ITFI20130303A1 - Metodica per l¿isolamento, purificazione ed amplificazione di progenitori renali cd133+cd24+ dalle urine di pazienti affetti da malattie renali. - Google Patents

Metodica per l¿isolamento, purificazione ed amplificazione di progenitori renali cd133+cd24+ dalle urine di pazienti affetti da malattie renali.

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ITFI20130303A1
ITFI20130303A1 IT000303A ITFI20130303A ITFI20130303A1 IT FI20130303 A1 ITFI20130303 A1 IT FI20130303A1 IT 000303 A IT000303 A IT 000303A IT FI20130303 A ITFI20130303 A IT FI20130303A IT FI20130303 A1 ITFI20130303 A1 IT FI20130303A1
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Laura Lasagni
Elena Lazzeri
Paola Romagnani
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Azienda Ospedaliero Universitaria M Eyer
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Description

DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
METODICA PER L’ISOLAMENTO, PURIFICAZIONE ED AMPLIFICAZIONE DI PROGENITORI RENALI CD133+CD24+ DALLE URINE DI PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIE RENALI.
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo dei metodi per l’isolamento di cellule pluripotenti da campioni di urina.
STATO DELL’ARTE
Recenti studi hanno dimostrato che, a seguito del danno glomerulare, cellule epiteliali glomerulari si distaccano e vengono perse nelle urine come dimostrato sia in modelli murini che in malattie glomerulari dell’uomo. La loro escrezione nelle urine è proposta come un utile marker non-invasivo per valutare l’attività della malattia glomerulare in pazienti affetti da molteplici malattie glomerulari come la glomerulosclerosi focale e segmentale (FSGS), la glomerulonefrite membranosa (MGN), la glomerulonefrite membrano-proliferativa (MPGN) e la nefropatia ad IgA. Risultati recenti dimostrano che le cellule isolate dalle urine non costituiscono una popolazione omogenea ma, piuttosto, si tratta di una popolazione eterogenea esprimente sia i marcatori podocitari sia i marcatori caratteristici delle cellule epiteliali parietali della capsula di Bowman. Questi risultati suggeriscono, quindi, che in corso di attività di malattia glomerulare un significativo numero di progenitori renali, residenti a livello della capsula di Bowman, possano reagire proliferando e distaccandosi dalla loro sede. L’escrezione nelle urine dei progenitori renali offrirebbe la possibilità di isolarli a partire da campioni di urina di pazienti affetti da patologie glomerulari. In accordo con l’ipotesi di isolare cellule staminali dalle urine dei pazienti, recenti lavori hanno dimostrato che cellule staminali possono essere isolate nell’uomo da campioni di urina. Queste cellule mostravano in vitro caratteristiche di progenitore multipotente in grado di differenziarsi verso molteplici lineage cellulari. Tuttavia, tutti i metodi descritti fino ad ora non hanno ben caratterizzato la specifica popolazione di progenitori ottenuta e hanno purificato le popolazioni staminali o di progenitori a bassa efficienza e purezza.
Risulta pertanto evidente la necessità di disporre di un metodo non invasivo per isolare con elevata efficienza, purezza e riproducibilità la popolazione di progenitori renali CD133+CD24+, che possono poi essere facilmente indotte a differenziare in podociti.
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI PBS = PHOSPHATE-BUFFERED SALINE
FBS = Fetal Bovine Serum
EGM-MV = endothelial cell growth medium-microVascular
VRAD = 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3]- and all-trans-retinoic acid (ATRA)-supplemented differentiation medium
(VRAD)
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante metodo per l’isolamento, purificazione ed amplificazione di cellule progenitori renali di pazienti affetti da una malattia renale, detto metodo comprendente la seguente sequenza di operazioni:
sottoporre ad una prima centrifugazione un campione di urina ottenuto da un paziente affetto da una malattia glomerulare su base genetica;
rimuovere il surnatante e risospendere i pellets in PBS;
sottoporre ad una seconda centrifugazione;
rimuovere il surnatante e
trasferire le cellule su una piastra da coltura cellulare e coltivare in un medium di coltura comprendente EGM-MV 20% FBS ed una miscela di antibiotici comprendente penicillina, streptomicina e rifampicina;
dopo 5-7 giorni di coltura rimuovere il medium di coltura, lavare la piastra di coltura con PBS e poi aggiungere detto medium di coltura fresco;
coltivare per almeno altri 7-9 giorni in detto medium di coltura fresco e poi successivamente fino a confluenza di una popolazione di cellule caratterizzate da espressione di marcatori di superficie CD133, CD24 o CD106 caratteristici dei progenitori renali.
Le cellule ottenute con il metodo dell’invenzione sono altamente purificate. Il grado di purificazione con cui sono state ottenute è molto superiore a quanto era stato possibile ottenere con i metodi noti allo stato dell’arte.
Dalla caratterizzazione morfologica si evince che le cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, sono morfologicamente identiche a quelle dei progenitori renali CD133+CD24+ isolati da tessuto renale, permettendo di stabilire, quindi, che le urine rappresentano una nuova sorgente da cui isolare, in modo facile, non invasivo veloce ed efficiente, una popolazione altamente purificata di progenitori renali CD133+CD24+.
La possibilità di disporre di queste cellule per studiare i meccanismi alla base del processo di rigenerazione del danno renale rappresenta una prospettiva di cruciale importanza per la comprensione dei meccanismi che possano diventare nuovi bersagli di un eventuale trattamento terapeutico.
Oggetto della presente invenzione sono quindi anche le cellule ottenute mediante il presente metodo che per la prima volta rende possibile l’ottenimento per ogni singolo paziente, mediante un metodo assolutamente non invasivo, una popolazione di progenitori renali specifici di quella malattia (e in quel paziente). Una possibile applicazione clinica della presente invenzione si basa sull’isolamento dei progenitori renali CD133+CD24+ da campioni di urina di pazienti, preferibilmente pediatrici, affetti da malattie renali, anche a trasmissione genetica, come ad esempio bambini con sindrome nefrosica steroido-resistente associata a mutazioni sul gene della podocina (NPHS2) e sul gene di LMX1B, fattore trascrizionale che regola l’espressione di molti geni podocitari.
L’isolamento dei progenitori renali CD133+CD24+ dalle urine di pazienti con malattie renali, nello specifico malattie genetiche come la sindrome nefrosica steroido-resistente, rende finalmente possibile l’ottenimento di un modello cellulare per lo studio in vitro dell’effetto di mutazioni note e non note alla base di malattie renali (Figura 4). Questo può consentire la diagnosi causale di una malattia genetica anche quando la mutazione è sconosciuta, utilizzando tali cellule come un modello di malattia in ambito clinico.
La presente invenzione propone, quindi, l’utilizzo dei progenitori renali CD133+CD24+ per un futuro uso diagnostico, come modello cellulare per lo screening di farmaci o per lo studio del ruolo funzionale di mutazioni non note coinvolte nelle patologie renali.
Oggetto della presente invenzione è anche un metodo diagnostico che comprende l’isolamento di progenitori renali da urina di pazienti affetti da una malattia renale, in particolare glomerulare, e più in particolare su base genetica, detto isolamento secondo il metodo dell’invenzione.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso dei progenitori renali isolati secondo il metodo dell’invenzione, da urina di pazienti affetti da una malattia glomerulare su base genetica, come modelli cellulari per lo screening in vitro di farmaci per il trattamento di detta malattia o per lo studio in vitro del ruolo funzionale di mutazioni non note coinvolte nelle patologie renali.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Preferibilmente le centrifugazioni del metodo dell’invenzione vengono effettuate a 1200-1800 rpm, più preferibilmente a 1400-1500 rpm, per un tempo compreso fra 3 e 15 min. Preferibilmente la prima centrifugazione può avvenire a 1400 rpm per 10 minuti e la seconda a 1400 rpm per 5 minuti.
Il medium di coltura del metodo secondo l’invenzione comprende EGM-MV 20% FBS ed una miscela di antibiotici. Detta miscela di antibiotici preferibilmente è costituita da penicillina, streptomicina e rafampicina. Più preferibilmente detta miscela è costituita da 100 U/ml di penicillina, streptomicina 1mg/ml e rifampicina 8 mcg/ml.
Dopo i primi 6 giorni di coltura il medium viene rimosso, la piastra lavata e viene aggiunto medium fresco, detto medium fresco sempre comprendente EGM-MV 20% FBS ed una miscela di antibiotici.
Dopo rimozione del primo medium di coltura e lavaggio si ottiene la rimozione, dalla piastra di coltura, delle cellule non adese e dei detriti di coltura.
La fase di coltura in presenza della miscela di antibiotici avviene complessivamente per circa 15 giorni.
Alla fine di questa fase di coltura cellulare in presenza di agenti antibiotici si ottiene una coltura cellulare selezionata che è esente da contaminazione batterica (frequentemente di batteri appartenenti al gruppo degli Enterococchi) e. , Successivamente ai 15 giorni di coltura in presenza della miscela di antibiotici è possibile mantenere la coltura in assenza di antibiotici.
La successiva fase di coltura, essendo già stati selezionati i progenitori renali, e sorprendentemente con elevata purezza, è una coltura di amplificazione di dette cellule.
Preferibilmente il metodo dell’invenzione può essere applicato a campioni di urina da pazienti affetti da sindrome nefrosica steroido-resistente associata a mutazioni genetiche. Più preferibilmente detti pazienti sono di età pediatrica.
I progenitori renali CD133+CD24+, ottenuti con il metodo dell’invenzione, come sopra descritto, possono poi essere differenziati verso il fenotipo podocitario. La differenziazione la si può effettuare coltivando le cellule progenitori renali CD133+CD24+ in un medium di differenziazione (VRAD) costituito da DMEM/F12 supplementato con Vitamina D3 e acido retinoico, per circa 48h.
La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE FIG. 1 – mostra il totale dei campioni di urina raccolti per la messa a punto del metodo dell’invenzione;
FIG. 2 – mostra il diagramma di flusso del metodo della presente invenzione che consente l’isolamento delle cellule progenitori renali CD133+CD24+;
FIG. 3 – mostra A) Immagine di microscopia che mostra la morfologia delle cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, ed espressione dei marcatori di superficie caratteristici dei progenitori renali CD133+CD24+ quali il CD133, il CD24 ed il CD106 come dimostrato dall’analisi citofluorimetrica. B) espressione dei marcatori CD133, CD24, citocheratina, vimentina e uroplachina III in cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, e valutate mediante microscopia confocale. C) volcano plots che mostrano il profilo di espressione genica dei GPCR, dei geni dell’infiammazione e dei microRNA nelle cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, e nei progenitori renali CD133+CD24+.
FIG. 4 – mostra A) Schema esemplificativo delle mutazioni identificate nei tre pazienti: case FD mutazione eterozigote composta sul gene NPHS2, case CL mutazione omozigote sul gene NPHS2; case BCW mutazione eterozigote sul gene LMX1B. B) Espressione della nefrina su un campione di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti da pazienti con malattia glomerulare ma senza mutazioni genetiche (healthy) usato come controllo e sui campioni di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti dai tre pazienti mutati dopo differenziamento a podocita. C) Valutazione dei livelli di mRNA della nefrina nei campioni di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti dai tre pazienti mutati dopo differenziamento a podocita e loro confronto con il campione di controllo (WT) ottenuto da pazienti senza mutazioni genetiche. D) Espressione della podocina (NPHS2) su un campione di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti da pazienti senza mutazioni genetiche (healthy), usato come controllo, e sui campioni di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti dai tre pazienti mutati dopo differenziamento a podocita. E) Valutazione dei livelli di mRNA della podocina nei campioni di progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti dai tre pazienti mutati dopo differenziamento a podocita e loro confronto con il campione di controllo (WT) ottenuto da pazienti senza mutazioni genetiche. F) Valutazione del citoscheletro dopo marcatura con falloidina (verde) in tutti e tre i pazienti analizzati in microscopia confocale. Controcolorazione dei nuclei con Topro-3. u-RPC: urine-derived renal progenitor cells CD133+CD24+.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è un kit of parts per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel metodo dell’invenzione, detto kit comprendente almeno un contenitore contenente un medium di coltura comprendente EGM-MV 20% FBS e una miscela di antibiotici comprendente penicillina, streptomicina e rifampicina. In detto kit preferibilmente il medium di coltura è costituito da EGM-MV 20% FBS e una miscela di antibiotici consistente in penicillina, streptomicina e rifampicina. Più preferibilmente detta miscela di antibiotici è costituita da 100 U/ml di penicillina, streptomicina 1mg/ml e rifampicina 8 mcg/ml.
Detto kit preferibilmente comprendente inoltre almeno un contenitore contenente anticorpi anti-CD133 ed almeno un contenitore contenente anticorpi anti-CD24 ed opzionalmente almeno un contenitore contenente anticorpi anti-CD106.
PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1 - CAMPIONI DI URINA
Un totale di 79 campioni di urina sono stati raccolti da 47 pazienti pediatrici con età compresa fra 0 e 17 anni ed affetti da diverse patologie glomerulari. Come controllo, sono state raccolte urine da bambini sani con età compresa fra 1 e 13 anni (Tabella 1 in FIG.1).
ESEMPIO 2 – ISOLAMENTO, PURIFICAZIONE ED AMPLIFICAZIONE DI PROGENITORI RENALI
I campioni di urina sono stati centrifugati a 1500 rpm per 10min, rimosso il supernatante sono stati sottoposti ad una seconda centrifuga in PBS 1X a 1500rpm per 5min (vedi diagramma di flusso di FIG. 2). Infine, dopo aver rimosso il supernatante, le cellule sono state risospese in EGM-MV 20% FBS. La maggior parte delle cellule nelle urine non si è attaccata alla piastra di coltura e sono state eliminate al cambio del medium dopo 6 giorni di coltura. A seguito della piastratura, solo poche cellule danno origine ad un cluster compatto ed uniforme. Essendo la contaminazione batterica un fenomeno frequente in questo tipo di campioni, tutte le colture ottenute sono state valutate in PCR per la presenza del gene dell’RNA ribosomiale batterico 16S. Successivamente, il prodotto di PCR è stato sottoposto a sequenziamento ed il confronto della sequenza del gene dell’RNA 16S ribosomiale con quelle presenti in GenBank ha dimostrato una omologia del 95% con batteri appartenenti al gruppo degli Enteroccocchi. Uno specifico mix di antibiotici composto da penicillina (100U/ml), streptomicina (1mg/ml) e rifampicina (8µg/ml) è stato aggiunto a tutte le colture ottenute e una ulteriore analisi per la presenza del RNA ribosomiale batterico è stata ripetuta dopo due settimane di trattamento. Alla fine di questo periodo, se le cellule erano prive di contaminazione batterica, gli antibiotici sono stati rimossi. Questo trattamento è stato incluso in un protocollo standardizzato, secondo l’invenzione, per la preparazione delle colture cellulari da campioni di urina come mostrato in Figura 2. Questa metodica di isolamento delle cellule dalle urine, ha permesso di ottenere colture primarie con elevata efficienza e riproducibilità (18 pazienti su 47 pazienti, 38.3%), ed in particolare da 13 pazienti sono state ottenute colture cellulari con rate di crescita esponenziale che ha permesso di espanderle indefinitamente. Nessun paziente di controllo ha dato origine a colture cellulari come mostrato in Tabella I (FIG.1).
ESEMPIO 3 – CARATTERIZZAZIONE DEI PROGENITORI RENALI ISOLATI DALLE URINE
Le cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, mostrano una morfologia simile a quella dei progenitori renali CD133+CD24+ isolati da tessuto renale (Figura 3A), ed esprimono ad elevata intensità i marcatori di superficie caratteristici dei progenitori renali quali il CD133, il CD24 ed il CD106 come dimostrato dopo analisi citofluorimetrica, solitamente in percentuali superiori al 90% (Figura 3A). Questi risultati mostrano che la metodica di isolamento secondo la presente invenzione permette di ottenere, con elevata purezza, una popolazione estremamente omogenea di progenitori renali CD133+CD24+. Inoltre, dopo analisi di microscopia confocale, le cellule isolate dalle urine si sono mostrate anche omogenee per l’espressione dei marcatori citocheratina e vimentina (Figura 3B), mentre non esprimono l’uroplachina III, marcatore caratteristico di urotelio, a dimostrazione, quindi, dell’origine renale delle cellule isolate dalle urine (Figura 3B). Inoltre, le cellule sono state valutate anche per il loro profilo di espressione genica dei G-protein coupled receptor (GPCR) (380 geni), dei geni caratteristici dell’infiammazione (92 geni) e dei microRNA (168 geni), rivelando che il profilo genico delle cellule isolate dalle urine, secondo il metodo dell’invenzione, non è significativamente diverso da quello dei progenitori renali CD133+CD24+ come mostrato in Figura 3C, e che pertanto si tratta della medesima popolazione.
ESEMPIO 4 – DIFFERENZIAZIONE DEI PROGENITORI RENALI ISOLATI DALLE URINE A PODOCITA E STUDIO DEL RUOLO FUNZIONALE DELLE MUTAZIONI sul gene della podocina (NPHS2) e sul gene di LMX1B
Il paziente 1 (case FD) presentava una mutazione eterozigote composta sul gene NPHS2 (NPHS2 c.[413G>A]+[467_468insT]) costituita da una mutazione nota missense su un allele e da una mutazione non nota che causa un frameshift sulla sequenza codificante sull’altro allele. Quest’ultima mutazione determina la comparsa di un codone di STOP che porta alla traduzione della podocina tronca nella porzione C-terminale. Il paziente 2 (case CL) presentava una nota mutazione omozigote sul gene NPHS2 (NPHS2 c.[419delG]+[419delG]) in grado di determinare un frameshift sulla sequenza codificante che determina la comparsa di un codone di STOP che porta alla traduzione di una proteina tronca nella porzione C-terminale. Il paziente 3 (case BCW) presentava una mutazione missense eterozigote sul gene LMX1B non nota (LMX1B c.[833C>T]+[=]) (Figura 4A). Allo scopo di studiare il ruolo funzionale di queste mutazioni sul podocita, i progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti, secondo il metodo dell’invenzione, dalle urine dei tre pazienti sono stati differenziati a podocita e successivamente valutati per l’acquisizione dell’espressione delle proteine nefrina e podocina dopo differenziamento. Per differenziare i progenitori renali CD133+CD24+ verso il fenotipo podocitario, le cellule sono state coltivate nel medium di differenziazione (VRAD) costituito da DMEM/F12 supplementato con Vitamina D3 e acido retinoico, per 48h. In tutti e tre i pazienti è stata valutata l’espressione della nefrina e della podocina (Figura 4B,D). Mentre la nefrina era espressa a normali livelli, l’espressione della podocina era fortemente ridotta nei pazienti con mutazioni sul gene NPHS2, o solo moderatamente ridotta nel paziente con mutazione sul gene LMX1B, rispetto all’espressione osservata nei progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti da pazienti pediatrici senza mutazione genetica e differenziati a podocita (Figura 4B,D). Al contrario di quello osservato sull’espressione delle proteine, nessuna variazione statisticamente significativa dei livelli di mRNA della nefrina e podocina è stata apprezzata nei tre pazienti con mutazioni sul gene NPHS2 e LMX1B rispetto ai progenitori renali CD133+CD24+ ottenuti da pazienti pediatrici senza mutazione genetica (Figura 4C,E). Dato il ruolo chiave svolto dalla podocina e da LMX1B nel mantenimento della corretta organizzazione dei filamenti citoscheletrici, è stato valutato se la ridotta espressione della podocina potesse alterare l’architettura citoscheletrica dei podociti. In tutti e tre i pazienti, l’analisi del citoscheletro valutato mediante marcatura con falloidina, ha dimostrato che la corretta organizzazione dei filamenti di actina del citoscheletro era gravemente alterata ed il numero dei filamenti di actina significativamente ridotto, a dimostrazione del ruolo chiave svolto dalla podocina e dal fattore trascrizionale LMX1B nel mantenimento della corretta architettura del citoscheletro nei podociti (Figura 4F).

Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l’isolamento, purificazione ed amplificazione di cellule progenitori renali di pazienti affetti da una malattia renale, detto metodo comprendente la seguente sequenza di operazioni: sottoporre ad una prima centrifugazione un campione di urina ottenuto da un paziente affetto da una malattia glomerulare su base genetica; rimuovere il surnatante e risospendere i pellets in PBS; sottoporre ad una seconda centrifugazione; rimuovere il surnatante; trasferire le cellule su una piastra da coltura cellulare e coltivare in un medium di coltura comprendente EGM-MV 20% FBS e una miscela di antibiotici comprendente penicillina, streptomicina e rifampicina; dopo 5-7 giorni di coltura rimuovere il medium di coltura, lavare la piastra di coltura con PBS e poi aggiungere detto medium di coltura fresco; coltivare per almeno altri 7-9 giorni, in detto medium di coltura fresco e poi successivamente fino a confluenza di una popolazione di cellule caratterizzate da espressione di marcatori di superficie CD133, CD24 o CD106 caratteristici dei progenitori renali.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta miscela è costituita da penicillina, streptomicina e rifampicina.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 3 in cui detta miscela è costituita da 100 U/ml di penicillina, streptomicina 1mg/ml e rifampicina 8 mcg/ml.
  4. 4. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 in cui successivamente ai primi 12-16 giorni complessivi di coltura in medium di coltura con miscela di antibiotici, la coltura è mantenuta in assenza di antibiotici.
  5. 5. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-4 in cui detta malattia renale è glomerulare.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5 in cui detta malattia glomerulare è su base genetica.
  7. 7. Metodo diagnostico per malattie renali, detto metodo diagnostico comprendente il metodo d’isolamento di progenitori renali secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-6.
  8. 8. Cellule progenitori renali di pazienti affetti da una malattia renale isolate mediante il metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-6.
  9. 9. Uso delle cellule secondo la rivendicazione 8 come modelli cellulari in vitro per lo screening di farmaci per il trattamento di detta malattia.
  10. 10. Uso delle cellule secondo la rivendicazione 78 come modelli cellulari per lo studio in vitro del ruolo funzionale di mutazioni non note coinvolte nelle patologie renali.
  11. 11. Kit of parts per l’uso simultaneo, separato o sequenziale nel metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-6, detto kit comprendente almeno un contenitore contenente un medium di coltura comprendente EGM-MV 20% FBS e una miscela di antibiotici comprendente penicillina, streptomicina e rifampicina.
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