は特異的であり得る。当技術分野で公知のROCK阻害剤は、Liao et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2007 Jul; 50(1): 17-24に概説されており、ファスジル、Y−27632、チアゾビビン、Y39983、Wf−536、SLx−2119、アザベンズイミダゾール−アミノフラザン、DE−104、オレフィン、イソキノリン、インダゾール、ピリジンアルケン誘導体、H−1152P、ROKα阻害剤、XD−4000、4−(1−アミノアルキル)−N−(4−ピリジル)シクロヘキサン−カルボキサミド、HMN−1152、ロストスタチン、BA−210、BA−207、BA−215、BA−285、BA−1037、Ki−23095、VAS−012が挙げられ、本発明の方法における使用について、、Y−27632又はチアゾビビンが特に想定される。
本発明の方法において適用される分化培地は、アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング経路の活性化剤をさらに含み得る。アクチビン/TGF−βシグナリング経路は当技術分野で公知であり、例えば、Heldin, Miyazono and ten Dijke (1997) “TGF-bold beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.” Nature 390, 465-471に記載されている。要するに、例えばTGFB1、TGFB2、TGFB3、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB及び/又はNODALを含むレセプターリガンドは、例えばTGFBR2、ACVR2A及び/又はACVR2Bを含む2つのI型レセプターキナーゼと、例えばTGFBR1、ACVR1 B及び/又はACVR1Cを含む2つのII型レセプターキナーゼとからなるヘテロ四量体レセプター複合体に結合する。この結合は、例えばSMAD2及び/又はSMAD3を含むR−smadと、例えばSMAD4を含むCo−smadとからなるヘテロマー複合体のリン酸化及び活性化をトリガーする。したがって、「アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか1つの活性化剤を指す。
アクチビン/TGF−βシグナリング経路の例示的な活性化剤としては、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB又はnodalが挙げられる。したがって、アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤は、TGFβ3であり得る。TGFβ3などのアクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤は、0.0001ng/μl〜0.1ng/μlの量で、例えば0.001ng/μlの量などで利用され得る。
本発明の方法において適用される分化培地は、cAMP類似体をさらに含み得る。このようなcAMP類似体は、サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)と同様の物理的特性、化学的特性、生化学的特性又は薬理学的特性を有する化合物である。cAMPは当業者に公知であり、例えば、Fimia GM, Sassone-Corsi P. (2001) “Cyclic AMP signalling.” J Cell Sci; 114(Pt 11):1971-2に記載されている。
本発明の方法において適用される分化培地は、さらに、(異なる化合物が希釈される)N2B27培地であり得る。これは、培地がN2サプリメント及びB27サプリメントを含むことを意味する。両サプリメントは当業者に周知であり、自由に入手可能である。B27サプリメントは、ビタミンAを含まないB27サプリメントであり得る。このB27は、1:10〜1:1000、例えば1:100(サプリメント:培地)の濃度で使用され得る。B27サプリメントは、例えば、Life technologiesから入手され得る。同様に、N2サプリメントもまた、例えば、Life technologiesから入手され得る。N2サプリメントは、1:20〜1:2000、例えば1:200(サプリメント:培地)の濃度で使用され得る。
分化培地はまた、Neurobasal培地及び/又はDMEM−F12培地であり得る。両培地は、例えば、Life technologiesから入手され得る。N2B27培地は、例えば、等量のNeurobasal培地及びDMEM/F12培地を含み得る。
本発明の方法において適用される分化培地は、抗生物質をさらに含み得る。
本発明の方法において適用される分化培地は、グルタミンをさらに含み得る。
本発明の方法において適用される分化培地は、約50%DMEM−F12(例えば、Life technologies製)/約50%Neurobasal(例えば、Life technologies製)、約1:200 N2サプリメント(例えば、Life technologies製)、ビタミンAを欠く約1:100 B27サプリメント(例えば、Life technologies製)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(例えば、Life technologies製)及び2mM L−グルタミン(例えば、Life technologies製)を含むN2B27培地を含み得る。
加えて、細胞は、二次元細胞培養で培養され得る。この種類の細胞培養は、当業者に周知である。二次元(2D)細胞培養では、細胞は、プラスチック平皿、例えばペトリ皿、フラスコ及びマルチウェルプレート上で成長される。しかしながら、生物学的に誘導されたマトリックス(例えば、フィブリン、コラーゲン及び本明細書にさらに記載されるもの)及び合成ヒドロゲル(例えば、PAA、PEG及び本明細書にさらに記載されるもの)は、剛体表面上で発現されない特定の細胞表現型を誘発するために使用され得る。
しかしながら、本発明の方法は、好ましくは、三次元細胞培養で行われ得る。本明細書で使用される「三次元細胞培養」又は「3D細胞培養」は、3つの次元全てにおいて細胞が成長し又はその周辺と相互作用することを可能にする人工的に作られた環境で、細胞を成長させることを意味する。例えば、細胞培養の三次元特性を達成するために、細胞は、マトリックス又は足場で成長又は分化される。原則として、三次元細胞培養で使用され得る適切なマトリックス又は足場は、当業者に公知である。したがって、このようなマトリックス又は足場は、任意のマトリックス又は足場であり得る。例えば、マトリックス又は足場は、天然分子若しくは合成ポリマー、生物学的合成ハイブリッド、金属、セラミック及び生物活性ガラス又はカーボンナノチューブのいずれかを含む細胞外マトリックスであり得る。
例示的な天然細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、ラミニン又はフィブリンのような基底膜、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、絹フィブロイン、酢酸セルロース(cellulose actetate)、カゼイン、キチン、フィブリノーゲン、ゼラチン、エラスチン又はポリ−(ヒドロキシアルカノアート)が挙げられる。合成細胞外マトリックスポリマーとしては、改変型ヒアルロン酸(HA)、改変型ポリエチレングリコール(PEG)、自己集合タンパク質ヒドロゲル、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリウレタン又はPGSが挙げられる。生物学的合成ハイブリッドとしては、例えば、ポリカプロラクトン−キトサン、PLLA−ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト−バイオガラス−セラミック、ポリ−(ヒドロキシアルカノアート)−バイオガラス、ヒドロキシアパタイトコラーゲン、PCL−ゼラチン又はPCL−コラーゲンが挙げられ得る。例示的な金属としては、タンタラム、マグネシウム及びその合金、チタン及びその合金又はニチノール(ニッケルとチタンとの合金)が挙げられる。セラミック及び生物活性ガラスマトリックス/足場の例としては、チタン及びリン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト及びリン酸三カルシウム、生物活性ケイ酸塩ガラス(SiO2−Na2O−CaO−P2O5)、ヒドロキシアパタイト及びバイオガラス、リン酸カルシウムガラス又はリン酸ガラスが挙げられる。カーボンナノチューブは、0.4〜2nmの範囲のグラファイトを使用して構築され得る。カーボンナノチューブは、CNT−ポリカプロラクトン、CNT−セラミックマトリックス、45S5バイオガラス−CNT、ゼラチンヒドロゲルをスタッドしたCNT、CNT−TiO2、CNT−ラミニン、ポリアクリル酸をグラフトしたCNT、又はCNT−TGF−βを含み得る。
マトリックス又は足場はまた、Matrigelのようなヒドロゲル、フィブリンゲル又はアルギン酸塩ゲルであり得る。Matrigelは、Engelbreth−Holm−Swarmマウス肉腫(細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍)から抽出された再構成基底膜調製物であり得る。Matrigelは、60%ラミニン、30%IV型コラーゲン及び8%エンタクチンから構成され得る。場合により、成長因子及び他の分子がMatrigelに追加され得る。Matrigelはまた、BD Matrigel(商標)(BD Biosciencesから入手可能)であり得る。
本明細書で言及される場合、神経上皮幹細胞(NESC)は、神経発生のいくつかの異なる段階の実際の幹細胞から誘導され得る。神経上皮細胞は幹細胞のクラスであり、幹細胞と同様の特徴を有する。例えば、これらの細胞は、自己複製することができる。自己複製は、未分化状態を維持しながら、細胞分裂の多数の細胞周期を経る能力である。加えて、神経上皮幹細胞は、複数の種類の細胞、例えばニューロン、アストロサイト及び他のグリア細胞にさらに分化する能力を有する。したがって、これらの細胞はまた多分化能性である。それらは神経系統に限定され、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化し得る(Gage, 2000)。細胞が自己複製能力を有するか、及び細胞が多分化能性であるかを試験するための方法は、当業者に公知である。自己複製は、細胞を10継代超、11継代、12継代、13継代、14継代、15継代、16継代、17継代、18継代、19継代、20継代、21継代、22継代、23継代、24継代、25継代、26継代、27継代、28継代、29継代、30継代又はそれ以上継代することによって試験され得る。継代は、単一細胞懸濁液としてそれらを再プレーティングする前に細胞の分割を含む。多分化能は、前記細胞を異なる系統、例えばアストロサイト、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化させることによって試験され得る。
さらに、神経上皮幹細胞は、PAX6、Notch1、ネスチン、PCNA、Hes5及びSox1などのマーカーを発現し得る。特に、本発明の方法において使用される神経上皮幹細胞は、国際公開公報第2013104752号に記載されている哺乳動物神経板境界幹細胞(NPBSC)であり得る。さらに、本発明の方法において使用される神経上皮幹細胞はまた、国際公開公報第2013104752号に記載されているNPBSC(これらはまた、国際公開公報第2013104752号に記載されている方法によって取得される)であり得る。これらのNPBSCは、FORSE1、MSX1、PHOX2B、PAX3、PAX6、SOX1、SOX2、ネスチン、IRX3、HOXA2、HOXB2、HES5、DACH1、PLZF、LM03、EVI1及びASCL1からなる群より選択される少なくとも3つのマーカーの発現を特徴とし得る。さらに、これらの細胞は、マーカーOCT4、NANOG、AFP、T、SOX17、EOMES、GSH2、OLIG2、CK8、CK18、NKX2.2、NKX6.1、HOXB8、HOXA5、FOXA2及びVCAM−1の少なくとも1つの発現の欠如を特徴とし得る。
本発明において使用される神経上皮幹細胞(NESC)は、マーカーSOX1、SOX2、PAX6及び/又はネスチンを発現することがさらに想定される。加えて又はあるいは、本発明において使用されるNESCは、5回超、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回又はそれ以上継代されたものである。本発明において使用されるNESCは、20回未満、19回、18回、17回、16回、15回、14回、13回、12回、11回、10回、9回、8回、7回、6回、5回、4回、3回又は2回継代されたものであることも想定される。本発明において使用されるNESCは、20回未満かつ2回超継代されたものであることも想定される。
注目すべきことに、NESCは、多能性幹細胞の三次元凝集体である胚様体の細胞とは異なる。これらの胚様体は、神経的に誘導され得る。しかしながら、このような誘導細胞は、中脳/後脳同一性に向かって十分にパターン形成され得ない。特に、開始集団としてのiPSCと比較して、NESCは、中脳/後脳同一性に向かって既にパターン形成されている。これにより、NESCは、本発明における使用に特に適切なものとなる。8日間の分化後に、FGF8を本明細書に記載される培地(例えば、分化培地I及び/又は分化培地II)に最初に追加することも想定される。この理由は、このようにしてドーパミン作動性ニューロンの作製効率を増加させ得るためである。
神経上皮幹細胞は、哺乳動物NESCであり得る。NESCは、hNESC−K7などのヒトNESC(hNESC)であることも本発明によって包含される。神経上皮幹細胞は、当業者に公知の異なる手段及び方法によって取得され得る。例えば、神経上皮幹細胞は、多能性細胞から誘導又は取得され得る。本発明のNESCは遺伝子改変され得るか、又はPDなどの神経学的疾患を患っている患者から取得され得る。また、NESCは、本明細書に記載されるようにiPSC、線維芽細胞又はPBMCから生産され得る。
全能性幹細胞(すなわち、「全てのものが可能」)は、栄養外胚葉の生殖系列を含む体の全ての細胞型を生じさせ得る(Weissman, 2000)。
本明細書で言及される場合、「多能性幹細胞」は、自己複製能力及び異なる細胞型への分化能力を有する細胞型に関する。多能性幹細胞は、ほぼ全ての細胞(すなわち、3つの主な胚葉:外胚葉、内胚葉及び中胚葉のいずれかに由来する細胞)に分化し得る。多能性幹細胞という用語はまた、胚盤胞として公知の初期胚の内部細胞塊に由来する幹細胞を包含する。
多分化能性幹細胞は組織又は器官に既に限定されており、全ての組織特異的細胞を生じさせ得る。
注目すべきことに、胚性幹細胞研究の最近の進歩は、例えば、胚の発生能力を妨げない割球生検ベースの技術を使用することによって、胚を破壊せずに新たな胚性幹細胞株を作り出す可能性をもたらした(Klimanskaya (2006) “Embryonic stem cells from blastomeres maintaining embryo viability.” Semin Reprod Med. 2013 Jan;31(1):49-55)。さらに、多数の樹立された胚性幹細胞株が当技術分野で利用可能である。したがって、胚の破壊を必要とせずに胚性幹細胞を扱うことが可能である。Takahashi及びYamanakaはこれらの懸念に対処し、体細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を作製する方法を発表した(Takahashi and Yamanaka, 2006)。4つの所定の因子で皮膚線維芽細胞を誘導して、多能性状態に戻るように再プログラミングした。それらの幹細胞は、ESCと同じ本質的特徴を有する(図1)(Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006; Yu et al., 2007)。一実施態様では、多能性幹細胞は胚性幹細胞であり、ヒト胚の破壊によって取得されなかった。したがって、多能性幹細胞は、胚を破壊せずに胚から取得される胚性幹細胞である。
神経上皮幹細胞はまた、別の多能性細胞(すなわち、人工多能性幹細胞(iPSC))から誘導又は取得され得る。本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞の決定的特性を維持するために重要な遺伝子及び因子を強制的に発現させることによって、胚性幹細胞様状態に遺伝的に再プログラミングされた成体体細胞を指す。したがって、人工多能性幹細胞は、非多能性細胞から誘導される。
人工多能性幹細胞は、胚を使用せずに多能性幹細胞を取得することを可能にするので、幹細胞研究の重要な進歩である。マウスiPSCは2006年に初めて報告され(Takahashi, K; Yamanaka, S (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors”. Cell 126 (4): 663-76)、ヒトiPSCは2007年に初めて報告された(Takahashi et al. (2007) “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.” Cell; 131(5):861-72)。幹細胞マーカーを発現すること、3つの胚葉全てに由来する細胞を含有する腫瘍を形成すること、及び非常に初期の発生段階のマウス胚に注射した場合に多くの異なる組織に寄与することができることを含め、マウスiPSCは、多能性幹細胞の重要な特徴を示す。ヒトiPSCもまた幹細胞マーカーを発現し、3つの胚葉全てに特徴的な細胞を生成することができる。このような幹細胞マーカーとしては、Oct3/4、Sox2、Nanog、アルカリホスファターゼ(ALP)並びに幹細胞特異的抗原3及び4(SSEA3/4)が挙げられ得る。また、iPSCのクロマチンメチル化パターンもまた、胚性幹細胞のものと同様である(Tanabe, Takahashi, Yamanaka (2014) “Induction of pluripotency by defined factors.” Proc. Jpn. Acad., 2014, Ser. B 90)。
加えて、iPSCは、in vitroで自己複製して3つの胚葉全ての細胞に分化することができる。iPSCの多能性又は異なる細胞型への分化能力は、例えば、神経細胞若しくはグリア細胞へのin vitro分化、又は胚盤胞注射による生殖系列キメラ動物の生産によって試験され得る。
ヒト人工多能性幹細胞の作製方法は、当業者に周知である。通常、Oct3/4、Sox2及びKlf4(並びにOCT3/4、SOX2及びKLF4)の強制発現は、線維芽細胞などの成体体細胞から人工多能性幹細胞を作製するために十分である。しかしながら、Oct3/4、Sox2、c−Myc及びKlf4(及びOCT3/4、SOX2、C−MYC)及びKLF4の組み合わせもまた、成体体細胞からiPSCを作製するために十分である。加えて、OCT3/4、SOX2、NANOG及びLIN28の組み合わせもまた、再プログラミングのために効率的であった(Tanabe, Takahashi, Yamanaka (2014) “Induction of pluripotency by defined factors.” Proc. Jpn. Acad., 2014, Ser. B 90)。このため、通常、これらの遺伝子をレトロウイルスベクター及び導入遺伝子発現ウイルス粒子又はベクターにクローニングし、これを体細胞にコトランスダクションする。しかしながら、当業者に公知の他の技術もまた、その目的のために使用され得る。また、例えばタンパク質トランスダクション又はネイキッドなDNAを介して、4つのベクター全てをヒト皮膚線維芽細胞にコトランスダクションし得る。
iPSCを取得するためのさらなる方法もまた当業者に公知であり、例えば、国際公開公報第2009115295号、国際公開公報第2009144008号又は欧州特許出願公開第2218778号に記載されている。したがって、当業者であれば、任意の方法によってiPSCを取得し得る。
原則として、人工多能性幹細胞は、(被験体の)任意の成体体細胞から取得され得る。例示的な体細胞としては、血液由来の末梢血単核細胞(PBMC)又は皮膚組織生検から取得された線維芽細胞のような線維芽細胞が挙げられる。
したがって、NESCは、人工多能性幹細胞(iPSC)から生産又は誘導又は取得されることが本発明によって想定される。iPCSを神経上皮幹細胞に分化させる異なる方法が当業者に公知であり、例えば、国際公開公報第2013/104752号に記載されている。加えて、iPSCは、線維芽細胞などの体細胞から生産され得ることが本発明によって想定される。さらに、iPSCは、ヒトiPSC(hiPSC)であり得る。
線維芽細胞などの体細胞は、被験体から取得されたものであることが本発明によってさらに包含される。「被験体」という用語はまた、ヒト又は動物を意味し得る。被験体はまた、パーキンソン病などの神経変性疾患を患っている被験体であり得る。特に、被験体は、家族性パーキンソン病に関連するLRRK2−G2019S突然変異を含む被験体であり得る。被験体はまた、パーキンソン病などの神経変性疾患を患っていない被験体であり得る。被験体は健常被験体であることも本発明によって包含される。被験体は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、限定されないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、イヌ、ウマ、マウス及びラットが挙げられる。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどであり得る。したがって、一実施態様では、被験体は、脊椎動物である。被験体はまた、ヒト被験体であり得る。
本明細書で使用される場合、「撹拌」又は「撹拌する」は、細胞を動的状態下に置く(すなわち、細胞が本質的に表面に接着しないようにする)任意の技術を包含する。撹拌は、振盪、スピニング、スターリング、移動及び/又は混合を含む多くの方法で達成され得る。スピニングは、例えば、磁気パドル又はインペラーを含有するスピナーフラスコの使用によって達成され得る。あるいは、本発明の方法は、バイオリアクターで行われ得る。パドル又はインペラー及び回転壁バイオリアクターを使用して培地の撹拌を達成するバイオリアクターを含む多くの種類のバイオリアクターが利用可能である。回転壁バイオリアクターは、低重力(微小重力)の条件をシミュレーションするためにさらに使用され得る。本発明の方法の操作において細胞が経験する剪断力をモニタリング及び/又はコントロールすることも望ましい。例えば、撹拌に供される最適な培養条件は、過度の剪断力による細胞損傷を回避する必要性に対して、培養中の酸素及び栄養素の均一な分布のための要件をバランスすることを必要とする。
本明細書で使用される「活性化剤」という用語は、ターゲット分子又は経路の活性を増強又は達成する化合物/分子として定義される。活性化剤は、活性化すべきタンパク質をコードする遺伝子の転写を増強若しくは誘導し、及び/又は活性化すべきタンパク質をコードするmRNAの翻訳を増強することによって、この効果を達成し得る。活性化すべきタンパク質は、活性化剤の存在下で高い効率でその生化学的機能を発揮すること、又は活性化すべきタンパク質は、活性化剤の存在下で高い効率でその細胞機能を発揮することもあり得る。したがって、「活性化剤」という用語は、特定の経路に対する直接的な活性化効果を有する分子/化合物だけではなく、例えば前記経路をネガティブにレギュレーションする(例えば、抑制する)分子と相互作用することによって間接的に活性化する分子も包含する。活性化剤は、活性化すべき経路のアゴニストであり得る。化合物/分子がターゲット分子又は経路の活性を誘導又は増強することができるかを試験するための方法は、当業者に公知である。例えば、SHH、WNTの活性化剤又は本明細書に記載される他の活性化剤は、例えば経路エフェクタータンパク質、例えばそれぞれGliタンパク質、LEF1又はTCF1タンパク質の量のウエスタンブロット分析を実施することによって試験され得る。
活性化剤として使用され得る化合物/分子は、各経路を活性化し得るか又は活性化すべき経路のサプレッサーを阻害する任意の化合物/分子であり得る。例示的な活性化剤は、例えば、特定の経路のサプレッサーに対する適切な結合タンパク質を含み得る。
活性化剤は、活性化剤を追加しない又は活性化剤を追加する前の経路の活性と比較して、活性化すべき経路を10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれ以上増強し又は増加させ得る。
「ヘッジホッグシグナリング経路」又は「SHH経路」は当技術分野で周知であり、例えば、et al. (2014) “Sonic hedgehog signalling pathway: a complex network.” Ann Neurosci. 21(1):28-31に記載されている。例えば、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ及び/又はデザートヘッジホッグを含むヘッジホッグリガンドは、例えば、下流シグナリングカスケードを誘導するPatched又はpatched−smoothenedレセプター複合体を含むレセプターに結合する。SHHシグナリングの下流ターゲット遺伝子としては、GLI1、GLI2及び/又はGLI3が挙げられる。したがって、「ヘッジホッグシグナリング経路の活性化剤」という用語はまた、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか1つの活性化剤を指す。
ヘッジホッグシグナリング(SHH)の例示的な活性化剤としては、パルモルファミン(PMA;2−(1−ナフトキシ)−6−(4−モルホリノアニリノ)−9−シクロヘキシルプリン9−シクロヘキシル−N−[4−(4−モルホリニル)フェニル]−2−(1−ナフタレニルオキシ);CAS番号:483367−10−8)、SHH、smoothenedアゴニスト(SAG;3−クロロ−N−[trans−4−(メチルアミノ)シクロヘキシル]−N−[[3−(4−ピリジニル)フェニル]メチル]−ベンゾ[b]チオフェン−2−カルボキサミド;CAS番号:912545−86−9)及びHh−Ag 1.5(3−クロロ−4,7−ジフルオロ−N−(4−(メチルアミノ)シクロヘキシル)−N−(3−(ピリジン−4−イル)ベンジル)ベンゾ[b]チオフェン−2−カルボキサミド;CAS番号:612542−14−0)並びにGli−2が挙げられる。SHH経路活性化剤はまた、パルモルファミン、SHH、SAG類似体及びGli−2からなる群より選択され得る。したがって、SHH経路活性化剤は、パルモルファミンであり得る。SHH経路活性化剤はまた、例えばSHH C24IIなどのSHH経路活性化機能を保持するSHHのリコンビナント又は短縮型であり得る。
パルモルファミンなどのSHHシグナリング経路活性化剤は、約0.25μM〜約1M、より好ましくは約0.4μM〜約0.5μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約0.5μMである。
SHHなどのSHHシグナリング経路活性化剤はまた、約50〜約1000ng/mlで用いられ得る。SHH C24IIなどのSHHシグナリング経路活性化剤はまた、約10〜約500ng/mlの濃度で用いられ得る。SAGなどのSHHシグナリング経路活性化剤は、約1〜約100nMの濃度で用いられ得る。Hh−Ag1.5などのSHHシグナリング経路活性化剤はまた、約1〜約50nMの濃度で用いられ得る。
加えて又はあるいは、本発明の方法において使用される培地は、カノニカルWNTシグナリング活性化剤を含み得る。カノニカルWntシグナリング経路は当業者に公知であり、例えば、Logan and Nusse (Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (2004) 20:781-810)に記載されている。要するに、WntリガンドはFrizzledレセプターに結合し、調節性APC/アキシン/GSK−3β複合体からの多機能キナーゼGSK−3βの解離をトリガーする。Wntシグナルの非存在下では(オフ状態)、CK1及びAPC/アキシン/GSK−3β複合体による協調的リン酸化によってβ−カテニンがターゲティングされ、ユビキチン化され、β−TrCP/SKP経路を介してプロテアソーム分解される。Wntリガンドの存在下では(オン状態)、コレセプターLRP5/6は、Wnt結合Frizzledと複合体形成する。これは、Dishevelled(Dvl)の活性化をもたらし、APC/アキシンからGSK−3βが解離する。Wntリガンドの転写効果は、β−カテニンのRac1依存性核移行とそれに続くLEF/TCF DNA結合因子(補助活性化因子)のリクルートによって媒介される。例示的なWntリガンドとしては、例えば、Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt7b及び/又はWnt11が挙げられる。
したがって、本明細書に記載される「カノニカルWNTシグナリング活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか1つの活性化剤を指す。
例示的なカノニカルWNTシグナリング活性化剤としては、Norrin、R−スポンジン2又はWNTタンパク質が挙げられる。しかしながら、カノニカルWNTシグナリング活性化剤はまた、アキシン又はAPCを遮断し得る。これは、例えば、siRNA又はmiRNA技術によって達成され得る。
したがって、例示的なカノニカルWNTシグナリング活性化剤としては、Norrin、R−スポンジン2又はWNTタンパク質が挙げられ得る。しかしながら、カノニカルWNTシグナリング活性化剤はまた、アキシン又はAPCを遮断し得る。これは、例えば、siRNA又はmiRNA技術によって達成され得る。カノニカルWNTシグナリング活性化剤はGSK−3阻害剤であることも本発明によって包含される。例示的なGSK−3阻害剤としては、CHIR 99021(6−[[2−[[4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(5−メチル−1H−イミダゾール−2−イル)−2−ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]−3−ピリジンカルボニトリル;CAS番号:252917−06−9)、SB−216763(3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン;CAS番号:280744−09−4)、6−ブロモインジルビン−3’−オキシム(CAS番号:CAS 667463−62−9)、タイドグルーシブ(4−ベンジル−2−(ナフタレン−1−イル)−1,2,4−チアジアゾリジン−3,5−ジオン)、GSK−3阻害剤1(CAS番号:603272−51−1)、AZD1080(CAS番号:612487−72−6)、TDZD−8(4−ベンジル−2−メチル−1,2,4−チアジアゾリジン−3,5−ジオン;CAS番号:327036−89−5)、TWS119(3−[[6−(3−アミノフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル]オキシ]−フェノール;CAS番号:601514−19−6)、CHIR−99021(CAS番号:252917−06−9)、CHIR−98014(N6−[2−[[4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(1H−イミダゾール−1−イル)−2−ピリミジニル]アミノ]エチル]−3−ニトロ−2,6−ピリジンジアミン;CAS番号:252935−94−7)、SB 415286(3−[(3−クロロ−4−ヒドロキシフェニル)−アミノ]−4−(2−ニトロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオン;CAS番号:264218−23−7)、LY2090314(3−(9−フルオロ−2−(ピペリジン−1−カルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−[1,4]ジアゼピノ[6,7,1−hi]インドール−7−イル)−4−(イミダゾ[1,2−a]ピリジン−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン;CAS番号:603288−22−8)、AR−A014418(N−(4−メトキシベンジル)−N′−(5−ニトロ−1,3−チアゾール−2−イル)尿素;CAS番号:487021−52−3及び/又はIM−12(3−(4−フルオロフェニルエチルアミノ)−1−メチル−4−(2−メチル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン;CAS番号:1129669−05−1)が挙げられる。したがって、GSK−3阻害剤はまた、CHIR99021であり得る。
CHIR99021などのカノニカルWNTシグナリング活性化剤は、約0.01μM〜約1M、より好ましくは約0.1μM〜約5μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約3μMである。CHIR99021は、例えば、Axon Medchemから入手され得る。
本発明の方法において使用される培地は、例えば、アクチビン/TGF−β阻害剤を含み得る。
アクチビン/TGF−βシグナリング経路は当技術分野で公知であり、例えば、Heldin, Miyazono and ten Dijke (1997) “TGF-bold beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.” Nature 390, 465-471に記載されている。要するに、例えばTGFB1、TGFB2、TGFB3、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB及び/又はNODALを含むレセプターリガンドは、例えばTGFBR2、ACVR2A及び/又はACVR2Bを含む2つのI型レセプターキナーゼと、例えばTGFBR1(ALK5)、ACVR1B(ALK4)及び/又はACVR1C(ALK7)を含む2つのII型レセプターキナーゼとを含むヘテロ四量体レセプター複合体に結合する。この結合は、例えばSMAD2及び/又はSMAD3を含むR−smadと、例えばSMAD4を含むCo−smadとからなるヘテロマー複合体のリン酸化及び活性化をトリガーする。したがって、「アクチビン/TGF−βシグナリング経路の活性化剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか1つの活性化剤を指し、「アクチビン/TGF−βシグナリング経路の阻害剤」という用語は、このシグナリング経路の一部を形成する上記分子のいずれか1つの阻害剤を指す。加えて、このような活性化剤は、ACVR2A及び/若しくはACVR1B(ALK4)レセプターのアゴニスト、又はTGFβRIIレセプター及び/若しくはALK5レセプターのアゴニストであり得る。このような阻害剤は、ACVR2A及び/若しくはACVR1B(ALK4)レセプターのアンタゴニスト、又はTGFβRIIレセプター及び/若しくはALK5レセプターのアンタゴニストであり得る。原則として、アクチビン/TGF−βシグナリング経路のこのような阻害剤/活性化剤は当業者に公知であり、市販されている。
本発明は、アクチビン/TGF−β阻害剤が、TGF−β I型レセプターのアクチビンレセプター様キナーゼの阻害剤であることを企図する。アクチビン/TGF−β阻害剤は、ALK5、ALK4及び/又はALK7を阻害することが本発明によってさらに想定される。アクチビン/TGF−β阻害剤の例示的だが非限定的な例は、A−83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド;CAS番号:909910−43−6)、D4476(4−[4−(2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−6−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;CAS番号:301836−43−1)、GW788388(4−[4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−2−ピリジニル]−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)−ベンズアミド;CAS番号:452342−67−5)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン;CAS番号:396129−53−6)、R268712(4−[2−フルオロ−5−[3−(6−メチル−2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]フェニル]−1H−ピラゾール−1−エタノール;CAS番号:879487−87−3)、SB−431542(4−(5−ベンゾl[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)−ベンズアミド水和物;CAS番号:CAS番号301836−41−9)、SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩水和物;CAS番号:694433−59−5)、SD208(2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジル)アミノ]プテリジン;CAS番号:627536−09−8)、SB−525334(6−[2−tert−ブチル−5−(6−メチル−ピリジン−2−イル)−1H−イミダゾール−4−イル]−キノキサリン;CAS番号:356559−20−1)及びALK5阻害剤II(CAS:446859−33−2)である。したがって、アクチビン/TGF−β阻害剤は、SB−431542であり得る。
SB−431542などのアクチビン/TGF−β阻害剤は、約0.01μM〜約1M、より好ましくは約5μM〜約15μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約10μMである。例えば、SB−431542は、Ascent Scientificから入手され得る。
加えて又はあるいは、本発明の方法において使用される培地は、BMPシグナリング阻害剤を含み得る。BMPシグナリング経路は当業者に公知であり、例えば、Jiwang Zhanga, Linheng Lia (2005) BMP signaling and stem cell regulation Developmental Biology Volume 284, Issue 1, 1 August 2005, Pages 1-11に記載されている。
要するに、BMPは、レセプター媒介性細胞内シグナリングを介して機能し、続いて、ターゲット遺伝子の転写に影響を及ぼす。このプロセスでは、I型及びII型と称される2種類のレセプターが必要である。1つのII型BMPレセプター(BmprII)のみが存在する場合、3つのI型レセプター:Alk2、Alk3(Bmpr1a)及びAlk6(Bmpr1b)が存在する。BMPシグナル伝達は、少なくとも2つのシグナリング経路で起こり得る。カノニカルBMP経路は、Smad1、Smad5又はSmad8(R−Smad)のレセプターI媒介性リン酸化によって媒介される。2つのリン酸化R−Smadは、共通のSmad4(co−Smad)とヘテロ三量体複合体共凝集体を形成する。Smadヘテロ三量体複合体は核に移行し得、他の転写因子と協調してターゲット遺伝子発現をモデュレーションし得る。BMPシグナルの平行経路は、TGFβ1活性化チロシンキナーゼ1(TAK1、MAPKKK)によって、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)を介して媒介され、BMP経路とWnt経路との間のクロストークにも関与する。
BMPシグナリングの阻害剤は、カノニカルBMP経路を遮断/低減し得るに過ぎないことが本発明によって想定される。したがって、BMPシグナリング阻害剤は、カノニカルBMPシグナリング阻害剤であり得る。カノニカルBMPシグナリング経路に選択的な1つのこのような阻害剤は、ドルソモルフィンである。BMPシグナリング阻害剤の例示的だが非限定的な例としては、コーディン、ノギン、DMH1(CAS 1206711−16−1)、K 02288(3−[(6−アミノ−5−(3,4,5−トリメトキシフェニル)−3−ピリジニル]フェノール;CAS番号:1431985−92−0)、ドルソモルフィン(6−[4−(2−ピペリジン−1−イルエトキシ)フェニル]−3−ピリジン−4−イルピラゾロ[1,5−a]ピリミジン;CAS番号:866405−64−3)及びLDN 193189(4−[6−[4−(1−ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン−3−イル]−キノリン塩酸塩、CAS番号:1062368−24−4)が挙げられる。BMPシグナリング阻害剤はまた、ドルソモルフィンであり得る。
ドルソモルフィンなどのBMPシグナリング阻害剤は、約0.01μM〜約1M、より好ましくは約0.1μM〜約5μMの濃度で用いられ得、最も好ましくは、その量は約0.1μMである。ドルソモルフィンは、例えば、Tocrisから入手され得る。
本発明によれば、「Map2」は、微小管関連タンパク質2(ヒトでは、MAP2遺伝子によってコードされるタンパク質)を指す。Map2は、微小管関連タンパク質ファミリーに属する。このファミリーのタンパク質は、神経突起生成の必須工程である微小管集合に関与すると考えられる。ヒトMAP2 mRNAは、NCBI参照NM_001039538(配列番号:1)に示されている配列を含み得、及び/又はタンパク質は、Uniprot番号P11137(配列番号:2)から入手される配列を含み得る。Map2という用語は、任意のMap2核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、Map2の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「TH」は、チロシンヒドロキシラーゼ/チロシン3−モノオキシゲナーゼ/チロシナーゼ(ヒトでは、TH遺伝子によってコードされるタンパク質)を指す。THは、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(L−DOPA)へのアミノ酸L−チロシンの変換の触媒に関与する酵素である。ヒトTH mRNAは、例えば、NCBI参照NM_000360(配列番号:3)に示されている配列及び/又はUniprot番号P07101(配列番号:4)のタンパク質配列を含み得る。THという用語は、任意のTH核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、THの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「βIIIチューブリン」としても公知の「Tuj1」は、ヒトではTUBB3遺伝子によってコードされるタンパク質である。タンパク質βIIIチューブリン(TuJ1)は、新たに生成された未成熟有糸分裂後ニューロン及び分化ニューロンに、並びにいくつかの有糸分裂的に活性なニューロン前駆体に存在する。ヒトTuj mRNAは、NCBI参照NM_006086.3(配列番号:5)に示されている配列を含み得、及び/又はタンパク質は、Uniprot番号Q13509(配列番号:6)に示されている配列を含み得る。Tuj1という用語は、任意のTuj1核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、Tuj1の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、グリア線維酸性タンパク質としても公知の「GFAP」は、ヒトではGFAP遺伝子によってコードされるタンパク質である。グリア線維酸性タンパク質は、中枢神経系(CNS)の多数の細胞型(アストロサイトを含む)によって発現される中間フィラメント(IF)タンパク質である。ヒトGFAP mRNAは、NCBI参照NM_001131019(配列番号:7)に示されている配列を含み得、及び/又はタンパク質は、Uniprot番号P14136(配列番号:8)に示されている配列を含み得る。GFAPという用語は、任意のGFAP核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、GFAPの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、S100カルシウム結合タンパク質Bとしても公知の「S100b」又は「S100β」は、ヒトではS100遺伝子によってコードされるタンパク質である。S100タンパク質は、広範囲の細胞の細胞質及び核に局在し、細胞周期進行及び分化などの多くの細胞プロセスのレギュレーションに関与する。ヒトS100b mRNAは、NCBI参照NM_006272(配列番号:9)に示されている配列を含み得、及び/又はタンパク質は、Uniprot番号P04271(配列番号:10)に示されている配列を含み得る。S100bという用語は、任意のS100b核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、S100bの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、無虹彩II型タンパク質(AN2)又はoculorhombinとしても公知のペアボックスタンパク質Pax−6とも称される「PAX6」は、ヒトではPAX6遺伝子によってコードされるタンパク質である。Pax6は、胚発生中に存在する転写因子である。コードされるタンパク質は、DNAに結合して遺伝子転写のレギュレーターとして機能することが公知の2つの異なる結合部位を含有する。それは、目及び脳の発生の重要な調節遺伝子である。ヒトPAX6 mRNAは、配列番号:11をコードする任意の配列を含み得る。ヒトPAX6はまた、Uniprot番号P26367(配列番号:11)によって示されているタンパク質配列を含み得る。PAX6という用語は、任意のPAX6核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、PAX6の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「SOX1性決定領域Y−ボックス1」とも称される「SOX1」は、ヒトではSOX1遺伝子によってコードされるタンパク質である。SOX1(性決定領域Y−ボックス1)は、Soxタンパク質ファミリーの転写因子である。ヒトSOX1 mRNAは、配列番号:12をコードする任意の配列を含み得る。SOX1はまた、Uniprot番号O00570(配列番号:12)のタンパク質配列を含み得る。SOX1という用語は、任意のSOX1核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、SOX1の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「性決定領域Y−ボックス2」としても公知の「SOX2」は、ヒトではSOX2遺伝子によってコードされるタンパク質である。SOX2は、未分化胚性幹細胞の自己複製又は多能性を維持するために必須の転写因子である。Sox2は、胚性幹細胞及び神経幹細胞の維持において重要な役割を有する。ヒトSOX2 mRNAは、配列番号:13をコードする任意の配列を含み得る。SOX2はまた、Uniprot番号P48431(配列番号:13)のタンパク質配列を含み得る。SOX2という用語は、任意のSOX2核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、SOX2の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「ネスチン」は、ヒトではNES遺伝子によってコードされるタンパク質である。ネスチンは、VI型中間フィラメント(IF)タンパク質である。ヒトネスチンmRNAは、配列番号:14をコードする任意の配列を含み得る。ネスチンはまた、例えばUniprot番号P48681(配列番号:14)によって示されているタンパク質配列を含み得る。ネスチンという用語は、任意のネスチン核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、ネスチンの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「LMX1A」(LIMホメオボックス転写因子1、アルファ)は、ヒトではLMX1A遺伝子によってコードされるタンパク質である。LMX1は、インスリンプロモーター中のA/Tリッチ配列に結合してインスリンの転写を刺激するLIMホメオボックス転写因子である。ヒトLMX1A mRNAは、配列番号:15をコードする任意の配列を含み得る。LMX1Aはまた、例えばUniprot番号Q8TE12(配列番号:15)によって示されているタンパク質配列を含み得る。LMX1Aという用語は、任意のLMX1A核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、LMX1Aの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「FOXA2」は、ヒトではFOXA2遺伝子によってコードされるタンパク質である。フォークヘッドボックスタンパク質A2は、DNA結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。ヒトFOXA2 mRNAは、配列番号:16をコードする任意の配列を含み得る。FOXA2はまた、例えばUniprot番号Q9Y261(配列番号:16)によって示されているタンパク質配列を含み得る。FOXA2という用語は、任意のFOXA2核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、FOXA2の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「LMX1B」は、ヒトではLMX1B遺伝子によってコードされるタンパク質である。LMX1Bは、脊椎動物の四肢の背側−腹側パターン形成において中心的な役割を果たすLIMホメオボックス転写因子である。ヒトFOXA2 mRNAは、配列番号:17をコードする任意の配列を含み得る。LMX1Bはまた、例えばUniprot番号O60663(配列番号:17)によって示されているタンパク質配列を含み得る。LMX1Bという用語は、任意のLMX1B核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、LMX1Bの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「NURR1」は、ヒトではNR4A2遺伝子によってコードされるタンパク質である。NURR1は、細胞内転写因子の核内レセプターファミリーのメンバーである。NURR1は、脳のドーパミン作動系の維持において重要な役割を果たす。ヒトNURR1 mRNAは、配列番号:18をコードする任意の配列を含み得る。NURR1はまた、例えばUniprot番号P43354(配列番号:18)によって示されているタンパク質配列を含み得る。NURR1という用語は、任意のNURR1核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、NURR1の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「AADC」は、芳香族L−アミノ酸デカルボキシラーゼである。ヒトAADC mRNAは、配列番号:19をコードする任意の配列を含み得る。AADCはまた、例えばUniprot番号P20711(配列番号:19)によって示されているタンパク質配列を含み得る。AADCという用語は、任意のAADC核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、AADCの検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
本発明によれば、「EN1」は、ヒトではEN1遺伝子によってコードされるタンパク質である。Engrailed(EN)は、多細胞発生の多くの態様に関与するホメオドメイン転写因子である。ヒトEN1 mRNAは、配列番号:20をコードする任意の配列を含み得る。EN1はまた、例えばUniprot番号Q05925(配列番号:20)によって示されているタンパク質配列を含み得る。EN1という用語は、任意のEN1核酸分子又はポリペプチドを包含し、それらのフラグメント又は変異体も含み得る。当業者であれば、EN1の検出方法を把握している。このような方法はまた、実施例に記載されている。
特に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す数は全て、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語は、10〜15%内、好ましくは5〜10%の範囲を意味する。したがって、特に反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値は、本発明によって得られると思われる望ましい特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定せず、各数値は、報告されている有効数字を考慮し、通常の丸め技術を使用することによって少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は本質的に、各試験測定値において見られる標準偏差から必ず生じる誤差を含有する。
本発明の説明との関連で(特に、以下の特許請求の範囲との関連で)使用される「a」、「an」、「the」及び同様の指示対象は、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。本明細書における値域の列挙は、該範囲に該当する別個の各値について個別に言及する簡単な方法として機能することを意図するに過ぎない。特に本明細書で指示がない限り、個々の各値は、それが本明細書で個別に列挙されているように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載される方法は全て、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例又は例示的文言(例えば、「など」)の使用は、本発明の理解をより容易にすることを意図するに過ぎず、特許請求の範囲に別様に記載されている本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書における文言は、特許請求の範囲に記載されていない任意の要素であって、本発明の実施に必須の要素を指示すると解釈されるべきではない。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素又は実施態様のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは個別に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書に見られる他の要素と組み合わせて言及および特許請求され得る。便宜上及び/又は特許性の理由により、グループの1つ以上のメンバーがグループに組み入れられ得るか、又はグループから削除され得る。任意のこのような組み入れ又は削除が生じた場合、本明細書は、改変されたグループを含有するので、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの記載要件を満たすと見なされる。
本発明の特定の実施態様は、本発明者が把握する本発明の最良の実施形態を含めて本明細書に記載される。当然のことながら、記載されているこれらの実施態様のバリエーションは、上記説明を読めば当業者には明らかであろう。本発明者は、当業者がこのようなバリエーションを適切に用いると予想し、本発明者は、本発明が、本明細書に具体的に記載されているものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、適用法によって認められているように、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲において列挙されている主題の全ての改変物及び等価物を含む。また、特に本明細書で指示がない限り、又は文脈上明確な矛盾がない限り、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせは本発明によって包含される。
本明細書に開示される特定の実施態様は、からなる又はから本質的になるという文言を使用して特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時からあるか又は補正によって追加されたかにかかわらず、「からなる」という移行語は、特許請求の範囲において特定されていないいかなる要素、工程又は成分も排除する。「から本質的になる」という移行語は、請求項の範囲を特定の材料又は工程に、並びに基本的特徴及び新規特徴に重大な影響を及ぼさないものに限定する。そのようにして特許請求の範囲に記載されている本発明の実施態様は、本明細書において本来的に又は明示的に記載され、使用可能である。
さらに、本明細書を通して、特許及び刊行物に対して多数の言及がなされている。上記で引用される参考文献及び刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に個別に組み入れられる。
最後に、本明細書に開示される本発明の実施態様は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲である。したがって、限定されないが一例として、本発明の代替的な構成は、本明細書における教示にしたがって利用され得る。したがって、本発明は、示され記載されているのと全く同じものに限定されない。
本明細書では、以下の配列が言及されている:
I.材料及び方法
1.細胞培養
層流フードを使用して滅菌条件下で、細胞培養作業を実施した。37℃及び5%CO2一定のインキュベーター内で、全ての細胞を培養した。2D条件下で成長させた細胞の場合、冷ノックアウトDMEM(LIFE TECHNOLOGIES)に再懸濁したMATRIGEL(登録商標)(CORNING)で細胞培養プレート(NUNC(商標), THERMO SCIENTIFIC(商標))をコーティングした。希釈MATRIGEL 1.5mLを6ウェルプレートの各ウェルに追加した。プレートを室温(RT)で一晩保持した。コーティングプレートを4℃で最大1カ月間保存した。
2.脳オルガノイドの作製
Lancasterらによって確立されたプロトコール(Lancaster and Knoblich, 2014a; Lancaster et al., 2013)に若干の改変を加えて、脳オルガノイドを作製した。フィーダー依存性iPSCに代えて、開始集団としてフィーダー非依存性ヒトiPS細胞を使用した。第1段階として、胚様体(EB)を作製した。イントロダクションのセクション1.1に記載されている胚発生と同様に、これらの3D凝集体は、3つの生殖系列(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)への分化を介して細胞特異化を受ける。次に、神経上皮組織の形成が始まり、細胞運命が神経系に限定された。神経上皮組織が発達すると、3D構造をMATRIGEL(これは構造支持を与え、組織が3D形状を維持するのを支援する)の小滴に移した。Engelbroth−Holm−Swarmマウス肉腫に由来するこのマトリックスは、ラミニン、コラーゲンIV、ニドゲン/エナクチン及びプロテオグリカンから構成されるので、細胞外マトリックス(ECM)に似ている。ビタミンAを含有するN2及びB27を補充したNeurobasal培地を使用することによって、神経分化を促す培地中で、MATRIGEL包埋組織を培養した。細胞成長及び生存率を増加させるために、非必須アミノ酸及びGlutaMax(商標)を追加した。還元剤2−メルカプトエタノールは、有毒な酸素ラジカルレベルの形成を防止した。組織を動的条件下に置いて、組織が底部に接着するのを防止した。それは栄養素交換をさらに増加させ、老廃物交換をコントロールする。この目的のために、Lancasterらは、スピニングバイオリアクターを使用した。このプロジェクトでは、約80rpmでスピニングしながら、オービタルシェーカー(IKA(登録商標))上の未処理10cm細胞培養ペトリ皿(GREINER)に組織を置いた。
2.1 ヒト人工多能性幹細胞の維持
CORIELLの野生型ヒト人工多能性幹細胞株を細胞培養6ウェルプレートに播種し、Essential8(商標)培地(LIFE TECHNOLOGIES)中で培養した。70〜80%コンフルエンスで、最後の播種後1週間以内に、細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を吸引し、0.5mM EDTA(INVITROGEN)を追加した。37℃及び5%CO2における4分間のインキュベーション時間後、EDTAを吸引した。PBSで細胞を洗浄し、Essential8(商標)培地に再懸濁した。細胞を新たなコーティング6ウェルプレートに1:3〜1:6の比で播種した。培地を毎日交換した。
2.2 hiPSCの免疫細胞化学的特性評価
ヒトiPS細胞を24ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション2.1に記載されている条件下で培養した。3日後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)によって細胞を4℃で40分間固定し、PBSで5分間にわたって3回洗浄した。0.2%Triton−X−100によって細胞膜を室温で10分間透過処理した。0.05%Triton−X−100 PBS溶液による3回の洗浄工程後、2%NGS+2%BSAの0.05%Triton−X−100 PBS溶液によって細胞を室温で60分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで一次抗体を希釈した(表1を参照のこと)。ウェットチャンバー内のパラフィルム上に、一次抗体溶液 35μl滴を調製した。カバースリップをこの小滴の上に載せ、4℃で一晩インキュベーションした。
翌日、3回交換したPBSでカバースリップを5分間洗浄した。一次抗体に対する二次抗体(表2)をヘキスト色素(INVITROGEN、1:10000)と一緒に希釈し、前述のようにパラフィルム上に小滴を調製した。カバースリップを室温で1時間インキュベーションし、次いで、PBSで3回洗浄し、H2Oで1回洗浄し、蛍光封入剤を使用してガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡(ZEISS LSM 710)を使用して、染色を分析した。
2.3 EBの作製
EBの作製では、PBSでコロニーを1回洗浄し、0.5mM EDTA(INVITROGEN)を使用して分離した。37℃における4分間のインキュベーション期間後、EDTAを予熱StemPro(登録商標)Accutase(登録商標)(LIFE TECHNOLOGIES) 1mlと交換し、細胞を37℃でさらに4分間インキュベーションした。Essential8(商標)培地(LIFE TECHNOLOGIES) 1mlを含む1mlピペットチップを使用して、ディッシュからコロニーを分離した。単一細胞懸濁液を作るために、細胞懸濁液をファルコンチューブに移してトリチュレートした。細胞計数のために、2回反復分の5μlを収集した。細胞を室温、270gで5分間遠心分離し、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター(Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES)を使用して、細胞を計数した。遠心分離後、上清を吸引し、ROCK阻害剤を含有するlow−FGF2 hESC培地(表3) 1mlに細胞を再懸濁した。次に、150μl当たり生細胞 9000個を得るために、low−FGF2 hESC培地を追加した。最後に、150μlを丸底超低接着96ウェルプレート(CORNING)(これは、細胞を沈降させてEBの形成を促す)の各ウェルにプレーティングした。37℃及び5%CO2のインキュベーター内で、細胞を培養した。培地の半分を新鮮low−FGF2 hESC培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。ROCK阻害剤及びlow−FGF2を4日間だけ追加した。
2.4 神経誘導
6日後、カットピペットチップを用いて、境界において明るい平滑縁を有するEBを、神経誘導培地(表4)を含有する超低接着24ウェルプレート(CORNING)に移し、4日間培養した。
2.5 MATRIGEL小滴への神経上皮組織の移動
MATRIGEL小滴を作製するために役立つ基材を調製するために、パラフィルムの角材を200μlピペットチップ用の空のチップトレイに置き、手袋をした指でパラフィルムを穴に押し込むことによって、小さい窪みを作った。窪んだパラフィルムにエタノールを再度噴霧し、層流フード下、ペトリ皿中で乾燥させた。パラフィルムが乾燥したら、神経上皮組織を各窪みに移し、培地を徐々に除去した。次に、MATRIGEL 30μlを慎重に追加し、組織を小滴の中央に置いた(図2.1)。MATRIGELを重合させるために、それを37℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション時間後、ビタミンAを含まない脳オルガノイド分化培地 15ml中に小滴を収集した(表5)。パラフィルムからMATRIGEL小滴を除去するために、小滴が落ちるまでディッシュを穏やかに振盪しながら、滅菌鉗子を使用してシートを保持した。ディッシュを静止条件下のインキュベーター内に置き、48時間後に培地を交換した。静置培養で4日後、培地を、ビタミンAを含有する新鮮分化培地と再度交換した。最後に、約80rpmで振盪しながら、インキュベーター内に設置したオービタルシェーカー上にディッシュを置き、培地を3日ごと又は4日ごとに交換した。
3.中脳オルガノイドの作製
3.1 ヒト神経上皮幹細胞
中脳オルガノイドを作製するために、ヒト神経上皮幹細胞(hNESC)は開始集団として機能した。これらの神経前駆細胞は、ロバストな不死性のエクスパンションが可能であり、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含むCNSの細胞に分化し得、神経堤系統にも分化し得るので、幹細胞の特性を有する。自己複製及びエクスパンションのために、それらは小分子を専ら必要とする。非神経BMP及び背側TGF−βシグナリングの阻害を介して、神経誘導を開始した。不死自己複製状態を維持するために、WNT及びSHHシグナルをトリガーした。WNTシグナリングは、神経板の外側縁において細胞の形成を誘導し、そのアンタゴニストSHHは、腹側神経管運命を規定する。CHIR99021を使用してカノニカルWNTシグナリング経路を刺激し、パルモルファミン(PMA)を追加してSHH経路を刺激した。hNESCは、運動ニューロン及びmDAに効率的に分化し得るので、初期ヒト発生及び神経変性疾患を研究するための強力なツールになる。
3.2 ヒト神経上皮幹細胞の維持
ヒト人工多能性幹細胞から誘導した野生型ヒト神経上皮幹細胞株(hNESC−K7)は、開始集団として機能した(Reinhardt et al., 2013)。新鮮補充N2B27維持培地(表6及び表7)中で、細胞を培養した。最後の播種後1週間以内に、80〜90%コンフルエンスで細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を温StemPro(登録商標)Accutase(登録商標)(LIFE TECHNOLOGIES) 700μlと交換し、細胞を37℃及び5%CO2で4〜6分間インキュベーションした。細胞を温DMEM/F12(LIFE TECHNOLOGIES) 5mlに再懸濁し、200gで3分間遠心分離した。上清を吸引した後、ペレットを補充N2B27維持培地に再懸濁し、コンフルエンスに応じて、細胞を新たなプレートに1:10〜1:20の比で播種した。培地を隔日で交換した。
3.3 hNESCの免疫細胞化学的特性評価
hNESCを24ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション3.2に記載されている条件下で培養した。3日後、4%PFAで細胞を4℃で40分間固定し、PBSで5分間かけて3回洗浄した。セクション2.2に記載されているプロトコールにしたがって、異なる一次抗体(表8)及び対応する二次抗体(表2)を用いて、ICCを実施した。
3.4 三次元hNESCコロニーの作製及びエクスパンション
単一3D hNESCコロニーを作製するために、セクション3.2に記載されているようにhNESCを継代した。遠心分離してN2B27維持培地 1mlに再懸濁した後、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター(Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES)を使用して、細胞を計数した。150μl当たり生細胞 9000個を得るために、N2B27維持培地を追加した。150μlを丸底超低接着96ウェルプレート(CORNING)(これは、細胞が1ウェル当たり1つの単一コロニーを形成することを可能にする)の各ウェルにプレーティングした。培地の半分を新鮮N2B27維持培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。6日後、副次的なコロニーを除去して組織をエクスパンションするために、コロニーを超低接着24ウェルプレート(CORNING)に移した。2日後、セクション2.5に記載されているのと同じ方法で、コロニーをMATRIGEL小滴に包埋した。10cmペトリ皿中、静止維持条件下で、MATRIGEL包埋コロニーを2日間以上培養してから、10日目に、PMAを含有するN2B27分化培地(表9)を用いて分化を開始した。Reinhardt et al. 2013から若干の改変を加えて分化プロトコールを適合した。FGF8は、mDAニューロンへの分化効率を減少させるので、最初の8日間はFGF8を追加しなかった。分化条件下で2日後、ディッシュをオービタルシェーカー上に置き、約80rpmの動的条件下に置いた。培地を3日ごと又は4日ごとに交換した。分化の最初の6日間のみ、PMAを追加した。
4.ヒト大脳オルガノイド及び中脳オルガノイドの免疫組織化学的特性評価
脳発生中に、細胞はそれら自身を再編成し、異なる機能領域及び相互依存領域を形成する。同時に、神経上皮細胞は、CNSの様々なニューロン及び支持グリア細胞に分化する。脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが、発生中のヒト脳に特徴的な異なる細胞型及び脳領域を発達させるかを分析するために、免疫組織化学的(IHC)染色を実施した。神経前駆細胞、幼若ニューロン及び成熟ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ドーパミン作動性ニューロンの存在を分析した。また、免疫蛍光染色を実施して、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが中脳同一性を確立したかを検証した。
4.1 切片化
6日目(n=3)、7日目(n=3)、16日目(n=3)、30日目(n=3)及び44日目(n=8)に、シェーカー上で、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドを4%PFAによって室温で一晩固定した。IHCの前に、900μm超の直径を有するより大きいオルガノイドを切片化した。PBSで固定組織を15分間かけて3回洗浄し、温3%低融点アガロースに包埋し、固体になるまで冷却した。次いで、アガロースのブロックをトリミングし、金属ブロックホルダー上に接着し、0.5mm/秒の速度及び70Hzの周波数でビブラトーム(LEICA, VT100 S)を使用して厚さ150μmに切片化した。
4.2 IHC
TBS+++(0.5%Triton−X−100、0.1%アジ化ナトリウム、0.1%クエン酸ナトリウム及び5%ウシ胎児血清又は正常ヤギ血清を含む1×Tris緩衝生理食塩水)を含有する24ウェルプレートに浮遊アガロース切片を収集し、シェーカー上、室温で少なくとも1時間ブロッキング/透過処理した。TBS+++で一次抗体(表10を参照のこと)を希釈し、抗体溶液 300μlを各ウェルに追加した。シェーカー上で切片を4℃で48時間インキュベーションし、その後、3回交換したTBSで15分間洗浄した。シェーカー上、TBS+++で希釈した二次抗体(表11を参照のこと)で切片を室温で2時間インキュベーションし、続いて、TBSによる3回の洗浄工程を15分間行った。最後に、H2Oで切片をリンスし、封入剤を用いてガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡(ZEISS LSM 710)を使用して、染色を分析した。
II.結果
中脳オルガノイドの作製
1.1 hNESCの免疫細胞化学的特性評価
ヒト神経上皮幹細胞のICCにより、維持条件下における神経前駆体マーカーSOX2及びネスチンの安定発現が明らかになった。hNESCでは、別の神経前駆体マーカーSOX1も発現していたが、蛍光強度が変動した。hNESCでは、FOXA2(腹側神経管のマーカー)がわずかに発現していた。初期分化時には、少数のhNESCが、ニューロン特異的クラスIIIβ−チューブリン(TUJ1)及びダブルコルチン(DCX)(これらは、初期ニューロンの指標である)を発現するニューロンに分化する(図3)。
1.2 中脳オルガノイドの発生
中脳オルガノイドの作製のために、開始集団として野生型hNESC株K7を使用した。丸底超低接着プレート上に播種したヒトNESCは高密度の球状コロニーを形成し、周辺の死細胞はごくわずかであった。いくつかのウェルでは、小さい副次的なコロニーが発達し、数日後、これは主要コロニーと一体化した。最初の3日以内に、コロニーは明るくなり始め、維持条件下で平滑縁を示した(これは、組織が健康であることを示す)。しかしながら、8日目の初期オルガノイドは、中央において暗いコアを発達させた(これは、細胞死を示す)(図4a、b)。2日間の分化後、オルガノイドは、組織の表面に沿って小さい突起を発達させた(図4c)。3週間以内に、突起は伸びて約1mmの長さに達し、コロニーの外側の細胞体はごくわずかであった。MATRIGEL支持がないコロニーでは、これは観察されなかった(図4d〜f)。
1.細胞培養
層流フードを使用して滅菌条件下で、細胞培養作業を実施した。37℃及び5%CO2一定のインキュベーター内で、全ての細胞を培養した。2D条件下で成長させた細胞の場合、冷ノックアウトDMEM(LIFE TECHNOLOGIES)に再懸濁したMATRIGEL(登録商標)(CORNING)で細胞培養プレート(NUNC(商標), THERMO SCIENTIFIC(商標))をコーティングした。希釈MATRIGEL 1.5mLを6ウェルプレートの各ウェルに追加した。プレートを室温(RT)で一晩保持した。コーティングプレートを4℃で最大1カ月間保存した。
2.脳オルガノイドの作製
Lancasterらによって確立されたプロトコール(Lancaster and Knoblich, 2014a; Lancaster et al., 2013)に若干の改変を加えて、脳オルガノイドを作製した。フィーダー依存性iPSCに代えて、開始集団としてフィーダー非依存性ヒトiPS細胞を使用した。第1段階として、胚様体(EB)を作製した。イントロダクションのセクション1.1に記載されている胚発生と同様に、これらの3D凝集体は、3つの生殖系列(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)への分化を介して細胞特異化を受ける。次に、神経上皮組織の形成が始まり、細胞運命が神経系に限定された。神経上皮組織が発達すると、3D構造をMATRIGEL(これは構造支持を与え、組織が3D形状を維持するのを支援する)の小滴に移した。Engelbroth−Holm−Swarmマウス肉腫に由来するこのマトリックスは、ラミニン、コラーゲンIV、ニドゲン/エナクチン及びプロテオグリカンから構成されるので、細胞外マトリックス(ECM)に似ている。ビタミンAを含有するN2及びB27を補充したNeurobasal培地を使用することによって、神経分化を促す培地中で、MATRIGEL包埋組織を培養した。細胞成長及び生存率を増加させるために、非必須アミノ酸及びGlutaMax(商標)を追加した。還元剤2−メルカプトエタノールは、有毒な酸素ラジカルレベルの形成を防止した。組織を動的条件下に置いて、組織が底部に接着するのを防止した。それは栄養素交換をさらに増加させ、老廃物交換をコントロールする。この目的のために、Lancasterらは、スピニングバイオリアクターを使用した。このプロジェクトでは、約80rpmでスピニングしながら、オービタルシェーカー(IKA(登録商標))上の未処理10cm細胞培養ペトリ皿(GREINER)に組織を置いた。
2.1 ヒト人工多能性幹細胞の維持
CORIELLの野生型ヒト人工多能性幹細胞株を細胞培養6ウェルプレートに播種し、Essential8(商標)培地(LIFE TECHNOLOGIES)中で培養した。70〜80%コンフルエンスで、最後の播種後1週間以内に、細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を吸引し、0.5mM EDTA(INVITROGEN)を追加した。37℃及び5%CO2における4分間のインキュベーション時間後、EDTAを吸引した。PBSで細胞を洗浄し、Essential8(商標)培地に再懸濁した。細胞を新たなコーティング6ウェルプレートに1:3〜1:6の比で播種した。培地を毎日交換した。
2.2 hiPSCの免疫細胞化学的特性評価
ヒトiPS細胞を24ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション2.1に記載されている条件下で培養した。3日後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)によって細胞を4℃で40分間固定し、PBSで5分間にわたって3回洗浄した。0.2%Triton−X−100によって細胞膜を室温で10分間透過処理した。0.05%Triton−X−100 PBS溶液による3回の洗浄工程後、2%NGS+2%BSAの0.05%Triton−X−100 PBS溶液によって細胞を室温で60分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーで一次抗体を希釈した(表1を参照のこと)。ウェットチャンバー内のパラフィルム上に、一次抗体溶液 35μl滴を調製した。カバースリップをこの小滴の上に載せ、4℃で一晩インキュベーションした。
翌日、3回交換したPBSでカバースリップを5分間洗浄した。一次抗体に対する二次抗体(表2)をヘキスト色素(INVITROGEN、1:10000)と一緒に希釈し、前述のようにパラフィルム上に小滴を調製した。カバースリップを室温で1時間インキュベーションし、次いで、PBSで3回洗浄し、H2Oで1回洗浄し、蛍光封入剤を使用してガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡(ZEISS LSM 710)を使用して、染色を分析した。
2.3 EBの作製
EBの作製では、PBSでコロニーを1回洗浄し、0.5mM EDTA(INVITROGEN)を使用して分離した。37℃における4分間のインキュベーション期間後、EDTAを予熱StemPro(登録商標)Accutase(登録商標)(LIFE TECHNOLOGIES) 1mlと交換し、細胞を37℃でさらに4分間インキュベーションした。Essential8(商標)培地(LIFE TECHNOLOGIES) 1mlを含む1mlピペットチップを使用して、ディッシュからコロニーを分離した。単一細胞懸濁液を作るために、細胞懸濁液をファルコンチューブに移してトリチュレートした。細胞計数のために、2回反復分の5μlを収集した。細胞を室温、270gで5分間遠心分離し、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター(Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES)を使用して、細胞を計数した。遠心分離後、上清を吸引し、ROCK阻害剤を含有するlow−FGF2 hESC培地(表3) 1mlに細胞を再懸濁した。次に、150μl当たり生細胞 9000個を得るために、low−FGF2 hESC培地を追加した。最後に、150μlを丸底超低接着96ウェルプレート(CORNING)(これは、細胞を沈降させてEBの形成を促す)の各ウェルにプレーティングした。37℃及び5%CO2のインキュベーター内で、細胞を培養した。培地の半分を新鮮low−FGF2 hESC培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。ROCK阻害剤及びlow−FGF2を4日間だけ追加した。
2.4 神経誘導
6日後、カットピペットチップを用いて、境界において明るい平滑縁を有するEBを、神経誘導培地(表4)を含有する超低接着24ウェルプレート(CORNING)に移し、4日間培養した。
2.5 MATRIGEL小滴への神経上皮組織の移動
MATRIGEL小滴を作製するために役立つ基材を調製するために、パラフィルムの角材を200μlピペットチップ用の空のチップトレイに置き、手袋をした指でパラフィルムを穴に押し込むことによって、小さい窪みを作った。窪んだパラフィルムにエタノールを再度噴霧し、層流フード下、ペトリ皿中で乾燥させた。パラフィルムが乾燥したら、神経上皮組織を各窪みに移し、培地を徐々に除去した。次に、MATRIGEL 30μlを慎重に追加し、組織を小滴の中央に置いた(図2.1)。MATRIGELを重合させるために、それを37℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション時間後、ビタミンAを含まない脳オルガノイド分化培地 15ml中に小滴を収集した(表5)。パラフィルムからMATRIGEL小滴を除去するために、小滴が落ちるまでディッシュを穏やかに振盪しながら、滅菌鉗子を使用してシートを保持した。ディッシュを静止条件下のインキュベーター内に置き、48時間後に培地を交換した。静置培養で4日後、培地を、ビタミンAを含有する新鮮分化培地と再度交換した。最後に、約80rpmで振盪しながら、インキュベーター内に設置したオービタルシェーカー上にディッシュを置き、培地を3日ごと又は4日ごとに交換した。
3.中脳オルガノイドの作製
3.1 ヒト神経上皮幹細胞
中脳オルガノイドを作製するために、ヒト神経上皮幹細胞(hNESC)は開始集団として機能した。これらの神経前駆細胞は、ロバストな不死性のエクスパンションが可能であり、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含むCNSの細胞に分化し得、神経堤系統にも分化し得るので、幹細胞の特性を有する。自己複製及びエクスパンションのために、それらは小分子を専ら必要とする。非神経BMP及び背側TGF−βシグナリングの阻害を介して、神経誘導を開始した。不死自己複製状態を維持するために、WNT及びSHHシグナルをトリガーした。WNTシグナリングは、神経板の外側縁において細胞の形成を誘導し、そのアンタゴニストSHHは、腹側神経管運命を規定する。CHIR99021を使用してカノニカルWNTシグナリング経路を刺激し、パルモルファミン(PMA)を追加してSHH経路を刺激した。hNESCは、運動ニューロン及びmDAに効率的に分化し得るので、初期ヒト発生及び神経変性疾患を研究するための強力なツールになる。
3.2 ヒト神経上皮幹細胞の維持
ヒト人工多能性幹細胞から誘導した野生型ヒト神経上皮幹細胞株(hNESC−K7)は、開始集団として機能した(Reinhardt et al., 2013)。新鮮補充N2B27維持培地(表6及び表7)中で、細胞を培養した。最後の播種後1週間以内に、80〜90%コンフルエンスで細胞を継代した。表面から細胞を分離するために、培地を温StemPro(登録商標)Accutase(登録商標)(LIFE TECHNOLOGIES) 700μlと交換し、細胞を37℃及び5%CO2で4〜6分間インキュベーションした。細胞を温DMEM/F12(LIFE TECHNOLOGIES) 5mlに再懸濁し、200gで3分間遠心分離した。上清を吸引した後、ペレットを補充N2B27維持培地に再懸濁し、コンフルエンスに応じて、細胞を新たなプレートに1:10〜1:20の比で播種した。培地を隔日で交換した。
3.3 hNESCの免疫細胞化学的特性評価
hNESCを24ウェルプレート中のカバースリップ上に播種し、セクション3.2に記載されている条件下で培養した。3日後、4%PFAで細胞を4℃で40分間固定し、PBSで5分間かけて3回洗浄した。セクション2.2に記載されているプロトコールにしたがって、異なる一次抗体(表8)及び対応する二次抗体(表2)を用いて、ICCを実施した。
3.4 三次元hNESCコロニーの作製及びエクスパンション
単一3D hNESCコロニーを作製するために、セクション3.2に記載されているようにhNESCを継代した。遠心分離してN2B27維持培地 1mlに再懸濁した後、トリパンブルーを用いた自動細胞カウンター(Countess II FL LIFE TECHNOLOGIES)を使用して、細胞を計数した。150μl当たり生細胞 9000個を得るために、N2B27維持培地を追加した。150μlを丸底超低接着96ウェルプレート(CORNING)(これは、細胞が1ウェル当たり1つの単一コロニーを形成することを可能にする)の各ウェルにプレーティングした。培地の半分を新鮮N2B27維持培地と交換することによって、培地を隔日で交換した。6日後、副次的なコロニーを除去して組織をエクスパンションするために、コロニーを超低接着24ウェルプレート(CORNING)に移した。2日後、セクション2.5に記載されているのと同じ方法で、コロニーをMATRIGEL小滴に包埋した。10cmペトリ皿中、静止維持条件下で、MATRIGEL包埋コロニーを2日間以上培養してから、10日目に、PMAを含有するN2B27分化培地(表9)を用いて分化を開始した。Reinhardt et al. 2013から若干の改変を加えて分化プロトコールを適合した。FGF8は、mDAニューロンへの分化効率を減少させるので、最初の8日間はFGF8を追加しなかった。分化条件下で2日後、ディッシュをオービタルシェーカー上に置き、約80rpmの動的条件下に置いた。培地を3日ごと又は4日ごとに交換した。分化の最初の6日間のみ、PMAを追加した。
4.ヒト大脳オルガノイド及び中脳オルガノイドの免疫組織化学的特性評価
脳発生中に、細胞はそれら自身を再編成し、異なる機能領域及び相互依存領域を形成する。同時に、神経上皮細胞は、CNSの様々なニューロン及び支持グリア細胞に分化する。脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが、発生中のヒト脳に特徴的な異なる細胞型及び脳領域を発達させるかを分析するために、免疫組織化学的(IHC)染色を実施した。神経前駆細胞、幼若ニューロン及び成熟ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ドーパミン作動性ニューロンの存在を分析した。また、免疫蛍光染色を実施して、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドが中脳同一性を確立したかを検証した。
4.1 切片化
6日目(n=3)、7日目(n=3)、16日目(n=3)、30日目(n=3)及び44日目(n=8)に、シェーカー上で、脳オルガノイド及び中脳オルガノイドを4%PFAによって室温で一晩固定した。IHCの前に、900μm超の直径を有するより大きいオルガノイドを切片化した。PBSで固定組織を15分間かけて3回洗浄し、温3%低融点アガロースに包埋し、固体になるまで冷却した。次いで、アガロースのブロックをトリミングし、金属ブロックホルダー上に接着し、0.5mm/秒の速度及び70Hzの周波数でビブラトーム(LEICA, VT100 S)を使用して厚さ150μmに切片化した。
4.2 IHC
TBS+++(0.5%Triton−X−100、0.1%アジ化ナトリウム、0.1%クエン酸ナトリウム及び5%ウシ胎児血清又は正常ヤギ血清を含む1×Tris緩衝生理食塩水)を含有する24ウェルプレートに浮遊アガロース切片を収集し、シェーカー上、室温で少なくとも1時間ブロッキング/透過処理した。TBS+++で一次抗体(表10を参照のこと)を希釈し、抗体溶液 300μlを各ウェルに追加した。シェーカー上で切片を4℃で48時間インキュベーションし、その後、3回交換したTBSで15分間洗浄した。シェーカー上、TBS+++で希釈した二次抗体(表11を参照のこと)で切片を室温で2時間インキュベーションし、続いて、TBSによる3回の洗浄工程を15分間行った。最後に、H2Oで切片をリンスし、封入剤を用いてガラススライド上にマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡(ZEISS LSM 710)を使用して、染色を分析した。
II.結果
中脳オルガノイドの作製
1.1 hNESCの免疫細胞化学的特性評価
ヒト神経上皮幹細胞のICCにより、維持条件下における神経前駆体マーカーSOX2及びネスチンの安定発現が明らかになった。hNESCでは、別の神経前駆体マーカーSOX1も発現していたが、蛍光強度が変動した。hNESCでは、FOXA2(腹側神経管のマーカー)がわずかに発現していた。初期分化時には、少数のhNESCが、ニューロン特異的クラスIIIβ−チューブリン(TUJ1)及びダブルコルチン(DCX)(これらは、初期ニューロンの指標である)を発現するニューロンに分化する(図3)。
1.2 中脳オルガノイドの発生
中脳オルガノイドの作製のために、開始集団として野生型hNESC株K7を使用した。丸底超低接着プレート上に播種したヒトNESCは高密度の球状コロニーを形成し、周辺の死細胞はごくわずかであった。いくつかのウェルでは、小さい副次的なコロニーが発達し、数日後、これは主要コロニーと一体化した。最初の3日以内に、コロニーは明るくなり始め、維持条件下で平滑縁を示した(これは、組織が健康であることを示す)。しかしながら、8日目の初期オルガノイドは、中央において暗いコアを発達させた(これは、細胞死を示す)(図4a、b)。2日間の分化後、オルガノイドは、組織の表面に沿って小さい突起を発達させた(図4c)。3週間以内に、突起は伸びて約1mmの長さに達し、コロニーの外側の細胞体はごくわずかであった。MATRIGEL支持がないコロニーでは、これは観察されなかった(図4d〜f)。
1.3 ヒト中脳オルガノイドの免疫組織化学的特性評価
維持条件下における6日目及び7日目の初期中脳オルガノイドを切片化せずに染色した。発生中の三次元ヒトNESCコロニーは、神経前駆体マーカーSOX2及びネスチンの安定発現、並びに初期分化幼若ニューロンを示した(図5)。コロニー全体にわたって、放射状に組織化された前駆細胞によって取り囲まれた小さい空洞が発達した。
分化条件下における後期の中脳オルガノイドは高密度のニューロンネットワークを発達させ、これは、肉眼的な形態学的変化と一致して徐々に複雑化した。ドーパミン作動性ニューロンのマーカー(TUJ1/TH)を用いた免疫蛍光染色により、16日目において既にいくつかのDAニューロンが発達し、後期には密度が増加することが明らかになった。注目すべきことに、DAニューロンは別個の領域に位置していたが、これは、in vivoにおける脳発生と一致して、3D構造の非対称極性組織化を示唆している(図6、図7)。中脳オルガノイドにおけるDAニューロンをさらに分析するために、THと一緒に成熟ニューロンマーカーMAP2の染色を実施した。同じオルガノイドの異なる切片の染色により、成熟ニューロンはオルガノイドの最外部に位置し、幼若TUJ1陽性ニューロンは内部コアにおいてより豊富であったことが明らかになった(図7a、c)。興味深いことに、成熟ニューロンの一部もTHを発現していたが、これは、中脳オルガノイドにおける成熟DAニューロンの存在を示している。加えて、神経前駆体マーカーSOX2の染色により、後期において、いくつかの神経前駆細胞がオルガノイドの内部コアを取り囲んでいたことが示された。TH陽性DAニューロンは、神経前駆細胞の層に隣接して位置していた(図7)。
中脳オルガノイドの細胞構成をさらに調べるために、GFAP(アストロサイト)及びO4(オリゴデンドロサイト)を含むグリア細胞マーカーの染色を実施した。中脳オルガノイドのいくつかの領域では、O4陽性及びTUJ1陰性細胞が同定されたが、これは、後期中脳オルガノイドにおけるオリゴデンドロサイトの発生を示している(図8a〜c)。中脳オルガノイドでは、アストロサイトはほとんど見られなかった。しかしながら、組織全体にわたって(図8c)、及び少数のGFAP陽性細胞(図8d)において、関連細胞体を有しないいくつかのGFAP陽性突起が観察された。
最後に、中脳マーカーLMX1A、FOXA2及びEN1について、後期の中脳オルガノイドを染色した。分析した切片及びオルガノイド内では、これらの転写因子を発現する細胞は見られなかった。いくつかの細胞はLMX1A発現の証拠を示したが、それは核内には存在せずに散在しており、非特異的結合を潜在的に示している。全体として、このデータは、中脳オルガノイドが様々な神経細胞型を発達させ、非対称極性の組織を示すことを示している。
2.ヒト中脳特異的オルガノイドのさらなる作製
2.1 材料及び方法
2.1.1 中脳オルガノイドの培養
以前に記載されているように(Reinhardt, et al. “Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.” PloS one 8, e59252)、hiPSC由来hNESCを培養した。オルガノイド培養の0日目に、アキュターゼを用いて20継代未満のhNESCを37℃で5分間処理し、続いて、穏やかにピペッティングして単一細胞を得た。合計9000個の細胞を超低接着96ウェル丸底プレート(Corning)の各ウェルに播種し、3μM CHIR−99021(Axon Medchem)、0.75μMパルモルファミン(Enzo Life Science)及び150μMアスコルビン酸(Sigma)を補充したN2B27培地(N2B27維持培地と称される)中で培養した。N2B27培地は、DMEM−F12(Invitrogen)/Neurobasal(Invitrogen)50:50と、1:200 N2サプリメント(Invitrogen)、ビタミンAを欠く1:100 B27サプリメント(Invitrogen)、1%L−グルタミン及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)とからなる。培地を6日間にわたって隔日で交換し、次いで、3Dコロニーを超低接着24ウェルプレート(Corning)に移し、N2B27維持培地中で培養した。
オルガノイド培養の8日目に、以前に記載されているように(Lancaster and Knoblich (2014) “Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.” Nature protocols 9, 2329-2340)、3DコロニーをhESC-qualified Matrigel (BD Bioscience)の小滴に移した。短期培養の場合には10cmペトリ皿、又は長期培養の場合には1滴/ウェルの超低接着24ウェルプレート(Corning)において、N2B27維持培地中でこの小滴を培養した。10日目に、10ng/ml hBDNF(Peprotech)、10ng/ml hGDNF(Peprotech)、500μM dbcAMP(Peprotech)、200μMアスコルビン酸(Sigma)及び1ng/ml TGF−β3(Peprotech)を補充したN2B27培地を用いて、分化を開始させた。加えて、1μMパルモルファミン(Enzo Life Science)をこの培地にさらに6日間追加した。オルガノイド培養の14日目に、インキュベーター(5%CO2、37℃)内のオービタルシェーカー(IKA)(80rpmで回転)上にプレートを置き、オルガノイドを培養状態に保ち、培地を2日ごと又は3日ごとに交換した。
2.1.2 免疫組織化学的分析
4%パラホルムアルデヒドを用いてオルガノイドを室温で一晩固定し、PBSで1時間にわたって3回洗浄した。その後、それらをPBS中3%低融点アガロースに包埋し、37℃で15分間インキュベーションし、続いて、室温で30分間インキュベーションした。固体アガロースブロックをPBSでカバーし、4℃で一晩置いた。特に指示がない場合、ビブラトーム(Leica VT1000s)を使用して50μm切片を切断し、0.5%Triton X−100 PBS溶液で切片を透過処理し、2.5%BSA、0.1%Triton X−100及び0.1%アジ化ナトリウムを含む2.5%正常ヤギ又はロバ血清でブロッキングした。シェーカー上で、以下の希釈のブロッキングバッファー中、切片を一次抗体と共に4℃で48〜72時間インキュベーションした:ウサギ抗TH(1:1000、Abcam)、ニワトリ抗TH(1:1000、Abcam)、ウサギ抗TH(1:1000、Santa Cruz Biotechnology)、ヤギ抗SOX2(1:200、R&D Systems)、ウサギ抗SOX2(1:100、Abcam)、ヤギ抗SOX1(1:100、R&D Systems)、マウス抗ネスチン(1:200、BD)、マウス抗Ki67(1:200、BD)、ウサギ抗CC3(1:200、Cell Signalling)、マウス抗FOXA2(1:250、Santa Cruz Biotechnology)、ウサギ抗LMX1A(1:200、Abcam)、ニワトリ抗GFAP(1:1000、Millipore)、マウス抗S100β(1:1000、Abcam)、マウス抗TUJ1(1:600、Covance)、ウサギ抗TUJ1(1:600、Covance)、ニワトリ抗TUJ1(1:600 Millipore)、ウサギ抗PAX6(1:300、Covance)、マウス抗シナプトフィジン(1:50 Abcam)、ウサギ抗PSD−95(1:300、Invitrogen)、マウス抗MAP2(1:200、Millipore)、マウス抗CNPase(1:200、Abcam)及びマウス抗O4(1:400、Sigma)。一次抗体と共にインキュベーションした後、0.05%Triton X−100で切片を3回洗浄し、シェーカー上、室温で30分間ブロッキングし、続いて、0.1%Triton X−100中二次抗体(1:1000)と共にインキュベーションした。全ての二次抗体(Invitrogen)をAlexa Fluor蛍光色素にコンジュゲートした。製造業者のプロトコールにしたがってSTAINperfect Immunostaining Kit (ImmuSmol)を使用して、ドーパミンを検出した。ニワトリ抗TH一次抗体(Abcam)で切片を共染色し、Hoechst 33342(Invitrogen)で核を対比染色した。切片をFluoromount-G封入剤(Southern Biotech)にマウントし、共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss LSM 710)を用いて分析した。Zenソフトウェア(Zeiss)及びImageJを用いて、画像をさらに加工した。Imarisソフトウェア(Bitplane)を使用して、共焦点z−スタックの三次元表面再構成を作った。ImageJ Interactive3D表面プロットプラグインを用いて蛍光強度に基づいて、DNの非対称分布を評価した。
2.1.3 定量的リアルタイムPCR
48日齢のオルガノイドから、全RNAを単離した。典型的には、1回の単離のために、5つのオルガノイドをプールした。解離のために、PBSでオルガノイドを1回洗浄し、QIAzol溶解試薬(Qiagen)で溶解し、針を3回通過させ、QIAshredderカラム(Qiagen)でホモジナイズした。製造業者の説明書にしたがってRNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用して、RNAを単離した。続いて、High Capacity RNA to DNA Kit (Thermo Fisher Scientific)のプロトコールにしたがって、単離したRNAを逆転写した。Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific)を用いて、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を行った。以下のようにAriaMx Real-time PCR System (Agilent Technologies)によって、cDNA 1μgの増幅を実施した:初期変性工程、95℃で10分間、95℃で15秒間の変性を40サイクル、60℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で30秒間の伸長。比較Ct法2−ΔΔCtを使用して、ハウスキーピング遺伝子RPL37Aの発現に対して、発現レベルを正規化した。中脳オルガノイドの発現パターンを評価するために、この値をhNESCの発現レベルと比較し、これを1に設定した。融解曲線分析によって、PCR産物の品質を評価した。
2.1.4 電気生理学的活性の評価
カルシウムイメージング及び多電極アレイ(MEA)記録を使用して、それぞれ50〜52日目及び60〜70日目におけるオルガノイドの自発活性を分析した。濃度5μMの細胞浸透Fluo-4 AM (Life Technologies)のneurobasal培地をウェルに追加し、オービタルシェーカー上、37℃で45分間インキュベーションした。CMOSカメラ(Orca Flash 4.0, Hamamatsu)を備える生細胞回転盤共焦点顕微鏡(Zeiss)を使用して、蛍光画像を取得した。カルシウム時系列を5Hzで約2分間取得し、単一の画像として保存した。ADINAツールボックス(Diego et al. (2013) “Automated identification of neuronal activity from calcium imaging by sparse dictionary learning.” Proceedings of the IEEE 10th International Symposium on Biomedical Imaging, pp. 1058-1061)(これは、個々の細胞体を自動的にセグメント化し、重複するものを分けるために開発された公的に入手可能なソフトウェアである)を使用して、これらの画像を分析した。次いで、セグメント化した細胞体について、蛍光強度(ΔF/F)の相対変化として表される蛍光トレースを測定した。
Axion BioSystemsのMaestroシステムを使用して、MEA記録を行った。1ウェル当たり16電極アレイを含有する48ウェルMEAプレートを0.1mg/mlポリ−D−リジン臭化水素酸塩(Sigma-Aldrich)によってプレコーティングし、続いて、10μg/mlラミニン(Sigma-Aldrich)によって室温(RT)で1時間コーティングした。60〜70日後に、中脳オルガノイドをアレイ上に置いた。カバースリップを上に置いて、浮遊オルガノイドを電極と確実に接触させた。ニューロン成熟培地中、5分間〜最大5日間にわたって12.5kHzのサンプリング速度で、自発活性を37.5℃で記録した。Axion Integrated Studio (AxIS 2.1)を使用して、200〜3000Hzのカットオフ周波数及び6×SDの閾値を有するButterworthバンドパスフィルタを、偽陽性及び検出ミスの両方を最小化するように設定した。Neural Metric Tool (Axion BioSystems)を使用して、スパイクラスタプロットを分析した。平均が5スパイク/分以上の電極を活性と定義した。記録から作成したスパイクカウントファイルを使用して、スパイク数/活性電極/測定を計算した。MEAシステムに関するさらなる詳細は、以前に記載されている(Bardy et al. (2015) “Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, E2725-2734)。
2.2 結果
以前に記載されている神経上皮幹細胞(Reinhardt et al. “Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.” PloS one 8, e59252)を、ヒト中脳オルガノイドの作製のための開始集団として使用した。開始集団としてのiPSCと比較して、NESCは、中脳/後脳同一性に既にパターン形成されている。
典型的には、オルガノイド作製の前に、NESCは、神経前駆体マーカーSOX1、SOX2、PAX6及びネスチンを発現する。細胞が三次元コロニーを形成することを可能にする丸底超低接着96ウェルプレートに細胞を播種した。GSK3b阻害剤CHIR99021の存在下でそれらを培養してカノニカルWNTシグナリング経路を刺激し、パルモルファミン(PMA)を使用してSHH経路を活性化した。8日目に、構造支持のために、三次元NESCコロニーをMATRIGELの小滴に包埋し、2日後、培地を分化培地に交換することによって、中脳オルガノイドへの特異化を開始させた。本発明者らは、オルガノイドを、短期培養の場合には10cmペトリ皿に、又は長期培養の場合には超低接着24ウェルプレートに置き、約80rpmで回転するオービタルシェーカー上にそれらを置いた(図9A)。
約27日間の全手順の後(中脳オルガノイドへの約16日間の分化後)、初期中脳オルガノイドは細胞増殖マーカーKi67を広く発現していたが、これは成熟時には減少した(図9B)。さらに、これらのオルガノイドは神経前駆体マーカーSOX2を発現したが、これも成熟中には減少し、幹細胞ニッチの形成に似てより局所限定的になる(図9C)。重要なことに、NESCからの中脳オルガノイドの作製は再現可能であり、有意な変動はなかった。
2.1 ヒト神経上皮幹細胞由来中脳オルガノイドの神経細胞分化及び自己組織化
増殖の減少及び幹細胞同一性を示した後、中脳ドーパミン作動性ニューロン(mDN)のニューロン分化及び特異化を評価した。TUJ1陽性ニューロン及びTH陽性DNへのロバストな分化を観察することができた。これらの染色により、複雑なニューロンネットワークの形成が明らかになった(図10A、2B)。成熟ニューロンマーカーMAP2/THの二重陽性染色により、オルガノイド内のDNの成熟が実証された。NESC由来オルガノイドは、中脳同一性を有するDNへの分化を受けるかをさらに調べた。後期オルガノイドでは、TH、LMX1A及びFOXA2陽性ニューロンの大集団が観察された(図10C〜E)。qRT−PCRにより、LMX1A、LMX1B、EN1、NURR1、AADC及びTHを含むmDN分化マーカーのアップレギュレーションがさらに明らかになった(図10F、10G)。これらのデータは、得られたドーパミン作動性ニューロンが実際に中脳同一性を有することを示している。
NESC由来中脳オルガノイドにおける空間的組織化の程度を調べるために、本発明者らは、DAニューロンマーカーTUJ1/THの分布パターンを評価し、表面プロットを使用して結果を示した。印象的なことに、本発明者らは、DAニューロンが、中脳オルガノイド内で明確な特定クラスタを形成することを見出した(図10H、10I)。
TH陽性ニューロンの同一性がドーパミン作動性であることをさらに実証するために、本発明者らは、神経伝達物質ドーパミンを産生するそれらの能力を分析した。成熟オルガノイドの免疫染色により、ドーパミン及びTH二重陽性細胞の存在が実証された(図10J)。これらの結果により、NESC由来オルガノイドのmDNが、空間的にパターン形成された複雑かつ機能的な神経組織に自己組織化することが示された。
3.中脳オルガノイドにおけるグリア分化
胎児ヒト脳の発生中、神経管由来細胞はニューロンに分化するだけではなく、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞にも分化する。したがって、中脳オルガノイドにおけるこれらのグリア細胞の存在を調査した。時間的には神経分化の後にグリア分化が起こる脳発生とよく一致して、(全手順の27日目、すなわち、中脳オルガノイド/初期オルガノイドへの分化開始の16日後の)オルガノイドでは、有意な量のグリア細胞は検出されなかった。しかしながら、(全手順の61日目、すなわち、中脳オルガノイドへの約51日間の分化後の)より成熟したオルガノイドでは、本発明者らは、マーカーS100β及びGFAPについて陽性のアストロサイトを観察した。興味深いことに、休止状態(GFAP陰性)及び反応状態(GFAP発現を特徴とする)の両方のアストロサイトの集団が得られた(図11A、B)。
また、全手順の44日目(中脳オルガノイドへの分化の約34日目)に、O4陽性オリゴデンドロサイトに分化した細胞分画が検出された。さらに、興味深いことに、これらのオリゴデンドロサイトは、典型的には、オルガノイド内で空間的非対称分布を示した(示さず)。中枢神経系では、成熟オリゴデンドロサイトはミエリン鞘(これは軸索を包んで、軸索に沿った活動電位の伝達を促進する)を形成する。中脳オルガノイド内のオリゴデンドロサイトがそれらの実際の機能(すなわち、ミエリン鞘の形成)を実行することができるかを分析するために、本発明者らは、ニューロンマーカーTUJ1と一緒に2’,3’−サイクリックヌクレオチド3’−ホスホジエステラーゼ(CNPase)(ミエリン関連酵素)に対する免疫蛍光染色を実施した。これらの染色の3D表面再構築により、CNPase陽性オリゴデンドロサイトのミエリン鞘によって覆われた多数のTUJ1陽性神経突起が明らかになった(図11C)。興味深いことに、これらの神経突起は、多くの場合、ランビエ絞輪(これは、跳躍的な高速のニューロン伝達を可能にする)の形成に似た鞘形成の間隙を示した(図11C)。
4.中脳オルガノイドの機能性
ニューロン伝達の1つの重要な要件は、シナプス結合の形成を介した成熟ニューロンネットワークの発達である。したがって、61日目(中脳オルガノイドへの51日間の分化)に、前シナプスマーカーのシナプトフィジン及び後シナプスマーカーのPSD95に対する免疫組織学的染色を使用して、シナプス接続を調査した。その後の3D表面再構築により、多数の前シナプス斑点及び後シナプス斑点の形成だけではなく複数のシナプス結合も実証された(図11D)。シナプトフィジン陽性の前シナプスとPSD95陽性の後シナプスとの直接接触によって示されているように、異なる神経突起間でシナプス結合が形成されていた(図11E)。したがって、中脳オルガノイドは、シナプス結合を介してシグナルを送る能力を示すので、電気生理学的に機能的であるための前提条件を満たす。
それらの機能性及びニューロンネットワーク活性をさらに確認するために、本発明者らは、オルガノイド全体に対してFluo-4AMカルシウムイメージングを実施した。本発明者らは、活動電位によって誘発されたカルシウム移行に基づいて自発ニューロン活性を測定した(図12A、B)。注目すべきことに、蛍光トレースのいくつかは規則的な発火パターン(これは、緊張性電気生理学的活性の指標である)を示し、ドーパミン作動性ニューロンのペースメーカー活性に似ていた(Moreno et al. (2015), “Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture.” Lab on a chip 15, 2419-2428; Cummings et al. (2014)” Alzheimer’s disease drug-development pipeline: few candidates, frequent failures.” Alzheimer’s research & therapy 6, 37)。カルシウムイメージングに加えて、多電極アレイ(MEA)システムを使用して、電気生理学的活性を調べた。この方法論は、活動電位によって生成される細胞外電場電位の非侵襲的記録を可能にする。60〜70日目(50〜60の分化)に、48ウェル組織培養プレート中で、中脳オルガノイドを16電極のグリッド上に置いた(図12C)。単相スパイク及び二相スパイクの形態の個々の電極によって、自発活性を数日間にわたって検出した(26.12±5.1スパイク/活性電極(n≧3)、図12D、E)。さらに、スパイクは、近いタイミングで複数の電極上で発生したが、これは、ニューロンネットワーク同期性を表す(図12F)。これらの知見は、中脳オルガノイドが機能的シナプス結合を発達させ、自発ニューロン活性を示すことを示している。
参考文献
それらの機能性及びニューロンネットワーク活性をさらに確認するために、本発明者らは、オルガノイド全体に対してFluo-4AMカルシウムイメージングを実施した。本発明者らは、活動電位によって誘発されたカルシウム移行に基づいて自発ニューロン活性を測定した(図12A、B)。注目すべきことに、蛍光トレースのいくつかは規則的な発火パターン(これは、緊張性電気生理学的活性の指標である)を示し、ドーパミン作動性ニューロンのペースメーカー活性に似ていた(Moreno et al. (2015), “Differentiation of neuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture.” Lab on a chip 15, 2419-2428; Cummings et al. (2014)” Alzheimer’s disease drug-development pipeline: few candidates, frequent failures.” Alzheimer’s research & therapy 6, 37)。カルシウムイメージングに加えて、多電極アレイ(MEA)システムを使用して、電気生理学的活性を調べた。この方法論は、活動電位によって生成される細胞外電場電位の非侵襲的記録を可能にする。60〜70日目(50〜60の分化)に、48ウェル組織培養プレート中で、中脳オルガノイドを16電極のグリッド上に置いた(図12C)。単相スパイク及び二相スパイクの形態の個々の電極によって、自発活性を数日間にわたって検出した(26.12±5.1スパイク/活性電極(n≧3)、図12D、E)。さらに、スパイクは、近いタイミングで複数の電極上で発生したが、これは、ニューロンネットワーク同期性を表す(図12F)。これらの知見は、中脳オルガノイドが機能的シナプス結合を発達させ、自発ニューロン活性を示すことを示している。
参考文献
Claims (53)
- 中脳オルガノイドを作製するための方法であって、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と分化培地とを接触させることを含み、ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、それにより、中脳オルガノイドを取得する、方法。
- 前記神経上皮幹細胞がヒト神経上皮幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経上皮幹細胞がhNESC−K7又はsmNPCである、請求項2に記載の方法。
- 前記神経上皮幹細胞が、遺伝子改変されたものであるか、又は神経学的疾患を患っている患者から取得されたものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子改変が突然変異、ノックアウト又はノックインを含む、請求項4に記載の方法。
- 神経学的疾患が、パーキンソン病、多発性硬化症、バッテン病又はアルツハイマー病のような神経変性疾患である、請求項4に記載の方法。
- 前記神経上皮幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)から生産されたものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- iPSCが、線維芽細胞又は末梢血単核細胞(PBMC)から生産されたものであり、該線維芽細胞又はPBMCが、好ましくは患者から取得されたものである、請求項7に記載の方法。
- ゲル、バイオリアクターで、超低接着条件又はマイクロチップ、好ましくはヒドロゲル及び/又はMatrigel小滴のようなヒドロゲル小滴で、三次元細胞培養を実施する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- マトリックスが細胞外マトリックスであり、並びに/又はマトリックスが、天然分子、合成ポリマー、生物学的−合成ハイブリッド、金属、セラミック、生物活性ガラス及び/若しくはカーボンナノチューブの1つ以上を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- マトリックスが、コラーゲン、好ましくはコラーゲンIV、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン、Matrigel、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、絹フィブリル、PEGのようなエチレングリコール、ポリ(ビニルアルコール)及び/又はポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリラート)を含み、好ましくは、マトリックスが、コラーゲンIV、ラミニン、エンタクチン、プロテオグリカン又はMatrigelを含み、場合により、前記マトリックスが、幹細胞の生存、増殖及び/又は分化のための成長因子をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分化培地(分化培地I)が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記分化培地(分化培地II)が、
(i)少なくとも2つの異なるニューロトロフィン;及び
(ii)抗酸化剤
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - SHH経路活性化剤が、パルモルファミン、SHH、smoothenedアゴニスト(SAG)、Hh−Ag 1.5及びGli−2からなる群より選択され、好ましくは、SHH経路活性化剤がパルモルファミンである、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも2つのニューロトロフィンが、NGF、BDNF、NT−3、NT−4、CNTF及びGDNFからなる群より選択され、好ましくは、少なくとも2つのニューロトロフィンがGDNF及びBDNFである、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 抗酸化剤が、アスコルビン酸、スーパーオキシドジスムターゼ1、スーパーオキシドジスムターゼ2、スーパーオキシドジスムターゼ3、グルタチオン、リポ酸、エピガロカテキンガラート、クルクミン、メトラニン、ヒドロキシチロソール、ユビキノン、カタラーゼ、ビタミンE及び尿酸からなる群より選択され、好ましくは、抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 分化培地(分化培地I及び/又はII)が、アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング経路の活性化剤をさらに含み、及び/又は分化培地IIがSHH経路活性化剤を含まない、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 分化培地(分化培地I及び/又はII)がcAMP類似体をさらに含む、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 8日間の分化後に、FGF8を分化培地(分化培地I及び/又はII)に追加する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 神経上皮幹細胞を分化培地と接触させる前に、それらを維持培地と接触させる、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 維持培地が、
(i)SHH経路活性化剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む、請求項20に記載の方法。 - 二次元細胞培養及び/又は三次元細胞培養で神経上皮幹細胞の維持を行う、請求項21に記載の方法。
- 神経上皮幹細胞がコロニー中に存在する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- コロニーが細胞クローンのクラスタである、請求項23に記載の方法。
- 前記撹拌条件が、三次元細胞培養の振盪、スピニング、スターリング、移動及び/又は混合を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- スピニングバイオリアクターを用いてスピニングを実施し、及び/又はオービタルシェーカーを用いて振盪を実施する、請求項25に記載の方法。
- 前記オービタルシェーカーを少なくとも40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm又はそれ以上で振盪し、好ましくは、前記オービタルシェーカーを80rpmで振盪する、請求項26に記載の方法。
- (i)神経上皮幹細胞と、請求項21で定義される維持培地とを接触させること;
(ii)マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞と、請求項12、14〜19のいずれか一項で定義される分化培地(I)とを接触させることを含み、
ここで、該培養が撹拌条件下で実施され、
該撹拌が、分化培地I中で該神経上皮幹細胞の培養を開始した0日後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後又はそれ以上後、好ましくは2日後に開始される;
(iii)撹拌条件下で神経上皮幹細胞と、請求項13〜27のいずれか一項で定義される分化培地(II)とを接触させること
を含み、それにより、中脳オルガノイドを取得する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。 - 1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間又はそれ以上の分化後に、中脳オルガノイドが取得可能である、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中脳オルガノイドが初期中脳オルガノイド又は後期中脳オルガノイドである、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 初期中脳オルガノイドが、1日間、2日間、3日間、4日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間又は20日間分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、初期中脳オルガノイドが、6日間、7日間又は16日間分化したものである、請求項30に記載の方法。
- 後期中脳オルガノイドが、少なくとも25日間、30日間、35日間、40日間、50日間、60日間又はそれ以上分化した中脳オルガノイドであり、好ましくは、後期中脳オルガノイドが、30日間又は44日間分化したものである、請求項30に記載の方法。
- 前記中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)オリゴデンドロサイト;
(h)オリゴデンドロサイト前駆体;
(i)アストロサイト;及び/又は
(j)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。 - 初期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;及び/又は
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン
を含む、請求項30、31又は33のいずれか一項に記載の方法。 - 後期中脳オルガノイドが、
(a)神経前駆細胞;
(b)幼若ニューロン;
(c)幼若ドーパミン作動性ニューロン;
(d)成熟ニューロン;
(e)成熟ドーパミン作動性ニューロン;
(f)中脳オルガノイドの非対称組織化;
(g)オリゴデンドロサイト;
(h)オリゴデンドロサイト前駆体;
(i)アストロサイト;
(j)中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化;及び/又は
(k)中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起
を含む、請求項30、32又は33のいずれか一項に記載の方法。 - 前記神経前駆細胞がマーカーSOX2及び/若しくはネスチンの発現を特徴とし、
前記幼若ニューロンがマーカーTUJ1の発現を特徴とし、
前記幼若ドーパミン作動性ニューロンがマーカーTUJ1及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の発現を特徴とし、
前記成熟ニューロンがマーカーMAP2の発現を特徴とし、
前記成熟ドーパミン作動性ニューロンがマーカーMAP2及びTHの発現を特徴とし、
前記オリゴデンドロサイトがマーカーO4の発現を特徴とし、
前記オリゴデンドロサイト前駆体がマーカーNG2の発現を特徴とし、並びに/又は
前記アストロサイトがマーカーGFAP及び/若しくはS100bの発現を特徴とする、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。 - 中脳オルガノイドの非対称組織化が、ドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化及び/又は中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称組織化である、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンの非対称極性組織化が、
(a)成熟ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの最外部にあり;及び/又は
(b)幼若ドーパミン作動性ニューロンが中脳オルガノイドの内部にある
という局在性を特徴とする、請求項37に記載の方法。 - 幼若ドーパミン作動性ニューロンが、成熟すると中脳オルガノイドの最外部に向かって遊走する、請求項37又は38に記載の方法。
- 中脳オルガノイド内の神経前駆細胞の非対称極性組織化が、神経前駆体が中脳オルガノイドの内部コア周辺の環状構造にあるという局在性を特徴とする、請求項37に記載の方法。
- 前記中脳オルガノイド内のドーパミン作動性ニューロンのクラスタ化が、中脳オルガノイドの特定領域における2個超、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又はそれ以上のドーパミン作動性ニューロンの蓄積を特徴とする、請求項33〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中脳オルガノイドからマトリックスを通して伸びる突起が、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm又はそれ以上の長さを有する、請求項33〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、中脳オルガノイドユニット。
- 細胞応答を誘発するその能力について目的の化合物を試験するための方法であって、
(a)請求項43に記載の中脳オルガノイドと前記目的の化合物とを接触させること;及び
(b)前記目的の化合物が細胞応答を誘発するかを決定すること
を含む、方法。 - 請求項43で定義される中脳オルガノイドにおけるドーパミン作動性ニューロンの分化及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を促進又は阻害する分子を同定するための方法であって、該中脳オルガノイドと目的の分子とを接触させることを含み、
コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を促進し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を阻害することを示し、コントロールと比較したドーパミン作動性ニューロンへの分化の減少が、該目的の分子がドーパミン作動性ニューロンの分化を阻害し、及び/又はドーパミン作動性ニューロンの死を誘導することを示す、方法。 - 前記目的の化合物が、薬物、小分子、ホルモン、成長因子、結合タンパク質、核酸分子、ペプチド、タンパク質又は(共培養)細胞である、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記細胞の種類がドーパミン作動性ニューロンである、請求項44に記載の方法。
- 神経突起伸長を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、請求項45に記載の方法。
- THの発現を比較することによって、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を測定する、請求項45又は48に記載の方法。
- コントロールが、目的の分子と接触されていない中脳オルガノイドである、請求項45、48又は49のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項43に記載の中脳オルガノイドユニットを含む、組成物。
- 中脳オルガノイドユニットを作製するための、撹拌条件下、マトリックスを含む三次元細胞培養で培養された神経上皮幹細胞の使用。
- a)場合により、人工多能性幹細胞(iPSC)を取得/提供すること;
b)
(i)アクチビン/トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)シグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)骨形成タンパク質(BMP)シグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、前記iPSCを培養すること;並びに
c)
(i)アクチビン/TGF−βシグナリング阻害剤;
(ii)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(iii)BMPシグナリング阻害剤;及び
(iv)SHH経路活性化剤
を含む培地中で、b)において取得した細胞を培養すること;並びに
d)
(i)カノニカルWNTシグナリング活性化剤;
(ii)SHH経路活性化剤;及び
(iii)抗酸化剤
を含む培地中で、c)において取得した細胞をさらに培養すること
を含み、それにより、神経上皮幹細胞を取得する方法によって、神経上皮幹細胞を取得する、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
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