TWI746459B - 製造腎前驅細胞之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係在於提供藉由鑑定腎前驅細胞特異性細胞表面抗原標記，而自由多能性幹細胞分化誘導成腎前驅細胞之細胞群體中，取得並製造純度較高的腎前驅細胞之方法。
一種製造由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞之方法，其係包含：(i)將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞分化之條件下進行培養之步驟；以及(ii)自步驟(i)所獲得之細胞中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)、及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之步驟。

Description

製造腎前驅細胞之方法
本發明係關於製造腎前驅細胞之方法，其係使用用於自包含由多能性幹細胞分化而成之腎前驅細胞之細胞群體中，取得並製造高純度的腎前驅細胞群體之細胞表面標記。
腎臟為藉由過濾自血中去除因在生物體內之代謝活動所產生之有害物質或廢棄物，為了謀求身體的健康維持而發揮機能之重要的臟器之一。作為腎臟的機能受損之嚴重的疾患，有腎功能不全，其尚未確立有效的藥物療法，在現狀係以腎移植、人工透析予以治療。然而，在腎移植中有深刻的捐贈者臟器不足之問題，另一方面，在人工透析中除了併發症的表現以外，尚有較大的醫療費負擔之問題，遂期望開發新的治療法。
另一方面，迄今為止已有報告藉由對胚性幹細胞(Embryonic stem cell；ES細胞)、或體細胞導入初期化因子所獲得之人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell；iPS細胞)等具有多能性之細胞(專利文獻1 及2)。目前，正檢討開發出將由此等多能性幹細胞分化誘導而成之腎細胞進行移植之腎功能不全的治療法。再者，使用源自此等多能性幹細胞之均一的腎細胞來施行治療藥的開發亦已列入考慮。
已知哺乳類的腎臟係歷經前腎、中腎、後腎共3階段而形成，其中，後腎係在中間中胚層的後方區域產生。在迄今為止的研究中，已檢討由小鼠多能性幹細胞分化誘導向中間中胚層之方法(非專利文獻1)，作為中間中胚層之特徵性標記，已確認Odd-Skipped Related Transcription Factor 1(OSR1)。此外，作為對腎前驅細胞賦予特徵之因子之一，已知SIX Homeobox 2(SIX2)(非專利文獻2及3)。製作使用細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome；BAC)載體以與內在性OSR1對偶基因相同重組導入綠色螢光蛋白質(Green Fluorescent Protein；GFP)基因而成之人類iPS細胞(OSR1-GFP報導子人類iPS細胞)，藉由使用此細胞之檢討，已成功使用活化素A(Activin A)、Wnt蛋白質、骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein(BMP))及各種低分子化合物由人類多能性幹細胞分化誘導向中間中胚層(非專利文獻3、專利文獻3)。接著，使用與Mae等人(非專利文獻3)同樣的相同重組方法，製作在OSR1-GFP報導子人類iPS細胞株的SIX2基因座導入屬於紅色螢光蛋白質之tdTomato而成之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導子iPS人類細胞株，藉由使用此細胞之檢 討，成功構築由人類多能性幹細胞分化誘導向腎前驅細胞之系統，並已確認在以此方法所獲得之腎前驅細胞的急性腎障礙模型中之藥效(非專利文獻4、專利文獻4)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：US5,843,780
專利文獻2：WO2007/069666
專利文獻3：WO2012/011610
專利文獻4：WO2014/200115
[非專利文獻]
非專利文獻1：Mae S, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (2010), 393:877-882
非專利文獻2：Kobayashi A, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:169-181
非專利文獻3：Mae S, et al,, Nat. Commun., (2013), 4:1367
非專利文獻4：Toyohara T, et al., Stem Cells Transl. Med., (2015), 4:980-992
本發明之課題係在於提供藉由鑑定腎前驅細胞特異性細胞表面標記，而自由多能性幹細胞分化誘導成腎前驅細胞之細胞群體中，取得並製造純度較高的腎前驅細胞群體之方法。
本發明者等人為了解決上述課題而致力進行檢討之結果，首次發現藉由使用選自CD9陰性(CD9(-))、CD55陰性(CD55(-))、CD106陽性(CD106(+))、CD140a陽性(CD140a(+))、CD140b陽性(CD140b(+))、CD165陽性(CD165(+))、CD271陽性(CD271(+))及CD326陰性(CD326(-))之細胞表面標記，便可自包含腎前驅細胞之細胞群體中，取得並製造純度較高的腎前驅細胞群體。本發明係基於此種見解而完成者。
即，本發明具有以下特徵：
〔1〕一種製造由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞之方法，其係包含：(i)將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞分化之條件下進行培養之步驟；以及(ii)自步驟(i)所獲得之細胞中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之步 驟。
〔2〕如〔1〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用至少2種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔3〕如〔1〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用至少3種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔4〕如〔1〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用至少4種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔5〕如〔1〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用選自CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)所組成群組之至少2種細胞表面標記。
〔6〕如〔5〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用至少3種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔7〕如〔4〕所記載之方法，其中，在步驟(ii)中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)作為細胞表面標記。
〔8〕如〔1〕~〔7〕中任一項之方法，其中，多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
〔9〕如〔1〕~〔7〕中任一項之方法，其中，多能性幹細胞為人類iPS細胞。
〔10〕一種腎前驅細胞群體，其係以〔1〕~〔9〕中任一項之方法所製造。
〔11〕一種自包含腎前驅細胞之細胞群體中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及 CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之方法。
〔12〕如〔11〕所記載之方法，其中，使用至少2種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔13〕如〔11〕所記載之方法，其中，使用至少3種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔14〕如〔11〕所記載之方法，其中，使用至少4種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔15〕如〔11〕所記載之方法，其中，使用選自CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)所組成群組之至少2種細胞表面標記。
〔16〕如〔15〕所記載之方法，其中，使用至少3種細胞表面標記來篩選細胞群體。
〔17〕如〔11〕所記載之方法，其中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)作為細胞表面標記。
〔18〕如〔11〕~〔17〕中任一項之方法，其中，腎前驅細胞為由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞。
〔19〕如〔11〕~〔17〕中任一項之方法，其中，多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
〔20〕如〔11〕~〔17〕中任一項之方法，其中，多能性幹細胞為人類iPS細胞。
〔21〕一種細胞群體，其係藉由〔11〕~〔20〕中任一項之方法所獲得。
藉由本發明，能夠初次自由多能性幹細胞(例如iPS細胞)分化誘導腎前驅細胞而成之細胞群體中，藉由使用細胞表面標記，而取得並製造高純度的腎前驅細胞群體。此外，本發明之方法所取得之腎前驅細胞群體可使用於腎功能不全等腎疾患的再生醫療用途。
〔圖1〕圖1係示出將實施例1中之CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271及CD326與OSR1及SIX2的表現以流式細胞儀進行測定而得之結果之2維展開圖。縱軸設為抗體相對於各細胞表面標記之螢光強度，橫軸設為代替OSR1或SIX2蛋白質的表現之螢光報導子的螢光強度。
〔圖2〕圖2係示出實施例2中之自源自人類iPS細胞之分化細胞群中分選出CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞之結果。圖2A為將源自人類iPS細胞之分化細胞群以CD9、CD140a、CD140b、CD271進行染色時之散點圖，縱軸及橫軸設為抗體相對於各細胞表面標記之螢光強度。P6表示CD9(-)且CD140a(+)的細胞群體，P4表示CD9(-)且CD140b(+)的細胞群體，P3表示CD9(-)且CD271(+)的細胞群體。分離 取得圖2A所示之P3且P4且P6的細胞群體。圖2B之2維展開圖自左起為針對分化誘導前之人類iPS細胞、源自人類iPS細胞之分化細胞群、自源自人類iPS細胞之分化細胞群中分選後之P3且P4且P6的細胞群體以流式細胞儀測定OSR1及SIX2的表現而得之圖，縱軸及橫軸設為代替OSR1或SIX2蛋白質的表現之螢光報導子的螢光強度。以百分率表示之數值表示OSR1、SIX2共陽性細胞(OSR1(+)SIX2(+)細胞；右上劃分)、OSR1陽性且SIX2陰性細胞(OSR1(+)SIX2(-)細胞；左上劃分)、OSR1陰性且SIX2陽性細胞(OSR1(-)SIX2(+)細胞；右下劃分)及OSR1、SIX2共陰性細胞(OSR1(-)SIX2(-)細胞；左下劃分)的比例。
〔圖3〕圖3係示出實施例3中之由自源自人類iPS細胞之分化細胞群中分離取得之CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞製作近曲小管樣構造之一例。圖3A係示出以與非專利文獻4同樣的方法形成細胞塊後，與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養之向近曲小管分化之方法。使用已添加屬於BMP7及Rho激酶阻礙劑之Y-27632(Wako，253-00513)之小鼠尿管芽細胞(ureteric bud cells(UBC))馴化培養基，使1×105cells的細胞塊形成。翌日，置換成已添加屬於BMP7、Y-27632及GSK3β阻礙劑之BIO(Wako，029-16241)之小鼠尿管芽細胞馴化培養基，再培養1日後，置於經絲裂黴素C處理完畢之表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞上進行 共培養，施行向近曲小管之分化誘導。圖3B係示出將CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞的細胞塊與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養後之顯微鏡影像(左上)、免疫染色影像(右上、左下)及該等之重合影像(右下)。此外，以箭頭的放大圖示出表現Lotus Tetragonolobus Lectin(LTL)之細胞。圖中，LTL表示近曲小管之標記，Hoechst33342表示細胞核染色劑，此外，比例尺表示100μm。
〔圖4〕圖4係以百分率示出實施例4中之經由陰性選擇標記CD9與陽性選擇標記3種之網羅性組合而得之OSR1(+)SIX2(+)細胞、OSR1(+)SIX2(-)細胞、OSR1(-)SIX2(+)細胞及OSR1(-)SIX2(-)細胞的比例。此外，亦一併示出使用CD55或CD326作為陰性選擇標記CD9的代替時之OSR1(+)SIX2(+)細胞、OSR1(+)SIX2(-)細胞、OSR1(-)SIX2(+)細胞及OSR1(-)SIX2(-)細胞的比例。
〔圖5〕圖5係以百分率示出實施例5中之藉由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)之任意細胞表面標記之組合自原細胞群體中所回收之細胞群體中之OSR1(+)SIX2(+)細胞的比例、以相同細胞表面標記之組合所規定之細胞在原細胞群體中之比例、以及藉由相同細胞表面標記之組合所回收之OSR1(+)SIX2(+)細胞數/原細胞數。
〔圖6〕圖6係示出實施例6中之將自源自人類iPS 細胞201B7株之分化細胞群體中以CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)為指標所分選出之細胞群體分化誘導成近曲小管樣構造之結果。圖6A係示出細胞數相對於OSR1(經由GFP之檢測)、SIX2(經由tdTomato之檢測)及各細胞表面標記的螢光強度之直方圖。圖6B為以流式細胞儀測定源自iPS細胞201B7株之分化細胞群體之CD9、CD140a、CD140b或CD271的表現之結果之2維展開圖。縱軸及橫軸設為抗體相對於各細胞表面標記之螢光強度。CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞係藉由分選出圈選(P4且P2且P3)劃分而分離取得細胞。圖6C係示出將分選後之CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞的細胞塊與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養後之顯微鏡影像與免疫染色影像之重合影像。圖中，LTL表示近曲小管之標記(框內)，比例尺表示100μm。
〔圖7〕圖7係示出實施例7中之源自iPS細胞201B7株之分化細胞群體經由抗SIX2抗體之免疫染色之結果。圖7A係示出分選前之細胞群體之免疫染色影像，圖7B係示出以CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)為指標所分選出之細胞群體之免疫染色影像。圖中，白箭頭表示SIX2陽性細胞，透明箭頭表示SIX2陰性細胞。比例尺表示100μm。A、B皆為照片左方表示明視野影像，照片中央表示經由抗SIX2抗體之染色影像，照片右方表示經由Hoechst33342之核染色影像。
以下詳細地說明本發明。
在本發明中，係提供自由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞群體中，使用細胞表面標記，而取得並製造高純度的腎前驅細胞群體之方法。具體而言，在本發明中，係包含以下方法(以下亦稱為「本發明之製造方法」)：一種製造由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞群體之方法，其係包含：(i)將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞分化之條件下進行培養之步驟；以及(ii)自步驟(i)所獲得之細胞中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之步驟。
在本發明中，復亦提供自包含腎前驅細胞之細胞群體中，使用細胞表面標記來篩選細胞群體之方法。具體而言，在本發明中，係包含以下方法(以下亦稱為「本發明之篩選方法」)：一種自包含腎前驅細胞之細胞群體中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-) 所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之方法。
本發明係包含藉由本發明之製造方法所製造之腎前驅細胞群體。
本發明復包含藉由本發明之篩選方法所獲得之細胞群體。
以下，針對本發明進行說明。
1.步驟(i)：將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞群體分化之條件下進行培養之步驟：作為可在本步驟中使用之由多能性幹細胞誘導向腎前驅細胞群體分化之方法，可列舉非專利文獻4及專利文獻4所記載之方法，但並不限定於此等，可使用任意的方法。由於藉由步驟(ii)中之篩選可將腎前驅細胞進行濃縮，因而在步驟(i)中，只要可獲得包含腎前驅細胞之細胞群體即可，該步驟(i)所獲得之細胞群體中所包含之腎前驅細胞的含有率並無特別問題，可例示5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上或30%以上。
藉由本發明所製造之腎前驅細胞係以腎前驅細胞濃縮而成之細胞群體之形式予以製造，所獲得之細胞群體中所包含之腎前驅細胞的含有率並無特別限定，可例示50%以上、60%以上、65%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上或75%以上。從而，在本發明中，「篩選」係指獲得含有所期望的細胞 50%以上、60%以上、65%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上或75%以上之細胞群體。
在本發明中，腎前驅細胞係意味其一部會朝向腎小管變化之細胞，其係OSR1及SIX2二重陽性(OSR1(+)SIX2(+))之細胞。OSR1可例示由人類OSR1基因(NCBI之存取編號：NM_145260.2)所編碼出之蛋白質，SIX2可例示由人類SIX2基因(NCBI之存取編號：NM_016932.4)所編碼出之蛋白質。OSR1陽性係意味OSR1基因的轉錄活性較高，可例示OSR1的mRNA可藉由公知的方法進行檢測、OSR1的蛋白質可藉由公知的方法進行檢測(實施例1、2及4~6)、或可確認到機能性地連結至OSR1基因的啟動子之標記基因的表現等。SIX2陽性係同樣地意味SIX2基因的轉錄活性較高，可例示SIX2的mRNA可藉由公知的方法進行檢測、SIX2的蛋白質可藉由公知的方法進行檢測(實施例1、2及4~6)、或可確認到機能性地連結至SIX2基因的啟動子之標記基因的表現等。在本發明中，標記基因可例示編碼出螢光蛋白質之基因，但並不限定於此。
在本發明中，多能性幹細胞係指具有能夠分化生物體中所存在之許多性質/形態相異的細胞之多能性，且亦一併擁有增殖能力之幹細胞，包含可誘導成腎前驅細胞之任意的細胞。在多能性幹細胞中，並無特別限定，可包含例如胚性幹細胞(ES細胞)、使用核移植技 術所製作之胚性幹細胞(Nuclear transfer embryonic stem cell；ntES細胞)、精子幹細胞(Germline stem cell；GS細胞)、胚性生殖細胞(Embryonic germ cell；EG細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、源自培養纖維母細胞或骨髓幹細胞之多能性細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell；Muse細胞)等。較佳的多能性幹細胞，從在製造步驟中能夠在不會破壞胚、卵子等之情形下取得之觀點而言，為iPS細胞，更佳為人類iPS細胞。
iPS細胞之製造方法在該領域中係屬公知，可藉由對任意的體細胞導入初期化因子而製造。在此處，初期化因子可例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因產物，此等初期化因子可單獨使用，亦可組合使用。作為初期化因子之組合，可例示WO2007/069666；WO2008/118820；WO2009/007852；WO2009/032194；WO2009/058413；WO2009/057831；WO2009/075119；WO2009/079007；WO2009/091659；WO2009/101084；WO2009/101407；WO2009/102983；WO2009/114949；WO2009/117439；WO2009/126250；WO2009/126251；WO2009/126655；WO2009/157593；WO2010/009015；WO2010/033906；WO2010/033920； WO2010/042800；WO2010/050626；WO 2010/056831；WO2010/068955；WO2010/098419；WO2010/102267；WO 2010/111409；WO 2010/111422；WO2010/115050；WO2010/124290；WO2010/147395；WO2010/147612；Huangfu D,et al.,Nat.Biotechnol.,(2008),26：795-797；Shi Y,et al.,Cell Stem Cell,(2008),2：525-528；Eminli S,et al.,Stem Cells,(2008),26：2467-2474；Huangfu D,et al.,Nat.Biotechnol.,(2008),26：1269-1275；Shi Y,et al.,Cell Stem Cell,(2008),3：568-574；Zhao Y,et al.,Cell Stem Cell,(2008),3：475-479；Marson A,Cell Stem Cell,(2008),3：132-135；Feng B,et al.,Nat.Cell Biol.,(2009),11：197-203；R.L.Judson et al.,Nat.Biotechnol.,(2009),27：459-461；Lyssiotis CA,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2009),106：8912-8917；Kim JB,et al.,Nature,(2009),461：649-643；Ichida JK,et al.,Cell Stem Cell.,(2009),5：491-503；Heng JC,et al.,Cell Stem Cell,(2010),6：167-174；Han J,et al.,Nature,(2010),463：1096-1100；Mali P,et al.,Stem Cells,(2010),28：713-720；Maekawa M,et al.,Nature,(2011),474：225-229.所記載之組合。
在體細胞中，係非限定地，新生兒(仔)的體細胞、及健常人或患者的體細胞皆包含在內，此外，源自該等之初代培養細胞、繼代細胞及株化細胞皆亦包含在內。具體而言，體細胞可例示例如(1)神經幹細胞、造 血幹細胞、間葉系統幹細胞、齒髓幹細胞等組織幹細胞(體性幹細胞)、(2)組織前驅細胞、(3)血液細胞(末梢血細胞、臍帶血細胞等)、肌肉細胞、皮膚細胞、毛細胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等臟器、組織中所存在之分化細胞等。
此外，在使用iPS細胞作為移植用細胞的材料之情況，從不會發生排斥反應之觀點而言，較宜使用移植目標之個體的人類白血球抗原(HLA)基因型為同一或實質上同一之體細胞。在此處，「實質上同一」係指HLA基因型一致而達到對於所移植之細胞可藉由免疫抑制劑來抑制免疫反應之程度，例如具有HLA-A、HLA-B及HLA-DR之3個基因座或該等加上HLA-C之4個基因座係一致之HLA型之體細胞。
在一實施形態中，作為步驟(i)，可使用非專利文獻4及專利文獻4所記載之由多能性幹細胞誘導向腎前驅細胞群體分化之方法，具體而言，包含以下步驟(i-1)~(i-3)：(i-1)將多能性幹細胞以包含選自活化素A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之1種以上物質之培養基進行培養之步驟；(i-2)將步驟(i-1)所獲得之細胞群體以包含選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之1種以上物質之培養基進行培養之步驟；以及 (i-3)將步驟(i-2)所獲得之細胞群體以包含TGFβ訊息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養之步驟。
以下，針對各步驟(i-1)~(i-3)進行說明。
(i-1)將多能性幹細胞以包含選自活化素A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之1種以上物質之培養基進行培養之步驟： 在本步驟中，可將多能性幹細胞以該領域所公知的任意方法進行分離，並藉由懸浮培養或貼附培養進行培養。作為多能性幹細胞之分離方法，可列舉例如機械性分離、或使用具有蛋白酶活性及膠原蛋白酶活性之分離溶液(例如Accutase(註冊商標)及Accumax(Innovative Cell Technologies,Inc))或僅具有膠原蛋白酶活性之分離溶液之分離。較佳為使用具有蛋白酶活性及膠原蛋白酶活性之分離溶液進行解離，並機械性地細小地分散成單一細胞之方法。作為本步驟中所使用之人類多能性幹細胞，較佳係使用相對於所使用之培養皿而言培養至成為80%全滿為止之群落。
在本發明之方法中所使用之懸浮培養係指將細胞以與培養皿非貼附之狀態進行培養，並無特別限定，可使用未經在提升與細胞之貼附性之目的下人工地進行處理(例如經由細胞外基質等之塗覆處理)者或經人工地進行抑制貼附之處理(例如經由聚羥乙基甲基丙烯酸 (poly-HEMA)之塗覆處理)者來進行培養。
在本發明之方法中所使用之貼附培養係指將細胞以貼附於培養皿之狀態進行培養，並無特別限定，亦能夠於經塗覆處理之培養皿中進行培養。作為塗覆劑，可列舉例如基質膠(BD Biosciences)、Synthemax(註冊商標)(Corning)、膠原蛋白、明膠、層黏連蛋白、硫酸肝素蛋白多醣或內動素及此等之組合，較佳為基質膠、Synthemax(註冊商標)或明膠。
在步驟(i-1)中所使用之培養基可在用於培養動物細胞之基礎培養基中添加選自活化素A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之1種以上物質而調製。在一實施形態中，本步驟中所使用之物質為活化素A及GSK-3β阻礙劑之組合或GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之組合。作為基礎培養基，係包含例如Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(α MEM)培養基、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM)培養基、Ham’s F12(F12)培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基及此等之混合培養基等。在培養基中，可含有血清(例如胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS))，或亦可為無血清。視需要可包含例如白蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(Invitrogen)、N2補充物(Invitrogen)、B27補充物(Invitrogen)等1種 以上血清代替物，亦可含有運鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫代甘油、脂質、胺基酸、L-麩胺酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(Non-essential amino acids；NEAA)、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等1種以上物質。在本步驟之一實施形態中，基礎培養基為包含GlutaMAX、血清及抗生物質之DMEM與F12為1：1之混合培養基(DMEM/F12)。
在步驟(i-1)中，作為活化素A，係包含源自人類及其他動物之活化素A以及此等之機能改變體，可使用例如R&D systems公司等之市售品。本步驟中所使用之活化素A的濃度為1ng/ml至1000ng/ml，較佳為10ng/ml至500ng/ml，更佳為50ng/ml至200ng/ml。
在步驟(i-1)中，作為GSK-3β阻礙劑，在屬於可阻礙GSK-3β的機能，例如激酶活性者之前提下，並無特別限定，可列舉例如屬於靛玉紅衍生物之BIO(別名GSK-3β阻礙劑IX；6-溴靛玉紅3’-肟)、屬於馬來醯亞胺衍生物之SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、屬於苯基α溴甲基酮化合物之GSK-3β阻礙劑VII(2,4’-二溴苯乙酮)、屬於細胞膜穿透型磷酸化胜肽之L803-mts(別名GSK-3β胜肽阻礙劑；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2(序列編號15))及具有高選擇性之CHIR99021(6-〔〔2-〔〔4- (2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基〕胺基〕乙基〕胺基〕-3-吡啶甲腈)(Nature,(2008),453：519-523)。此等化合物能夠取自例如Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等，此外，亦可自行製作。作為本步驟中所使用之較佳的GSK-3β阻礙劑，可列舉CHIR99021。本步驟中所使用之GSK-3β阻礙劑的濃度能夠因應所使用之GSK-3β阻礙劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用CHIR99021作為GSK-3β阻礙劑之情況，為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為1μM至3μM。
在步驟(i-1)中，視黃酸衍生物為保持天然的視黃酸所具有之機能且可經人工地修飾之視黃酸，包含例如類視黃醇化合物及維生素A化合物。作為類視黃醇化合物之例，可列舉視黃酸、3-脫氫視黃酸、4-〔〔(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羰基〕胺基〕-安息香酸(AM580)(Tamura K,et al.,Cell Differ.Dev.,(1990),32：17-26)、4-〔(1E)-2-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯-1-基〕-安息香酸(TTNPB)(Strickland S,et al.,Cancer Res.,(1983),43：5268-5272)、Takenaga,K.et al.,Cancer Res.,(1980),40：914-919所記載之化合物、棕櫚酸視黃醇、視黃醇、視黃醛、3-脫氫視黃醇、3-脫氫視黃醛等。視黃酸化合物係指類視黃醇化合物之中，具有羧基之化合物，可列舉例如視黃酸、3-脫氫視黃酸、AM580、TTNPB等。在本步驟之一實 施形態中，視黃酸衍生物為類視黃醇化合物或維生素A化合物。在本步驟之另一實施形態中，視黃酸衍生物為視黃酸化合物，在又另一實施形態中，視黃酸衍生物為維生素A化合物。作為本步驟中所使用之較佳的視黃酸衍生物，可列舉AM580或TTNPB。本步驟中所使用之視黃酸衍生物的濃度能夠因應所使用之視黃酸衍生物而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用AM580或TTNPB作為視黃酸衍生物之情況，為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至2μM。
在步驟(i-1)中所使用之培養基亦可進一步包含ROCK阻礙劑。特定而言，在本步驟係包含使多能性幹細胞分散成單一細胞之步驟之情況，較佳係在培養基中包含ROCK阻礙劑。
ROCK阻礙劑在屬於可抑制Rho-激酶(ROCK)的機能者之前提下，並無特別限定，可列舉例如Y-27632(例如Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.,(2000),57,976-983；Narumiya et al.,Methods Enzymol.,(2000),325,273-284)、Fasudil/HA1077(例如Uehata et al.,Nature,(1997),389：990-994)、H-1152(例如Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.,(2002),93：225-232)、Wf-536(例如Nakajima et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.,(2003),52(4)：319-324)及該等之衍生物、以及相對於ROCK之反義核酸、RNA干涉誘導性核酸(例如siRNA)、顯性負變異體及該等之表現載體。此外，作為ROCK阻礙劑，亦可 使用其他公知的低分子化合物(參照例如美國專利申請案公開第2005/0209261號、同第2005/0192304號、同第2004/0014755號、同第2004/0002508號、同第2004/0002507號、同第2003/0125344號、同第2003/0087919號及國際公開第2003/062227號、同第2003/059913號、同第2003/062225號、同第2002/076976號、同第2004/039796號)。在本發明中，可使用1種或2種以上ROCK阻礙劑。作為本步驟中所使用之較佳的ROCK阻礙劑，可列舉Y-27632。本步驟中所使用之ROCK阻礙劑的濃度能夠因應所使用之ROCK阻礙劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用Y-27632作為ROCK阻礙劑之情況，為0.1μM至100μM，較佳為1μM至50μM，更佳為5μM至20μM。
在步驟(i-1)中，培養溫度並不限定於以下，為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣之環境下施行培養。CO2濃度為約2~5%，較佳為約5%。本步驟之培養時間係例如為2日以下的培養，較佳為2日。
(i-2)將步驟(i-1)所獲得之細胞群體以包含選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之1種以上物質之培養基進行培養之步驟：在本步驟中，可將前述步驟(i-1)所獲得之懸浮培養後之細胞群體依原樣於經塗覆處理之培養皿中，在任意的培養基中進行貼附培養，或者亦可藉由更換培養基而繼 續培養藉由在前述步驟(i-1)中進行貼附培養所獲得之細胞群體。
在步驟(i-2)中所使用之培養基可在用於培養動物細胞之基礎培養基中添加選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所組成群組之1種以上物質而調製。在一實，施形態中，本步驟所使用之物質為BMP7及GSK-3β阻礙劑之組合或視黃酸衍生物。作為基礎培養基，係包含例如IMDM培養基、Medium 199培養基、EMEM培養基、α MEM培養基、DMEM培養基、Ham’s F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基及此等之混合培養基等。在培養基中，可含有血清(例如FBS)，或亦可為無血清。視需要可包含例如白蛋白、KSR(Invitrogen)、N2補充物(Invitrogen)、B27補充物(Invitrogen)等1種以上血清代替物，亦可含有運鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫代甘油、脂質、胺基酸、L-麩胺酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素、增殖因子、抗生物質、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類及此等之同等物質等1種以上物質。在本步驟之一實施形態中，基礎培養基為包含GlutaMAX、KSR、非必需胺基酸、2-巰基乙醇及抗生物質之DMEM/F12。
在步驟(i-2)中，可例如將步驟(i-1)所獲得之細胞群體以包含選自BMP7及GSK-3β阻礙劑之1種 以上物質之培養基進行培養，然後，再以包含視黃酸衍生物之培養基進行培養。較佳係在步驟(i-2)中，將步驟(i-1)所獲得之細胞群體以包含選自BMP7及GSK-3β阻礙劑之1種以上物質之培養基進行培養，然後，再以包含視黃酸衍生物及TGFβ訊息刺激劑之培養基進行培養。即，步驟(i-2)可分成下列步驟(i-2-a)及(i-2-b)之2步驟來施行：(i-2-a)以包含選自BMP7及GSK-3β阻礙劑之1種以上物質之培養基進行培養之步驟；以及(i-2-b)以包含視黃酸衍生物及TGFβ訊息刺激劑之培養基進行培養之步驟。更佳係在步驟(i-2)中，步驟(i-2-a)為以包含BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養之步驟，步驟(i-2-b)為以包含視黃酸衍生物及TGFβ訊息刺激劑之培養基進行培養之步驟。
在步驟(i-2)中，作為BMP7，係包含人類BMP7(NCBI之存取編號：NM_001719.2)及源自其他動物之BMP7以及此等之機能改變體(保持分化誘導能力之改變體)，可使用例如Invitrogen公司、R&D公司等之市售品。本步驟中所使用之BMP7的濃度為1ng/ml至1000ng/ml，較佳為10ng/ml至500ng/ml，更佳為50ng/ml至200ng/ml。
在步驟(i-2)中，GSK-3β阻礙劑可使用針對前述步驟(i-1)所例示之GSK-3β阻礙劑，作為較佳的GSK-3β阻礙劑，可列舉CHIR99021。本步驟中所使用之GSK-3β阻礙劑的濃度能夠因應所使用之GSK-3β阻礙 劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用CHIR99021作為GSK-3β阻礙劑之情況，為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為1μM至3μM。
在步驟(i-2)中，視黃酸衍生物可使用針對前述步驟(i-1)所例示之視黃酸衍生物，作為較佳的視黃酸衍生物，可列舉AM580或TTNPB。本步驟中所使用之視黃酸衍生物的濃度能夠因應所使用之視黃酸衍生物而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用AM580或TTNPB作為視黃酸衍生物之情況，為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至2μM。
在步驟(i-2)中，TGFβ訊息刺激劑在屬於會活化TGFβ訊息路徑者之前提下，並無特別限定，作為TGFβ訊息刺激劑，可例示TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3等蛋白質(能夠取自Peprotech、R&D公司等)、IDE1(1-〔2-〔(2-羧基苯基)亞甲基〕醯肼〕庚酸)及IDE2(庚二酸1-(2-環亞戊基醯肼))(Borowiak M,et al.,Cell Stem Cell,(2009),4：348-358)等化合物。IDE1及IDE2能夠取自Stemgent公司、Tocris公司等。作為較佳的TGFβ訊息刺激劑，可列舉TGFβ1。本步驟中所使用之TGFβ訊息刺激劑的濃度能夠因應所使用之TGFβ訊息刺激劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3等蛋白質作為TGFβ訊息刺激劑之情況之濃度為0.1ng/ml至100ng/ml，較佳為1 ng/ml至10ng/ml，更佳為5ng/ml至10ng/ml。此外，在使用IDE1及IDE2之情況之濃度為1μM至100μM，較佳為25μM至75μM，更佳為40μM至60μM。
在步驟(i-2)中，培養溫度並不限定於以下，為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣之環境下施行培養。CO2濃度為約2~5%，較佳為約5%。作為培養時間，係例如為3日以上的培養，可列舉較佳為3日以上且12日以下，更佳為3日以上且9日以下。此時，培養基較宜每3日進行更換。在步驟(i-2)包含步驟(i-2-a)及(i-2-b)之情況，作為步驟(i-2)之培養時間，係如前述，作為步驟(i-2-a)之培養時間，係例如為1日以上的培養，可列舉較佳為2日以上且11日以下，更佳為2日以上且6日以下，作為步驟(i-2-b)之培養時間，係例如為1日以上的培養，可列舉較佳為2日以上且11日以下，更佳為3日以上且6日以下。此時，培養基較宜每3日進行更換。
藉由前述步驟(i-1)及(i-2)，可由多能性幹細胞誘導出中間中胚層細胞。作為對中間中胚層細胞賦予特徵之標記，已知OSR1，在一實施形態中，在藉由步驟(i-1)及(i-2)所誘導出之細胞群體中，含有許多OSR1陽性SIX2陰性(OSR1(+)SIX2(-))的中間中胚層細胞，亦可包含OSR1及SIX2二重陽性(OSR1(+)SIX2(+))的腎前驅細胞。從而，作為步驟(i)，可以前述步驟(i-1)及(i-2)完成該步驟，但從 提高腎前驅細胞的含有率之觀點而言，較宜進一步施行步驟(i-3)。
(i-3)將步驟(i-2)所獲得之細胞群體以包含TGFβ訊息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養之步驟： 在本步驟中，可將前述步驟(i-1)及(i-2)所獲得之細胞(中間中胚層細胞)群體以該領域所公知的任意方法進行分離或將該細胞依原樣藉由懸浮培養或貼附培養進行培養。作為細胞之分離方法，可列舉例如機械性分離、或使用具有蛋白酶活性及膠原蛋白酶活性之分離溶液(例如Accutase(註冊商標)及Accumax(Innovative Cell Technologies,Inc))或僅具有膠原蛋白酶活性之分離溶液之分離。
在步驟(i-3)中所使用之培養基可對用於培養動物細胞之基礎培養基添加TGFβ訊息刺激劑及BMP阻礙劑而調製。作為基礎培養基，係包含例如IMDM培養基、Medium 199培養基、EMEM培養基、α MEM培養基、DMEM培養基、Ham’s F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基及此等之混合培養基等。在培養基中，可含有血清(例如FBS)，亦可為無血清。視需要可包含例如白蛋白、KSR(Invitrogen)、N2補充物(Invitrogen)、B27補充物(Invitrogen)等1種以上血清代替物，亦可含有運鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫代甘油、脂質、 胺基酸、L-麩胺酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素、增殖因子、抗生物質、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類及此等之同等物質等1種以上物質。在本步驟之一實施形態中，基礎培養基為包含GlutaMAX、KSR、非必需胺基酸、2-巰基乙醇及抗生物質之DMEM/F12。
在步驟(i-3)中，TGFβ訊息刺激劑在屬於會活化TGFβ訊息路徑者之前提下，並無特別限定，作為TGFβ訊息刺激劑，可例示TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3等蛋白質、IDE1及IDE2等化合物。作為較佳的TGFβ訊息刺激劑，可列舉TGFβ1。本步驟中所使用之TGFβ訊息刺激劑的濃度能夠因應所使用之TGFβ訊息刺激劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3等蛋白質作為TGFβ訊息刺激劑之情況之濃度為0.1ng/ml至100ng/ml，較佳為1ng/ml至10ng/ml，更佳為5ng/ml至10ng/ml。此外，在使用IDE1及IDE2之情況之濃度為1μM至100μM，較佳為25μM至75μM，更佳為40μM至60μM。
在步驟(i-3)中，BMP阻礙劑在屬於會活化BMP訊息路徑者之前提下，並無特別限定，作為BMP阻礙劑，可例示Chordin、頭蛋白、濾泡抑素等蛋白質性阻礙劑、Dorsomorphin(6-〔4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基〕-3-吡啶-4-基-吡唑并〔1,5-a〕嘧啶)及其衍生物(Yu et al.,Circulation,(2007),116：II_60；Yu et al.,Nat. Chem.Biol.,(2008),4：33-41；J.Hao et al.,PLoS ONE,(2008),3：e2904)、DMH1(4-〔6-(4-異丙氧基苯基)吡唑并〔1,5-a〕嘧啶-3-基〕喹啉、4-〔6-〔4-(1-甲基乙氧基)苯基〕吡唑并〔1,5-a〕嘧啶-3-基〕-喹啉)以及LDN193189(4-(6-(4-(哌啶-1-基)苯基)吡唑并〔1,5-a〕嘧啶-3-基)喹啉)。此等化合物能夠取自例如Stemgent、Tocris Bioscience、MERCK LIFE SCIENCE或Wako公司等，此外，亦可自行製作。作為較佳的BMP阻礙劑，可列舉DMH1、LDN193189、頭蛋白、及Dorsomorphin，更佳的BMP阻礙劑為DMH1。本步驟中所使用之BMP阻礙劑的濃度能夠因應所使用之BMP阻礙劑而由熟習該項技術者適宜選擇，舉例而言，在使用Chordin、頭蛋白、濾泡抑素等蛋白質性阻礙劑作為BMP阻礙劑之情況之濃度為0.1ng/ml至1000ng/ml，較佳為1ng/ml至500ng/ml，更佳為10ng/ml至100ng/ml。在使用Dorsomorphin、LDN193189、DMH1之情況，為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至1μM。
在一實施形態中，步驟(i-3)所使用之TGFβ訊息刺激劑及BMP阻礙劑之組合為TGFβ1及DMH1。
在步驟(i-3)之培養步驟中，可在基礎培養基中進一步添加纖維母細胞增殖因子(Fibroblast Growth Factor；FGF)9、FGF20、BMP7、視黃酸衍生物及GSK-3 β阻礙劑之任一者或任意的組合。
步驟(i-3)之培養步驟之日數，由於在長期間培養下並不會特別影響腎前驅細胞群體之製造效率，故並無上限，可列舉例如2日以上、4日以上、6日以上、8日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上、16日以上、17日以上、18日以上、19日以上、20日以上。
在步驟(i-3)中，培養溫度並不限定於以下，為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣之環境下施行培養，CO2濃度為約2~5%，較佳為約5%。
2.步驟(ii)：自步驟(i)所獲得之細胞中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之步驟、以及本發明之篩選方法：在步驟(ii)及本發明之篩選方法(以下在本章節中，總稱為「步驟(ii)」)中，係以選自CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271、CD326所組成群組之至少1種細胞表面標記的表現之有無為指標，而自步驟(i)所獲得之細胞群體中篩選出更純化的細胞群體。更具體而言，以針對CD106、CD140a、CD140b、CD165及CD271為陽性，且針對CD9、CD55、及CD326為陰性作為指標。在本說明書中，對於細胞表面標記之 (+)標記係意味細胞針對其抗原為陽性，將CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)及CD271(+)稱為陽性選擇標記。在本說明書中，對於細胞表面標記之(-)標記係意味細胞針對其抗原為陰性，將CD9(-)、CD55(-)及CD326(-)稱為陰性選擇標記。在本說明書中，亦將陽性及陰性的選擇標記總稱為細胞表面標記。
在較佳態樣中，在步驟(ii)中所使用之細胞表面標記之組合可為選自CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD165、CD271、CD326所組成群組之至少2種、3種或4種細胞表面標記之組合。舉例而言，至少2種細胞表面標記之組合較佳可包含選自CD9(-)、CD55(-)及CD326(-)所組成群組之1種陰性選擇標記(較佳為CD9(-))以及選自CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)及CD271(+)所組成群組(較佳為CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)所組成群組)之1種陽性選擇標記之組合。至少3種細胞表面標記之組合較佳可包含選自CD9(-)、CD55(-)及CD326(-)所組成群組之1種陰性選擇標記(較佳為(CD9(-))以及選自CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)及CD271(+)所組成群組(較佳為CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)所組成群組)之2種陽性選擇標記之組合；或者選自CD106(+)、CD140a(+)、CD140b (+)、CD165(+)及CD271(+)所組成群組之3種陽性選擇標記之組合。至少4種細胞表面標記之組合較佳可包含選自CD9(-)、CD55(-)及CD326(-)所組成群組之1種陰性選擇標記(較佳為CD9(-))以及選自CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)及CD271(+)所組成群組之3種陽性選擇標記之組合。在一實施形態中，在步驟(ii)中所使用之細胞表面標記為選自CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)所組成群組之至少2種或3種細胞表面標記，較佳為CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)之組合。
步驟(ii)所使用之細胞表面標記可使用於篩選源自包含人類但不限定於人類之哺乳動物之腎前驅細胞的細胞群體。在篩選人類腎前驅細胞的細胞群體之情況，8種各個人類細胞表面標記之NCBI存取編號係對應如下。
CD9：NM_001769.3(序列編號1)
CD55：NM_000574.4(序列編號3)
CD106：NM_001078.3(序列編號5)
CD140a：NM_006206.4(序列編號7)
CD140b：NM_002609.3(序列編號9)
CD165：geneID_23449
CD271：NM_002507.3(序列編號11)
CD326：NM_002354.2(序列編號13)
在人類的各個細胞表面標記中，係包含具有對應於上述存取編號之核苷酸序列之基因及該基因所編碼出之蛋白質以及天然存在之變異體。
人類CD9係由具有序列編號1的鹼基序列(鹼基編號185~871)之基因所編碼出，其係具有序列編號2的胺基酸序列。人類CD55係由具有序列編號3的鹼基序列(鹼基編號295~1440)之基因所編碼出，其係具有序列編號4的胺基酸序列。人類CD106係由具有序列編號5的鹼基序列(鹼基編號222~2441)之基因所編碼出，其係具有序列編號6的胺基酸序列。人類CD140a係由具有序列編號7的鹼基序列(鹼基編號332~3601)之基因所編碼出，其係具有序列編號8的胺基酸序列。人類CD140b係由具有序列編號9的鹼基序列(鹼基編號470~3790)之基因所編碼出，其係具有序列編號10的胺基酸序列。人類CD271係由具有序列編號11的鹼基序列(鹼基編號126~1409)之基因所編碼出，其係具有序列編號12的胺基酸序列。人類CD326係由具有序列編號13的鹼基序列(鹼基編號359~1303)之基因所編碼出，其係具有序列編號14的胺基酸序列。人類CD165係亦已知為AD2或gp37之37~42kDa的膜表面蛋白質。作為特異性地結合至CD165之抗體，已鑑定出單株抗體SN2(Seon,BK,et al.,J.Immunol.,(1984),132：2089-2095)，該抗體已進行市售。
上述細胞表面標記之天然存在之變異體係意 味針對CD9、CD55、CD106、CD140a、CD140b、CD271及CD326，由相對於上述鹼基序列而言具有至少80%以上，較佳為85%以上、90%以上、95%以上、98%以上的同一性之基因所編碼出、或包含相對於上述胺基酸序列而言具有至少80%以上，較佳為85%以上、90%以上、95%以上、98%以上的同一性之胺基酸序列之細胞表面標記。
針對核酸序列或胺基酸序列，本說明書中之「同一性」係意味藉由NEEDLE program(Needleman SB,et al.,J.Mol.Biol.,(1970),48：443-453)檢索使用預設所準備之參數所獲得之值Identity。前述參數係如下。
Gap penalty=10
Extend penalty=0.5
Matrix=EBLOSUM62
此外，結合至上述人類的細胞表面抗原之特異性抗體已進行市售。作為該種抗體之一例，係包含後述之實施例中所記載者。保有特異性地結合至上述細胞表面標記各者之市售的抗體會進行結合之特徵之細胞表面標記復亦包含在本發明中能夠利用於篩選細胞群體之細胞表面標記中。
在步驟(ii)中，使用細胞表面標記來篩選細胞群體可藉由該領域所公知的各種方法施行。可列舉例如使用特異性地結合至細胞表面標記之抗體，基於該抗體對細胞之結合來篩選細胞之方法。作為此種方法，可列舉使 用經螢光標識之抗體並採用細胞篩選器之方法(例如FACS(註冊商標)(BD Biosciences))、使用已標識抗體之磁珠藉由磁性來篩選細胞之方法(例如MACS(註冊商標)(Miltenyi Biotec))、使用已固定化有抗體之擔體(例如細胞濃縮管柱)之方法等。
3.腎疾患治療劑、腎疾患治療方法及製造腎疾患治療用細胞之方法： 藉由本發明之方法所取得之腎前驅細胞群體能夠利用作腎疾患治療劑。從而，本發明係提供以下腎疾患治療用細胞之製造方法及腎疾患治療用細胞群體之篩選方法：一種製造腎疾患治療用細胞之方法，其係包含：(i)將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞分化之條件下進行培養之步驟；以及(ii)自步驟(i)所獲得之細胞中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選細胞群體之步驟。
一種自包含腎前驅細胞之細胞群體中，使用選自CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)、及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記來篩選腎疾患治療用細胞群體之方法。
本發明中之腎疾患治療用細胞係指以選自 CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)、及CD326(-)所組成群組之至少1種細胞表面標記為特徵之細胞，較佳為以CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)為特徵之細胞。
在本發明中，係提供包含以本發明之製造方法所製造之腎前驅細胞群體或以本發明之篩選方法所篩選出之腎前驅細胞群體之腎疾患治療劑、以及包含將以本發明之製造方法所製造之腎前驅細胞群體或以本發明之篩選方法所篩選出之腎前驅細胞群體投予至患者之步驟之腎疾患治療方法。作為對患者投予腎前驅細胞群體或治療劑之方法，可列舉例如將所取得之腎前驅細胞群體進行薄片化，並貼附於患者的腎臟之方法；將所取得之腎前驅細胞群體懸浮於生理食鹽水等中，藉由直接或經血管投予而移植至患者的腎臟之方法；在由基質膠等所構成之支架上進行三維培養，將所獲得之腎前驅細胞塊進行移植之方法；將腎前驅細胞群體填充於透析管柱中之方法；將腎前驅細胞群體包埋於微膠囊中進行投予之方法等。作為腎疾患，可例示包含未達慢性腎功能不全之狀態之慢性腎臟病。
在本發明中，腎疾患治療劑中所包含之腎前驅細胞的細胞數可配合疾患的嚴重度、患部或軀體的大小而適宜增減並調製。
〔實施例〕
藉由以下實施例進一步具體地說明本發明，但本發明之範圍並不受該等實施例所限制。
〔實施例1〕 <OSR1及SIX2與各種細胞表面標記經由流式細胞儀之腎前驅細胞群體之2維展開>
iPS細胞係使用以非專利文獻3所記載之方法所製作之與內在性OSR1的基因表現連動地表現GFP，並與內在性SIX2的基因表現連動地表現tdTomato之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導子人類iPS細胞株。由此人類iPS細胞株，依照非專利文獻4所記載之方法，施行向包含腎前驅細胞之細胞群體之分化誘導。使用Human Cell Surface Marker Screening Panel(BD Biosciences：560747)，施行在腎前驅細胞中特異性地表現之細胞表面標記的探索之結果，鑑定出CD9(-)、CD55(-)、CD106(+)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD165(+)、CD271(+)及CD326(-)為可明確地劃分出目標之包含腎前驅細胞之細胞群體之細胞表面標記(圖1)。
〔實施例2〕 <在CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)的細胞群體中包含70%以上腎前驅細胞>
藉由複數組合使用實施例1所獲得之細胞表面標記，檢討是否可提高由源自人類iPS細胞之分化細胞群體劃分 出之細胞中所包含之腎前驅細胞的比例。
首先，作為陰性選擇標記係使用1個，作為陽性選擇標記係使用3個，檢討是否可提高源自人類iPS細胞之分化細胞群體中所包含之腎前驅細胞的比例。作為細胞表面標記，係選定在實施例1與OSR1及SIX2之2維展開圖中可獲得細胞群體之明確分離影像之CD9、CD140a、CD140b及CD271，作為對抗各細胞表面標記之抗體，係分別使用APC-H7 Mouse Anti Human CD9(BD Biosciences，655409)、Alexa Fluor(註冊商標)647 Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences，562798)、BV421 Mouse Anti-Human CD140b(BD Biosciences，564124)及BV510 Mouse Anti-Human CD271(BD Biosciences，563451)。各抗體係經20倍稀釋而使用，於室溫使其反應15分鐘。反應後，以含有2%FBS之PBS洗淨2次，使用FACSAria III(註冊商標)(BD Biosciences)進行解析。隨後，由該2維展開圖，設定CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的細胞劃分，分離取得該細胞。將所分離取得之細胞群體再度使用FACSAria III(註冊商標)進行解析，結果細胞群體整體中所包含之OSR1(+)SIX2(+)細胞的比例超過70%(圖2B)。圖2A為將源自人類iPS細胞之分化細胞群以CD9、CD140a、CD140b、CD271進行染色時之散點圖，圖2B之2維展開圖自左起為針對分化誘導前之人類iPS細胞、源自人類iPS細胞之分化細胞群、以及P3且P4且 P6的分選後之細胞群體以流式細胞儀測定OSR1及SIX2的表現而得之圖。
〔實施例3〕 <由藉由CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)篩選而得之細胞群體形成LTL(近曲小管之標記)陽性腎小管樣構造>
作為腎前驅細胞之特徵，除了表現腎前驅細胞標記以外，尚可列舉保有向腎小管細胞之分化能力。因此，為了確認實施例2所獲得之CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞是否為腎前驅細胞，便供試於腎小管分化誘導系統。向腎小管細胞的分化及腎小管樣構造的形成之判定係由屬於近曲小管之標記之LTL的表現、及形態的特徵來施行。
依照非專利文獻4所記載之方法將包含由人類iPS細胞株分化誘導而成之腎前驅細胞之細胞群體使用APC-H7 Mouse Anti Human CD9、Alexa Fluor(註冊商標)647 Mouse Anti-Human CD140a、BV421 Mouse Anti-Human CD140b及BV510 Mouse Anti-Human CD271來施行免疫染色，以FACSAria III(註冊商標)分離取得CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞。將所分離取得之細胞以1.0×105cells/well接種於包含已添加50ng/ml BMP7(R&D，354-BP-010)及10μM Y-27632(Wako，253-00513)之UBC馴化培養基(參照以下)之 紡錘底低貼附96孔盤(住友Bakelite，MS-9096M)中，於37℃、含有5%CO2之空氣環境下培養24小時。接著，將培養基置換成已添加50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Calbiochem，361552)、及10μM Y-27632之UBC馴化培養基，再培養24小時。然後，依照非專利文獻4所記載之方法，與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養。表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞係以4.0×105cells/well接種於24孔盤中並在絲裂黴素C處理後使用。在共培養中係使用UBC馴化培養基，培養2週之後，施行染色。在染色之1次反應中係使用LTL,Biotin Conjugate(Vector Labs，B-1325)，在2次反應中係使用streptavidin,Alexa Fluor(註冊商標)546 conjugate(Life Technologies，S-11225)，在核染色中係使用Hoechst 33342(Life Technologies，H3570)。LTL係經200倍稀釋而使用，於4℃施行反應一晚。此外，streptavidin,Alexa Fluor(註冊商標)546 conjugate係經200倍稀釋而使用，於室溫施行反應1小時。其結果，確認到由CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的細胞群體形成LTL陽性管腔構造(圖3B)。圖3A係示出以與非專利文獻4同樣的方法形成細胞塊後，與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養之向近曲小管分化之方法。圖3B係示出將CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞的細胞塊與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養時之模樣。
<UBC馴化培養基>
以將文獻(Barasch et al.,Am.J.Physiol.,(1997),273,F757-767)記載之方法改良而成之方法製作尿管芽細胞(UBC)馴化培養基。將UBC(受讓自哥倫比亞大學Dr.Barasch，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1997),94,6279-6284)以含有10%FBS之最小必需培養基(MEM；Invitrogen)進行培養。在成為80%全滿時，將細胞以PBS洗淨，將培養基置換成在DMEM與F12為1：1之混合培養基中，包含GlutaMAX、10%KSR、0.1mM非必需胺基酸、0.55mM 2-巰基乙醇及500U/ml青黴素/鏈黴素之培養基。接著，將細胞培養3日而生成培養上清液。培養上清液係在使用前以0.22μm過濾器進行過濾。
〔實施例4〕 <藉由CD9(-)與陽性選擇標記3種之組合所篩選出之腎前驅細胞(OSR1(+)SIX2(+)細胞)的比例>
在使用CD9(-)與實施例1所萃取之陽性選擇標記3種時之網羅性組合(10種)中，使用FACSAria Fusion(註冊商標)(BD Biosciences)調查OSR1(+)SIX2(+)細胞的比例。此外，一併調查在屬於實施例3中可確認能夠分離取得包含腎前驅細胞之細胞群體之組合之CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、CD271(+)中，CD55(-)及CD326(-)是否可成為代替CD9(-)之陰性選擇標記。
使用APC-H7 Mouse Anti Human CD9(BD Biosciences，655409)、Alexa Fluor(註冊商標)647Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences，562798)、BV421 Mouse Anti-Human CD140a(BD Biosciences，562799)、BV421 Mouse Anti-Human CD140b(BD Biosciences，564124)、BV510 Mouse Anti-Human CD271(BD Biosciences，563451)、APC Mouse Anti-Human CD106(BD Biosciences，551147)、BV605 Mouse Anti-Human CD106(BD Biosciences,563307)、CD165-Biotin，人類(Miltenyi Biotec，130-098-536)、CD165-APC，人類(Miltenyi Biotec，130-098-542)、Anti-Human CD55 Biotin(eBioscience，13-0559)及BV605Mouse Anti-Human CD326(BD Biosciences，563182)當作抗體。各抗體係經20倍稀釋而使用，於室溫使其反應15分鐘之後，以PBS洗淨3次並進行解析。此外，生物素化抗體係使用BV605 Streptavidin(BD Biosciences，563260)以500倍稀釋施行2次染色。2次染色係於室溫使其反應15分鐘之後，以PBS洗淨3次並進行解析。將源自人類iPS細胞之分化細胞群體使用FACSAria Fusion(註冊商標)進行解析，由其2維展開圖，設定12種組合之劃分，分離取得各劃分之細胞。將所分離取得之細胞群體再度使用FACSAria Fusion(註冊商標)進行解析，算出細胞群體整體中所包含之OSR1(+)SIX2(+)細胞、OSR1(+)SIX2(-)細胞、OSR1(-)SIX2(+)細 胞及OSR1(-)SIX2(-)細胞的比例(圖4)。其結果，在所有標記之組合中，相對於所分離取得之細胞群體整體而言，皆以較高的比例包含OSR1(+)SIX2(+)細胞。
〔實施例5〕 <可分離取得腎前驅細胞之細胞表面標記之組合的檢討>
在CD9、CD140a、CD140b、CD271的細胞表面標記之組合中，使用實施例4所使用之抗體施行經由FACSAria Fusion(註冊商標)之解析，在屬於陰性選擇標記之CD9(-)以及選自CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)之任意的陽性選擇標記之組合中，算出以各種細胞表面標記所分離取得之細胞群體中所包含之OSR1(+)SIX2(+)細胞的比例。此外，調查以各細胞表面標記組合所規定之細胞在原細胞群體中之比例，並算出以所期望的各表面標記所回收之OSR1(+)SIX2(+)細胞數/原細胞數(圖5)。其結果，在所有細胞表面標記之組合中，皆可濃縮OSR1(+)SIX2(+)細胞，在2種或3種細胞表面標記之組合中，亦能夠以與4種細胞表面標記之組合相同程度之比例濃縮OSR1(+)SIX2(+)細胞。
〔實施例6〕 <可分離取得腎前驅細胞之細胞表面標記之組合的檢討>
在確認使用此細胞表面標記亦可自未導入報導子基因 之人類iPS細胞株中分離取得高純度的腎前驅細胞群體之目的下，將人類iPS細胞(201B7株，受讓自京都大學)供試於分化誘導系統。人類iPS細胞(201B7)係以習知的方法(Takahashi K,et al.,(2007),Cell.131：861-72)維持培養，依照非專利文獻4所記載之方法，施行向包含腎前驅細胞之細胞群體之分化誘導。與實施例3同樣地，使用FACSAria Fusion(註冊商標)分離取得CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞並形成細胞塊後，藉由與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養，確認是否可分離取得保有向腎小管之分化能力之細胞群體。向腎小管分化之判定係由屬於近曲小管之標記之LTL的表現、及形態的特徵來施行。其結果，確認到可由CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的細胞群體形成LTL陽性管腔構造。亦即，可確認在來自人類iPS細胞(201B7)之分化細胞中，使用CD9、CD140a、CD140b及CD271，亦可以高純度分離取得包含腎前驅細胞之細胞群體(圖6C)。圖6A係示出細胞數相對於OSR1(GFP)、SIX2(tdTomato)及各細胞表面標記的螢光強度之直方圖。圖6B為以流式細胞儀測定源自iPS細胞201B7株之分化細胞群體之CD9、CD140a、CD140b或CD271的表現之結果之2維展開圖。圖6C係示出將P4且P2且P3的細胞群體進行分選後，形成細胞塊，與表現Wnt4之NIH3T3纖維母細胞進行共培養之影像。
〔實施例7〕 <可分離取得腎前驅細胞之細胞表面抗原標記之組合的檢討(2)>
與實施例6同樣地將對人類iPS細胞(201B7)進行分化誘導而成之包含腎前驅細胞之細胞群體使用APC-H7Mouse Anti Human CD9、Alexa Fluor(註冊商標)647Mouse Anti-Human CD140a、BV421 Mouse Anti-Human CD140b及BV510 Mouse Anti-Human CD271施行表面抗原之免疫染色，並使用FACSAria Fusion(註冊商標)來分離取得CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)細胞。分離取得細胞後，使用Smear Gell(註冊商標)(GenoStaff，SG-01)塗抹於載玻片上，施行核內轉錄因子之免疫染色。使用anti-SIX2,rabbit poly(Proteintech，11562-1-AP)當作1次抗體，使用Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody Alexa Fluor(註冊商標)488 conjugate(Life Technologies，A21206)當作2次抗體，使用Hoechst 33342(Life Technologies，H3570)當作核染色。使用顯微鏡(KEYENCE，BZ-9000)進行觀察之結果，觀察到CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)的細胞群體，屬於腎前驅細胞的特徵之一之SIX2陽性細胞的比例相較於分選前之分化細胞群體而言係較高(圖7)。
〔產業上之可利用性〕
如以上所詳述，本發明係提供自由多能性幹細胞分化誘導成腎前驅細胞之細胞群體中，使用細胞表面標記取得並製造高純度的腎前驅細胞之方法。本方法所取得之腎前驅細胞可使用於腎功能不全等腎疾患的再生醫療。
〔序列表自由正文〕
序列編號15：L803-mts/GSK-3β胜肽阻礙劑；屬於第1個胺基酸之甘胺酸殘基係在N末端接受透過醯胺鍵之肉豆蔻酸的鍵結；屬於第11個胺基酸之絲胺酸殘基係經磷酸化；屬於第12個胺基酸之脯胺酸係C末端經醯胺化。
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<221> CDS
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<213> Homo sapiens
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<212> PPT
<213> Homo sapiens
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<221> CDS
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Figure 105129345-A0202-12-0070-29
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<213> Homo sapiens
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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Figure 105129345-A0202-12-0080-42
Figure 105129345-A0202-12-0081-43
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Figure 105129345-A0202-12-0083-45
Figure 105129345-A0202-12-0084-46
Figure 105129345-A0202-12-0085-47
<210> 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Figure 105129345-A0202-12-0085-48
Figure 105129345-A0202-12-0086-49
Figure 105129345-A0202-12-0087-50
Figure 105129345-A0202-12-0088-51
Figure 105129345-A0202-12-0089-52
Figure 105129345-A0202-12-0090-53
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
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Figure 105129345-A0202-12-0091-55
Figure 105129345-A0202-12-0092-56
Figure 105129345-A0202-12-0093-57
Figure 105129345-A0202-12-0094-58
<210> 12
<211> 427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Figure 105129345-A0202-12-0095-59
Figure 105129345-A0202-12-0096-60
<210> 13
<211> 1731
<212> DNA
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<220>
<221> CDS
<222> (359)..(1303)
<300>
<308> NM_002354.2
<309> 2015-03-15
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<400> 13
Figure 105129345-A0202-12-0097-61
Figure 105129345-A0202-12-0098-62
Figure 105129345-A0202-12-0099-63
<210> 14
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Figure 105129345-A0202-12-0099-64
Figure 105129345-A0202-12-0100-65
Figure 105129345-A0202-12-0101-66
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L803-mts/GSK-3β胜肽阻礙劑
<220>
<221> LIPID
<222> (1)..(1)
<223> MYRISTATE
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> AMIDATION
<400> 15
Figure 105129345-A0202-12-0101-67

Claims (9)

  1. 一種製造由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞之方法，其係包含：(i)將多能性幹細胞在誘導向腎前驅細胞分化之條件下進行培養之步驟；以及(ii)自步驟(i)所獲得之細胞中，使用下述(a)~(i)中任一之細胞表面標記的組合來篩選細胞群體之步驟，(a)CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(b)CD9(-)、CD165(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(c)CD9(-)、CD140a(+)、CD106(+)、及CD271(+)(d)CD9(-)、CD140a(+)、CD165(+)、及CD271(+)(e)CD55(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(f)CD326(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(g)CD9(-)、CD140a(+)、及CD271(+)(h)CD9(-)、CD140b(+)、及CD271(+)(i)CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)。
  2. 如請求項1之方法，其中，在步驟(ii)中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)作為細胞表面標記。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
  4. 如請求項1或2之方法，其中，多能性幹細胞為人類iPS細胞。
  5. 一種自包含腎前驅細胞之細胞群體中篩選細胞群 體之方法，其係使用下述(a)~(i)中任一之細胞表面標記的組合，(a)CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(b)CD9(-)、CD165(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(c)CD9(-)、CD140a(+)、CD106(+)、及CD271(+)(d)CD9(-)、CD140a(+)、CD165(+)、及CD271(+)(e)CD55(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(f)CD326(-)、CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)(g)CD9(-)、CD140a(+)、及CD271(+)(h)CD9(-)、CD140b(+)、及CD271(+)(i)CD140a(+)、CD140b(+)、及CD271(+)。
  6. 如請求項5之方法，其中，使用CD9(-)、CD140a(+)、CD140b(+)及CD271(+)作為細胞表面標記。
  7. 如請求項5或6之方法，其中，腎前驅細胞為由多能性幹細胞分化誘導而成之腎前驅細胞。
  8. 如請求項7之方法，其中，多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
  9. 如請求項7之方法，其中，多能性幹細胞為人類iPS細胞。
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