RU2730861C2 - Способ продуцирования почечных клеток-предшественников - Google Patents

Способ продуцирования почечных клеток-предшественников Download PDF

Info

Publication number
RU2730861C2
RU2730861C2 RU2018112687A RU2018112687A RU2730861C2 RU 2730861 C2 RU2730861 C2 RU 2730861C2 RU 2018112687 A RU2018112687 A RU 2018112687A RU 2018112687 A RU2018112687 A RU 2018112687A RU 2730861 C2 RU2730861 C2 RU 2730861C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
leu
glu
ser
val
gly
Prior art date
Application number
RU2018112687A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018112687A3 (ru
RU2018112687A (ru
Inventor
Тацуя КАВАМОТО
Юкико ЯМАГИСИ
Кендзи ОСАФУНЕ
Original Assignee
Астеллас Фарма Инк.
Киото Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Астеллас Фарма Инк., Киото Юниверсити filed Critical Астеллас Фарма Инк.
Publication of RU2018112687A3 publication Critical patent/RU2018112687A3/ru
Publication of RU2018112687A publication Critical patent/RU2018112687A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2730861C2 publication Critical patent/RU2730861C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0687—Renal stem cells; Renal progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к продуцированию почечных клеток-предшественников, в которые дифференцируются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС-клетки) и отбору клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественники. Способ включает культивирование иПС-клеток в условиях, индуцирующих дифференцировку в почечные клетки-предшественники и разделение клеточной популяции из клеток, полученных на стадии (i), путем отбора по маркерам клеточной поверхности: CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+). Способ включает использование по меньшей мере двух маркеров клеточной поверхности, включающих комбинацию одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-), и одного маркера позитивного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+) или трех маркеров клеточной поверхности, включающих комбинацию одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-), и двух маркеров положительного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+), или трех маркеров положительного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+). Способ включает использование двух маркеров клеточной поверхности, выбранных из группы, состоящей из CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+). Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 пр.

Description

Область, к которой относится изобретения
[0001] Настоящее изобретение относится к способу продуцирования почечных клеток-предшественников (ПКП) с использованием маркера клеточной поверхности для идентификации и продуцирования популяции ПКП с высокой степенью чистоты из ПКП-содержащей клеточной популяции, дифференцированной из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК).
Предпосылки создания изобретения
[0002] Почки являются важным органом, функция которых заключается в поддержании хорошего физического состояния благодаря фильтрации и удалению из крови токсических веществ и нежелательных продуктов, генерируемых посредством метаболической активности в организме. Почечная недостаточность представляет собой тяжелое заболевание, которое нарушает функцию почек, но поскольку пока еще не разработана эффективная лекарственная терапия, в настоящее время, лечение такого заболевания осуществляют путем трансплантации почек, диализа или т.п. Однако, при трансплантации почек возникает проблема, связанная с отсутствием органов-доноров, а при диализе возникают проблемы, связанные с развитием осложнений и с очень высокой стоимостью лечения, а поэтому необходимо разработать новый способ терапии такого заболевания.
[0003] Тем не менее, уже имеются сообщения о плюрипотентных клетках, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированнные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК), полученные путем введения перепрограммирующего(их) фактора(ов) в соматические клетки (PTL 1 и 2). В настоящее время проводятся различные исследования по разработке нового способа лечения почечной недостаточности, который включает трансплантацию почечных клеток, полученных путем индуцирования дифференцировки таких ПСК. Другой целью исследований является разработка терапевтического лекарственного средства для лечения почечной недостаточности с использованием гомогенных почечных клеток, происходящих от таких ПСК.
[0004] Известно, что развитие почек у млекопитающих проходит в три стадии: пронефрос, мезонефрос и метанефрос, и из этих стадий, метанефрос наблюдается в задней области промежуточной мезодермы. В проведенных ранее исследованиях рассматривался метод индуцирования дифференцировки мышиных ПСК в промежуточную мезодерму (NPL 1), и был идентифицирован фактор транскрипции 1, ассоциированный с нечетным исключением (OSR1) как характеристический маркер промежуточной мезодермы. Кроме того, гомеобокс SIX 2 (SIX2) известен как один из факторов характеризации ПКП (NPL 2 и 3). В результате исследования, проводимого с использованием человеческих иПСК (человеческих иПС-клеток, являющихся репортерами для OSR1-GFP), которые были получены путем введения гена белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра (GFP), с помощью вектора на основе искусственной бактериальной хромосомы (BAC) посредством гомологичной рекомбинации с эндогенным аллелем OSR1, было обнаружено, что человеческие ПСК были успешно дифференцированы в промежуточную мезодерму посредством активина А, белка Wnt, белка морфогенеза кости (BMP) и различных низкомолекулярных соединений (NPL 3, PTL 3). Затем, в результате исследования, проводимого с использованием человеческих иПС-клеточных линий, которые являются репортерами для OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, и которые были получены путем введения белка, флуоресцирующего в красном диапазоне спектра, tdTomato, в локусы SIX2, присутствующие в человеческих иПС-клеточных линиях, являющихся репортерами для OSR1-GFP, с применением метода гомологичной рекомбинации, разработанного Mae, et al. (NPL 3), была успешно создана система индуцирования дифференцировки человеческих ПСК в ПКП и было подтверждено, что полученные таким образом ПКП являются терапевтически эффективными у моделей с острым поражением почек (NPL 4, PTL 4).
Список цитируемой литературы
Патентная литература
[0005] PTL 1: US 5843780
PTL 2: WO 2007/069666
PTL 3: WO 2012/011610
PTL 4: WO 2014/200115.
Не-патентная литература
[0006] NPL 1: Mae S, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (2010), 393:877-882;
NPL 2: Kobayashi A, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:169-181;
NPL 3: Mae S, et al., Nat. Commun., (2013), 4:1367;
NPL 4: Toyohara T, et al., Stem Cells Transl. Med., (2015), 4:980-992.
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0007] Целью настоящего изобретения является разработка способа выявления и продуцирования популяции ПКП высокой чистоты из популяции ПКП, в которую дифференцируются индуцированные ПСК, путем идентификации маркера клеточной поверхности, специфичного к ПКП.
Решение проблемы
[0008] Для достижения вышеупомянутой цели, авторами настоящего изобретения были проведены интенсивные исследования, и в результате было впервые обнаружено, что популяция ПКП с высокой чистотой может быть выявлена и продуцирована из ПКП-содержащей клеточной популяции с использованием маркера клеточной поверхности, выбранного из CD9-негативного (CD9(-)), CD55-негативного (CD55(-)), CD106-позитивного (CD106(+)), CD140a-позитивного (CD140a(+)), CD140b-позитивного (CD140b(+)), CD165-позитивного (CD165(+)), CD271-позитивного (CD271(+)) и CD326-негативного (CD326(-)) маркера. И на основе этих данных было создано настоящее изобретение.
Более конкретно, настоящее изобретение имеет признаки, определенные ниже.
[1] Способ продуцирования почечных клеток-предшественников, в которые дифференцируются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, где указанный способ включает стадии:
(i) культивирования плюрипотентных стволовых клеток в условиях, индуцирующих дифференцировку в почечные клетки-предшественники; и
(ii) отбора клеточной популяции из клеток, полученных в стадии (i), с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-).
[2] Способ, представленный в [1], где в стадии (ii), отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере двух маркеров клеточной поверхности.
[3] Способ, представленный в [1], где в стадии (ii), отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности.
[4] Способ, представленный в [1], где в стадии (ii), отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере четырех маркеров клеточной поверхности.
[5] Способ, представленный в [1], где в стадии (ii) используются по меньшей мере два маркера клеточной поверхности, выбранные из группы, состоящей из CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+).
[6] Способ, представленный в [5], где в стадии (ii), отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности.
[7] Способ, представленный в [4], где в стадии (ii), CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+) используются в качестве маркеров клеточной поверхности.
[8] Способ, представленный в любом из [1]-[7], где плюрипотентными стволовыми клетками являются индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки.
[9] Способ, представленный в любом из [1]-[7], где плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие иПС-клетки.
[10] Популяция почечных клеток-предшественников, полученная способом, представленным в любом из [1]-[9].
[11] Способ отбора клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественники, с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-).
[12] Способ, представленный в [11], где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере двух маркеров клеточной поверхности.
[13] Способ, представленный в [11], где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности.
[14] Способ, представленный в [11], где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере четырех маркеров клеточной поверхности.
[15] Способ, представленный в [1], где используются по меньшей мере два маркера клеточной поверхности, выбранные из группы, состоящей из CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+).
[16] Способ, представленный в [15], где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности.
[17] Способ, представленный в [11], где CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+) используются в качестве маркеров клеточной поверхности.
[18] Способ, представленный в любом из [11]-[17], где почечными клетками-предшественниками являются почечные клетки-предшественники, в которые дифференцируются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
[19] Способ, представленный в любом из [11]-[17], где плюрипотентными стволовыми клетками являются индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки.
[20] Способ, представленный в любом из [11]-[17], где плюрипотентными стволовыми клетками являются человеческие иПС-клетки.
[21] Клеточная популяция, идентифицированная способом, представленным в любом из [11]-[20].
Преимущественные эффекты изобретения
[0009] В соответствии с настоящим изобретением, авторам настоящего изобретения впервые удалось выявить и продуцировать популяцию ПКП с высокой чистотой из популяции ПКП, в которую были дифференцированы индуцированные ПСК (например, иПСК) с использованием маркера клеточной поверхности. Популяция ПКП, выявленная способом согласно изобретению, может быть использована для восстановительной терапии почечных заболеваний, таких как почечная недостаточность.
Краткое описание чертежей
[0010] [Фиг. 1] На фиг. 1 представлена серия двухмерных графиков рассеяния, построенных по данным проточного цитометрического анализа экспрессии CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271 и CD326 по сравнению с OSR1 и SIX2. На оси Y представлена интенсивность флуоресценции антитела против каждого из различных маркеров клеточной поверхности, а на оси Х представлена интенсивность флуоресценции флуоресцентного репортера, репрезентативного для экспрессии белка OSR1 или SIX2.
[Фиг. 2] На фиг. 2 представлены результаты отбора CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеток из группы дифференцированных клеток, происходящих из чиПСК, как было осуществлено в Примере 2. На фиг. 2A представлена серия блок-схем для групп дифференцированных клеток, происходящих из чиПСК, окрашенных маркерами CD9, CD140a, CD140b и CD271. На осях Y и Х представлены интенсивности флуоресценции для антител против различных маркера клеточной поверхности. P6 означает присутствие CD9(-)CD140a(+)-клеточной популяции; P4 означает присутствие CD9(-)CD140b(+)-клеточной популяции; а P3 означает присутствие CD9(-)CD271(+)-клеточной популяции. Клеточная популяция P3+P4+P6, представленная на фиг. 2A, была фракционирована. На фиг. 2B представлена серия двухмерных графиков рассеяния, построенных по данным проточного цитометрического анализа экспрессии OSR1 и SIX2 в чиПСК до индуцирования дифференцировки, в группах дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК, и в популяции клеток P3+P4+P6, отобранных из групп дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК, соответственно, как показано на панелях слева направо. На осях Y и Х представлены интенсивности флуоресценции флуоресцентного репортера, репрезентативного для экспрессии белка OSR1 или SIX2. Процентные величины означают проценты клеток, позитивных по двум OSR1/SIX2 (OSR1(+)SIX2(+)-клеток; верхняя правая фракция), OSR1-позитивных, SIX2-негативных клеток (OSR1(+)SIX2(-)-клеток; верхняя левая фракция) OSR1-негативных, SIX2-позитивных клеток (OSR1( )SIX2(+)-клеток; нижняя правая фракция), и клеток, негативных по двум OSR1/SIX2 (OSR1( )SIX2(-)-клеток; нижняя левая фракция).
[Фиг. 3] На фиг. 3 представлен пример структур, подобных проксимальным почечным канальцам и полученных как описано в примере 3 из CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеток, отобранных из группы дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК. На фиг. 3A проиллюстрирована процедура дифференцировки в проксимальные почечные канальцы, где образуются клеточные агрегаты, которые культивируют вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3 в соответствии с процедурой, описанной в NPL 4. Клеточные агрегаты, состоящие из 1×105 клеток, были получены с использованием среды, кондиционированной мышиными почкующимися клетками мочеточника (UBC) и содержащей BMP7 и ингибитор Rho-киназы Y-27632 (Wako; Cat. No. 253-00513). На следующий день, культуральную среду заменяли средой, которая была кондиционирована мышиными UBC, и в которую были добавлены BMP7, Y-27632 и ингибитор GSK-3β BIO (Wako; Cat. No. 029-16241), после чего, клетки культивировали в течение одного дня, а затем, их совместно культивировали на верхнем слое Wnt4-экспрессирующих фибробластов NIH3T3, обработанных митомицином С для индуцирования дифференцировки клеток в проксимальные почечные канальцы. На фиг. 3B показано изображение под микроскопом (верхняя левая панель) CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточных агрегатов после их совместного культивирования с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3; изображения указанных клеточных агрегатов, полученные под микроскопом для иммунологического окрашивания (верхняя правая и нижняя левая панели), и изображения, совмещенные друг с другом (нижняя правая панель). Кроме того, клетки, экспрессирующие лектин четырехдольчатого лотоса (LTL), представлены как увеличенное изображение, на которое указывают стрелки. На этих панелях, LTL представляет собой маркер проксимальных почечных канальцев, Hoechst33342 представляет собой краситель для окрашивания клеточного ядра, а черта под графиком означает масштаб в 100 мкм.
[Фиг. 4] На фиг. 4 представлены проценты OSR1(+)SIX2(+)- клеток, OSR1(+)SIX2(-)-клеток, OSR1(-)SIX2(+)-клеток и OSR1(-)SIX2(-)-клеток в клеточных популяциях, отобранных в Примере 4, по всем исчерпывающим комбинациям маркера негативного отбора CD9 и любых трех маркеров позитивного отбора. На этой фигуре представлены проценты OSR1(+)SIX2(+)-клеток, OSR1(+)SIX2(-)-клеток, OSR1(-)SIX2(+)-клеток и OSR1(-)SIX2(-)-клеток в клеточных популяциях, отобранных с использованием других комбинаций маркеров, в которых вместо CD9 используется маркер негативного отбора CD55 или CD326.
[Фиг. 5] На фиг. 5 представлены следующие проценты клеток: процент OSR1(+)SIX2(+)-клеток в клеточных популяциях, отобранных в примере 5 из неотсортированных клеточных популяций с использованием любой комбинации маркеров клеточной поверхности CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+); процент клеток, промаркированных для каждой комбинации различных клеточных маркеров в неотсортированной клеточной популяции; и процент числа OSR1(+)SIX2(+)-клеток, отобранных с использованием каждой комбинации различных маркеров клеточной поверхности по числу неотсортированных клеток.
[Фиг. 6] На фиг. 6 представлены результаты индуцирования дифференцировки клеточной популяции, отобранной из популяции дифференцированных клеток, происходящих от линии чиПСК 201B7, с использованием CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) как индикатора превращения в структуры, подобные проксимальным почечным канальцам, как показано в Примере 6. На фиг. 6A представлены серии гистограмм зависимости числа клеток от интенсивности флуоресценции каждого из OSR1 (детектированного по GFP), SIX2 (детектированного по tdTomato) и других маркеров клеточной поверхности. На фиг. 6B представлена серия графиков рассеяния, построенных по данным проточного цитометрического анализа экспрессии CD9 по сравнению с CD140a, CD140b или CD271 в популяции дифференцированных клеток, происходящих от линии иПСК 201B7. На осях Y и Х представлены интенсивности флуоресценции для антител против различных маркеров клеточной поверхности. CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клетки были фракционированы путем отбора фракций (P4+P2+P3) в окне возбуждения. На фиг. 6C представлены совмещенные изображения, полученные под микроскопом и микроскопом для иммунологического окрашивания отобранных CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточных агрегатов после их совместного культивирования с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3. На этой панели, LTL представляет собой маркер проксимальных почечных канальцев (показано в рамке), а черта под графиком означает масштаб в 100 мкм.
[Фиг. 7] На фиг. 7 представлены результаты иммунологического окрашивания популяции дифференцированных клеток, происходящих от линии иПСК 201B7, анти-SIX2 антителами, как описано в Примере 7. На фиг. 7A представлена серия изобрежений, полученных с помощью иммунологического окрашивания неотсортированной клеточной популяции, а на фиг. 7B представлена серия изобрежений, полученных с помощью иммунологического окрашивания клеточной популяции, отобранной с использованием CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) в качестве индикатора. На этих панелях, белыми сплошными стрелками показаны SIX2-позитивные клетки, а белыми контурными стрелками показаны SIX2-негативные клетки. Черта под графиком означает масштаб в 100 мкм. На фиг. 7A и 7B, на левой панели представлено изображение в световом поле, на центральной панели представлено изображение окрашивания анти-SIX2 антителом, а на правой панели представлено изображение окрашивания ядра реагентом Hoechst33342.
Описание вариантов осуществления изобретения
[0011] Настоящее изобретение более подробно описано ниже.
[0012] Настоящее изобретение относится к способу идентификации и продуцирования популяции ПКП с высокой чистотой из популяции ПКП, в которую дифференцируются индуцированные ПСК, с использованием маркера клеточной поверхности. В частности, настоящее изобретение включает описанный ниже способ (далее также называемый «способом продуцирования настоящего (данного) изобретения»):
«Способ продуцирования популяции почечных клеток-предшественников, в которые дифференцируются индуцированные плюрипатентные стволовые клетки, включает стадии:
(i) культивирования плюрипотентных стволовых клеток в условиях, индуцирующих дифференцировку в почечные клетки-предшественники; и
(ii) отбора клеточной популяции из клеток, полученных в стадии (i), с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-)».
[0013] Настоящее изобретение также относится к способу отбора клеточной популяции из ПКП-содержащей клеточной популяции с использованием маркера клеточной поверхности. В частности, настоящее изобретение включает описанный ниже способ (далее также называемый «способом отбора настоящего (данного) изобретения»):
«Способ отбора клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественники, с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-)».
[0014] Настоящее изобретение включает популяцию почечных клеток-предшественников, полученных способом продуцирования согласно изобретению.
[0015] Настоящее изобретение также включает клеточную популяцию, отобранную способом отбора согласно изобретению.
[0016] Ниже приводится описание настоящего изобретения.
1. Стадия (i) культивирования ПСК в условиях, индуцирующих дифференцировку в популяцию ПКП:
Процедурой индуцирования дифференцировки ПСК в популяцию ПКП, которая может быть проведена в этой стадии, может быть любая процедура, включая, но не ограничиваясь ею, процедуру, описанную в NPL 4 и PTL 4. В стадии (i) необходимо получить лишь клеточную популяцию, содержащую ПКП, поскольку ПКП могут быть концентрированы путем проведения последующего отбора на стадии (ii). Процентное содержание ПКП в клеточной популяции, полученной в стадии (i), не имеет большого значения и составляет, например, не менее, чем 5%, не менее, чем 10%, не менее, чем 15%, не менее, чем 20%, не менее, чем 25%, или не менее, чем 30%.
[0017] В настоящем изобретении, ПКП продуцируют как клеточную популяцию концентрированных ПКП. Процентное содержание ПКП в продуцированной клеточной популяции не имеет конкретных ограничений и составляет, например, не менее, чем 50%, не менее, чем 60%, не менее, чем 65%, не менее, чем 70%, не менее, чем 71%, не менее, чем 72%, не менее, чем 73%, не менее, чем 74%, или не менее, чем 75%. В соответствии с этим, как описано в настоящем изобретении, термин «отбор» означает получение клеточной популяции, содержащей нужные клетки в концентрации не менее, чем 50%, не менее, чем 60%, не менее, чем 65%, не менее, чем 70%, не менее, чем 71%, не менее, чем 72%, не менее, чем 73%, не менее, чем 74%, или не менее, чем 75%.
[0018] Как описано в настоящем изобретении, термин «почечные клетки-предшественники (ПКП)» означает клетки, частично превращающиеся в почечные канальцы и в клетки, позитивные по двум OSR1/SIX2 (OSR1(+)SIX2(+)). Так, например, OSR1 представляет собой белок, кодируемый человеческим геном OSR1 (NCBI Accession No. NM_145260.2), а SIX2 представляет собой белок, кодируемый человеческим геном SIX2 (NCBI Accession No. NM_016932.4). «OSR1-позитивный (OSR1(+))» означает, что активность транскрипции OSR1 является высокой, а более конкретно, это означает, например, что мРНК OSR1 может быть детектирована известным методом, белок OSR1 может быть детектирован известным методом (Примеры 1, 2 и 4-6), или может наблюдаться экспрессия маркерного гена, функционально сцепленного с промотором OSR1. Аналогичным образом, «SIX2-позитивный (SIX2(+))» означает, что активность транскрипции SIX2 является высокой, а более конкретно, это означает, например, что мРНК SIX2 может быть детектирована известным методом, белок SIX2 может быть детектирован известным методом (Примеры 1, 2 и 4-6), или может наблюдаться экспрессия маркерного гена, функционально сцепленного с промотором SIX2. Как описано в настоящем изобретении, «маркерный ген» означает, но не ограничиваются им, например, ген, кодирующий флуоресцентный белок.
[0019] Как описано в настоящем изобретении, термин «плюрипотентные стволовые клетки» (ПСК)» означает стволовые клетки, которые не только обладают плюрипотентностью, но и дифференцируются в клетки многих типов с различными свойствами и морфологией, обнаруженными у живых организмов, а также обладают способностью к пролиферации, и этот термин включает клетки любого типа, способные превращаться в ПКП. Примерами ПСК являются, но не ограничиваются ими, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), эмбриональные стволовые клетки с перенесенным ядром (ntESC), которые были продуцированы методом переноса ядра; зародышевые стволовые клетки (ЗСК), эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗК), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) и плюрипотентные клетки, происходящие от культивированных фибробластов или миелоидных стволовых клеток (клетки, индуцирующие стресс, способствующий дифференцировке в клетки множества линий дифференцировки; клетки Мюзе). Предпочтительными ПСК являются иПСК, а более предпочтительно, человеческие иПСК, с той точки зрения, что такие клетки могут быть получены без разрушения эмбриона яйцеклетки или т.п. в процессе продуцирования клетки.
[0020] Методы продуцирования иПСК уже известны специалистам, и иПСК могут быть продуцированы путем введения перепрограммирующего(их) фактора(ов) в соматические клетки любого типа. Как описано в настоящей заявке, термин «перепрограммирующий(ие) фактор(ы)» означает ген(ы) или генный(е) продукт(ы), такой(ие) как Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, бета-катенин, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 или Glis1. Такие перепрограммирующие факторы могут быть использованы отдельно или в комбинации. Репрезентативными комбинациями перепрограммирующих факторов являются комбинации, описанные в каждой из нижеследующих заявок и публикаций: WO 2007/069666; WO 2008/118820; WO 2009/007852; WO 2009/032194; WO 2009/058413; WO 2009/057831; WO 2009/075119; WO 2009/079007; WO 2009/091659; WO 2009/101084; WO 2009/101407; WO 2009/102983; WO 2009/114949; WO 2009/117439; WO 2009/126250; WO 2009/126251; WO 2009/126655; WO 2009/157593; WO 2010/009015; WO 2010/033906; WO 2010/033920; WO 2010/042800; WO 2010/050626; WO 2010/056831; WO 2010/068955; WO 2010/098419; WO 2010/102267; WO 2010/111409; WO 2010/111422; WO 2010/115050; WO 2010/124290; WO 2010/147395; WO 2010/147612; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26: 795 797; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 2: 525-528; Eminli S, et al., Stem Cells, (2008), 26:2467-2474; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26:1269-1275; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3: 568-574; Zhao Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:475-479; Marson A, Cell Stem Cell, (2008), 3: 132-135; Feng B, et al., Nat. Cell Biol., (2009), 11:197-203; R. L. Judson et al., Nat. Biotechnol., (2009), 27:459-461; Lyssiotis C.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009), 106:8912-8917; Kim J.B., et al., Nature, (2009), 461:649-643; Ichida J.K., et al., Cell Stem Cell, (2009), 5:491-503; Heng J.C., et al., Cell Stem Cell, (2010), 6:167-174; Han J, et al., Nature, (2010), 463:1096-1100; Mali P, et al., Stem Cells, (2010), 28:713-720; и Maekawa M, et al., Nature, (2011), 474:225-229.
[0021] Неограничивающими примерами соматических клеток являются не только соматические клетки всех типов, присутствующих у новорожденных и у здоровых или больных индивидуумов, но также и первичные культивированные клетки всех типов, пассированные клетки и укоренившиеся клетки, происходящие от вышеупомянутых соматических клеток. Конкретными примерами соматических клеток являются: (1) стволовые клетки тканей (соматические стволовые клетки), такие как стволовые клетки нервов, гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и стволовые клетки пульпы зуба; (2) тканевые клетки-предшественники; и (3) дифференцированные клетки, присутствующие в органах и тканях, такие как клетки крови (например, клетки периферической крови, клетки крови пупочного канатика), мышечные клетки, клетки кожи, клетки волос, клетки печени, клетки слизистой желудка, клетки тонкой кишки, клетки селезенки, клетки поджелудочной железы, клетки головного мозга, клетки почечного эпителия, почечные клетки и жировые клетки.
[0022] Если иПСК используюся как материал для трансплантации клеток, то желательно использовать соматические клетки, имеющие такой же или, в основном, такой же генотип человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA), как и у репипиентов с трансплантацией, для того, чтобы не происходило отторжения трансплантата. Используемое здесь словосочетание «в основном, тот же самый», если оно относится к генотипу человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA), означает, что соматические клетки имеют соответствующий HLA-генотип, при котором иммунный ответ на трансплантированные клетки может подавляться иммунным супрессором. Примерами таких соматических клеток являются клетки, имеющие один и тот же тип HLA в трех различных локусах HLA-A, HLA-B и HLA-DR, или в четырех различных локусах HLA-A, HLA-B, HLA-DR и HLA-C.
[0023] В одном из вариантов осуществления изобретения, стадию (i) осуществляют с помощью процедуры индуцирования дифференцировки ПСК в популяцию ПКП, как описано в NPL 4 и PTL 4. В частности, стадия (i) включает следующие стадии (i-1)-(i-3):
(i-1) культивирования ПСК в культуральной среде с добавлением по меньшей мере одного вещества, выбранного из активина A, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты;
(i-2) культивирования клеточной популяции, полученной в стадии (i-1), в культуральной среде с добавлением по меньшей мере одного вещества, выбранного из BMP7, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты; и
(i-3) культивирования клеточной популяции, полученной в стадии (i-2), в культуральной среде с добавлением стимулятора сигнала TGFβ и ингибитора BMP.
[0024] Ниже представлено описание стадий (i-1)-(i-3).
[0025] Стадия (i-1) культивирования ПСК в культуральной среде с добавлением по меньшей мере одного вещества, выбранного из активина A, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты:
В этой стадии, ПСК могут быть диссоциированы с помощью любой процедуры, известной специалистам, и культивированы в суспензионной культуре или в адгезионной культуре. Репрезентативные процедуры диссоциации ПСК включают механическую диссоциацию и диссоциацию с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеолитической и коллагенолитической активностью (например, Accutase® и Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)), или раствора для диссоциации, обладающего только коллагенолитической активностью. Предпочтительной является процедура, при которой ПСК подвергают диссоциации с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеолитической и коллагенолитической активностью, и тонкому механическому диспергированию с получением одиночных клеток. Человеческими ПСК, предпочтительно, используемыми в этой стадии, являются колонии ПСК, культивированные до достижения 80% конфлюэнтности на чашку, используемую для культивирования.
[0026] Суспензионная культура, используемая в способе согласно изобретению, означает культуру клеток, культивируемых так, чтобы они не прилипали к чашке для культивирования. Суспензионная культура может быть культивирована без ограничений, с использованием сосуда, который не был искусственно обработан (например, покрытием внеклеточным матриксом) для усиления клеточной адгезии, или с использованием сосуда, который был искусственно обработан (например, покрытием полимером гидроксиэтилметакрилата) (поли-HEMA)) для предотвращения адгезии клеток.
[0027] Адгезионная культура, используемая в способе согласно изобретению, означает культуру клеток, культивируемых так, чтобы они прилипали к чашке для культивирования. Адгезионная культура может быть также культивирована, без ограничений, в чашке для культивирования с покрытием. Репрезентативными агентами для нанесения покрытий являются матригель (BD Biosciences), Synthemax® (Corning), коллаген, желатин, ламинин, сульфат гепарана, протеогликан или энтактин и их комбинации, причем, предпочтительными являются матригель, Synthemax® или желатин.
[0028] Культуральная среда, используемая в стадии (i-1), может быть получена путем добавления по меньшей мере одного вещества, выбранного из активина A, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты, в базальную среду, испольуемую для культивирования клеток животных. В одном из вариантов осуществления изобретения, веществами, испольуемыми в этой стадии, являются комбинация активина A и ингибитора GSK-3β или комбинация ингибитора GSK-3 и производного ретиноевой кислоты. Примерами базальной среды являются модифицированная по способу Исков среда Дульбекко (IMDM), среда 199, минимальная поддерживающая среда Игла (EMEM), альфа-модифицированная минимальная поддерживающая среда Игла (αMEM), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), среда Хемса F12 (F12), среда RPMI 1640, среда Фишера и их смеси. В культуральную среду может быть добавлена сыворотка (например, фетальная бычья сыворотка (FBS)), либо такая среда может быть бессывороточной. При необходимости, культуральная среда может быть заменена по меньшей мере одной средой, содержащей вместо сыворотки добавку, такую как альбумин, агент для модификации сывороточной среды (KSR) (Invitrogen), добавка N2 (Invitrogen), и/или добавка B27 (Invitrogen), либо в эту среду может быть также добавлено по меньшей мере одно вещество, такое как трансферрин, жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, 3' тиолглицерин, липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, факторы роста, низкомолекулярные соединения, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградная кислота, буферы и/или неорганические соли. В одном из вариантов этой стадии, базальной средой является смешанная среда DMEM/F12 (1:1), в которую были добавлены GlutaMAX, сыворотка и антибиотик.
[0029] Примерами активина А, который может быть использован в стадии (i-1), являются белки активина А, происходящие от человека и других животных, и их функциональные варианты, представленные как продукты активина А, поставляемые R&D Systems и другими производителями. Концентрация активина А, испольуемого в этой стадии, составялет в пределах от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, предпочтительно, от 10 нг/мл до 500 нг/мл, а более предпочтительно, от 50 нг/мл до 200 нг/мл.
[0030] Ингибитор GSK-3β, используемый в стадии (i-1), не имеет конкретных ограничений, при условии, что он способен ингибировать функции GSK-3β, такие как киназная активность. Репрезентативными ингибиторами GSK-3β являются: производное индирубина BIO (также называемое ингибитором GSK-3β IX; 6-броминдирубин-3'-оксим), производное малеимида SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1Н-пиррол-2,5-дион), фенил-α-бромметилкетоновое соединение ингибитора GSK-3β VII (2,4'-дибромацетофенон), фосфорилирующий пептид, проникающий через клеточную мембрану, L803-mts (также называемый ингибитором пептида GSK-3β; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2 (SEQ ID NO: 15)) и в высокой степени селективный ингибитор GSK CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(5-метил-1Н-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]-3-пиридинкарбонитрил) (Nature, (2008), 453: 519-523). Перечисленные выше соединения поставляются Stemgent, Calbiochem, Biomol и другими производителями, либо они могут быть получены самим специалистом. Предпочтительным примером ингибитора GSK-3β, используемого в этой стадии, является CHIR99021. Концентрация ингибитора GSK-3β, используемого в этой стадии, может быть выбрана самим специалистом в зависимости от типа используемого ингибитора GSK-3β. Так, например, при использовании CHIR99021 в качестве ингибитора GSK-3β, концентрация этого ингибитора составляет в пределах от 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 0,1 мкМ до 10 мкМ, а более предпочтительно, от 1 мкМ до 3 мкМ.
[0031] Производное ретиноевой кислоты, используемое в стадии (i-1), представляет собой, но необязательно, искусственно модифицированную ретиноевую кислоту, которая сохраняет функции природной ретиноевой кислоты. Примерами производных ретиноевой кислоты являются ретиноидные соединения и соединения витамина A. Примерами ретиноидных соединений являются ретиноевые кислоты, 3-дегидроретиноевая кислота, 4-[[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталинил)карбонил]амино]бензойная кислота (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev., (1990), 32: 17-26), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропен-1-ил]бензойная кислота (TTNPB) (Strickland S, et al., Cancer Res., (1983), 43: 5268-5272), где эти ретиноевые соединения описаны Takenaga, K. et al., Cancer Res., (1980), 40: 914-919; пальмитат ретинола, ретинол, ретиналь, 3-дегидроретинол и 3-дегидроретиналь. Соединения ретиноевой кислоты представляют собой ретиноидные соединения, имеющее карбоксильную группу, например, ретиноевые кислоты, 3-дегидроретиноевая кислота, AM580 и TTNPB. В одном из вариантов этой стадии, производным ретиноевой кислоты являются ретиноидное соединение или соединение витамина А. В другом варианте этой стадии, производным ретиноевой кислоты является соединение ретиноевой кислоты. В еще одном варианте этой стадии, производным ретиноевой кислоты являются соединение витамина А. Предпочтительным примером производного ретиноевой кислоты, используемого в этой стадии, является AM580 или TTNPB. Концентрация производного ретиноевой кислоты, используемой в этой стадии, может быть соответствующим образом выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого производного ретиноевой кислоты. Так, например, при использовании AM580 или TTNPB в качестве производного ретиноевой кислоты, концентрация этого производного составляет в пределах от 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 0,1 мкМ до 10 мкМ, а более предпочтительно, от 0,5 мкМ до 2 мкМ.
[0032] Культуральная среда, используемая в стадии (i-1), может дополнительно содержать ингибитор ROCK. В частности, если эта стадия включает диспергирование ПСК с образованием одиночных клеток, то предпочтительно, чтобы эта культуральная среда содержала ингибитор ROCK.
[0033] Тип ингибитора ROCK не имеет конкретных ограничений, при условии, что он способен ингибировать функции Rho-киназы (ROCK). Репрезентативными ингибиторами ROCK являются Y 27632 (например, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol., (2000), 57, 976-983; Narumiya et al., Methods Enzymol., (2000), 325, 273-284), фазудил/HA1077 (например, Uehata et al., Nature, (1997), 389: 990-994), H-1152 (например, Sasaki et al., Pharmacol. Ther., (2002), 93: 225-232), Wf-536 (например, Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., (2003), 52(4): 319-324) и их производные, а также антисмысловые нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, индуцирующие интерференцию РНК (например, киРНК), и доминантно-негативные варианты, нацеленные на ROCK, и их экспрессионные векторы. В качестве ингибиторов ROCK могут быть использованы и другие известные низкомолекулярные соединения (см, например, публикации заявок на патент США 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344 и 2003/0087919 и публикации Международных патентных заявок WO 2003/062227, WO 2003/059913, WO 2003/062225, WO 2002/076976 и WO 2004/039796). В настоящем изобретении могут быть использованы один или два или более ингибиторов ROCK. Предпочтительным примером ингибитора ROCK, используемого в этой стадии, является Y-27632. Концентрация ингибитора ROCK, используемого в этой стадии, может быть соответствующим образом выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого ингибитора ROCK. Так, например, если Y-27632 используется в качестве ингибитора ROCK, то концентрация этого ингибитора составляет в пределах от 0,1 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 1 мкМ до 50 мкМ, а более предпочтительно, от 5 мкМ до 20 мкМ.
[0034] Стадию культивирования клеток (i-1) осуществляют при температуре, которая составляет, но не ограничивается ею, приблизительно 30-40°C, предпочтительно, приблизительно 37°C, и в атмосфере CO2-содержащего воздуха. Концентрация CO2 составляет в пределах приблизительно от 2 до 5%, а предпочтительно, приблизительно 5%. Время культивирования в этой стадии составляет, например, не более, чем 2 дня, а предпочтительно, 2 дня.
[0035] Стадия (i-2) культивирования клеточной популяции, полученной в стадии (i-1), в культуральной среде с добавлением по меньшей мере одного вещества, выбранного из BMP7, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты:
В этой стадии, популяция суспензионных клеточных культур, полученных в стадии (i-1), описанной выше, может быть культивирована в адгезионных условиях, как это осуществляют для для данной культуральной среды в чашке для культивирования с покрытием, либо популяция адгезионных клеточных культур, полученных в стадии (i-1), может быть впоследствии культивирована с заменой культуральной среды.
[0036] Культуральная среда, используемая в стадии (i-2), может быть получена путем добавления по меньшей мере одного вещества, выбранного из BMP7, ингибиторов GSK-3β и производных ретиноевой кислоты, в базальную среду, используемую для культивирования клеток животных. В одном из вариантов осуществления изобретения, веществом(ами), используемым(и) в этой стадии, является (являются) комбинация BMP7 и ингибитора GSK-3β или производное ретиноевой кислоты. Примерами базальной среды являются IMDM, среда 199, EMEM, αMEM, DMEM, среда Хэмса F12, среда RPMI 1640, среда Фишера и их смеси. В культуральную среду может быть добавлена сыворотка (например, FBS), либо такая среда может быть бессывороточной. При необходимости, культуральная среда может быть заменена по меньшей мере одной средой, содержащей вместо сыворотки добавку, такую как альбумин, KSR (Invitrogen), добавка N2 (Invitrogen) и/или добавка B27 (Invitrogen), либо в эту среду может быть также добавлено по меньшей мере одно вещество, такое как трансферрин, жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, 3' тиолглицерин, липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, факторы роста, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградная кислота, буферы, неорганические соли и их эквиваленты. В одном из вариантов этой стадии, базальной средой является среда DMEM/F12, в которую были добавлены GlutaMAX, KSR, NEAA, 2-меркаптоэтанол и антибиотик.
[0037] В стадии (i-2), например, клеточная популяция, полученная в стадии (i-1), может быть культивирована в культуральной среде, в которую было добавлено по меньшей мере одно вещество, выбранное из BMP7 и ингибиторов GSK-3β, а затем в культуральной среде, в которую было добавлено производное ретиноевой кислоты. Предпочтительно, стадия (i-2) включает культивирование клеточной популяции, полученной в стадии (i-1), в культуральной среде, в которую было добавлено по меньшей мере одно вещество, выбранное из BMP7 и ингибиторов GSK-3β, а затем в культуральной среде, в которую было добавлено производное ретиноевой кислоты и стимулятор сигнала TGFβ. Другими словами, стадия (i-2) может быть осуществлена путем проведения двух отдельных нижеследующих стадий (i-2-a) и (i-2-b):
(i-2-a) культивирования клеточной популяции в культуральной среде, в которую было добавлено по меньшей мере одно вещество, выбранное из BMP7 и ингибиторов GSK-3β; и
(i-2-b) культивирования клеточной популяции в культуральной среде, в которую было добавлено производное ретиноевой кислоты и стимулятор сигнала TGFβ.
Более предпочтительно, стадия (i-2) включает стадию (i-2-a) культивирования клеточной популяции в культуральной среде, в которую были добавлены BMP7 и ингибитор GSK-3β, и стадию (i-2-b) культивирования клеточной популяции в культуральной среде, в которую было добавлено производное ретиноевой кислоты и стимулятор сигнала TGFβ.
[0038] Примерами BMP7, которые могут быть использованы в стадии (i-2), являются человеческие белки BMP7 (NCBI Accession No. NM_001719.2) и белки BMP7, происходящие от других животных, и их функциональные варианты (варианты, сохраняющие способность индуцировать дифференцировку), представленные продуктами BMP7, которые являются коммерчески доступными и поставляются Invitrogen, R&D Systems и другими производителями. Концентрация BMP7, используемого в этой стадии, составляет в пределах от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, предпочтительно, от 10 нг/мл до 500 нг/мл, а более предпочтительно, от 50 нг/мл до 200 нг/мл.
[0039] Примерами ингибитора GSK-3β, который может быть использован в стадии (i-2), являются ингибиторы, упомянутые выше при описании стадии (i-1). Предпочтительным примером ингибитора GSK-3β является CHIR99021. Концентрация ингибитора GSK-3β, используемого в этой стадии, может быть выбрана самим специалистом в зависимости от типа используемого ингибитора GSK-3β. Так, например, при использовании CHIR99021 в качестве ингибитора GSK-3β, концентрация этого ингибитора составляет в пределах от 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 0,1 мкМ до 10 мкМ, а более предпочтительно, от 1 мкМ до 3 мкМ.
[0040] Примерами производного ретиноевой кислоты, которое может быть использован в стадии (i-2), являются производные, упомянутые выше при описании стадии (i-1). Предпочтительным примером производного ретиноевой кислоты, используемого в этой стадии, является AM580 или TTNPB. Концентрация производного ретиноевой кислоты, используемой в этой стадии, может быть соответствующим образом выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого производного ретиноевой кислоты. Так, например, при использовании AM580 или TTNPB в качестве производного ретиноевой кислоты, концентрация этого производного составляет в пределах от 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 0,1 мкМ до 10 мкМ, а более предпочтительно, от 0,5 мкМ до 2 мкМ.
[0041] Тип стимулятора сигнала TGFβ, используемого в стадии (i-2), не имеет конкретных ограничений, при условии, что он способен активировать путь передачи сигнала TGFβ. Примерами стимуляторов сигнала TGFβ являются белки, такие как TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 (поставляемые Peprotech, R&D и другими производителями), и соединения, такие как IDE1 (1 [2 [(2 карбоксифенил)метилен]гидразид]гептановая кислота) и IDE2 (1 (2 циклопентилиденгидразид)гептандионовая кислота) (Borowiak M, et al., Cell Stem Cell, (2009), 4: 348-358). IDE1 и IDE2 поставляются Stemgent, Tocris и другими производителями. Предпочтительным примером стимулятора сигнала TGFβ является TGFβ1. Концентрация стимулятора сигнала TGFβ, используемого в этой стадии, может быть выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого стимулятора сигнала TGFβ. Так, например, при использовании любых белков, таких как TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 в качестве стимулятора сигнала TGFβ, концентрация этого стимулятора составляет в пределах от 0,1 нг/мл до 100 нг/мл, предпочтительно, от 1 нг/мл до 10 нг/мл, а более предпочтительно, от 5 нг/мл до 10 нг/мл. При использовании любых IDE1 и IDE2 в качестве стимулятора сигнала TGFβ, концентрация этого стимулятора составляет в пределах от 1 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 25 мкМ до 75 мкМ, а более предпочтительно, от 40 мкМ до 60 мкМ.
[0042] Стадию культивирования клеток (i-2) осуществляют при температуре, которая составляет, но не ограничивается ею, приблизительно 30-40°C, предпочтительно, приблизительно 37°C, и в атмосфере CO2-содержащего воздуха. Концентрация CO2 составляет в пределах приблизительно от 2 до 5%, а предпочтительно, приблизительно 5%. Время культивирования в этой стадии составляет, например, не менее, чем 3 дня, предпочтительно, не менее, чем 3 дня и не более, чем 12 дней, а более предпочтительно, не менее, чем 3 дня и не более, чем 9 дней. При проведении этой стадии, культуральную среду желательно заменять через каждые 3 дня. Если стадия (i-2) включает стадии (i-2-a) и (i-2-b), то общий период культивирования в стадии (i-2) является таким, как он был описан выше, а более конкретно, время культивирования в стадии (i-2-a) составляет, например, не менее, чем один день, предпочтительно, не менее, чем 2 дня, и не более, чем 11 дней, более предпочтительно, не менее, чем 2 дня, и не более, чем 6 дней, а время культивирования в стадии (i-2-b) составляет, например, не менее, чем один день, предпочтительно, не менее, чем 2 дня, и не более, чем 11 дней, а более предпочтительно, не менее, чем 3 дня, и не более, чем 6 дней. При проведении этих стадий, культуральную среду желательно заменять через каждые 3 дня.
[0043] При проведении стадий (i-1) и (i-2), как описано выше, ПСК могут быть индуцированы в промежуточные мезодермальные клетки. OSR1 известен как маркер, характеризующий промежуточные мезодермальные клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения, клеточная популяция, индуцированная в нижеследующих стадиях (i-1) и (i-2), содержит большое число OSR1-позитивных и SIX2-негативных (OSR1(+)SIX2(-)) промежуточных мезодермальных клеток, но может также содержать почечные клетки-предшественники, позитивные по двум OSR1/SIX2 (OSR1(+)SIX2(+)). В соответствии с этим, стадия (i) может быть проведена путем осуществления стадий (i-1) и (i-2), описанных выше, но для увеличения содержания ПКП, желательно проводить не только вышеуказанные две стадии, но также и стадию (i-3).
[0044] Стадия (i-3) культивирования клеточной популяции, полученной в стадии (i-2), в культуральной среде, в которую были добавлены стимулятор сигнала TGFβ и ингибитор BMP:
В этой стадии, клеточная популяция (промежуточных мезодермальных клеток), полученная в стадиях (i-1) и (i-2), описанных выше, может быть культивирована в суспензионной культуре или в адгезионной культуре, в том виде, в котором они были получены, или после диссоциации любым известным методом. Репрезентативные процедуры диссоциации клеток включают механическую диссоциацию и диссоциацию с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеолитической и коллагенолитической активностью (например, Accutase® и Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)), или раствора для диссоциации, обладающего только коллагенолитической активностью.
[0045] Культуральная среда, используемая в стадии (i-3), может быть получена путем добавления стимулятора сигнала TGFβ и ингибитора BMP в базальную среду, используемую для культивирования клеток животных. Примерами базальной среды являются IMDM, среда 199, EMEM, αMEM, DMEM, среда Хэмса F12, среда RPMI 1640, среда Фишера и их смеси. В культуральную среду может быть добавлена сыворотка (например, FBS), либо такая среда может быть бессывороточной. При необходимости, культуральная среда может быть заменена по меньшей мере одной средой, содержащей вместо сыворотки добавку, такую как альбумин, KSR (Invitrogen), добавка N2 (Invitrogen) и/или добавка B27 (Invitrogen), либо в эту среду может быть также добавлено по меньшей мере одно вещество, такое как трансферрин, жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, 3' тиолглицерин, липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, факторы роста, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградная кислота, буферы, неорганические соли и их эквиваленты. В одном из вариантов этой стадии, базальной средой является среда DMEM/F12, в которую были добавлены GlutaMAX, KSR, NEAA, 2-меркаптоэтанол и антибиотик.
[0046] Тип стимулятора сигнала TGFβ, используемого в стадии (i-3), не имеет конкретных ограничений, при условии, что он способен активировать путь передачи сигнала TGFβ. Примерами стимуляторов сигнала TGFβ являются белки, такие как TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3, и соединения, такие как IDE1 и IDE2. Предпочтительным примером стимулятора сигнала TGFβ является TGFβ1. Концентрация стимулятора сигнала TGFβ, используемого в этой стадии, может быть выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого стимулятора сигнала TGFβ. Так, например, при использовании любых белков, таких как TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 в качестве стимулятора сигнала TGFβ, концентрация этого стимулятора составляет в пределах от 0,1 нг/мл до 100 нг/мл, предпочтительно, от 1 нг/мл до 10 нг/мл, а более предпочтительно, от 5 нг/мл до 10 нг/мл. При использовании любых IDE1 и IDE2 в качестве стимулятора сигнала TGFβ, концентрация этого стимулятора составляет в пределах от 1 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 25 мкМ до 75 мкМ, а более предпочтительно, от 40 мкМ до 60 мкМ.
[0047] Тип ингибитора BMP, используемого в стадии (i-3), не имеет конкретных ограничений, при условии, что он способен активировать путь передачи сигнала BMP. Примерами ингибиторов BMP являются белковые ингибиторы, такие как хордин, ноггин и фоллистатин, дорсоморфин (6-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-3-пиридин-4-ил-пиразоло[1,5-a]пиримидин) и их производные (Yu et al., Circulation, (2007), 116:II_60; Yu et al., Nat. Chem. Biol., (2008), 4:33-41; J. Hao et al., PLoS ONE, (2008), 3:e2904), DMH1 (4-[6-(4-изопропоксифенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]хинолин, 4-[6-[4-(1-метилэтокси)фенил]пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]хинолин) и LDN193189 (4-(6-(4-(пиперидин-1-ил)фенил) пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]хинолин). Перечисленные выше соединения поставляются Stemgent, Tocris Bioscience, Merck Life Science, Wako, и другими производителями, либо они могут быть получены самим специалистом. Предпочтительными примерами ингибитора BMP являются DMH1, LDN193189, ноггин и дорсоморфин, а более предпочтительным примером является DMH1. Концентрация ингибитора BMP, используемого в этой стадии, может быть выбрана специалистом в данной области в зависимости от типа используемого ингибитора BMP. Так, например, при использовании любых белковых ингибиторов, таких как хордин, ноггин и фоллистатин, в качестве ингибитора BMP, концентрация этого ингибитора составляет в пределах от 0,1 нг/мл до 1000 нг/мл, предпочтительно, от 1 нг/мл до 500 нг/мл, а более предпочтительно, от 10 нг/мл до 100 нг/мл. При использовании дорсоморфина, LDN193189 и DMH1 в качестве ингибитора BMP, концентрация этого ингибитора составляет в пределах от 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно, от 0,1 мкМ до 10 мкМ, а более предпочтительно, от 0,5 мкМ до 1 мкМ.
[0048] В одном из вариантов осуществления изобретения, комбинация стимулятора сигнала TGFβ и ингибитора BMP, используемых в стадии (i-3), представляет собой комбинацию TGFβ1 и DMH1.
[0049] В стадии культивирования клеток (i-3), в базальную среду могут быть также добавлены любые или в любых комбинациях, фактор роста фибробластов FGF9, FGF20, BMP7, производное ретиноевой кислоты и ингибитор GSK-3β.
[0050] Какого-либо верхнего предела числа дней культивирования клеток в стадии (i-3) не существует, поскольку длительность культивирования клеток не оказывает какого-либо существенного влияния на эффективность продуцирования популяции ПКП. Так, например, время культивирования клеток составляет не менее, чем 2 дня, не менее, чем 4 дня, не менее, чем 6 дней, не менее, чем 8 дней, не менее, чем 10 дней, не менее, чем 11 дней, не менее, чем 12 дней, не менее, чем 13 дней, не менее, чем 14 дней, не менее, чем 15 дней, не менее, чем 16 дней, не менее, чем 17 дней, не менее, чем 18 дней, не менее, чем 19 дней, или не менее, чем 20 дней.
[0051] Стадию культивирования клеток (i-3) осуществляют при температуре, которая составляет, но не ограничивается ею, приблизительно 30-40°C, предпочтительно, приблизительно 37°C, и в атмосфере CO2-содержащего воздуха. Концентрация CO2 составляет в пределах приблизительно от 2 до 5%, а предпочтительно, приблизительно 5%.
[0052] 2. Стадия (ii) отбора клеточной популяции из клеток, полученных в стадии (i), с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-), а также способ отбора согласно изобретению:
В стадии (ii) и в способе отбора согласно изобретению (далее называемыми в этом разделе общим термином «стадия (ii)»), популяцию клеток с более высокой степенью очистки отбирают из клеток, полученных в стадии (i), по присутствию или отсутствию по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271 и CD326, в качестве индикатора. Более конкретно, отбор клеток осуществляют с использованием индикатора, указывающего на то, что клетки являются позитивными по CD106, CD140a, CD140b, CD165 и CD271, и негативными по CD9, CD55 и CD326. В описании настоящего изобретения, символ «плюс» (+), используемый для некоторых маркеров клеточной поверхности, означает, что клетки являются позитивными по некоторым антигенам, а CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+) означают «маркеры позитивного отбора». В этом описанни, символ «минус» (-), используемый для некоторых маркеров клеточной поверхности, означает, что клетки являются негативными по некоторым антигенам, а CD9(-), CD55(-) и CD326(-) означают «маркеры негативного отбора». Кроме того, маркеры позитивного и негативного отбора могут называться общим термином «маркеры клеточной поверхности».
[0053] В предпочтительном варианте, комбинацией маркеров клеточной поверхности, используемых в стадии (ii), может быть комбинация по меньшей мере из двух, трех или четырех маркеров клеточной поверхности, выбранных из группы, состоящей из CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD165, CD271 и CD326. Так, например, комбинация по меньшей мере из двух маркеров клеточной поверхности, предпочтительно, включает комбинацию из одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-) (предпочтительно, CD9(-)) и одного маркера позитивного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+) (предпочтительно, из группы, состоящей из CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+)). Комбинация по меньшей мере из трех маркеров клеточной поверхности, предпочтительно, включает комбинацию из одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-) (предпочтительно, CD9(-)) и двух маркеров позитивного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+)(предпочтительно, из группы, состоящей из CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+)); или комбинацию из трех маркеров позитивного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+). Комбинация по меньшей мере из четырех маркеров клеточной поверхности, предпочтительно, включает комбинацию из одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-) (предпочтительно, CD9(-)) и трех маркеров позитивного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+). В одном из вариантов осуществления изобретения, маркерами клеточной поверхности, испольуемыми в стадии (ii), являются по меньшей мере два или три маркера клеточной поверхности, выбранные из группы, состоящей из CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+), а предпочтительно, комбинации маркеров CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+).
[0054] Маркеры клеточной поверхности для стадии (ii) могут быть использованы в целях отбора популяции ПКП, происходящей от млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, человека. В случае отбора популяции человеческих ПКП, восемь различных маркеров поверхности человеческих клеток имееют следующие регистрационные номера NCBI:
CD9: NM_001769.3 (SEQ ID NO:1)
CD55: NM_000574.4 (SEQ ID NO:3)
CD106: NM_001078.3 (SEQ ID NO:5)
CD140a: NM_006206.4 (SEQ ID NO:7)
CD140b: NM_002609.3 (SEQ ID NO:9)
CD165: geneID_23449
CD271: NM_002507.3 (SEQ ID NO:11)
CD326: NM_002354.2 (SEQ ID NO:13)
[0055] Различные маркеры поверхности человеческих клеток включают гены, имеющие нуклеотидные последовательности, соответствующиие регистрационным номерам, указанным выше, белки, кодируемые указанными генами, и их природные варианты.
[0056] Человеческий CD9 кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (нуклеотиды 185-871), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Человеческий CD55 кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 (нуклеотиды 295-1440), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. Человеческий CD106 кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5 (нуклеотиды 222-2441), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. Человеческий CD140a кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7 (нуклеотиды 332-3601), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. Человеческий CD140b кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:9 (нуклеотиды 470-3790 и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. Человеческий CD271 кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11 (нуклеотиды 126-1409), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12. Человеческий CD326 кодируется геном, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 (нуклеотиды 359-1303), и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14. Человеческий CD165 представляет собой мембранный поверхностный белок 37-42 кДа, также известный как AD2 или gp37. Антителом, специфически связывающимся с CD165, является моноклональное антитело SN2, которое было уже идентифицировано (Seon, B. K., et al., J. Immunol., (1984), 132:2089-2095), и является коммерчески доступным.
[0057] Природные варианты вышеупомянутых маркеров клеточной поверхности, а в частности, CD9, CD55, CD106, CD140a, CD140b, CD271 и CD326, представляют собой маркеры клеточной поверхности, кодируемые генами, нуклеотидные последовательности которых по меньшей мере на 80%, а предпочтительно, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98% идентичны вышеупомянутым нуклеотидным последовательностям, или маркеры клеточной поверхности, содержащие аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, идентичны вышеупомянутым аминокислотным последовательностям.
[0058] Используемый здесь термин «идентичность», если он относится к нуклеотидным последовательностям или к аминокислотным последовательностям, означает величину идентичности, вычисленную посредством поиска с помощью программы NEEDLE (Needleman S. B., et al., J. Mol. Biol., (1970), 48: 443-453) с использованием параметров по умолчанию. Параметры по умолчанию указаны ниже.
Штраф за пробел=10
Штраф за удлинение=0,5
Матрица=EBLOSUM62
[0059] Антитела, специфически связывающиеся с вышеуказанными антигенами поверхности человеческих клеток, являются коммерчески доступными. Примерами таких антител являются антитела, упомянутые ниже в разделе «Примеры». Маркеры клеточной поверхности, сохраняющие свои свойства, то есть, способность связываться с коммерчески доступными антителами, специфически связывающимися с каждым из вышеупомянутых маркеров клеточной поверхности, также включают маркеры клеточной поверхности, которые могут быть использованы для отбора клеточной популяции согласно изобретению.
[0060] Отбор клеточной популяции с использованием маркера клеточной поверхности в стадии (ii) может быть осуществлен любыми различными методами, известными специалистам. Так, например, отбор клеток осуществляют с использованием антитела, специфически связывающегося с маркером клеточной поверхности, исходя из связывания указанного антитела с клетками. Примерами таких методов отбора на основе антител являются: отбор клеток на клеточном сортере с использованием флуоресцентно меченного антитела (например, FACS® (BD Biosciences); отбор клеток с использованием магнитных сфер, меченных антителами (например, MACS® (Miltenyi Biotec)); и отбор клеток с использованием носителя, на котором иммобилизовано антитело (например, на колонке для обогащения клеток).
[0061] 3. Терапевтическое средство для лечения почечных заболеваний, способ лечения почечного заболевания и способ продуцирования клеток для лечения почечного заболевания:
Популяция ПКП, полученная способом согласно изобретению, может быть использована в качестве терапевтического средства для лечения почечных заболеваний. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к описанному ниже способу продуцирования клеток для лечения почечного заболевания и отбора клеточной популяции для леченичя почечного заболевания:
«Способ продуцирования клеток для лечения почечного заболевания, включающий стадии:
(i) культивирования плюрипотентных стволовых клеток в условиях, индуцирующих дифференцировку в почечные клетки-предшественники; и
(ii) отбора клеточной популяции из клеток, полученных в стадии (i), с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-)».
[0062] «Способ отбора клеточной популяции для лечения почечного заболевания из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественники, с использованием по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-)».
[0063] Как описано в настоящем изобретении, клетками для лечения почечного заболевания являются клетки, характеризующиеся тем, что они имеют по меньшей мере один маркер клеточной поверхности, выбранный из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-), а предпочтительно, клетки, характеризующиеся тем, что они имеют CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+).
[0064] Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения почечных заболеваний, содержащему популяцию ПКП, полученную способом продуцирования согласно изобретению, или популяцию ПКП, отобранную способом отбора согласно изобретению, а также к способу лечения почечного заболевания, где указанный способ включает стадию введения пациенту популяции ПКП, полученной способом продуцирования согласно изобретению, или популяции ПКП, отобранной способом отбора согласно изобретению. Репрезентативные процедуры введения популяции ПКП или терапевтического средства пациенту включают: нанесение слоя клеток, отобранных из идентифицированной популяции ПКП, на почки пациента; трансплантацию идентифицированной популяции ПКП, суспендированной в физиологическом растворе и т.п., в почки пациента прямым методом или через кровеносные сосуды; трансплантацию агрегатов ПКП, полученных путем трехмерного культивирования на носителе из матригеля и т.п.; загрузку популяции ПКП в колонку для диализа и введение микрокапсул, включающих популяцию ПКП. Репрезентативными почечными заболеваниями являются хронические почечные заболевания, включая состояния, не приводящие к развитию хронической почечной недостаточности.
[0065] В настоящем изобретении, число ПКП, содержащихся в терапевтическом средстве для лечения почечных заболеваний, может регулироваться в сторону увеличения или снижения в зависимости от тяжести заболевания, размера участка поражения и/или массы тела.
Примеры
[0066] Настоящее изобретение более подробно описано ниже на примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
[0067] [Пример 1]
<График двухмерного рассеяния для популяции ПКП, построенный по данным проточного цитометрического анализа OSR1 и SIX2 и анализа на другие различные маркеры клеточной поверхности>
иПС-клетками, используемыми в этом примере, являются человеческие иПС-клеточные линии, служащие репортерами для OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, где указанные клетки, полученные методом, описанным в NPL 3, обладают способностью экспрессировать GFP вместе с экспрессией эндогенного гена OSR1 и способностью экспрессировать tdTomato вместе с экспрессией эндогенного гена SIX2. Человеческие иПСК-клеточные линии индуцировали для дифференцировки в популяцию клеток, содержащих ПКП, в соответствии с процедурой, описанной в NPL 4. В результате поиска маркеров клеточной поверхности, специфически экспрессирующихся в ПКП, с использованием панели для скрининга маркера клеточной поверхности человеческих клеток (BD Biosciences, Cat. No. 560747), были идентифицированы CD9(-), CD55(-), CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+), CD271(+) и CD326(-) как маркеры клеточной поверхности, позволяющие осуществлять успешное фракционирование представляющей интерес клеточной популяции, содержащей ПКП (фиг. 1).
[0068] [Пример 2]
<CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточная популяция содержит по меньшей мере 70% ПКП>
В этом примере описано исследование, проведенное для того, чтобы определить, может ли процент ПКП, присутствующих в клетках, фракционированных из клеточной популяции, дифференцированной из человеческих иПСК, увеличиваться при использовании комбинации из некоторых маркеров клеточной поверхности, идентифицированных в Примере 1.
[0069] Сначала было проведено исследование для того, чтобы определить, может ли процент ПКП, присутствующих в клеточной популяции, дифференцированной из человеческих иПСК, увеличиваться при использовании одного маркера негативного отбора и трех маркеров позитивного отбора. Отобранными маркерами клеточной поверхности являются CD9, CD140a, CD140b и CD271, которые дают четкую картину дискретной клеточной популяции на двухмерных графиках рассеяния, построенных как кривые зависимости от OSR1 и SIX2, описанных в Примере 1. В качестве антител против этих маркеров клеточной поверхности были использованы мышиное антитело APC-H7 против человеческого CD9 (BD Biosciences; Cat. No. 655409), мышиное антитело Alexa Fluor® 647 против человеческого CD140a (BD Biosciences; Cat. No. 562798), мышиное антитело BV421 против человеческого CD140b (BD Biosciences; Cat. No. 564124), и мышиное антитело BV510 против человеческого CD271 (BD Biosciences; Cat. No. 563451). Эти антитела были использованы в 20-кратном разведении, и клетки подвергали реакции взаимодействия с этими антителами при комнатной температуре в течение 15 минут. После реакции, реакционную смесь два раза промывали PBS, в который добавляли 2% FBS, и анализировали с использованием FACSAria™ III (BD Biosciences). По результатам, полученным из графиков двухмерного рассеяния, CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточную фракцию разделяли для фракционирования указанной клеточной популяции. Фракционированную клеточную популяцию снова анализировали с использованием FACSAria™ III, и результаты показали, что OSR1(+)SIX2(+)-клетки присутствовали во всей клеточной популяции в концентрации более, чем 70% (фиг. 2B). На фиг. 2A представлена серия блок-схем для групп дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК и окрашенных маркерами CD9, CD140a, CD140b и CD271. На фиг. 2B представлена серия двухмерных графиков рассеяния, построенных по данным проточного цитометрического анализа экспрессии OSR1 и SIX2 в чиПСК до индуцирования дифференцировки, в группах дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК, и в популяции клеток после отбора клеток P3+P4+P6, соответственно, как показано на панелях слева направо.
[0070] [Пример 3]
<Образование структур, подобных почечным канальцам и позитивных по LTL (маркеру проксимальных почечных канальцев), из клеточной популяции, отобранной по CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+)>
ПКП характеризуются не только экспрессией маркеров ПКП, но также и способностью сохранять функцию дифференцировки в клетки почечных канальцев. В соответствии с этим, для того, чтобы подтвердить, являются ли CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клетки, полученные как описано в Примере 2, ПКП-клетками, полученные клетки тестировали в системе на индуцирование дифференцировки в почечные канальцы. Дифференцировку в клетки почечных канальцев и образование структур, подобных почечным канальцам, определяли исходя из экспрессии маркера LTL проксимальных почечных канальцев и морфологических свойств.
[0071] В соответствии с процедурой, описанной в NPL 4, ПКП-содержащую клеточную популяцию, в которую были дифференцированы чиПСК-линии, подвергали иммунологическому окрашиванию мышиным антителом APC-H7 против человеческого CD9, мышиным антителом Alexa Fluor® 647 против человеческого CD140a, мышиным антителом BV421 против человеческого CD140b и мышиным антителом BV510 против человеческого CD271 для фракционирования CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеток на FACSAria™ III. Фракционированные клетки высевали при 1,0×105 клеток/лунку на 96-луночных планшетах с крутящимся дном и с низкой адгезией клеток (Sumitomo Bakelite; Cat. No. MS-9096M), где указанные планшеты содержали UBC-кондиционированную среду (см. ниже) с добавлением 50 нг/мл BMP7 (R&D; Cat. No. 354-BP-010) и 10 мкМ Y-27632 (Wako; Cat. No. 253-00513), и эти клетки культивировали в течение 24 часов при 37°C в атмосфере 5% CO2-содержащего воздуха. Затем, клетки культивировали еще 24 часа, и культуральную среду заменяли UBC-кондиционированной средой с добавлением 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Calbiochem; Cat. No. 361552) и 10 мкМ Y-27632. Затем, клетки культивировали вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3 в соответствии с процедурой, описанной в NPL 4. Wnt4-экспрессирующие фибробласты NIH3T3 использовали после посева при плотности 4,0×105 клеток/лунку на 24-луночных планшетах и обработки митомицином C. Совместное культивирование осуществляли с использованием UBC-кондиционированной среды. После 2-недельного совместного культивирования, клетки окрашивали. Во время этого процесса окрашивания клеток, для первой реакции использовали конъюгат LTL-биотин (Vector Laboratories; Cat. No. B-1325); для второй реакции использовали конъюгат стрептавидин-Alexa Fluor® 546 (Life Technologies; Cat. No. S-11225); а для окрашивания ядра использовали Hoechst 33342 (Life Technologies; Cat. No. H3570). LTL использовали в 200-кратном разведении, а реакцию с LTL проводили при 4°C в течение ночи. Конъюгат стрептавидин-Alexa Fluor® 546 использовали в 200-кратном разведении, а реакцию с этим конъюгатом проводили при комнатной температуре в течение одного часа. В результате было обнаружено, что LTL-позитивные структуры просветов образовывались из CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточной популяции (фиг. 3B). На фиг. 3A проиллюстрирована процедура дифференцировки в проксимальные почечные канальцы, в которых образовывались клеточные агрегаты, и эти агрегаты были культивированы вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3 в соответствии с процедурой, описанной в NPL 4. На фиг. 3B показан внешний вид агрегатов CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеток, культивированных вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3.
<UBC-кондиционированная среда>
Среду, кондиционированную мышиными почкующимися клетками мочеточника (UBC), получали модифицированным методом, описанным в литературе (Barasch et al., Am. J. Physiol., (1997), 273, F757-767). UBC (любезно предоставленные Dr. Barasch, Columbia University; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1997), 94, 6279-6284) культивировали в минимальной поддерживающей среде (MEM; Invitrogen) с добавлением 10% FBS. После достижения 80% конфлюэнтности, клетки промывали PBS, и культуральную среду заменяли смешанной средой DMEM/F12 (1:1), в которую были добавлены GlutaMAX, 10% KSR, 0,1 мМ NEAAs, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанола и 500 ед./мл пенициллина/стрептомицина. Затем клетки культивировали в течение 3 дней с получением супернатанта культуры. Супернатант культуры, перед его использованием, фильтровали через 0,22 мкм-фильтр.
[0072] [Пример 4]
<Проценты ПКП (OSR1(+)SIX2(+-клеток) в клеточных популяциях, отобранных по различным комбинациям CD9(-) с использованием трех маркеров позитивного отбора>
Проценты (OSR1(+)SIX2(+)-клеток в клеточных популяциях, отобранных по всем (10) истощающим комбинациям CD9(-) с использованием любых трех маркеров позитивного отбора и экстрагированных как описано в Примере 1, вычисляли с использованием FACSAria™ Fusion (BD Biosciences). Кроме того, в случае использования конкретной комбинации CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+), которая, как было подтверждено в Примере 3, позволяют фракционировать популяцию ПКП-содержащих клеток, было проведено исследование для того, чтобы определить, могут ли CD55(-) и CD326(-) служить маркерами негативного отбора, альтернативными CD9(-).
[0073] Используемыми антителами являются: мышиное антитело APC-H7 против человеческого CD9 (BD Biosciences; Cat. No. 655409); мышиное антитело Alexa Fluor® 647 против человеческого CD140a (BD Biosciences; Cat. No. 562798); мышиное антитело BV421 против человеческого CD140a (BD Biosciences; Cat. No. 562799); мышиное антитело BV421 против человеческого CD140b (BD Biosciences; Cat. No. 564124); мышиное антитело BV510 против человеческого CD271 (BD Biosciences; Cat. No. 563451); мышиное антитело APC против человеческого CD106 (BD Biosciences; Cat. No. 551147); мышиное антитело BV605 против человеческого CD106 (BD Biosciences; Cat. No. 563307); конъюгированное с биотином антитело против человеческого CD165 (Miltenyi Biotec; Cat. No. 130-098-536); конъюгированное с APC антитело против человеческого CD165 (Miltenyi Biotec; Cat. No. 130-098-542); конъюгированное с биотином антитело против человеческого CD55 (eBioscience; Cat. No. 13-0559); и мышиное антитело BV605 против человеческого CD326 (BD Biosciences; Cat. No. 563182). Эти антитела были использованы в 20-кратном разведении, а клетки подвергали реакции с антителами при комнатной температуре в течение 15 минут, три раза промывали PBS, а затем анализировали. В случае использования биотинилированных антител, вторичное окрашивание осуществляли с использованием BV605-стрептавидина (BD Biosciences; Cat. No. 563260) в 500-кратном разведении. В процессе вторичного окрашивания, клетки подвергали реакции с указанными антителами при комнатной температуре в течение 15 минут, три раза промывали PBS, а затем анализировали. Популяции дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК, анализировали с использованием FACSAria™ Fusion, и исходя из результатов, полученных для серий кривых двухмерного рассеяния, клеточные фракции, окрашенные 12 различными комбинациями антител, разделяли для фракционирования соответствующих фракций клеток. Фракционированные клеточные популяции снова анализировали с использованием FACSAria™ Fusion, для вычисления процентов OSR1(+)SIX2(+)-клеток, OSR1(+)SIX2(-)-клеток, OSR1(-)SIX2(+)-клеток и OSR1(-)SIX2(-)-клеток, присутствующих в общей популяции клеток (фиг. 4). Полученные результаты показали, что высокие проценты OSR1(+)SIX2(+)-клеток присутствовали во всех клеточных популяциях, фракционированных с использованием всех комбинаций маркеров.
[0074] [Пример 5]
<Исследования комбинаций маркеров клеточной поверхности, позволяющих фракционировать ПКП>
Клеточные популяции анализировали с помощью FACSAria™ Fusion с использованием антител против любых комбинаций маркеров клеточной поверхности CD9, CD140a, CD140b и CD271, полученных как описано в Примере 4, для вычисления процента OSR1(+)SIX2(+)-клеток, присутствующих в каждой клеточной популяции, фракционированной с использованием различных комбинаций маркера негативного отбора CD9(-) и любых маркеров позитивного отбора, выбранных из CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+). Кроме того, был вычислен процент клеток, идентифицированных для каждой из различных комбинаций маркеров клеточной поверхности в неотобранной клеточной популяции, и на этой основе был вычислен процент числа OSR1(+)SIX2(+)(+)-клеток, отобранных с использованием каждой нужной комбинации маркеров клеточной поверхности по отношению к числу неотобранных клеток (фиг. 5). Результаты показали, что конденсация OSR1(+)SIX2(+)-клеток возможна только при использовании любых различных комбинаций маркеров клеточной поверхности, и что проценты OSR1(+)SIX2(+)-клеток, конденсированных с различными комбинациями двух или трех маркеров клеточной поверхности, сравнимы с процентом OSR1(+)SIX2(+)-клеток, конденсированных с различными комбинациями четырех маркеров клеточной поверхности.
[0075] [Пример 6]
<Исследования комбинаций маркеров клеточной поверхности, позволяющих фракционировать ПКП>
Для того, чтобы подтвердить, что популяция ПКП с высокой чистотой может быть фракционирована даже из чиПСК-линий, которые не несут репортерного гена, с использованием маркеров клеточной поверхности, описанных выше, были протестированы чиПСК (штамм 201B7, любезно предоставленный Киотским Университетом) в системе индуцирования дифференцировки. чиПСК (201B7) хранили в поддерживающей культуре в соответствии со стандартной процедурой (Takahashi K, et al., (2007), Cell. 131:861-72) и индуцировали для дифференцировки в ПКП-содержащую клеточную популяцию в соответствии со процедурой, описанной в NPL 4. Затем, в соответствии с той же самой процедурой, описанной в Примере 3, CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клетки фракционировали с использованием FACSAria™ Fusion с образованием клеточных агрегатов, и эти клеточные агрегаты культивировали вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами, для того, чтобы подтвердить успешное фракционирование клеточной популяции, сохраняющей способность дифференцироваться в почечные канальцы. Дифференцировку в почечные канальцы определяли по экспрессии маркера LTL проксимальных почечных канальцев и по морфологическим свойствам. В результате было подтверждено, что LTL-позитивные структуры просветов могут образовываться из CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточной популяции. Другими словами, было продемонстрировано, что ПКП-содержащая клеточная популяция с высокой чистотой может быть фракционирована даже из дифференцированных клеток, происходящих от чиПСК (201B7), с использованием CD9, CD140a, CD140b и CD271 (фиг. 6C). На фиг. 6A представлена серия гистограмм зависимости числа клеток от интенсивности флуоресценции каждого из OSR1 (GFP), SIX2 (tdTomato) и других маркеров клеточной поверхности. На фиг. 6B представлена серия графиков двухмерного рассеяния, построенных по данным проточного цитометрического анализа экспрессии CD9, CD140a, CD140b или CD271 в популяции дифференцированных клеток, происходящих от линии иПСК 201B7. На фиг. 6C представлено изображение клеточных агрегатов, полученных путем отбора клеточных популяций P4+P2+P3 и культивированных вместе с Wnt4-экспрессирующими фибробластами NIH3T3.
[0076] [Пример 7]
<Исследования комбинаций маркеров клеточной поверхности, позволяющих фракционировать ПКП (2)>
В соответствии с той же самой процедурой, описанной в Примере 6, ПКП-содержащие клеточные популяции, в которые были дифференцированы чиПСК (201B7), подвергали иммунологическому окрашиванию поверхностными антигенами с использованием мышиного антитела APC-H7 против человеческого CD9, мышиного антитела Alexa Fluor® 647 против человеческого CD140a, мышиного антитела BV421 против человеческого CD140b и мышиного антитела BV510 против человеческого CD271, а затем клетки отбирали с помощью FACSAria™ Fusion для фракционирования CD9( )CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеток. Фракционированные клетки наносили мазками на предметные стекла с использованием Smear Gell® (GenoStaff; Cat. No. SG-01) и подвергали иммунологическому окрашиванию на внутриядерные факторы транскрипции. В качестве «первого» антитела использовали кроличье поликлональное анти-SIX2 антитело (Proteintech; Cat. No. 11562-1-AP); в качестве «второго» антитела использовали конъюгат ослиного антитела против кроличьих IgG (H+L) и антитела Alexa Fluor® 488 (Life Technologies; Cat. No. A21206); а для окрашивания ядра использовали Hoechst 33342 (Life Technologies; Cat. No. H3570). В результате наблюдения под микроскопом (KEYENCE; Cat. No. BZ-9000) было обнаружено, что CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+)-клеточная популяция содержит более высокий процент SIX2-позитивных клеток, что является одним из признаков ПКП по сравнению с неотобранной популяцией дифференцированных клеток (фиг. 7).
Промышленное применение
[0077] Как подробно описано выше, настоящее изобретение относится к способу выявления и продуцирования популяции ПКП с высокой чистотой из популяции ПКП, в которую были дифференцированы индуцированные ПСК с использованием маркера клеточной поверхности. ПКП, идентифицированные способом согласно изобретению, могут быть использованы в восстановительной медицине, применяемой для лечения почечных заболеваний, таких как почечная недостаточность.
Список последовательностей в свободном формате
[0078] SEQ ID NO:15: Пептидный ингибитор L803-mts/GSK-3β; 1-я аминокислота глицин присоединена к миристиновой кислоте посредством амидной связи у N-конца; 11-я аминокислота серин является фосфорилированной, а 12-я аминокислота пролин амидирована у С-конца.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Astellas Pharma Inc.
KYOTO UNIVERSITY
<120> Способ продуцирования почечных клеток-предшественников
<130> FA1535-16136
<150> JP 2015-179104
<151> 2015-09-11
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1321
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (185)..(871)
<300>
<308> NM_001769.3
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(1321)
<400> 1
cttttcccgg cacatgcgca ccgcagcggg tcgcgcgccc taaggagtgg cactttttaa 60
aagtgcagcc ggagaccagc ctacagccgc ctgcatctgt atccagcgcc aggtcccgcc 120
agtcccagct gcgcgcgccc cccagtcccg cacccgttcg gcccaggcta agttagccct 180
cacc atg ccg gtc aaa gga ggc acc aag tgc atc aaa tac ctg ctg ttc 229
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe
1 5 10 15
gga ttt aac ttc atc ttc tgg ctt gcc ggg att gct gtc ctt gcc att 277
Gly Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile
20 25 30
gga cta tgg ctc cga ttc gac tct cag acc aag agc atc ttc gag caa 325
Gly Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln
35 40 45
gaa act aat aat aat aat tcc agc ttc tac aca gga gtc tat att ctg 373
Glu Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu
50 55 60
atc gga gcc ggc gcc ctc atg atg ctg gtg ggc ttc ctg ggc tgc tgc 421
Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys
65 70 75
ggg gct gtg cag gag tcc cag tgc atg ctg gga ctg ttc ttc ggc ttc 469
Gly Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe
80 85 90 95
ctc ttg gtg ata ttc gcc att gaa ata gct gcg gcc atc tgg gga tat 517
Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr
100 105 110
tcc cac aag gat gag gtg att aag gaa gtc cag gag ttt tac aag gac 565
Ser His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp
115 120 125
acc tac aac aag ctg aaa acc aag gat gag ccc cag cgg gaa acg ctg 613
Thr Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu
130 135 140
aaa gcc atc cac tat gcg ttg aac tgc tgt ggt ttg gct ggg ggc gtg 661
Lys Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val
145 150 155
gaa cag ttt atc tca gac atc tgc ccc aag aag gac gta ctc gaa acc 709
Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr
160 165 170 175
ttc acc gtg aag tcc tgt cct gat gcc atc aaa gag gtc ttc gac aat 757
Phe Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn
180 185 190
aaa ttc cac atc atc ggc gca gtg ggc atc ggc att gcc gtg gtc atg 805
Lys Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met
195 200 205
ata ttt ggc atg atc ttc agt atg atc ttg tgc tgt gct atc cgc agg 853
Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg
210 215 220
aac cgc gag atg gtc tag agtcagctta catccctgag caggaaagtt 901
Asn Arg Glu Met Val
225
tacccatgaa gattggtggg attttttgtt tgtttgtttt gttttgtttg ttgtttgttg 961
tttgtttttt tgccactaat tttagtattc attctgcatt gctagataaa agctgaagtt 1021
actttatgtt tgtcttttaa tgcttcattc aatattgaca tttgtagttg agcggggggt 1081
ttggtttgct ttggtttata ttttttcagt tgtttgtttt tgcttgttat attaagcaga 1141
aatcctgcaa tgaaaggtac tatatttgct agactctaga caagatattg tacataaaag 1201
aatttttttg tctttaaata gatacaaatg tctatcaact ttaatcaagt tgtaacttat 1261
attgaagaca atttgataca taataaaaaa ttatgacaat gtcctggact ggtaaaaaaa 1321
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu
35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly
65 70 75 80
Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu
85 90 95
Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser
100 105 110
His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr
115 120 125
Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys
130 135 140
Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu
145 150 155 160
Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe
165 170 175
Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys
180 185 190
Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile
195 200 205
Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn
210 215 220
Arg Glu Met Val
225
<210> 3
<211> 2796
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (295)..(1140)
<300>
<308> NM_000574.4
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(2796)
<400> 3
agcgagctcc tcctccttcc cctccccact ctccccgagt ctagggcccc cggggcgtat 60
gacgccggag ccctctgacc gcacctctga ccacaacaaa cccctactcc acccgtcttg 120
tttgtcccac ccttggtgac gcagagcccc agcccagacc ccgcccaaag cactcattta 180
actggtattg cggagccacg aggcttctgc ttactgcaac tcgctccggc cgctgggcgt 240
agctgcgact cggcggagtc ccggcggcgc gtccttgttc taacccggcg cgcc atg 297
Met
1
acc gtc gcg cgg ccg agc gtg ccc gcg gcg ctg ccc ctc ctc ggg gag 345
Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly Glu
5 10 15
ctg ccc cgg ctg ctg ctg ctg gtg ctg ttg tgc ctg ccg gcc gtg tgg 393
Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val Trp
20 25 30
ggt gac tgt ggc ctt ccc cca gat gta cct aat gcc cag cca gct ttg 441
Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu
35 40 45
gaa ggc cgt aca agt ttt ccc gag gat act gta ata acg tac aaa tgt 489
Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys
50 55 60 65
gaa gaa agc ttt gtg aaa att cct ggc gag aag gac tca gtg atc tgc 537
Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys
70 75 80
ctt aag ggc agt caa tgg tca gat att gaa gag ttc tgc aat cgt agc 585
Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser
85 90 95
tgc gag gtg cca aca agg cta aat tct gca tcc ctc aaa cag cct tat 633
Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr
100 105 110
atc act cag aat tat ttt cca gtc ggt act gtt gtg gaa tat gag tgc 681
Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys
115 120 125
cgt cca ggt tac aga aga gaa cct tct cta tca cca aaa cta act tgc 729
Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys
130 135 140 145
ctt cag aat tta aaa tgg tcc aca gca gtc gaa ttt tgt aaa aag aaa 777
Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys
150 155 160
tca tgc cct aat ccg gga gaa ata cga aat ggt cag att gat gta cca 825
Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro
165 170 175
ggt ggc ata tta ttt ggt gca acc atc tcc ttc tca tgt aac aca ggg 873
Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly
180 185 190
tac aaa tta ttt ggc tcg act tct agt ttt tgt ctt att tca ggc agc 921
Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser
195 200 205
tct gtc cag tgg agt gac ccg ttg cca gag tgc aga gaa att tat tgt 969
Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys
210 215 220 225
cca gca cca cca caa att gac aat gga ata att caa ggg gaa cgt gac 1017
Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp
230 235 240
cat tat gga tat aga cag tct gta acg tat gca tgt aat aaa gga ttc 1065
His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe
245 250 255
acc atg att gga gag cac tct att tat tgt act gtg aat aat gat gaa 1113
Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu
260 265 270
gga gag tgg agt ggc cca cca cct gaa tgcagaggaa aatctctaac 1160
Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu
275 280
ttccaaggtc ccaccaacag ttcagaaacc taccacagta aatgttccaa ctacagaagt 1220
ctcaccaact tctcagaaaa ccaccacaaa aaccaccaca ccaaatgctc aagcaacacg 1280
gagtacacct gtttccagga caaccaagca ttttcatgaa acaaccccaa ataaaggaag 1340
tggaaccact tcaggtacta cccgtcttct atctgggcac acgtgtttca cgttgacagg 1400
tttgcttggg acgctagtaa ccatgggctt gctgacttag ccaaagaaga gttaagaaga 1460
aaatacacac aagtatacag actgttccta gtttcttaga cttatctgca tattggataa 1520
aataaatgca attgtgctct tcatttagga tgctttcatt gtctttaaga tgtgttagga 1580
atgtcaacag agcaaggaga aaaaaggcag tcctggaatc acattcttag cacacctaca 1640
cctcttgaaa atagaacaac ttgcagaatt gagagtgatt cctttcctaa aagtgtaaga 1700
aagcatagag atttgttcgt atttagaatg ggatcacgag gaaaagagaa ggaaagtgat 1760
ttttttccac aagatctgta atgttatttc cacttataaa ggaaataaaa aatgaaaaac 1820
attatttgga tatcaaaagc aaataaaaac ccaattcagt ctcttctaag caaaattgct 1880
aaagagagat gaaccacatt ataaagtaat ctttggctgt aaggcatttt catctttcct 1940
tcgggttggc aaaatatttt aaaggtaaaa catgctggtg aaccaggggt gttgatggtg 2000
ataagggagg aatatagaat gaaagactga atcttccttt gttgcacaaa tagagtttgg 2060
aaaaagcctg tgaaaggtgt cttctttgac ttaatgtctt taaaagtatc cagagatact 2120
acaatattaa cataagaaaa gattatatat tatttctgaa tcgagatgtc catagtcaaa 2180
tttgtaaatc ttattctttt gtaatattta tttatattta tttatgacag tgaacattct 2240
gattttacat gtaaaacaag aaaagttgaa gaagatatgt gaagaaaaat gtatttttcc 2300
taaatagaaa taaatgatcc cattttttgg tatcatgtag tatgtgaaat ttattcttaa 2360
acgtgactac tttatttcta aataagaaat tccctacctg cttcctacaa gcagttcaga 2420
atgccatgcc ttggttgtcc tagtgtgaat aattttcagc tactttaaaa ttatattgta 2480
ctttctcaag catgtcatat cctttcctat tagagtatct atattacttg ttactgattt 2540
acctgaaggc aatctgatta atttctaggt ttttaccata ttcttgtcat cttgccaatt 2600
acattttaag tgttagacta gactaagatg tactagttgt atagaatata actagattta 2660
ttatggcaat gtttattttg tcattttgct tcatctgttt tgttgttgaa gtactttaaa 2720
tttcatacgt tcatggcatt tcactgtaaa gactttaatg tgtatttctt aaaataaaac 2780
tttttttcct ccttaa 2796
<210> 4
<211> 282
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20 25 30
Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala
35 40 45
Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys
50 55 60
Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile
65 70 75 80
Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg
85 90 95
Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro
100 105 110
Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu
115 120 125
Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val
165 170 175
Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr
180 185 190
Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly
195 200 205
Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg
225 230 235 240
Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly
245 250 255
Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp
260 265 270
Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu
275 280
<210> 5
<211> 3220
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (222)..(2441)
<300>
<308> NM_001078.3
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(3220)
<400> 5
aaactttttt ccctggctct gccctgggtt tccccttgaa gggatttccc tccgcctctg 60
caacaagacc ctttataaag cacagacttt ctatttcact ccgcggtatc tgcatcgggc 120
ctcactggct tcaggagctg aataccctcc caggcacaca caggtgggac acaaataagg 180
gttttggaac cactattttc tcatcacgac agcaacttaa a atg cct ggg aag atg 236
Met Pro Gly Lys Met
1 5
gtc gtg atc ctt gga gcc tca aat ata ctt tgg ata atg ttt gca gct 284
Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp Ile Met Phe Ala Ala
10 15 20
tct caa gct ttt aaa atc gag acc acc cca gaa tct aga tat ctt gct 332
Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu Ser Arg Tyr Leu Ala
25 30 35
cag att ggt gac tcc gtc tca ttg act tgc agc acc aca ggc tgt gag 380
Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser Thr Thr Gly Cys Glu
40 45 50
tcc cca ttt ttc tct tgg aga acc cag ata gat agt cca ctg aat ggg 428
Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Asn Gly
55 60 65
aag gtg acg aat gag ggg acc aca tct acg ctg aca atg aat cct gtt 476
Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Thr Met Asn Pro Val
70 75 80 85
agt ttt ggg aac gaa cac tct tac ctg tgc aca gca act tgt gaa tct 524
Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Ala Thr Cys Glu Ser
90 95 100
agg aaa ttg gaa aaa gga atc cag gtg gag atc tac tct ttt cct aag 572
Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile Tyr Ser Phe Pro Lys
105 110 115
gat cca gag att cat ttg agt ggc cct ctg gag gct ggg aag ccg atc 620
Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ile
120 125 130
aca gtc aag tgt tca gtt gct gat gta tac cca ttt gac agg ctg gag 668
Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro Phe Asp Arg Leu Glu
135 140 145
ata gac tta ctg aaa gga gat cat ctc atg aag agt cag gaa ttt ctg 716
Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys Ser Gln Glu Phe Leu
150 155 160 165
gag gat gca gac agg aag tcc ctg gaa acc aag agt ttg gaa gta acc 764
Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys Ser Leu Glu Val Thr
170 175 180
ttt act cct gtc att gag gat att gga aaa gtt ctt gtt tgc cga gct 812
Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val Leu Val Cys Arg Ala
185 190 195
aaa tta cac att gat gaa atg gat tct gtg ccc aca gta agg cag gct 860
Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro Thr Val Arg Gln Ala
200 205 210
gta aaa gaa ttg caa gtc tac ata tca ccc aag aat aca gtt att tct 908
Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser
215 220 225
gtg aat cca tcc aca aag ctg caa gaa ggt ggc tct gtg acc atg acc 956
Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly Ser Val Thr Met Thr
230 235 240 245
tgt tcc agc gag ggt cta cca gct cca gag att ttc tgg agt aag aaa 1004
Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys
250 255 260
tta gat aat ggg aat cta cag cac ctt tct gga aat gca act ctc acc 1052
Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr
265 270 275
tta att gct atg agg atg gaa gat tct gga att tat gtg tgt gaa gga 1100
Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly
280 285 290
gtt aat ttg att ggg aaa aac aga aaa gag gtg gaa tta att gtt caa 1148
Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Val Gln
295 300 305
gag aaa cca ttt act gtt gag atc tcc cct gga ccc cgg att gct gct 1196
Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala
310 315 320 325
cag att gga gac tca gtc atg ttg aca tgt agt gtc atg ggc tgt gaa 1244
Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser Val Met Gly Cys Glu
330 335 340
tcc cca tct ttc tcc tgg aga acc cag ata gac agc cct ctg agc ggg 1292
Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly
345 350 355
aag gtg agg agt gag ggg acc aat tcc acg ctg acc ctg agc cct gtg 1340
Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val
360 365 370
agt ttt gag aac gaa cac tct tat ctg tgc aca gtg act tgt gga cat 1388
Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Val Thr Cys Gly His
375 380 385
aag aaa ctg gaa aag gga atc cag gtg gag ctc tac tca ttc cct aga 1436
Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu Tyr Ser Phe Pro Arg
390 395 400 405
gat cca gaa atc gag atg agt ggt ggc ctc gtg aat ggg agc tct gtc 1484
Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val Asn Gly Ser Ser Val
410 415 420
act gta agc tgc aag gtt cct agc gtg tac ccc ctt gac cgg ctg gag 1532
Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu
425 430 435
att gaa tta ctt aag ggg gag act att ctg gag aat ata gag ttt ttg 1580
Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu
440 445 450
gag gat acg gat atg aaa tct cta gag aac aaa agt ttg gaa atg acc 1628
Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr
455 460 465
ttc atc cct acc att gaa gat act gga aaa gct ctt gtt tgt cag gct 1676
Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala
470 475 480 485
aag tta cat att gat gac atg gaa ttc gaa ccc aaa caa agg cag agt 1724
Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser
490 495 500
acg caa aca ctt tat gtc aat gtt gcc ccc aga gat aca acc gtc ttg 1772
Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu
505 510 515
gtc agc cct tcc tcc atc ctg gag gaa ggc agt tct gtg aat atg aca 1820
Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser Ser Val Asn Met Thr
520 525 530
tgc ttg agc cag ggc ttt cct gct ccg aaa atc ctg tgg agc agg cag 1868
Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln
535 540 545
ctc cct aac ggg gag cta cag cct ctt tct gag aat gca act ctc acc 1916
Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr
550 555 560 565
tta att tct aca aaa atg gaa gat tct ggg gtt tat tta tgt gaa gga 1964
Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly
570 575 580
att aac cag gct gga aga agc aga aag gaa gtg gaa tta att atc caa 2012
Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln
585 590 595
gtt act cca aaa gac ata aaa ctt aca gct ttt cct tct gag agt gtc 2060
Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val
600 605 610
aaa gaa gga gac act gtc atc atc tct tgt aca tgt gga aat gtt cca 2108
Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro
615 620 625
gaa aca tgg ata atc ctg aag aaa aaa gcg gag aca gga gac aca gta 2156
Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val
630 635 640 645
cta aaa tct ata gat ggc gcc tat acc atc cga aag gcc cag ttg aag 2204
Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys
650 655 660
gat gcg gga gta tat gaa tgt gaa tct aaa aac aaa gtt ggc tca caa 2252
Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln
665 670 675
tta aga agt tta aca ctt gat gtt caa gga aga gaa aac aac aaa gac 2300
Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp
680 685 690
tat ttt tct cct gag ctt ctc gtg ctc tat ttt gca tcc tcc tta ata 2348
Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile
695 700 705
ata cct gcc att gga atg ata att tac ttt gca aga aaa gcc aac atg 2396
Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met
710 715 720 725
aag ggg tca tat agt ctt gta gaa gca cag aag tca aaa gtg tag 2441
Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys Ser Lys Val
730 735
ctaatgcttg atatgttcaa ctggagacac tatttatctg tgcaaatcct tgatactgct 2501
catcattcct tgagaaaaac aatgagctga gaggcagact tccctgaatg tattgaactt 2561
ggaaagaaat gcccatctat gtcccttgct gtgagcaaga agtcaaagta aaacttgctg 2621
cctgaagaac agtaactgcc atcaagatga gagaactgga ggagttcctt gatctgtata 2681
tacaataaca taatttgtac atatgtaaaa taaaattatg ccatagcaag attgcttaaa 2741
atagcaacac tctatattta gattgttaaa ataactagtg ttgcttggac tattataatt 2801
taatgcatgt taggaaaatt tcacattaat atttgctgac agctgacctt tgtcatcttt 2861
cttctatttt attccctttc acaaaatttt attcctatat agtttattga caataatttc 2921
aggttttgta aagatgccgg gttttatatt tttatagaca aataataagc aaagggagca 2981
ctgggttgac tttcaggtac taaatacctc aacctatggt ataatggttg actgggtttc 3041
tctgtatagt actggcatgg tacggagatg tttcacgaag tttgttcatc agactcctgt 3101
gcaactttcc caatgtggcc taaaaatgca acttcttttt attttctttt gtaaatgttt 3161
aggttttttt gtatagtaaa gtgataattt ctggaattag aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3220
<210> 6
<211> 739
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp
1 5 10 15
Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser
35 40 45
Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp
50 55 60
Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu
65 70 75 80
Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr
85 90 95
Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile
100 105 110
Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu
115 120 125
Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro
130 135 140
Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys
145 150 155 160
Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys
165 170 175
Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val
180 185 190
Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro
195 200 205
Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys
210 215 220
Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly
225 230 235 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile
245 250 255
Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly
260 265 270
Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile
275 280 285
Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val
290 295 300
Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly
305 310 315 320
Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser
325 330 335
Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp
340 345 350
Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu
355 360 365
Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr
370 375 380
Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val
405 410 415
Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro
420 425 430
Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu
435 440 445
Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys
450 455 460
Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala
465 470 475 480
Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro
485 490 495
Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg
500 505 510
Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser
515 520 525
Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile
530 535 540
Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu
545 550 555 560
Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val
565 570 575
Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val
580 585 590
Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe
595 600 605
Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr
610 615 620
Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu
625 630 635 640
Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg
645 650 655
Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn
660 665 670
Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg
675 680 685
Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe
690 695 700
Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala
705 710 715 720
Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys
725 730 735
Ser Lys Val
<210> 7
<211> 6574
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (332)..(3601)
<300>
<308> NM_006206.4
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(6574)
<400> 7
aagagcaaaa agcgaaggcg caatctggac actgggagat tcggagcgca gggagtttga 60
gagaaacttt tattttgaag agaccaaggt tgaggggggg cttatttcct gacagctatt 120
tacttagagc aaatgattag ttttagaagg atggactata acattgaatc aattacaaaa 180
cgcggttttt gagcccatta ctgttggagc tacagggaga gaaacagagg aggagactgc 240
aagagatcat tggaggccgt gggcacgctc tttactccat gtgtgggaca ttcattgcgg 300
aataacatcg gaggagaagt ttcccagagc t atg ggg act tcc cat ccg gcg 352
Met Gly Thr Ser His Pro Ala
1 5
ttc ctg gtc tta ggc tgt ctt ctc aca ggg ctg agc cta atc ctc tgc 400
Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys
10 15 20
cag ctt tca tta ccc tct atc ctt cca aat gaa aat gaa aag gtt gtg 448
Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro Asn Glu Asn Glu Lys Val Val
25 30 35
cag ctg aat tca tcc ttt tct ctg aga tgc ttt ggg gag agt gaa gtg 496
Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val
40 45 50 55
agc tgg cag tac ccc atg tct gaa gaa gag agc tcc gat gtg gaa atc 544
Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile
60 65 70
aga aat gaa gaa aac aac agc ggc ctt ttt gtg acg gtc ttg gaa gtg 592
Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu Phe Val Thr Val Leu Glu Val
75 80 85
agc agt gcc tcg gcg gcc cac aca ggg ttg tac act tgc tat tac aac 640
Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn
90 95 100
cac act cag aca gaa gag aat gag ctt gaa ggc agg cac att tac atc 688
His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile
105 110 115
tat gtg cca gac cca gat gta gcc ttt gta cct cta gga atg acg gat 736
Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe Val Pro Leu Gly Met Thr Asp
120 125 130 135
tat tta gtc atc gtg gag gat gat gat tct gcc att ata cct tgt cgc 784
Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg
140 145 150
aca act gat ccc gag act cct gta acc tta cac aac agt gag ggg gtg 832
Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr Leu His Asn Ser Glu Gly Val
155 160 165
gta cct gcc tcc tac gac agc aga cag ggc ttt aat ggg acc ttc act 880
Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr
170 175 180
gta ggg ccc tat atc tgt gag gcc acc gtc aaa gga aag aag ttc cag 928
Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln
185 190 195
acc atc cca ttt aat gtt tat gct tta aaa gca aca tca gag ctg gat 976
Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp
200 205 210 215
cta gaa atg gaa gct ctt aaa acc gtg tat aag tca ggg gaa acg att 1024
Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile
220 225 230
gtg gtc acc tgt gct gtt ttt aac aat gag gtg gtt gac ctt caa tgg 1072
Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn Glu Val Val Asp Leu Gln Trp
235 240 245
act tac cct gga gaa gtg aaa ggc aaa ggc atc aca atg ctg gaa gaa 1120
Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu
250 255 260
atc aaa gtc cca tcc atc aaa ttg gtg tac act ttg acg gtc ccc gag 1168
Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu
265 270 275
gcc acg gtg aaa gac agt gga gat tac gaa tgt gct gcc cgc cag gct 1216
Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala
280 285 290 295
acc agg gag gtc aaa gaa atg aag aaa gtc act att tct gtc cat gag 1264
Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys Val Thr Ile Ser Val His Glu
300 305 310
aaa ggt ttc att gaa atc aaa ccc acc ttc agc cag ttg gaa gct gtc 1312
Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val
315 320 325
aac ctg cat gaa gtc aaa cat ttt gtt gta gag gtg cgg gcc tac cca 1360
Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro
330 335 340
cct ccc agg ata tcc tgg ctg aaa aac aat ctg act ctg att gaa aat 1408
Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn
345 350 355
ctc act gag atc acc act gat gtg gaa aag att cag gaa ata agg tat 1456
Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr
360 365 370 375
cga agc aaa tta aag ctg atc cgt gct aag gaa gaa gac agt ggc cat 1504
Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly His
380 385 390
tat act att gta gct caa aat gaa gat gct gtg aag agc tat act ttt 1552
Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe
395 400 405
gaa ctg tta act caa gtt cct tca tcc att ctg gac ttg gtc gat gat 1600
Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp
410 415 420
cac cat ggc tca act ggg gga cag acg gtg agg tgc aca gct gaa ggc 1648
His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly
425 430 435
acg ccg ctt cct gat att gag tgg atg ata tgc aaa gat att aag aaa 1696
Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys
440 445 450 455
tgt aat aat gaa act tcc tgg act att ttg gcc aac aat gtc tca aac 1744
Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn
460 465 470
atc atc acg gag atc cac tcc cga gac agg agt acc gtg gag ggc cgt 1792
Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg
475 480 485
gtg act ttc gcc aaa gtg gag gag acc atc gcc gtg cga tgc ctg gct 1840
Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala
490 495 500
aag aat ctc ctt gga gct gag aac cga gag ctg aag ctg gtg gct ccc 1888
Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro
505 510 515
acc ctg cgt tct gaa ctc acg gtg gct gct gca gtc ctg gtg ctg ttg 1936
Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala Ala Ala Val Leu Val Leu Leu
520 525 530 535
gtg att gtg atc atc tca ctt att gtc ctg gtt gtc att tgg aaa cag 1984
Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val Leu Val Val Ile Trp Lys Gln
540 545 550
aaa ccg agg tat gaa att cgc tgg agg gtc att gaa tca atc agc cca 2032
Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro
555 560 565
gat gga cat gaa tat att tat gtg gac ccg atg cag ctg cct tat gac 2080
Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp
570 575 580
tca aga tgg gag ttt cca aga gat gga cta gtg ctt ggt cgg gtc ttg 2128
Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly Leu Val Leu Gly Arg Val Leu
585 590 595
ggg tct gga gcg ttt ggg aag gtg gtt gaa gga aca gcc tat gga tta 2176
Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu
600 605 610 615
agc cgg tcc caa cct gtc atg aaa gtt gca gtg aag atg cta aaa ccc 2224
Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Pro
620 625 630
acg gcc aga tcc agt gaa aaa caa gct ctc atg tct gaa ctg aag ata 2272
Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile
635 640 645
atg act cac ctg ggg cca cat ttg aac att gta aac ttg ctg gga gcc 2320
Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala
650 655 660
tgc acc aag tca ggc ccc att tac atc atc aca gag tat tgc ttc tat 2368
Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr
665 670 675
gga gat ttg gtc aac tat ttg cat aag aat agg gat agc ttc ctg agc 2416
Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser
680 685 690 695
cac cac cca gag aag cca aag aaa gag ctg gat atc ttt gga ttg aac 2464
His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn
700 705 710
cct gct gat gaa agc aca cgg agc tat gtt att tta tct ttt gaa aac 2512
Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn
715 720 725
aat ggt gac tac atg gac atg aag cag gct gat act aca cag tat gtc 2560
Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val
730 735 740
ccc atg cta gaa agg aaa gag gtt tct aaa tat tcc gac atc cag aga 2608
Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg
745 750 755
tca ctc tat gat cgt cca gcc tca tat aag aag aaa tct atg tta gac 2656
Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp
760 765 770 775
tca gaa gtc aaa aac ctc ctt tca gat gat aac tca gaa ggc ctt act 2704
Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr
780 785 790
tta ttg gat ttg ttg agc ttc acc tat caa gtt gcc cga gga atg gag 2752
Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr Gln Val Ala Arg Gly Met Glu
795 800 805
ttt ttg gct tca aaa aat tgt gtc cac cgt gat ctg gct gct cgc aac 2800
Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
810 815 820
gtc ctc ctg gca caa gga aaa att gtg aag atc tgt gac ttt ggc ctg 2848
Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu
825 830 835
gcc aga gac atc atg cat gat tcg aac tat gtg tcg aaa ggc agt acc 2896
Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr
840 845 850 855
ttt ctg ccc gtg aag tgg atg gct cct gag agc atc ttt gac aac ctc 2944
Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu
860 865 870
tac acc aca ctg agt gat gtc tgg tct tat ggc att ctg ctc tgg gag 2992
Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu
875 880 885
atc ttt tcc ctt ggt ggc acc cct tac ccc ggc atg atg gtg gat tct 3040
Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Gly Met Met Val Asp Ser
890 895 900
act ttc tac aat aag atc aag agt ggg tac cgg atg gcc aag cct gac 3088
Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp
905 910 915
cac gct acc agt gaa gtc tac gag atc atg gtg aaa tgc tgg aac agt 3136
His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile Met Val Lys Cys Trp Asn Ser
920 925 930 935
gag ccg gag aag aga ccc tcc ttt tac cac ctg agt gag att gtg gag 3184
Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr His Leu Ser Glu Ile Val Glu
940 945 950
aat ctg ctg cct gga caa tat aaa aag agt tat gaa aaa att cac ctg 3232
Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu
955 960 965
gac ttc ctg aag agt gac cat cct gct gtg gca cgc atg cgt gtg gac 3280
Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala Val Ala Arg Met Arg Val Asp
970 975 980
tca gac aat gca tac att ggt gtc acc tac aaa aac gag gaa gac aag 3328
Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys
985 990 995
ctg aag gac tgg gag ggt ggt ctg gat gag cag aga ctg agc gct 3373
Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp Glu Gln Arg Leu Ser Ala
1000 1005 1010
gac agt ggc tac atc att cct ctg cct gac att gac cct gtc cct 3418
Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp Ile Asp Pro Val Pro
1015 1020 1025
gag gag gag gac ctg ggc aag agg aac aga cac agc tcg cag acc 3463
Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His Ser Ser Gln Thr
1030 1035 1040
tct gaa gag agt gcc att gag acg ggt tcc agc agt tcc acc ttc 3508
Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser Ser Thr Phe
1045 1050 1055
atc aag aga gag gac gag acc att gaa gac atc gac atg atg gat 3553
Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met Met Asp
1060 1065 1070
gac atc ggc ata gac tct tca gac ctg gtg gaa gac agc ttc ctg 3598
Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe Leu
1075 1080 1085
taa ctggcggatt cgaggggttc cttccacttc tggggccacc tctggatccc 3651
gttcagaaaa ccactttatt gcaatgcaga ggttgagagg aggacttggt tgatgtttaa 3711
agagaagttc ccagccaagg gcctcgggga gcgttctaaa tatgaatgaa tgggatattt 3771
tgaaatgaac tttgtcagtg ttgcctcttg caatgcctca gtagcatctc agtggtgtgt 3831
gaagtttgga gatagatgga taagggaata ataggccaca gaaggtgaac tttgtgcttc 3891
aaggacattg gtgagagtcc aacagacaca atttatactg cgacagaact tcagcattgt 3951
aattatgtaa ataactctaa ccaaggctgt gtttagattg tattaactat cttctttgga 4011
cttctgaaga gaccactcaa tccatccatg tacttccctc ttgaaacctg atgtcagctg 4071
ctgttgaact ttttaaagaa gtgcatgaaa aaccattttt gaaccttaaa aggtactggt 4131
actatagcat tttgctatct tttttagtgt taaagagata aagaataata attaaccaac 4191
cttgtttaat agatttgggt catttagaag cctgacaact cattttcata ttgtaatcta 4251
tgtttataat actactactg ttatcagtaa tgctaaatgt gtaataatgt aacatgattt 4311
ccctccagag aaagcacaat ttaaaacaat ccttactaag taggtgatga gtttgacagt 4371
ttttgacatt tatattaaat aacatgtttc tctataaagt atggtaatag ctttagtgaa 4431
ttaaatttag ttgagcatag agaacaaagt aaaagtagtg ttgtccagga agtcagaatt 4491
tttaactgta ctgaataggt tccccaatcc atcgtattaa aaaacaatta actgccctct 4551
gaaataatgg gattagaaac aaacaaaact cttaagtcct aaaagttctc aatgtagagg 4611
cataaacctg tgctgaacat aacttctcat gtatattacc caatggaaaa tataatgatc 4671
agcaaaaaga ctggatttgc agaagttttt tttttttttt tcttcatgcc tgatgaaagc 4731
tttggcgacc ccaatatatg tattttttga atctatgaac ctgaaaaggg tcagaaggat 4791
gcccagacat cagcctcctt ctttcacccc ttaccccaaa gagaaagagt ttgaaactcg 4851
agaccataaa gatattcttt agtggaggct ggatgtgcat tagcctggat cctcagttct 4911
caaatgtgtg tggcagccag gatgactaga tcctgggttt ccatccttga gattctgaag 4971
tatgaagtct gagggaaacc agagtctgta tttttctaaa ctccctggct gttctgatcg 5031
gccagttttc ggaaacactg acttaggttt caggaagttg ccatgggaaa caaataattt 5091
gaactttgga acagggttgg cattcaacca cgcaggaagc ctactattta aatccttggc 5151
ttcaggttag tgacatttaa tgccatctag ctagcaattg cgaccttaat ttaactttcc 5211
agtcttagct gaggctgaga aagctaaagt ttggttttga caggttttcc aaaagtaaag 5271
atgctacttc ccactgtatg ggggagattg aactttcccc gtctcccgtc ttctgcctcc 5331
cactccatac cccgccaagg aaaggcatgt acaaaaatta tgcaattcag tgttccaagt 5391
ctctgtgtaa ccagctcagt gttttggtgg aaaaaacatt ttaagtttta ctgataattt 5451
gaggttagat gggaggatga attgtcacat ctatccacac tgtcaaacag gttggtgtgg 5511
gttcattggc attctttgca atactgctta attgctgata ccatatgaat gaaacatggg 5571
ctgtgattac tgcaatcact gtgctatcgg cagatgatgc tttggaagat gcagaagcaa 5631
taataaagta cttgactacc tactggtgta atctcaatgc aagccccaac tttcttatcc 5691
aactttttca tagtaagtgc gaagactgag ccagattggc caattaaaaa cgaaaacctg 5751
actaggttct gtagagccaa ttagacttga aatacgtttg tgtttctaga atcacagctc 5811
aagcattctg tttatcgctc actctccctt gtacagcctt attttgttgg tgctttgcat 5871
tttgatattg ctgtgagcct tgcatgacat catgaggccg gatgaaactt ctcagtccag 5931
cagtttccag tcctaacaaa tgctcccacc tgaatttgta tatgactgca tttgtgtgtg 5991
tgtgtgtgtt ttcagcaaat tccagatttg tttccttttg gcctcctgca aagtctccag 6051
aagaaaattt gccaatcttt cctactttct atttttatga tgacaatcaa agccggcctg 6111
agaaacacta tttgtgactt tttaaacgat tagtgatgtc cttaaaatgt ggtctgccaa 6171
tctgtacaaa atggtcctat ttttgtgaag agggacataa gataaaatga tgttatacat 6231
caatatgtat atatgtattt ctatatagac ttggagaata ctgccaaaac atttatgaca 6291
agctgtatca ctgccttcgt ttatattttt ttaactgtga taatccccac aggcacatta 6351
actgttgcac ttttgaatgt ccaaaattta tattttagaa ataataaaaa gaaagatact 6411
tacatgttcc caaaacaatg gtgtggtgaa tgtgtgagaa aaactaactt gatagggtct 6471
accaatacaa aatgtattac gaatgcccct gttcatgttt ttgttttaaa acgtgtaaat 6531
gaagatcttt atatttcaat aaatgatata taatttaaag tta 6574
<210> 8
<211> 1089
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg
35 40 45
Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly
85 90 95
Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu
100 105 110
Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe
115 120 125
Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp
130 135 140
Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln
165 170 175
Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr
180 185 190
Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu
195 200 205
Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val
210 215 220
Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys
245 250 255
Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr
275 280 285
Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys
290 295 300
Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr
305 310 315 320
Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val
325 330 335
Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn
340 345 350
Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu
355 360 365
Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala
370 375 380
Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp
385 390 395 400
Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr
420 425 430
Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met
435 440 445
Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile
450 455 460
Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp
465 470 475 480
Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr
485 490 495
Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg
500 505 510
Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala
515 520 525
Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val
530 535 540
Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg
545 550 555 560
Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp
565 570 575
Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly
580 585 590
Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val
595 600 605
Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val
610 615 620
Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala
625 630 635 640
Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn
645 650 655
Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile
660 665 670
Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys
675 680 685
Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu
690 695 700
Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr
705 710 715 720
Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln
725 730 735
Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser
740 745 750
Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr
755 760 765
Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp
770 775 780
Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr
785 790 795 800
Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His
805 810 815
Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val
820 825 830
Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn
835 840 845
Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro
850 855 860
Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser
865 870 875 880
Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr
885 890 895
Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly
900 905 910
Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile
915 920 925
Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr
930 935 940
His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys
945 950 955 960
Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala
965 970 975
Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr
980 985 990
Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp
995 1000 1005
Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro
1010 1015 1020
Asp Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn
1025 1030 1035
Arg His Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly
1040 1045 1050
Ser Ser Ser Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu
1055 1060 1065
Asp Ile Asp Met Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu
1070 1075 1080
Val Glu Asp Ser Phe Leu
1085
<210> 9
<211> 5718
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (470)..(3790)
<300>
<308> NM_002609.3
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(5718)
<400> 9
ctcctgaggc tgccagcagc cagcagtgac tgcccgccct atctgggacc caggatcgct 60
ctgtgagcaa cttggagcca gagaggagat caacaaggag gaggagagag ccggcccctc 120
agccctgctg cccagcagca gcctgtgctc gccctgccca acgcagacag ccagacccag 180
ggcggcccct ctggcggctc tgctcctccc gaaggatgct tggggagtga ggcgaagctg 240
ggccgctcct ctcccctaca gcagccccct tcctccatcc ctctgttctc ctgagccttc 300
aggagcctgc accagtcctg cctgtccttc tactcagctg ttacccactc tgggaccagc 360
agtctttctg ataactggga gagggcagta aggaggactt cctggagggg gtgactgtcc 420
agagcctgga actgtgccca caccagaagc catcagcagc aaggacacc atg cgg ctt 478
Met Arg Leu
1
ccg ggt gcg atg cca gct ctg gcc ctc aaa ggc gag ctg ctg ttg ctg 526
Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu Leu Leu Leu
5 10 15
tct ctc ctg tta ctt ctg gaa cca cag atc tct cag ggc ctg gtc gtc 574
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly Leu Val Val
20 25 30 35
aca ccc ccg ggg cca gag ctt gtc ctc aat gtc tcc agc acc ttc gtt 622
Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val
40 45 50
ctg acc tgc tcg ggt tca gct ccg gtg gtg tgg gaa cgg atg tcc cag 670
Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln
55 60 65
gag ccc cca cag gaa atg gcc aag gcc cag gat ggc acc ttc tcc agc 718
Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser
70 75 80
gtg ctc aca ctg acc aac ctc act ggg cta gac acg gga gaa tac ttt 766
Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe
85 90 95
tgc acc cac aat gac tcc cgt gga ctg gag acc gat gag cgg aaa cgg 814
Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg
100 105 110 115
ctc tac atc ttt gtg cca gat ccc acc gtg ggc ttc ctc cct aat gat 862
Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu Pro Asn Asp
120 125 130
gcc gag gaa cta ttc atc ttt ctc acg gaa ata act gag atc acc att 910
Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile
135 140 145
cca tgc cga gta aca gac cca cag ctg gtg gtg aca ctg cac gag aag 958
Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys
150 155 160
aaa ggg gac gtt gca ctg cct gtc ccc tat gat cac caa cgt ggc ttt 1006
Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe
165 170 175
tct ggt atc ttt gag gac aga agc tac atc tgc aaa acc acc att ggg 1054
Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly
180 185 190 195
gac agg gag gtg gat tct gat gcc tac tat gtc tac aga ctc cag gtg 1102
Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Val
200 205 210
tca tcc atc aac gtc tct gtg aac gca gtg cag act gtg gtc cgc cag 1150
Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val Val Arg Gln
215 220 225
ggt gag aac atc acc ctc atg tgc att gtg atc ggg aat gag gtg gtc 1198
Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn Glu Val Val
230 235 240
aac ttc gag tgg aca tac ccc cgc aaa gaa agt ggg cgg ctg gtg gag 1246
Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly Arg Leu Val Glu
245 250 255
ccg gtg act gac ttc ctc ttg gat atg cct tac cac atc cgc tcc atc 1294
Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile Arg Ser Ile
260 265 270 275
ctg cac atc ccc agt gcc gag tta gaa gac tcg ggg acc tac acc tgc 1342
Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Thr Cys
280 285 290
aat gtg acg gag agt gtg aat gac cat cag gat gaa aag gcc atc aac 1390
Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys Ala Ile Asn
295 300 305
atc acc gtg gtt gag agc ggc tac gtg cgg ctc ctg gga gag gtg ggc 1438
Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly Glu Val Gly
310 315 320
aca cta caa ttt gct gag ctg cat cgg agc cgg aca ctg cag gta gtg 1486
Thr Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu Gln Val Val
325 330 335
ttc gag gcc tac cca ccg ccc act gtc ctg tgg ttc aaa gac aac cgc 1534
Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys Asp Asn Arg
340 345 350 355
acc ctg ggc gac tcc agc gct ggc gaa atc gcc ctg tcc acg cgc aac 1582
Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser Thr Arg Asn
360 365 370
gtg tcg gag acc cgg tat gtg tca gag ctg aca ctg gtt cgc gtg aag 1630
Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val Arg Val Lys
375 380 385
gtg gca gag gct ggc cac tac acc atg cgg gcc ttc cat gag gat gct 1678
Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His Glu Asp Ala
390 395 400
gag gtc cag ctc tcc ttc cag cta cag atc aat gtc cct gtc cga gtg 1726
Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro Val Arg Val
405 410 415
ctg gag cta agt gag agc cac cct gac agt ggg gaa cag aca gtc cgc 1774
Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln Thr Val Arg
420 425 430 435
tgt cgt ggc cgg ggc atg ccc cag ccg aac atc atc tgg tct gcc tgc 1822
Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp Ser Ala Cys
440 445 450
aga gac ctc aaa agg tgt cca cgt gag ctg ccg ccc acg ctg ctg ggg 1870
Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr Leu Leu Gly
455 460 465
aac agt tcc gaa gag gag agc cag ctg gag act aac gtg acg tac tgg 1918
Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gln Leu Glu Thr Asn Val Thr Tyr Trp
470 475 480
gag gag gag cag gag ttt gag gtg gtg agc aca ctg cgt ctg cag cac 1966
Glu Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Val Ser Thr Leu Arg Leu Gln His
485 490 495
gtg gat cgg cca ctg tcg gtg cgc tgc acg ctg cgc aac gct gtg ggc 2014
Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn Ala Val Gly
500 505 510 515
cag gac acg cag gag gtc atc gtg gtg cca cac tcc ttg ccc ttt aag 2062
Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys
520 525 530
gtg gtg gtg atc tca gcc atc ctg gcc ctg gtg gtg ctc acc atc atc 2110
Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile
535 540 545
tcc ctt atc atc ctc atc atg ctt tgg cag aag aag cca cgt tac gag 2158
Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg Tyr Glu
550 555 560
atc cga tgg aag gtg att gag tct gtg agc tct gac ggc cat gag tac 2206
Ile Arg Trp Lys Val Ile Glu Ser Val Ser Ser Asp Gly His Glu Tyr
565 570 575
atc tac gtg gac ccc atg cag ctg ccc tat gac tcc acg tgg gag ctg 2254
Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Thr Trp Glu Leu
580 585 590 595
ccg cgg gac cag ctt gtg ctg gga cgc acc ctc ggc tct ggg gcc ttt 2302
Pro Arg Asp Gln Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser Gly Ala Phe
600 605 610
ggg cag gtg gtg gag gcc acg gct cat ggc ctg agc cat tct cag gcc 2350
Gly Gln Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His Ser Gln Ala
615 620 625
acg atg aaa gtg gcc gtc aag atg ctt aaa tcc aca gcc cgc agc agt 2398
Thr Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala Arg Ser Ser
630 635 640
gag aag caa gcc ctt atg tcg gag ctg aag atc atg agt cac ctt ggg 2446
Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu Gly
645 650 655
ccc cac ctg aac gtg gtc aac ctg ttg ggg gcc tgc acc aaa gga gga 2494
Pro His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gly Gly
660 665 670 675
ccc atc tat atc atc act gag tac tgc cgc tac gga gac ctg gtg gac 2542
Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Val Asp
680 685 690
tac ctg cac cgc aac aaa cac acc ttc ctg cag cac cac tcc gac aag 2590
Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gln His His Ser Asp Lys
695 700 705
cgc cgc ccg ccc agc gcg gag ctc tac agc aat gct ctg ccc gtt ggg 2638
Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ser Asn Ala Leu Pro Val Gly
710 715 720
ctc ccc ctg ccc agc cat gtg tcc ttg acc ggg gag agc gac ggt ggc 2686
Leu Pro Leu Pro Ser His Val Ser Leu Thr Gly Glu Ser Asp Gly Gly
725 730 735
tac atg gac atg agc aag gac gag tcg gtg gac tat gtg ccc atg ctg 2734
Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val Pro Met Leu
740 745 750 755
gac atg aaa gga gac gtc aaa tat gca gac atc gag tcc tcc aac tac 2782
Asp Met Lys Gly Asp Val Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Ser Ser Asn Tyr
760 765 770
atg gcc cct tac gat aac tac gtt ccc tct gcc cct gag agg acc tgc 2830
Met Ala Pro Tyr Asp Asn Tyr Val Pro Ser Ala Pro Glu Arg Thr Cys
775 780 785
cga gca act ttg atc aac gag tct cca gtg cta agc tac atg gac ctc 2878
Arg Ala Thr Leu Ile Asn Glu Ser Pro Val Leu Ser Tyr Met Asp Leu
790 795 800
gtg ggc ttc agc tac cag gtg gcc aat ggc atg gag ttt ctg gcc tcc 2926
Val Gly Phe Ser Tyr Gln Val Ala Asn Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser
805 810 815
aag aac tgc gtc cac aga gac ctg gcg gct agg aac gtg ctc atc tgt 2974
Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Ile Cys
820 825 830 835
gaa ggc aag ctg gtc aag atc tgt gac ttt ggc ctg gct cga gac atc 3022
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile
840 845 850
atg cgg gac tcg aat tac atc tcc aaa ggc agc acc ttt ttg cct tta 3070
Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Leu
855 860 865
aag tgg atg gct ccg gag agc atc ttc aac agc ctc tac acc acc ctg 3118
Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Ser Leu Tyr Thr Thr Leu
870 875 880
agc gac gtg tgg tcc ttc ggg atc ctg ctc tgg gag atc ttc acc ttg 3166
Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Thr Leu
885 890 895
ggt ggc acc cct tac cca gag ctg ccc atg aac gag cag ttc tac aat 3214
Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gln Phe Tyr Asn
900 905 910 915
gcc atc aaa cgg ggt tac cgc atg gcc cag cct gcc cat gcc tcc gac 3262
Ala Ile Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gln Pro Ala His Ala Ser Asp
920 925 930
gag atc tat gag atc atg cag aag tgc tgg gaa gag aag ttt gag att 3310
Glu Ile Tyr Glu Ile Met Gln Lys Cys Trp Glu Glu Lys Phe Glu Ile
935 940 945
cgg ccc ccc ttc tcc cag ctg gtg ctg ctt ctc gag aga ctg ttg ggc 3358
Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu Val Leu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Gly
950 955 960
gaa ggt tac aaa aag aag tac cag cag gtg gat gag gag ttt ctg agg 3406
Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu Phe Leu Arg
965 970 975
agt gac cac cca gcc atc ctt cgg tcc cag gcc cgc ttg cct ggg ttc 3454
Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu Pro Gly Phe
980 985 990 995
cat ggc ctc cga tct ccc ctg gac acc agc tcc gtc ctc tat act 3499
His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu Tyr Thr
1000 1005 1010
gcc gtg cag ccc aat gag ggt gac aac gac tat atc atc ccc ctg 3544
Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile Pro Leu
1015 1020 1025
cct gac ccc aaa ccc gag gtt gct gac gag ggc cca ctg gag ggt 3589
Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu Glu Gly
1030 1035 1040
tcc ccc agc cta gcc agc tcc acc ctg aat gaa gtc aac acc tcc 3634
Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn Thr Ser
1045 1050 1055
tca acc atc tcc tgt gac agc ccc ctg gag ccc cag gac gaa cca 3679
Ser Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp Glu Pro
1060 1065 1070
gag cca gag ccc cag ctt gag ctc cag gtg gag ccg gag cca gag 3724
Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu Pro Glu
1075 1080 1085
ctg gaa cag ttg ccg gat tcg ggg tgc cct gcg cct cgg gcg gaa 3769
Leu Glu Gln Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg Ala Glu
1090 1095 1100
gca gag gat agc ttc ctg tag ggggctggcc cctaccctgc cctgcctgaa 3820
Ala Glu Asp Ser Phe Leu
1105
gctccccccc tgccagcacc cagcatctcc tggcctggcc tgaccgggct tcctgtcagc 3880
caggctgccc ttatcagctg tccccttctg gaagctttct gctcctgacg tgttgtgccc 3940
caaaccctgg ggctggctta ggaggcaaga aaactgcagg ggccgtgacc agccctctgc 4000
ctccagggag gccaactgac tctgagccag ggttccccca gggaactcag ttttcccata 4060
tgtaagatgg gaaagttagg cttgatgacc cagaatctag gattctctcc ctggctgaca 4120
ggtggggaga ccgaatccct ccctgggaag attcttggag ttactgaggt ggtaaattaa 4180
cttttttctg ttcagccagc tacccctcaa ggaatcatag ctctctcctc gcacttttat 4240
ccacccagga gctagggaag agaccctagc ctccctggct gctggctgag ctagggccta 4300
gccttgagca gtgttgcctc atccagaaga aagccagtct cctccctatg atgccagtcc 4360
ctgcgttccc tggcccgagc tggtctgggg ccattaggca gcctaattaa tgctggaggc 4420
tgagccaagt acaggacacc cccagcctgc agcccttgcc cagggcactt ggagcacacg 4480
cagccatagc aagtgcctgt gtccctgtcc ttcaggccca tcagtcctgg ggctttttct 4540
ttatcaccct cagtcttaat ccatccacca gagtctagaa ggccagacgg gccccgcatc 4600
tgtgatgaga atgtaaatgt gccagtgtgg agtggccacg tgtgtgtgcc agtatatggc 4660
cctggctctg cattggacct gctatgaggc tttggaggaa tccctcaccc tctctgggcc 4720
tcagtttccc cttcaaaaaa tgaataagtc ggacttatta actctgagtg ccttgccagc 4780
actaacattc tagagtattc caggtggttg cacatttgtc cagatgaagc aaggccatat 4840
accctaaact tccatcctgg gggtcagctg ggctcctggg agattccaga tcacacatca 4900
cactctgggg actcaggaac catgcccctt ccccaggccc ccagcaagtc tcaagaacac 4960
agctgcacag gccttgactt agagtgacag ccggtgtcct ggaaagcccc cagcagctgc 5020
cccagggaca tgggaagacc acgggacctc tttcactacc cacgatgacc tccgggggta 5080
tcctgggcaa aagggacaaa gagggcaaat gagatcacct cctgcagccc accactccag 5140
cacctgtgcc gaggtctgcg tcgaagacag aatggacagt gaggacagtt atgtcttgta 5200
aaagacaaga agcttcagat gggtacccca agaaggatgt gagaggtggg cgctttggag 5260
gtttgcccct cacccaccag ctgccccatc cctgaggcag cgctccatgg gggtatggtt 5320
ttgtcactgc ccagacctag cagtgacatc tcattgtccc cagcccagtg ggcattggag 5380
gtgccagggg agtcagggtt gtagccaaga cgcccccgca cggggagggt tgggaagggg 5440
gtgcaggaag ctcaacccct ctgggcacca accctgcatt gcaggttggc accttacttc 5500
cctgggatcc ccagagttgg tccaaggagg gagagtgggt tctcaatacg gtaccaaaga 5560
tataatcacc taggtttaca aatattttta ggactcacgt taactcacat ttatacagca 5620
gaaatgctat tttgtatgct gttaagtttt tctatctgtg tacttttttt taagggaaag 5680
attttaatat taaacctggt gcttctcact cacaaaaa 5718
<210> 10
<211> 1106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser
35 40 45
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg
50 55 60
Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr
65 70 75 80
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu
100 105 110
Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu
130 135 140
Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu
145 150 155 160
His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln
165 170 175
Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr
180 185 190
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg
195 200 205
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val
210 215 220
Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly Arg
245 250 255
Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile
260 265 270
Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr
275 280 285
Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys
290 295 300
Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly
305 310 315 320
Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu
325 330 335
Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys
340 345 350
Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser
355 360 365
Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val
370 375 380
Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His
385 390 395 400
Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro
405 410 415
Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln
420 425 430
Thr Val Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp
435 440 445
Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr
450 455 460
Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gln Leu Glu Thr Asn Val
465 470 475 480
Thr Tyr Trp Glu Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Val Ser Thr Leu Arg
485 490 495
Leu Gln His Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn
500 505 510
Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu
515 520 525
Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu
530 535 540
Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro
545 550 555 560
Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Ile Glu Ser Val Ser Ser Asp Gly
565 570 575
His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Thr
580 585 590
Trp Glu Leu Pro Arg Asp Gln Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser
595 600 605
Gly Ala Phe Gly Gln Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His
610 615 620
Ser Gln Ala Thr Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala
625 630 635 640
Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser
645 650 655
His Leu Gly Pro His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr
660 665 670
Lys Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Arg Tyr Gly Asp
675 680 685
Leu Val Asp Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gln His His
690 695 700
Ser Asp Lys Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ser Asn Ala Leu
705 710 715 720
Pro Val Gly Leu Pro Leu Pro Ser His Val Ser Leu Thr Gly Glu Ser
725 730 735
Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val
740 745 750
Pro Met Leu Asp Met Lys Gly Asp Val Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Ser
755 760 765
Ser Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Asp Asn Tyr Val Pro Ser Ala Pro Glu
770 775 780
Arg Thr Cys Arg Ala Thr Leu Ile Asn Glu Ser Pro Val Leu Ser Tyr
785 790 795 800
Met Asp Leu Val Gly Phe Ser Tyr Gln Val Ala Asn Gly Met Glu Phe
805 810 815
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val
820 825 830
Leu Ile Cys Glu Gly Lys Leu Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala
835 840 845
Arg Asp Ile Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys Gly Ser Thr Phe
850 855 860
Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Ser Leu Tyr
865 870 875 880
Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile
885 890 895
Phe Thr Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gln
900 905 910
Phe Tyr Asn Ala Ile Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gln Pro Ala His
915 920 925
Ala Ser Asp Glu Ile Tyr Glu Ile Met Gln Lys Cys Trp Glu Glu Lys
930 935 940
Phe Glu Ile Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu Val Leu Leu Leu Glu Arg
945 950 955 960
Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu
965 970 975
Phe Leu Arg Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu
980 985 990
Pro Gly Phe His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu
995 1000 1005
Tyr Thr Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile
1010 1015 1020
Pro Leu Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu
1025 1030 1035
Glu Gly Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn
1040 1045 1050
Thr Ser Ser Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp
1055 1060 1065
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu
1070 1075 1080
Pro Glu Leu Glu Gln Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg
1085 1090 1095
Ala Glu Ala Glu Asp Ser Phe Leu
1100 1105
<210> 11
<211> 3420
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (126)..(1409)
<300>
<308> NM_002507.3
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(3420)
<400> 11
agagcgagcc gagccgcggc cagctccggc gggcaggggg ggcgctggag cgcagcgcag 60
cgcagcccca tcagtccgca aagcggaccg agctggaagt cgagcgctgc cgcgggaggc 120
gggcg atg ggg gca ggt gcc acc ggc cgc gcc atg gac ggg ccg cgc ctg 170
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu
1 5 10 15
ctg ctg ttg ctg ctt ctg ggg gtg tcc ctt gga ggt gcc aag gag gca 218
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala
20 25 30
tgc ccc aca ggc ctg tac aca cac agc ggt gag tgc tgc aaa gcc tgc 266
Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys
35 40 45
aac ctg ggc gag ggt gtg gcc cag cct tgt gga gcc aac cag acc gtg 314
Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val
50 55 60
tgt gag ccc tgc ctg gac agc gtg acg ttc tcc gac gtg gtg agc gcg 362
Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala
65 70 75
acc gag ccg tgc aag ccg tgc acc gag tgc gtg ggg ctc cag agc atg 410
Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met
80 85 90 95
tcg gcg ccg tgc gtg gag gcc gac gac gcc gtg tgc cgc tgc gcc tac 458
Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr
100 105 110
ggc tac tac cag gat gag acg act ggg cgc tgc gag gcg tgc cgc gtg 506
Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val
115 120 125
tgc gag gcg ggc tcg ggc ctc gtg ttc tcc tgc cag gac aag cag aac 554
Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn
130 135 140
acc gtg tgc gag gag tgc ccc gac ggc acg tat tcc gac gag gcc aac 602
Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn
145 150 155
cac gtg gac ccg tgc ctg ccc tgc acc gtg tgc gag gac acc gag cgc 650
His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg
160 165 170 175
cag ctc cgc gag tgc aca cgc tgg gcc gac gcc gag tgc gag gag atc 698
Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile
180 185 190
cct ggc cgt tgg att aca cgg tcc aca ccc cca gag ggc tcg gac agc 746
Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser
195 200 205
aca gcc ccc agc acc cag gag cct gag gca cct cca gaa caa gac ctc 794
Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu
210 215 220
ata gcc agc acg gtg gca ggt gtg gtg acc aca gtg atg ggc agc tcc 842
Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser
225 230 235
cag ccc gtg gtg acc cga ggc acc acc gac aac ctc atc cct gtc tat 890
Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr
240 245 250 255
tgc tcc atc ctg gct gct gtg gtt gtg ggc ctt gtg gcc tac ata gcc 938
Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala
260 265 270
ttc aag agg tgg aac agc tgc aag cag aac aag caa gga gcc aac agc 986
Phe Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser
275 280 285
cgg cca gtg aac cag acg ccc cca cca gag gga gaa aaa ctc cac agc 1034
Arg Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser
290 295 300
gac agt ggc atc tcc gtg gac agc cag agc ctg cat gac cag cag ccc 1082
Asp Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro
305 310 315
cac acg cag aca gcc tcg ggc cag gcc ctc aag ggt gac gga ggc ctc 1130
His Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu
320 325 330 335
tac agc agc ctg ccc cca gcc aag cgg gag gag gtg gag aag ctt ctc 1178
Tyr Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu
340 345 350
aac ggc tct gcg ggg gac acc tgg cgg cac ctg gcg ggc gag ctg ggc 1226
Asn Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly
355 360 365
tac cag ccc gag cac ata gac tcc ttt acc cat gag gcc tgc ccc gtt 1274
Tyr Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val
370 375 380
cgc gcc ctg ctt gca agc tgg gcc acc cag gac agc gcc aca ctg gac 1322
Arg Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp
385 390 395
gcc ctc ctg gcc gcc ctg cgc cgc atc cag cga gcc gac ctc gtg gag 1370
Ala Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu
400 405 410 415
agt ctg tgc agt gag tcc act gcc aca tcc ccg gtg tga gcccaaccgg 1419
Ser Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val
420 425
ggagcccccg ccccgcccca cattccgaca accgatgctc cagccaaccc ctgtggagcc 1479
cgcaccccca ccctttgggg ggggcccgcc tggcagaact gagctcctct gggcaggacc 1539
tcagagtcca ggccccaaaa ccacagccct gtcagtgcag cccgtgtggc cccttcactt 1599
ctgaccacac ttcctgtcca gagagagaag tgcccctgct gcctccccaa ccctgcccct 1659
gccccgtcac catctcaggc cacctgcccc cttctcccac actgctaggt gggccagccc 1719
ctcccaccac agcaggtgtc atatatgggg ggccaacacc agggatggta ctagggggaa 1779
gtgacaaggc cccagagact cagagggagg aatcgaggaa ccagagccat ggactctaca 1839
ctgtgaactt ggggaacaag ggtggcatcc cagtggcctc aaccctccct cagcccctct 1899
tgccccccac cccagcctaa gatgaagagg atcggaggct tgtcagagct gggaggggtt 1959
ttcgaagctc agcccacccc cctcattttg gatataggtc agtgaggccc agggagaggc 2019
catgattcgc ccaaagccag acagcaacgg ggaggccaag tgcaggctgg caccgccttc 2079
tctaaatgag gggcctcagg tttgcctgag ggcgagggga gggtggcagg tgaccttctg 2139
ggaaatggct tgaagccaag tcagctttgc cttccacgct gtctccagac ccccacccct 2199
tccccactgc ctgcccaccc gtggagatgg gatgcttgcc tagggcctgg tccatgatgg 2259
agtcaggttt ggggttcgtg gaaagggtgc tgcttccctc tgcctgtccc tctcaggcat 2319
gcctgtgtga catcagtggc atggctccag tctgctgccc tccatcccga catggacccg 2379
gagctaacac tggcccctag aatcagccta ggggtcaggg accaaggacc cctcaccttg 2439
caacacacag acacacgcac acacacacac aggaggagaa atctcacttt tctccatgag 2499
ttttttctct tgggctgaga ctggatactg cccggggcag ctgccagaga agcatcggag 2559
ggaattgagg tctgctcggc cgtcttcact cgcccccggg tttggcgggc caaggactgc 2619
cgaccgaggc tggagctggc gtctgtcttc aagggcttac acgtggagga atgctccccc 2679
atcctcccct tccctgcaaa catggggttg gctgggccca gaaggttgtg atgaagaaaa 2739
gtgggccagt gtgggaatgc ggcaagaagg aattgacttc gactgtgacc tgtggggatt 2799
tctcccagct ctagacaacc ctgcaaagga ctgttttttc ctgagcttgg ccagaagggg 2859
gccatgaggc ctcagtggac tttccacccc ctccctggcc tgttctgttt tgcctgaagt 2919
tggagtgagt gtggctcccc tctatttagc atgacaagcc ccaggcaggc tgtgcgctga 2979
caaccaccgc tccccagccc agggttcccc cagccctgtg gaagggacta ggagcactgt 3039
agtaaatggc aattctttga cctcaacctg tgatgagggg aggaaactca cctgctggcc 3099
cctcacctgg gcacctgggg agtgggacag agtctgggtg tatttatttt cctccccagc 3159
aggtggggag ggggtttggg ggcttgcaag tatgttttag catgtgtttg gttctggggc 3219
ccctttttac tccccttgag ctgagatgga acccttttgg cccccgagct gggggccatg 3279
agctccagac ccccagcaac cctcctatca cctcccctcc ttgcctcctg tgtaatcatt 3339
tcttgggccc tcctgaaact tacacacaaa acgttaagtg atgaacatta aatagcaaag 3399
aaagaaaaat agtacaaaga g 3420
<210> 12
<211> 427
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg
275 280 285
Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser Asp
290 295 300
Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His
305 310 315 320
Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr
325 330 335
Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn
340 345 350
Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg
370 375 380
Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala
385 390 395 400
Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser
405 410 415
Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val
420 425
<210> 13
<211> 1731
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (359)..(1303)
<300>
<308> NM_002354.2
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(1731)
<400> 13
aactgcagcg ccggggctgg gggaggggag cctactcact cccccaactc ccgggcggtg 60
actcatcaac gagcaccagc ggccagaggt gagcagtccc gggaaggggc cgagaggcgg 120
ggccgccagg tcgggcaggt gtgcgctccg ccccgccgcg cgcacagagc gctagtcctt 180
cggcgagcga gcaccttcga cgcggtccgg ggaccccctc gtcgctgtcc tcccgacgcg 240
gacccgcgtg ccccaggcct cgcgctgccc ggccggctcc tcgtgtccca ctcccggcgc 300
acgccctccc gcgagtcccg ggcccctccc gcgcccctct tctcggcgcg cgcgcagc 358
atg gcg ccc ccg cag gtc ctc gcg ttc ggg ctt ctg ctt gcc gcg gcg 406
Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
acg gcg act ttt gcc gca gct cag gaa gaa tgt gtc tgt gaa aac tac 454
Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr
20 25 30
aag ctg gcc gta aac tgc ttt gtg aat aat aat cgt caa tgc cag tgt 502
Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys
35 40 45
act tca gtt ggt gca caa aat act gtc att tgc tca aag ctg gct gcc 550
Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala
50 55 60
aaa tgt ttg gtg atg aag gca gaa atg aat ggc tca aaa ctt ggg aga 598
Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg
65 70 75 80
aga gca aaa cct gaa ggg gcc ctc cag aac aat gat ggg ctt tat gat 646
Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp
85 90 95
cct gac tgc gat gag agc ggg ctc ttt aag gcc aag cag tgc aac ggc 694
Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly
100 105 110
acc tcc atg tgc tgg tgt gtg aac act gct ggg gtc aga aga aca gac 742
Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp
115 120 125
aag gac act gaa ata acc tgc tct gag cga gtg aga acc tac tgg atc 790
Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile
130 135 140
atc att gaa cta aaa cac aaa gca aga gaa aaa cct tat gat agt aaa 838
Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys
145 150 155 160
agt ttg cgg act gca ctt cag aag gag atc aca acg cgt tat caa ctg 886
Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu
165 170 175
gat cca aaa ttt atc acg agt att ttg tat gag aat aat gtt atc act 934
Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr
180 185 190
att gat ctg gtt caa aat tct tct caa aaa act cag aat gat gtg gac 982
Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp
195 200 205
ata gct gat gtg gct tat tat ttt gaa aaa gat gtt aaa ggt gaa tcc 1030
Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser
210 215 220
ttg ttt cat tct aag aaa atg gac ctg aca gta aat ggg gaa caa ctg 1078
Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu
225 230 235 240
gat ctg gat cct ggt caa act tta att tat tat gtt gat gaa aaa gca 1126
Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala
245 250 255
cct gaa ttc tca atg cag ggt cta aaa gct ggt gtt att gct gtt att 1174
Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile
260 265 270
gtg gtt gtg gtg ata gca gtt gtt gct gga att gtt gtg ctg gtt att 1222
Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile
275 280 285
tcc aga aag aag aga atg gca aag tat gag aag gct gag ata aag gag 1270
Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu
290 295 300
atg ggt gag atg cat agg gaa ctc aat gca taa ctatataatt tgaagattat 1323
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
305 310
agaagaaggg aaatagcaaa tggacacaaa ttacaaatgt gtgtgcgtgg gacgaagaca 1383
tctttgaagg tcatgagttt gttagtttaa catcatatat ttgtaatagt gaaacctgta 1443
ctcaaaatat aagcagcttg aaactggctt taccaatctt gaaatttgac cacaagtgtc 1503
ttatatatgc agatctaatg taaaatccag aacttggact ccatcgttaa aattatttat 1563
gtgtaacatt caaatgtgtg cattaaatat gcttccacag taaaatctga aaaactgatt 1623
tgtgattgaa agctgccttt ctatttactt gagtcttgta catacatact tttttatgag 1683
ctatgaaata aaacatttta aactgaattt cttaaaaaaa aaaaaaaa 1731
<210> 14
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr
20 25 30
Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys
35 40 45
Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala
50 55 60
Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg
65 70 75 80
Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp
85 90 95
Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly
100 105 110
Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp
115 120 125
Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile
130 135 140
Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys
145 150 155 160
Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu
165 170 175
Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr
180 185 190
Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp
195 200 205
Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu
225 230 235 240
Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile
260 265 270
Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile
275 280 285
Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu
290 295 300
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala
305 310
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> L803-mts / пептидный ингибитор GSK-3бета
<220>
<221> ЛИПИД
<222> (1)..(1)
<223> МИРИСТАТ
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> АМИДИРОВАНИЕ
<400> 15
Gly Lys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro
1 5 10
<---

Claims (11)

1. Способ продуцирования почечных клеток-предшественников, в которые дифференцируются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС-клетки), где указанный способ включает стадии:
(i) культивирования иПС-клеток в условиях, индуцирующих дифференцировку в почечные клетки-предшественники; и
(ii) разделение клеточной популяции из клеток, полученных на стадии (i), путем отбора по маркерам клеточной поверхности: CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+).
2. Способ по п. 1, где иПС-клетками являются человеческие иПС-клетки.
3. Способ отбора клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественники, с использованием по меньшей мере двух маркеров клеточной поверхности, включающих комбинацию одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-), и одного маркера позитивного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+), где почечные клетки-предшественники представляют собой почечные клетки-предшественников, в которые дифференцируются иПС-клетки.
4. Способ отбора клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественников, с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности, включающих комбинацию одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-), и двух маркеров положительного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+), или трех маркеров положительного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+),где почечные клетки-предшественники представляют собой почечные клетки-предшественников, в которые дифференцируются иПС-клетки.
5. Способ по п. 4, где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере четырех маркеров клеточной поверхности, включающих комбинацию одного маркера негативного отбора, выбранного из группы, состоящей из CD9(-), CD55(-) и CD326(-), и трех маркеров положительного отбора, выбранных из группы, состоящей из CD106(+), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) и CD271(+).
6. Способ отбора клеточной популяции из клеточной популяции, содержащей почечные клетки-предшественников, с использованием по меньшей мере двух маркеров клеточной поверхности, выбранных из группы, состоящей из CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+), где почечные клетки-предшественники представляют собой почечные клетки-предшественников, в которые дифференцируются иПС-клетки.
7. Способ по п. 6, где отбор клеточной популяции осуществляют с использованием по меньшей мере трех маркеров клеточной поверхности.
8. Способ по п. 6, где CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) и CD271(+) используются в качестве маркеров клеточной поверхности.
9. Способ по любому из пп. 3-8, где иПС-клетками являются человеческие иПС-клетки.
RU2018112687A 2015-09-11 2016-09-09 Способ продуцирования почечных клеток-предшественников RU2730861C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-179104 2015-09-11
JP2015179104 2015-09-11
PCT/JP2016/077353 WO2017043666A1 (ja) 2015-09-11 2016-09-09 腎前駆細胞を製造する方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018112687A3 RU2018112687A3 (ru) 2019-10-11
RU2018112687A RU2018112687A (ru) 2019-10-11
RU2730861C2 true RU2730861C2 (ru) 2020-08-26

Family

ID=58240847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018112687A RU2730861C2 (ru) 2015-09-11 2016-09-09 Способ продуцирования почечных клеток-предшественников

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10731133B2 (ru)
EP (1) EP3348632B1 (ru)
JP (1) JP6830893B2 (ru)
KR (1) KR20180042391A (ru)
CN (1) CN108138136B (ru)
AU (1) AU2016321015B2 (ru)
CA (1) CA2998096C (ru)
ES (1) ES2897974T3 (ru)
IL (1) IL257974B (ru)
MX (1) MX2018003036A (ru)
RU (1) RU2730861C2 (ru)
SG (1) SG11201801970XA (ru)
TW (1) TWI746459B (ru)
WO (1) WO2017043666A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2802345C1 (ru) * 2022-12-28 2023-08-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) Способ культивирования клеточной линии проксимальных почечных канальцев RPTEC/TERT1

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018013932A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
KR102594102B1 (ko) 2017-05-25 2023-10-25 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법
WO2020022261A1 (ja) 2018-07-23 2020-01-30 国立大学法人京都大学 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法
CN110684855B (zh) * 2019-10-21 2021-08-03 华中农业大学 一种米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN116802276A (zh) 2021-01-08 2023-09-22 国立大学法人京都大学 用于扩增培养肾元祖细胞的培养基、扩增培养肾元祖细胞的方法以及肾脏类器官的制造方法
CN113201560B (zh) * 2021-05-06 2023-05-30 北京起源爱心生物科技有限公司 一种修复型多能肾前体干细胞库的建立方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2327487C2 (ru) * 2002-08-08 2008-06-27 Бейлор Колледж Оф Медисин Выделение и идентификация т-клеток
WO2015014731A1 (en) * 2013-07-29 2015-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for differentiation of pluripotent stem cells into multi-competent renal precursors

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
EP2206724A1 (en) 2005-12-13 2010-07-14 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
CA2741420C (en) * 2008-10-24 2016-08-16 Childrens Hospital Los Angeles Amniotic fluid cells and uses thereof
WO2010097794A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Methods of reprogramming renal cells
WO2012011610A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Kyoto University Method for inducing differentiation of human pluripotent stem cell into intermediate mesoderm cell
DK2729562T3 (en) 2011-07-06 2018-07-23 Cell Therapy Ltd Progenitor cells of mesodermal origin
JP6450311B2 (ja) 2013-06-11 2019-01-09 国立大学法人京都大学 腎前駆細胞の製造方法及び腎前駆細胞を含む医薬
ITFI20130303A1 (it) * 2013-12-24 2015-06-25 Azienda Ospedaliero Universitaria M Eyer Metodica per l¿isolamento, purificazione ed amplificazione di progenitori renali cd133+cd24+ dalle urine di pazienti affetti da malattie renali.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2327487C2 (ru) * 2002-08-08 2008-06-27 Бейлор Колледж Оф Медисин Выделение и идентификация т-клеток
WO2015014731A1 (en) * 2013-07-29 2015-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for differentiation of pluripotent stem cells into multi-competent renal precursors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOYOHARA T., et al. "Cell Therapy using Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Renal Progenitors Ameliorates Acute kidney Injury in Mice", Stem Cells Translational Medicine. 2015; 4:980-992. ANGELOTTI M.L., et al. "Characterization of Renal Progenitors Comitted Toward Tubular Lineage and Their Regenerative Potential in Renal Tubular Injury", *
TOYOHARA T., et al. "Cell Therapy using Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Renal Progenitors Ameliorates Acute kidney Injury in Mice", Stem Cells Translational Medicine. 2015; 4:980-992. ANGELOTTI M.L., et al. "Characterization of Renal Progenitors Comitted Toward Tubular Lineage and Their Regenerative Potential in Renal Tubular Injury", Stem Cells. 2012; 30:1714-1725. SALLUSTIO F., et al. "Human renal stem/progenitor cells repair tubular epithelial cell injury through TRL2-driven inhibin-A and microvesicle-shuttled decorin", Kidney International. 2013; 83:392-403. DE CUNHA M.G.M.C.M., et al. "Amniotic Fluid Derived Stem Cells with a Renal Progenitor Phenotype Inhibit Interstitial Fibrosis in Renal Ischemia and reperfusion Injury in Rats", PLoS ONE. 2015; 10(8):e0136145. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2802345C1 (ru) * 2022-12-28 2023-08-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) Способ культивирования клеточной линии проксимальных почечных канальцев RPTEC/TERT1

Also Published As

Publication number Publication date
RU2018112687A3 (ru) 2019-10-11
CA2998096C (en) 2024-01-30
US10731133B2 (en) 2020-08-04
JP6830893B2 (ja) 2021-02-17
CN108138136A (zh) 2018-06-08
EP3348632B1 (en) 2021-11-03
AU2016321015A1 (en) 2018-04-05
ES2897974T3 (es) 2022-03-03
SG11201801970XA (en) 2018-04-27
IL257974B (en) 2022-07-01
KR20180042391A (ko) 2018-04-25
RU2018112687A (ru) 2019-10-11
TW201723173A (zh) 2017-07-01
MX2018003036A (es) 2018-05-02
JPWO2017043666A1 (ja) 2018-06-28
TWI746459B (zh) 2021-11-21
CN108138136B (zh) 2022-02-11
AU2016321015B2 (en) 2021-09-30
IL257974A (en) 2018-05-31
WO2017043666A1 (ja) 2017-03-16
EP3348632A4 (en) 2019-05-01
US20200407692A1 (en) 2020-12-31
US20180273905A1 (en) 2018-09-27
EP3348632A1 (en) 2018-07-18
US11746332B2 (en) 2023-09-05
CA2998096A1 (en) 2017-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2730861C2 (ru) Способ продуцирования почечных клеток-предшественников
US20240043811A1 (en) Method of producing a mesodermal-lineage primitive streak cell
KR102675213B1 (ko) 망막 색소 표피 세포의 제조 방법
EP2582795A1 (en) Method for selecting human induced pluripotent stem cells
US20210332329A1 (en) Novel renal progenitor cell marker and method for concentrating renal progenitor cells using same
WO2019107485A1 (ja) 細胞の培養方法
WO2021025027A1 (ja) 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法
EP3985104A1 (en) Method for producing renal interstitial cell
TW202345878A (zh) 控制性ｔ細胞之製造方法
JP2013223446A (ja) 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法
WO2024071375A1 (ja) ヒトアストロサイト細胞集団、細胞集団培養物、ヒトアストロサイト細胞集団の製造方法、および被験物質の評価方法
WO2024029617A1 (ja) 心筋の製造方法