PL214283B1 - Sposób izolacji komórek T, sposób wytwarzania autologicznej szczepionki komórek T, autologiczna szczepionka komórek T, zastosowanie autologicznej szczepionki komórek T - Google Patents

Description

(51) Int.Cl.

G01N 33/53 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374673 (22) Data zgłoszenia: 06.08.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

06.08.2003, PCT/US03/024548 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

19.02.2004, WO04/015070

Sposób izolacji komórek T, sposób wytwarzania autologicznej szczepionki komórek T, (54) autologiczna szczepionka komórek T, zastosowanie autologicznej szczepionki komórek T
	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE, Houston, US
08.08.2002, US, 60/402,521	OPEXA PHARMACEUTICALS INC., Houston, US
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.10.2005 BUP 22/05	(72) Twórca(y) wynalazku: JINGWU Z. ZHANG, Missouri City, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.07.2013 WUP 07/13	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska

PL 214 283 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji komórek T, sposób wytwarzania autologicznej szczepionki komórek T, autologiczna szczepionka komórek T, zastosowanie autologicznej szczepionki komórek T. Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny diagnozy i leczenia chorób autoimmunizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS). Bardziej szczególnie dotyczy izolacji specyficznych względem antygenu komórek T. Dodatkowo obecny wynalazek dotyczy stosowania specyficznych względem antygenu komórek T do leczenia chorób autoimmunizacyjnych takich jak MS.

Międzykomórkowe kompleksy rozpoznania tworzone przez receptory komórek T (TCR) na cytotoksycznych limfocytach T lub komórkach pomocniczych T i kompleksy MHC/peptyd na komórkach prezentujących antygen (APC) są powszechnym składnikiem rozpoznania w różnorodnym zestawie spotkań komórka-komórka, które aktywują komórki T zarówno w czasie rozwoju repertuaru komórek T w pojedynczym organizmie (selekcja dodatnia; selekcja ujemna; przeżycie obwodowe) i w czasie kontroli (komórki T pomocnicze) i w stadiach efektorów (komórki T zabójcy) adaptacyjnej odpowiedzi odpornościowej.

W adaptacyjnej odpowiedzi odpornościowej antygeny są rozpoznawane przez cząsteczki hiperzmienne, takie jak przeciwciała lub TCR, które są wyrażane z dostatecznie różnymi strukturami by mogły rozpoznawać dowolny antygen. Przeciwciała mogą wiązać się do dowolnej części powierzchni antygenu. TCR są jednak ograniczone do wiązania krótkich peptydów związanych z cząsteczkami klasy I lub klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na powierzchni APC. Rozpoznanie przez TCR kompleksu peptyd/MHC powoduje aktywację (ekspansję klonalną) komórki T.

TCR są heterodimerami złożonymi z dwóch łańcuchów, które mogą być αβ (alfa-beta) lub γδ (gamma-delta). Każdy łańcuch ma dwie zewnątrzkomórkowe domeny, które są foldami immunoglobulinowymi. N-końcowa domena jest wysoce zmienna i jest zwana domeną zmienną (V). Domena najbliższa membranie jest domeną stałą (C). Te dwie domeny są analogiczne do domen immunoglobulin i są podobne do fragmentów Fab. Domena V każdego łańcucha ma trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR). W pobliżu membrany, każdy łańcuch TCR ma krótką sekwencję łączącą z resztą cysteiny, która tworzy wiązanie dwusiarczkowe między obydwoma łańcuchami.

Geny kodujące heterodimery αβ i γδ są tylko wyrażane w linii komórek T. Cztery loci TCR (α, β, γ i δ.) mają organizację w linii komórek płciowych bardzo podobną do Ig. Łańcuchy α i γ są produkowane przez rearanżację odcinków V i J podczas gdy łańcuchy β i δ są produkowane przez rearanżację odcinków V, D i J. Odcinki genów dla łańcuchów TCR są zlokalizowane na różnych chromosomach, poza odcinkami genu łańcucha δ, które leżą między odcinkami V i J łańcucha α. Lokalizacja odcinków genu łańcucha δ ma znaczenie: produktywna rearanżacja odcinków genu łańcucha α deletuje geny C łańcucha δ, tak, że w danej komórce heterodimer αβ nie może być wyrażany razem z receptorem γδ.

U myszy jest około 100 odcinków genu Va i 50 Ja i tylko jeden odcinek Ca. Rodzina genów łańcucha δ ma około 10 odcinków genów V, 2 D i 2 J. Rodzina genów łańcucha β ma 20-30 odcinków V i dwa identyczne powtórzenia zawierające 1 Dβ, 6 Jβ i 1 Cβ. I na końcu rodzina genów łańcucha γ zawiera 7 V i 3 różne powtórzenia J-C. U ludzi organizacja jest podobna jak u myszy, ale liczba odcinków jest inna.

Rearanżacje odcinków genów w łańcuchach a i β są podobne jak w Ig. Łańcuch a, podobnie jak łańcuch lekki Ig, jest kodowany przez odcinki genu V, J i C. Łańcuch β jak łańcuch ciężki Ig, jest kodowany przez odcinki genu V, D i J. Rearanżacja odcinków genu a daje łączenie VJ i rearanżacja łańcucha β daje łączenie VDJ. Po transkrypcji genów po rearanżacji, obróbce RNA i translacji, łańcuchy a i β są wyrażane połączone przez mostek dwusiarczkowy na membranie komórek T.

Odcinki genu TCR są oflankowane przez sekwencje rozpoznawania sygnału (RSS) zawierające heptametr i nonamer z sekwencją między nimi albo 12 nukleotydów (jeden skręt) albo 23 nukleotydów (dwa skręty). Jak w Ig, enzymy kodowane przez geny aktywujące rekombinację (RAG-1 i RAG-2) są odpowiedzialne za proces rekombinacji. RAG1/2 rozpoznają RSS i łączą odcinki V-J i V-D-J w taki sam sposób jak przy rearanżacjach Ig. Pokrótce, te enzymy tną jedną nić DNA między odcinkiem genu i RSS i katalizują tworzenie szpilki do włosów w sekwencji kodującej. Następnie jest wycinana sekwencja sygnałowa.

Kombinacyjne łączenie odcinków V i J w łańcuchach a i odcinków V, D i J w łańcuchach β produkuje dużą liczbę możliwych cząsteczek, w ten sposób tworząc różnorodność TCR. Różnorodność jest też uzyskiwana w TCR przez alternatywne łączenie odcinków genu. W odróżnieniu od Ig, odcinki

PL 214 283 B1 genu β i δ mogą być łączone w alternatywne sposoby. Flankujące RSS odcinki genów w odcinkach genu β i δ mogą generować VJ i VDJ w łańcuchu β i VJ, VDJ i VDDJ w łańcuchu δ. Jak w przypadku Ig, różnorodność jest też tworzona przez zmienność przy łączeniu odcinków genu.

Hiperzmienne pętle TCR znane jako regiony determinujące dopasowanie (CDR) rozpoznają złożoną powierzchnię zbudowaną z cząsteczki MHC i związanego peptydu. Pętle CDR2 α i β kontaktują tylko cząsteczkę MHC na powierzchni APC, podczas gdy pętle CDR1 i CDR3 kontaktują zarówno peptyd i cząsteczkę MHC. W porównaniu z Ig, TCR mają bardziej ograniczoną różnorodność w CDR1 i CDR2. Jednak różnorodność pętli CDR3 w TCR jest wyższa niż w Ig ponieważ TCR mogą łączyć więcej niż jeden odcinek D prowadząc do zwiększonej zmienności przy łączeniu.

Uważa się, że patogeneza szeregu chorób autoimmunizacyjnych jest powodowana przez odpowiedź autoimmunologicznych komórek T na antygeny własne obecne w organizmie. Nie wszystkie autoreaktywne komórki T są usuwane w grasicy, w przeciwstawieniu do paradygmatu selekcji klonalnej. Te komórki T z TCR dla szerokiego spektrum antygenów własnych reprezentują część normalnego repertuaru komórek T i normalnie krążą na obwodzie. Jest niejasne dlaczego autoreaktywnym komórkom T pozwala się w czasie ich rozwoju na przechodzenie różnicowania w grasicy i są one umieszczane na obwodzie. Podczas gdy ich rola fizjologiczna nie jest znana, te autoreaktywne komórki T, po aktywacji, stanowią potencjalne zagrożenie w indukcji patologii autoimmunizacyjnych. Autoreaktywne komórki T mogą być także izolowane z normalnych osobników bez konsekwencji chorób autoimmunizacyjnych. Ustalono, że rozpoznawanie antygenów autoreaktywności jako takie nie jest wystarczające do wywołania procesu autodestrukcji. Jednym z wymagań, by autoreaktywne komórki T były patogenne jest ich aktywacja.

Autoreaktywne komórki T są implikowane w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych takich jak stwardnienie rozsiane (MS) i reumatoidalne zapalenie stawów (RA). Ogólnie uważa się, że patogeneza autoreaktywnych komórek T w MS pochodzi z odpowiedzi komórek T na antygeny mieliny, w szczególności zasadowe białko mieliny (myelin basic protein - MBP). Stwierdza się, że komórki T reagujące z MBP przechodzą aktywację in vivo i występują z wyższą częstością prekursora w krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów z MS w porównaniu z osobnikami kontrolnymi. Te reagujące z MBP komórki T produkują cytokiny T_H1 np. IL-2, TNFa i interferon γ (IFNy), które ułatwiają migrację zapalnych komórek do centralnego układu nerwowego i pogarszają niszczące mielinę odpowiedzi zapalne w MS.

Wykazano także, że reagujące z mieliną komórki T biorą udział w patogenezie eksperymentalnego autoimmunizacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia (experimental immune encephalomyelitis - EAE) u zwierząt. EAE można aktywnie indukować u podatnych zwierząt przez wstrzyknięcie białek mieliny zemulgowanych w adiuwancie lub pasywnie przez wstrzyknięcie reagujących z mieliną linii i klonów komórek T pochodzących z uczulonych na mielinę zwierząt. Gdy są aktywowane in vitro, bardzo małe ilości reagujących z mieliną komórek T są wymagane do indukcji EAE, podczas gdy 100 razy więcej komórek spoczynkowych T z tą samą reaktywnością nie jest zdolnych do indukowania EAE.

Wykazano, że EAE można zapobiegać i także leczyć przez szczepienie inaktywowanymi reagującymi z mieliną komórkami T, procedura ta nazywa się szczepieniem komórkami T (Ben-Nun i wsp., Nature, 1981; 292: 60-61). Szczepienie komórkami T indukuje regulacyjne odpowiedzi immunologiczne złożone z anty-idiotypowych komórek T i anty-ergotypowych komórek T, co prowadzi do usunięcia reagujących z mieliną komórek T. Przez usunięcie reagujących z mieliną komórek T obserwuje się efekty terapeutyczne w EAE i innych eksperymentalnych modelach chorób autoimmunizacyjnych (Lider i wsp. Science, 1988; 239:820-8221 Lohse i wsp., Science,1989; 244:820-822).

Ze względu na sukces w modelach chorób autoimmunizacyjnych, szczepienie komórkami T niedawno zaawansowało do badań klinicznych u pacjentów z MS. W oparciu o wyniki w modelach eksperymentalnych takich jak EAE, uważa się, że usunięcie autoreaktywnych komórek T może poprawić przebieg kliniczny MS i innych chorób autoimmunizacyjnych.

W pilotowych badaniach klinicznych, szczepienie napromieniowanymi autologicznymi reagującymi z MBP klonami komórek T wywołało odpowiedzi CD8⁺ komórek cytolitycznych T, które specyficznie rozpoznawały i lizowały krążące reagujące z MBP komórki T (Hang i wsp., Science, 1993; 262: 145-454, Medaer i wsp., Lancet 1995: 346:807-808). Trzy podskórne zastrzyki napromieniowanymi reagującymi z MBP klonami komórek T spowodowało zmniejszenie ilości krążących reagujących z MBP komórek T u pacjentów z MS.

PL 214 283 B1

We wstępnych badaniach klinicznych, zmniejszono ilość krążących reagujących z MBP komórek T u będących w remisji pacjentów MS z wznowami i wtórnie postępujących pacjentów MS (Zhang i wsp., J Neurol., 2002; 249:212-8), przez szczepienie pacjentów trzema podskórnymi zastrzykami napromieniowanych autologicznych komórek T reagujących z MBP. Szczepienie komórkami T było korzystne dla każdej grupy pacjentów na podstawie pomiarów częstości wznowy, wartości zwiększonej niesprawności i aktywności uszkodzeń MRI. Jednak występowała skłonność do zwiększonego tempa postępu choroby około dwanaście miesięcy po ostatnim zastrzyku. Znaczenie widocznego przyspieszonego postępu choroby nie jest jasne ale może być związane ze stopniowym spadkiem odporności indukowanej przez szczepienie komórkami T przeciwko reagującym z MBP komórkami T. U około 10-12% immunizowanych pacjentów reagujące z MBP komórki T pojawiły się ponownie w tym samym czasie jak przyspieszony postęp choroby. W niektórych przypadkach ponawiające się ponownie reagujące z MBP komórki T pochodziły z innych klonalnych populacji, które nie były wykryte przed szczepieniem, sugerując, że reagujące z MBP komórki T mogą przejść zmianę klonalną lub rozszerzanie się epitopu. Zmiana klonalna reagujących z MBP komórek T była obserwowana w poprzednich badaniach (Hang i wsp. 1995) i może być związana z będącym w toku procesem choroby.

Choć wykazano, że szczepienie komórkami T jest skuteczne dla zmniejszenia ilości komórek T reagujących z mieliną i potencjalnie korzystne dla pacjentów MS, jest kilka problemów z terapią. Terapia szczepionkami komórek T musi być indywidualizowana dla każdego pacjenta, ponieważ receptory komórek T reagujących z mieliną komórek T są wysoce różne i zmieniają się wśród różnych pacjentów MS (Vandervyver i wsp., Eur. J. Immunol., 1995; 25:958-968, Wuchterpfennig i wsp., J. Immunol., 994; 152:5581-5592, Hong i wsp., J. Immunol., 1999; 163:3530-3538).

Poza indywidualizacją u każdego pacjenta, wymagane jest do 8 tygodni do produkcji danej szczepionki komórek T stosując obecne procedury. Produkcja szczepionki komórek T rozpoczyna się od izolacji komórek jednojądrowych z płynu mózgowo-rdzeniowego (CSFMC) lub krwi obwodowej (PBMC) pacjenta. Wyizolowane komórki jednojądrowe hoduje się następnie z peptydami mielinowymi, aby zaktywować reagujące z mieliną komórki T. Hodowle następnie testuje się pod kątem specyficznej ₃ proliferacji na peptydy mielinowe przez pomiar inkorporacji [³H]-tymidyny w obecności peptydów mielinowych przez okres 3 dni. Hodowle z dodatnim wynikiem dla specyficznej proliferacji w obecności peptydów mielinowych następnie rozcieńcza się seryjnie aby uzyskać klonalne linie komórek T lub ekspanduje się je bezpośrednio. Komórki następnie hoduje się 6-8 tygodni aby ekspandować komórki T. Gdy ostateczny produkt szczepionki komórek T jest klonalny, komórki T są homogenne z pojedynczym wzorem ekspresji użycia genu νβ-De-Je. Na ogół łączy się trzy do sześciu klonalnych linii komórkowych aby wyprodukować heterogenną formułę z wieloma wzorami użycia genu νβ-ϋβ-ϋβ. Gdy ostateczna szczepionka komórek T jest produkowana przez bezpośrednią ekspansję, komórki T są heterogenne z więcej niż jednym wzorem użycia genu νβ-ϋβ-ϋβ.

Zindywidualizowana natura szczepień komórkami T i przedłużona hodowla potrzebna do produkcji każdej szczepionki powodują, że terapia jest kosztowna i wymaga dużej ilości pracy przy obecnych metodologiach. Wydłużony czas hodowli komórek także powoduje znaczące ryzyko zakażania. W końcu, prawdopodobieństwo zmiany klonalnej lub rozszerzenia epitopu reagujących z mieliną komórek T może wymagać dalszej produkcji szczepionki komórek T dla każdego pacjenta z innym wzorem użycia genu νβ-ϋβ-ϋβ.

Tak więc istnieje potrzeba opracowania ulepszonych sposobów izolacji komórek T ze specyficznością względem antygenów takich jak MBP, które mogą być stosowane do produkcji szczepionek komórek T do leczenia pacjentów z chorobami związanymi z komórkami T takimi jak MS. Istnieje też potrzeba opracowania ulepszonych sposobów produkcji szczepionek komórek T z heterogennym wzorem użycia genu νβ-ϋβ-ϋβ aby uwzględnić przesunięcie klonalne autoreaktywnych komórek T.

Obecny wynalazek jest ogólnie ukierunkowany na sposoby izolacji specyficznych względem antygenu komórek T i bardziej szczególnie komórek T specyficznych dla antygenów własnych lub autoantygenów. Sposoby izolacji jednej lub więcej komórek T specyficznych dla interesującego antygenu na ogół obejmują inkubację próbki zawierającej komórki T uzyskane od pacjenta z tym antygenem lub jego pochodną, wybranie jednej lub więcej komórek T, które wyrażają jeden lub więcej pierwszych markerów wybranych z grupy złożonej z CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i jeden lub więcej z drugich markerów wybranych z grupy złożonej z IL-2, IFNg, TNFα, IL5, IL-10 i IL-13.

PL 214 283 B1

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji komórek T specyficznych dla kombinacji antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

(a) inkubację próbki zawierającej komórki T z kombinacją antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym, (b) wybranie komórek T specyficznych dla antygenów, w których zachodzi ekspresja co najmniej jednego pierwszego markera wybranego z grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFN_gamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13.

Korzystnie, gdy kombinacja antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym zawiera co najmniej dwa antygeny wybrane z grupy złożonej z zasadowego białka mieliny, białka proteolipidu, glikoproteiny oligodendrocytów mieliny, fragmentu zasadowego białka mieliny, fragmentu białka proteolipidu, i fragmentu glikoproteiny oligodendrocytów. Korzystnie, gdy kombinacja antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym obejmuje sekwencje SEQ ID NO: 1-6. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez 1 do 7 dni. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 1 dzień. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 16 godzin. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 12 godzin. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 8 godzin. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 4 godziny. Korzystnie, gdy antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 2 godziny.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania autologicznej szczepionki komórek T charakteryzujący się tym, że obejmuje:

(a) uczulanie [priming] próbki zawierającej komórki T z kombinacją autoantygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO:1-6, (b) wybranie komórek T specyficznych dla autoantygenów, które wyrażają co najmniej jeden pierwszy marker wybrany z grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFN_gamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13; i (c) inaktywację autoreaktywnych komórek T.

Korzystnie, gdy sposób ponadto obejmuje rosnącą liczbę autoreaktywnych komórek T wybranych w etapie (b).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest autologiczna szczepionka komórek T charakteryzująca się tym, że zawiera inaktywowane komórki T reaktywne względem kombinacji antygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO: 1-6 i eksprymująca co najmniej jeden pierwszy marker wybrany spośród grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFN_gamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13.

Korzystnie, gdy komórki T są inaktywowane przez napromieniowanie.

Korzystnie, gdy próbki zawierają autologiczne komórki T krwi obwodowej.

Korzystnie, gdy próbki zawierają komórki T płynu mózgowo-rdzeniowego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie autologicznej szczepionki komórek T zawierającej inaktywowane komórki T reaktywne względem kombinacji antygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO: 1-6 i eksprymujące co najmniej jeden pierwszy marker wybrany spośród grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFNgamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13 do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego.

Sposoby według wynalazku są szczególnie pożyteczne do izolacji autoreaktywnych komórek T, które odgrywają rolę w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych.

Sposoby według wynalazku także pozwalają na diagnostykę chorób autoimmunizacyjnych jak i monitorowanie progresji choroby i monitorowania skuteczności leczenia choroby.

Sposoby według wynalazku także pozwalają na przygotowanie autologicznych szczepionek komórek T do leczenia chorób autoimmunizacyjnych związanych z komórkami T. Sposoby przygotowania szczepionek na ogół obejmują izolację specyficznych względem antygenu komórek T jak opisano powyżej po czym dowolnie następują kolejne etapy hodowli, które pozwalają na ekspansję populacji wyizolowanych specyficznych względem antygenu komórek T.

Wynalazek między innymi jest skierowany ma szczepionki komórek T i kompozycje farmaceutyczne zawierające specyficzne względem antygenu komórki T wyizolowane stosując sposoby według wynalazku.

Sposoby według wynalazku są także pożyteczne w charakteryzowaniu receptorów komórek T i kodujących je kwasów nukleinowych.

PL 214 283 B1

Poniżej przedstawiono opis figur rysunku:

Fig. 1 wykazuje identyfikację za pomocą FACS komórek wyrażających CD69 i yIFN (u góry) i CD69 i TNFα (u dołu) u pacjenta chorego na stwardnienie rozsiane przed stymulacją (z lewej), po stymulacji resztami 83-99 MBP (na środku) i po stymulacji resztami 83-99 MBP (z prawej).

Fig. 2 wykazuje identyfikację za pomocą FACS komórek wyrażających CD69 i yIFN (u góry) i CD69 i TNFα (u dołu) u zdrowego kontrolnego pacjenta przed stymulacją (z lewej), po stymulacji resztami 83-99 MBP (na środku) i po stymulacji resztami 83-99 MBP (z prawej).

Poniżej przedstawiono szczegółowy opis wynalazku

1. Definicje

Aby pomóc w zrozumieniu tego wynalazku kilka określeń jest zdefiniowanych poniżej.

„Autoantygen” lub „antygen własny” jak jest tu stosowane dotyczy antygenu lub epitopu, który jest natywny dla ssaka, i który jest immunogenny w danej chorobie ssaka, jest konserwowany w tym gatunku ssaka i może brać udział w patogenezie autoimmunizacji.

„CD” „kompleks różnicowania” lub „wspólna determinanta” jak jest tu stosowane dotyczy cząsteczek na powierzchni komórki rozpoznawanych przez przeciwciała. Wyrażanie pewnych CD jest specyficzne dla komórek specyficznej linii lub szlaku dojrzewania, a ekspresja innych zmienia w zależności od stanu aktywacji, pozycji lub różnicowania tych samych komórek.

„Pochodząca od” lub „pochodna” w kontekście sekwencji nukleotydów oznacza, że sekwencja nukleotydów nie jest ograniczona do specyficznej sekwencji opisanej, ale także obejmuje warianty tej sekwencji, które mogą obejmować addycje, delecje, substytucje lub modyfikacje w takim zakresie, że warianty tej opisanej sekwencji zachowują zdolność do hybrydyzacji, w umiarkowanych lub wysoce ostrych warunkach, do dopełnienia opisanej sekwencji. W kontekście sekwencji peptydowych lub polipeptydowych „pochodząca od” lub „pochodna” oznacza, że peptyd lub polipeptyd nie jest ograniczony do specyficznej sekwencji opisanej, ale także obejmuje warianty tej sekwencji, które mogą obejmować addycje, delecje, substytucje lub modyfikacje aminokwasów w takim zakresie, że warianty tej opisanej sekwencji zachowują zdolność do wywoływania odpowiedzi odpornościowej na opisaną sekwencję.

„Immunogenny” gdy jest stosowany do opisania peptydu lub polipeptydu oznacza, że peptyd lub polipeptyd jest zdolny do indukcji odpowiedzi odpornościowej, z udziałem komórek T, przeciwciała lub obu.

„Choroba związana z odpornością” oznacza chorobę, w której układ odpornościowy bierze udział w patogenezie choroby. Podzbiorem chorób związanych z odpornością są choroby autoimmunizacyjne. Choroby autoimmunizacyjne obejmują, ale nie są ograniczone do, reumatoidalne zapalnie stawów, ciężką miastenię, stwardnienie rozsiane, łuszczycę, toczeń ustrojowy, autoimmunizacyjne zapalenie tarczycy (zapalenie tarczycy Hashimoto), chorobę Graves'a, zapalną chorobę jelit, autoimmunizacyjne zapalenie błony naczyniowej oka i siatkówki, zapalenie wielomięśniowe i pewne typy cukrzycy. Ze względu na obecne ujawnienie, osoba biegła w może łatwo zauważyć inne choroby autoimmunizacyjne możliwe do leczenia za pomocą kompozycji i sposobów obecnego wynalazku. „PCR” oznacza reakcję łańcuchową polimerazy na przykład ogólnie opisane w US Pat. Nr 4,683,207 (wydany 28 lipca, 1987 Mullisowi), który jest tu włączony w formie odniesienia. PCR jest techniką amplifikacji, w której wybrane oligonukleotydy lub startery mogą być hybrydyzowane do matryc kwasu nukleinowego w obecności czynnika polimeryzującego (takiego jak polimeraza DNA lub RNA) i trifosforanów nukleozydów, przez co produkty wydłużenia mogą być wytworzone ze starterów. Te produkty mogą być następnie denaturowane i stosowane jako matryce w reakcji cyklicznej, która amplifikuje liczbę i ilość istniejących kwasów nukleinowych, co może następnie ułatwić ich detekcję. W dziedzinie znany jest szereg technik PCR i mogą być stosowane w związku z tym ujawnieniem.

„Peptyd” lub „polipeptyd” jest połączoną sekwencją aminokwasów i może być naturalny, syntetyczny, lub modyfikacją lub kombinacją naturalnych i syntetycznych.

„Starter” oznacza oligonukleotyd, naturalny, syntetyczny, lub ich modyfikację, zdolny do działania jako punkt inicjacji syntezy nukleotydów wystarczająco komplementarny do specyficznej sekwencji nukleotydów na cząsteczce matrycy.

„Sonda” oznacza oligonukleotyd, naturalny, syntetyczny, lub ich modyfikację, zdolny do specyficznego wiązania do dostatecznie komplementarnej sekwencji nukleotydów.

„Choroba związana z komórkami T” oznacza chorobę powstającą w wyniku rozpoznawania własnych antygenów przez komórki T.

„Terapia” lub „leczenie” gdy dotyczy ochrony zwierzęcia przed chorobą oznacza zapobieganie, supresję, represję lub całkowitą eliminację choroby. Zapobieganie chorobie obejmuje podawanie

PL 214 283 B1 kompozycji według wynalazku zwierzęciu przed początkiem choroby. Supresja choroby obejmuje podanie kompozycji według wynalazku zwierzęciu po indukcji choroby ale przed pojawieniem się objawów klinicznych. Represja choroby obejmuje podanie kompozycji według wynalazku zwierzęciu po wystąpieniu klinicznych objawów choroby.

2. Izolacja komórek T specyficznych względem antygenu

a. Izolacja monoklonalnych komórek T specyficznych względem antygenu

Komórki T mogą być aktywowane i ekspandowane w hodowli komórek przez inkubację z celem antygenowym i komórkami prezentującymi antygen. Po aktywacji, komórki T przechodzą złożoną kaskadę sygnalizacji komórkowej, która prowadzi do transkrypcji i ekspresji wielu produktów genu. Wynalazek tu opisany wykorzystuje produkty genów specyficzne dla aktywowanych komórek T dla identyfikacji i izolacji komórek T z pożądaną specyficznością antygenu.

W pierwszym aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na sposób izolacji komórki T, która jest specyficzna dla interesującego antygenu. Próbka zawierająca komórki T jest inkubowana z konkretnym antygenem, co powoduje aktywację komórki T specyficznej dla interesującego antygenu. Próbka może być inkubowana z antygenem przez 1 do 7 dni. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 1 dzień. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 16 godzin. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 12 godzin. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 8 godzin. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 4 godziny. Próbka może być także inkubowana z antygenem przez mniej niż 2 godziny.

Komórka T specyficzna dla interesującego antygenu może być następnie izolowana przez selekcję komórek T, które wyrażają produkty genów komórek T aktywowanych jak opisano powyżej. Podzbiory komórek T mogą być izolowane przez wybranie komórek T z produktami specyficznymi dla podzbioru genów lub markerów powierzchniowych komórek (np. CD4 w stosunku do CD8).

Interesujący antygen obejmuje zasadowe białko mieliny (MBP), białko proteolipidu (PLP), glikoproteinę mieliny oligodendrocytów (MOG) lub ich fragment. Interesujący antygen może być też immunodominującym fragmentem obejmującym, ale nie ograniczonym, do reszt 83-99 lub reszt 151-170 MBP. Interesujący antygen może być też kombinacją dwóch lub więcej poszczególnych interesujących antygenów.

Antygen lub jego pochodna stosowany do aktywacji komórek T może być dowolnym immunogenem, który jest zdolny do wywołania odpowiedzi odpornościowej na interesujący antygen. Aktywujący antygen może być interesującym antygenem lub jego pochodną. Aktywujący antygen może być MBP, PLP, MOG lub ich fragmentem i/lub pochodną. Aktywujący antygen może także być immunodominującym fragmentem obejmującym, ale nie ograniczonym do, reszty 83-99 lub reszty 151-170 MBP lub ich fragmentem i/lub pochodną. Aktywujący antygen może być też kombinacją dwóch lub więcej poszczególnych aktywujących antygenów. Aktywujący antygen może być stosowany jeden lub więcej razy aby aktywować komórki T specyficzne dla interesującego antygenu.

Komórki T mogą być obecne w dowolnej próbce zawierającej komórki jednojądrowe. Próbka może być izolowana z krwi obwodowej lub z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta z MS lub z płynu maziówkowego pacjenta RA. Komórki T z pacjentów z innymi chorobami autoimmunizacyjnymi mogą być podobnie izolowane z krwi obwodowej i/lub tkanek związanych z chorobą. Komórki jednojądrowe mogą być wzbogacone w próbce przez stosowanie technik wirowania znanych w dziedzinie obejmujących, ale nie ograniczonych do, gradienty Ficoll®. Komórki T mogą być także wzbogacone w próbce stosując selekcję pozytywną, selekcję negatywną lub ich kombinację dla ekspresji produktów genów komórek T.

Produkt genu dla identyfikacji lub negatywnej selekcji aktywowanych komórek T może być markerem powierzchniowym komórki lub cytokiną lub ich kombinacją. Markery powierzchniowe komórki dla identyfikacji aktywowanych komórek T obejmują, ale nie są ograniczone do, CD69, CD4, CD6, CD25, HLA-DR, CD28 i CD134. CD69 jest wczesnym markerem aktywacji spotykanym na limfocytach B i T, komórkach NK i granulocytach. CD25 jest receptorem IL-2 i jest markerem dla aktywowanych komórek T i komórek B. CD4 jest koreceptorem TCR i jest markerem dla tymocytów, komórek T typu TH1 i TH2, monocytów i makrofagów. CD8 jest także koreceptorem TCR i jest markerem dla cytotoksycznych komórek T. CD134 jest wyrażany tylko na aktywowanych komórkach T CD4⁺.

Markery powierzchniowe komórki dla negatywnej selekcji aktywowanych komórek T obejmują, ale nie są ograniczone do, CD36, CD40 i CD44. CD28 działa jako stymulujący szlak aktywacji komórek T niezależny od szlaku receptora komórek T i jest wyrażany na komórkach CD4⁺ i CD8⁺.

PL 214 283 B1

CD36 jest glikoproteiną membranową i jest markerem dla płytek, monocytów i komórek śródbłonka. CD44 jest markerem dla makrofagów i innych komórek fagocytujących. Podzbiory komórek T mogą być izolowane stosując selekcję pozytywną, selekcję negatywną, lub ich kombinację do ekspresji produktów powierzchniowych komórki komórek pomocniczych T lub cytotoksycznych komórek T (np. CD4 w stosunku do CD8).

Cytokiny dla identyfikacji aktywowanych komórek T według wynalazku obejmują, ale nie są ograniczone do, cytokiny produkowane przez komórki T typu TH1 (odpowiedź z udziałem komórek) i komórek typu TH2 (odpowiedź przeciwciał). Cytokiny do identyfikacji aktywowanych komórek T typu

T_H1 obejmują, ale nie są ograniczone do, IL-2, interferon gamma (yIFN) i tkankowy czynnik nekrozy guzów alfa (TNFa). Cytokiny do identyfikacji aktywowanych komórek T typu TH2 obejmują, ale nie są ograniczone do, IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13. Podzbiory komórek T mogą być także izolowane stosując selekcję pozytywną, selekcję negatywną lub ich kombinację dla ekspresji cytokinowych produktów genów komórek T pomocniczych lub cytotoksycznych komórek T (np. yIFN w stosunku do IL4).

Aktywowana komórka T typu TH1 specyficzna dla interesującego antygenu może być izolowana przez identyfikację komórek, które wyrażają CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNy, TNFα lub ich kombinację. Aktywowana komórka T typu TH1 specyficzna dla interesującego antygenu może być także izolowana przez identyfikację komórek, które wyrażają CD69 i CD4 razem z IFNy lub TNFα. Aktywowana komórka T typu TH2 specyficzna dla interesującego antygenu może być izolowana przez identyfikację komórek, które wyrażają CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 lub ich kombinację. Kombinacja aktywowanej komórki T typu TH1 i komórki T typu TH2 specyficznej dla interesującego antygenu może być identyfikowana przez identyfikację komórek, które wyrażają CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNy, TNFα lub ich kombinację, i komórek, które wyrażają CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 lub ich kombinację.

Produkty genów stosowane do pozytywnej lub negatywnej selekcji aktywowanych komórek T według wynalazku mogą być identyfikowane za pomocą technik immunoselekcji znanych osobom biegłym w dziedzinie, które stosują przeciwciała obejmujące, ale nie ograniczone do, aktywowane fluorescencją sortowanie komórek (FACS), magnetyczne sortowanie komórek, selekcję i chromatografię. Immunoselekcja dwóch lub więcej markerów na aktywowanych komórkach T może być wykonana w jednym lub więcej etapów, gdzie każdy etap pozytywnie lub negatywnie selekcjonuje jeden lub więcej markerów. Gdy immunoselekcja dwóch lub więcej markerów jest wykonywana w jednym etapie stosując FACS, dwa lub więcej przeciwciała mogą być znakowane różnymi fluoroforami.

Magnetyczne sortowanie komórek może być przeprowadzone stosując superparamagnetyczne mikropaciorki złożone z tlenku żelaza i powłoczki polisacharydowej. Korzystnie mikropaciorki mogą mieć około 50 nanometrów średnicy i mają objętość około jednej milionowej typowej komórki ssaka. Mikropaciorki są korzystnie na tyle małe by pozostawały w zawiesinie koloidalnej, co pozwala na szybkie, wydajne wiązanie do antygenów powierzchniowych komórki. Mikropaciorki korzystnie nie interferują z cytometrią przepływową, są biodegradowalne, i mają pomijalny wpływ na funkcje komórkowe. Sprzęgnięcie przeciwciał do mikropaciorków może być bezpośrednie lub pośrednie przez drugie przeciwciało do ligandu takiego jak fluoresceina.

Przeciwciało może być z klas IgG, IgM, IgA, IgD i IgE lub ich fragmentów lub pochodnych obejmując Fab, F(ab')2, Fd i przeciwciała jednołańcuchowe, diaprzeciwciała, bispecyficzne przeciwciała, bifunkcjonalne przeciwciała i ich pochodne. Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym, przeciwciałem poliklonalnym, przeciwciałem oczyszczonym za pomocą powinowactwa, lub ich mieszaniną, które wykazuje dostateczną specyficzność wiązania do epitopu produktu genu specyficznego dla aktywowanych komórek T lub sekwencji od nich pochodzącej. Przeciwciało może być też przeciwciałem chimerycznym.

Przeciwciało może być derywatyzowane przez przyłączenie jednego lub więcej związków chemicznych, peptydów lub reszt polipeptydu znanych w dziedzinie, które pozwalają na identyfikację i/lub selekcję aktywowanej komórki T, do której jest związane przeciwciało. Aktywowana komórka T związana z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem może być izolowana stosując techniki obejmujące, ale nie ograniczone do, aktywowanego fluorescencją sortowania komórek (FACS). Przeciwciało może także być koniugowane z cząsteczką magnetyczną taką jak paramagnetyczny mikropaciorek (Milthenyi Biotec, Niemcy). Aktywowana komórka T związana przez magnetycznie znakowane przeciwciało może być izolowana stosując techniki obejmujące, ale nie ograniczone do, magnetyczne sortowanie komórek.

Dla produktów genu wyrażanych na powierzchni komórek, przeciwciało może wiązać się bezpośrednio do produktu genu i może być stosowane do selekcji komórek. Dla produktów genów na

PL 214 283 B1 powierzchni komórek wyrażanych w niskich stężeniach, do selekcji komórek można stosować magnetofluorescencyjne liposomy (Scheffold i wsp. Nature Med. 6:107-110, 2000). Na niskich poziomach ekspresji konwencjonalne fluorescencyjnie znakowane przeciwciała mogą nie być dostatecznie czułe, aby wykryć obecność wyrażanego produktu genu na powierzchni komórki. Można koniugować liposomy zawierające fluorofory do przeciwciał o interesującej specyficzności w ten sposób pozwalając na detekcję produktu genu wyrażanego na powierzchni komórki.

Dla wewnątrzkomórkowych produktów genów takich jak cytokiny przeciwciało może być stosowane po permeabilizacji komórek. Alternatywnie, aby uniknąć zabijania komórek przez permeabilizację, wewnątrzkomórkowy produkt genu, jeśli jest ostatecznie wydzielany z komórki, może być wykryty gdy jest wydzielany przez błonę komórkową stosując „wychwytujące” przeciwciało na powierzchni komórki. Przeciwciało wychwytujące może być podwójnym przeciwciałem, które jest specyficzne dla dwóch różnych antygenów: (i) wydzielanego interesującego produktu genu i (ii) białka powierzchniowego komórki. Białko powierzchniowe komórki może być dowolnym markerem powierzchniowym obecnym na komórkach T, w szczególności, lub ogólnie na limfocytach (np. CD45). Przeciwciało wychwytujące może najpierw wiązać się do białka powierzchniowego komórki i następnie wiązać się do wewnątrzkomórkowego interesującego produktu genu, gdy jest wydzielany przez błonę, w ten sposób zatrzymując produkt genu na powierzchni komórki. Znakowane przeciwciało specyficzne dla wyłapanego produktu genu może być stosowane do wiązania do wyłapanego produktu genu, co pozwala na selekcję aktywowanej komórki T (Manz i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1921-1925, 1995, włączone tu w formie odniesienia).

Pewne formy cytokin także spotyka się wyrażane w niskim stężeniu na powierzchni komórki. Na przykład yIFN jest eksponowany w niskim stężeniu na powierzchni komórki z kinetyką podobną do tej dla wewnątrzkomórkowej ekspresji yIFN (Assenmacher i wsp. Eur. J. Immunol, 1996, 26:263-267). Dla form cytokin wyrażanych na powierzchni komórki, można stosować konwencjonalne fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, lub można stosować liposomy zawierające fluorofory do detekcji interesującej cytokiny. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie rozpozna inne techniki wykrywania i selekcji zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych produktów genów specyficznych dla aktywowanych komórek T.

Komórki T izolowane przez obecny wynalazek mogą być wzbogacone o przynajmniej 90% z całej krwi. Komórki T mogą być także wzbogacone o przynajmniej 95% z całej krwi. Komórki T mogą być także wzbogacone o przynajmniej 98% z całej krwi. Komórki T mogą być także wzbogacone o przynajmniej 99,5% z całej krwi.

b. Izolowane monoklonalne komórki T specyficzne względem antygenu

W drugim aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na komórkę T specyficzną dla interesującego antygenu izolowaną za pomocą sposobu według pierwszego aspektu tego wynalazku.

c. Izolowane poliklonalne komórki T specyficzne względem antygenu

W trzecim aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na sposób izolacji komórek T, które są specyficzne względem jednego lub więcej interesujących antygenów. Próbkę zawierającą komórki T inkubuje się z jednym lub więcej antygenami, co powoduje aktywację komórek T specyficznych dla jednego lub więcej antygenów. Komórki T specyficzne dla jednego lub więcej antygenów mogą następnie być wyizolowane jak w pierwszym aspekcie tego wynalazku.

Komórki T mogą mieć heterogenny wzór używania genu Vβ-Dβ-Jβ, który wyraża różne TCR, które są każdy specyficzny dla interesującego antygenu. Komórki T mogą mieć także heterogenny wzór używania genu Vβ-Dβ-Jβ, który wyraża różne TCR, które są specyficzne dla więcej niż jednego interesującego antygenu. Jak opisano poniżej, komórki T zawierające heterogenny wzór używania genu Vβ-Dβ-Jβ mogą być stosowane do formułowania poliklonalnej szczepionki komórek T, która może zapobiegać rozszerzaniu się epitopu u szczepionych pacjentów.

d. Izolowane poliklonalne komórki T specyficzne względem antygenu

W czwartym aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na komórki T specyficzne dla jednego lub więcej interesujących antygenów izolowane za pomocą sposobu według trzeciego aspektu obecnego wynalazku.

3. Oznaczenie ilościowe liczby komórek T specyficznych względem antygenu

W piątym aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na sposób oznaczania względnej częstości komórek T specyficznych dla jednego lub więcej interesujących antygenów w próbce przez oznaczenie ilości komórek T izolowanych za pomocą sposobu według pierwszego lub trzeciego aspektu obecnego wynalazku.

PL 214 283 B1

4. Diagnostyka choroby autoimmunizacyjnej

W szóstym aspekcie obecnego wynalazku pacjent z chorobą autoimmunizacyjną może być diagnozowany przez uzyskanie próbki od pacjenta i izolację autoreaktywnych komórek T za pomocą sposobu według pierwszego lub trzeciego aspektu wynalazku. Choroba autoimmunizacyjna może być diagnozowana przez porównanie poziomu autoreaktywnych komórek T u pacjenta z kontrolą. Poziom autoreaktywnych komórek T może być oznaczony zgodnie z piątym aspektem wynalazku.

5. Monitorowanie postępu choroby autoimmunizacyjnej

W siódmym aspekcie obecnego wynalazku choroba autoimmunizacyjna może być monitorowana przez oznaczenie częstości autoreaktywnych komórek T w próbce od pacjenta z chorobą autoimmunizacyjną zgodnie z piątym aspektem obecnego wynalazku. Ostrość objawów choroby autoimmunizacyjnej może korelować z liczbą autoreaktywnych komórek T. Dodatkowo zwiększenie liczby autoreaktywnych komórek T w próbce może być stosowane jako wskazanie do stosowania terapii mających W na celu minimalizowanie ostrości objawów i/lub leczenie choroby przez pojawieniem się objawów.

6. Produkowanie szczepionki do leczenia choroby autoimmunizacyjnej

W ósmym aspekcie obecnego wynalazku może być wyprodukowana kompozycja do leczenia choroby autoimmunizacyjnej przez inaktywację autoreaktywnych komórek T, które były izolowane (i dowolnie ekspandowane w hodowli jak tu opisano) za pomocą sposobu według pierwszego lub trzeciego aspektu tego wynalazku. Autoreaktywne komórki T mogą być inaktywowane stosując szereg technik znanych w dziedzinie obejmujących, ale nie ograniczonych do, inaktywację chemiczną lub napromieniowanie. Autoreaktywne komórki T mogą być konserwowane albo przed albo po inaktywacji stosując szereg technik znanych osobom biegłym w dziedzinie obejmujących, ale nie ograniczonych do, krioprezerwację. Jak opisano poniżej, kompozycja może być stosowana jako szczepionka aby zmniejszyć liczbę autoreaktywnych komórek T u pacjentów z autoimmunizacją.

Kompozycja może być kompozycją farmaceutyczną, która może być produkowana stosując sposoby dobrze znane w dziedzinie. Kompozycje farmaceutyczne stosowane jako terapeutyki prekliniczne i kliniczne w leczeniu choroby lub zaburzeń mogą być produkowane przez osoby biegłe w dziedzinie stosując przyjęte zasady diagnozy i terapii. Takie zasady są znane w dziedzinie i są przedstawione, na przykład, w Braunwald i wsp., red., Harrison's Principles of Internal Medicine, wyd. 11, McGraw-Hill, wydawca, Nowy Jork, N.Y. (1987), które jest tu włączone w formie odniesienia. Kompozycja farmaceutyczna może być podana dowolnemu zwierzęciu, które może odczuć korzystne efekty kompozycji. Zwierzęta otrzymujące kompozycję farmaceutyczną mogą być ludźmi lub innymi ssakami.

a) Szczepionka

W dziewiątym aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na kompozycję wyprodukowaną sposobem według ósmego aspektu wynalazku. Kompozycja może być szczepionką, która może być stosowana, aby zmniejszyć liczbę autoreaktywnych komórek T u pacjentów z autoimmunizacją.

7. Leczenie choroby autoimmunizacyjnej

W dziesiątym aspekcie choroba autoimmunizacyjna może być leczona u pacjentów z autoreaktywnymi komórkami T przez podanie kompozycji według dziewiątego aspektu wynalazku. Kompozycja może być szczepionką, co może doprowadzić do zmniejszenia liczby autoreaktywnych komórek T u pacjentów. Szczepionka może zawierać autoreaktywne komórki T zawierające homogenne („monoklonalne”) lub heterogenne („poliklonalne”) wzory używania genu νβ-ϋβ-ϋβ. Badania kliniczne wykazują, że pacjenci z autoimmunizacją otrzymujący szczepienie autologicznymi monoklonalnymi komórkami T mogą wykazywać stopniowe zmniejszenie odporności na reagujące z mieliną komórki T. W niektórych przypadkach pojawiające się ponownie autoreaktywne komórki T mogą pochodzić z różnych populacji klonalnych sugerując, że reagujące z mieliną komórki T mogą przechodzić przesunięcie klonalne lub rozszerzanie się epitopu potencjalnie związane z trwającym procesem choroby. Przesunięcie klonalne lub rozszerzanie epitopu może być problemem w chorobach autoimmunizacyjnych z udziałem autoreaktywnych komórek T. Szczepionka zawierająca poliklonalne autoreaktywne komórki T zdolne do usuwania wielu populacji autoreaktywnych komórek T może uniknąć problemów z przesunięciem klonalnym lub rozszerzaniem się epitopu.

Kompozycja może być kompozycją farmaceutyczną, która jest podawana w dowolny sposób aby osiągnąć zamierzony cel. Na przykład podanie może być drogą pozajelitową, podskórną, dożylną, dotętniczą, śródskórną, domięśniową, dootrzewnową, przezskórną, przez śluzówki, do mózgu, dooponowo lub dokomorowo. Alternatywnie lub równocześnie, podawanie może być drogą doustną.

PL 214 283 B1

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane pozajelitowo przez iniekcję pojedynczej dużej dawki lub stopniowy wlew w czasie.

Podawana dawka może zależeć od wieku, płci, zdrowia i masy biorcy, rodzaju równocześnie podawanej terapii, jeśli jest stosowana, częstości terapii, i charakteru pożądanego efektu. Zakresy dawki do podawania kompozycji farmaceutycznych mogą być dostatecznie duże by wywołać pożądany efekt, przez co, na przykład, autoreaktywne komórki T ulegają usuwaniu, co mierzy się za pomocą siódmego aspektu tego wynalazku, i znacząco zapobiega się, suprymuje lub leczy chorobę autoimmunizacyjną. Dawki mogą nie być takie duże by powodowały efekty uboczne, takie jak niepożądane reakcje krzyżowe, uogólnioną immunosupresję, reakcje anafilaktyczne i tym podobnie.

Kompozycje farmaceutyczne mogą dalej zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmujące zarobki i środki pomocnicze, które mogą ułatwiać obróbkę aktywnych kompozycji do preparatów, które mogą być stosowane farmaceutycznie. Dodatki do kompozycji farmaceutycznych mogą obejmować włączenie adiuwantu takiego jak ałun, chitosan, lub inne adiuwanty znane w dziedzinie (patrz Warren i wsp. Ann. Rev. Immunol. 4:369-388 (1986); Chedid, L. Feder. Proc. 45:2531 -2560 (1986), które są tu włączone w formie odniesienia. Kompozycje farmaceutyczne mogą także dalej zawierać liposomy aby zwiększyć dostarczanie lub bioaktywność, stosując metody i związki znane w dziedzinie.

Odpowiednie formuły do podawania pozajelitowego obejmują wodne zawiesiny inaktywowanych autoreaktywnych komórek T, na przykład, rozpuszczalne w wodzie sole w roztworze wodnym. Dodatkowo mogą być podawane zawiesiny olejowe zawierające inaktywowane autoreaktywne komórki T. Odpowiednie rozpuszczalniki lub nośniki lipofilowe obejmują oleje tłuszczowe, na przykład olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, na przykład oleinian etylu lub triglicerydy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny i obejmują, na przykład, karboksymetylocelulozę sodową, sorbitol i/lub dekstran. Zawiesina może też zawierać stabilizatory.

Inaktywowane autoreaktywne komórki T mogą być formułowane stosując konwencjonalne dopuszczalne farmaceutycznie pozajelitowe nośniki do podawania w formie iniekcji. Te nośniki mogą być nietoksyczne i terapeutyczne, i szereg formuł przedstawiono w Remington's Pharmaceutical Sciences (powyżej). Nieograniczające przykłady zarobek to woda, sól fizjologiczna, płyn Ringera, roztwór dekstrozy i zrównoważony roztwór soli Hanka. Kompozycje farmaceutyczne mogą też zawierać niewielkie ilości dodatków takich jak substancje, które utrzymują izotoniczność, fizjologiczny pH i stabilność.

Inaktywowane autoreaktywne komórki T mogą być formułowane przy całkowitych stężeniach komórek zawierających od około 5 x 10² komórek/ml do około 1 x 10⁹ komórek/ml. Korzystne dawki inaktywowanych autoreaktywnych komórek T do stosowania w zapobieganiu, supresji lub leczeniu choroby autoimmunizacyjnej mogą być w zakresie około 2 x 10⁶ komórek/ml do około 9 x 10⁷ komórek/ml.

8. Określenie repertuaru komórek T

W jedenastym aspekcie obecny wynalazek jest skierowany na sposób określenia repertuaru kwasów nukleinowych kodujących jeden lub więcej receptorów komórek T lub ich części u pacjenta z autoimmunizacją przez amplifikację kwasów nukleinowych kodujących jeden lub więcej receptorów komórek T z komórek T izolowanych za pomocą pierwszego lub trzeciego aspektu wynalazku, gdzie ta amplifikacja jest przeprowadzana stosując parę starterów. Pierwszy starter pary starterów może być oligonukleotydem około 15 do 30 nukleotydów długości, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego zawierającego region zmienny genu TCR. Drugi starter pary starterów może być oligonukleotydem około 15 do 30 nukleotydów długości, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego zawierającego region stały genu TCR. Para starterów może być stosowana do amplifikacji kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje do regionu Vβ-Dβ-Jβ genu TCR.

Kwasy nukleinowe kodujące jeden lub więcej receptorów z komórek T („Sekwencja Docelowa”) lub ich części mogą być amplifikowane z próbki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosując dowolną szczególną technikę PCR lub urządzenie znane w dziedzinie. Na przykład amplifikacja PCR może być według procedury, gdzie przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera następujące składniki: 5 μL, 10x buforu II do PCR (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl), 3 μL 25 mM MgCl₂, 1 μL mieszaniny 10 mM dNTP, 0,3 μL polimerazy Taq (5U^L (AmpliTagGold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.), 30 pmol pierwszego startera, 30 pmol drugiego startera i 1 μL DNA próbki. Polimeraza może być stabilna w temperaturze przynajmniej 95°C, mieć procesywność 50-60 i mieć tempo wydłużania większe niż 50 nukleotydów na minutę.

PL 214 283 B1

Reakcja PCR może być przeprowadzona z profilem amplifikacji 1 min w 95°C (denaturacja), 20 sek w 56°C (przyłączanie startera), i 40 sek w 72°C (wydłużanie) przez w sumie 40 cykli. Przed rozpoczęciem pierwszego cyklu, mieszanina reakcyjna może być poddana wstępnej denaturacji przez okres około 5 min do 15 min. Podobnie, po zakończeniu ostatniego cyklu, mieszanina reakcyjna może być poddana końcowemu wydłużaniu przez okres około 5 min do 10 min. Pewne reakcje PCR mogą działać z zaledwie 15 do 20 cyklami, lub aż 50 cyklami. W zależności od specyficznej reakcji PCR, dłuższe lub krótsze czasy inkubacji i wyższe lub niższe temperatury mogą być stosowane dla każdego etapu profilu amplifikacji.

Próbka zawierająca sekwencję docelową może być kwasem nukleinowym takim jak genomowy DNA, cDNA, DNA uprzednio amplifikowany za pomocą PCR lub dowolna inna forma DNA. Próbka może być izolowana bezpośrednio lub pośrednio z dowolnej tkanki zwierzęcej lub ludzkiej zawierającej komórki T, takiej jak jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PBMC). Genomowy DNA może być izolowany bezpośrednio z tkanki zawierającej komórki T. cDNA może być izolowany pośrednio stosując odwrotną transkrypcję mRNA bezpośrednio izolowanego z tkanki zawierającej komórki T.

Zdolność do detekcji Sekwencji Docelowej może być zwiększona przez izolację próbki DNA bezpośrednio przez amplifikację genomowego DNA, cDNA lub dowolnej inne formy DNA za pomocą procedury dwuetapowej PCR. Na przykład pierwsza reakcja amplifikacji PCR może być przeprowadzona aby amplifikować wstępny fragment, który jest większy od i obejmuje fragment, do którego pierwszy i drugi starter są zdolne do wiązania się selektywnie na przeciwnych niciach. Druga reakcja amplifikacji PCR może być wówczas przeprowadzona stosując pierwotny fragment jako matrycę z pierwszym i drugim starterem by zamplifikować fragment zawierający Sekwencję Docelową. Jeśli albo pierwszy albo drugi starter jest stosowany w pierwszej PCR aby amplifikować wstępny fragment, druga reakcja PCR jest „połowicznie zagnieżdżona”. Jeśli ani pierwszy ani drugi starter nie jest stosowany w pierwszej reakcji PCR aby zamplifikować wstępny fragment druga reakcja PCR jest „zagnieżdżona”.

W przykładowej dwuetapowej reakcji PCR, jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących jeden lub więcej receptorów komórek T z komórek T może być amplifikowany przez przeprowadzenie pierwszej reakcji PCR stosując pierwszy wstępny starter, który hybrydyzuje do regionu νβ genu TCR i drugi wstępny starter, który hybrydyzuje do regionu Cβ genu TCR, co amplifikuje wstępny fragment, który sięga od Vβ przez styk Vβ-Dβ-Jβ do Cβ, po czym przeprowadza się drugą reakcję PCR, która może być zagnieżdżona lub połowicznie zagnieżdżona. W świetle obecnego ujawnienia, osoba biegła w dziedzinie będzie zdolna do wybrania odpowiednich starterów i warunków reakcji do amplifikacji Sekwencji Docelowej za pomocą PCR.

Po amplifikacji sekwencji docelowej, amplifikowany produkt może być wykryty za pomocą szeregu procedur. Na przykład próbka produktu amplifikacji może być nałożona na żel do elektroforezy, do którego przykłada się pole elektryczne aby rozdzielić cząsteczki DNA na podstawie wielkości. W innym sposobie próbka produktu amplifikacji może być nałożony na żel barwiony zielenią SYBR, bromkiem etydyny lub inną cząsteczką, która będzie się wiązała do DNA i emitowała wykrywalny sygnał. Suszony żel może zawierać znakowany oligonukleotyd, który hybrydyzuje do sekwencji docelowej, z której można zrobić autoradiogram przez ekspozycję żelu na film.

Następujące przykłady są włączone by wykazać korzystne wykonania wynalazku. Osoby biegłe w dziedzinie docenią, że techniki ujawnione w następujących przykładach reprezentują techniki, dla których wynalazca stwierdził, że funkcjonują dobrze w praktyce wynalazku i tak więc mogą być uważane za stanowiące korzystne sposoby jego praktykowania. Jednak osoby biegłe w dziedzinie powinny docenić w świetle obecnego ujawnienia, że można wprowadzić wiele zmian do specyficznych wykonań, które są ujawnione i nadal uzyska się zbliżony lub podobny wynik bez oddalania się od ducha i zakresu wynalazku. W celu lepszego zrozumienia poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Izolacja reagujących z mieliną komórek T do szczepienia komórkami T

1.Przygotowanie PMBC i pierwotnych standardów

Próbki świeżej krwi od pacjentów z MS i pacjentów kontrolnych obrabiano w ciągu 2 godzin od zebrania. Alternatywnie można uzyskać jednojądrowe komórki z płynu mózgowo-rdzeniowego (CSFMC) pacjentów z MS. Jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PBMC) izolowano z pełnej krwi za pomocą standardowej metody rozdziału w gradiencie Ficoll. Specyficznie, heparynizowaną krew rozcieńczono zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) (1:1 krew/HBSS) i następnie powoli

PL 214 283 B1 nałożono na roztwór Ficoll-hypaque w probówce do wirowania i wirowano przez 20 minut przy 1800 obr/min, 18°C do 25°C, bez hamulca. PBMC następnie płukano przez dodanie nadmiaru HBSS i wirowano przy 1700 obr/min przez 10 min w 18°C do 25°C. Oczyszczone PBMC płukano trzy razy w podłożu RPMI 1640 przez wirowanie i następnie ponownie zawieszono w podłożu AIM V (Gibco, Grand Island, N.Y.). Policzono liczbę komórek i komórki wysiano na 96-studzienkowych płytkach do hodowli z denkami w kształcie U z gęstością 200000 komórek/studzienkę. Wszystkie płytki oznaczono numerem pacjenta i inicjałami pacjenta. Komórki inkubowano w 37°C w obecności syntetycznych peptydów wyliczonych w Tabeli 1 odpowiadających znanym immunodominującym regionom trzech peptydów mielinowych, zasadowego białka mielinowego (MBP), białka proteolipidu (PLP) i glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG) w stężeniu 20 μg/ml. Płytki umieszczono w inkubatorze CO₂ w 37°C i oglądano codziennie. Komórki hodowano przez 7-10 dni bez zmiany podłoża hodowlanego aby selektywnie wyhodować komórki T specyficzne względem antygenu.

T a b e l a 1 - Peptydy aktywujące

Peptydy antygenu mieliny	Sekwencje aminokwasów
Zasadowe białko mieliny, peptyd-1 (MBP-1)	ENPVVHFFKNIVTPRTP	SEQ ID NO.1
Zasadowe białko mieliny, peptyd-2 (MBP-2)	SKIFKLGGRDSRSGSPMARR	SEQ ID NO.2
Białko proteolipidu, peptyd-3 (PLP-3)	LFCGCGHEALTGTEKLIETY	SEQ ID NO.3
Białko proteolipidu, peptyd-4 (PLP-4)	WTTCQSIAFPSKTSASIGSL	SEQ ID NO.4
Glikoproteina mieliny oligodendrocytów, peptyd-6 (MOG-6)	GQFRVIGPRHPIRALVG	SEQ ID NO.5
Glikoproteina mieliny oligodendrocytów, peptyd-7 (MOG-7)	EVELPCRISPGKNATGMEVGW	SEQ ID NO.6

2. Identyfikacja i selekcja komórek T specyficznych względem antygenu

Komórki opisane powyżej następnie selekcjonuje się na ekspresję produktów genów wskazujących aktywowane komórki T. Patrz część 2(a) powyżej. Stosuje się Cytokine Catch Reagent (Miltenyi Biotec) do wykrycia wewnątrzkomórkowej cytokiny yIFN lub TNFα, gdy jest ostatecznie wydzielana z komórki. Pokrótce, Cytokine Catch Reagent (typowo bispecyficzne przeciwciało, które wiąże się zarówno do markera aktywowanych komórek T i wydzielanej cytokiny) inkubuje się najpierw z komórkami w 4-8°C aby związać cząsteczkę CD45 na powierzchniach komórek lub inny marker powierzchniowy aktywowanych komórek T taki jak CD69. Komórki ze związanym Cytokine Catch Reagent następnie inkubuje się w 37°C przez 45 minut aby pozwolić by yIFN lub TNFα w obrębie komórki także związał się z Cytokine Catch Reagent, gdy cytokina jest wydzielana z wnętrza komórki w czasie okresu inkubacji. yIFN lub TNFα, obecnie związany z powierzchnią komórki przez Cytokine Catch Reagent jest następnie wykrywany stosując przeciwciało specyficzne dla interesującej cytokiny koniugowane z fluorochromem PE.

Cząsteczki powierzchni komórki CD4 i CD69 są wykrywane stosując przeciwciała koniugowane z różnymi fluorochromami. Populacja komórek CD4⁺ jest wyselekcjonowana najpierw przez bramkowanie i następnie w obrębie tej populacji „podwójnie dodatnie” (tzn. CD69 i IFNy lub CD69 i TNFα) barwione komórki oddziela się za pomocą FACS i zbiera aseptycznie.

Wyizolowane reagujące z mieliną komórki T następnie bezpośrednio poddaje się ekspansji przez stymulację rIL-2, PHA, anty-CD3 lub innym ogólnym miogenem komórek T w obecności napromieniowanych autologicznych PBMC przez 7-10 dni. Reagujące z mieliną linie komórek T namnażano w hodowli aż całkowita liczba komórek osiągnęła około 20 milionów.

P r z y k ł a d 2

Diagnoza MS

Od pacjenta zbiera się dwa do 100 ml krwi i dodaje się bezpośrednio jeden lub więcej peptydów syntetycznych do pełnej krwi by „prymować” czyli stymulować limfocyty T. Peptydy odpowiadają znanym immunodominującym regionom trzech białek mielinowych, zasadowego białka mieliny (MBP), białka proteolipidu (PLP) i glikoproteiny mieliny oligodendrocytów. Krew inkubuje się z peptydami 1 do 7 dni

PL 214 283 B1 aby zaktywować specyficzne dla mieliny komórki T. Na koniec tego okresu prymowania antygenem, komórki ponownie prowokuje się antygenami w krótkim oznaczeniu restymulacji.

Komórki T aktywowane peptydem mieliny wykrywa się przez permeabilizację komórki roztworem detergentu, płukanie komórek a następnie inkubację z jednym lub więcej barwiącymi przeciwciałami aby wykryć cząsteczki CD4 lub CD69 na powierzchni komórki lub IFNy lub TNFα wewnątrzkomórkowo. Barwiące przeciwciała koniuguje się do różnych fluorochromów tak, że fluoryzują przy różnych długościach fali, gdy są wzbudzane laserem 488 nm, za pomocą analizy FACS. Najpierw wybiera się populację komórek T CD4⁺ przez stosowanie komórek CD4⁺ do bramkowania a następnie w obrębie tej populacji identyfikuje komórki, które są immunoreaktywne z obydwoma przeciwciałami (CD69 i IFNy lub CD69 i TNFα). Wykazano, że ta populacja „podwójnie pozytywnych” reagujących z mieliną komórek T wzrasta znacząco u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) w porównaniu ze zdrowymi kontrolami w podobnych badaniach (Fig. 1, pacjent MS, Fig. 2, zdrowa kontrola). Stosując tę metodę można oznaczyć liczbę reagujących z mieliną komórek T krążących w krwi pacjenta przed, w czasie i po terapii aby określić wpływ terapii MS na autoreaktywną populację komórek T. Punkt końcowy może być oznaczony jako albo procent dodatnich podwójnie barwionych komórek albo jako absolutna liczba dodatnich podwójnie barwionych komórek.

P r z y k ł a d 3

Diagnoza MS stosując liposomy koniugowane z przeciwciałem

Uzyskuje się pełną krew od pacjenta i stymuluje jednym lub więcej syntetycznym peptydem jak opisano w Przykładzie 2. Krew inkubuje się z peptydami przez 3 do 16 godzin aby zaktywować specyficzne względem mieliny komórki T. Na koniec tego okresu prymowania antygenem, komórki można poddać ponownej prowokacji antygenami w krótkim oznaczeniu restymulacji przed barwieniem magnetofluorescencyjnymi liposomami koniugowanymi do przeciwciał przeciwko IFNy, TNFα lub ich kombinacji. Komórki także barwi się przeciwciałem na CD4 i/lub CD69. Barwione reagujące z mieliną komórki T wykrywa się jak opisano w Przykładzie 2.

P r z y k ł a d 4

Określenie repertuaru klonalnego TCR

Repertuar klonalny receptora komórek T (TCR) reprezentowany w populacji komórek może być analizowany przez wyizolowanie podwójnie dodatnio barwionych komórek za pomocą sortowania komórek jak opisano w Przykładzie 2 i Przykładzie 3. DNA ekstrahuje się z wyizolowanych komórek i stosuje do przeprowadzenia ilościowych oznaczeń z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) stosując startery oligonukleotydowe specyficzne dla 25 znanych rodzin zmiennego łańcucha beta (νβ). Ta procedura daje informację o dystrybucji wykorzystania genu νβ TCR i wskazuje klonalność patogennych populacji komórek T. Ta metoda może także być stosowana do oznaczania, czy klonalne lub epitopowe przesunięcie populacji komórek T reagujących z mieliną zachodzi u pacjenta MS.

P r z y k ł a d 5

Usuwanie komórek T reagujących z mieliną za pomocą szczepienia komórkami T

Pacjenci z MS z wznową-remisją (RR) i wtórnym postępującym (SP) MS otrzymali trzy podskórne zastrzyki napromieniowanych autologicznych reagujących z mieliną klonów komórek T izolowanych przez bezpośrednią ekspansję, z trzema dodatkowymi iniekcjami 4, 12 i 20 tygodni później. Pacjentów monitorowano pod kątem zmian w częstościach prekursorów komórek T reagujących z mieliną, częstości wznowy, expanded disability status score (EDSS - rozszerzona wartość niesprawności) i aktywności uszkodzeń MRI przez okres 24 miesięcy. Wyniki porównywano z wartościami przed szczepieniem stosując parowanie własne. Dodatkowo, włączono wyniki klinicznych danych grupy placebo RR-MS w próbie klinicznej interferonu-1a (Jacobs i wsp., 1996) i SP-MS w niedawnych badaniach beta-IFN-1b (European Study Group, Lancet, 352:1491-1497 (1998) by dostarczyć dane naturalnej historii MS w celu porównania. Częstość komórek T była albo niewykrywalna albo znacząco obniżona po szczepieniu w tygodniu 20. Wyniki potwierdziły zmniejszenie liczby reagujących z mieliną komórek T w wyniku szczepienia komórkami T u pacjentów z MS.

P r z y k ł a d 6

Szczepienie pacjenta MS stosując autologiczne komórki T reagujące z mieliną

Protokół szczepień jest podobny do tego stosownego w poprzednich badaniach klinicznych (Hang i wsp., 1993, Medaer i wsp., 1005). Pokrótce, klony komórek T reagujących z mieliną przygotowane według Przykładu 1 aktywowano fitohemaglutyniną (PHA) (4 μg/ml) w obecności napromieniowanych PBMC jako źródła komórek dodatkowych. Komórki następnie hodowano przez 10 dni w podłożach RPMI 1640 uzupełnionych 10% inaktywowaną termicznie ludzką surowicą AB i 100 jednostek

PL 214 283 B1 na mL rIL-2. Aktywowane reagujące z mieliną komórki T następnie płukano trzy razy sterylną solą fizjologiczną aby usunąć resztki PHA, rIL-2 i szczątki komórek i następnie zawieszono w 2 ml soli

137 fizjologicznej. Po napromieniowaniu (10000 rad, źródło ¹³⁷Ce) komórki wstrzyknięto podskórnie w dwa ramiona (1 ml/ramię). Liczba komórek T stosowanych do szczepienia jest w zakresie od 40 x 10⁶ do 80 x 10⁶ komórek na iniekcję i są wybrane przez ekstrapolację dawek komórek T skutecznych u zwierząt doświadczalnych na podstawie względnej powierzchni skóry (Ben-Nun i wsp., 1981). Każdy pacjent otrzymuje dwa podskórne zastrzyki po czym podaje się powtórzenia zastrzyków po 4, 12 i 20 tygodniach.

Pacjentów następnie obserwuje się od czasu początku potwierdzonej progresji niesprawności, EDSS, tempa wznowy i aktywności uszkodzeń MRI. Wyniki porównano z własnym przebiegiem przed terapią jak i grupami placebo dwóch niedawnych badań klinicznych u pacjentów z RR-MS i SP-MS, które służą jako oszacowanie naturalnej historii MS (Jacobs i wsp., 1996) European Study Group, 1998). Czas do progresji określa się przez wzrost przynajmniej 1,0 w EDSS (Poser i wSP., 1983) utrzymujący się przez przynajmniej 2 miesiące. W badaniach pogorszenie definiuje się przez pojawienie się nowych objawów neurologicznych lub pogorszenie już istniejących objawów neurologicznych trwających przynajmniej 48 godzin, czemu towarzyszą obiektywne zmiany przy badaniu neurologicznym (pogorszenie przynajmniej 0,5 punkta na EDSS). Pacjentów instruuje się, by donosili o zdarzeniach pomiędzy planowanymi wizytami i są oni badani przez neurologa, jeśli objawy wskazują na pogorszenie. Oceny bezpieczeństwa obejmowały niekorzystne zjawiska, oznaki życiowe i badania fizyczne przy regularnych wizytach. Różnice w zmiennych klinicznych u pacjentów z badania przed i po szczepieniu komórkami T analizuje się stosując test Wilcoxa sumy rang.

P r z y k ł a d 7

Zmiana przebiegu klinicznego MS po szczepieniu

Pacjenci otrzymują szczepienia komórkami T przygotowane według Przykładu 1 bez niekorzystnych efektów. Średni EDSS spada u pacjentów z RR-MS przez okres 24 miesięcy po szczepieniu. W porównaniu, obserwowano wzrost średniego EDSS o 0,61 w naturalnej historii RR-MS (n=56) przez ten sam okres obserwacji, jak doniesiono w próbie przeprowadzonej stosując próbę beta-IFN-1a (Jacobs i wsp., 1996). Dodatkowo proporcja pacjentów, którzy mają albo niezmieniony albo poprawiony EDSS jest wyższa niż przy naturalnej historii MS. Niewielu, o ile jacykolwiek, pacjentów w traktowanej grupie RR-MS ma progresję ponad EDSS 2,0 w ciągu 24 miesięcy w porównaniu z 18% pacjentów w naturalnej historii MS.

W kohorcie SP-MS, średni EDSS postępuje wolniej przez okres 24 miesięcy w porównaniu z +0,6 zapisanym w naturalnej historii SP-MS (European Study Group, Lancet 1998;352:1491-1497). Co więcej, szacowanie czasu do potwierdzonej progresji stosując metodę Kaplana-Meiera wykazuje znaczne opóźnienie w porównaniu z naturalną historią pacjentów MS (20% progresji w 12 miesięcy dla RR-MS i 9 miesięcy dla SP-MS) (Jacobs i wsp., Ann. Neurol, 1996;285-295, European Study Group, 1998).

PL 214 283 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Baylor College of Medicine

	Opexa Pharmaceuticals Inc. Zhang, Jingwu Z
<120>	Izolacja i identyfikacja komórek T
<130>	213838-00068
<150>	OS 60/402,521
<151>	2002-08-08
<160>	6
<170>	Patentln version 3.1
<210>	1
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Syntetyczna

<220>

<221>	PEPTYD
<222>	(1)·.(17)
<223>	aminokwasy 110 do 126 ludzkiego zasadowego białka mieliny
<400>	1

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

PL 214 283 B1

Pro <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Syntetyczna <22O>

<221> PEPTYD <222> (1)..(20) <223> aminokwasy 167 do 186 ludzkiego zasadowego białka mieliny <400> 2

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro 15 10 15

Met Ala Arg Arg 20 <210> 3 <21i> 20 <212> PRT <213> Syntetyczna <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(20) <223> aminokwasy 31 do 50 ludzkiego białka proteolipidu mieliny <400> 3

Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu 15 10 15

PL 214 283 B1

Ile Glu Thr Tyr 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Syntetyczna <22O>

<221> PEPTYD <222> (1)..(20) <223> aminokwasy 181 do 200 ludzkiego białka proteolipidu mieliny <400> 4

Trp Thr Thr Cys Głn Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser 15 10 15

ILe Gly Ser Leu 20 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Syntetyczna <220>

<221> PEPTYD <222> (1)..(17) <223> aminokwasy 1 do 17 ludzkiej glikoproteiny mieliny oligodendrocytów <400> 5

Gly Gin Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

10 15

PL 214 283 B1

Gly <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Syntetyczna <22O>

<221> PEPTYD <222> {1)..(21) <223> aminokwasy 18 do 38 ludzkiej glikoproteiny mieliny oligodendrocytów <400> 6

Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly 1 5 10 15

Met Glu Val Gly Trp

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób izolacji komórek T specyficznych dla kombinacji antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym, znamienny tym, że obejmuje:

   (a) inkubację próbki zawierającej komórki T z kombinacją antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym, (b) wybranie komórek T specyficznych dla antygenów, w których zachodzi ekspresja co najmniej jednego pierwszego markera wybranego z grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFNgamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kombinacja antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym zawiera co najmniej dwa antygeny wybrane z grupy złożonej z zasadowego białka mieliny, białka proteolipidu, glikoproteiny oligodendrocytów mieliny, fragmentu zasadowego białka mieliny, fragmentu białka proteolipidu, i fragmentu glikoproteiny oligodendrocytów.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kombinacja antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym obejmuje sekwencje SEQ ID NO: 1-6.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez 1 do

   7 dni.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 1 dzień.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 16 godzin.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 12 godzin.

   PL 214 283 B1
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 8 godzin.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 4 godziny.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że antygen jest inkubowany z próbką przez mniej niż 2 godziny.
11. 11. Sposób wytwarzania autologicznej szczepionki komórek T, znamienny tym, że obejmuje:

    (a) uczulanie [priming] próbki zawierającej komórki T z kombinacją autoantygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO:1-6, (b) wybranie komórek T specyficznych dla autoantygenów, które wyrażają co najmniej jeden pierwszy marker wybrany z grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFNgamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13; i (c) inaktywację autoreaktywnych komórek T.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że ponadto obejmuje rosnącą liczbę autoreaktywnych komórek T wybranych w etapie (b).
13. 13. Autologiczna szczepionka komórek T, znamienna tym, że zawiera inaktywowane komórki T reaktywne względem kombinacji antygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO: 1-6 i eksprymująca co najmniej jeden pierwszy marker wybrany spośród grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFNgamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13.
14. 14. Autologiczna szczepionka komórek T według zastrz. 13, znamienna tym, że komórki T są inaktywowane przez napromieniowanie.
15. 15. Autologiczna szczepionka komórek T według zastrz. 13, znamienna tym, że próbki zawierają autologiczne komórki T krwi obwodowej.
16. 16. Autologiczna szczepionka komórek T według zastrz. 13, znamienna tym, że próbki zawierają komórki T płynu mózgowo-rdzeniowego.
17. 17. Zastosowanie autologicznej szczepionki komórek T zawierającej inaktywowane komórki T reaktywne względem kombinacji antygenów zawierających sekwencje SEQ ID NO: 1-6 i eksprymujące co najmniej jeden pierwszy marker wybrany spośród grupy obejmującej CD69, CD4, CD25, CD36 i HLADR i co najmniej jeden drugi marker wybrany z grupy obejmującej IL-2, IFNgamma, TNFa, IL5, IL-10 i IL-13 do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego.

    Departament Wydawnictw UP RP