CN110832069B - 用于化学诱导的谱系重编程的方法 - Google Patents

Abstract

提供了谱系重编程(CiLR)的化学诱导剂，其包含：糖原合酶激酶抑制剂、TGFβ受体抑制剂、环AMP激动剂或组蛋白乙酰化剂。本发明还提供了一种诱导第一类型的部分或完全分化的细胞成为具有第二和不同谱系特征的细胞的谱系重编程的方法。所述方法包括：将细胞与CiLR接触足够长的时间，以将细胞重编程为经修饰的XEN样细胞，随后将经修饰的XEN样细胞编程为具有第二和不同谱系特征的细胞。

Description

用于化学诱导的谱系重编程的方法

发明领域

本发明主要涉及小分子组合物、以及用于化学地转分化细胞的方法。

背景技术

直接谱系重编程已经成为通过引入细胞类型特异性转录因子的组合来诱导细胞命运直接转变的有前景的策略，并已经在绕过致瘤多能性阶段而产生多种细胞类型方面取得了显著进展。化学重编程已成为产生不同功能细胞类型的新手段。与诱导谱系重编程的转基因手段相比，化学手段更具优势，因为化学手段使用细胞可渗透性、可逆且易于制造的小分子化合物，并可以在浓度、持续时间、结构和组合方面进行微调。已经验证了从小鼠和人细胞产生化学诱导的神经元(CiN)的可行性(Li等,Cell Stem Cell,17:195-203(2015)；Hu等,Cell Stem Cell,17:204-212(2015)；Zhang等,Cell Stem Cell,17:1-13(2015))。这些发现提供了另一种用于研究细胞命运可塑性和产生所需功能性细胞类型的方法，从而避免了通过外源转录因子的使用带来的基因组整合的风险。然而，直接重编程策略中的受限的细胞产量是对于未来应用的主要缺点。期望提供方法来改善经诱导的细胞的重编程动力学和功能成熟度。

本发明的一个目的为提供可用于细胞的谱系重编程的小分子的组合。

本发明的另一个目的为提供一种将细胞从一个谱系重编程为第二谱系的方法。

本发明的进一步的目的为提供化学重编程细胞。

发明内容

已公开了用于改善将第一谱系或类型的细胞化学重编程为第二(且不同的)谱系或类型的细胞的效率的组合物和方法。所述方法基于XEN样状态的可塑性的发现，XEN样状态允许化学处理以绕过多能性并将第一类型/谱系的细胞化学诱导为经修饰的XEN样状态，而转化为第二类型/谱系的细胞。

因此，已经鉴定了可以用于将增强部分或完全分化的细胞重编程为经修饰的XEN样状态的小分子混合物，其为谱系重编程(CiLR)的化学诱导剂。经修饰的XEN样状态的细胞可以随后重编程为不同/第二谱系的细胞。CiLR包括：(1)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂；(2)TGFβ受体抑制剂；(3)环AMP激动剂；(4)组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂；(5)DOT1L甲基转移酶抑制剂；(6)视黄酸受体(RAR)激动剂；以及(7)组蛋白去甲基化抑制剂及其组合。

在一个实施方式中，GSK抑制剂为氨基嘧啶，CHIR99021(“C”)[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈]。在一个优选的实施方式中，GSK抑制剂为TD114-2，TD114-2具有化学名称((10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-十氢-9,4：24,29-二甲基亚基-1H-二苯并[n，t]吡咯并[3,4-q][1,4,7,10,13,22]-四氧杂二氮杂cyclotetracosine)-31,33(32H)二酮))(“TD114-2”)；优选的TGFβ受体抑制剂包括：616452(“6”)；SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)(“S)；LDN193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹诺酮)(“L”)以及Dorsomorphin(“D”)；cAMP激动剂为毛喉素(FSK；“F”)。优选的甲基转移酶抑制剂为EPZ004777，“1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲(“E”)。优选的RAR激动剂包括AM580(“A”)(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)酰胺基]苯甲酸。优选的组蛋白去甲基化抑制剂为反苯环丙胺(“T”)。优选的组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂如为丙戊酸(“V”)。

本发明还提供了一种增强第一类型的细胞谱系重编程为第二类型/谱系的细胞的方法。优选进行重编程的细胞包括：成纤维细胞、脂肪来源的干细胞(ADSC)、神经源性干细胞和肠上皮细胞。在一个优选的实施方式中，所述方法并不包括将待重编程的细胞与多肽如转录因子接触。本文公开的方法包括以下步骤：(a)将待重编程的细胞与CiLR的第一混合物(本文中，指经改良的XEN-混合物)接触足够长的时间以使细胞偏向成为经改良的XEN样细胞群；以及(b)在谱系特异性诱导/分化细胞培养基中培养经改良的XEN样细胞群足够长的时间，以将细胞重编程为第二细胞类型/谱系的细胞(CiLRC)，在所述培养基中含有使Xen样细胞偏向成为特定谱系(此处为谱系特异性培养基)的化合物。

分离得到的化学诱导谱系重编程细胞(CiLRC)不是天然存在的细胞。CiLRC拥有属于被重编程而成的第二谱系的细胞的混合特性，例如形态学、相似的倍增时间、第二谱系特异性标记物的表达；然而，所述细胞保留了来自获得它们的第一细胞类型的特征。例如，如果第一类型的细胞为成纤维细胞，并重编程成为神经元样细胞，则CiLRC在形态学和功能上为神经元样。

在一个优选的实施方式中，CiLRC不是经基因工程改造的，即，CiLRC不是通过包括导入或从细胞中去除遗传元件的方法获得的。然而，本文公开的CiLRC至少可以通过用于产生它们的方法即通过它们的来源而与它们被重编程的谱系中的细胞区分开。第一类型的细胞为天然存在的细胞，与此相对，如本文所述那样，CiLRC不是天然存在的、并且是通过用小分子的组合培养第一谱系的细胞而获得的。

CiLRC可用于许多应用，包括但不限于：细胞疗法和组织工程。

附图说明

图1A示出了通过利用TD114-2-混合物或CHIR-混合物进行化学诱导的XEN主基因(GATA4、SALL4、SOX17和GATA6)的RT-qPCR分析。n＝2；图1B为显示由TD114-2-混合物诱导的原代集落的共免疫染色(Gata4、Sall4、Sox17和Gata6)的条形图。图1C为基于化学重编程手段的XEN样状态的示意图；图1D为示出以不同起始细胞密度利用TD114-2-混合物或CHIR-混合物经诱导的TauEGFP阳性细胞的效率(通过FACS测定)的柱状图。n＝2。数据以平均值+/-SEM(平均值的标准误)表示。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001(斯氏t-检验)；图1E示出了从XEN样集落经诱导的TauEGFP阳性和阴性集落的数量；图1F示出了，由在含有N2、B27、BDNF、GDNF、bFGF、FSK、CHIR、化合物C(缩写为CC，也命名为：Dorsomorphin)的第二阶段神经诱导培养基中的组分调节的神经基因、成纤维细胞基因和XEN主基因的qRT-PCR分析。n＝2。

图2A示出对于受化学诱导上调或下调最稳健的基因的GO分析(>10倍的差异表达)；图2B示出经诱导的TauEGFP阳性细胞的电生理学功能特性，所述TauEGFP阳性细胞不与星形胶质细胞共培养。n＝3。数据以平均值+/-SEM表示。图2C示出在TauEGFP阳性的诱导细胞上引发的动作电位。将动作电位的一个示例性迹线突出显示。n＝11；图2D示出了TauEGFP阳性细胞的全细胞电压钳记录，并记录了内向电流，以及被河豚毒素(TTX)阻断的钠电流,n＝11；图2E示出了在与原代星形胶质细胞共培养后记录的用20μM CNQX plus、50μM AP5封闭的自发兴奋性突触后电流(EPSC)。n＝6。图2F示出了局部应用100μM谷氨酸诱导的内向膜电流。n＝5；图2G为示出在距注射部位不同距离处的TauEGFP阳性细胞的定量的柱状图。n＝2；图2H示出在移植到脑纹状体(28天和35天)后的TauEGFP阳性细胞上引发的动作电位。将动作电位的一个示例性迹线突出显示。n＝7；图2I示出来自小鼠新生成纤维细胞(NBF)的源自CEN样细胞的神经元的产生。图2J示出来自小鼠成体成纤维细胞(MAF)的源自CEN样细胞的神经元的产生。

图3A为谱系追踪系统的示意图；图3B示出从TdTomato阳性和阴性细胞经诱导的TauEGFP阳性集落的定量。从XEN样细胞经诱导的经诱导的TdTomato阳性细胞表达泛神经元标记物TUJ1、NF-H和SYN。图3C示出从XEN样细胞经诱导的TdTomato阳性细胞的全细胞电压钳记录，并记录内向和外向电流。n＝4；图3D示出在化学诱导过程中对标志性多能性基因(Nanog、Oct4和Esrrb)的RT-qPCR分析。n＝2；图3E示出从TdTomato标记的成纤维细胞经诱导的TauEGFP阳性集落的百分比。

图4A示出诱导的XEN样细胞(不同传代)、ESCs和成纤维细胞的倍增时间分析。n＝3；图4B示出化学诱导的XEN样细胞的核型分析；图4C示出了传代的XEN样细胞中染色体数目的分布。n表示分析的细胞数量。化学诱导的XEN样细胞的比较基因组杂交(CGH)分析。使用成纤维细胞作为参考，绘制了平均log2比值；图4D示出从长期扩增的XEN样细胞经诱导的TauEGFP阳性神经元(在20次传代后)显示的电生理学功能特性。n＝12；图4E示出了在不同传代中，来自XEN样细胞的TauEGFP阳性细胞的诱导效率的定量(将第1代的来自XEN样细胞的诱导效率设为100％)。n＝2；图4F为可扩展性的基于XEN样状态的化学重编程的示意图。数据以平均值+/-SEM表示。

图5A示出在第一阶段化学诱导期间，神经主基因(NeuroD1、Ngn2和Sox2)的诱导表达，以及在第二阶段中XEN-主基因(Gata4、Gata6和Sox17)的表达降低。n＝2；图5B示出在shRNA敲减后，Sox2或Gata6的表达。shControl：非靶向载体shRNA。n＝2；图5C示出通过敲减神经-主基因(Sox2)或XEN-主基因(Gata6)的原代XEN样集落和TauEGFP阳性集落的诱导效率。n＝2；图5D示出了在成纤维细胞、XEN样细胞、从XEN样细胞经诱导的肝细胞样细胞(来自两批试验)和原代肝细胞(从出生后2天的小鼠分离)中的肝标志性基因的qRT-PCR分析。n＝3；图5E示出采用ELISA对XEN样细胞、来自XEN样细胞(>第20代)的iHeps(化学诱导的肝细胞)和原代肝细胞中的白蛋白和尿素分泌的定量分析。n＝3。数据以平均值+/-SEM表示。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001(斯氏t-检验)。图5F示出在XEN向肝细胞转化过程中上调或下调的基因数量。“上调”表示与成纤维细胞相比，其表达水平上调了超过2倍的基因，而“下调”表示与成纤维细胞相比，其表达水平下调了超过2倍的基因。

具体实施方式

I.定义

如本文所用的术语“化学诱导的谱系重编程细胞”(CiLRC)是指具有至少一种细胞谱系特征的细胞，所述细胞通过用化学化合物与第一类型/谱系的细胞接触而非通过一种或多种转染基因的表达而源自所述第一类型的细胞，具有不同于第一类型细胞的类型/谱系。

如本文所用的术语“培养物”是指在培养基中生长并任选进行传代的细胞群体。细胞培养物可以为原代培养物(例如，未传代的培养物)或可以为继代或后续培养物(例如，已经传代培养或传代一次或多次的细胞群体)。

如本文所用，重编程的效率“增强”或“增加”意味着，与不经由将待编程的细胞偏向至XEN样状态的化学重编程方法相比时，总的重编程时间的减少，和/或在相同的时间长度，由相同的起始细胞密度得到的重编程细胞的数量的增加。

如本文所用，术语“经诱导的多能干细胞”(iPSC)为一类从非多能细胞人工衍生的多能干细胞。

当提及CiLRC时，术语“分离的”或“纯化的”是指化学诱导的重编程细胞，其至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％不含有污染细胞类型，例如非谱系重编程细胞。分离的干细胞也可以基本上不含有可溶的、天然存在的分子。

当用于提及重编程细胞时，术语“神经元样”是指所述细胞具有通常认为是神经元/神经细胞的特性，即“神经元样特性”，例如：形态学(例如，神经突向外生长)；神经元特异性标记物例如MAP2、NF-H，成熟神经元标记物例如NeuN的表达；如通过vGlut和/或Gad67的表达所证明的兴奋性或抑制性的膜特性；以及如在膜片钳分析中测量的膜去极化。

“神经元样形态学”在本文中与“神经元形态学”可互换使用，指神经元的形态学特征，例如存在胞体/细胞体、树突、轴突和/或突触。

如本文所用，术语“非神经元细胞”是指基于与神经元相关的形态学和功能的组合而未被表征为神经元的细胞。

如本文所用，术语“多能性”(或多能的)是指具有分化成三个胚层：内胚层(例如，内部胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)中的任一个的潜能的干细胞。术语“非多能的”是指细胞不具有分化成所有三个胚层的潜能。多能性干细胞的可塑性较低，已分化程度较大，可成为给定器官内的几种细胞类型之一。例如，多能性血液干细胞可以发育成红细胞祖细胞、白细胞或血小板生成细胞。成体干细胞为多能性干细胞。脂肪来源的干细胞是多能性的。

如本文所用术语“重编程”是指一种特定的细胞类型向另一种特定细胞类型的转化，并且所述重编程包括诱导一种分化的细胞类型来表达对不同的分化细胞类型而言已知的标记物，所述不同的分化细胞类型可以为外胚层、中胚层或内胚层来源。例如，可以将非神经元细胞例如成纤维细胞重编程为具有神经元样特性的细胞。当用化学化合物将第一类型细胞重编程为第二和不同类型/谱系的细胞时，所得细胞为化学诱导的谱系重编程(CiLR)神经元。

术语“小分子”是指分子量小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于1,000道尔顿的分子，例如有机或有机金属化合物。

本文使用的“XEN样细胞”是指被表征为上皮细胞，并且表达XEN标记物，例如SALL4、GATA4、GATA6和SOX17的细胞。当与细胞相连地使用时，XEN样状态是指一个或多个XEN标记物的表达。

II.组合物

A.诱导谱系重编程的小分子

诱导谱系重编程的化学化合物，即谱系重编程的化学诱导剂(CiLR)包括分子量小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于1,000道尔顿的小分子，所述小分子可以是单独的或与蛋白质组合。小分子可具有小于或等于900道尔顿、或小于或等于500道尔顿的分子量。可用于化学诱导的重编程的较大的分子，优选与此处鉴定的小分子靶向相同的途径。已经证明几种蛋白质因子，例如重组bFGF，在以下用于化学重编程的方案中有效。

因此，已经鉴定了小分子混合物，其可用于增强第一类型/谱系的已部分或完全分化的细胞重编程为经修饰的XEN样状态，并随后成为第二和不同类型/谱系的细胞。所述CiLR包括：(1)糖原合酶激酶(GSK)抑制剂；(2)TGFβ受体抑制剂；(3)环AMP激动剂；(4)组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂(5)DOT1L甲基转移酶抑制剂；(6)视黄酸受体(RAR)激动剂；以及(7)组蛋白去甲基化抑制剂，及它们的组合。

(1).GSK抑制剂

优选的GSK抑制剂包括氨基嘧啶，CHIR99021(“C”)，其优选的使用浓度为1～30μM、更优选为10～20μM，以及具有以下所示的结构的TD114-2(“T”)，其优选的使用浓度为0.2～20μM、更优选为2～6μM、最优选为2～4μM。

TD114-2

在一些优选的实施方式中，所述小分子混合物不包括CHIR99021。

在本文公开的方法中也可使用其他GSK抑制剂，它们包括但不限于：BIO-丙酮肟(例如1μM)；GSK 3I抑制剂XV；SB-216763；CHIR 99021三盐酸盐，其为CHIR99021的盐酸盐；GSK-3抑制剂IX[((2Z,3E)-6'-溴-3-(羟基亚氨基)-[2,3'-二氢亚吲哚基]-2'-酮]；GSK3IX[6-溴靛玉红-3'-肟]；GSK-3β抑制剂XII[3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚]；GSK-3抑制剂XVI[6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙基-氨基)-烟腈]；SB-415286[3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮]；以及[(2'Z，3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟]，以相当于20μMCHIR99021的浓度使用。

(2).TGFβ受体抑制剂

TGFβ抑制剂优选单独或组合抑制TGFβ1型受体激活受体样激酶(ALK)5、ALK2、ALK3和ALK4，以及其他实施方式中的节点型受体1受体ALK7。

优选的TGFβ受体抑制剂包括：616452(“6”)，优选的使用浓度范围为1～30μM、优选为5～10μM，例如6、7、8、9或10μM；SB431542(“S”)，优选的使用浓度范围为0.2～20μM、更优选为2～10μM、进一步更优选为2～5μM；LDN193189(“L”)，优选的使用浓度范围为0.01～10μM、更优选0.01～1μM、进一步更优选0.1～1μM；以及dosomorphine(“D”)，优选的使用浓度范围为0.1～10μM、优选为1～5μM、更优选为1～2μM。

其他TGFβ抑制剂是本领域已知的，并且是市售可获得的。实例包括：E-616452[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘]；A 83-01[3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺]；SB505124[2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶]；GW 788388[4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺]；以及SB 525334[6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉]。

(3)cAMP激动剂

优选的cAMP激动剂为毛喉素(F)，优选的浓度范围为5-500μM、更优选50～100μM，进一步更优选10～50μM。在本文公开的混合物中可包括额外的cAMP激动剂。实例包括但不限于：前列腺素E2(PGE2)、咯利普兰(rolipram)、染料木黄酮和cAMP类似物，例如DBcAMP或8-溴-cAMP。

(4)组蛋白乙酰化剂/脱乙酰基酶抑制剂

优选的组蛋白乙酰化剂为丙戊酸(“V”)，优选的使用浓度范围为50～1000μM、更优选为100～500μM。其他组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是市售可获得的，并可用于所述公开的方法中。非限制性实例包括：apicidin、CI994(N-乙酰基地那林4-(乙酰氨基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺)、缩酚酸肽、KD5170(S-[2-[6-[[[4-[3-(二甲基氨基)丙氧基]苯基]磺酰基]氨基]-3-吡啶基]-2-氧代乙基]乙硫酸酯)、4-苯基丁酸钠、丁酸钠、UF010等。

(5)DOT1L甲基转移酶抑制剂

DOT1L甲基转移酶抑制剂是优选的。实例包括：甲基转移酶抑制剂，包括：SGC0946(1-[3-[[[(2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7]-(3,4)-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基](异丙基)氨基]丙基]-3-[4-(2,2-二甲基乙基)苯基]脲)，以及EPZ004777(“E”)。优选的DOT1L甲基转移酶抑制剂为EPZ004777，优选的使用浓度范围为0.5～20μM、更优选1～10μM、更优选1～5μM。

(6)视黄酸受体(RAR)激动剂

RAR激动剂的实例包括：Ch 55([4-[(1E)-3-[3,5-双(1,1-二甲基乙基)苯基]-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸]，为对RAR-α和RAR-β受体具有高亲和力、对细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)具有低亲和力的强效的合成类视黄醇]；AM580([4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)酰胺基]苯甲酸]；视黄酸的类似物，其作为选择性RARα激动剂)；[4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢)-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸](TTNPB)。

优选的RAR激动剂为AM580(“A”)，优选的使用浓度范围为0.005～1μM、更优选0.05～0.1μM。

(7)组蛋白去甲基化抑制剂

优选的组蛋白去甲基化抑制剂为反苯环丙胺(“T”)，优选的使用浓度范围为0.5～50μM、更优选5～20μM、进一步更优选7～15μM。反苯环丙胺为非选择性和不可逆的单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。也为组蛋白去甲基化的抑制剂的另一种有用的MAOI包括苯乙肼(Lee,等Chem and Biol.,13:563-567(2006))，另外的非限制性实例包括Zhou,等,Chem Biol.andDrug Design,85(6):659-671(2015)中公开的化合物XZ09，以及非肽炔丙基胺(Schmidtt,等J.Med.Chem.,56(18):7334–7342(2013))。

(8)附加的小分子加强剂

可用于提高重编程效率的附加和任选的小分子包括：D4476(D4476(CAS 301836-43-1)(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己-6-基)-5)-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、高纯度酪蛋白激酶抑制剂和TGF-β1型受体(ALK5)抑制剂)；ISX9[N-环丙基-5-(2-噻吩基)-3-异噁唑甲酰胺]；溴结构域抑制剂，例如I-BET151，化学名为[(7-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-8-甲氧基-1-((R)-1-(吡啶-2-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮]；JQ1，化学名为[(6S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂

-6-乙酸1,1-二甲基乙基酯]；溴孢菌素；以及I-CBP112，化学名[1-[7-(3,4-二甲氧基苯基)-9-[[(3S)-1-甲基哌啶-3-基]甲氧基]-2,3,4,5-四氢-1,4-苯并氧氮杂/>

-4-基]丙-1-酮]。

优选的混合物仅包括来自上述组(1)～(7)的小分子，即，所述混合物不包括选自ISX9、I-BET151、JQ1、溴孢菌素或I-CBP112中的任一种。

B.待诱导的细胞

所述重编程细胞通过对从哺乳动物，例如任意哺乳动物(例如牛、绵羊、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，优选为人类所得到的部分或完全分化的细胞进行诱导得到。来源包括：骨髓、成纤维细胞、胚胎组织(例如，胚胎肝脏组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。可进行诱导的有用的细胞类型包括但不限于：多能性干细胞、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞和结缔组织细胞。

待重编程的细胞可以从得自哺乳动物受试者的样品得到。所述受试者可以为任意哺乳动物(例如：牛、绵羊、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，包括人。细胞的样品可以从许多不同来源，包括例如：骨髓、胚胎组织(例如，胚胎肝脏组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织中的任一种得到。

在优选的实施方式中，CiLRC从成纤维细胞、神经来源的干细胞、肠上皮来源的细胞和脂肪来源的干细胞得到。在更优选的实施方式中，CiLRC从成纤维细胞得到，所述成纤维细胞可以为新生儿(例如，包皮成纤维细胞)、新生儿成纤维细胞(即，从新生儿(产后)机体获得的成纤维细胞)或成体成纤维细胞。在该实施方式中，例如，新生儿可以为出生后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天。在一些优选的实施方式中，CiLRC细胞不表达Oct4和/或未经基因工程改造以表达多能性的一种或多种标记物。

细胞可以通过使用对本领域技术人员已知的技术，将作为细胞来源的适当器官或组织进行解聚而分离。例如，所述组织或器官可以机械地解聚，和/或用消化酶和/或螯合剂处理，所述消化酶和/或螯合剂削弱在相邻细胞之间的连接，从而使得组织可以被分散以形成单个细胞的悬浮液，且没有明显的细胞破裂。酶促解离可以通过切碎组织并用一种或多种酶处理切碎的组织而实现，所述一种或多种酶为例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等。机械破坏也可以通过多种方法实现，所述方法包括但不限于使用研磨机、搅拌机、筛、均化器、压碎器或超声器(insonators)。

D.化学诱导的谱系重编程细胞(CiLRC)

CiLRC具有包括作为获得它们的来源的第一类型细胞的特性、以及它们被重编程为的第二类型细胞的特性的混合特性。与作为获得CiLRC的来源的谱系的细胞相比时，CiLRC显示出与来自来自相同生物体的该谱系的特征性基因的下调。所述基因可以下调2倍、3倍、4倍、5倍等，或完全沉默。CiLRC保留作为获得它们的来源的谱系的特征的一种或多种基因的表达。此外，CiLRC获得了它们被重编程为的谱系的特征的一种或多种基因的表达增加。

优选所述细胞与作为获得它的来源的第一类型细胞相比，不显示选自nanog、Oct4、Dax1、Oct4、Nanog和Esrrb中的一种或多种ESC标记物的表达增加，并且细胞不是多能性的。

用于鉴定特定细胞类型的标记物是本领域已知的。

神经元标记物

神经元具有某些已知的形态学和功能特征。神经元的形态学特征包括例如，神经突向外生长。

神经元样形态可以使用成熟的方法，例如显微镜检查确定，例如综述于Parekh,等,Neuron,77(6):1017-1038(2013)中。用于定量神经元形态的方法描述于例如，Ho等人，BMC Bioinformatics，12：230(2011)中。神经元特异性标记物包括：TUJ1(神经元特异性III类β-微管蛋白)、MAP2、NF-H和NeuN。MAP-2为神经元特异性细胞骨架蛋白，其用作神经元表型的标记物。Izant,等.,Proc Natl Acad Sci U S A.,77:4741-5(1980)。NeuN为由Mullen等,Development，116：201-11(1992)鉴定的神经元特异性核蛋白。这种蛋白质被称为神经元核(Neuronal Nuclei)(NeuN)，在成年小鼠的中枢和外周神经系统中的大多数神经细胞类型中被检测到。

可以用于鉴定神经元的其他标记物综述于例如Mater Methods，3：196(2013)中。兴奋性或抑制性膜特性通过神经递质转运蛋白例如，囊泡谷氨酸转运蛋白(vGlut)和/或Gad67(谷氨酸脱羧酶67)的表达、以及在膜片钳分析中测量的膜去极化而证明。谷氨酸能神经元表达三种已知的囊泡谷氨酸转运蛋白，VGLUT1、VGLUT2或VGLUT3中的至少一种。这些转运蛋白介导谷氨酸摄取到突触小泡中，并由质子电化学梯度驱动。已经显示VGLUT的表达水平决定了加载入囊泡中及释放的谷氨酸的量，从而调节神经传递的功效。Wojcik,等,PNAS,101(18:7158-7163(2004)。抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)由两种谷氨酸脱羧酶(GAD)同种型：GAD65和GAD67合成。在原代神经元中，GAD67靶向至高尔基膜、胞质囊泡和独立于GAD65的突触前簇。Kanaani,等,J.Cell.Biol.,190(5):911-925。

CiLR神经元

化学重编程的神经元显示出一种或多种神经元特异性基因的上调。例如，所述基因可以上调2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。然而，在与作为获得CiLR神经元的来源的细胞/细胞类型中的水平相比时，所述上调包括被认为是神经元特异性基因的基因的表达水平增加。优选的基因包括一种或多种的富集表达。

此外，CiLRs神经元可以具有与神经元所示的相似的膜特性；这些膜特性在获得它们的细胞中不存在。

本文公开的CiLRs神经元优选不包括使用基因工程技术引入细胞、并诱导非神经元细胞转化为神经元样细胞的外源性引入的核酸(“神经原性核酸”)。神经原性转录因子和核苷酸的实例包括：Asc1、Zic1、Olig2、Brn2/4、NeuroD1和Myt11(Vierbuchen等，Nature,463:1035-1041(2010))；微小RNA(miRNA)miR-9/9或miR-124(miR-9/9*-124)(Yoo等,Nature,476(7359):228-31(2011)和Ambasudhan等，Cell Stem Cell,9(2):113-118(2001)；神经原质蛋白(neurogenin)2(NGN2)；SOX11。

在一个优选的实施方式中，CiLR神经元显示泛神经基因(Mapt、Map2和Nefl)和功能性突触组分(Stmn3、Stmn4和Syp)的表达增加，而对于作为获得它们来源的细胞的标记性基因(对于成纤维细胞可列举包括：Thy1、Twist2、Tgfb1i1和Snail)的表达显著下调。在另一个优选的实施方式中，与通过以下方法产生的神经元样细胞相比，在CiLR神经元中的Sox2的内源性表达上调，所述方法包括：在本发明公开的化学诱导的重编程方法的步骤(a)中，以相同的时间长度在含有混合物VC6TFAE的细胞培养基中培养成纤维细胞。

成纤维细胞标记物

示例性成纤维细胞标记物包括Thy1和/或SSEA-1的上调。在CiLR神经元中，成纤维细胞标志性基因例如：Fap、Des、Slug、Dcn、FSp1、Tgfb1i1、Snail、Collagen1和Twist2下调。

肝细胞标记物

CiLR肝细胞表达一种或多种肝细胞标记物。肝细胞细胞标记物包括但不限于：白蛋白、细胞色素P450(Cyp)3A4、CYPB6、CYP1A2、CYP2C9和/或CYP2C19；脂肪细胞标记物包括例如：脂联素、脂肪酸结合蛋白P4和瘦蛋白。肝细胞的形态学特征包括：对于肝细胞为特异性的形态学特征的确认，例如利用相位显微镜观察到的具有多个细胞核的细胞，以及通过电子显微镜观察到的在细胞质中富含的颗粒，特别是糖原颗粒的存在。与CiLR神经元一样，对于作为获得它们的来源的细胞的标志性基因的表达显著下调，对于成纤维细胞，可列举的标志性基因包括Thy1、Twist2、Tgfb1i1和Snail。

III.制备方法

本文公开的方法允许将第一类型/谱系的细胞化学重编程为第二细胞类型/谱系的细胞。本文公开的方法不包括用诱导向第二细胞类型(例如，神经元样细胞)的细胞转化的核酸对第一类型细胞(例如，非神经元细胞)进行转染。

在一个实施方式中，优选的第二细胞类型的细胞为神经元。在该实施方式中，所述方法不包括利用使用基因工程技术被引入细胞、并诱导非神经元细胞向神经元样细胞转化的核酸(“神经原性核酸”)对非神经元细胞进行转染。神经原性转录因子和核苷酸的实例包括：Asc1、Zic1、Olig2、Brn2/4、NeuroD1和Myt11(Vierbuchen等，Nature,463:1035-1041(2010))；微小RNA(miRNA)miR-9/9或miR-124(miR-9/9*-124)(Yoo等,Nature,476(7359):228-31(2011)和Ambasudhan等，Cell Stem Cell,9(2):113-118(2001)；神经原质蛋白2(NGN2)；SOX11。在优选的实施方式中，不包括ISX9[N-环丙基-5-(2-噻吩基)-3-异噁唑甲酰胺]。

在另一个实施方式中，优选的第二细胞类型的细胞为肝细胞。所述方法不包括用诱导非神经元细胞向肝细胞样细胞转化的核酸对非肝细胞进行转染。

以10,000细胞/孔～70,000细胞/孔、优选30,000～60,000细胞/孔、更优选约25,000～30,000细胞/孔的起始细胞密度将细胞接种至6孔板。

A.为了偏向经修饰的XEN样状态，通过对条件的具体选择诱导CiLRC

经由经修饰的XEN样状态偏向，将第一类型的细胞重编程为第二和不同类型/谱系的细胞包括以下步骤：(a)将待重编程的细胞与CiLR的第一混合物(在本文中，称为经改良的XEN-混合物)接触足够长的时间，以使细胞偏向成为经改良的XEN样细胞群；(b)在谱系特异性诱导/分化细胞培养基中培养经改良的XEN样细胞群足够长的时间，以将细胞重编程为第二细胞类型/谱系的细胞(CiLRC)，在所述培养基(本文中，称为谱系特异性培养基)中含有使Xen样细胞偏向成为特定谱系的化合物。经改良的XEN混合物用于对细胞培养基进行补充，所述细胞培养基例如：DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、敲除DMEM，其为本领域已知的并且为市售的。

在一个优选的实施方式中，与通过以下方法产生的神经元样细胞相比，在经改良的XEN-混合物中的培养导致至少一种谱系指示物例如，Sox2、Ngn2和/或NeuroD1的内源表达的上调，所述方法包括：在含有混合物VC6TFAE的细胞培养基中培养第一类型的细胞与步骤(a)中相同的时间长度。因此，选择经改良的XEN-混合物以包括增加谱系指示物表达的小分子。

在一个优选的实施方式中，待重编程的细胞最初在含有经改良的XEN-混合物的培养基中培养优选为8～20天、优选10～16天、更优选12天的总时间(第一阶段)。优选的经改良的XEN-混合物为V6TFAE-TD114-2。细胞在谱系特异性培养基中培养优选为10～30天(图1C)，例如20～24天(第二阶段)。在一些实施方式中，优选毛喉素在整个培养过程中存在，并且优选在第一阶段或第二阶段的细胞培养基中不包括ISX9。CHIR99021和Dorsomorphin优选不包括在步骤(a)中，尽管它们可以包括在步骤(b)中。因此，对于用于产生CiLR神经元的阶段(2)的优选混合物为FCD，该混合物任选包括LDN193189和SB431542。用于从经改良的Xen样细胞诱导肝细胞的优选细胞培养基包括：DMEM 1％N₂、1％B27、1％Glutamax、1％青霉素/链霉素(P/S)、20ng/ml激活素A、20ng/ml EGF(表皮生长因子)、20ng/ml BMP4(骨形态发生蛋白4)和10ng/ml FGF2(成纤维细胞生长因子2)。优选Xen样细胞在该培养基中培养5～15天、优选为8～10天、更优选约10天。然后在经改良的HCM(肝细胞培养基)、10ng/ml OSM(制瘤素M)、0.1uM DEX(地塞米松)中培养5～15天、优选8～10天、更优选约10天。然而，可以使用已知诱导和/或维持肝细胞生长的因子。如此处对于肝细胞所例示的，可以将已知的细胞培养诱导和分化培养基和培养条件应用于本文公开的经改良的Xen样细胞，以获得不同的细胞类型。谱系特异性诱导和分化培养基是本领域已知的，并有一些为市售可获得的。例如，Banerrjee等,PLOS One，7(3)e33165(2012)公开了用于将人胚胎细胞分化为肺上皮细胞谱系特异性细胞的细胞培养基。在脂肪形成、成骨或软骨形成培养基中的细胞培养是已知的并且在前已有描述。Mhanna,等,Tissue engineering Part A.2014；20(7–8):1165–74(2014)；Yang,等,J.Biomed.Sci.,18:59(2011)；Xin,等,PLOS One DOI:10.1371/journal.pone.0145838January 12,2016。(Liu,等,Cell Res.,24(10):1181-1200(2014)。参见Liu,等,Cell Res.,24(10):1181-1200(2014).

经由经修饰的XEN样状态偏向的CiLRC诱导增加了重编程的效率。例如，当与包括不选择性地将待编程的细胞偏向经修饰的XEN样状态，并且例如通过直接并立即诱导相关的转录因子而进行化学重编程方法相比时，来自相同起始细胞群体的首先进行经修饰的XEN样状态的偏向而获得的待编程细胞的集落数提高，和/或获得同样的集落数所需要的时间长度减少。

B.CiLRC的分离

可以在体外培养中维持分化细胞的培养基是已知的。

基本上纯化的CiLRC群体，可以例如通过从培养来源中提取(例如，经由密度梯度离心和/或流式细胞术)而获得。纯度可以采用任何适当的方法测量。CiLRC细胞可以通过例如流式细胞术(例如，FACS分析)而99％～100％纯化。人类CiLRC可以通过例如利用与CiLRC上的标记物或标记物的组合结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子)而分离，从而主动地选择结合该分子的细胞(即阳性选择)。阳性选择方法的其他实例包括：在所需和不需要的细胞类型的混合群体中，优先促进所需细胞类型的生长的方法。备选地，通过使用与不存在于所需细胞类型上、但存在于不需要的细胞类型上的标记物结合的分子，可以从所需细胞中除去含有这样的标记物的不需要的细胞(即，阴性选择)。其他阴性选择方法包括：在所需和不需要的细胞类型的混合群体中，优先杀死或抑制不需要的细胞类型的生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择或其组合，可以制备富集的干细胞群体。

用于分离的步骤可包括：磁性分离、使用抗体包被的磁珠、亲和层析、连接于单克隆抗体的细胞毒性剂、或与单克隆抗体联合使用的这样的试剂(例如，补体和细胞毒素)、以及用附着于固体基质(例如，平板)的抗体进行的“淘选”、或其他便利的技术。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可具有多种程度的复杂性，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道，以及阻抗通道(impedance channel)。抗体可以与以下标记物缀合：如磁珠，其允许直接分离；生物素，其可以用结合到支持物的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白去除；或荧光染料，其可以与荧光激活细胞分选仪一起使用，允许易于特定细胞类型的分离。可以采用不对CiLRC的可行性过度有害的任何技术。在一个实施方式中，将细胞与针对标记物的抗体一起温育，并手动选择对所述标记物染色为阳性的细胞并进行传代培养。

可使用富集方法的组合，用于改善纯化或富集的时间或效率。例如，在去除具有并非指示所需细胞类型的标记物的细胞的富集步骤之后，细胞可以通过荧光激活细胞分选仪(FACS)或具有高特异性的其他方法进行进一步分离或富集。多色分析可以与FACS一起使用。可以基于特定抗原染色的水平或所述特定抗原的缺乏来分离细胞。可使用荧光染料来标记对于特定抗原特异性的抗体。这样的荧光染料包括：藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红。

可以使用任何细胞类型特异性标记物来选出特定细胞类型或针对特定细胞类型选择。用于富集的诱导的干细胞标记物包括表达的标记物如TRA-1-81，和与逆转录病毒载体或其他外源载体相关的标记物(例如，GFP)的丧失。

C.CiLRC的培养和保存

CiLRC可以在培养中扩大并储存，以供以后恢复和使用。一旦建立了细胞培养物，细胞群体就通过在有利于细胞增殖的条件下，以伴随或不伴随组织形成的方式，以指定的细胞密度被传代于新鲜培养基，在体外进行有丝分裂扩增。这样的培养方法可包括例如：将细胞在缺乏诱导分化的特定生长因子(例如，IGF、EGF、FGF、VEGF和/或其他生长因子)的培养基中传代。当达到足够的细胞密度时，培养的细胞可以转移到新鲜培养基中。用于维持神经元细胞的细胞培养基是市售可获得的。

可以根据已知方法，例如Doyle,等,(eds.),1995,Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester中所述的那些方法，将细胞冷冻保存用于储存。例如，细胞可以以例如约4～10×10⁶细胞/ml的密度悬浮于“冻存培养基”中，所述冻存培养基例如为含有15～20％胎牛血清(FBS)以及10％二甲基亚砜(DMSO)、有或没有5～10％甘油的培养基。将细胞分配到玻璃或塑料小瓶中，然后将它们密封并转移至可编程或被动冷冻机的冷冻室中。最佳冷冻速率可以经验性地确定。例如，可以使用通过熔化热而使温度以-1℃/分钟进行改变的制冷程序。一旦含有细胞的小管达到-80℃，就将它们转移至液氮储存区。冷冻保存的细胞可以储存数年。

IV.使用方法

谱系重编程的手段已经用于疾病建模，表明了在再生医学中的有希望的应用(Xu,等,Cell Stem Cell,16:119-134(2015))。基于细胞的疗法正在人体临床试验中应用。例如，Geron Corporation和SanBio，Inc.分别针对神经元疾病进行了对于基于人胚胎干细胞和骨髓衍生细胞的临床试验。因此，本文公开的细胞可用于基于细胞的疗法。

此外，化学诱导的XEN样状态的可塑性的发现使其在筛选小分子文库以得到能够增强谱系指示物的内源表达的化合物的方法中有用，在提供小分子混合物的方法中有用，所述小分子混合物对诱导具有谱系指示物的表达增加的经修饰的XEN样状态有用，对于随后诱导成为所需谱系有用。

A.细胞疗法

CiLRC的治疗用途包括将CiLRC移植到个体中以治疗多种病理状态，包括由癌症、伤口、肿瘤、损伤、病毒感染、糖尿病等引起的疾病和病症。治疗可以包括通过本领域已知的或将来开发的任何方法使用所述细胞产生新组织、以及由此产生的组织的用途。细胞可以以植入、注射或以其他方式直接施用于组织损伤的部位，以便它们在体内产生新组织。在一个实施方式中，施用包括经遗传修饰的CiLRC的施用。

在优选的实施方式中，CiLRC从自体细胞获得，即，供体细胞是自体的。然而，细胞也可以从异源细胞获得。在一个实施方式中，供体细胞从与接受者遗传相关的供体获得。在另一个实施方式中，供体细胞从与接受体遗传上无关的供体获得。

如果人类CiLRC是从与受体受试者相比异源(非自体/同种异体)来源衍生的，则通常施用伴随的免疫抑制疗法，例如免疫抑制剂环孢菌素或FK506的施用。或者，细胞可包封在允许流体的交换但防止细胞与细胞之间接触的膜中。微囊化的细胞的移植是本领域已知的，例如，Balladur等,Surgery,117:189-94,1995；和Dixit等，Cell Transplantation,1:275-79(1992)。

(i)糖尿病

糖尿病(DM)为一组代谢性疾病，其中受试者因为胰腺不产生足够的胰岛素、或因为细胞对产生的胰岛素没有反应而具有高血糖。对于胰岛素治疗的有希望的替代是向需要胰岛素的患者提供胰岛细胞。Shapiro等.,N Engl J Med.,343(4):230-8(2000)已经阐明β细胞/胰岛的移植提供了对于患有糖尿病的患者的疗法。尽管有许多胰岛素类型市售可获得，但这些制剂是以注射剂形式提供的。本文公开的CiLRC可以提供胰岛细胞的备选来源以预防或治疗糖尿病。因此，所述细胞可用于移植以预防或治疗糖尿病的发生。例如在Naziruddin等的美国专利号8,637,494中，公开了在不影响胰岛细胞活力和效力的情况下减少在细胞因子暴露后的炎症的方法。

(ii)神经变性病症

神经变性病症的特征在于，涉及由于疾病、遗传性状况或损伤，例如创伤性或缺血性脊髓或脑损伤导致的神经元的退化的状况。神经变性病症包括任何涉及神经元损伤或退化的疾病、或病症、或症状、或其原因或其影响。神经变性病症可包括但不限于：亚历山大病、阿尔珀斯病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症、运动失调性毛细血管扩张症、卡纳万病、Cockayne综合征、皮质基底变性、克雅氏病、亨廷顿病、肯尼迪氏病、Krabbe病、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病、多发性硬化症、帕金森病、佩梅病、尼曼氏病、原发性侧索硬化症、雷弗素姆氏病、山德霍夫氏病、谢耳德氏病、进行性核上性眼肌麻痹、脊髓痨或任何其他与受损的神经元相关的病症。其他神经变性病症可包括创伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤和遗传性疾病或由它们引起的那些。

特别地，本文公开的方法包括：将已经在体外扩增的CiLR神经元移植到需要其的受试者中，以使细胞能够改善所述神经变性疾病。扩增的神经元样细胞的移植可用于改善患有各种形式的脊髓病的受试者的行走功能，所述脊髓病具有痉挛、僵硬、癫痫发作、麻痹或任何其他的肌肉过度活跃的症状。例如，在Johe等人的美国专利号8,236,299中，公开了用于扩增和移植神经细胞和神经祖细胞用于不同神经变性疾病的治疗的方法。

(iii)肝病症

肝功能衰竭和功能丧失为肝病最严重的后果之一。肝移植由于起效快速，进展快速，为治疗这些疾病的主要手段。然而，捐赠者严重缺少，导致许多患者在等待肝移植时死亡。CiLR肝细胞可以利用载体例如已知用于移植肝细胞的基质，而移植至接受者机体中。例如,Zhou,等.,Liver Transpl.,17(4):418-27(2011)公开了去细胞的肝基质(DLM)作为用于肝细胞移植的载体的用途。用于从组织样品中分离肝和胰腺细胞，接种至聚-L-乳酸基质上并重植入同一患者的肠系膜中的方法是本领域已知的。

CiLR肝细胞也可用于生物-人工肝支持系统。构建基于本文公开的细胞的生物人工肝支持系统以临时替代肝功能衰竭的主要功能(有害物质的去除、提供肝脏合成生物活性物质)以稳定和改善患者的内部环境，直到有对移植而言合适的供体来源为止。用于制备生物人工肝的方法，公开于例如美国专利公开号2008/0206733中。

(iv)癌症治疗

CiLRC及其后代的治疗用途包括：将细胞移植到个体中以治疗和/或改善与癌症相关的症状。例如，在一个实施方式中，可以将CiLRC施用于已经经历杀死、减少或损害受试者的细胞的化学疗法的癌症患者。在对于癌症的典型干细胞移植中，使用了非常高剂量的化学疗法，通常与放射疗法一起以努力破坏所有癌细胞。这种治疗也会杀死在骨髓中的干细胞。在治疗后不久，提供干细胞以替换被破坏的细胞。

在另一个实施方式中，可以用至少一种另外的治疗因子(除了去分化因子以外)对CiLRC进行转染或转化。例如，一旦分离出CiLRC，所述细胞可以用编码治疗性多肽的多核苷酸进行转化然后将其植入或施用于受试者，或可以被分化成所需的细胞类型并植入并递送给受试者。在这样的条件下，所述多核苷酸在受试者体内表达，以进行多肽产物的递送。

(v)组织工程化

CiLRC及其后代可使用本领域已知的方法以用于制备组织工程化构建体。组织工程化构建体可用于多种目的，包括例如作为受损器官或组织的修复或置换的假体装置。一般而言，它们也可以用作对于由构建体的细胞分泌的蛋白质或其他分子的体内递送系统，或作为药物递送系统。组织工程化构建体还可用于作为组织功能的体外模型、或用于作为试验各种治疗或药物的效果的模型。用于干细胞移植的最常用的生物材料支架综述于Willerth,S.M.和Sakiyama-Elbert,S.E.,Combining stem cells and biomaterialscaffolds for constructing tissues and cell delivery(7月9日,2008),StemBook,ed.The Stem Cell Research Community,StemBook。组织工程化技术经常涉及维持和促进组织生长的合适的培养基质的选择。一般而言，这些基质应该是三维的且应该是可加工的，以形成对于目标组织而言所需形状的支架。

美国专利号6,962,814一般地公开了用于生产组织工程化构建体和工程化的天然组织的方法。关于具体实例，在Vacanti等的美国专利号7,914,579中，公开了组织工程化的韧带和肌腱。在美国专利号5,716,404中公开了用于重建或增强乳房组织的方法和组合物，其使用与聚合物基质组合植入的解离的肌细胞。美国专利号8,728,495公开了使用自体真皮成纤维细胞进行的软骨的修复。在由Duailibi等人的美国公开申请号20090029322中，公开了干细胞的用途，其用于形成牙齿组织以用于制造牙齿替代品。美国公开申请号2006/0019326公开了用于颅内微动脉瘤的治疗的细胞接种组织工程化聚合物。由Atala的美国公开申请号2007/0059293公开了可用于替换受损器官例如：肾脏、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、膀胱、输尿管和尿道的组织工程化构建体(以及制备这种构建体的方法)。

CiLRC可以配制使得用于施用、递送至或与受试者、组织或细胞进行接触，以促进在体内或体外/离体的去分化。可以掺入其他因子，例如生长因子、诱导分化或去分化的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎剂、退行因子，促进神经支配、血管形成或增强淋巴网络的生物活性化合物和药物。

CiLRC可以通过组合物方式施用于患者，所述组合物包括：仅CiLRC的群体、或在载体或支持体结构之上或之中的CiLRC的群体。在许多实施方式中，并不需要载体。细胞可以通过注射而被施用至需要所述细胞的部位上或其中。在这些情况下，细胞通常经历洗涤以除去细胞培养基，并悬浮在生理缓冲液中。

在其他实施方式中，细胞以与支持体结构一起、或结合到支持体结构上、或支持体结构中的方式提供。支持体结构可以为网状物、固相支持体、支架、管、多孔结构和/或水凝胶。支持体结构可以全部或部分地为可生物降解的或不可生物降解的。支持体可以由以下形成：天然或合成的聚合物、金属如钛、骨骼、或羟基磷灰石、或陶瓷。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、多糖和粘多糖。合成的聚合物包括：多羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚羟基烷酸酯如聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氨基甲酸酯、聚碳酸酯和聚酯。这些可以为植入物、管、网状物或水凝胶的形式。

固相支持体

支持体结构可以为松散的编织或非编织网，其中，细胞被接种在网中和网上。该结构中可包括固相结构支持体。支持体可以为管，例如，用于神经轴突再生的神经管。支持体可以为支架或瓣膜。支持体可以为关节假体，例如膝盖或髋关节或其的一部分，所述关节假体具有允许细胞的向内生长和/或将细胞接种到多孔结构中的多孔界面。许多其他类型的支持体结构也是可以的。例如，支持体结构可由海绵、泡沫、珊瑚或具有内部孔的生物相容性无机结构、或交织的聚合物纤维的网片形成。这些支持体结构可以使用已知方法制备。

支持体结构可以为可渗透结构，所述可渗透结构具有成形并支持水凝胶-细胞混合物的孔状空腔或空隙。例如，所述支持体结构可以为：多孔聚合物网、天然或合成海绵、或由金属、或例如骨或羟基磷灰石的材料形成的支持体结构。支持体结构的孔隙度应使得营养物质可以扩散到结构中，从而有效地到达在内的细胞，且细胞产生的废物可以扩散出结构。

支持体结构可以成形为符合新组织期望的空间。例如，支持体结构可以成形为符合已经烧伤的皮肤的区域、或已经丢失的软骨或骨骼部分的形状。取决于制造它的材料，支持体结构可以通过被切割、模制、铸造或任何其他产生所需形状的方法成形。如下所述，支持体可以在将细胞接种至、或用水凝胶-细胞混合物填充支持体结构之前或之后成形。

合适的聚合物的实例为聚乳酸，其为乙交酯和丙交酯的90:10共聚物，并且制造为VICRYL^TM编织的可吸收缝合线(Ethicon Co.，Somerville，N.J。).聚合物纤维(例如，VICRYL^TM)可以编织或压缩成毡状聚合物片材，然后可以将其切割成任何所需形状。或者，聚合物纤维可以在将它们模铸成对于支持体结构所需的形状的模具中压缩在一起。在一些情况下，可以在聚合物纤维被模塑时将另外的聚合物添加到聚合物纤维中以修改或赋予纤维网格额外的结构。例如，可以将聚乳酸溶液添加至该聚乙醇纤维网的片材中，从而可以将该组合一起模塑以形成多孔支持体结构。聚乳酸与聚乙醇酸纤维的交联结合，从而包覆这些个体纤维，并使模塑的纤维的形状固定。聚乳酸也填充在纤维之间的空间中。因此，孔隙率可根据引入支持体中的聚乳酸的量而改变。将纤维网成型为所需形状需要的压力可以非常适中。所有需要的是将纤维保持就位足够长时间以使聚乳酸的粘合和包覆作用生效。

备选地或可附加地，支持体结构可以包括通过本领域已知技术生产的其他类型的聚合物纤维或聚合物结构。例如，薄的聚合物薄膜可以通过从聚合物溶液中蒸发溶剂而得到。如果从具有所需形状的浮雕图案的模具中蒸发聚合物溶液，则可以将这些薄膜铸成所需的形状。还可以使用本领域已知的压缩模塑技术，将聚合物凝胶模塑成为薄的可渗透性聚合物结构。

水凝胶

在另一个实施方式中，将细胞与水凝胶混合以形成细胞-水凝胶混合物。水凝胶可以通过注射或导管施用、或在其他支持体结构的植入时施用。交联可以在施用之前，期间或之后发生。

B.筛选方法

用于鉴定试剂的筛选系统和方法，所述试剂使处于XEN样状态的细胞偏向于特定谱系(经修饰的XEN样状态)，所述XEN样状态随后可诱导成为该谱系。

所述方法包括：筛选小分子文库以鉴定对于用于化学诱导XEN样状态(VC6TFAE)的分子的代替物，所述代替物将增加在靶细胞例如成纤维细胞中的谱系决定基因的表达，所述谱系决定基因优选为来自三个胚层中的每一个的至少一个基因。受精后的发育经由三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层的形成而进行。外胚层发育成表面外胚层、神经嵴和神经管。表面外胚层发育成：表皮、毛发、指甲、眼睛的晶状体、皮脂腺、角膜、牙釉质、口腔和鼻的上皮。外胚层的神经嵴发展成：周围神经系统、肾上腺髓质、黑色素细胞、面部软骨、牙齿的牙本质。外胚层的神经管发育成：脑、脊髓、垂体后叶、运动神经元、视网膜。中胚层形成：肌肉(平滑肌和条纹肌)、骨骼、软骨、结缔组织、脂肪组织、循环系统、淋巴系统、真皮、泌尿生殖系统、浆膜和脊索。内胚层形成大部分消化道的上皮衬里。它也形成通向消化管的所有腺体的衬里细胞。

本文公开的方法可用于鉴定能够用于使XEN样细胞偏向控制细胞命运的基因表达朝向三个胚层的试剂。

用作谱系指示物的基因为本领域已知的，并且包括例如GATA3，GATA6和SOX7，它们涉及中内胚层(ME)谱系特化；外胚层谱系指示物Dlx3，GMNN；另外的谱系指示物包括Oct4，Sox2，Gata4，Pax1，CEBPa，GRB2，ASCL1，MIXL1，Sox1，Sox3和RCOR2和Henf4a(Shu等，Cell，153：963-975(2013))。具体而言，神经外胚层标记物包括：神经外胚层基因：Sox2、Msl1、Nefl；NefH、Pax3、Pax6和neurog2；中胚层基因：Msx1、Smn1、Lmo2 Eomes、Bmps、Msx2；以及内胚层基因：Hnf1b、Krt8、Gata4、Sox17、Krt18、Foxa2、cdh1、Cdx2和Gata6。

V.试剂盒

本发明提供了试剂盒，其包括本文公开的谱系重编程(CiLR)的化学诱导剂。CiLR如上所述。这些可以处于具有定义的浓度的形式，以帮助将其添加到细胞培养基中以产生所需浓度。试剂盒可包括基于待诱导细胞类型而提供需要的浓度范围及施用的时间的指导。试剂盒还可以包括细胞培养基，其与CiLR预混合用于培养细胞以诱导谱系重编程。

本发明通过参考以下非限制性实施例而得到进一步理解。

实施例

材料和方法

小鼠

TauEGFP敲入小鼠、Fsp1-Cre转基因小鼠和Rosa26-loxp-STOP-loxp-tdTomato小鼠如先前报道的那样(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))制备。Oct4-CreER小鼠(货号016829)来自Jackson实验室，并与Rosa26-lox-STOP-lox-tdTomato小鼠杂交以制备用于追踪Oct4的成纤维细胞，如先前报道的那样(Bar-Nur等，Nat Biotechnol.,33:761-768(2015))。所有动物实验均根据中国北京大学动物保护指南进行。

细胞培养

如前所述(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))分离并制备了成纤维细胞，并在补充了10％FBS(Pan-Biotech)、1％GlutaMAXTM-I(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)、0.055mMβ-ME(Sigma)的DMEM(Gibco)中培养。小鼠ESC和iPSC在含有KnockOut DMEM(Invitrogen)、10％KSR(Invitrogen)、10％FBS(Pan-Biotech)、1％GlutaMAXTM-I(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)、0.055Mmβ-ME(Sigma)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、1,000U/ml白血病抑制因子(LIF，Miltenyi Biotec)和2i(3μMCHIR99021和1μM PD0325901)的ESC培养基中在丝裂霉素C处理的MEF的饲养层上培养。

用于从成纤维细胞化学诱导神经元的具体方案

小分子制备

本研究中使用的小分子详细列于下表(表1)，包括：VPA、TD114-2、616452、反苯环丙胺、毛喉素、AM580、EPZ004777等。如先前报道的那样(Zhao等，Cell，163：1678-1691(2015))制备小分子化合物。根据化学结构合成了TD114-2(Kuo等，J.Med.Chem.，6,4021-4031(2003))。

表1.本研究中使用的；以及图1涉及的小分子

全名	缩写	剂量(uM)	来源
				VPA	V	500	Sigma,cat.no.P4543
CHIR99021	C	10-20	由WUXI APPTEC合成
				616452	6	10	由WUXI APPTEC合成
反苯环丙胺	T	5	Enzo,cat.no.BML-EI217-0005
				毛喉素	F	10-50	Enzo,cat.no.BML-CN100-0100
AM580	A	0.05	Tocris,cat.no.0760
				EPZ004777	E	5	Selleckchem,cat.no.S7353
TD114-2	TD114-2	2-4	由WUXI APPTEC合成
				Dorsomorphin	D	1-2	Tocris,cat.no.3093
LDN193189	L	0.1	Selleckchem,cat.no.S2618
				SB431542	S	2-10	Tocris,cat.no.1614

培养基制备

第一阶段培养基制备：补充了10％KSR(Invitrogen)、10％FBS(Pan-Biotech)、1％GlutaMAXTM-1(Invitrogen)、1％NEAA(Invitrogen)、0.055mMβ-ME(Sigma)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、100ng/ml bFGF(Origene)的KnockOut DMEM(Invitrogen)中，含有以下小分子混合物：0.5mM VPA、2～4μM TD114-2或20μM CHIR、10μM 616452、10μM反苯环丙胺、10～50μM毛喉素、0.05μM AM580和5μM EPZ004777(VT6TFAE或VC6TFAE)。对于小鼠成体肺成纤维细胞(MAF)的诱导，添加了1μM CH55和50μg/ml维生素C(VC)以增强诱导效率。

第二阶段培养基制备：含有0.5％N-2(Invitrogen)、1％B-27(Invitrogen)、1％GlutaMAXTM-I(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、25ng/ml bFGF、20ng/mlBDNF、20ng/ml GDNF的Neurobasal(Invitrogen)中，含有以下小分子混合物：10～50μM毛喉素、3μM CHIR、1μM Dorsomorphin(FCD)(0.1μML DN193189和5μM SB431542，它们不是诱导神经元必不可少的，但有利于提高诱导效率)。

从成纤维细胞化学诱导神经元

TauEGFP成纤维细胞如先前报道的那样(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))制备。将成纤维细胞以每孔30,000～50,000个细胞的密度接种于6孔板、或以每100mm培养皿300,000个细胞密度进行接种(第-1天)(成纤维细胞培养基-DMEM基础培养基+10％FBS++beta-Me(0.055mM))+1％PS)。培养板或培养皿用0.1％明胶预包被。

将培养基更换为第一阶段培养基(第0天)。对于第一阶段化学重编程，细胞由含有0.5mM VPA、2～4μM TD114-2或20μMCHIR、10μM616452、10μM反苯环丙胺、10～50μM毛喉素、0.05μM AM580和5μM EPZ004777(VT6TFAE或VC6TFAE))的培养基诱导12天。在诱导期间，每4天更新培养基。XEN样集落在大约第6～8天形成。

在第12天，将细胞切换为第二阶段神经特化培养基。在利用第二阶段培养基诱导8～12天后，生成了TauEGFP阳性集落。将TauEGFP阳性集落进一步重新铺板而与原代星形胶质细胞或原代神经元共培养，以进行成熟。

可选步骤：第一阶段结束时的XEN样集落是紧密的。在第12天执行重新铺板步骤，可以扩增XEN样集落并增强神经元的产率。

以6孔板的每孔10,000-200,000个细胞的密度，在第一阶段培养基中对细胞进行胰蛋白酶消化并重新铺板。在重新铺板后4～6天重新形成XEN样集落，然后切换成第二阶段神经诱导培养基。在第二阶段培养基中8～12天后，XEN样集落变为TauEGFP阳性。正如神经突样生长的发展所展示的那样，延长诱导期可以产生更多的TauGFP阳性集落并增强成熟度。这些TauEGFP阳性细胞可以进行表征、或重新铺板而与原代星形胶质细胞或原代神经元共培养，以进行进一步成熟。

原代神经元培养、原代星形胶质细胞培养和共培养

神经元的原代培养如前所述地(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))进行。从出生后第1天的野生型ICR小鼠中分离了原代星形胶质细胞。消毒后，将小鼠断头。将它们的大脑和海马体移入预冷的PBS(Gibco)中。除去脑膜并切除残余的组织。组织的碎片用2ml0.25％胰蛋白酶(Gibco，溶解于消化溶液中)消化20分钟，然后用含有10％FBS(GIBCO)的2ml Dulbecco改良的Eagle培养基/F12(DMEM)培养基(Gibco)终止消化。将细胞以1500rpm离心5分钟，并重悬于DMED/F12培养基中，将总共6×10⁵个细胞铺板到100mm培养皿上30分钟。之后，吸出上清并放入用12.5μg/ml聚-D-赖氨酸包被的25cm2培养瓶中。将培养瓶在37℃、5％CO₂/95％空气中温育。每3天换新一次培养基。在第10天，将摇瓶以260rpm在摇床中摇动18小时，以除去小胶质细胞。在分离原代神经元和星形胶质细胞一周后，将TauEGFP阳性集落用胰蛋白酶消化，并重新铺板到原代神经元或星形胶质细胞上，以进行进一步成熟。

倍增时间分析

通过每8小时计数(n＝3)，确定了不同传代数的ES细胞、成纤维细胞、CeXEN细胞和XEN样细胞的细胞数。通过线性回归拟合这些细胞的生长曲线，并对起始细胞密度进行归一化。对于每个分析的时间窗口，倍增时间计算为倍增时间＝ln(2)/的生长速率。

XEN样细胞传代和扩增

从所有孔中将第12天诱导的XEN样集落(P0)胰蛋白酶消化下来，并以1:10～20的比例在第一阶段培养基中重新铺板到明胶包被的培养板上，进行第一次传代。在第1代的XEN样细胞变得汇合后，每3～4天在第一阶段培养基中以1:20～30的比例对细胞进行传代。XEN样细胞可以在第一阶段培养基中长期扩增多于20次传代且具有谱系特化潜力。

对于单个原代XEN样菌落传代，需要经丝裂霉素C处理的MEF的饲养层。用1ml注射器取出单个原代XEN样菌落，用胰蛋白酶消化5分钟并用第一阶段培养基进行中和，然后用吸管上下吹打，得到单细胞悬液。用第一阶段培养基将细胞悬浮液接种于饲养层上，以进行进一步扩增。XEN样细胞的随后的传代可以是无饲养细胞的。

对于来自传代的XEN样细胞的神经诱导而言，将细胞以每孔50,000～100,000个细胞接种于6孔板(具有明胶包被)的第一阶段培养基中(第0天)。直到传代的细胞在第2天或第3天达到70～80％汇合，将XEN样细胞切换为第二阶段神经诱导培养基。在12～20天后，出现了TauEGFP阳性集落。

注意：

由于XEN样细胞的高增殖率，因此，相对低的初始细胞密度有利于进行从传代的XEN样细胞的神经诱导。

考虑到在第二阶段，在高浓度50μM下使用的FSK对传代的XEN样细胞是有毒的，优选其在位于传代的XEN样细胞上的神经诱导培养基中的浓度为10～20μM。

从CeXEN细胞系产生神经元

具有TauEGFP报告基因的CeXEN(化学来源的eXEN)细胞，是如先前报道那样从E3.5囊胚使用第1阶段培养基衍生而成(Zhao等，Cell，163:1678-1691(2015))。每天更换培养基，每3天以1:20至1:30的比例对细胞进行传代。

1.对于化学诱导，将CeXEN细胞以每孔50,000～100,000个细胞在第一阶段培养基中接种于6孔板(具有明胶包被)(第0天)。

2.在第2天或第3天，直到70～80％汇合，将细胞切换到第二阶段神经诱导培养基中12～20天，而生成了TauEGFP阳性细胞。

由于CeXEN细胞的高增殖率，相对低的初始细胞密度有利于进行来自传代的CeXEN细胞的谱系诱导。

考虑到在第二阶段，以高浓度50μM使用的FSK对CeXEN细胞是有毒的，优选其在位于CeXEN细胞上的神经诱导培养基中的浓度为10～20μM。

免疫荧光

如前所述进行了免疫荧光(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))。对于免疫荧光，一级抗体包括对TUJ1(Covance，兔抗，1:500)、TUJ1(Santa Cruz，小鼠抗，1:100)、MAP2(Sigma-Aldrich，小鼠抗，1:200)、NF-H(Abcam，兔抗，1:500)、SYN(Abcam，兔抗，1:500)、NEUN(Millipore，小鼠抗，1:100)、vGLUT1(Synaptic Systems，兔抗，1:5,000)、GABA(Sigma-Aldrich，兔抗，1:5,000)、OCT4(Abcam，兔抗，1:200)、NANOG(Abcam，兔抗，1:200)、SALL4(Abcam，兔抗，1:500)、SOX17(R&D，山羊抗，1:500)、GATA4(Santa Cruz，山羊抗，1:100)、GATA6(R&D，山羊抗，1:200)、AFP(Santa Cruz，小鼠抗，1:200)、ALB(Abcam，山羊抗，1:500)特异的抗体。本研究中使用的二级抗体包括：488-缀合的二级抗体、Cy3-缀合的二级抗体、以及647-缀合的二级抗体(Jackson ImmunoResearch)。

qRT-PCR

使用Direct-zol^TM RNA试剂盒(Zymo Research)提取总RNA，并使用TransScriptOne-step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)将其逆转录成cDNA。使用

FASTqPCR Kit Master Mix(KAPA Biosystems)进行实时PCR，并在CFX ConnectTM实时系统(Bio-Rad)上进行。将在该研究中使用的引物列于表2中。数据使用ΔΔCt方法进行分析。将所有结果针对Gapdh表达归一化，并将成纤维细胞的值设定为1。使用了两个重复样本以确定误差棒。

表2.用于实时qPCR的引物

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RNA-seq

使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)分离总RNA。使用用于

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Ultra^TMRNA文库制备试剂盒(NEB)，构建了RNA测序文库。使用Illumina HiSeq 2500，对已片段化且随机引物化的2×100bp的配对末端文库进行测序。使用RPKM值用于评估基因的表达水平。层次聚类由Cluster 3.0和TreeView实行。在散点图中，设置了2倍变化阈值截止值用于分析。使用DAVID程序进行所述DE基因的基因本体分析。

电生理学

全细胞膜片钳记录如前所述进行(Li等，Cell Stem Cell,17:195-203(2015))。人造脑脊液细胞外溶液含有(以mM计)：141NaCl、2.5KCl、1.3MgCl₂、2.4CaCl₂、1.25NaH₂PO₄、10葡萄糖和10HEPES，用NaOH将pH调节至7.4。用P97微量移液器(Sutter Instruments)拉动贴片移液管(～5MΩ尖端电阻)，其中所述P97微量移液器填装的内部移液管溶液中含有(以mM计)：140葡萄糖酸钾、1CaCl₂、10EGTA、2MgCl₂、5Na₂ATP和10HEPES，用KOH将pH调节至7.4。膜片钳记录使用具有PatchMaster的EPC-10放大器(HEKA)取得。细胞膜电位通常保持在-80mV并去极化，以10mV的增量测试-80至+80mV的电位，以记录钠和钾电流。样品为20μs，扫描间隔为2s。对于电流钳记录，将超极化电流注入化学神经元至膜电位约-70mV。动作电位通过步进去极化电流引发，扫描间隔为3秒。将细胞保持在0pA，以记录静息膜电位。在电流钳模式下，采样频率为25kHz。将经GFP鉴定的经诱导的神经元与小鼠原代星形胶质细胞共培养，以记录自发兴奋性突触后电流(sEPSC)或自发抑制性突触后电流(sIPSC)。经诱导的神经元分别被保持在-70mV(接近氯的反转电位)和0mV的保持电位。数据以20kHz进行连续数字化。对于神经递质反应，将谷氨酸盐(100μM，Sigma-Aldrich)溶解在ACSF中，装填入移液管中，并使用picosprizer III(Parker Instrument)以10psi和1s持续时间喷到hciN细胞上。所有记录均在室温下实行。

对于脑切片记录，将小鼠脑快速解剖并置于含有以下成分的冰预冷含氧人工CSF(aCSF)中(以mM计)：125NaCl、2.5KCl、2CaCl₂、2MgCl₂-6H₂O、1.25NaH₂PO₄-2H₂O、25NaHCO₃和10葡萄糖，pH 7.4。用振动切片机(VT-1200S；Leica)制备了300mm厚的冠状动脉切片，并在转移到记录室之前，在含有含氧的(95％O 2/5％CO2)aCSF的温育室中于37℃保持15分钟然后转移至室温30分钟。

核型和比较基因组杂交(CGH)分析

如前所述进行核型分析。对于CGH实验，提取了基因组DNA，并与Imagenes的NimbleGen 2x105K小鼠全基因组平铺阵列杂交，使用来自TauEGFP敲入小鼠的MEF DNA作为参照(Gene BioDesign)。

流式细胞术

使用FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson)估计了TauEGFP阳性细胞的诱导效率，流式细胞术数据使用FlowJo进行分析。对于细胞内流式细胞术分析，单细胞悬浮液用抗体进行染色，并使用BD FACSCalibur进行分析。

细胞移植和免疫组织化学

对于TauEGFP阳性细胞移植，成年BALB/c-nu小鼠(8周龄)用0.8％戊巴比妥钠麻醉，并接受了立体定位手术。将在4μl人造脑脊髓液(aCSF)中的约1×10⁵个细胞，以下列坐标(AP＝+0.5mm，ML＝-2.0mm，DV＝-3.0mm)注射至左侧纹状体中。对于脑切片的免疫组织化学，小鼠在移植后4周用0.8％戊巴比妥钠麻醉，并用0.9％盐水溶液灌注，然后用4％经冰冷却的磷酸盐缓冲的多聚甲醛(PFA)灌注。移出脑，并在4℃浸入4％PFA中过夜。然后将脑依次转移到20％和30％蔗糖中，以对组织进行冷冻保护。在用OCT溶液(Tissue-Tek)包埋后，在冷冻切片机上切割为厚度为30μm的冠状动脉切片，并储存于-20℃。对于免疫染色，将脑切片与一级抗体在4℃孵育过夜，然后在室温与相应的二级抗体孵育2小时。所有切片均由Fluoroshield用DAPI(Sigma)固定。

从XEN样细胞诱导肝细胞样细胞

1.XEN样细胞(如上所述，通过在第一阶段细胞培养基中培养成纤维细胞获得)以每孔50,000个细胞的密度接种于12孔板(第-2天)。

2.在第0天，直至70％汇合时，将细胞切换为特化培养基持续10天，所述特化培养基含有：DMEM培养基、1％N₂、1％B27、1％Glutamax、1％青霉素/链霉素(P/S)、20ng/ml激活蛋白A、20ng/ml EGF、20ng/ml BMP4、10ng/ml FGF2。

3.然后将细胞更换为成熟培养基再进行10天，所述成熟培养基含有：改良的HCM、10ng/ml OSM、0.1uM DEX。

每天更新培养基。在约第20天，出现了典型的肝细胞样形态。对这些诱导的肝细胞样细胞进行表征。

注意：由于XEN样细胞的高增殖率，因此，相对低的初始细胞密度有利于进行从来自传代的XEN样细胞的肝诱导。

原代肝细胞分离和培养

小鼠原代肝细胞如前所述从小鼠肝脏分离，并在HCM培养基(LONZA)中在胶原蛋白包被的培养皿中培养24小时用于ELISA分析。用TRI Reagent裂解小鼠胎肝组织，用于RNA提取。

白蛋白和尿素分泌

使用小鼠ALB ELISA试剂盒或尿素分析试剂盒(来自QuantiChrom^TM)，测量了培养上清中的白蛋白和尿素的量。

结果

微调化学配方以使以稳健的方式得到XEN样细胞

事先建立的用于从成纤维细胞产生化学诱导的多能干细胞(CiPSC)的方案在用七种化合物的混合物(VPA、CHIR99021、616452、反苯环丙胺、毛喉素、AM580和EPZ004777；VC6TFAE)重编程的早期阶段诱导了XEN样原代集落(Zhao等，Cell，163：1678-1691(2015))(表1)。这项研究的重点为在不改变Xen样状态的情况下，提高Xen样状态的产率。为此目的，将TD114-2鉴定为比CHIR99021更优选的GSK3-β抑制剂(表1)。通过用TD114-2替换CHIR99021，原代集落的产率增加了3倍，而不改变XEN样状态的建立(图1A和B，数据未示出)。因此，鉴定了以显著改善的方式从成纤维细胞诱导XEN样细胞的一种新的小分子混合物(VT6TFAE)。

从XEN样状态稳健地产生神经元样细胞

先前的研究鉴定了具有擦除的标记成纤维细胞基因的即用特征的XEN样状态，所述XEN样状态可以进一步诱导成为多能性状态(Zhao等，Cell，163:1678-1691(2015))。本研究试图从Xen样细胞产生其他功能性细胞，同时绕过多能性的步骤。

为了从XEN样状态诱导神经元细胞，使用了促进神经谱系分化的化学化合物(图1C和表1)。使用这些化学诱导剂，早在神经诱导后4天就诱导了表明其获得神经元命运的TauEGFP阳性细胞，利用经优化的起始细胞密度进行诱导8～12天后诱导效率>50％(图1D，数据未示出，和图1E)。使用相同的方案从出生后的成纤维细胞诱导了神经元样特征。还从成熟成纤维细胞产生了TauEGFP阳性细胞，并通过对于神经元标记物TUJI和MAP2的阳性共免疫染色证实了所述细胞的神经元身份(数据未示出)。

对于这些化学诱导剂的单独作用以及培养基中的梯度而言，通过检查在不存在这些因子的情况下的神经-、成纤维细胞-和XEN-特异性基因而进一步确定(图1F)。数据显示，优选GDNF和毛喉素的存在。GDNF对于诱导神经元主基因和功能基因是重要的，而毛喉素对于下调成纤维细胞特异性基因是重要的。

TauEGFP阳性细胞也可以从CHIR诱导的(VC6TFAE诱导的)XEN样细胞产生，尽管具有较低的效率(图1D)。通过延长神经元特化期，许多经诱导的TauEGFP阳性集落产生了大量的TauEGFP阳性神经突样分支(数据未示出)，表明成熟过程。综上所述，在进一步的神经元特化后，可以从XEN样细胞诱导神经元样细胞命运。

经诱导的神经元样细胞表达神经元标记基因

为了探索这些TauEGFP阳性细胞的经诱导的神经元特性，对在这些细胞中典型的泛神经元标记物的表达进行了检查。共免疫染色显示：经诱导的具有广泛神经突生长的TauEGFP阳性细胞共表达了多种神经元特异性蛋白，包括：TUJ1、MAP2、NF-H和周围的突触蛋白阳性的斑点(数据未示出)。此外，根据通过vGLUT1的共表达(80％效率)和GABA的共表达(5％效率)所检测的那样，兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性GABA能神经元均在延长的神经元特化时间后约18天产生，即，获得了80％vGLut1/TauEGFP双阳性和5％ GABA/TauEGFP阳性细胞(数据未示出)。对经诱导的细胞群体的检查还显示了约20％GFAP阳性星形胶质细胞样细胞(数据未示出)。

经诱导的神经元的表达谱与原代神经元的表达谱相似

为了更好地理解经诱导的细胞的特性而进行了RNAseq，以分析经诱导的神经元的表达模式。分层聚类分析显示了经诱导的神经元与原代神经元分组接近并与成纤维细胞区别(数据未示出)。进一步的分析显示，在化学诱导后，经诱导的细胞表现出多种神经元特异性基因，包括泛神经元基因(Mapt、Map2和Dcx)和功能性突触成分(Stmn3、Stmn4和Syp1)的丰富表达，而成纤维细胞的标志性基因的表达显著下调(数据未示出)。

为了进一步理解化学重编程过程，选择了被化学诱导最强力地上调或下调(>10倍差异表达)的基因，用于GO(基因本体论)分析。结果显示，上调的基因在突触传递、离子转运、神经元分化和神经元发育、涉及神经发生的关键生物过程(图2A)中高度富含，而下调的基因参与了细胞粘附、细胞迁移和细胞生长(图2A)。综上所述，这些结果说明，这些化学诱导的神经元具有类似于原代神经元的转录谱，并与原始的成纤维细胞的转录谱区别。

经诱导的神经元的功能特性和成熟

为了检查经诱导的神经元的电生理学功能特性，进行了全细胞膜片钳记录。通过以电流钳模式对膜进行去极化，在12+12天的化学诱导后，在经诱导的TauEGFP阳性神经元上引发了动作电位(AP)(图2B和表3)。

表3.从胚胎成纤维细胞(MEF)化学经诱导的神经元的电生理学特性

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*没有与星形胶质细胞共培养。

Rm：输入电阻；

Cm：膜电容；

RMP：静息膜电位；

AP阈值：动作电位阈值；

APamp：动作电位幅度；

Ina-max：钠电流的最大幅度。

所有数据均为平均值+/-SEM。

此外，在电压钳模式中，对经诱导的神经元也记录了对应于这些细胞的电压依赖性K⁺-和Na⁺-通道的开放的快速、失活的内向和外向电流(图2B和表3)。这些结果显示，通过使用这种基于XEN样状态的化学重编程，可以诱导功能性神经元。

为了进一步增强功能成熟度，将经诱导的神经元样细胞重新铺板到预先存在的原代星形胶质细胞的单层培养物上，如先前报道的那样(Li等，Cell Stem Cell，17：195-203(2015))。在重新铺板后，经诱导的TauEGFP阳性细胞显示出更复杂的神经元形态，表明了成熟过程(数据未示出)。经诱导的细胞的功能性膜特性得到进一步改善(85％，n＝13，即85％的检查的细胞是功能性的)(数据未示出，2C和2D；表3)，并对诱导的TauEGFP阳性细胞(54.5％，n＝11)记录了自发兴奋性突触后电流(EPSCs)，所述自发兴奋性突触后电流可被特异性受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)和2-氨基-5-膦酰戊酸(AP5)阻断(图2E)。此外，在高达80％的经诱导的TauEGFP阳性细胞中，也检测到成熟的神经元转录因子NEUN(数据未示出)。通过100μM谷氨酸的局部施用对内向膜电流的诱导，证实了经诱导的神经元的功能亚型特性(图2F)。这些结果显示，经诱导的神经元显示出功能性成熟特性，并能够在进一步成熟后形成功能性突触。这些研究中的化学诱导的神经元与天然存在的神经元一样不依赖于BDNF或GDNF来存活。为了证明这一点，从用于经诱导的神经元的培养基中撤去了BDNF和/或GDFN。结果显示，CiLR神经元存活是不依赖于BDNF或GDNF的，这与培养原代神经元相似。从培养基中撤去BDNF和/或GDFN后，没有明显的细胞死亡或神经元变性(数据未示出)。

从新生儿和成体成纤维细胞产生XEN样细胞衍生的神经元

为了证明本发明的方法的适用性，使用所述方法对新生儿和成体成纤维细胞进行了重编程。通过使用与诱导胚胎成纤维细胞相同的方案(本文讨论的)，可以从新生儿成纤维细胞(出生后第3天)有效地产生XEN样衍生的神经元(图2I)。对于来自>8周龄小鼠的成体成纤维细胞的重编程而言，可以诱导成XEN样细胞，尽管效率较低(图2J)，这可能是由培养期间的细胞衰老导致的。通过提供另外两种小分子化合物，维生素C(抑制细胞衰老和增强细胞增殖)和CH55(提高重编程效率)，在12天的诱导中产生XEN样细胞的效率显著提高，并且在12天的神经元特化后，也从这些XEN样细胞产生了神经元细胞(图2J和图1C)。这些结果显示，本文公开的方法也可用于对产后成纤维细胞进行重编程。

在移植入成年小鼠脑后，经诱导的神经元存活和成熟

为了检查XEN样状态衍生的化学诱导的神经元的体内功能性能力，将得到的TauEGFP阳性神经元细胞移植到成年小鼠(>8周龄)的纹状体中。在移植4周后，在注射的部位清楚地检测到存活的TauEGFP阳性细胞移植物(数据未示出)。通过对神经元特异性基因包括成熟神经元转录因子NEUN、TUJI和MAP2的共免疫染色，进一步证实了细胞移植物的神经元身份和成熟特性(数据未示出，图2G)。此外，在新鲜脑切片中的移植的TauEGFP阳性细胞表现了功能性电生理学特性(图2H)。综上所述，这些结果表明这些XEN样状态衍生的神经元细胞的体内功能性。

谱系追踪证实经诱导的神经元的成纤维细胞起源

为了检查经诱导的神经元的成纤维细胞起源，如先前报道的那样使用Cre-LoxP系统追踪了表达成纤维细胞特异性蛋白1(Fsp1)的原始成纤维细胞(Cell Stem Cell，17：195-203(2015))(图3A))。这些研究试图证明本文获得的诱导神经元最初来源于成纤维细胞，而不是来源于在制备过程中可能污染MEF的神经元祖细胞。

最初的成纤维细胞并不全部为tdTomato阳性，在化学诱导后，经诱导的tdTomato阳性集落中有大约30％为TauEGFP阳性(数据未示出，图3B)。共免疫染色显示，具有广泛轴突生长的经诱导的TauEGFP和tdTomato双阳性细胞与tdTomato共表达了多种神经元特异性蛋白，包括TUJ1、NF-H和SYN(数据未示出)。此外，这些TauEGFP和tdTomato双阳性细胞在进一步的神经元特化后也可以发育成功能性神经元。膜片钳记录显示了诱导的TauEGFP和tdTomato双阳性神经元的功能特性(数据未示出，图3C)。这些结果提供了通过使用这种化学诱导策略，可以从成纤维细胞来源诱导功能性神经元的直接的遗传证据。

谱系追踪证实化学重编程绕过了多能性的获得

为了进一步研究重编程过程并确定化学诱导是否绕过了多能性状态，在不同的诱导阶段进行了实时qPCR和免疫染色。在整个化学重编程过程中，未检测到标志性多能性基因包括Oct4、Nanog和Esrrb的内源表达(图3D)。

为了仔细研究从多能性状态的短暂获得中诱导神经分化的可能性，使用了CreER-LoxP系统追踪了作为控制多能性的核心转录因子的Oct4的内源性表达，如先前报道的那样(Bar-Nur等,33:761-768(2015))。通过引入四种Yamanaka转录因子，有效地在10天内从成纤维细胞诱导tdTomato阳性iPS集落(数据未示出)，从而证实了该谱系示踪系统的可靠性。相反，即使在建立神经元命运后，也没有在化学诱导后检测到tdTomato阳性集落(数据未示出，图3E)。综上所述，这些结果表明，这种基于XEN样状态以产生神经元的化学重编程方法确实绕过了多能性的获得。

对于神经元诱导，胚胎衍生的XEN细胞类似于化学诱导的XEN样细胞

为了进一步理解基于XEN样态的神经谱系重编程和检验已建立的方法，从胚泡制备了化学衍生的eXEN细胞系(CeXENs；胚胎衍生的XEN细胞(eXEN)，如先前报道的那样(Zhao等，Cell，163：1678-1691(2015))。这些CeXEN表达了控制XEN状态的关键转录因子：GATA4、SALL4、SOX17和GATA6(数据未示出)。使用本文公开的第二阶段混合物将CeXEN诱导成为神经元样细胞，但并没有过表达Sox2(数据未示出)。这将神经元诱导阶段从12天延长至24天，并在修改了此阶段的毛喉素的浓度(50uM FSK以建立CeXEN系，10uM用于诱导成为神经元)而实现。

这些结果显示，胚泡来源的XEN样细胞也可以按照本文公开的方案诱导成神经元细胞。

长期扩增的化学诱导的XEN样细胞保留着基因组稳定性和神经元特化潜力

为了进一步探索XEN样状态的特征，通过评估倍增时间而调查了化学诱导的XEN样细胞的生长速率。经诱导的XEN样细胞(倍增需约20小时)比原始成纤维细胞(倍增需约40小时)生长快得多，这与CeXEN细胞相当且慢于ESC(倍增需约15小时)(图4A)。鉴于化学诱导的XEN样细胞的高度增殖特性，我们进一步探索了这些XEN样中间体的可扩增性。通过使用基于TD114-2的培养条件，可以在每3～4天以平均比例为1:20～30的条件将XEN样集落长期扩增(至少测试20代)，甚至以单集落选择和单细胞消化的方式(数据未示出)。尽管具有高度可扩增的特性，但在将所述XEN样细胞注射至免疫缺陷(SCID)小鼠后没有检测到肿瘤发生(测试了第6代和第19代的XEN样细胞)(数据未示出)。此外，如通过核型和比较基因组杂交(CGH)分析的结果显示的，长期扩增的XEN样中间体保持了遗传完整性和基因组稳定性(图4B-C)。最重要的是，除了保持了XEN样特征表达模式，如共免疫染色和电生理学功能分析的结果显示的那样，这些扩增的XEN样细胞保持了神经元特化潜力，即使在20次传代后也没有神经元诱导效率的损害，且来自长期传代的XEN样细胞的所得神经元示出了功能性成熟特性(数据未示出，图4D～F；表4)。

表4.来自20次传代的XEN样细胞的化学诱导的神经元的电生理学特性

*没有与星形胶质细胞共培养。

Rm：输入电阻；

Cm：膜电容；

RMP：静息膜电位；

AP阈值：动作电位阈值；

APamp：动作电位幅度；

Ina-max：钠电流的最大幅度。

所有数据均为平均值+/-SEM。

基于XEN样的化学谱系重编程潜在的动态转录变化

为了理解XEN样细胞的谱系可塑性，施行了单集落衍生的XEN样细胞系的RNA-seq分析。结果显示，在第一阶段XEN样诱导期间，成纤维细胞特异性转录程序被显著擦除了(数据未示出)。此外，结果显示，XEN样状态潜在的独特转录特征，所述特征用于共表达控制细胞命运朝向三个胚层的主基因(数据未示出)，表明了XEN样中间体的潜在谱系可塑性。

为了研究基于特征性XEN样状态的谱系重编程的机制，通过RT-qPCR分析检查了被鉴定为控制不同细胞命运的主基因的转录变化。除了成纤维细胞特异性程序的转录下调与单集落视角的结果一致外，神经外胚层特异性(SOX2、Ngn2和NeuroD1)和XEN-主基因(GATA6、Sox17、Sall4、Gata4)均在朝向XEN样状态的第一阶段化学诱导期间被上调(图5A，数据未示出)。从第12天的后期神经元特化开始(图1C)，XEN主基因被稳健地下调(图5A；(第二阶段))。

为了进一步检验和确认神经和XEN主基因在这种特征性谱系重编程中的作用，在重编程过程中进行了这些基因(Sox2和Gata6)的敲减，所述敲减抑制了XEN样集落的产生并阻断了神经元诱导(图5B和5C)，证明了这些内源性主基因对于化学重编程的重要作用。综上所述，这些结果表明在化学重编程过程中的动态转录变化，并揭示了对于基于XEN样状态的谱系重编程的重要因素。

从XEN样细胞产生肝细胞样细胞

在下一组研究中，通过修饰培养基以促进肝细胞命运特化，使XEN样细胞成为内胚层的肝细胞(Cai,等,Hepatology,45:1229-1239(2007)；Song,等,Cell Res.,19:1233-1242(2009))。在20天诱导后，出现了典型的肝细胞形态，甚至当从长期扩增的XEN样细胞进行诱导时也如此(>第20代)(数据未示出)。

进行了RT-qPCR分析，以检验肝特异性基因表达。XEN样诱导的肝细胞样细胞共表达了肝特异性基因，包括：Alb、nf4α、Hnf1a和Ttr(图5D和表2)。此外，诱导的肝细胞样细胞也表达了作为关键的功能性肝基因的细胞色素P450酶(CYP)(图5D和表2)。通过共免疫染色(数据未示出)进一步证实了作为肝标志性基因的甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的诱导性表达，其诱导效率>20％。RNAseq结果显示，XEN来源的肝细胞的全局基因表达分组与原代肝细胞接近并与成纤维细胞区别。结果还显示，在化学诱导后，内源性肝细胞-命运特异性程序显著上调，而内源性成纤维细胞-命运特异性程序显著下调(图5F)。

为了探索XEN样诱导的肝细胞样细胞的功能特性，检查了由经诱导的肝细胞样细胞的白蛋白和尿素分泌。结果显示，经诱导的肝细胞样细胞能够有效地分泌白蛋白和尿素(图5E)。综上所述，这些结果表明，也可以从XEN样细胞诱导成为肝细胞样细胞。

讨论

在本研究中，开发了通过仅使用化学化合物从成纤维细胞诱导XEN样细胞的有效系统。这用于提供新的谱系重编程途径以从体成纤维细胞经由特征性中间XEN样状态产生功能性神经元和肝细胞样细胞，绕过了多能性阶段。此外，建立了一种稳健的用于长期扩增经诱导的XEN样细胞(至少20次传代)，并保持着基因组稳定性和谱系特化能力的方法。此外，鉴定了基于XEN样状态的谱系重编程期间的特征性转录变化。通过从具有擦除的原始体细胞转录程序的中间XEN样状态进行进一步特化，这些化学诱导的XEN样细胞可以发育为特定谱系，甚至特定的亚型细胞。

一个重要的发现为，化学诱导的XEN样状态不限于被重编程为多能性，也可以被诱导成功能特定细胞如神经元和肝细胞。正如电生理学功能分析的结果所显示的那样，XEN样细胞衍生的神经元可以被引发激发动作电位，与之前的报道(Li等,Cell Stem Cell,17:195-203(2015))相比具有显著提高的效率。此外，经诱导的神经元在培养皿中与共培养的原代神经元形成功能性突触，甚至在长期传代后也如此(图2C-2H和4A-E)。更重要的是，在移植到成年小鼠的脑中后，这些细胞存活了并进一步成熟，表达了功能性成熟神经元基因，并发展出功能特性。此外，谱系示踪表明，经由XEN样状态的神经元细胞诱导绕过了多能性阶段的获得(图3E，数据未示出)。总而言之，这些数据表明，可以从化学诱导的XEN样细胞来诱导功能特定的细胞，绕过了多能阶段。有趣的是，XEN样状态不仅可接通神经元命运，还可以接通其他谱系。经诱导的XEN样细胞表达了控制朝向不同胚层和细胞谱系的细胞命运选择的主基因，并且在第一阶段化学诱导期间观察到了神经外胚层和中内胚层特异性主基因的上调(图5A)，表明从诱导的XEN样状态出发，除了被指定为神经元细胞命运之外，有更广阔的谱系可塑性。为了支持这一观点，通过使用促进肝命运的诱导条件，可以从XEN样细胞诱导为肝细胞样细胞(图5D和5E)。这些诱导的肝细胞样细胞示出了肝标记物基因的上调(图5D)，并表现出包括白蛋白和尿素的分泌的肝功能特征(图5E)。来自XEN样细胞的神经元和肝细胞样细胞的诱导表明，可以经由XEN样状态获得其他细胞谱系。

值得注意的是，经诱导的XEN样细胞的可扩增性赋予了对于产生所需的细胞而言可放大的细胞资源。如本研究中的倍增时间分析所揭示的，XEN样细胞稳健增殖，而没有在传代后损害神经元诱导效率(图4A和图4E)。在所公开的XEN样培养条件下，在80天内可以从单个成纤维细胞获得至少～10¹⁶个神经元细胞：在12天内可以将单个成纤维细胞诱导成包含约1,000～3,000个细胞的单个XEN样集落，用于在60天内以平均比例1：20～30进行20次传代扩增，随后切换成神经特化培养基，在约8～12天内获得神经元细胞(图4F)。此外，在传代后，XEN样细胞保持了遗传完整性和基因组稳定性(图4B-C)。因此，这种新的谱系重编程手段将规避传统的直接重编程中的受限的细胞产量的根深蒂固的问题，通过高度可扩展性的XEN样中间阶段产生足够数量的功能细胞。

Claims (23)

1.试剂盒或细胞培养基组合物，其用于在真核细胞中诱导谱系重编程，所述组合物包含对诱导第一类型/谱系的细胞重编程为第二类型/谱系的细胞有效的量的V6TFEA-TD114-2，

其中V6TFEA-TD114-2表示以下7种小分子量化合物的混合物：V表示丙戊酸，6表示[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘]，T表示组蛋白去甲基化的抑制剂为反苯环丙胺，F表示毛喉素，E表示EPZ004777(1-(3-(((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲)，A表示AM 580(4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)酰胺基]苯甲酸)，TD114-2表示((10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-十氢-9,4：24,29-二甲基亚基-1H-二苯并[n，t]吡咯并[3,4-q][1,4,7,10,13,22]-四氧杂二氮杂cyclotetracosine-31,33(32H)二酮))。

2.试剂盒或细胞培养基组合物，其用于神经特化，所述组合物包含有效的量的FCD，其中F表示毛喉素，C表示[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈]，D表示dosomorphin。

3.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含L和/或S，其中L表示LDN 193189(4-(6-(4)-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹诺酮)，S表示SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中V的浓度范围为100～500μM；6的浓度范围为5～10μM；F的浓度范围为5～100μM；T的浓度范围为1～5μM，F的浓度范围为50～100μM；E的浓度范围为1～5μM；A的浓度范围为0.01～0.05μM，且TD114-2的浓度范围为2～6μM。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中F的浓度范围为50～100μM。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其在试剂盒中，其中所述小分子量化合物以被放入细胞培养基中的相对量存在，用于分化细胞以诱导选自Sox2、Ngn2和NeuroD1组成的组的标记物，以及选自SALL4、GATA4、GATA6组成的组的XEN标记物的表达。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中所述组合物中不包含ISX9[N-环丙基-5-(2-噻吩基)-3-异噁唑甲酰胺]。

8.一种在部分或完全分化的细胞中诱导谱系重编程的方法，所述方法包括：

(a)将待重编程的第一类型/谱系的细胞与经改良的XEN-混合物接触足够长的时间，以将细胞偏向成为经改良的XEN样细胞群体；以及

(b)将经改良的XEN样细胞群体培养足够长的时间，以在谱系特异性细胞培养基中将细胞重编程为化学诱导的谱系重编程细胞(CiLRC)，

其中所述经改良的XEN-混合物包含权利要求1中所述的V6TFEA-TD114-2，其中所述谱系特异性细胞培养基包含：(a)权利要求2所定义的FCD；或(b)BMP4(骨形态发生蛋白4)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)；OSM(制瘤素M)，和/或DEX(地塞米松)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中(a)还包括权利要求2所定义的L和/或S。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述分化的细胞选自：多能干细胞、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞和结缔组织细胞。

11.根据权利要求8所述的方法，其中待诱导的细胞选自：成纤维细胞、脂肪来源的细胞和肠上皮细胞。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中被重编程为具有选自下组的神经元样特性的细胞：(i)神经元形态；(ii)选自TUJ1、MAP2、NF-H、NeuN、vGlut和Gad67的标记物的表达；以及(iii)通过膜片钳分析测量的膜去极化；或(iv)以上特性的组合。

13.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中待诱导的细胞于体外在经改良的XEN-混合物中培养至少8天。

14.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步在包含CiLR混合物的细胞培养基中体外培养至少8天。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞培养8～15天。

16.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其包括：基于形态学、倍增时间、标记物的表达及其组合鉴定重编程的细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述标记物包含：来自第一类型的细胞的至少一种标记物，以及来自所需细胞类型的至少一种标记物，其中与未处理的细胞相比，所述来自第一类型的细胞的至少一种标记物被下调。

18.根据权利要求17所述的方法，其中第一类型的细胞为成纤维细胞，所需细胞类型为神经元，并且标记物选自：TUJ1、MAP2、NF-H、vGLUT1、GAD67和NEUN。

19.根据权利要求17的方法，其进一步包括分离重编程的细胞。

20.通过权利要求13～19中任一项所述的方法获得的化学重编程的细胞。

21.根据权利要求20所述的重编程的细胞，其中与来自相同生物的原代成纤维细胞相比，所述重编程的细胞的Thy1、Twist2和/或Snail的表达被下调，且TUJ1、MAP2、NF-H、vGLUT1、GAD67和NEUN的表达被上调。

22.根据权利要求20的重编程的细胞，其中与通过包括在包含VC6TFAE的细胞培养基中培养成纤维细胞的方法产生的神经元样细胞相比，所述重编程的细胞的Sox、Ngn2或NeuroD1的内源性表达被上调。

23.一种治疗组合物，其包含权利要求20的重编程的细胞，所述治疗组合物被配制为用于通过注射、植入假体装置或组织工程化基质而施用于个体。

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