ES2897974T3 - Método para producir células progenitoras renales - Google Patents

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Abstract

Un método para producir células progenitoras renales en el que se induce la diferenciación de células madre pluripotentes, comprendiendo el método las etapas de: (i) cultivar las células madre pluripotentes en condiciones que inducen la diferenciación en células progenitoras renales; y (ii) clasificar una población de células a partir de las células obtenidas en la etapa (i) mediante el uso de al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+).

Description

DESCRIPCIÓN
Método para producir células progenitoras renales
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para la producción de células progenitoras renales (CPR) utilizando al menos dos marcadores de superficie celular específicos destinados a adquirir y producir una población CPR de alta pureza a partir de una población de células que contiene CPR diferenciadas de células madre pluripotentes (CMP).
Antecedentes de la técnica
El riñón es un importante órgano que funciona para mantener una buena salud física a través de la filtración y eliminación de sustancias tóxicas y productos de desecho generados por la actividad metabólica en el organismo desde la sangre. La insuficiencia renal es una enfermedad grave que altera la función del riñón, pero dado que todavía no se ha establecido una terapia farmacológica eficaz para esta enfermedad, esta enfermedad se trata actualmente mediante trasplante renal, diálisis o similares. Sin embargo, el trasplante renal se enfrenta al problema de la grave falta de órganos de donantes, y la diálisis también adolece del problema de la aparición de complicaciones y una gran carga de costes médicos; por tanto, es deseable desarrollar una nueva terapia para esta enfermedad.
Por otra parte, ha habido ya informes sobre células pluripotentes, tales como células madre embrionarias (CME) y células madre pluripotentes inducidas (CMPi) obtenidas introduciendo un factor(es) de reprogramación en células somáticas (LPT 1 y 2). En este momento, se están realizando varios estudios para desarrollar una nueva terapia para insuficiencia renal que implica el trasplante de células renales obtenidas induciendo la diferenciación de dichas CMP. Otro punto de atención se ha puesto en el desarrollo de un fármaco terapéutico para la insuficiencia renal utilizando células renales homogéneas derivadas de dichas CMP.
Se sabe que los riñones de los mamíferos se desarrollan a lo largo de las tres etapas de pronefros, mesonefros y metanefros, y que dentro de ellas, metanefros se desarrolla en la región posterior del mesodermo intermedio. En investigaciones anteriores, se ha estudiado un método para inducir la diferenciación de CMP de ratón en mesodermo intermedio (NPL 1) y se ha identificado el factor de transcripción relacionado con saltos impares 1 (OSR1) como un marcador característico del mesodermo intermedio. Además, se conoce SIX Homeobox 2 (SIX2) como uno de los factores que caracterizan las CPR (NPL 2 y 3). Como resultado del estudio con las CMPi humanas (células MPi humanas indicadoras OSR1-GFP) generadas introduciendo el gen de la proteína verde fluorescente (GFP por sus siglas en inglés) utilizando un vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC) por recombinación homóloga con el alelo OSR1 endógeno, se consiguió inducir con éxito la diferenciación de CMP humanas en mesodermo intermedio utilizando Activina A, proteína Wnt, proteína morfogenética ósea (PMO) y varios compuestos de bajo peso molecular (NPL 3, PTL 3). A continuación, como resultado del estudio con las líneas de células MPi humanas indicadoras OSR1-GFP y SIX2-tdTomato generadas introduciendo la proteína roja fluorescente, tdTomato, en loci SIX2 en las líneas de células MPi humanas indicadoras OSR1-GFP utilizando el mismo procedimiento de recombinación homóloga que el adoptado por Mae, et al. (NPL 3), se consiguió construir con éxito un sistema para inducir la diferenciación de CMP humanas en CPR, y se confirmó la eficacia terapéutica de una terapia con las CPR así obtenidas en modelos de lesión renal aguda (NPL 4, PTL 4).
El documento WO 2015/014731 A1 divulga un método para la diferenciación de células madre pluripotentes en células precursoras renales multicompetentes que expresan Six2.
M. L. Angelotti et al., "Characterization of Renal Progenitors Committed Toward Tubular Lineage and Their Regenerative Potential in Renal Tubular Injury", Stem Cells, vol. 30, no. 8, 1 de agosto de 2012, p. 1714-1725, divulga el marcador CD106 (además de CD133 y CD24) en subpoblaciones de células progenitoras renales.
F. Sallustio et al., "Human renal stem/progenitor cells repair tubular epithelial cell injury through TLR2-driven inhibin-A and microvesicle-shuttled decorin", Kidney International, vol. 83, no. 3, 2013, p. 392-403 divulga CD106 presente en subpoblaciones de células progenitoras renales.
S. da Sacco et al., "Human Amniotic Fluid as a Potential New Source of Organ-Specific Precursor Cells for Future Regenerative Medicine Applications", The Journal of Urology, Vol. 183, 2010, p. 1193-1200 y el documento WO 2010/047824 A1 divulga CD140a en subpoblaciones de células progenitoras renales.
C. Velagapudi et al., "Reciprocal Induction of Simple Organogenesis by Mouse Kidney Progenitor Cells in ThreeDimensional Co-Culture", The American Journal of Pathology, vol. 180, no. 2, 1 de febrero de 2012, p. 819­ 830 y el documento JP 2014-520523 que corresponde al documento EP 2 729 562 A1 divulga CD140b en subpoblaciones de células progenitoras renales.
N. Shiraki et al., "Identification of DAF1/CD55, a Novel Definive Endoderm Marker", Cell Structure And Function, vol.
35, no. 2, p. 73-80 divulga CD55 en subpoblaciones de células progenitoras renales.
S. Metsuyanim et al., "Expression of Stem Cell Markers in the Human Fetal Kidney", PLOS ONE, Vol. 4, 2009, p. E6709 y el documento WO 2010/097793 A2 divulga CD326 (EpCAM) en subpoblaciones de células progenitoras renales.
Listado de citas
Bibliografía de patentes
PTL 1: US 5.843.780
PTL 2: WO 2007/069666
PTL 3: WO 2012/011610
PTL 4: WO 2014/200115
Bibliografía no de patentes
NPL 1: Mae S, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (2010), 393:877-882
NPL 2: Kobayashi A, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3:169-181
NPL 3: Mae S, et al., Nat. Commun., (2013), 4:1367
NPL 4: Toyohara T, et al., Stem Cells Transl. Med., (2015), 4:980-992
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención reside en proporcionar un método para adquirir y producir una población CPR de alta pureza a partir de una población CPR en la que se induce la diferenciación de CMP, identificando al menos dos marcadores de superficie celular específico para CPR.
Solución al problema
Los autores de la presente invención han realizado un exhaustivo estudio para conseguir el objeto antes mencionado y, como resultado, han encontrado en primer lugar que se puede adquirir y producir una población CPR de alta pureza a partir de una población de células que contiene CPR utilizando al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados entre CD9 negativo (CD9(-)), CD140a positivo (CD140a(+)), CD140b positivo (CD140b(+)) y CD271 positivo (CD271(+)). La presente invención se ha completado sobre la base de este hallazgo.
Más específicamente, La presente invención tiene las características definidas en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
Efectos ventajosos de la invención
De acuerdo con la presente invención, se ha hecho posible por primera vez adquirir y producir una población CPR de alta pureza a partir de una población CPR en la que se induce la diferenciación de CMP (por ejemplo, CMPi), mediante el uso de al menos dos marcadores de superficie celular específicos. La población de c Pr adquirida a través del método de la presente invención puede utilizarse en medicina regenerativa para enfermedades renales tales como insuficiencia renal.
Breve descripción de los dibujos
[FIG. 1] La FIG. 1 muestra un conjunto de diagramas de dispersión bidimensionales de las mediciones de citometría de flujo de la expresión de CD9, CD55 (no de acuerdo con la invención), CD106 (no de acuerdo con la invención), CD 140a, CD 140b, CD 165 (no de acuerdo con la invención), CD271 y CD326 (no de acuerdo con la invención) frente a OSR1 y SIX2. El eje y- representa la intensidad de fluorescencia de un anticuerpo contra cada uno de los diferentes marcadores de superficie celular, y el eje x- representa la intensidad de fluorescencia de un indicador de fluorescencia representativo de la expresión de la proteína OSR1 o SIX2.
[FIG. 2] La FIG. 2 muestra los resultados de la clasificación de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) de grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih, tal como se llevó a cabo en el Ejemplo 2. La FIG. 2A muestra un conjunto de citogramas de flujo para grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih teñidas con CD9, CD140a, CD140b y CD271. Los ejes y- y x- representan las intensidades de fluorescencia de anticuerpos frente a diferentes marcadores de superficie celular. P6 representa la presencia de una población de células CD9(-)CD140a(+); P4 representa la presencia de una población de células CD9(-)CD140b(+); y P3 representa la presencia de una población de células CD9(-)CD271(+). Se fraccionó la población de células P3+P4+P6 representada en la FIG. 2A. La FIG. 2B muestra un conjunto de diagramas de dispersión bidimensionales de las mediciones de citometría de flujo de la expresión de OSR1 y SIX2 en CMPih antes de la inducción de diferenciación, en grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih, y en la población de células P3+P4+P6 clasificadas a partir de los grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih, respectivamente, en orden de paneles de izquierda a derecha. Los ejes y- y x- representan las intensidades de fluorescencia de los indicadores de fluorescencia representativos de la expresión de la proteína OSR1 o SIX2. Los valores porcentuales mostrados representan los porcentajes de células doble positivo OSR1/SIX2 (células OSR1(+)SIX2(+); fracción superior derecha), células OSR1 positivo, SIX2 negativo (células OSR1(+)SIX2(-); fracción superior izquierda), células OSR1 negativo, SIX2 positivo (células OSR1(-)SIX2(+); fracción inferior derecha) y células OSR1/SIX2 doble negativo células (OSR1(-)SIX2(-); fracción inferior izquierda).
[FIG. 3] La FIG. 3 muestra un ejemplo de las estructuras de tipo túbulo renal proximal preparadas en el Ejemplo 3 a partir de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) fraccionadas desde grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih. La FIG. 3A ilustra el procedimiento de diferenciación en túbulo renal proximal, en el que se forman agregados de células y se cocultivan con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4 de acuerdo con el mismo procedimiento que el divulgado en NPL 4. Se formaron agregados de células compuestos de 1 * 105 células usando un medio acondicionado con células de la yema ureteral (UBC por sus siglas en inglés) de ratón suplementado con PMO7 y el inhibidor de Rho-quinasa Y-27632 (Wako; Cat. No. 253-00513). Al día siguiente, se reemplazó el medio de cultivo con un medio acondicionado con UBC de ratón suplementado con PMO7, Y-27632 y el inhibidor BIO de GSK-3p (Wako; Cat. No. 029-16241), y se siguió cultivando las células durante un día y, a continuación, se cocultivaron sobre fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4 tratados con mitomicina C para inducir la diferenciación de las células en túbulo renal proximal. La FIG. 3B muestra una imagen microscópica (panel superior izquierdo) de agregados de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) después del cocultivo con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4, por inmunotinción de imágenes (paneles superior derecho e inferior izquierdo) de dichos agregados de células y una imagen fusionada de estas imágenes (panel inferior derecho). Asimismo, se muestran las células que expresan Lectina de Lotus Tetragonolobus (LTL) en vistas en aumento, indicadas por flechas. En estos paneles, LTL es un marcador de túbulo renal proximal, Hoechst33342 es un colorante de tinción nuclear celular y la barra de escala representa 100 pm.
[FIG. 4] La FIG. 4 muestra los porcentajes de células OSR1(+)SIX2(+), células OSR1(+)SIX2(-), células OSR1(-)SIX2(+) y células OSR1(-)SIX2(-) en poblaciones de células clasificadas en Ejemplo 4 según todas las combinaciones exhaustivas del marcador de selección negativo CD9 con tres de los marcadores de selección positivos cualquiera. Esta figura también muestra los porcentajes de células OSR1(+)SIX2(+), células OSR1(+)SIX2(-), células OSR1(-)SIX2(+) y células OSR1(-)SIX2(-) en poblaciones de células clasificadas según otras combinaciones de marcadores en las que se utilizó el marcador de selección negativo CD55 (no de acuerdo con la invención) o CD326 (no de acuerdo con la invención) en lugar de CD9.
[FIG. 5] La FIG. 5 muestra los siguientes porcentajes de células: el porcentaje de células OSR1(+)SIX2(+) en poblaciones de células recogidas en el Ejemplo 5 de una población de células sin clasificar utilizando cualquier combinación de los marcadores de superficie celular CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+); el porcentaje de células delimitadas por cada una de las diferentes combinaciones de marcadores de células en la población de células sin clasificar; y el porcentaje del número de células OSR1(+)SIX2(+) recogidas usando cada una de las diferentes combinaciones de marcadores de superficie con respecto al número de células sin clasificar.
[FIG. 6] La FIG. 6 muestra los resultados de la inducción de diferenciación de una población de células clasificadas a partir de una población de células diferenciadas derivada de la línea CMPih 201B7 utilizando CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) como indicador en estructuras de tipo túbulo renal proximal en el Ejemplo 6. La FIG. 6A muestra un conjunto de histogramas del número de células en función de la intensidad de fluorescencia de cada uno de OSR1 (detectado mediante GFP), SIX2 (detectado por tdTomato) y los diferentes marcadores de superficie celular. La FIG. 6B muestra un conjunto de diagramas de dispersión de las mediciones de citometría de flujo de la expresión de CD9 frente a CD140a, CD140b o CD271 en una población de células diferenciadas derivadas de la línea de CMPih 201B7. Los ejes y- y x- representan las intensidades de fluorescencia de anticuerpos frente a diferentes marcadores de superficie celular. Se fraccionaron células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) clasificando las fracciones de la ventana de análisis (P4+P2+P3). La FIG. 6C muestra una imagen fusionada de las imágenes microscópicas y de inmunotinción de agregados de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+) CD271(+) clasificadas después del cocultivo con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4. En este panel, LTL es un marcador de túbulo renal proximal (recuadro) y la barra de escala representa 100 pm.
[FIG. 7] La FIG. 7 muestra los resultados de la inmunotinción de una población de células diferenciadas derivadas de la línea CMPi 201B7 con anticuerpos anti-SIX2 tal como se llevó a cabo en el Ejemplo 7. La FIG.
7A muestra un conjunto de imágenes de inmunotinción de una población de células sin clasificar, y la FIG. 7B muestra un conjunto de imágenes de inmunotinción de una población de células clasificadas usando CD9(-)CD140a(+)CD140b(+) CD271(+) como indicador. En estos paneles, las flechas blancas representan células SIX2 positivas y las flechas de contorno blanco representan células SIX2 negativas. La barra de escala representa 100 pm. Tanto en la FIG. 7A como en la f Ig .7B, el panel izquierdo muestra una imagen de campo de luz, el panel central muestra una imagen de tinción de anticuerpos anti-SIX2 y el panel derecho muestra una imagen de tinción nuclear Hoechst33342.
Descripción de las realizaciones
A continuación, se describirá con detalle la presente invención.
La presente invención proporciona un método para adquirir y producir una población CPR de alta pureza a partir de una población CPR en la que se induce la diferenciación de CMP, mediante el uso de al menos dos marcadores de superficie celular específicos. Específicamente, la presente invención incluye el siguiente método (en lo sucesivo también denominado "el método de producción de la presente (esta) invención"):
"Un método para producir células progenitoras renales en el que se induce la diferenciación de células madre pluripotentes, comprendiendo el método las etapas de:
(i) cultivar las células madre pluripotentes en condiciones que inducen la diferenciación en células progenitoras renales; y
(ii) clasificar una población de células a partir de las células obtenidas en la etapa (i), utilizando al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+)".
La presente invención incluye una población de células progenitoras renales producida a través del método de producción de la presente invención.
La presente invención proporciona también un uso de al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+) para clasificar una población de células a partir de una población de células que contiene células progenitoras renales.
A continuación se proporcionan descripciones de la presente invención.
1. Etapa (i) de cultivar CMP en condiciones que inducen la diferenciación en una población de CPR:
El procedimiento para inducir la diferenciación de CMP en una población de CPR, que se puede aplicar en esta etapa, puede ser cualquier procedimiento, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los divulgados en NPL 4 y PTL 4. En la etapa (i), únicamente es necesario obtener una población de células que contenga CPR, ya que las CPR pueden concentrarse mediante la clasificación posterior en la etapa (ii). El porcentaje de contenido de CPR en la población de células obtenida en la etapa (i) no es de particular importancia y es, por ejemplo, no menos del 5 %, no menos del 10 %, no menos del 15 %, no menos del 20 %, menos del 25 % o menos del 30 %.
En la presente invención, las CPR se producen como una población de células de RPC concentradas. El porcentaje de contenido de CPR en la población de células producida no está particularmente limitado y es, por ejemplo, no menos del 50 %, no menos del 60 %, no menos del 65 %, no menos del 70 %, no menos del 71 %, no menos del 72 %, no menos del 73 %, menos del 74 % o menos del 75 %. Por consiguiente, tal como se hace referencia a ello en esta invención, "clasificación" significa obtener una población de células que contiene las células deseadas en una concentración de no menos del 50 %, no menos del 60 %, no menos del 65 %, no menos del 70 %, no menos del 71 %, no menos del 72 %, no menos del 73 %, menos del 74 % o menos del 75 %.
Tal como se hace referencia a ello en la presente invención, las "células progenitoras renales (CPR)" se refieren a células que se transforman parcialmente en túbulo renal y células OSR1/SIX2 doble positivo (OSR1(+) SIX2(+)). Como ejemplo, OSR1 es una proteína codificada por el gen OSR1 humano (No. de acceso NCBI NM_145260.2), y SIX2 es una proteína codificada por el gen SIX2 humano (No. de acceso NCBI NM_016932.4). "OSR1 positivo (OSR1(+))" significa que la actividad de transcripción de OSR1 es alta y, más específicamente, significa, por ejemplo, que el ARNm de OSR1 puede detectarse a través de un método conocido, que la proteína OSR1 puede detectarse a través de un método conocido (Ejemplos 1, 2 y 4-6) o que se puede observar la expresión de un gen marcador funcionalmente ligado al promotor OSR1. Análogamente, "SIX2 positivo (SIX2(+))" significa que la actividad de transcripción de SIX2 es alta, y más específicamente significa, por ejemplo, que el ARNm de SIX2 puede detectarse a través de un método conocido, que la proteína SIX2 puede detectarse a través de un método conocido (Ejemplos 1, 2 y 4-6) o que se puede observar la expresión de un gen marcador funcionalmente ligado al promotor SIX2. Tal como se hace referencia a ello en esta invención, el "gen marcador" se refiere, por ejemplo, pero no se limita a, un gen que codifica una proteína fluorescente.
Tal como se hace referencia a ello en la presente invención, "células madre pluripotentes (CMP)" se refiere a células madre que no solo tienen pluripotencia, que es la capacidad de diferenciarse en muchos tipos de células con diferentes propiedades y morfologías tal como se encuentran en los organismos vivos, sino que también tienen capacidad proliferativa, y este término incluye cualquier tipo de células que puedan inducirse en CPR. Los ejemplos de CMP incluyen, pero no se limitan particularmente a,, células madre embrionarias no humanas (CME), células madre embrionarias de transferencia nuclear no humanas CMEtn), que se producen mediante el uso de una técnica de transferencia nuclear, células madre de línea germinal (CMG), células germinales embrionarias no humanas (CGE), células madre pluripotentes inducidas (CMPi) y células pluripotentes derivadas de fibroblastos cultivados o células madre mieloides (células que soportan estrés de la diferenciación de múltiples linajes; Células Muse). Las CMP preferentes son las CMPi, más preferentemente las CMPi humanas, desde el punto de vista de que dichas células pueden adquirirse sin destruir el embrión, el óvulo o similares durante el proceso de producción celular. Los métodos para producir CMPi son ya conocidos en la técnica, y las CMPi se pueden producir introduciendo un factor(es) de reprogramación en cualquier tipo de células somáticas. Tal como se hace referencia a ello en el presente documento, el "factor(es) de reprogramación" se refiere a un gen(es) o producto(s) génico(s), tales como Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenina, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 o Glis1. Dichos factores de reprogramación se pueden utilizar solos o en combinación. Entre los ejemplos de combinaciones de factores de reprogramación se incluyen las combinaciones divulgadas en cada uno de los documentos de la bibliografía: WO 2007/069666; WO 2008/118820; WO 2009/007852;
WO 2009/032194; WO 2009/058413; WO 2009/057831; WO 2009/075119;
WO 2009/079007; WO 2009/091659; WO 2009/101084; WO 2009/101407;
WO 2009/102983; WO 2009/114949; WO 2009/117439; WO 2009/126250;
WO 2009/126251; WO 2009/126655; WO 2009/157593; WO 2010/009015;
WO 2010/033906; WO 2010/033920; WO 2010/042800; WO 2010/050626;
WO 2010/056831; WO 2010/068955; WO 2010/098419; WO 2010/102267;
WO 2010/111409; WO 2010/111422; WO 2010/115050; WO 2010/124290;
WO 2010/147395; WO 2010/147612; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26: 795-797; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 2: 525-528; Eminli S, et al., Stem Cells, (2008), 26:2467-2474; Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., (2008), 26:1269-1275; Shi Y, et al., Cell Stem Cell, (2008), 3: 568-574; Zhao Y, et al., Cell Stem Cell, (2008) , 3:475-479; Marson A, Cell Stem Cell, (2008), 3: 132-135; Feng B, et al., Nat. Cell Biol., (2009), 11:197-203; R. L. Judson et al., Nat. Biotechnol., (2009), 27:459-461; Lyssiotis C.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., (2009) , 106:8912-8917; Kim J.B., et al., Nature, (2009), 461:649-643; Ichida J.K., et al., Cell Stem Cell, (2009), 5:491-503; Heng J.C., et al., Cell Stem Cell, (2010), 6:167-174; Han J, et al., Nature, (2010), 463:1096-1100; Mali P, et al., Stem Cells, (2010), 28:713-720; y Maekawa M, et al., Nature, (2011), 474: 225-229.
Los ejemplos no exhaustivos de células somáticas incluyen no solo todos los tipos de células somáticas de neonatos y de individuos sanos o afectados, sino también todos los tipos de células cultivadas primarias, células de pasaje y células establecidas derivadas de las células somáticas antes mencionadas. Los ejemplos específicos de células somáticas incluyen: (1) células madre de tejido (células madre somáticas), tales como células madre neuronales, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales y células madre de pulpa dental; (2) células progenitoras de tejido; y (3) células diferenciadas que se encuentran en órganos y tejidos, tales como células sanguíneas (p. ej., células de la sangre periférica, células sanguíneas de la médula), células musculares, células de la piel, células del cabello, células hepáticas, células de la mucosa gástrica, células intestinales, células esplénicas, células pancreáticas, células cerebrales, células pulmonares, células renales y células grasas.
Cuando se utilizan CMPi como material para células de trasplante, es deseable utilizar células somáticas que tengan el mismo, o sustancialmente el mismo genotipo de antígeno leucocitario humano (HLA, por sus siglas en inglés) que el receptor del trasplante, desde el punto de vista de que no pueda tener lugar ningún episodio de rechazo al trasplante. Tal como se hace referencia a ello en el presente documento, la expresión "sustancialmente el mismo" en relación con el genotipo del antígeno leucocitario humano (HLA) significa que las células somáticas tienen un apareamiento del genotipo HLA hasta el punto de suprimirse la respuesta inmune a las células trasplantadas con un inmunosupresor. Ejemplos de dichas células somáticas incluyen aquellas células con el mismo tipo de HLA en los tres loci diferentes de HlA-A, HLA-B y HLA-DR, o en los cuatro loci diferentes de HLA-A, HLA-B, HLA-DR y HLA-C.
En una realización, la etapa (i) se lleva a cabo aplicando el procedimiento para inducir la diferenciación de las CMP en una población CPR tal como se divulga en NPL 4 y PTL 4. Específicamente, la etapa (i) implica las siguientes etapas (i-1 ) a (i-3):
(i-1) cultivar CMP en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre Activina A, inhibidores de GSK-3p y derivados del ácido retinoico;
(i-2) cultivar una población de células obtenida en la etapa (i-1) en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre PMO7, inhibidores de GSK-3p y derivados del ácido retinoico; y (i-3) cultivar una población de células obtenida en la etapa (i-2), en un medio de cultivo suplementado con un estimulador de señal de TGFp y un inhibidor de PMO.
A continuación, se proporcionan descripciones de las etapas (i-1) a (i-3).
Etapa (i-1) de cultivar CMP en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre Activina A, inhibidores de GSK-3p y derivados de ácido retinoico:
En esta etapa, se pueden disociar las CMP a través de cualquier procedimiento conocido en la técnica y cultivarse por cultivo en suspensión o cultivo de adhesión. Los ejemplos de procedimientos de disociación de CMP incluyen disociación mecánica y disociación mediante el uso de una solución de disociación con actividades proteolíticas y colagenolíticas (p. ej., Accutase® y Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)) o una solución de disociación con actividad colagenolítica solamente. Es preferente un procedimiento en el que se disocian las CMP mediante el uso de una solución de disociación con actividades proteolíticas y colagenolíticas y se dispersan finamente mecánicamente en células individuales. Las CMP humanas que se utilizan preferentemente en esta etapa son colonias de CMP cultivadas hasta un 80 % de confluencia por placa de cultivo utilizada.
El cultivo en suspensión para su uso en el método de la presente invención se refiere al cultivo de células cuando no se adhieren a una placa de cultivo. El cultivo en suspensión puede llevarse a cabo, pero no está particularmente limitado a ello, utilizando un vaso que no haya sido tratado artificialmente (p. ej., con revestimiento de matriz extracelular) para potenciar la adhesión a las células, o un vaso tratado artificialmente (p. ej., con revestimiento de poli(metacrilato de hidroxietilo) (poli-HEMA) para evitar la adhesión.
El cultivo de adhesión para su uso en el método de la presente invención se refiere al cultivo de células cuando están adheridas a una placa de cultivo. El cultivo de adhesión también se puede llevar a cabo, pero no se limita particularmente a ello, en una placa de cultivo revestida. Los ejemplos de agentes de revestimiento incluyen matrigel (BD Biosciences), Synthemax® (Corning), colágeno, gelatina, laminina, proteoglicanos de heparán sulfato o entactina, y combinaciones de los mismos, siendo preferente matrigel, Synthemax® o gelatina.
El medio de cultivo que se utilice en la etapa (i-1) se puede preparar añadiendo al menos una sustancia seleccionada entre Activina A, inhibidores de GSK-3p y derivados del ácido retinoico a un medio basal para su uso en el cultivo de células animales. En una realización, las sustancias usadas en esta etapa son una combinación de Activina A y un inhibidor de GSK-3p o una combinación de un inhibidor de GSK-3p y un derivado de ácido retinoico. Los ejemplos del medio basal incluyen medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), medio 199, medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), medio esencial mínimo de Eagle alfa modificado (aMEM), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio F12 de Ham (F12), Medio RPMI 1640, medio de Fischer y medios mixtos de los mismos. El medio de cultivo se puede suplementar con suero (p.ej., suero bovino fetal (FBS)) o puede estar exento de suero. Dependiendo de la necesidad, el medio de cultivo puede ser reemplazado por al menos una alternativa de suero como albúmina, reemplazo de suero inactivado (KSR) (Invitrogen), suplemento de N2 (Invitrogen) y/o suplemento de B27 (Invitrogen), o también puede ser suplementado con al menos una sustancia como transferrina, ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiol glicerol, lípidos, aminoácidos, L-glutamina, GlutaMAX (Invitrogen), aminoácidos no esenciales (NEAA), vitaminas, factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones y/o sales inorgánicas. En una realización de esta etapa, el medio basal es un medio mixto DMEM/F12 (1:1) suplementado con GlutaMAX, suero y un antibiótico.
Entre los ejemplos de Activina A que se pueden utilizar en la etapa (i-1) se incluyen proteínas de Activina A derivadas de seres humanos y otros animales y variantes funcionales de las mismas, como por ejemplo productos de Activina A disponibles en el mercado por R&D Systems y otros fabricantes. La concentración de Activina A utilizada en esta etapa está en el intervalo de 1 ng/ml a 1000 ng/ml, preferentemente de 10 ng/ml a 500 ng/ml, más preferentemente de 50 ng/ml a 200 ng/ml.
El inhibidor de GSK-3p para su uso en la etapa (i-1) no está particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de inhibir las funciones de GSK-3p tales como la actividad quinasa. Los ejemplos de inhibidores de GSK-3p incluyen: el derivado de indirrubina BIO (también denominado inhibidor IX de GSK-3p; 6-bromoindirrubina-3'-oxima); el derivado de maleimida SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il) -1H-pirrol-2,5-diona); el Inhibidor VII de GSK-3p compuesto de fenil a-bromometil cetona (2,4'-dibromoacetofenona); el péptido de fosforilación permeable a la membrana celular L803-mts (también denominado inhibidor del péptido GSK-3p; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH 2(SEQ ID NO: 15)); y el inhibidor de GSK altamente selectivo CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5- (5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridincarbonitrilo) (Nature (2008), 453: 519-523). Los compuestos enumerados anteriormente están disponibles en Stemgent, Calbiochem, Biomol y otros fabricantes, o pueden prepararse por cuenta propia. Un ejemplo preferente del inhibidor de GSK-3p que se utilizará en esta etapa es CHIR99021. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del inhibidor de GSK-3p utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de inhibidor de GSK-3p que se utilice. Por ejemplo, cuando se usa CHIR99021 como inhibidor de GSK-3p, la concentración de este inhibidor está en el intervalo de 0,01 pm a 100 |jm, preferentemente de 0,1 pm a 10 pm, más preferentemente de 1 pm a 3 pm.
El derivado de ácido retinoico que se utiliza en la etapa (i-1) es un ácido retinoico opcionalmente modificado artificialmente que mantiene las funciones de origen natural ácido retinoico. Los ejemplos de derivados de ácido retinoico incluyen compuestos retinoides y compuestos de vitamina A. Ejemplos de compuestos retinoides incluyen ácidos retinoicos, ácido 3-deshidroretinoico, ácido 4-[[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carbonil]amino]-benzoico (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev., (1990), 32: 17-26), ácido 4-[(1 E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propen-1-il] benzoico (TTNPB) (Strickland S, et al., Cancer Res., (1983), 43: 5268-5272 ), los compuestos retinoides divulgados en Takenaga, K. et al., Cancer Res., (1980), 40: 914­ 919, palmitato de retinol, retinol, retinal, 3-dehidroretinol y 3-dehidroretinal. Los compuestos de ácido retinoico se refieren a compuestos retinoides que tienen un grupo carboxilo, como, por ejemplo, ácidos retinoicos, ácido 3-deshidroretinoico, AM580 y TTNPB. En una realización de esta etapa, el derivado del ácido retinoico es un compuesto retinoide o un compuesto de vitamina A. En otra realización de esta etapa, el derivado de ácido retinoico es un compuesto de ácido retinoico. En otra realización más de esta etapa, el derivado del ácido retinoico es un compuesto de vitamina A. Un ejemplo preferente del derivado de ácido retinoico para su uso en esta etapa es AM580 o TTNPB. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del derivado de ácido retinoico utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de derivado de ácido retinoico que se utilice. Por ejemplo, cuando se utilice AM580 o TTNPB como derivado de ácido retinoico, la concentración de este derivado está en el intervalo de 0,01 |jm a 100 |jm, preferentemente de 0,1 |jm a 10 |jm, más preferentemente de 0,5 |jm a 2 |jm.
El medio de cultivo utilizado en la etapa (i-1) se puede suplementar adicionalmente con un inhibidor de ROCK. En particular, cuando esta etapa implica la dispersión de las CMP en células individuales, es preferente suplementar el medio de cultivo con un inhibidor de ROCK.
El tipo de un inhibidor de ROCK no está particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de inhibir las funciones de Rho-cinasa (ROCK). Ejemplos de inhibidores de ROCK incluyen Y-27632 (p. ej., Ishizaki et al., Mol. Pharmacol., (2000), 57, 976-983; Narumiya et al., Methods Enzymol., (2000), 325, 273-284), Fasudil/HA1077 (e.g., Uehata et al., Nature, (1997), 389: 990-994), H-1152 (p. ej., Sasaki et al., Pharmacol. Ther., (2002), 93: 225-232), Wf-536 (p. ej., Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., (2003), 52(4): 319-324) y derivados de los mismos, así como ácidos nucleicos no codificantes, ácidos nucleicos que desencadenan interferencias de ARN (p. ej., ARNip) y variantes dominantes negativas, que se dirigen a ROCK, y vectores de expresión de los mismos. También se pueden utilizar como inhibidores de ROCK otros compuestos de bajo peso molecular (a los que se hace referencia, p. ej., en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos Nos. US 2005/0209261, US 2005/0192304, US 2004/0014755, US 2004/0002508, US 2004/0002507, US 2003/0125344 y US 2003/0087919, y las publicaciones de patente internacional Nos. WO 2003/062227, WO 2003/059913, WO 2003/062225, WO 2002/076976 y WO 2004/039796). En la presente invención, se pueden usar uno o dos o más inhibidores de ROCK. Un ejemplo preferente del inhibidor de ROCK para su uso en esta etapa es Y-27632. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del inhibidor de ROCK utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de inhibidor de ROCK que se utilice. Por ejemplo, cuando se usa Y-27632 como inhibidor de ROCK, la concentración de este inhibidor está en el intervalo de 0,1 jim a 100 jim, preferentemente de 1 jim a 50 jim, más preferentemente de 5 jim a 20 jim.
El cultivo de células en la etapa (i-1) se realiza a una temperatura de cultivo, pero sin limitarse a, de aproximadamente 30 a 40 °C, preferentemente aproximadamente 37 °C, y en una atmósfera de aire que contiene CO2. La concentración de CO2 está en el intervalo de aproximadamente 2 a 5 %, preferentemente aproximadamente 5 %. El periodo de cultivo en esta etapa es por ejemplo no más de 2 días, preferentemente 2 días.
La etapa (i-2) de cultivar una población de células obtenida en la etapa (i-1), en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre PMO7, inhibidores de GSK-3p y derivados de ácido retinoico:
En esta etapa, la población de células cultivadas en suspensión obtenidas en la etapa (i-1) descrita anteriormente puede cultivarse por adhesión, tal como está, en un medio de cultivo dado en una placa de cultivo revestida, o se puede seguir cultivando la población de células cultivadas por adhesión obtenida en la etapa (i-1) reemplazando el medio de cultivo.
El medio de cultivo que se utilice en la etapa (i-2) se puede preparar añadiendo al menos una sustancia seleccionada entre PMO7, inhibidores de GSK-3p y derivados del ácido retinoico a un medio basal para su uso en el cultivo de células animales. En una realización, la(s) sustancia(s) utilizada(s) en esta etapa es (son) una combinación de PMO7 y un inhibidor de GSK-3p o un derivado de ácido retinoico. Ejemplos del medio basal incluyen IMDM, medio 199, EMEM, aMEM, DMEM, medio F12 de Ham, Medio RPMI 1640, medio de Fischer y medios mixtos de los mismos. El medio de cultivo se puede suplementar con suero (p.ej., suero FBS) puede estar exento de suero. Dependiendo de la necesidad, el medio de cultivo puede ser reemplazado por al menos una alternativa de suero como albúmina, KSR (Invitrogen), suplemento de N2 (Invitrogen) y/o suplemento de B27 (Invitrogen), o también puede ser suplementado con al menos una sustancia como transferrina, ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiol glicerol, lípidos, aminoácidos, L-glutamina, GlutaMAX (Invitrogen), aminoácidos no esenciales (NEAA), vitaminas, factores de crecimiento, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y equivalentes de los mismos. En una realización de esta etapa, el medio basal es un medio DMEM/F12 suplementado con GlutaMAX, KSR, NEAAs, 2-mercaptoetanol y un antibiótico.
En la etapa (i-2), por ejemplo, se puede cultivar la población de células obtenida en la etapa (i-1) en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre PMO7 e inhibidores de GSK-3p, y cultivarse después adicionalmente en un medio de cultivo suplementado con un derivado del ácido retinoico. Preferentemente, la etapa (i-2) implica cultivar la población de células obtenida en la etapa (i-1), en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre PMO7 e inhibidores de GSK-3p, y cultivar después adicionalmente la población de células en un medio de cultivo suplementado con un derivado de ácido retinoico y un estimulador de señal TGFp. En otras palabras, la etapa (i-2) se puede realizar adoptando las dos siguientes etapas por separado (i-2-a) y (i-2-b): (i-2-a) cultivar la población de células en un medio de cultivo suplementado con al menos una sustancia seleccionada entre PMO7 e inhibidores de GSK-3p; y (i-2-b) cultivar la población de células en un medio de cultivo suplementado con un derivado de ácido retinoico y un estimulador de señal de TGFp. Más preferentemente, la etapa (i-2) implica la etapa (i-2-a) de cultivar la población de células en un medio de cultivo suplementado con PMO7 y un inhibidor de GSK-3p, y la etapa (i-2-b) de cultivar la población de células en un medio de cultivo suplementado con un derivado de ácido retinoico y un estimulador de señal de TGFp.
Los ejemplos de PMO7 que se pueden utilizar en la etapa (i-2) incluyen PMO7 humano (número de acceso NCBI NM_001719.2) y proteínas PMO7 derivadas de otros animales, y variantes funcionales de las mismas (variantes que mantienen una capacidad de inducción de diferenciación), como, por ejemplo, los productos PMO7 disponibles comercialmente de Invitrogen, R&D Systems y otros fabricantes. La concentración de PMO7 utilizada en esta etapa está en el intervalo de 1 ng/ml a 1000 ng/ml, preferentemente de 10 ng/ml a 500 ng/ml, más preferentemente de 50 ng/ml a 200 ng/ml.
Los ejemplos del inhibidor de GSK-3p que se pueden usar en la etapa (i-2) incluyen los inhibidores mencionados anteriormente en relación con la etapa (i-1). Un ejemplo preferente del inhibidor de GSK-3p es CHIR99021. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del inhibidor de GSK-3p utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de inhibidor de GSK-3p que se utilice. Por ejemplo, cuando se usa CHIR99021 como inhibidor de GSK-3p, la concentración de este inhibidor está en el intervalo de 0,01 pm a 100 pm, preferentemente de 0,1 pm a 10 pm, más preferentemente de 1 pm a 3 pm.
Los ejemplos del derivado de ácido retinoico que se pueden usar en la etapa (i-2) incluyen los derivados mencionados anteriormente en relación con la etapa (i-1). Un ejemplo preferente del derivado de ácido retinoico es AM580 o TTNPB. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del derivado de ácido retinoico utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de derivado de ácido retinoico que se utilice. Por ejemplo, cuando se utilice AM580 o TTNPB como derivado de ácido retinoico, la concentración de este derivado está en el intervalo de 0,01 pm a 100 pm, preferentemente de 0,1 pm a 10 pm, más preferentemente de 0,5 pm a 2 pm.
El tipo de estimulador señal de TGFp que se utilice en la etapa (i-2) no está particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de activar la ruta de señalización TGFp. Los ejemplos de estimuladores de señal de TGFp incluyen proteínas tales como TGFp1, TGFp2 y TGFp3 (disponibles de Peprotech, R&D y otros fabricantes), y compuestos tales como IDE1 (ácido 1-[2-[(2-carboxifenil)metilen]hidrazida] heptanoico) e IDE2 (ácido 1-(2-ciclopentilidenhidrazida)-heptanodioico) (Borowiak M, et al., Cell Stem Cell, (2009), 4: 348-358). |De 1 e IDE2 disponibles de Stemgent, Tocris y otros fabricantes. Un ejemplo preferente de estimulador de señal de TGFp es TGFp1. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del estimulador de señal de TGFp usado en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de estimulador de señal de TGFp que se vaya a utilizar. Por ejemplo, Cuando se utiliza cualquiera de las proteínas TGFp1, TGFp2 y TGFp3 como estimulador de señal de TGFp, la concentración de este estimulador está en el intervalo de 0.1 ng/ml a 100 ng/ml, preferentemente de 1 ng/ml a 10 ng/ml, más preferentemente de 5 ng/ml a 10 ng/ml. Cuando se utiliza cualquiera de IDE1 e IDE2 como estimulador de señal de TGFp, la concentración de este estimulador está en el intervalo de 1 pm a 100 pm, preferentemente de 25 pm a 75 pm, más preferentemente de 40 pm a 60 pm.
El cultivo de células en la etapa (i-2) se realiza a una temperatura de cultivo, pero sin limitarse a, de aproximadamente 30 a 40 °C, preferentemente aproximadamente 37 °C, y en una atmósfera de aire que contiene CO2. La concentración de CO2 está en el intervalo de aproximadamente 2 a 5 %, preferentemente aproximadamente 5 %. El periodo de cultivo en esta etapa es por ejemplo no menos de 3 días, preferentemente, no menos de 3 días y no más de 12 días, más preferentemente no menos de 3 días y no más de 9 días. Durante esta etapa, es deseable reemplazar el medio de cultivo cada 3 días. Cuando la etapa (i-2) incluye las etapas (i-2-a) y (i-2-b), el período de cultivo total en la etapa (i-2) es como se ha descrito anteriormente, y más particularmente, el período de cultivo en la etapa (i-2-a) es, por ejemplo, no menos de 1 día, preferentemente, no menos de 2 días y no más de 11 días, más preferentemente no menos de 2 días y no más de 6 días, y el período de cultivo en la etapa (i-2-b) es, por ejemplo, no inferior a 1 día, preferentemente, no menos de 2 días y no más de 11 días, más preferentemente no menos de 3 días y no más de 6 días. Durante estas etapas, es deseable reemplazar el medio de cultivo cada 3 días.
Al adoptar las etapas (i-1) y (i-2) como se ha descrito anteriormente, Se puede inducir CMP en células mesodérmicas intermedias. OSR1 se conoce como un marcador que caracteriza células mesodérmicas intermedias. En una realización, una población de células inducida por las siguientes etapas (i-1) y (i-2) contiene un gran número de células mesodérmicas intermedias OSR1-positivo SIX2-negativo (OSR1(+) SIX2(-)), pero también puede contener células progenitoras renales OSR1/SIX2 doble positivo (OSR1(+) SIX2(+)). Por consiguiente, la etapa (i) puede completarse adoptando las etapas (i-1) y (i-2) como se ha descrito anteriormente, pero desde el punto de vista de aumentar el contenido de CPR, es deseable tomar no solo las dos etapas anteriores, sino también la etapa (i-3).
Etapa (i-3) de cultivar una población de células obtenida en la etapa (i-2) en un medio de cultivo suplementado con un estimulador de señal de TGFp y un inhibidor de PMO:
En esta etapa, puede cultivarse la población de células (mesodérmicas intermedias) obtenida en las etapas (i-1) y (i-2) como se ha descrito anteriormente por cultivo en suspensión o por cultivo de adhesión tal como están, o después de disociarse a través de cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los ejemplos de procedimientos de disociación celular incluyen disociación mecánica y disociación utilizando una solución de disociación con actividades proteolíticas y colagenolíticas (por ejemplo, Accutase® y Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)) o una solución de disociación con solo actividad colagenolítica.
El medio de cultivo que se utilice en la etapa (i-3) se puede preparar añadiendo un estimulador de señal de TGFp y un inhibidor de PMO a un medio basal para su uso en el cultivo de células animales. Ejemplos del medio basal incluyen IMDM, medio 199, EMEM, aMEM, DMEM, medio F12 de Ham, Medio RPMI 1640, medio de Fischer y medios mixtos de los mismos. El medio de cultivo se puede suplementar con suero (p.ej., suero FBS) puede estar exento de suero. Dependiendo de la necesidad, el medio de cultivo puede ser reemplazado por al menos una alternativa de suero como albúmina, KSR (Invitrogen), suplemento de N2 (Invitrogen) y/o suplemento de B27 (Invitrogen), o también puede ser suplementado con al menos una sustancia como transferrina, ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiol glicerol, lípidos, aminoácidos, L-glutamina, GlutaMAX (Invitrogen), aminoácidos no esenciales (NEAA), vitaminas, factores de crecimiento, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y equivalentes de los mismos. En una realización de esta etapa, el medio basal es un medio DMEM/F12 suplementado con GlutaMAX, KSR, NEAAs, 2-mercaptoetanol y un antibiótico.
El tipo de estimulador de señal de TGFp para su uso en la etapa (i-3) no está particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de activar la ruta de señalización TGFp. Los ejemplos de estimuladores de señal de TGFp incluyen proteínas tales como TGFpl, TGFp2 y TGFp3 y compuestos, tales como IDE1 e IDE2. Un ejemplo preferente de estimulador de señal de TGFp es TGFpl. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del estimulador de señal de TGFp usado en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de estimulador de señal de TGFp que se vaya a utilizar. Por ejemplo, cuando cualquiera de las proteínas como TGFpl, TGFp2 y TGFp3 se usa como un estimulador de señal de TGFp, la concentración de este estimulador está en el intervalo de 0.1 ng/ml a 100 ng/ml, preferentemente de 1 ng/ml a 10 ng/ml, más preferentemente de 5 ng/ml a 10 ng/ml. Cuando se utiliza cualquiera de IDE1 e IDE2 como estimulador de señal de TGFp, la concentración de este estimulador está en el intervalo de 1 pm a 100 pm, preferentemente de 25 pm a 75 pm, más preferentemente de 40 |jm a 60 pm.
El tipo del inhibidor de PMO que se utilice en la etapa (i-3) no está particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de activar la ruta de señalización PMO. Los ejemplos de inhibidores de PMO incluyen inhibidores proteicos tales como cordina, nogina y folistatina, dorsomorfina (6-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi) fenil]-3-piridin-4-il-pirazol[1,5-a ] pirimidina) y derivados de los mismos (Yu et al., Circulation, (2007), 116:II_60; Yu et al., Nat. Chem. Biol., (2008), 4:33-41; J. Hao et al., PLoS ONE, (2008), 3:e2904), DMH1 (4-[6-(4-isopropoxifenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-3-il]quinolina, 4-[6-[4-(1-metiletoxi)fenil]pirazol[1,5-a] pirimidin-3-il] quinolina) y LDN193189 (4-(6-(4-(piperidin-1-il)fenil)pirazol[1,5-a] pirimidin-3-il) quinolina). Los compuestos enumerados anteriormente están disponibles en Stemgent, Tocris Bioscience, Merck Life Science, Wako y otros fabricantes, o pueden prepararse por cuenta propia. Los ejemplos preferentes del inhibidor de PMO incluyen DMH1, LDN193189, nogina y dorsomorfina, siendo un ejemplo más preferente de los mismos DMH1. Los expertos en la materia podrán seleccionar la concentración del inhibidor de PMO utilizada en esta etapa según sea apropiado dependiendo del tipo de inhibidor de PMO que se utilice. Por ejemplo, cuando se utiliza como inhibidor de PMO cualquiera de los inhibidores proteicos como la cordina, nogina y folistatina, la concentración de este inhibidor está en el intervalo de 0,1 ng/ml a 1000 ng/ml, preferentemente de 1 ng/ml a 500 ng/ml, más preferentemente de 10 ng/ml a 100 ng/ml. Cuando se usa cualquiera entre dorsomorfina, LDN193189 y DMH1 como inhibidor de PMO, la concentración de este inhibidor está en el intervalo de 0,01 pm a 100 pm, preferentemente de 0,1 pm a 10 pm, más preferentemente de 0,5 pm a 1 pm.
En una realización, la combinación de un estimulador señal de TGFp y un inhibidor de PMO para su uso en la etapa (i-3) es una combinación de TGFp1 y DMH1.
En la etapa de cultivo de células (i-3), el medio basal se puede suplementar además con cualquier, o cualquier combinación, de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 9, FGF20, PMO7, un derivado de ácido retinoico, y un inhibidor de GSK-3p.
No hay límite superior en el número de días de cultivo celular en la etapa (i-3), ya que no se ejerce ninguna influencia particular a través del cultivo de células a largo plazo en la eficiencia de la producción de la población CPR. Por ejemplo, Por ejemplo, el número de días de cultivo celular no es menos de 2 días, no menos de 4 días, no menos de 6 días, no menos de 8 días, no menos de 10 días, no menos de 11 días, no menos de 12 días, no menos de 13 días, no menos de 14 días, no menos de 15 días, no menos de 16 días, no menos de 17 días, no menos de 18 días, no menos del 19 o no menos del 20.
El cultivo de células en la etapa (i-3) se realiza a una temperatura de cultivo, pero sin limitarse a, de aproximadamente 30 a 40 °C, preferentemente aproximadamente 37 °C, y en una atmósfera de aire que contiene CO2. La concentración de CO2 está en el intervalo de aproximadamente 2 a 5 %, preferentemente aproximadamente 5 %.
2. Etapa (ii) de clasificación de una población de células a partir de las células obtenidas en la etapa (i), utilizando al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en c D9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+), así como el uso de dichos al menos dos marcadores de superficie de la presente invención para clasificar una población de células:
En la etapa (ii) y en el uso para la clasificación de la presente invención (a la que se hace referencia en lo sucesivo colectivamente como "etapa (ii)"), se clasifica una población de células más altamente purificada a partir de las células obtenidas en la etapa (i), utilizando como indicador la presencia o ausencia de al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en c D9, CD140a, CD140b y CD271. Más específicamente, la clasificación de células se realiza utilizando un indicador que requiere que las células sean positivas para CD106, CD140a, CD140b y CD271, y negativas para CD9. En la presente memoria descriptiva, el símbolo más(+) utilizado para ciertos marcadores de superficie celular significa que las células son positivas para ciertos antígenos y CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+) se denominan "marcadores de selección positivos". En esta memoria descriptiva, el símbolo menos(-) utilizado para ciertos marcadores celulares significa que las células son negativas para ciertos antígenos, CD9(-), se denomina "marcador de selección negativo". Además, los marcadores de selección positivos y negativos pueden denominarse colectivamente como "marcadores de superficie celular".
La combinación de marcadores de superficie celular que se utilice en la etapa (ii) es una combinación de al menos dos, tres o cuatro marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9, CD140a, CD140b y CD271. Por ejemplo, la combinación de al menos dos marcadores de superficie celular comprende preferentemente una combinación de un marcador de selección negativo que es CD9(-) y un marcador de selección positivo seleccionado del grupo que consiste en CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+). La combinación de al menos tres marcadores de superficie celular comprende preferentemente: una combinación de un marcador de selección negativo que es CD9(-) y dos marcadores de selección positivos seleccionados del grupo que consiste en, CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+); o una combinación de tres marcadores de selección positivos seleccionados del grupo que consiste en CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+). La combinación de al menos cuatro marcadores de superficie celular comprende preferentemente una combinación de un marcador de selección negativo que es CD9(-) y tres marcadores de selección positivos CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+). En una realización, los marcadores de superficie celular que se utilicen en la etapa (ii) son al menos dos o tres marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+), preferentemente una combinación de CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+).
Los marcadores de superficie celular para su uso en la etapa (ii) se pueden utilizar para la clasificación de una población de CPR derivadas de mamíferos que incluye, pero sin limitarse a, seres humanos. En el caso de clasificar una población de células CPR humanas, los números de acceso NCBI de los ocho marcadores de superficie celular humanos diferentes son los siguientes. (*: no de acuerdo con la invención)
CD9: NM_001769.3 (SEQ ID NO:1)
CD55*: NM_000574.4 (SEQ ID NO:3)
CD106*: NM_001078.3 (SEQ ID NO:5)
CD140a: NM_006206.4 (SEQ ID NO:7)
CD140b: NM_002609.3 (SEQ ID NO:9)
CD165*: IDgen_23449
CD271: NM_002507.3 (SEQ ID NO:11)
CD326*: NM_002354.2 (SEQ ID NO: 13)
Los diferentes marcadores de superficie celular humanos incluyen genes que tienen las secuencias de nucleótidos de los números de acceso correspondientes mencionados anteriormente, las proteínas codificadas por dichos genes y variantes de origen natural de los mismos.
El CD9 humano está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (nucleótidos 185 a 871) y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El CD55 humano (no de acuerdo con la invención) está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 (nucleótidos 295 a 1440), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. El CD106 humano (no de acuerdo con la invención) está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 (nucleótidos 222 a 2441), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. El CD140a humano está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 (nucleótidos 332 a 3601), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. El CD140b humano está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 (nucleótidos 470 a 3790), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. El CD271 humano está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 (nucleótidos 126 a 1409), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El CD326 humano (no de acuerdo con la invención) está codificado por el gen que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 (nucleótidos 359 a 1303), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. El CD165 humano (no de acuerdo con la invención) es una proteína de superficie de membrana de 37-42 kDa, también conocida como AD2 o gp37. Como anticuerpo que se une específicamente a CD165, se ha identificado el anticuerpo monoclonal SN2 (Seon, B. K., et al., J. Immunol., (1984), 132:2089-2095) y está disponible en el mercado actualmente.
Las variantes de origen natural de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente, en particular, CD9, CD 140a, CD 140b y CD271, se refieren a marcadores de superficie celular codificados por genes cuyas secuencias de nucleótidos tienen una identidad de al menos 80 %, preferentemente al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 %, de las secuencias de nucleótidos antes mencionadas, o marcadores de superficie celular que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 80 %, preferentemente al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 %, de las secuencias de aminoácidos antes mencionadas.
La "identidad", a la que se hace referencia en el presente documento con respecto a secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos, se refiere a un valor de identidad obtenido a través de búsqueda con el programa NEEDLE (Needleman S. B. et al., J. Mol. Biol., (1970), 48: 443-453 ) utilizando los parámetros disponibles por defecto. Los parámetros por defecto son los que se definen a continuación.
penalización por hueco = 10
penalización por extensión = 0,5
Matriz = EBLOSUM62
Los anticuerpos específicos que se unen a los antígenos de superficie celular humanos mencionados anteriormente están disponibles en el mercado. Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen los mencionados a continuación en la sección de Ejemplos. Los marcadores de superficie celular que mantienen la característica por que están unidos por anticuerpos comerciales capaces de unirse específicamente a cada uno de los marcadores de superficie celular mencionados anteriormente también están incluidos entre los marcadores de superficie celular que pueden usarse para clasificar una población de células en la presente invención.
La clasificación de una población de células utilizando un marcador de superficie celular en la etapa (ii) puede realizarse a través de cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la clasificación celular se lleva a cabo utilizando un anticuerpo que se une específicamente a un marcador de superficie celular, sobre la base de la unión de dicho anticuerpo a las células. Ejemplos de dichos procedimientos de clasificación basados en anticuerpos incluyen clasificación de células con un clasificador de células utilizando un anticuerpo marcado de manera fluorescente (p. ej., FACS® (BD Biosciences)), clasificación de células magnética utilizando perlas magnéticas marcadas con anticuerpos (p. ej., MACS® (Miltenyi Biotec)) y clasificación de células utilizando un vehículo inmovilizado con anticuerpos (p. ej., Columna de enriquecimiento celular).
Los aspectos expuestos a continuación no son de acuerdo con la invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos.
3. Agente terapéutico para enfermedades renales, método de tratamiento de la enfermedad renal y método para producir células para el tratamiento de la enfermedad renal:
La población c Pr adquirida según el método de la presente invención se puede utilizar como agente terapéutico para enfermedades renales. Por consiguiente, se divulgan el siguiente método para producir células para el tratamiento de enfermedad renal y el siguiente método para clasificar una población de células para el tratamiento de la enfermedad renal:
"Un método para producir células para el tratamiento de enfermedad renal, comprendiendo el método las etapas de: (i) cultivar células madre pluripotentes en condiciones que inducen la diferenciación en células progenitoras renales; y
(ii) clasificar una población de células a partir de las células obtenidas en la etapa (i), utilizando al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+)".
"Un método para clasificar una población de células para el tratamiento de enfermedad renal a partir de una población de células que contiene células progenitoras renales utilizando al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+)".
Las células para el tratamiento de enfermedad renal son células que se caracterizan por al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+).
Se divulga un agente terapéutico para enfermedades renales, que comprende una población de CPR producida a través del método de producción de la presente invención o una población de CPR clasificadas mediante el uso de la presente invención, así como dicho agente terapéutico para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad renal, comprendiendo el método la etapa de administrar a un paciente una población de CPR producida a través del método de producción de la presente invención o una población de CPR clasificada mediante el uso de la presente invención. Los ejemplos de procedimientos para administrar una población de CPR o un agente terapéutico a un paciente incluyen: la aplicación de una lámina de células preparada a partir de una población de CPR adquirida en el riñón de un paciente; el trasplante de una población de c Pr adquirida suspendida en solución salina fisiológica, etc. en el riñón de un paciente directamente o a través de vasos sanguíneos; el trasplante de agregados de CPR obtenidos por cultivo tridimensional sobre un andamio formado por matrigel, etc.; carga de una población de CPR en una columna de diálisis; y administración de microcápsulas que encapsulan una población de CPR. Los ejemplos de enfermedades renales incluyen enfermedades renales crónicas que incluyen afecciones que no alcanzan la insuficiencia renal crónica.
En la presente invención, se puede controlar el número de CPR contenidas en un agente terapéutico para enfermedades renales para aumentarlo o disminuirlo según sea apropiado dependiendo de la gravedad de la enfermedad, el tamaño de un sitio afectado, y/o el tamaño del cuerpo.
Ejemplos
A continuación, se describirá específicamente la presente invención con más detalle mediante ejemplos, si bien el alcance de la presente invención no queda limitado con estos ejemplos.
[Ejemplo 1]
<Representación en un diagrama de dispersión bidimensional de una población de CPR por citometría de flujo de OSR1 y SIX2 y otros marcadores de superficie celular diferentes>
Las células MPi utilizadas en este ejemplo fueron líneas de células MPi humanas indicadoras OSR1-GFP y SIX2-tdTomato generadas por el procedimiento divulgado en NPL 3, que son capaces de expresar GFP junto con la expresión del gen OSR1 endógeno y de expresar tdTomato junto con la expresión de gen SIX2 endógeno. Se indujo la diferenciación de líneas de células CMPi humanas en una población de células que contenía CPR siguiendo el procedimiento descrito en NPL 4. Como resultado de la búsqueda de marcadores de superficie celular expresados específicamente en CPR utilizando el Panel de selección de marcadores de superficie celular humano (BD Biosciences, Cat. No. 560747), se identificaron CD9(-), CD55 (-) (no de acuerdo con la invención), CD106 (+) (no de acuerdo con la invención), CD140a(+), CD140b(+), CD165(+) (no de acuerdo con la invención), CD271(+) y CD326(-) (no de acuerdo con la invención), como marcadores de superficie celular que permiten el fraccionamiento de la población de células que contiene CPR de interés (FIG. 1).
[Ejemplo 2]
<Población de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) contiene al menos un 70 % CRP>
En este ejemplo, se estudió si se puede aumentar el porcentaje de CPR presentes en las células fraccionadas a partir de una población de células diferenciadas de CMPi humanas mediante el uso de una combinación de algunos de los marcadores de superficie celular identificados en el Ejemplo 1.
En primer lugar, se estudió si se puede aumentar el porcentaje de CPR presentes en una población de células diferenciadas de CMPi humanas utilizando un marcador de selección negativo y tres marcadores de selección positivos. Los marcadores de superficie celular seleccionados fueron CD9, CD140a, CD140b y CD271, que proporcionaron imágenes claras de una población de células discreta en los diagramas de dispersión bidimensionales dibujados en función de OSR1 y SIX2 en el Ejemplo 1. Como anticuerpos contra estos marcadores de superficie celular, se utilizaron CD9 anti-humano de ratón APC-H7 (BD, Biosciences; Cat. No. 655409), CD140a anti-humano de ratón Alexa Fluor® 647 (BD Biosciences; Cat. No. 562798), CD140b anti-humano de ratón BV421 (BD, Biosciences; Cat. No. 564124) CD271 anti-humano de ratón, BV510 (BD Biosciences; Cat. No. 563451). Se utilizaron los anticuerpos diluidos 20 veces y se hizo reaccionar las células con los anticuerpos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la reacción, se lavó la mezcla de reacción dos veces con PBS suplementado con FBS al 2 % y se analizó usando FACSAria™ III (BD Biosciences). Basándose en los diagramas de dispersión bidimensionales resultantes, se demarcó la fracción de células CD9(-) CD140a(+) CD140b(+) CD271(+) para fraccionar así dicha población de células. Se analizó de nuevo la población de células fraccionadas usando FACSAria™ III, y los resultados mostraron que estaban presentes células OSR1(+) SIX2(+) en una concentración de más del 70 % en la población de células completa (Figura 2B). La FIG. 2A muestra un conjunto de citogramas de flujo para grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih teñidas con CD9, CD140a, CD140b y CD271. La FIG.
2B muestra un conjunto de diagramas de dispersión bidimensionales de las mediciones de citometría de flujo de la expresión de OSR1 y SIX2 en CMPih antes de la inducción de diferenciación, en grupos de células diferenciadas derivadas de CMPih y en una población de células tras la clasificación de células P3+P4+P6, respectivamente, en orden de paneles de izquierda a derecha.
[Ejemplo 3]
<Formación de estructuras de tipo túbulo renal positivas para LTL (marcador de túbulo renal proximal) a partir de la población de células clasificada mediante CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+)>
Las CPR se caracterizan no solo por su expresión de marcadores de CPR sino también por su capacidad para mantener el potencial de diferenciación en células tubulares renales. Por consiguiente, con el fin de confirmar si las células CD9(-) CD140a(+) CD140b(+) CD271(+) obtenidas en el Ejemplo 2 eran CPR, se analizaron las células obtenidas en un sistema para inducir la diferenciación en túbulo renal. La diferenciación en células tubulares renales y la formación de estructuras de tipo túbulo renal se determinaron basándose en la expresión del marcador LTL de túbulo renal proximal y las características morfológicas.
De acuerdo con el procedimiento descrito en la NPL 4, se inmunotiñó la población de células que contenían CPR en la que se había inducido la diferenciación de líneas CMPih con CD9 anti humano de ratón APC-H7, CD140a anti­ humano de ratón Alexa Fluor® 647, CD140b anti humano de ratón BV421 y CD271 anti-humano de ratón BV510 para fraccionar las células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+) en FACSAria™ III. Se sembraron las células fraccionadas a 1,0 x 105 células/pocillo en placas de fondo cónico de adhesión celular de 96 pociNos(Sumitomo Bakelite; Cat. No. MS-9096M) que contienen un medio acondicionado, UBC (véase a continuación), suplementado con 50 ng/ml de PMO7 (R&D; Cat. No. 354-BP-010) y 10 pM Y-27632 (Wako; Cat. No. 253-00513) y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera de aire con un contenido de 5 % CO2. A continuación, se cultivaron las células durante 24 horas más, reemplazándose el medio de cultivo por un medio acondicionado con UBC con 50 ng/ml PMO7, 0,5 pM BIO (Calbiochem; Cat. No. 361552) y 10 pM Y-27632. A continuación, se cocultivan las células con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4 de acuerdo con el mismo procedimiento divulgado en NPL 4. Se utilizaron fibroblastos NIH3T3 que expresan Wn4 después de su siembra a 4,0 x 105 células/pocillo en placas de 24 pocillos y se trataron con mitomicina C. Se llevó a cabo el cocultivo utilizando medio acondicionado con UBC. Al de 2 semanas de cocultivo, se realizó la tinción celular. Durante el proceso de tinción celular, se utilizó conjugado de LTL-Biotina (Vector Laboratories; Cat. No. B-1325) para la reacción primaria; Se utilizó conjugado estreptavidina-Alexa Fluor® 546 (Life Technologies; Cat. No. S-11225) para la reacción secundaria; y se utilizó Hoechst 33342 (Life Technologies; Cat. No. H3570) para la tinción nuclear. Se utilizó LTL diluido 200 veces y se llevó a cabo la reacción con TLC a 4 °C durante toda la noche. Se utilizó conjugado estreptavidina Alexa Fluor® 546 diluido 200 veces y se llevó a cabo la reacción con este conjugado a temperatura ambiente durante una hora. Como resultado, Se observó que se habían formado estructuras luminales LTL positivas a partir de la población de células CD9(-) CD140a(+) CD140b(+) CD271(+) (Figura 3B). La FIG. 3A ilustra el procedimiento de diferenciación en túbulo renal proximal, en el que se forman agregados de células y se cocultivan con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4 de acuerdo con el mismo procedimiento que el divulgado en NPL 4. La FIG. 3B muestra el aspecto de los agregados de células CD9(-) CD140a(+) CD140b(+) CD271(+) cocultivadas con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4.
<Medio acondicionado con UBC>
Se preparó medio acondicionado con célula de yema ureteral (UBC) según una versión modificada del procedimiento descrito en la bibliografía (Barasch et al., Am. J. Physiol., (1997), 273, F757-767). Se cultivaron UBC (donadas por Dr. Barasch, Columbia University; Proc. Natl. Acad. Sci. EE.u U., (1997), 94, 6279-6284) en medio esencial mínimo (MEM; Invitrogen ) suplementado con 10 % FBS. Después de alcanzar el 80 % de confluencia, se lavaron las células con PBS y el medio de cultivo se reemplazó con un medio mixto DMEM/F12 (1:1) suplementado con GlutaMAX, KSR al 10 %, 0,1 mM de NEAA, 0,55 mM de 2-mercaptoetanol y 500 U/ml de penicilina/estreptomicina. A continuación, se cultivaron las células durante 3 días para producir un sobrenadante de cultivo. Se filtró el sobrenadante del cultivo a través de un filtro de 0,22 pm antes de su uso.
[Ejemplo 4]
<Porcentajes de CPR (células OSR1(+) SIX2(+)) en poblaciones de células clasificadas según diferentes combinaciones de CD9(-) con tres marcadores de selección positivos>
Se investigaron los porcentajes de células OSR1(+) SIX2(+) en las poblaciones de células clasificadas según todas (10) las combinaciones exhaustivas de CD9(-) con cualquiera de los tres marcadores de selección positivos extraídos en el Ejemplo 1 utilizando FACSAria™ Fusión (BD Biosciences). Además, con respecto a la combinación particular de CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+), que según se confirmó en el Ejemplo 3 permitió el fraccionamiento de una población de células que contenía CPR, se investigó si CD55(-) y CD326(-) (ambos no de acuerdo con la invención) pueden servir como marcadores de selección negativos alternativos a CD9(-).
Los anticuerpos usados fueron: CD9 anti-humano de ratón APC-H7 (BD, Biosciences; Cat. N.° 655409); CD140a anti-humano de ratón Alexa Fluor® 647 (BD Biosciences; Cat. N.° 562798); CD140a anti-humano de ratón BV421 (BD, Biosciences; Cat. N.° 562799); CD140b anti-humano de ratón BV421 (BD, Biosciences; Cat. N.° 564124); CD271 anti-humano de ratón BV510 (BD, Biosciences; Cat. N.° 563451); CD106 anti-humano de ratón APC (BD, Biosciences; Cat. N.° 551147); CD106 anti-humano de ratón BV605 (bD, Biosciences; Cat. N.° 563307); CD165-Biotina, Humano (Miltenyi Biotec; Cat. No. 130-098-536); CD165-APC, Humano (Miltenyi Biotec; Cat. No. 130-098­ 542); CD55 Biotina anti-humano (eBioscience; Cat. No. 13-0559); y CD326 anti-humano de ratón BV605 (BD, Biosciences; Cat. N.° 563182). Se utilizaron los anticuerpos diluidos 20 veces y se hicieron reaccionar las células con los anticuerpos a temperatura ambiente durante 15 minutos, se lavaron con PBS tres veces y después se analizaron. En caso de usar anticuerpos biotinilados, se realizó una tinción secundaria con estreptavidina BV605 (BD Biosciences; Cat. Cat. No. 563260) diluida 500 veces. Durante el proceso de tinción secundaria, se hicieron reaccionar las células con los anticuerpos indicados a temperatura ambiente durante 15 minutos, se lavaron con PBS tres veces y luego se analizaron. Se analizaron las poblaciones de células diferenciadas derivadas de CMPih usando FACSAria™ Fusion y, basándose en los conjuntos resultantes de diagramas de dispersión bidimensionales, se delimitaron las fracciones de células teñidas con 12 combinaciones diferentes de anticuerpos para fraccionar así las correspondientes fracciones de células. Se analizaron de nuevo las poblaciones de células fraccionadas utilizando FACSAria™ Fusion, para calcular así los porcentajes de células OSR1(+) SIX2(+), células OSR1(+)SIX2(-), células OSR1(-) SIX2(+) y células OSR1(-) SIX2(-) presentes en las poblaciones de células completas (Figura 4). Según se observó en los resultados se encontraron altos porcentajes de células OSR1(+) SIX2(+) en las poblaciones de células completas fraccionadas con todas las combinaciones de marcadores.
[Ejemplo 5]
investigación de combinaciones de marcadores de superficie celular que permiten el fraccionamiento de CPR> Se analizaron las poblaciones de células mediante FACSAria™ Fusion usando los anticuerpos contra cualquier combinación de los marcadores de superficie celular CD9, CD140a, CD140b y CD271 como se adoptó en el Ejemplo 4, para calcular así el porcentaje de células OSR1(+) SIX2(+) presentes en cada una de las poblaciones de células fraccionadas con diferentes combinaciones del marcador de selección negativo CD9(-) con cualquier marcador de selección positivo seleccionado entre CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+). Además, se investigó el porcentaje de células delimitadas según cada una de las diferentes combinaciones de marcadores de superficie celular en una población de células sin clasificar y, sobre esa base, se calculó el porcentaje del número de células OSR1(+) SIX2(+) recolectadas utilizando cada una de las combinaciones de marcador superficial deseado con respecto al número de células no clasificadas (Figura 5). Los resultados revelaron que la condensación de células OSR1(+)SIX2(+) fue posible con el uso de cualquiera de las diferentes combinaciones de marcadores de superficie celular y que los porcentajes de células OSR1(+)SIX2(+) condensadas con diferentes combinaciones de dos o tres marcadores de superficie celular fueron comparables a los porcentajes de células OSR1(+)SIX2(+) condensadas con una combinación de cuatro marcadores de superficie celular.
[Ejemplo 6]
<Investigación de combinaciones de marcadores de superficie celular que permiten el fraccionamiento de CPR> Con vistas a confirmar que una población de alta pureza CPR se puede fraccionar incluso a partir de líneas CMPih que no llevan ningún gen indicador mediante el uso de los marcadores de superficie celular antes explicados, se analizaron CMPih (cepa 201B7, donada por la Universidad de Kioto) en un sistema de inducción de diferenciación. Se mantuvieron en cultivo de mantenimiento las CMPih (201B7) a través de un procedimiento convencional (Takahashi K, et al., (2007), Cell. 131:861-72), y se indujo la diferenciación en una población de células que contenían CPR siguiendo el procedimiento divulgado en NPL 4. A continuación, de acuerdo con el mismo procedimiento que el del Ejemplo 3, se fraccionaron células CD9(-) CD140a(+) CD140b(+) CD271(+) usando FACSAria™ Fusion para formar agregados de células y se cocultivaron los agregados celulares con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4, con lo cual se confirmó si una población de células que mantenía el potencial de diferenciación en túbulo renal se había fraccionado con éxito. La diferenciación en túbulo renal se determinó sobre la base de la expresión del LTL marcador de túbulo renal proximal y las características morfológicas. Como resultado, se confirmó que se pueden formar estructuras luminales LTL positivas a partir de la población de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+). En otras palabras, se demostró que una población de células que contiene CPR de alta pureza se puede fraccionar incluso a partir de células diferenciadas derivadas de CMPih (201B7) mediante el uso de CD9, CD140a, CD140b y CD271 (FiG. 6C). La FIG: 6A muestra un conjunto de histogramas del número de células en función de la intensidad de fluorescencia de cada uno de OSR1 (g Fp ), SIX2 tdTomato) y los diferentes marcadores de superficie celular. La FIG: 6B muestra un conjunto de dos diagramas de dispersión de las mediciones de citometría de flujo de la expresión de CD9, CD140a, CD140b o CD271 en una población de células diferenciadas derivadas de la línea CMPi 201B7. La FIG. 6C muestra una imagen de agregados de células formados por clasificación de poblaciones de células P4+P2+P3 y cocultivadas con fibroblastos NIH3T3 que expresan Wnt4. [Ejemplo 7]
investigación de combinaciones de marcadores de superficie celular que permiten el fraccionamiento de CPR(2)> De acuerdo con el mismo procedimiento que el del Ejemplo 6, se sometió a inmunotinción la población de células que contenía CPR en la que se había inducido la diferenciación de CMPih (201B7) utilizando CD9 anti humano de ratón APC-H7, CD140a anti-humano de ratón Alexa Fluor® 647, Cd140b anti-humano de ratón BV421 y CD271 anti­ humano de ratón BV510 y a continuación a clasificación celular con FACSAria™ Fusion para fraccionar células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+)CD271(+). Se mancharon las células fraccionadas en vidrios portaobjetos utilizando Smear Gell® (GenoStaff; Cat. No. SG-01) y se inmunotiñeron para factores de transcripción intranuclear. Se utilizó Poli.Rabbit anti-SIX2, (Protein- tech; Cat. No. 11562-1-AP) como anticuerpo primario; se utilizó el conjugado Alexa Fluor® 488 anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-conejo de burro (Life Technologies; Cat. No. A21206) como anticuerpo secundario; y se utilizó Hoechst 33342 (Life Technologies; Cat. No. H3570) para la tinción nuclear. Como resultado de la observación con un microscopio (KEYENCE; Cat. No. BZ-9000), se observó que la población de células CD9(-)CD140a(+)CD140b(+) CD271(+) contiene un mayor porcentaje de células SIX2-positivas, que es una de las características de las CPR, en comparación con una población de células diferenciadas no clasificadas (FIG.
7).
Aplicabilidad industrial
Como se ha detallado anteriormente en este documento, la presente invención proporciona un método para adquirir y producir CPR de alta pureza a partir de una población CPR en la que se induce la diferenciación de CMP, utilizando un marcador de superficie celular. Las CPR adquiridas a través del método de la presente invención

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir células progenitoras renales en el que se induce la diferenciación de células madre pluripotentes, comprendiendo el método las etapas de:
(i) cultivar las células madre pluripotentes en condiciones que inducen la diferenciación en células progenitoras renales; y
(ii) clasificar una población de células a partir de las células obtenidas en la etapa (i) mediante el uso de al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde en la etapa (ii), la clasificación de una población de células se lleva a cabo utilizando al menos tres marcadores de superficie celular.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde en la etapa (ii), la clasificación de una población de células se lleva a cabo utilizando los cuatro marcadores de superficie celular en su totalidad.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas (MPi).
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las células madre pluripotentes son células MPi humanas.
6. Una población de células progenitoras renales producida a través del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las células en la población están caracterizadas por sus marcadores de superficie celular seleccionados de un grupo que consiste en las siguientes combinaciones:
(B) tres marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+)
(C) CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+).
7. Uso de al menos dos marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD9(-), CD140a(+), CD140b(+) y CD271(+) para clasificar una población de células a partir de una población de células que contiene células progenitoras renales.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la clasificación de una población de células se lleva a cabo utilizando al menos tres marcadores de superficie celular.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la clasificación de una población de células se lleva a cabo utilizando cuatro marcadores de superficie celular.
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde las células progenitoras renales son células progenitoras renales en las que se induce la diferenciación de células madre pluripotentes.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas (MPi).
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde las células madre pluripotentes son células MPi humanas.
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