CN114026222A - 脑类器官的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；以及将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养的工序(c)；在白血病抑制因子(LIF)的存在进行上述工序(c)的至少一部分。

Description

脑类器官的制造方法
技术领域
本发明涉及脑类器官的制造方法。更详细而言，本发明涉及具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法、具有淀粉样斑块的脑类器官、阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法。本申请基于2019年7月5日在日本提出申请的日本特愿2019－126266号主张优先权，并将其内容援引于本说明书中。
背景技术
类器官是指细胞聚集而形成的小型的脏器，具有与生物体内的脏器类似的结构和功能。近年来，积极地进行了由多能干细胞制作各种类器官的研究，例如，制作了脑类器官、肠类器官、肝脏类器官、肾脏类器官等。
但是，阿尔茨海默病是不可逆的进行性的脑部疾病。在阿尔茨海默病患者的脑部确认到被称为淀粉样斑块的特征性的结构，已知淀粉样斑块的构成成分是被称为淀粉样蛋白β肽的肽。淀粉样蛋白β肽是将被称为β－淀粉样前体蛋白(amyloidprecusor protein)(APP)的前体蛋白切断而生成的由长度为36～43个氨基酸构成的肽。
为了开发阿尔茨海默病的治疗药，开发了一种阿尔茨海默病模型小鼠。然而，人与小鼠的脑部的结构不同，有时无法将通过阿尔茨海默病模型小鼠得到的见解应用于人。因此，寻求一种能够更可靠地重新阿尔茨海默病的病情且能够在体外使用的人脑类器官。例如，在非专利文献1中记载了由来自阿尔茨海默病患者的iPS细胞制作具有淀粉样斑块的脑类器官。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Gonzalez C.,et al.,Modeling amyloid beta and taupathology in human cerebral organoids.,Mol Psychiatry,23(12),2363-2374,2018.
发明内容
然而，非专利文献1中记载的脑类器官的制作方法在淀粉样斑块的形成效率方面有改良的余地。因此，本发明的目的在于提供高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官的技术。
本发明包含以下的方案。
[1]一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体(Embryoid Body，EB)的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养的工序(c)；在白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor)(LIF)的存在下进行上述工序(c)的至少一部分。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，在超过20体积％的氧的存在下进行上述工序(c)的至少一部分。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，将上述工序(c)进行100天以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，在上述工序(a)之前，进一步包括将上述多能干细胞在小于100ng/mL的成纤维细胞生长因子(Fibroblast GrowthFactor)－2(FGF2)的存在下进行培养的工序。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，以无饲养物进行上述多能干细胞的培养。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，上述阿尔茨海默病相关基因为早老素(Presenilin)1(PS1)基因、早老素2(PS2)基因或β－淀粉样前体蛋白(APP)基因。
[7]一种脑类器官，具有直径大于20μm的淀粉样斑块。
[8]根据[7]所述的脑类器官，其中，在脑类器官的截面，每1个上述淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例的平均值为0.1％以上。
[9]根据[7]或[8]所述的脑类器官，其中，相对于每1个脑类器官，上述淀粉样斑块的数量为2个以上。
[10]根据[7]～[9]中任一项所述的脑类器官，其中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)为0.15以上。
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的脑类器官，是通过[1]～[6]中任一项所述的制造方法而制造的。
[12]一种阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法，包括：在受试物质的存在下培养[7]～[10]中任一项所述的脑类器官的工序，以及测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序；上述淀粉样斑块的大小发生了缩小表示上述受试物质为阿尔茨海默病的治疗药。
[13]一种阿尔茨海默病的预防药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及在将工序(c)进行100天以上后测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序(d)；在工序(d)中，上述淀粉样斑块的大小与对照相比发生了缩小表示上述受试物质为阿尔茨海默病的预防药。
[14]一种阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及对工序(c)的上述脑类器官的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量进行定量的工序(d’)；在工序(d’)中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的比与对照相比发生了降低表示上述受试物质为阿尔茨海默病的预防药或治疗药。
根据本发明，能够提供一种高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官的技术。
附图说明
图1是表示实验例1中的脑类器官制作的进度表(schedule)的图。
图2中的(a)和(b)是表示实验例2中对于人脑类器官的淀粉样斑块进行检测而得的结果的显微镜照片。
图3是表示实验例2中直径20μm以上的每1个淀粉样斑块的面积相对于人脑类器官的截面的总面积的比例(％)的图表。
图4的(a)～(e)是表示实验例3中对人脑组织和人脑类器官的淀粉样斑块进行检测而得的结果的显微镜照片。
图5的(a)是表示实验例4中对脑类器官的淀粉样蛋白β40(Aβ40)的表达量进行定量而得的结果的图表。(b)是表示实验例4中对脑类器官的淀粉样蛋白β42(Aβ42)的表达量进行定量而得的结果的图表。(c)是表示基于(a)和(b)的结果来算出脑类器官的淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)而得的结果的图表。
图6的(a)是表示实验例5中使用在100ng/mL的FGF2的存在下培养而得的iPS细胞进行分化诱导而成的脑类器官的照片。(b)是表示实验例5中使用在10ng/mL的FGF2的存在下培养而得的iPS细胞进行分化诱导而成的脑类器官的照片。
图7的(a)～(c)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和βIII微管蛋白的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图8的(a)和(b)分别是将图7(b)和(c)的脑类器官的中心部的Tau蛋白的染色图像放大而得的图。
图9的(a)～(c)是表示实验例6中将脑类器官用MC1抗体进行免疫染色而得的结果的荧光显微镜照片。
图10的(a)～(c)是表示实验例6中的脑类器官的MAP2和GFAP的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图11的(a)～(c)是表示实验例6中将脑类器官用BTA－1进行染色而得的结果的荧光显微镜照片。
图12的(a)～(c)是表示实验例6中通过蛋白质印迹对脑类器官的Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白进行检测而得的结果的照片。(d)是表示基于(b)和(c)算出磷酸化Tau蛋白相对于总Tau蛋白的比例而得的结果的图表。
图13的(a)和(b)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和HuC/D的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图14的(a)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和CTIP2的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。(b)是将(a)的染色图像放大而得的图。
图15的(a)～(c)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和突触小泡蛋白的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图16的(a)～(c)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和gammaH2A.X的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图17的(a)和(b)是表示实验例6中的脑类器官的Tau蛋白和BNIP3的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图18的(a)～(c)是表示实验例7中的脑类器官的磷酸化Tau蛋白、HuC/D和GFAP的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。
图19的(a)～(c)是表示实验例8中将脑类器官用MC1抗体、抗HuC/D抗体和抗GFAP抗体进行免疫染色而得的结果的荧光显微镜照片。
具体实施方式
[具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法]
在1个实施方式中，本发明提供一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；以及将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养的工序(c)；在白血病抑制因子(LIF)的存在下进行上述工序(c)的至少一部分。
在实施例中如后所述，通过本实施方式的制造方法，能够高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官。
本说明书中，作为多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等。多能干细胞优选为人的细胞。另外，作为阿尔茨海默病相关基因，可举出早老素1(PS1)基因、早老素2(PS2)基因、β－淀粉样前体蛋白(APP)基因等。
人PS1基因的基因组DNA的NCBI登录号为NC_000014.9。人PS2基因的基因组DNA的NCBI登录号为NC_000001.11。人APP基因的基因组DNA的NCBI登录号为NC_000021.9。
作为阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞，可举出这些阿尔茨海默病相关基因具有导致阿尔茨海默病发病的变异的多能干细胞。
作为导致阿尔茨海默病发病的变异，例如可举出PS1基因中在PS1蛋白质的第246个氨基酸产生从丙氨酸向谷氨酸的氨基酸变异(A246E)的基因变异、PS2基因中在PS2蛋白质的第141个氨基酸产生从天冬酰胺向异亮氨酸的氨基酸变异(N141I)的基因变异、APP基因的重复等，但并不限定于这些。
导致阿尔茨海默病发病的变异可以是通过基因组编辑等而人工地导入的变异。或者，也可以将由来自阿尔茨海默病患者的细胞制作的多能干细胞作为阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞使用。
以下，对本实施方式的制造方法的各工序进行说明。首先，在工序(a)中，在SMAD抑制剂的存在下由多能干细胞形成胚状体。工序(a)优选进行约7天。通过本工序，能够使多能干细胞分化诱导成神经系统细胞。作为SMAD抑制剂，优选并用BMP抑制剂和TGF－β抑制剂。
作为BMP抑制剂，可以使用多索吗啡(Dorsomorphin)(CAS号：866405－64－3)、DMH1(CAS号：1206711－16－1)、LDN－193189(CAS号：1062368－24－4)等。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。BMP抑制剂向培养基的添加量例如可举出1～3μM左右。
另外，作为TGF－β抑制剂，可举出A83－01(CAS号：909910－43－6)、SB－431542(CAS号：301836－41－9)、RepSox(CAS号：446859－33－2)等。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。TGF－β抑制剂向培养基的添加量例如可举出1～3μM左右。
在本实施方式的制造方法中，优选不使用饲养细胞而以无饲养物的形式进行全部工序。即，阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞优选为以无饲养物的形式进行培养而得的细胞，工序(a)～(c)也优选以无饲养物的形式进行。由此，培养操作变得简便，另外，能够防止饲养细胞混入脑类器官。
在工序(a)之前，可以进一步进行将多能干细胞以小于100ng/mL的成纤维细胞生长因子－2(FGF2)的存在下进行培养的工序。FGF2向培养基的添加量优选小于100ng/mL，例如可以为50ng/mL，例如也可以为10ng/mL。
FGF2可以来源于人，也可以来源于小鼠，优选来源于人。
在以无饲养物的形式培养多能干细胞的情况下，通常在培养基中添加100ng/mL的FGF2。与此相对，发明人等明确了通过减少FGF2向培养基的添加量，具有淀粉样斑块的脑类器官的制造效率上升。
如果FGF2的添加量过低，则有时多能干细胞分化。另外，如果FGF2的添加量过多，则存在不易得到神经上皮样结构的趋势。
另外，例如，在使FGF2向培养基的添加量为10ng/mL的情况下，如果持续3周左右以上的培养，则难以维持多能干细胞。因此，在无饲养物且在10ng/mL的FGF2的存在下培养多能干细胞的情况下，培养时间优选为4周以下。
接下来，在工序(b)中，将工序(a)之后的胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官。这里，胚状体优选不分散地包埋于细胞外基质。胚状体的分散方法没有特别限定，可举出物理方法、酶处理法等，但从不损伤细胞的观点考虑，优选酶处理法。作为酶处理法中使用的酶，可以使用TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司)、TrypLE Select(Thermo FisherScientific公司)、胰蛋白酶、胶原酶、分散酶I等。工序(b)优选进行约7天。
作为细胞外基质，例如可举出IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内联蛋白等。作为细胞外基质，例如也可以使用基质胶(康宁公司制)等市售的商品。
作为SMAD抑制剂，优选使用上述的TGF－β抑制剂。SMAD抑制剂在工序(b)中可以单独使用1种，在工序(a)中组合使用2种以上。SMAD抑制剂向培养基的添加量例如可举出1～5μM左右。其中，在工序(b)中，优选使用SB－431542。
作为GSK3β抑制剂，例如可举出CHIR99021(CAS号：252917－06－9)、肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS号：142273－20－9)、6－溴靛玉红－3’－肟(6－Bromoindirubin－3’－oxime)(CAS号：029－16241)等。GSK3β抑制剂向培养基的添加量例如可举出1～5μM左右。其中，优选使用CHIR99021。
接下来，在工序(c)中，将工序(b)之后的类器官从细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养。搅拌培养优选使用生物反应器进行。作为生物反应器，可以使用市售的生物反应器。
工序(c)优选进行100天以上。在实施例中如后所述，对从开始工序(c)起第70天的脑类器官进行解析，结果未确认到淀粉样斑块的形成，与此相对，对进行了100天以上的工序(c)的脑类器官进行解析，结果确认到多个淀粉样斑块的形成。
在工序(c)的至少一部分中，优选在培养基中添加白血病抑制因子(LIF)。LIF的添加量例如可举出5～50ng/mL左右。LIF向培养基的添加可以仅在工序(c)的一部分中进行，也可以在工序(c)全部中进行。LIF可以来源于人，也可以来源于小鼠，优选来源于人。发明人等明确了通过在LIF的存在下进行搅拌培养，具有淀粉样斑块的脑类器官的制造效率上升。
优选在超过20体积％的氧的存在下进行工序(c)的至少一部。超过20体积％的氧是指比通常的空气中的氧浓度(约20体积％)高的氧浓度。工序(c)中的氧的浓度优选超过20体积％，例如可以为30体积％，例如也可以为40体积％，例如还可以为50体积％。发明人等明确了通过在比通常高的氧浓度下进行搅拌培养，具有淀粉样斑块的脑类器官的制造效率上升。
提高氧浓度的期间例如可以为从工序(c)开始后约第7天到培养结束为止的期间，也可以为从工序(c)开始后约第14天到培养结束为止的期间，还可以为从工序(c)开始后约第21天到培养结束为止的期间。
[具有淀粉样斑块的脑类器官]
在1个实施方式中，本发明提供具有直径为20μm以上的淀粉样斑块的脑类器官。在本实施方式的脑类器官中，淀粉样斑块的直径可以超过20μm，也可以为25μm以上，也可以为30μm以上，也可以为35μm以上，还可以为40μm以上。淀粉样斑块的直径可以通过将组织切片用抗淀粉样蛋白β抗体进行免疫染色，对淀粉样斑块的截面形状进行显微镜观察来测定。在淀粉样斑块的截面形状不是正圆的情况下，可以假定与淀粉样斑块的截面形状相同面积的正圆，将其直径作为淀粉样斑块的直径。
实施方式的脑类器官优选来源于人。以往，难以高效地制作具有淀粉样斑块的人脑类器官。与此相对，本实施方式的脑类器官由于能够高效地制作，因此，作为用于研究阿尔茨海默病的发病机制或研究预防方法·治疗方法的模型是有用的。本实施方式的脑类器官可以通过上述的制造方法来制造。
本实施方式的脑类器官优选在脑类器官的截面中每1个直径20μm以上的淀粉样斑块的面积在该截面的总面积中所占的比例的平均值为0.1％以上。
在本实施方式的脑类器官中，直径20μm以上的淀粉样斑块的数量优选相对于每1个脑类器官为2个以上。
另外，本实施方式的脑类器官优选淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)为0.15以上。将淀粉样蛋白β40的氨基酸序列示于序列号1，将淀粉样蛋白β42的氨基酸序列示于序列号2。
淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比更优选为0.16以上，进一步优选为0.18以上，特别优选为0.2以上。
认为具有上述的任一特征的脑类器官反映阿尔茨海默病的病情，因此，作为阿尔茨海默病的模型是有用的。
如后所述，本实施方式的脑类器官可以用于阿尔茨海默病的治疗药的筛选。因此，在一个实施方式中，本发明提供包含具有淀粉样斑块的脑类器官的阿尔茨海默病的治疗药的筛选用试剂盒。对于具有淀粉样斑块的脑类器官，与上述的脑类器官同样。
[阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法]
在1个实施方式中，本发明提供阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法，包括：在受试物质的存在下培养上述的具有淀粉样斑块的脑类器官的工序，以及测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序；上述淀粉样斑块的大小发生了缩小表示上述受试物质为阿尔茨海默病的治疗药。
作为受试物质，没有特别限制，例如可举出天然化合物库、合成化合物库、现有药物库、代谢物库等。
淀粉样斑块的大小的测定例如可以将脑类器官使用抗淀粉样蛋白β抗体进行免疫染色，基于得到的染色图像进行。或者，也可以将脑类器官用2－(4’－甲基氨基苯基)苯并噻唑(BTA－1)等能够染色淀粉样斑块的试剂进行染色，基于得到的染色图像进行。
在受试物质的存在下，脑类器官的淀粉样斑块的大小发生了缩小时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的治疗药。
例如，在受试物质存在下的脑类器官的淀粉样斑块的大小与不存在受试物质下的脑类器官的淀粉样斑块的大小相比发生了缩小时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的治疗药。
或者，受试物质给予后的脑类器官的淀粉样斑块的大小与受试物质给予前的脑类器官的淀粉样斑块的大小相比发生了缩小时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的治疗药。
通过本实施方式的筛选方法，能够筛选阿尔茨海默病的治疗药。可以说通过本实施方式的筛选而得到的阿尔茨海默病的治疗药是使所形成的淀粉样斑块缩小或消失的药物。
[阿尔茨海默病的预防药的筛选方法]
在1个实施方式中，本发明提供阿尔茨海默病的预防药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及将工序(c)进行100天以上后，测定上述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序(d)；在工序(d)中，上述淀粉样斑块的大小与对照相比发生了缩小表示上述受试物质是阿尔茨海默病的预防药。
在本实施方式的筛选方法中，工序(a)和(b)与上述的具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法中的工序(a)和(b)同样。在本实施方式的筛选方法中，工序(c)与上述的具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法中的工序(c)同样，但在受试物质的存在下进行工序(c)的至少一部分这一点与上述的制造方法不同。
作为受试物质，与阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法中上述的受试物质同样。
在本实施方式的筛选方法中，在工序(d)中测定脑类器官的淀粉样斑块的大小。淀粉样斑块的大小可以与阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法中上述的方法同样地进行测定。
在工序(d)中，在受试物质的存在下培养的脑类器官的淀粉样斑块的大小与对照相比发生了缩小时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的预防药。这里，作为对照，可举出在不存在受试物质下培养的脑类器官等。
通过本实施方式的筛选方法，能够筛选阿尔茨海默病的预防药。可以说通过本实施方式的筛选而得到的阿尔茨海默病的预防药是通过在淀粉样斑块形成前进行给予而抑制或防止淀粉样斑块的形成的药物。
[阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法]
在1个实施方式中，本发明提供阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法，包括：在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成形成胚状体的工序(a)；将工序(a)之后的上述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序(b)；将工序(b)之后的上述类器官从上述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序(c)；以及对工序(c)的上述脑类器官的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量进行定量的工序(d’)；在工序(d’)中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的比与对照相比发生了降低表示上述受试物质是阿尔茨海默病的预防药或治疗药。
在本实施方式的筛选方法中，工序(a)～(c)与上述的阿尔茨海默病的预防药的筛选方法中的工序(a)～(c)同样。另外，作为受试物质，与阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法中上述的受试物质同样。
在本实施方式的筛选方法中，在工序(d’)中对脑类器官的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量进行定量。淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量例如可以通过与实施例中后述的方法同样的ELISA法等进行定量。具体而言，可以将作为测定对象的脑类器官放入管或微孔板的孔等，培养24～48小时左右，测定分泌到培养基中的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42。
在工序(d’)中，在受试物质的存在下培养的脑类器官的淀粉样蛋白β40的表达量与淀粉样蛋白β42的表达量的比与对照相比发生了降低时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的预防药或治疗药。这里，作为对照，可举出在不存在受试物质下培养的脑类器官等。
在工序(d’)中，淀粉样蛋白β40的表达量与淀粉样蛋白β42的表达量的比例如可以为摩尔比。例如，通过受试物质的给予，摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)降低至小于0.2、例如小于0.15时，可以说该受试物质是阿尔茨海默病的预防药或治疗药。即，通过本实施方式的筛选方法，能够筛选阿尔茨海默病的预防药或治疗药。
实施例
接着，示出实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实验例1]
(脑类器官的制作1)
对多能干细胞进行培养，制作脑类器官。作为多能干细胞，使用作为野生型的人iPS细胞株的414C2、201B7、RPC771，作为野生型的人ES细胞株的KhES1，作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2、PS2－2。
明确了PS1－2细胞具有PS1基因在PS1蛋白质的第246个氨基酸产生从丙氨酸向谷氨酸的氨基酸变异(A246E)的基因变异。另外，明确了PS2－2细胞具有PS2基因在PS2蛋白质的第141个氨基酸产生从天冬酰胺向异亮氨酸的氨基酸变异(N141I)的基因变异。
图1是表示脑类器官制作的进度表的图。各多能干细胞的培养以不使用饲养细胞的无饲养物的形式进行。首先，将各细胞在包含10ng/mL的FGF2的培养基中培养1～3周。
接下来，在培养第0天(Day0)，将解离成单一细胞的各细胞悬浮于包含2μM多索吗啡(Sigma公司)和2μM A83－01(Tocris公司)、10μMY27632(Nacalai Tesque公司)且不含FGF2的iPS培养基(iPS Medium)，接种于96孔板。在培养第1天(Day1)，追加等量的从上述的培养基中除去了Y27632的培养基。在培养第3天(Day3)更换一半量的培养基。图1中，“Dorso”表示多索吗啡，“A83”表示A83－01。
接下来，在培养第5～6天(Day5～6)，将培养基的一半量更换成诱导培养基(Induction Medium)。诱导培养基的组成为DMEM/F12、GlutaMAX(Thermo FisherScientific公司)、1μM CHIR99021(Cellagen Technology公司)、1μM SB－431542(Cellagen Technology公司)、1×N2Supplement(Thermo Fisher Scientific公司)、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific公司)、1×青霉素·链霉素。图1中，“CHIR”表示CHIR99021，“SB”表示SB－431542。
接下来，在培养第7天(Day7)，将各细胞包埋于基质胶(BD Bioscience公司)，在诱导培养基中进一步培养6天。培养基每隔1天更换一半量。
接下来，在培养第14天(Day14)，使用5mL移液管进行移液，由此取出将基质胶机械解离而形成的类器官。接下来，将类器官悬浮于分化培养基(Differentiation medium)，放入到生物反应器(Able公司)中进行搅拌培养。分化培养基的组成为DMEM/F12、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、1×N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific公司)、1×B27Supplement(Thermo Fisher Scientific公司)、2.5μg/mL胰岛素(Sigma公司)、0.1mM 2－巯基乙醇、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific公司)、1×青霉素·链霉素、10ng/mL LIF(Merck Millipore公司)。培养基每隔2～3天更换。图1中，“N2”表示N2Supplement，“B27”表示B27 Supplement。
从培养第28天(Day28)起，将孵育器内的氧浓度设定为40体积％。
从培养第71天(Day71)起，将分化培养基更换为成熟培养基(Maturationmedium)，继续搅拌培养。成熟培养基的组成为Neurobasal Plus(Thermo FisherScientific公司)、1×B27 Supplement(Thermo Fisher Scientific公司)、20ng/mL BDNF(PeproTech公司)、20ng/mL GDNF(PeproTech公司)、0.5mM cAMP(Sigma公司)、1×GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、0.2mM抗坏血酸(Sigma公司)、1×抗菌－抗真菌剂(Antibiotic－Antimycotic)(Thermo Fisher Scientific公司)、10ng/mL LIF(MerckMillipore公司)。培养基每隔2～3天更换。
[实验例2]
(淀粉样斑块的检测1)
对实验例1中制作的脑类器官的淀粉样斑块进行检测。在培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)取出各脑类器官，用4％多聚甲醛固定。接下来，将固定的类器官包埋于树脂，制作冷冻切片。
接下来，将各冷冻切片用抗淀粉样蛋白β抗体(Clone 6E10、BioLegend社)进行免疫染色，对淀粉样斑块进行检测。图2(a)使用由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图2(b)是由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。图2(b)中，箭头表示直径20μm以上的淀粉样斑块。
其结果明确了由来自阿尔茨海默病患者的iPS细胞制作的脑类器官可重现性良好地检测出淀粉样斑块。
图3是表示在由各多能干细胞制作的培养第120天的脑类器官的切片(截面)中每1个直径20μm以上的淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例(％)的图表。对于来自414C2、KhES1、PS1－2、PS2－2的脑类器官，对3个类器官进行了解析。另外，对于来自201B7、RPC771的脑类器官，对2个类器官进行了解析。图3中，“Control”表示是来自对照的iPS细胞或ES细胞的脑类器官，“AD”表示是来自源自阿尔茨海默病患者的iPS细胞的脑类器官。另外，“*”表示曼惠特尼检验的结果，在p＜0.05存在显著性差异。
其结果，在来自PS1－2、PS2－2的脑类器官的截面中，每1个直径20μm以上的淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例的平均值为0.1％以上。
应予说明，在培养第84天(Day84，从开始搅拌培养起第70天)，进行同样的研究，结果在来自任一细胞的脑类器官中均没有检测出淀粉样斑块。因此，明确了为了形成淀粉样斑块，需要从开始搅拌培养起100天左右以上的培养。
[实验例3]
(淀粉样斑块的检测2)
使用2－(4’－甲基氨基苯基)苯并噻唑(BTA－1，Sigma公司)代替抗淀粉样蛋白β抗体，对实验例1中制作的脑类器官的淀粉样斑块进行检测。BTA－1为硫黄素－T的衍生物，是对淀粉样蛋白β肽的沉积物显示硫黄素－T的约50倍的高亲和性的化合物。
在培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)，取出各脑类器官，用4％多聚甲醛固定。接下来，将固定的类器官包埋于树脂，制作冷冻切片。
接下来，将各冷冻切片用BTA－1染色，对淀粉样斑块进行检测。另外，为了比较，对于对照的人脑组织切片(26岁)和阿尔茨海默病患者的脑组织切片(73岁)也同样地用BTA－1进行染色。
图4(a)是表示对照(26岁)的人脑组织的结果的代表性的照片。图4(b)是表示阿尔茨海默病患者(73岁)的脑组织的结果的代表性的照片。图4(c)是表示由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。图4(d)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。图4(e)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。
其结果，在对照(26岁)的人脑组织、来自414C2的脑类器官中没有检测出淀粉样斑块。与此相对，在阿尔茨海默病患者(73岁)的脑组织、由PS1－2制作的培养第120天的脑类器官、由PS2－2制作的培养第120天的脑类器官中检测出淀粉样斑块。
[实验例4]
(淀粉样蛋白β40、淀粉样蛋白β42的表达量的定量)
分别使用市售的试剂盒(富士胶片和光纯药)，通过ELISA法对分泌到与实验例1同样地制作的脑类器官的培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)的培养上清中的淀粉样蛋白β40肽和淀粉样蛋白β42肽进行定量。
具体而言，将培养第118天(Day118，从开始搅拌培养起第104天)的脑类器官各转移1个到48孔板的1个孔中，进一步培养2天。作为脑类器官，使用由作为野生型的人iPS细胞株的414C2、作为野生型的人ES细胞株的KhES1、作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2、PS2－2制作的脑类器官。
接下来，分别对分泌到培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)的培养上清中的淀粉样蛋白β40肽和淀粉样蛋白β42肽进行定量。
图5(a)是表示淀粉样蛋白β40(Aβ40)的定量结果的图表。另外，图5(b)是表示淀粉样蛋白β42(Aβ42)的定量结果的图表。另外，图5(c)是基于图5(a)和(b)的结果算出各脑类器官的淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)而得的结果的图表。图5(c)中，“*”表示没有对应的学生t检验的结果，在p＜0.05存在显著性差异。
其结果明确了由来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株(PS1－2、PS2－2)制作的脑类器官的淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比(淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量)与对照的脑类器官(414C2、KhES1)相比显著高。如果淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比高，则可以说容易形成淀粉样斑块，本实验例的结果支持该结论。
[实验例5]
(脑类器官的制作2)
由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2、PS2－2制作脑类器官。在培养第1天(Day1)之前，将各细胞在100ng/mL的FGF2的存在下培养1～3周，除这一点以外，与实验例1同样地制作脑类器官。
其结果明确了如果将在100ng/mL的FGF2的存在下培养的iPS细胞进行分化诱导，则与将在10ng/mL的FGF2的存在下培养的iPS细胞进行分化诱导的情况相比，基质胶包埋后的神经上皮样结构的形成效率变低。图6(a)是使用在100ng/mL的FGF2的存在下培养的iPS细胞进行了分化诱导的培养第14天(Day14)的脑类器官的照片。图6(b)是使用在10ng/mL的FGF2的存在下培养的iPS细胞进行了分化诱导的培养第14天(Day14)的脑类器官的照片。其结果确认了与图6(a)相比，在图6(b)中，确认到更清晰的神经上皮样结构。
[实验例6]
(Tau蛋白的表型的研究)
作为阿尔茨海默病的特征性的病理变化，已知有老人斑的沉积和神经原纤维变化(Neurofibrillary tangle，NFT)、脑萎缩。NFT由于是Tau的不溶性凝集体蓄积在细胞内而成的，因此，通过免疫染色对由来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株制作的脑类器官(PS1－2、PS2－2)的Tau蛋白的表型进行解析。
《Tau蛋白和βIII微管蛋白的免疫染色》
将与实验例1同样地制作的脑类器官在培养第84天(Day84，从开始搅拌培养起第70天)用4％多聚甲醛固定。接下来，将固定的类器官包埋于O.C.T.化合物(Kenis公司)，制作冷冻切片。
接下来，将各冷冻切片用抗Tau抗体(富士胶片和光纯药工业株式会社，DAKO公司)进行免疫染色。另外，还进行了作为未成熟神经细胞的标志物的βIII微管蛋白的免疫染色。另外，还以Hoechst33342进行了核的染色。
图7(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图7(a)是作为对照的由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图7(b)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图7(c)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。比例尺为100μm。另外，图7(a)～(c)中，“inner”表示类器官的中心部，“outer”表示类器官的外缘部。
另外，图8(a)和(b)是将图7(b)和(c)中类器官的中心部的Tau蛋白的染色图像放大而得的图。比例尺为20μm。图8(a)是由PS1－2制作的脑类器官的结果，图8(b)是由PS2－2制作的脑类器官的结果。
其结果明确了：在第84天的脑类器官中，在由对照(414C2)制作的脑类器官中在类器官整体均匀地观察到Tau蛋白的表达，与此相对，在由PS1－2、PS2－2制作的脑类器官中，在脑类器官的内部，Tau蛋白蓄积于细胞体。
《利用MC1抗体的免疫染色》
接下来，用识别阿尔茨海默病中所观察到的Tau蛋白的早期的立体结构变化的MC1抗体(由Dr.Peter Davies提供)进行免疫染色。另外，还以Hoechst33342进行了核的染色。图9(a)～(c)是表示类器官的中心部的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图9(a)是表示作为对照的由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图9(b)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图9(c)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。比例尺为20μm。
其结果明确了在由PS1－2、PS2－2制作的脑类器官的内部观察到Tau蛋白的蓄积的细胞被MC1抗体染色。该结果表示在这些细胞中发生了蓄积的Tau蛋白的立体结构变化。
《MAP2和GFAP的免疫染色》
接下来，进行作为成熟的神经细胞的标志物的MAP2的免疫染色。另外，还进行了作为星形胶质细胞的标志物的GFAP的免疫染色。另外，还以Hoechst33342进行了核的染色。
图10(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图10(a)是作为对照的由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图10(b)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图10(c)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的结果的代表性的照片。比例尺为20μm。
其结果明确了在脑类器官内部的神经细胞中作为成熟的神经细胞的标志物的MAP2蓄积于细胞体。
《利用BTA－1的染色》
接下来，使用作为硫黄素－T的衍生物的BTA－1(Sigma公司)对由PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的冷冻切片进行染色。另外，为了比较，将健康人的脑的组织切片和阿尔茨海默病患者的脑的组织切片也用BTA－1进行了染色。
图11(a)～(c)是表示染色结果的荧光显微镜照片。比例尺为50μm。图11(a)是健康人的脑的代表性的结果，图11(b)是阿尔茨海默病患者的脑的代表性的结果，图11(c)是由PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的代表性的结果。
其结果明确了由PS2－2制作的培养第84天的脑类器官与阿尔茨海默病患者的脑同样地被BTA－1染色。
《Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的蛋白质印迹》
接下来，通过蛋白质印迹对由PS1－2制作的培养第84天的脑类器官的提取物进行解析，对Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白进行检测。另外，作为对照，对由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第84天的脑类器官的提取物同样地进行解析。
图12(a)～(c)是表示蛋白质印迹的结果的照片。图12(a)是将图12(b)和(c)合并的结果。图12(b)是对总Tau蛋白进行检测而得的结果。图12(c)是对磷酸化Tau蛋白进行检测而得的结果。另外，图12(d)是表示基于图12(b)和(c)而算出磷酸化Tau蛋白相对于总Tau蛋白的比例而得的结果的图表。
其结果明确了由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第84天的脑类器官与对照相比，总Tau蛋白中的磷酸化Tau蛋白的比例高。
《HuC/D和CTIP2的免疫染色》
接下来，对于培养第84天的脑类器官的中心部中可见的Tau蛋白蓄积于细胞质的细胞，将作为神经细胞标志物的HuC/D和作为神经细胞的层标志物的CTIP2进行免疫染色。
图13(a)和(b)是表示Tau蛋白和HuC/D的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。作为对照，对由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第84天的脑类器官也同样地进行了免疫染色。比例尺为20μm。
另外，图14(a)是表示由PS1－2制作的培养第84天的脑类器官的Tau蛋白和CTIP2的免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图14(a)中，“inner”表示类器官的中心部，“outer”表示类器官的外缘部。比例尺为100μm。另外，图14(b)分别是将图14(a)的类器官的中心部的染色图像放大而得的图。比例尺为20μm。
其结果，作为第5层神经细胞的标志物的CTIP2阳性的细胞在脑类器官的中心部被观察到，在其一部分中可见Tau蛋白向细胞质的蓄积。根据该结果明确了在第5层神经细胞的一部分中，可见Tau蛋白向细胞质的蓄积。
《Tau蛋白和突触小泡蛋白(Synaptophysin)的免疫染色》
接下来，进行由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2
－2制作的培养第84天的脑类器官的Tau蛋白和突触小泡蛋白的免疫染色。
图15(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图15(a)中，“inner”表示类器官的中心部，“outer”表示类器官的外缘部。比例尺为100μm。另外，图15(b)是将图15(a)的类器官的外缘部的染色图像放大而得的图。比例尺为10μm。另外，图15(c)是将图15(a)的类器官的中心部的染色图像放大而得的图。比例尺为10μm。
其结果，在脑类器官的外缘部和中心部检测出突触小泡蛋白。如果将显微镜照片放大，则在外缘部沿着神经突起观察到许多斑点(puncta)，但在中心部得到突触小泡蛋白凝集这样的染色图像。认为在脑类器官的中心部，Tau蛋白在神经细胞的细胞质聚集，神经突起的形成产生异常，失去了去处的突触小泡蛋白凝集。
《Tau蛋白和gammaH2A.X的免疫染色》
接下来，进行由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的Tau蛋白和老化标志物即gammaH2A.X的免疫染色。
图16(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图16(a)中，“inner”表示类器官的中心部，“outer”表示类器官的外缘部。比例尺为100μm。另外，图16(b)是将图16(a)的类器官的外缘部的染色图像放大而得的图。比例尺为10μm。另外，图16(c)是将图16(a)的类器官的中心部的染色图像放大而得的图。比例尺为10μm。
其结果，在脑类器官的中心部检测出gammaH2A.X。如果将显微镜照片放大，则在外缘部几乎不存在gammaH2A.X，在中心部的Tau蛋白蓄积的神经细胞中检测出gammaH2A.X。该结果表示在脑类器官的中心部的细胞中有可能发生细胞老化现象。
《Tau蛋白和BNIP3的免疫染色》
接下来，进行由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第84天的脑类器官的Tau蛋白和低氧标志物即BNIP3的免疫染色。
图17(a)和(b)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图17(a)中，“inner”表示类器官的中心部，“outer”表示类器官的外缘部。比例尺为100μm。另外，图16(b)是将图16(a)的类器官的中心部的染色图像放大而得的图。比例尺为5μm。
其结果，在脑类器官的中心部检测出BNIP3，表明成为低氧状态。如果将显微镜照片放大，则在Tau蛋白蓄积的细胞的一部分中，可见BNIP3的表达。BNIP3存在于线粒体外膜，报告了参与线粒体自噬(mitophagy)。因此，表明在这些细胞中有可能发生线粒体的累积、异常。
[实验例7]
(磷酸化Tau蛋白的检测)
对实验例1中制作的脑类器官的磷酸化Tau蛋白进行检测。在培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)取出各脑类器官，用4％多聚甲醛固定。接下来，将固定的类器官包埋于O.C.T.化合物(Kenis公司)，制作冷冻切片。
接下来，将各冷冻切片用抗磷酸化Tau抗体(Clone AT8，Thermo FisherScientific公司)进行免疫染色，对磷酸化Tau蛋白进行检测。另外，还进行作为神经细胞标志物的HuC/D、作为星形胶质细胞标志物的GFAP的免疫染色。另外，还以Hoechst33342进行了核的染色。
图18(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图18(a)是表示由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图18(b)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图18(c)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。比例尺为50μm。其结果，在各脑类器官中观察到存在磷酸化Tau蛋白。
[实验例8]
(立体结构发生了变化的Tau蛋白的存在的研究)
对实验例1中制作的脑类器官的立体结构发生了变化的Tau蛋白进行检测。在培养第120天(Day120，从开始搅拌培养起第106天)取出各脑类器官，用4％多聚甲醛固定。接下来，将固定的类器官包埋于O.C.T.化合物(Kenis公司)，制作冷冻切片。
接下来，将各冷冻切片用已知识别立体结构发生了变化的Tau蛋白的MC1抗体(由Dr.Peter Davies提供)进行免疫染色。另外，还进行作为神经细胞标志物的HuC/D、作为星形胶质细胞标志物的GFAP的免疫染色。另外，还以Hoechst33342进行了核的染色。
图19(a)～(c)是表示免疫染色的结果的荧光显微镜照片。图19(a)是作为对照的由作为野生型的人iPS细胞株的414C2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图19(b)是由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。另外，图19(c)是表示由作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS2－2制作的培养第120天的脑类器官的结果的代表性的照片。比例尺为50μm。
其结果，在来自作为来自阿尔茨海默病患者的人iPS细胞株的PS1－2、PS2－2的脑类器官中的星形胶质细胞中，观察到表示存在立体结构发生了变化的Tau蛋白的MC1阳性细胞比来自作为对照的414C2的脑类器官多。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供高效地形成具有淀粉样斑块的脑类器官的技术。
序列表
<110> 学校法人庆应义塾
<120> 脑类器官的制造方法
<130> PC-29991
<150> JP2019-126266
<151> 2019-07-05
<160> 2
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40

Claims (14)

1.一种具有淀粉样斑块的脑类器官的制造方法，包括：
在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序a，
将工序a之后的所述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和糖原合成酶激酶3β即GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序b，以及
将工序b之后的所述类器官从所述细胞外基质取出并在培养基中进行搅拌培养的工序c；
在白血病抑制因子即LIF的存在下进行所述工序c的至少一部分。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在超过20体积％的氧的存在下进行所述工序c的至少一部分。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，将所述工序c进行100天以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，在所述工序a之前，进一步包括将所述多能干细胞在小于100ng/mL的成纤维细胞生长因子－2即FGF2的存在下进行培养的工序。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，以无饲养物进行所述多能干细胞的培养。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述阿尔茨海默病相关基因为早老素1即PS1基因、早老素2即PS2基因或β－淀粉样前体蛋白即APP基因。
7.一种脑类器官，具有直径大于20μm的淀粉样斑块。
8.根据权利要求7所述的脑类器官，其中，在脑类器官的截面，每1个所述淀粉样斑块的面积相对于该截面的总面积的比例的平均值为0.1％以上。
9.根据权利要求7或8所述的脑类器官，其中，相对于每1个脑类器官，所述淀粉样斑块的数量为2个以上。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的脑类器官，其中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的摩尔比即淀粉样蛋白β42的表达量/淀粉样蛋白β40的表达量为0.15以上。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的脑类器官，是通过权利要求1～6中任一项所述的制造方法而制造的。
12.一种阿尔茨海默病的治疗药的筛选方法，包括：
在受试物质的存在下培养权利要求7～10中任一项所述的脑类器官的工序，以及
测定所述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序；
所述淀粉样斑块的大小发生了缩小表示所述受试物质为阿尔茨海默病的治疗药。
13.一种阿尔茨海默病的预防药的筛选方法，包括：
在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序a，
将工序a之后的所述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序b，
将工序b之后的所述类器官从所述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养，得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序c，以及
在将工序c进行100天以上后测定所述脑类器官的淀粉样斑块的大小的工序d；
在工序d中，所述淀粉样斑块的大小与对照相比发生了缩小表示所述受试物质为阿尔茨海默病的预防药。
14.一种阿尔茨海默病的预防药或治疗药的筛选方法，包括：
在SMAD抑制剂的存在下由阿尔茨海默病相关基因具有变异的多能干细胞形成胚状体的工序a，
将工序a之后的所述胚状体包埋于细胞外基质并在SMAD抑制剂和GSK3β抑制剂的存在下进行三维培养，形成类器官的工序b，
将工序b之后的所述类器官从所述细胞外基质取出，在培养基中进行搅拌培养而得到脑类器官的工序，并且在受试物质的存在下进行至少一部分的工序c，以及
对工序c的所述脑类器官的淀粉样蛋白β40和淀粉样蛋白β42的表达量进行定量的工序d’，
在工序d’中，淀粉样蛋白β42的表达量相对于淀粉样蛋白β40的表达量的比与对照相比发生了降低表示所述受试物质为阿尔茨海默病的预防药或治疗药。
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