MXPA05001044A - Aislamiento e identificacion de celulas t. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con vacunas de celula T autologas mejoradas y metodos mejorados para su produccion. La invencion tambien esta dirigida a metodos para tratar enfermedades autoinmunes tales como esclerosis multiple o artritis reumatoide utilizando vacunas de celula T autologas. La invencion esta dirigida ademas al diagnostica de enfermedades asociadas con celula T.

Description

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS T CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con el campo de diagnóstico y tratamiento de enfermedad autoinmune, tal como esclerosis múltiples (MS) . Más particularmente, se relaciona con el aislamiento de células T especificas de antígeno. Además, la presente invención se relaciona con el uso de células T especificas de antigeno para el tratamiento de enfermedad autoinmune, tal como MS . ANTECEDENTES Los complejos de reconocimiento intercelular formados por receptores de célula T (TCR) en linfocitos T citotóxicos o células de ayuda de T y complejos de HMC/péptido en células que presentan antigeno (APC) son un componente de reconocimiento común en un grupo diversos de encuentros de célula-célula que activan células T tanto durante el desarrollo del repertorio de células T dentro del organismo de un individuo (selección positiva; selección negativa; supervivencia periférica) como durante el control (ayuda de T) y etapas de efector (exterminador de T) de una respuesta inmune de adaptación. - En la respuesta inmune de adaptación, los antigenos se reconocen por moléculas hipervariables, tales como anticuerpos o TCRs, que se expresan con estructuras suficientemente diversas para ser capaces de reconocer cualquier antigeno. Los anticuerpos se pueden ligar a cualquier parte de la superficie de un antigeno. Los TCRs, sin embargo, se restringen a ligarse a péptidos cortos ligados a las moléculas clase I o clase II del complejo de histocompatifailidad mayor (MHC) en la superficie de APCs . El reconocimiento de TCR de un complejo de péptido/MHC diapara la activación (expansión clonal) de la célula T. Los TCRs son heterodimeros compuestos de dos cadenas que pueden ser aß (alfa-beta) o ?d (gamma-delta) . La estructura de los TCRs es muy similar a aquella de inmunoglobulinas (Ig) . Cada cadena tiene dos dominios extracelulares, que son dobleces de inmunoglobulina. El dominio amino terminal es altamente variable y se lleva el dominio variable (V) . El dominio más cercano a la membrana es el dominio constante (C) . Estos dos dominios son análogos a aquellos de inmunoglobulinas, y se parecen a fragmentos Fab. El dominio V de cada cadena tiene tres regiones determinantes de complementaridad (CDR) : Próxima a la membrana, cada cadena TCR tiene una secuencia de conexión corta con un residuo de cisteina que forma un enlace de disulfuro entre ambas cadenas. Los genes que codifican heterodimeros aß o ?d solamente se expresan en la linea de célula T. Las cuatro ubicaciones TCR (a, ß. ? y d) tienen una organización de linea de germen muy similar a aquella de Ig. Las cadenas alfa y gamma se producen mediante redisposiciones de segmentos V y J mientras que las cadenas beta y delta se producen mediante redisposiciones de segmentos V, D, y J. los segmentos de gene para cadenas TCR están colocados en diferentes cromosomas, excepto los segmentos de gene de cadena delta que están entre los segmentos de gene V y J de la cadena alfa. La ubicación de los segmentos de gene de cadena delta tiene un significado: una redisposición productora de segmentos de gene de cadena alfa omite genes C de la cadena delta, de manera que en una celda determinada el heterodimero alfa-beta no se puede coexpresar con el receptor gamma-delta. En ratones, ya aproximadamente 500 genes Valfa y 50 Jalfa y solamente un segmento Caifa. La familia de gene de cadena delta tiene aproximadamente 10 segmentos de gene V, 2D y 2 J. La familia de gene de cadena beta tiene 20-30 segmentos V y dos repeticiones idénticas que contienen 1 Dbeta, 6 Jbeta y ICbeta. Finalmente, la familia de gene de cadena gamma contiene 7V y 3 repeticiones J-C diferentes. En los humanos, la organización es similar a aquella de ratones, pero el número de segmentos varia. Las redispositiciones de segmento de gene en cadenas alfa y beta es similar a aquella de Igs. La cadena alfa, como la cadena ligera de Ig se codifica mediante segmentos de gene V, J, y C. La cadena beta, como la cadena pesada de Ig, se codifica mediante segmentos de gene V, D y J. Las redisposiciones de segmentos de gene de cadena alfa resultan en unión de VJ y redisposiciones de cadena beta resultan en unión de VDJ. Después de transcripción de genes redispuestos, procesamiento de RNA, y traducción, las cadenas alfa y beta se expresan enlazadas por un enlace de disulfuro en la membrana de células T. Los segmentos de gene TCR están flanqueados en secuencias de señal de reconocimiento (RSS) que contienen un heptámero y un nonámero con una secuencia de intervención de ya sea 12 nucleótidos (un turno) o 23 nucleótidos (dos vueltas) . Como en Igs, las enzimas codificadas por genes de activación de recombinación (RAG-1 y RAG-2) son responsables por los procesos de recombinación. RAG1/2 reconoce las RSS y une segmentos V-J y V-D-J de la misma manera que en redisposiciones Ig. Brevemente, estas enzimas cortan una hebra de ADN entre el segmento de gene y las RSS y catalizan la formación de una horquilla en la secuencia de codificación. La secuencia de señal se corta subsecuentemente . La unión de combinación de segmentos V y J en cadenas alfa y segmentos V, D y J en cadenas beta produce un número grande de moléculas posibles, creando de esta manera una diversidad de TCRs. La diversidad también se logra en TCRs mediante la unión alternativa de segmentos de gene. En contraste con Ig, los segmentos de gene beta y delta se pueden unir en formas alternativas . Los segmentos de gene de flanco de RSS en segmentos de gene beta y delta pueden generar VJ y VDJ en la cadena beta, y VJ, VDJ, y VDDJ en la cadena delta. Como en el caso de Ig, la diversidad también se produce mediante variabilidad en la unión de segmentos de gene. Los lazos hipervariables del TCR conocidos como regiones que determinan la complementariedad (CDRs) reconocen la superficie compuesta hecha de una molécula de MHC y un péptido ligado. Los lazos CDR2 de alfa y beta hacen contacto solamente con la molécula MHC en la superficie de APC, mientras que los lazos CDR1 y CDR3 hacen contacto con ambos el péptido y molécula de MHC. Comparado con Ig, las TCRs tienen diversidad más limitada en el CDRÍ y CDR2. Sin embargo, la diversidad de los lazos CDR3 en TCRs es superior que aquel de Ig, debido a que las TCRs se pueden unir más que un segmento D que conduce a diversidad de junta aumentada. La patogénesis de un número de enfermedades autoinmunes se cree que se ocasiona por respuestas de célula T autoinmune a autoantigenos presentes en el organismo. No todas las células T autoreactivas se omiten en el timo, en contradicción con el paradigma de selección clonal. Aquellas células T con TCRs para un espectro amplio de autoantigenos representan parte del repertorio de celda T normal y circulan naturalmente en la periferia. No es claro por qué las células T autoreactivas se dejan, durante su evaluación, someterse a diferenciación en el timo y se acomodan en la periferia. Mientras que su papel fisiológico no se entiende, estas células T autoreactivas, cuando se activan, presentan un riesgo potencial en la inducción de patologías autoinmunes. las células T autoreactivas también se pueden aislar de individuos normales sin las consecuencias de enfermedades autoinmunes . Se ha establecido que el reconocimiento de antígeno de autoreactividad en sí no es suficiente para mediar el proceso autodestructivo . Uno de los requisitos previos para que las células T autoreactivas sean patógenas es que deben activarse. Las células T autoreactivas están implicadas en la patogénesis de enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis múltiple (MS) y artritis reumatoide (RA) . La patogénesis de células T autoreactivas en MS generalmente se mantiene para elevarse de respuestas de célula T a antígenos de mielina, en particular proteína básica de mielina (???'). Las células T reactivas de MBP se encuentra que se someten a activación en vivo, y ocurren a frecuencia de precursor superior en sangre un fluido cerebroespinal en pacientes con MS en oposición a individuos de control . Estas células T reactivas de MBP producen citoquinas TH1, v.gr., IL-2, TNFalfa, y gamma-interferón (IFNgamma), que facilitan la migración de células inflamatorias hacia el sistema nervioso central y exacerban las respuestas inflamatorias destructoras de mielina en MS . Las células T reactivas con mielina también han mostrado que están involucradas en la patogénesis de encefalomielitis autoinmune experimental (???) en animales, que se parece a MS. EAE se puede inducir activamente en animales susceptibles inyectando proteínas de mielina emulsionadas en un adyuvante o pasivamente inyectando líneas de célula T reactivas con mielina y clones derivados de animales sensibilizados con mielina. Cuando se activan in vitro, se requieren cantidades muy pequeñas de células T reactivas con mielina para inducir EAE, mientras que 200 veces más células T restantes con la misma reactividad son incapaces de mediar EAE. EAE ha mostrado que se evita y también se trata mediante vacuna con células T reactivas con mielina inactivadas, un procedimiento llamado vacuna de célula T (Ben-Nun y col., Nature, 1981; 292: 60-61). La vacuna de célula T induce respuestas inmunes regulatorias comprendidas de células T anti-idiotípicas y células T anti-ergotípicas, que conducen al agotamiento de células T reactivas con mielina. Agotando las células T reactivas con mielina, se observan efectos terapéuticos en EAE y otros modelos de Enfermedad autoinmune experimentales (Lider y col., Science, 1988; 239:820-822K; Lohse y col., Science, 1989/ 244:820-822) Debido al éxito de modelos de enfermedad autoinmune, la vacuna de célula T ha avanzado recientemente en pruebas clínicas en pacientes con MS. Basado en los resultados en modelos experimentales tales como EAE, se cree que el agotamiento de células T autoreactivas puede mejorar el curso clínico de MS y otras enfermedades autoinmunes. En una prueba clínica piloto, la vacunación con clones de célula T reactivos con MBP autólogos irradiados produjeron respuestas ce célula T citolítica CD8+ que células T reactivas con MBP circulante específicamente reconocidas y Usadas (Z ang y col., Science, 1993; 261: 1451-1454; Medaer y col., Lancet 1995: 346:807-808). Tres inoculaciones subcutáneas con clones de célula T reactivas con MBP irradiada resultaron en el agotamiento de células T reactivas con MBP circulantes en pacientes con MS. En una prueba clínica preliminar, células T reactivas con MEP circulantes se agotaron en pacientes de MS remitentes reincidentes y pacientes con MS progresiva secundaria (Zhang y col., J. Neurol . , 2002; 249:212-8), vacunando los pacientes con tres inyecciones subcutáneas de células T reactivas con MBP autólogas irradiadas. la vacuna de célula T fue benéfica a cada grupo de pacientes como se mite medíante régimen de marca de escala de incapacidad expandida, reincidente y actividad de lesión de MRI . Sin embargo, hubo una tendencia a una progresión acelerada después de aproximadamente doce meses después de la última inyección. El significado de la progresión acelerada aparente se desconoce, pero puede estar asociado con una declinación gradúan en la inmunidad inducida por vacuna de célula T contra células T reactivas de MBP. En aproximadamente 10-12% de los pacientes inmunizados, las células T reactivas con MBP aparecieron aproximadamente al mismo tiempo que la progresión acelerada. En algunos casos, las células T reactivas con MBP reaparecidas originadas de las poblaciones clones diferentes que no fueron detectadas antes de la vacuna, sugiriendo que las células T reactivas a MBP se pueden someter a desplazamiento clonal o dispersión de epitope. El desplazamiento clonal de células T reactivas con MBP se observó en estudios previos (Zhang y col. 1995} y se puede asociar con proceso de enfermedad en avance. Aún cuando la vacuna de célula T se ha demostrado que es efectiva para agotar células T reactivas con mielina y potencialmente benéfica para pacientes de MSf existen varios problemas con el tratamiento. El tratamiento de vacuna de célula T para cada paciente se debe individualizar debido a que los receptores de célula T de células T reactivos con mielina son altamente diversos y varían entre diferentes pacientes de MS. (Vandevyver y col., Eur. J. Immunol., 1995; 1995; 25:958-968, Wucherpfennig y col., J. Immunol., 1994; 152:5581-5592, Hongo y col., J. Immunol., 1999; 163: 3530-3538) . Además de ser individualizados para cada paciente, se requieren hasta 8 semanas para producir una vacuna de célula T determinada utilizando los procedimientos actuales.

La producción de una vacuna de célula T empieza con aislar células mononucleares del fluido cerebroespinal (CSFMCs) o sangre periférica (PBMCs) de un paciente. Las células mononucleares aisladas luego se cultivan con péptidos de mielina durante 7-10 días para activar las células T reactivas con mielina. Los cultivos luego se prueban para proliferación especifica a péptidos de mielina midiando incorporación de [¾] -timidina en presencia de péptidos de mielina durante un periodo de 3 dias . Los cultivos que prueban positivos para proliferación especifica a péptidos de mielina luego se diluyen en serie para obtener lineas de célula T clonal o directamente expandidas . Las células luego se cultivan hasta 6-8 semanas para expandir las células T. Cuando el producto de vacuna de célula T final es clonal, las células T son homogéneas con un solo patrón de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta . Usualmente, tres a seis de las lineas de célula clonal se combinan para producir una formulación heterogénea con múltiples patrones de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta. Cuando el producto de vacuna de célula Final se produce mediante expansión directa, las células T son heterogéneas con más de un patrón de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta . La naturaleza individualizada de la vacunación de célula T y el cultivo de célula prolongado necesario para producción de cada vacuna hacen al tratamiento costoso e intenso en trabajo bajo metodologías actuales. El tiempo prolongado requerido para cultivo de célula también rea un riesgo significativo de contaminación. Finalmente, la probabilidad de desplazamiento clonal o dispersión de epitope de células T reactivas con mielina puede requerir la producción subsecuente de una vacuna de célula T para cada paciente con un patrón diferente de uso de gene Vbeta, -Dbeta-Jbeta. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos mejoradas para aislar células T con especificidad para antígenos, tales como MBP, que se puede utilizar para producir vacunas de célula T para el tratamiento de pacientes en enfermedades mediadas por célula T tales como MS. También existe una necesidad de desarrollar métodos mejorados para producir vacunas de célula T con un patrón heterogéneo de uso de gene Vbeta-Dbega-Jbeta para considerar el desplazamiento clonal de células T autoreactivas . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está generalmente dirigida a métodos para aislar células T especificas de antigeno y más particularmente células T especificas para autoantigenos . Los métodos para aislar una o más células T especificas para un antigeno de interés generalmente comprenden incubar una muestra que comprende células T obtenidas de un paciente con el antigeno o un derivado del mismo; seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en HD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR; y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2, IFNg, TNFalfa, IL5, IL-50 e IL-13. Los métodos de la invención son particularmente útiles para aislar células T autoreactivas que juegan un papel en la patogénesis de enfermedades autoxnmunes. Los métodos de la invención también permiten el diagnóstico de enfermedad autoinmune asi como supervisar la progresión de la enfermedad y para supervisar la eficacia de tratamientos para la enfermedad. Los métodos de la invención también permiten la preparación de vacunas de célula T autólogas para el tratamiento de enfermedades autoxnmunes relacionadas con célula T. Los métodos para preparación de vacuna generalmente involucran el aislamiento de células T especificas de antigeno como se describen arriba opcionalmente seguido por pasos de cultivo subsecuentes que permite la expansión de la población de células T especificas de antigeno aisladas. La invención, entre otros, también está dirigida a vacunas de célula T y composiciones farmacéuticas que comprenden células T especificas de antigeno aisladas utilizando los métodos de la invención. Los métodos de la invención también son útiles para caracterizar receptores de célula T y su ácidos nucleicos de codificación . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 demuestra identificación FACS de células que expresan CD69 y gammalFN (superior) y CD69 y TNFalfa (inferior) en un paciente de esclerosis múltiples antes de estimulo (izquierda) , después de estimulo con residuos 83-99 de MBP (medio) , y después de estimulo con residuos 83-99 de MBP (derecha) . La Figura 2 muestra identificación FACS de células que expresan CD69 y gammaIFN (superior) y CD69 h TNFalfa (inferior) en un paciente de control saludable antes de estimulo (-izquierda) , después de estimulo con residuos 83-99 de MBP (medio) , y después de estimule con residuos 83-99 de MBP (derecha) . DESCRIPCIÓN DETALLADA 1. Definiciones Para ayudar al entendimiento de la presente invención, se definen abajo varios términos.

"Autoantígeno" como se utiliza en la presente se refiere a un antigeno o epitope que es nativo al mamífero que es inmunogénico en la enfermedad de mamífero se conserva en ese especia de mamífero y que se puede involucran en la patogénesis de autoinmune. "CD", "grupo de diferenciación" o "determinante común" como se utiliza en la presente se refiere a moléculas superficiales de célula reconocidas como anticuerpos . La expresión de algunos CDs es específica para células de una línea particular o trayectoria de maduración, y la presión de otros varía de conformidad con el estado de activación, posición, o diferenciación de las mismas células. ""Derivado de" o "un derivado del mismo", en el contexto de secuencias de nucleótido significa que la secuencia de nucleótido no está limitada a la secuencia específica descrita, sino también incluye variaciones en esa secuencia, que pueden incluir adiciones, omisiones, substituciones o modificaciones de nucleótido hasta el grado en que la variación a la secuencia descrita retiene la capacidad de hibridizarse bajo condiciones moderadas o altamente estrictas al complemento de la secuencia descrita. En el contexto de péptido o secuencias de polipéptido, "derivado de" o "un derivado del mismos" significa que el péptido o polipéptido no está limitado a la secuencia específica descrita, sino también incluye variaciones en esa secuencia, que puede incluir adiciones de aminoácido, omisiones, substituciones o modificaciones hasta el grado que las variaciones en la secuencia enumerada retienen la capacidad de producir una respuesta inmune a la secuencia descrita . "Enfermedad relacionada con inmune" significa una enfermedad en la que el sistema inmune está involucrado en la patogénesis de la enfermedad. Un subjuego de enfermedades relacionadas con inmune son enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero no están limitadas a, artritis reumatoide, maistenia grave, esclerosis múltiples, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmune (tiroiditis de Hashimoto) , enfermedades de Greaves, enfermedad de intestino inflamatorio, uveoretinitis autoinmune, polimiositis, y ciertos tipos de diabetes. En vista de la presente exposición, uno experto en el ramo puede percibir fácilmente otras enfermedades autoinmunes tratables por las composiciones y métodos de la presente invención. "PCR" significa la reacción de cadena de polimerasa, por ejemplo, como se describe generalmente en la Patente de E.U.A. No. 4, 683,202 (expedida el 28 de julio de 1987 a Mullis), que se incorpora en la presente por referencia. PCR es una técnica de amplificación en donde oligonucleótidos seleccionados, o imprimadores, se pueden hibridizar a plantillas de ácido nucleico en presencia de un agente de polimerización (tal como polimerasa de ADN o R A) y trifosfatos de nucleótido, mediante los cual se pueden formar productos de extensión de los imprimadores. Estos productos pueden luego desnaturalizarse y utilizarse como plantillas en una reacción de ciclado que amplifica el número y cantidad de ácidos nucleicos existentes que pueden facilitar su detección subsecuente. Una variedad de técnicas de PCR se conocen en el ramo y se pueden utilizar en conexión con la exposición en la presente. Un "péptido" o "polipéptido" es una secuencia enlazada de aminoácidos y pueden ser naturales, sintéticos, o una modificación o combinación de naturales y sintéticos. "Imprimador" significa un oligonucleótido, ya sea natural, sintético, o una modificación del mismo, capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis de nucleótido suficientemente complementario a una secuencia de nucleótido específica en una molécula de plantilla. "Sonda" significa un oligonucleótido, ya sea natural, sintético, o una modificación del mismo, capaz de ligarse específicamente a una secuencia de nucleótido suficientemente complementaria. "Enfermedad mediada con célula T" significa una enfermedad que se suscita como resultado de autoantígenos que reconocen células T. "Tratamiento" o "tratar" cuando se refiere a protección de un animal de una enfermedad, significa prevenir, suprimir, reprimir, o eliminar completamente la enfermedad. Prevenir la enfermedad involucra administrar una composición de la presente invención a un animal antes del principio de la enfermedad. Suprimir la enfermedad involucra administrar una composición de la presente invención a un animal después de inducción de la enfermedad pero antes de su aparición clinica. Reprimir la enfermedad involucra administrar una composición de la presente invención a un animal después de la aparición clinica de la enfermedad. 2. Aislamiento de Células T Especificas de Antigeno a. Aislamiento de Células T Especificas de Antigeno Monoclonales Las células T se pueden activar y expandir en cultivo de célula mediante incubación con una meta de antigeno y células que presentan antigeno. Una vez activadas, las células T se someten a una cascada compleja de señalización de célula que conduce a la transcripción y expresión de muchos productos de gene. La invención descrita en la presente aprovecha ios productos de gene específicos para células T activadas para la identificación y aislamiento de células T con especificidad de antígeno deseada. En un primer aspecto, la presente invención está dirigida a un método para aislar una célula T que es específica para un antígeno de interés . Una muestra que comprende células T se incuba con un antigeno particular, que ocasiona la activación de una célula T especifica para el antigeno de interés . La muestra se puede incubar con el antigeno durante 1 a 7 dias . La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 1 dia. La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 16 horas. La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 12 horas . La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 8 horas. La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 4 horas. La muestra también se puede incubar con el antigeno durante menos de 2 horas . Una célula T especifica para el antígeno de interés se puede aislar luego seleccionando células T que expresan productos de gene de células T activadas como se describe arriba. Sub uegos de células T activadas se pueden aislar seleccionando células T con su uego de productos de gene específicos o marcadores de superficie de célula v. gr . , CD4 contra CD8) . El antigeno de interés incluye proteina básica de mielina (MBP), proteina de proteolipido {PLP}, glicoproteina de oligodendrocito de mielina (MOG) , o un fragmento de la misma. El antigeno de interés también puede ser un fragmento inmunodominante que incluye, pero no está limitado a, residuos 83-99 o residuo 151-170 de MBP. El antigeno de interés también puede ser una combinación de dos o más antigenos individuales de interés . El antigeno o un derivado del mismo, utilizado para activar las células T puede ser cualquier inmunógeno que sea capaz de producir una respuesta inmune al antigeno de interés . El antigeno de activación puede ser el antigeno de interés, o un derivado del mismo. El antigeno de activación puede ser MBP, PLP, MOG, o un fragmento y/o derivado del mismo. El antigeno de activación también puede ser un fragmento inmunodominante que incluye, pero no está limitado a, residuos 83-99 o residuo 151-170 de MBP, o un fragmento y/o derivado del mismo. El antigeno de activación también puede ser una combinación de dos o más antigenos de activación individuales. El antigeno de activación se puede utilizar una o más veces para activar células T especificas para un antigeno de interés . Las células T pueden estar presentes en cualquier muestra que comprende células mononucleares . La muestra se puede aislar de la sangre periférica o fluido cerebroespinal de un paciente de MS o del fluido sinovial de un paciente de RA. Las células T de pacientes con otras enfermedades autoinmunes se pueden aislar de manera similar de sangre periférica y/o tejidos involucrados con la enfermedad. Las células mononucleares se pueden enriquecer en la muestra utilizan técnicas de centrifugación conocidas por aquellos del ramo incluyendo, pero no limitado a, gradientes Ficoll(R>. las células T también se pueden enriquecer en la muestra usando selección positiva, selección negativa, o una combinación de las mismas para expresión de productos de gene de células T. El producto de gene para identificar o seleccionar negativamente células T activadas puede ser un marcador de superficie de célula o citoquina, o una combinación de los mismos. Los marcadores de superficie de célula para identificar células T activadas incluyen, pero no están limitadas a CD69, CD4, CD8, CD25, HLA-DR, CD28 y CD134. CD69 es un marcador de activación temprana encontrado en linfocitos B y T, células NK y granulocitos . CD25 es un receptor de IL-2 y es un marcador para células T y células B activadas. CD4 es un coreceptor de TCR y es marcador para timocitos, células T tipo TH1 y TH2, monocitos y macrofagos. CD8 también es un coreceptor de TCR y es marcador para células T citotóxicas. CD134 se expresa solamente en células T CD4+ activadas. Los marcadores superficiales de célula para seleccionar negativamente células T activadas incluyen, pero no están limitadas a, CD36, CD40, y CD44. CD28 actúa como una trayectoria de activación de célula T de estimulo independiente de la trayectoria de receptor de célula T y se expresa en CD4+ y células CD8+. CD36 es una glicoproteina de membrana y es un marcador para plaquetas, monocitos y células endoteliales . CD40 es un marcador para células B, macrofagos u otras células fagocíticas. Los subjuegos de células T se pueden aislar utilizando selección positiva, selección negativa, o una combinación de las mismas para expresión de productos de gene de superficie de célula para células T de ayuda o células T citotóxicas (v.gr., CD4 contra CD8) . Las citoquinas para identificar células T activadas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a citoquinas producidas por células T tipo TH1 (respuesta medida por célula) y células T tipo TH2 (respuesta de anticuerpo) . Las citoquinas para identificar células T tipo TH1 activadas incluyen, pero no están limitadas a IL-2, gama interferón (ylGN) y factor alfa de necrosis de tejido (TNFa) . Las citoquinas para identificar células T tipo TH2 activadas incluyen, pero no están limitadas a, IL-4 , IL-5, IL-10 e IL-13. Los subjuegos de células T también se pueden aislar usando selección positiva, selección negativa, o una combinación de las mismas para expresión de productos de gene de citoquina de células T de ayuda o células T citotóxicas (v.gr., ylFN contra 114). Una célula T tipo TH1 activada especifica para un antígeno de interés se puede aislar mediante identificación de células que expresan CD69, CD4, CD25, IL-2, IFNgamma, T Falfa, o una combinación de las mismas. Una célula T de tipo TH1 especifica para un antigeno de interés también se puede aislar identificando células que expresan CD69 y CD4 junto con IFNqamma o TNFalfa. Una célula T tipo TH2 activada especifica para un antígeno de interés se puede aislar identificando células que expresan CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 o una combinación de los mismos. Una combinación de una célula T tipo TH1 activada y una célula T tipo TH2 especifica para un antigeno de interés se puede aislar identificando células que expresan CD69, CD4, CD25, IL-2 , IFNgamma, TNFalfa, o una combinación de los mismos y células que expresan CD69, CD4, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, o una combinación de las mismas. Los productos de gene utilizados para selección positiva o negativa de la células T activadas de la presente invención se pueden identificar mediante técnicas de inmunoselección conocidas por aquellos en el ramo que utilizan anticuerpos incluyendo, pero no limitado a, clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS), clasificación de célula magnética, separación, y cromatografía. La inmunoselección de dos o más marcadores en células T activadas se pueden realizar en uno o más pasos, en donde cada paso selecciona positiva o negativamente uno o más marcadores. Cuando la inmunoselección de dos o más marcadores se realiza en un paso usando FACS, los dos o más anticuerpos diferentes se pueden etiquetar con diferentes fluoroforos . La clasificación de célula magnética se puede realizar utilizando microcuentas superparamagnéticas compuestas de óxido de hierro y un revestimiento de polisacárido . De preferencia, las microcuentas pueden ser de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro, y tienen un volumen de aproximadamente una millonésima de aquella de una célula de mamífero típica. Las microcuentas son de preferencia suficientemente pequeñas para permanecer en suspensión coloidal, que permite en enlace rápido, eficiente a antígenos superficiales de célula. Las microcuentas de preferencia no interfieren con citometrí de flujo, son biodegradables , y tienen efectos omisibles en funciones celulares. El acoplamiento de anticuerpo a las microcuentas puede ser directo o indirecto, a través de un segundo anticuerpo a un ligando tal como fluoresceína . El anticuerpo puede ser de clases IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, o fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado por afinidad, o mezclas de los mismos, que exhibe suficiente especificidad de enlace a un epitope de un producto de gene específico para células T activadas, o una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo se puede derivar mediante la fijación de uno o más químico, péptido, o fracciones de polipéptido conocidas en el ramo que permiten la identificación y/o selección de la célula T activada a la que el anticuerpo se liga. El anticuerpo puede estar conjugado con una fracción química tal como un tinte fluorescente. Una célula T activada ligada por un anticuerpo fluorescentemente etiquetado se puede aislar utilizando técnicas que incluyen, pero no están limitadas a, clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS}. El anticuerpo también puede estar conjugado con una partícula magnética, tal como una microcuenta paramagnética (Miitenyi Biotec, Alemania) . Una célula T activada ligada a un anticuerpo magnéticamente etiquetado se puede aislar utilizando técnicas incluyendo pero no limitado a clasificación de célula magnética. Para productos de gene expresado por superficie de célula, el anticuerpo se puede ligar directamente al producto de gene y se puede utilizar para selección de célula. Para productos de gene de superficie de célula expresados a concentraciones bajas, se pueden utilizar liposomas magnetofluorescentes (Sc effold, y col., Nature Med 6:107-110, 2000} para selección de célula. A niveles bajos de expresión, los anticuerpos fluorescentemente etiquetados convencionales puede no ser suficientemente sensibles para detectar la presencia del producto de gene expresado por superficie de célula. Las liposomas que contienen fluoroforo se pueden conjugar a anticuerpos con la especificidad de interés, permitiendo de esta manera la detección del producto de gene expresado por superficie de célula. Para productos de gene intracelular, tales como citoquinas, el anticuerpo se puede utilizar después de permeabilizar las células. Alternativamente, para evitar exterminar las células por permeabilización, el producto de gene intracelular si se secreta finalmente de la célula se puede detectar a medida que se secreta a través de la membrana de célula utilizando un anticuerpo para "atrapar" en la superficie de célula. El anticuerpo de atrapamiento puede ser un anticuerpo doble que es especifico a dos antigenos diferentes: (i) el producto de gene secretado de interés y (ii) una proteína de superficie de célula. La proteina de superficie de célula puede ser cualquier marcador de superficie presente en las células T, en particular, o linfocitos, en general, [v.gr., CD45) . El anticuerpo de atrapamiento se puede ligar primero a la proteína de superficie de célula y luego ligarse al producto de gene intracelular de interés a medida que se secreta a través de la membrana, reteniendo de esta manera al producto de gene en la superficie de célula. Un anticuerpo etiquetado especifico para el producto de gene capturado puede luego utilizarse para ligarse al producto de gene capturado, que permite la selección de la célula T activada {Manz, y col., Proc. Nati, Acad. Sci. USA 92:1921-1925, 1995, incorporada en la presente por referencia) . Ciertas formas de citoquinas también se encuentran expresadas a concentración baja en la superficie de célula. Por ejemplo, ylFN se exhibe a una concentración baja en la superficie de celda con cinéticas similares a aquellas de expresión ylFN intracelular (Assenmacher, y col. Eur J. Immunol, 1996, 26:263-267). Para formas de citoquinas expresadas en la superficie de célula, los anticuerpos fluorescentemente etiquetados convencionales o liposomas que contienen fluoroforo se pueden utilizar para detectar la citoquina de interés. Uno de experiencia ordinaria en el ramo reconocerá otras técnicas para detectar y seleccionar productos de gene extracelulares e xntracelulares específicos para células T activas. Las células T aisladas por la presente invención se pueden enriquecer por cuando menos 90% de la sangre entera. Las células T también se pueden enriquecer por cuando menos 95% de la sangre entera. Las células T también se pueden enriquecer por cuando menos 98% de la sangre entera. Las células T también se pueden aislar cuando menos 99.5% de la sangre entera. b. Células T Específicas de Antigeno Monoclonal Aisladas En un segundo aspecto, la presente invención está dirigida a una célula T especifica para un antígeno de interés aislada mediante el método del primer aspecto de la presente invención. c. Aislamiento 'de Células T Específicas de Antigeno Policlonal En un tercer aspecto, la presente invención está dirigida a un método para aislar células T que son específicas para uno o más antígenos de interés. Una muestra que comprende células T se incuba con uno o más antígenos, que ocasionan la activación de las células T específicas para uno o más antígenos . Las células T específicas para uno o más antígenos pueden luego aislarse como en el primer aspecto de la presente invención. Las células T pueden tener un patrón heterogéneo de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta que expresan diferentes TCRs que son cada uno específicos para un antígeno de interés. Las células T también pueden tener un patrón heterogéneo de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta que expresan diferentes TCRs que son específicos para más de un antígeno de interés. Como se describe abajo, las células T que comprenden un patrón heterogéneo de uso de gene Vbeta-Dbeta-Jbeta se puede utilizar para formar una vacuna de célula T policlonal que puede prevenir la dispersión de epitope en pacientes vacunados . d. Células T Específicas de Antigeno Policlonal Aisladas En un cuarto aspecto, la presente invención está dirigida a células T especificas para uno o más antígenos de interés aislados mediante el método del tercer aspecto de la presente invención. 3. Cuantificar el Número de Células T Especificas de Antígeno En un quito aspecto, la presente invención está dirigida a un método para determinar la frecuencia relativa de células T específicas para uno o más antígenos de interés en una muestra determinando el número de células T aisladas por el método del primer o tercer aspectos de la presente invención. 4. Diagnosticar una Enfermedad Autoxnmune En un sexto aspecto de la presente invención, un paciente con una enfermedad autoinmune puede ser diagnosticado obteniendo una muestra de un paciente y aislando las células T autoreactivas mediante el método del primer o tercer aspectos de la presente invención. La enfermedad autoinmune se puede diagnosticar comparando el nivel de células T autoreactivas en un paciente con un control. El nivel de células T autoreactivas se puede determinar de conformidad con el método del quinto aspecto de la presente invención. 5. Supervisar el Progreso de una Enfermedad Autoxnmune. En un séptimo aspecto de la presente invención, una enfermedad autoinmune se puede supervisar determinando la frecuencia de células T autoreactivas en una muestra de un paciente con una enfermedad autoinmune de conformidad con el quinto aspecto de la presente invención. La severidad de sintonías de la enfermedad autoinmune se puede correlacionar con el número de células T autoreactivas. Además, un aumento en el número de células T autoreactivas en la muestra se puede utilizar como una indicación para aplicar tratamientos pretendidos para reducir al mínimo la severidad de los síntomas y/o tratar la enfermedad antes de que aparezcan los síntomas . 6. Producir una Vacuna para el Tratamiento de una Enfermedad Autoinmune En un octavo aspecto de la presente invención, una composición se puede producir para tratar una enfermedad autoinmune inactivando células T autoreactivas que se han aislado (y opcionalmente expandido en cultivo como se describe en la presente) mediante el método del primer o tercer aspectos de la presente invención. Las células T autoreactivas se puedan inactivar utilizando un número de técnicas conocidas por aquellos en el ramo incluyendo, pero no limitadas a, inactivación química o irradiación. Las células T autoreactivas se pueden conservar ya sea antes o después de la inactivación utilizando un número de técnicas conocidas por aquellos en el ramo, incluyendo, pero no limitado a, crioconservación. Como se describe abajo, la composición se puede utilizar como una vacuna para agotar las células T autoreactivas en pacientes autoinmunes. La composición puede ser una composición farmacéutica, que se puede producir utilizando métodos bien conocidos en el ramo. Las composiciones armacéuticas utilizadas como terapéuticas preclínicas y clínicas en el tratamiento de enfermedad o desórdenes se puede producir por aquellos de experiencia, empleando principios aceptados de diagnóstico y tratamiento. Estos principios se conocen en el ramo,- y se exponen, por ejemplo,- en Braunwald y col., eds.,- Harrison's principales of Infernal Medicine, lia Ed. , McGraw-Hiil, editor, New York, N.Y. (1987), que se incorpora por referencia en la presente. La composición farmacéutica se puede administrar a cualquier animal que pueda experimentar los efectos benéficos de la composiciones. Los animales que reciben la composición farmacéutica pueden ser humanos u otros mamíferos . a . Vacuna En un noveno aspecto, la presente invención está dirigida a una composición producida mediante el método del octavo aspecto de la presente invención . La composición puede ser una vacuna, que se puede utilizar para agotar células t autoreactivas en pacientes autoinmunes . 7. Tratamiento de una Enfermedad Autoinmune En un décimo aspecto, una enfermedad autoinmune se puede tratar en pacientes con células T autoreactivas administrando una composición de conformidad con el noveno aspecto de la presente invención. La composición puede ser una vacuna, que puede conducir al agotamiento de células t autoreactivas en el paciente. Una vacuna puede comprender células T autoreactivas que comprenden patrones homogéneos ("monoclonales") o heterogéneos {^policlonales" ) de uso de gene V eta-Dbeta-Jbeta . Los estudios clínicos indican que los pacientes autoinmunes que reciben vacunación de célula T monoclonai autóloga pueden mostrar una declinación gradual en la inmunidad contra células T reactivas con mielina. En algunos casos, las células T autoreactivas que reaparecen pueden originarse de diferentes poblaciones clónales, sugiriendo que las células T reactivas con mielina se pueden someter a desplazamiento clonal o dispersión de epítope potencialmente asociado con el proceso de enfermedad en avance. El desplazamiento clonal o dispersión de epitope puede ser un problema de enfermedades autoinmunes mediadas por células T autoreactivas . Una vacuna que comprende células T autoreactivas policlonales capaces de agotar múltiples poblaciones de células T autoreactivas puede evitar problemas con desplazamiento clonal o dispersión de epítope. La composición puede ser una composición farmacéutica, que se administra por cualquier medio que logre su propósito pretendido. Por ejemplo,- la administración puede ser por rutas parenteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, interdérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, transmucosal, intracerebral, intratecal o intraventricular . Alternativamente, o al mismo tiempo, la administración puede ser por la ruta oral. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar parenteralmente mediante inyección de bolo o mediante perfusión gradual durante el tiempo. La dosificación administrada puede depender de la edad, sexo, salud y peso del recipiente, clase de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. La dosis varía para la administración de las composiciones farmacéuticas sean suficientemente grandes para producir el efecto deseado, mediante lo cual, por ejemplo, se agotan células T autoreactivas, como se mide por el séptimo aspecto de la presente invención, se logra, y la enfermedad autoinmune se impide significativamente, suprime o trata. Las dosis pueden ser no tan grandes como para ocasionar efectos laterales adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, inmunosupresión generalizada, reacciones anafilácticas y lo semejante. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además portadores farmacéuticamente aceptables apropiados que comprenden excipientes y auxiliares que pueden facilitar el procesamiento de las composiciones activas en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. Los aditivos a las composiciones farmacéuticas pueden incluir la inclusión de un adyuvante, tal como alumbre, quitosán, u otros adyuvantes conocidos en el ramo. (Ver, por ejemplo, Warren y col., Ann. Rev. Immunol. 4:369-388 (1986); Chedid, L., Feder. Proc. 45:2531-2560 (1986), que se incorporan en la presente por referencia) . Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender además liposomas para mejorar la entrega o bioactividad, utilizando métodos y compuestos conocidos en el ramo . Las formulaciones apropiadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de células T autoreactivas inactivadas, por ejemplo sales solubles en agua en solución acuosa. Además, las suspensiones de aceite que comprenden células T autoreactivas inactivadas se pueden administrar. Los solventes o vehículos lipofílieos apropiados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de ajonjolí, o ésteres de ácido graso sintético, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos , Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener substancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyen,- por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio,- sorbitol, y/o dextrano» La suspensión también puede contener estabilizadores. Las células T autoreactivas inactivadas se pueden formular utilizando vehículos parenterales convencionales, farmacéuticamente aceptables para administración mediante inyección. Estos vehículos pueden ser no tóxicos y terapéuticos, y un número de formulaciones se expone en Remington' s Pharmaceutical Sciences, (supra) . Ejemplos no limitativos de excipientes son agua, salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de sal equilibrada de Hank. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener cantidades inferiores de aditivos tales como substancias que mantienen isotonicidad, pH fisiológico, y estabilidad. Las células T autoreactivas inactivadas se pueden formular a concentraciones de célula totales que incluyen de aproximadamente 5x102 células/mi a aproximadamente 1x109 células/ml. Las dosis preferidas de las células T autoreactivas inactivadas para uso al prevenir, suprimir o tratar una enfermedad autoinmune puede ser de la escala de aproximadame te 2xl06 células a aproximadamente 9x1O7 células. 8. Determinación de Repertorio de TCR En un décimo primer aspecto, la presente invención está dirigida a un método para determinar el repertorio de ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T, o una porción de los mismos, en un paciente autoinmune amplificando ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de células T aisladas del primer o tercer aspectos de la presente invención. en donde la amplificación se realiza utilizando un par de imprimador. El primer imprimador del par de imprimador puede ser un oligonucleótido de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos en longitud que hibridiza a un ácido nucleico que comprende la región variable del gene de TCR. El segundo imprimador del par de imprimador puede ser un oligonucleótido de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos en longitud que hibridiza a un ácido nucleico que comprende la región constante del gene de TCR. El par de imprimador se puede utilizar para amplificar un ácido nucleico que hibridiza a la región Vbeta-Dbeta-ü¾eta del gene TCR, Los ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de células T (la "Secuencia de Meta") o un fragmento de las mismas se puede amplificar de una muestra mediante la reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando cualquier técnica de PCR particular o equipo conocido en el ramo. Por ejemplo,- la amplificación de PCR puede seguir un procedimiento en donde una mezcla de reacción se prepara que contiene los siguientes ingredientes: 5 uL lOxPCR tampón II (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KC1) , 3 uL 25 mM MgCl2r- 1 uL 10 mM d TP en mezcla,- 0,3 uL Taq polimerasa (5 U/uL) (AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, Norwalk, Conn) , 30 pmol de un primer imprimador 30 pmol de un segundo imprimador,- y 1 uL de muestra de ADN. La polimerasa puede ser estable a temperaturas de cuando menos 95°C, tener una procesividad de 50-60 y tener un régimen de extensión mayor de 50 nucleótidos por minuto. La reacción de PCR se puede realizar con un perfil de amplificación de 1 min a 95°C (desnaturalización), 20 seg a 56°C (recocido),- 40 seg a 72°C (extensión) para un total de 40 ciclos. Antes de que empiece el primer ciclo, la mezcla de reacción se puede someter a una desnaturalización inicial durante un período de aproximadamente 5 rain a 15 rain. De manera similar,- después de que se completa el ciclo final, la mezcla de reacción se puede someter a extensión final durante un período de aproximadamente 5 min a 50 min. Ciertas reacciones de PCR pueden trabajar con tan poco como 15 a 20 ciclos o tantos como 50 ciclos. Dependiendo de la reacción de PCR específica, tiempos de incubación más prolongados o más cortos y temperaturas superiores o inferiores para cada paso del perfil de amplificación se puede utilizar. La muestra que comprende la Secuencia de Meta, puede ser un ácido nucleico, tal como ADN genómico, cADN, ADN previamente amplificado por PCR, o cualquier otra forma de ADN. La muestra se puede aislar, directa o indirectamente,- de cualquier tejido animal o humano que comprenda células T, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . El ADN genómico se puede aislar directamente de un tejido que comprende células T. El cADN se puede aislar indirectamente mediante transcripción invertida de mRNA directamente aislado de un tejido que comprende células T . La capacidad de detectar la Secuencia de meta se puede mejorar aislando el ADN de muestra indirectamente mediante amplificación de ADN genómico, cADN, o cualquier otra forma de ADN, mediante una reacción de PCR de dos pasos. Por ejemplo, una primera reacción de amplificación de PCR se puede realizar para amplificar un fragmento preliminar que es mayor que, y comprende, un fragmento al que los imprimadores primero y segundo son capaces de ligarse selectivamente en hebras opuestas» Una segunda reacción de amplificación de PCR puede entonces realizarse, utilizando el fragmento preliminar como una plantilla con el primer y segundo imprimadores, para amplificar un fragmento que comprende la Secuencia de meta. Si cualquier del primer o segundo imprimador se utiliza en la primera reacción de PCR para amplificar el fragmento preliminar, la segunda reacción de PCR está "semiacunada" , Si ninguno del primero o segundo imprimador se utilizar en la primera reacción de PCR para amplificar el fragmento preliminar, la segunda reacción de PCR está "acunada". En una reacción de PCR de dos pasos de ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de células T se pueden amplificar realizando una primera reacción de PCR utilizando un primer imprimador preliminar que somete a recocido la región Vbeta del gene TCR y un segundo imprimador preliminar que somete a recocido a la región Cbeta del gene TCR, que amplifica un fragmento preliminar que se extiende de Vbeta a través de la junta Vbeta-Dbeta-Jbeta a Cbeta, seguido por una segunda reacción de PCR que puede estar encajada o semienca ad . En la luz de la presente exposición, el artesano experto será capa de seleccionar imprimadores y condiciones de reacción apropiados para amplificación de PCR de la Secuencia de Meta. Después de la amplificación de la Secuencia de Meta, el producto amplificado se puede detectar por un número de procedimientos. Por ejemplo, una alícuota de producto de amplificación se puede cargar hacia un gel de electroforesis, al que se aplica un campo eléctrico para separar moléculas de ADN por tamaño. En otro método, una alícuota de producto de amplificación se puede cargar hacia un gel manchado con verde SYBR, bromuro de etidio u otra molécula que se ligará a ADN y emitirá una señal detectable. Un gel seco puede contener un oligonucleótido etiquetado que se hibridiza a la Secuencia de Meta, desde la que se puede tomar una autoradiografia exponiendo el gel a película. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos de experiencia en el ramo que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y de esta manera se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de experiencia en el ramo, en la luz de la presente exposición, deben apreciar que se pueden hacer muchos cambios en la modalidades especificas que se describen y todavía obtener un resultado semejante o similar sin abandonar el espíritu y alcance de la invención. EJEMPLO 1 Aislamiento de Células T Reactivas a Mielina para Vacunación de Célula T 1. Preparación de PBMC y el Estímulo Primario Muestras de sangre fresca de pacientes de MS y pacientes de control se procesaron dentro de 2 horas de la recolección. Alternativamente, las células mononucleares se pueden obtener del fluido cerebroespinal (CSFMCs ) de pacientes de MS. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de la sangre entera mediante método de separación de gradiente de Ficoll convencional. Específicamente, sangre heparinizada se diluyó con solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) (1:1 sangre/HBSS9 y luego se tendió lentamente sobre solución de hipaca de ficoll en un tubo centrifugo y se centrifugó durante 20 minutos a 180 rpm, 18 °C a 25°C, sin freno. Las PBMCs se lavaron luego añadiendo exceso de HBSS y se centrifugaron a 1700 rpm durante 10 minutos a 18QC a 25°C. Las PBMCs purificadas se lavaron tres veces con RPI 1640 medio mediante centrifugación y subsecuentemente se resuspendieron en AIM V medio (Gibco, Grand Island, N.Y.). El número de células se contó y las células se colocaron en placas de cultivo de 96 pozos de fondo en U a una densidad de 200,000 células/pozo. Todas las placas se etiquetaron con número de paciente e iniciales del paciente. Las células se incubaron a 37 °C en presencia de péptidos sintéticos enumerados en el cuadro 1 correspondientes a regiones inmunodominantes conocidas de tres proteínas de mielina, proteína básica de mielina (MBP) , proteína de proteolípico (PLP)f y glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) a una concentración de 20 ug/rcil . Las placas se colocaron en una incubadora de C02 a 37 °C y se inspeccionaron visualmente de manera diaria. Las células se cultivaron durante 7-10 días sin cambio de medio de cultivo para desarrollar selectivamente células T específicas de antígeno.

Cuadro 1 - Péptidos de Activación Péptidos de Antigeno de Mielina Secuencias de Aminoácido Proteina básica de mielina, ENPWHFFKNIVTPRTP SEQ ID péptido-1 (MBP-1) No. 1 Proteina básica de mielina SKIFKLGGRDSRSGSPMARR SEQ ID péptido-2 (MJBP-2) NO. 2 Proteina de proteolipido, LFCGCGHEALTGTEKLIETY SEQ ID péptido-3 (PLP-3) no. 3 Proteina de proteolipido, WTTCQSTAFPSKTSASIGSL SEQ ID péptido-4 (PLP-4) O. 4 Glicoproteina de oligodendrocito GQFRVIGPRHPIRALVG SEQ ID ee mielina, péptido-6 (MOG-6) NO. 5 Glicoproteina de oligodendrocito EVELPCRISPGKNATGMEVGW SEQ Id de mielina, péptido-7 ( OG-7) NO. 6 2. Identificación y Selección de Células T Especificas de Antigeno Las células arriba descritas luego se seleccionaron para la expresión de productos de gene indicativos de células T activadas. Ver la sección 2(a) anterior. El Reactivo de Atrapamiento de Citoquina (Miltenyi Biotec (como se describe arriba) se utiliza a fin de detectar la citoquina ??t?a?e???a? ylFN o TNF cuando finalmente se excretaron de la célula.

Brevemente, el Reactivo de Atrapamiento de Citoquina (típicamente un cuerpo biespecifico que se liga a ambos marcador el marcador de célula T activado y la citoquina secretada) se incuba primero con las células a 4-8 °C a fin de ligarlas a la molécula CD45 en las superficies de célula u otro marcador de superficie de célula T activada tal como CD69. Las células con el Reactivo de Atrapamiento de Citoquina luego se incuban a 37 °C durante 45 minutos para permitir que la ylFN o TNF dentro de la célula también se liguen al Reactivo de Atrapamiento de citoquina como la citoquina se secreta desde el interior de la célula durante este periodo de incubación. ylFN o TNFa, ahora ligadas a la superficie de célula por el Reactivo de Atrapamiento de Citoquina que luego se detecta utilizando un anticuerpo especifico para citoquina de interés conjugada al fluorocromo PE Las moléculas de superficie de célula CD4 y CD69, se detectan utilizando anticuerpos conjugados a diferentes fluorocromas . La población de célula CD4+ se selecciona primero mediante selección y luego, dentro de esta población, las células manchadas "positivas dobles" (CD69 e IFNgamma o CD69 y TNFalfa) se separan mediante FACS y se recogen asépticamente. Las células T reactivas a mielina aisladas luego se expanden directamente estimulando con rIL-2, PUA, anti-CD3 u otro mitógeno de célula T general en presencia de PBMNCs autólogos irradiados durante 7-10 dias. Las lineas de célula T reactivas a mielina se propagan en cultivo hasta que el número de células total alcanzó aproximadamente 20 millones. EJEMPLO 2 Diagnóstico de MS Se recogen dos a 100 mi de sangre del paciente y uno o más péptidos sintéticos se añaden directamente a la sangre entera para imprimar o estimular, los linfocitos T. Los péptidos corresponden a las regiones inmunodominantes conocidas de las tres proteínas de mielina, proteína básica de mielina (MBP), proteína de proteolípido (PLP), y glicoprotexna de oligodendrocito de mielina (MOG) . La sangre se incuba con los péptidos durante 1 a 7 días para activar las células T específicas de mielina. Al final de este período de imprimación de antígeno, las células se retaron nuevamente con antígenos en un ensayo de nuevo estímulo corto . Células T activadas con péptido de mielina se detectaron permeabilizando la membrana de célula con una solución detergente, lavando las células, luego incubando con uno o más anticuerpos de mancha para detectar moléculas de CD4 o CD69 sobre la superficie de célula o IFNgamma o TNFalfa intracelularmente. Los anticuerpos de mancha se conjugan a diferentes fluorocromos de manera que fluorescen a diferentes longitudes de onda cuando se excitan por un láser de 488 nanómetros mediante análisis FASC . La población de células CD4+ se seleccionan primero usando las células CD4+ para seleccionar y luego dentro de esta población, las células que son inmunoreactivos con ambos anticuerpos (CD69 y gammalFN o CD69 y TNFalfa) se identifican. Esta población de células T reactivas a mielina "doble positivas" se ha mostrado que aumenta significativamente en pacientes de esclerosis múltiple (MS) er. comparación con controles saludables en un estudio similar (Figura 1, paciente de MS, Figura 2, control saludable) . Utilizando este método, el número de células T reactivas a mielina que circulan en la sangre de un paciente se puede determinar antes, durante y después del tratamiento para determinar el efecto de una terapia de MS en la población de célula T autoreactiva . El punto final se puede determinar como ya sea el porcentaje de células manchadas positivas dobles o como el número absoluto de células manchadas positrvas dobles. EJEMPLO 3 Diagnóstico de MS Utilizando Liposomas Conjugadas con Anticuerpo Se obtiene sangre entera de un paciente y se estimula con uno o más péptidos sintéticos como se describe en el Ejemplo 2. La sangre se incuba con los péptidos durante 3 a 16 horas para activar las células T especificas de mielina. Al final de este periodo de imprimación de antigeno, las células se pueden retar nuevamente con antigenos en un ensayo corto de nuevo estimulo antes de manchar con liposomas magnetoflucrescentas conjugados a anticuerpos contra IFNgamma, TNFalfa, o una combinación de las mismas. Las células también se manchan con un anticuerpo a CD4 y/o CD69. Las células T reactivas a mielina manchadas se detectan como se describe en el Ejemplo 2. EJEMPLO 4 Determinación de Repertorio Clonal de TCR El repertorio clonal receptor de célula T (TCR) representado en una población de célula se puede analizar aislando la población de célula manchada doble positiva mediante clasificación de célula como se describe en el Ejemplo 2 y Ejemplo 3. El ADN se extrae de las células aisladas y se utiliza para realizar ensayos de reacción de cadena de polimerisa (PCR5) cuantitativos utilizando imprimadores de oligonucleótido específicos para 25 familias de gene (Vbeta ) de cadena beta variable de TCR. Este procedimiento proporciona información sobre la distribución de uso de gene de TCR Vbeta e indica la capacidad de clonación de poblaciones de célula T patógenas. Este método también se puede utilizar para determinar si el desplazamiento clonal o epitópico de la población de célula T reactiva a mielina está ocurriendo en un paciente de MS. EJEMPLO 5 El Agotamiento de Células T Reactivas a Mielina mediante Vacunación de Célula T Pacientes con (RR)-MS reincidencia-remisión y (SO) -MS progresiva secundaria recibieron tres inyecciones subcutáneas de clones de célula T reactivos a mielina autólogos irradiados mediante expansión directa, con tres inyecciones adicionales 4, 12 y 20 semanas después. Los pacientes se observaron por cambios en la frecuencia de precursor de las células T reactivas a mielina, régimen de reincidencia, marca de estado de incapacidad expandida (EDSS) y actividades de lesión de MRI durante un periodo de 24 meses. Los resultados se compararon con valores de vacunación previa en una manera autoemparejada. Además, los datos clínicos de las armas de placebo de RR-MS en la prueba clínica de beta-interferón-la (Jacobs y col., 1996) y SP-MS en un estudio de beta-IFN-lb reciente (European Study Group, Lancet, 352:1491-1497 (1998)) se incluyeron para proporcionar datos de historia natural de MS para comparación. La frecuencia de célula T fue no detectable o substancialmente declinada después de la vacunación a la semana 20. Los resultados confirmaron el agotamiento de células T reactivas a mielina mediante vacunación de célula T en pacientes con MS. EJEMPLO 6 Vacunación de Paciente de MS Utilizando Células T Reactivas a Mielina Autólogas El protocolo de vacunación es similar a aquel usado en estudios clínicos previos (Zhang y col.,. 1993,- Medaer y col., 1995) . Brevemente, clones de célula T reactivos con mielina preparados de conformidad con el Ejemplo 1 se activan con fitohemaglutinina (PHA) (4 ug/ml) en presencia de PBMCs irradiados como una fuente de células accesorias . Las células luego se cultivan durante 10 dias en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero AB humano inactivado con calor y 100 unidades por mL de rIL-2. Las células T reactivas a mielina activadas se lavan subsecuentemente tres veces son salina estéril para eliminar el pHA residual, rIL-2 y basura de célula y finalmente se suspenden de nuevo en 2 mi de salina. Después de irradiación (10,000 rads, fuente 131Ce) , las células se inyectaron subcutáneamente en ambos brazos (1 ml/brazo) . El número de células T usado para escala de vacunación de 40 x 10G a 80 x 106 células por inyección y se seleccionan mediante una extrapolación de dosis de células T efectivas en animales experimentales sobre la base de áreas superficiales de piel relativas (Ben-Nun y col., 1981). Cada paciente recibe dos inyecciones subcutáneas seguidas por inyecciones de repetición a 4, 12 y 20 semanas. Los pacientes luego se observan durante el tiempo al principio de progresión confirmada de incapacidad, EDSS, régimen de reinicio y actividades de lesión de MRI . Los resultados se comparan con el curso del propio tratamiento previo del paciente asi como los brazos de placebo de dos pruebas clínicas recientes en pacientes de RR-MS y SP-MS , que sirven como un cálculo de la historia natural de MS (Jacobs y col., 1996), European Study Group, 1998). El tiempo a la progresión se determina por un aumento de cuando menos 1.0 en el EDSS (Poser y col., 1983) que persiste durante cuando menos 2 meses . Las exacerbaciones en estudio se definen por la aparición de nuevos síntomas neurológicos y empeoramiento de síntomas neurológicos previamente existentes que durante cuando menos 48 horas, acompañado por cambio objetivo en examen neurológico (empeoramiento de cuando menos 0.5 puntos en EDSS) . Los pacientes se instruyen de reportar eventos entre las visitas regulares programadas, y se examinan por un neurólogo si los síntomas sugieren una exacerbación. Las determinaciones de seguridad incluyeron eventos adversos, signos vitales y exámenes físicos en visitas regulares. Las diferencias en la variables clínicas en pacientes de estudio antes y después de la vacunación de célula T se analizan utilizando la prueba de rango-suma de Wilcoxon. EJEMPLO 7 Alteración de curso Clínico de MS Después de Vacunación Los pacientes reciben vacunaciones de célula T preparadas de conformidad con el Ejemplo 1 sin efectos adversos . El EDSS medio declina en pacientes con RM-MS durante un período de 24 meses después de la vacunación. Por comparación,, hay un aumento de EDSS medio por 0.61 en la historia natural de RR-MS (n=56) durante el mismo periodo de observación, como se reportó en una prueba conducida usando la prueba de beta-IFN-la (Jacobs y col., 1996). Además, la proporción de los pacientes que tienen EDSS sin cambiar o mejorado es superior a aquella de la historia de MS natural. Pocos, si los hay, pacientes en el grupo de RR-MS tratado progresan más allá de EDSS de 2.0 dentro de 24 meses en comparación con 18% de pacientes en la historia natural de MS . En la cohesión de SP-MS, el EDSS medio progresa más lentamente durante un periodo de 24 meses en comparación con +0.6 registrado en la historia natural de SP-MS (European Study Group, Lancet 1998; 352:1491-1497) . Además, el cálculo de tiempo a progresión confirmada utilizando el método de Kaplan-Meier muestra retraso considerable en comparación con la historia natural de pacientes de MS (20% de progresión en 12 meses para RR-MS y 9 meses para SP-MS) (Jacobs y col., Ann. Neurol, 1996; 39:285-294, European Study Group, 1998).

LISTADO DE SECUENCIAS Baylor College of Medicine Opexa Pharmaceuticals, Inc. Zhang, Jingwu Z <120> Aislamiento e Identificación de Células T <130> 213838-00068 <150> US 60/402,521 <151> 2002-08-08 <160> <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (17) <223> aminoácidos 110 a 126 de protexna básica de mielina humana <400> 1 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr 1 5 10 15 Pro <210> 2 <211> 20 <212>~ PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (20) <223> aminoácidos 167 a 186 de proteína básica de mielina humana <400> 2 Ser Lys lie Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro 1 5 10 15 et Ala Arg Arg 20 <210> 3 <211> 20 <212>- PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (20) <223> aminoácidos 31 a 50 de proteina de proteolipido de mielina humana <400> 3 Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu 1 5 10 15 lie Glu Thr Tyr 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (20) <223> aminoácidos 181 a 200 de proteina de proteolipido de mielina humana <400> 4 Trp Thr Thr Cys Gln Ser lie Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 lie Gly Ser Leu 20 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) ¦ ¦ (17) <223> aminoácidos 1 a 17 de glicoproteína de oligodendrocito de mielina humana <400> 5 Gly Gln Phe Arg Val lie Gly Pro Arg His Pro lie Arg Ala Leu Val 1 5 10 15 Gly <210 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (21) <223> aminoácidos 18 a 38 de glicoproteina de oligodendrocito de mielina humana <400> 6 Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg lie Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly 1 5 10 15 et Glu Val Gly Trp 20

Claims (30)

1. RE I V I N D I C A C I O N E S 1. - Un método para aislar una o más células T especificas para un antigeno de interés, que comprende: (a) incubar una muestra que comprende células T con el antigeno o un derivado del mismo; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y' uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13.
2. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antigeno es un autoantígeno .
3. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el autoantígeno se selecciona del grupo que consiste en proteína básica de mielina, proteína de proteolípido, glicoproteína de oligodendrocito de mielina, péptidos tipo II de colágeno, proteína de choque térmico, proteína, MAGE, PSA, CA125, GAD, y antígeno asociado con tumor . •
4. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antígeno es un epítope inmunodominante de un autoantígeno .
5. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el epítope inmunodominante se selecciona del grupo que consiste en residuos 83-99 de proteina básica de mielina y residuos 151-170 de proteina básica de mielina.
6. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células que expresan y el primer y el segundo marcadores se seleccionan utilizando anticuerpos al primer y segundo marcadores respectivamente, o de manera opcional, un anticuerpo biespecífico que se liga a ambos primero y segundo marcadores en combinación con un anticuerpo que se liga al segundo marcador.
7. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde uno o más de los anticuerpos está fluorescentemente etiquetado.
8. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la célula T se selecciona mediante clasificación de célula activada fluorescente.
9. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el primer anticuerpo está conjugado a una microcuenta magnética.
10. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la célula T se selecciona mediante clasificación de célula activada magnética.
11. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante 1 a 7 días.
12. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 1 día.
13. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 16 horas. ·'
14. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 12 horas.
15. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 8 horas .
16. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 4 horas.
17. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el antígeno se incuba con la muestra durante menos de 2 horas.
18. 18.- Una célula T aislada mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.
19. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células T aisladas son células T TH1 o TH2 o una combinación de las mismas.
20. 20.- Un método para cuantificar el número de células T en una muestra, en donde las células T son específicas para uno o más antígenos de interés, que comprende : (a) incubar una muestra que comprende células T con el antígeno o un derivado del mismo; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 ' IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; y (c) determinar el número de células seleccionadas por el paso (b) .
21. 21. - Un método para diagnosticar una enfermedad autoinmune en un paciente, que comprende; (a) incubar una muestra derivada del paciente que comprende células T con uno o más antigenos involucrados en la intermediad; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD , CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores .seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5, IL-10 e IL-13. ' ·
22. 22.— Un método para supervisar una enfermedad autoinmune en un paciente, que comprende: (a) incubar una muestra derivada del paciente que comprende células T con uno o más antígenos; (b) seleccionar, una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que -·- consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5- IL-10 e IL-13; y (c) determinar el número de células T autoreactivas seleccionadas por el paso (a) .
23. 23. - ün método para tratar una enfermedad autoinmune en un paciente, que comprende: (a) incubar una muestra derivada del paciente que comprende células T con uno o más autoantigenos ; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4 , CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; (c) inactivar las células T autoreactivas seleccionadas (d) administrar las células T autoreactivas inactivadas por el paso (b9 al paciente.
24. 24. - ün método para producir una composición para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente, que comprende: (a) incubar una muestra derivada del paciente que comprende células T con uno o más autoantígenos; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69f CD4 , CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; y (c) inactivar las células T autoreactivas .
25. 25. - El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, que comprende además expandir el número de células T autoreactivass seleccionadas en el paso (b) .
26. 26. - Una composición para el tratamiento de un paciente con una enfermedad autoinmune producida por el método de conformidad con la reivindicación 24 o 25.
27. 27. - Un método para aislar un ácido nucleico que codifica un receptor de célula T, o una porción del mismo, en donde el receptor de célula T es especifico para un antigeno de interés, que comprende: (a) incubar una muestra que comprende células T con el antigeno; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; y (c) amplificar el ácido nucleico que codifica un receptor de célula T de una célula T aislada por el paso (b) utilizando cuando menos un primer imprimador especifico para la región variable del gene receptor de célula T y un segundo imprimador especifico para la región constante del gene de receptor de célula T.
28. 28.- Un método para aislar uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T, o una porción de los mismos, en donde el uno o más receptores de célula T son específicos para uno o más antigenos de interés, que comprende: (a) incubar una muestra que comprende células T con uno o más antígenos; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste de IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; y (c) amplificar el uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de las células ? aisladas por el paso (b) usando cuando menos un primer imprimador especifico para la región variable del gene receptor de célula T y un segundo imprimador especifico para la región constante del gene receptor de célula T.
29. 29.- Un método para determinar el repertorio de ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T, o una porción de los mismos, en un paciente, en donde el uno o más receptores de célula T son específicos para uno o más antígenos de interés, que comprende: (a) incubar una muestra derivada del paciente que comprende células T con el uno o más antígenos; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5, IL-10 e IL-13; (c) · amplificar uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de células T aisladas por el paso (b) utilizando cuando menos un primer imprimador específico para la región variable del gene receptor de célula T y un segundo imprimador específico para la región constante del Gene receptor de célula T; y (d) determinar la secuencia de nucleótido del uno o más ácidos nucleicos amplificados por el paso (c) .
30. 30.- Un método para determinar el repertorio de ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T, o una porción de los mismos, en un paciente autoinmune, en donde el uno o más receptores de célula T son específicos para uno o más autoantígenos de interés, que comprende: (a) incubar, una muestra derivada del paciente autoinmune que comprende células T con el uno o más autoantígenos ; (b) seleccionar una o más células T que expresan uno o más primeros marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD69, CD4, CD25, CD36 y HLADR y uno o más segundos marcadores seleccionados del grupo que consiste en IL-2 IFNgamma y TNFalfa IL5 IL-10 e IL- 13; (c) amplificar el uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más receptores de célula T de las células T aisladas por el paso (b) usando cuando menos un primer imprimador específico para la región variable del gene receptor de célula T y un segundo imprimador específico para la región constante del gene receptor de célula T; y (d) determinar la secuencia de nucleótido del uno o más ácidos nucleicos amplificados por el paso (c) .