KR102210850B1 - 비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102210850B1
KR102210850B1 KR1020167003185A KR20167003185A KR102210850B1 KR 102210850 B1 KR102210850 B1 KR 102210850B1 KR 1020167003185 A KR1020167003185 A KR 1020167003185A KR 20167003185 A KR20167003185 A KR 20167003185A KR 102210850 B1 KR102210850 B1 KR 102210850B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
reprogramming
pluripotent
cipscs
Prior art date
Application number
KR1020167003185A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160029115A (ko
Inventor
홍쿠이 뎅
양 자오
핑핑 호우
얀친 리
수 장
춘 리우
징양 구안
홍강 리
Original Assignee
홍 구안 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 홍 구안 리미티드 filed Critical 홍 구안 리미티드
Publication of KR20160029115A publication Critical patent/KR20160029115A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102210850B1 publication Critical patent/KR102210850B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/065—Modulators of histone acetylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 비-다능성 진핵 세포에서 다능성을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제, TGFβ 수용체 억제제, 사이클릭 AMP 효능제, S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 (SAH) 억제제, 및 임의로, 히스톤 아세틸화를 증진시키는 작용제를 포함한 다능성의 화학적 유도인자 (CIPs)를 포함한다. 상기 방법은 특정 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하는 데 충분한 기간 동안, 상기 세포를 CIPs와 접촉시키는 것을 포함한다.

Description

비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR REPROGRAMING NON-PLURIPOTENT CELLS INTO PLURIPOTENT STEM CELLS}
본 발명은 일반적으로, 진핵 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 소분자 조성물 및 방법에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 (ESCs)는 자기 재생할 수 있고, 모든 체세포 유형으로 분화될 수 있다. 체세포는 난모세포 내로의 핵 전이를 통하여 또는 규정된 인자의 이소성(ectopic) 발현을 통하여 다능성이 되도록 재프로그래밍되어 왔다 [Wilmut, et al., Nature, 385:810-813 (1997); Takahashi, et al., Cell, 126:663-676 (2006); Yamanaka, et al., Nature, 465:704-712 (2010) and Stadtfeld, et al., Genes Dev ., 24:2239-2263 (2010)]. 그러나, 외인성 다능성 관련 인자, 특히 Oct4가 다능성을 확립시키기 위한 이들 방법에 있어서 필수적이다 [Zhu, Annu . Rev. Biomed . Eng ., 13:73-90 (2011); Li, Cell Res., 21:196-204 (2011) and Li, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 109:20853-20858 (2012)]. 부가적으로, 이들 재프로그래밍 방법에 c-Myc와 같은 종양형성 유전자가 요구됨에 따라, 암성 세포가 유도될 위험이 있다. 따라서, 재프로그래밍 전략은 임상 적용에 관한 우려를 제기하였다 [Saha, et al., Cell Stem Cell, 5:584-595 (2009) and Wu, et al., Cell Biol ., 13:497-505 (2011)].
체세포를 다능성 세포가 되도록 하는 재프로그래밍을 구동시킬 수 있는 소분자에 대한 요구가 있다. 소분자는 보다 용이하게 세포 내로 침투되고, 비면역원성이며, 비용면에서 보다 효율적이고 보다 용이하게 합성되고, 보존되며 표준화되기 때문에, 다능성을 유도시킬 수 있는 소분자는 여러 장점을 지니고 있다.
본 발명의 목적은 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 소분자를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
부분적으로 또는 완전히 분화된 세포 (다능성의 하나 이상의 마커, 예컨대 Oct4를 발현하도록 유전적으로 조작되지 않고, Oct4를 자연적으로 발현하지 않는 세포 포함)를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 소분자가 확인되었다. 이에 요구되는 다능성의 화학적 유도인자 (CIPs)는 (1) 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제, (2) TGFβ 수용체 억제제, (3) 사이클릭 AMP 효능제, (4) S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 (SAH) 억제제, (5) 히스톤 아세틸화를 증진시키는 작용제, 예컨대 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 [예를 들어, 발프로산(VPA)], 및 그의 조합물을 포함한다. 상기 CIPs는 별개로 제공되거나 또는 CIP 조성물로서 조합되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 후성적(epigenetic) 조절제 및 레티노산 수용체 효능제, 예를 들어 레티노산 수용체 리간드가 CIPs와 함께 투여될 수도 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, CIPs는 SAH 억제제로서의 DZNep를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, GSK 억제제는 화학명 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴]을 갖는 아미노피리미딘, CHIR99021 ("CHIR")이고; TGFβ 수용체 억제제는 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)이며; cAMP 효능제는 포르스콜린(Forskolin) (FSK)이며 SAH 억제제는 3-데아자네플라노신 A (DZNep)이다. 일부 실시양태에서, CIPs는 CHIR, 616452, FSK 및 DZNep의 조합물 (C6FZ)이다. 보다 바람직한 실시양태에서, CIPs는 VPA, CHIR, 616452, 트라닐시프로민(Tranylcypromine) [파르넷(Parnet)], FSK (집합적으로, VC6TF) 및 DZNep (집합적으로, VC6TFZ)의 조합물이다.
바람직한 실시양태에서, CIP 조성물에 포함될 수 있는 후성적 조절제는 5-아자시티딘, 소듐 부티레이트 및 RG108 중 하나 이상, 및 그의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자와, VC6TFZ를 이용한 경우에 관찰된 수준에 비해 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자가 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자는 cAMP 효능제, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), FSK 및 롤리프람(rolipram), 또는 그의 조합물이다. 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자는 프로스타글란딘 E2 (PGE2), [N-(9,10-디옥소-9,10-디히드로페난트렌-2-일)피발라미드] (SF1670), [N-(4-(디에틸아미노벤질리데닐)-N'-(4-히드록시벤조일)-히드라진] (DY131), [2-시클로헥실-6-메톡시-N-[1-(1-메틸에틸)-4-피페리디닐]-7-[3-(1-피롤리디닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민] (UNC0638), [N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드 히드로클로라이드] (SRT1720), [N-프탈릴-L-트립토판] (RG108), 2-Me-5HT (2-메틸-5-히드록시트립타민), [3,7-디히드로-1-메틸-3-(2-메틸프로필)-1H-푸린-2,6-디온앤드] (IBMX) 및 [4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산] (TTNPB)을 포함한다. 화학적 재프로그래밍 효율을 증가시키는 데 바람직한 소분자는 TTNPB이다.
몇 가지 단백질 인자, 예컨대 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)가 또한, 다음 화학적 재프로그래밍을 위한 프로토콜에 유효한 것으로 입증되었다.
또한, 다능성 세포가 아닌 첫 번째 유형의 세포, 예컨대 체세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 것을 유도시키는 방법이 제공된다. 재프로그래밍하는 데 바람직한 세포는 섬유아세포 세포, 지방 유래 줄기 세포 (ADSC), 신경 유래 줄기 세포 및 장 상피 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 재프로그래밍하고자 하는 세포가 Oct4, KLF4, SOX2, C-Myc 또는 NANOG 중 어느 것을 발현하도록 이를 형질감염시키는 것을 포함하지 않는다. 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 또한, 재프로그래밍하고자 하는 세포를 전사 인자와 같은 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하지 않는다. 재프로그래밍하고자 하는 세포는 이러한 세포를 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포 (CiPSC)가 되도록 재프로그래밍하는 데 충분한 시간 동안 CIPs와 접촉시킨다. 이로써 재프로그래밍된 세포는 ESC-유사 특성, 예컨대 형태학, 배가 시간, ESC 마커, 예컨대 알칼리성 포스파타제 (AP), nanog, Rex1, Sox2, Dax1, Sall4, 미분화된 배아 세포 전사 인자(Utf1), 발생 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)의 발현, 및 3가지 배아 배엽의 조직으로 분화될 수 있는 세포의 능력에 근거하여 다능성 세포로서 확인된다. CiPSCs를 단리하고, 추가로 배양할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포를 초기에는, 26일 내지 36일의 기간 동안 상기 CIPs를 함유하는 재프로그래밍 배지에서 배양한다. 이어서, 세포를 4일 초과 동안 2i-배지 (글리코겐 합성효소 키나제-3과 분열촉진물질-활성화 단백질 키나제 신호 전달의 이중 억제를 수반하는 ESC 배양 배지)에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 세포를 4 내지 20일 동안 2i-배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 2i-배지에서의 배양은 재프로그래밍 배지로 처리한지 대략 28일 후에 개시한다. 소분자 (CIPs)에 대한 세포의 상이한 노출 지속 기간에 관하여 시험하였다. 616452와 포르스콜린은 2i-배지를 사용하기 전의 모든 시간에 존재해야 할 필요가 있다. CHIR99021은 처음 12일에 사용되어야 하고, 바람직하게는 2i-배지를 사용하기 전의 모든 시간에 존재한다. DZNep는 재프로그래밍의 후기 단계 (12일에서 40일째)에 부가되어야 하고, 바람직하게는 다른 소분자의 초기 처리 후 16일 내지 20일까지 부가되어야 한다. 소분자 조합물 (VC6TFZ)은 28일째와 48일째 사이, 바람직하게는 40일째에 2i-배지로 변화시켜야 한다.
세포는 바람직하게, CIP 성분 VC6TF를 포함한 재프로그래밍 배지에서 약 16일 내지 20일 동안 배양한 다음, 세포를 다능성 세포로 전환시키는 데 요구되는 나머지 시간 동안 VC6TFZ에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 세포는 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자, 예를 들어 cAMP 효능제 및 후성적 조절제, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은, 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자와 추가로 접촉시킨다. 화학적 재프로그래밍 효율을 증가시키는 데 바람직한 소분자는 TTNPB이다.
단리된 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포 (CiPSCs)는 자연 발생적 다능성 줄기 세포가 아니다. CiPSCs는 ESC-유사 특성, 예컨대 ESC 형태학, ESC와 유사한 배가 시간, ESC 마커, 예컨대 알칼리성 포스파타제 (AP), nanog, Rex1, Sox2, Dax1, Sall4, 미분화된 배아 세포 전사 인자 (Utf1), 발생 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)의 발현, 및 3가지 배아 배엽의 조직으로 분화될 수 있는 세포의 능력을 보유하고 있다. CiPSCs는, 예를 들어 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 직접적으로 유래/단리되지 않는다는 점에서 ESCs와 상이하다. CiPSCs는 트랜스유전자, 예컨대 Oct4, KLF4, SOX2, c-Myc 또는 NANOG를 발현하는 유전자를 발현하도록 조작되지 않거나 또는 이들 트랜스유전자 중 어느 것을 발현하도록 하기 위해 이들이 수득되어지는 상기 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 공정에 의해 생성되지 않는다는 점에서 기타 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)와 상이하다. CiPSCs는 또한, 이들이 비-다능성 세포를 하나 이상의 폴리펩티드, 예컨대 Klf, Oct, Myc 또는 Sox와 접촉시키는 것을 포함하는 공정에 의해 생성되지 않는다는 점에서 기타 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)와 상이하다. 바람직한 실시양태에서, 상기 CiPSCs는 유전적으로 조작되지 않는데, 즉 CiPSCs는 세포로부터 유전적 요소를 도입하거나 제거함으로써 변경시키지 않는다. CiPSCs, iPSCs 및 ESCs 간에는 명백한 차이가 없다. 그러나, 본원에 개시된 CiPSCs는 적어도 그들을 생성시키기 위해 사용되는 방법, 즉 그들의 기원에 의해 ESC와 구별될 수 있다. ESC가 자연 발생적 세포인 경우, 다른 한편으론 CiPSCs는 자연 발생적이 아니고, 비-다능성 세포를 본원에 기재된 바와 같은 소분자의 조합물로 처리함으로써 수득된다.
CiPSCs를 목적 유형의 세포로 분화시키기 위해 배양하거나 유도시킬 수 있다. 이러한 CiPSCs와 그의 자손을 수많은 적용 (세포 요법 및 조직 공학을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)에 사용할 수 있다.
도 1a 및 1b는 SKM (도 1a) 또는 SK (도 1b) 플러스 화학물질 또는 Oct4에 의해 감염된 MEFs로부터 유도된 iPSC 집락의 수를 도시한 것이다. 오차 막대, 평균 ± SD (n = 3개 생물학적 반복 웰). 도 1c는 MEFs, SKM-FSK-iPSCs 및 ESCs (R1)에서 다능성 마커 유전자의 RT-PCR 분석을 도시한 것이다. 도 1d는 SKM-FSK-iPSCs 및 SK-FSK-iPSCs의 게놈 PCR 분석을 도시한 것이다. 도 1e 및 1f는 화학물질 처리를 수반하면서 SKM 또는 SK에 의해 유도된 iPSC 집락의 JRT-PCR 분석 (도 1e) 및 게놈 PCR 분석 (도 1f)을 도시한 것이다. 약어: M (2-Me-5HT); D (D4476); V (VPA). Tg는 외생적으로 도입된 유전자를 표시한다. 눈금 막대, 100 μM.
도 2는 MEFs, GFP-음성 세포, GFP-양성 군집 및 ESCs (R1)에서 RNA-seq 분석에 의해 검출된 다능성 관련 유전자의 mRNA 수준을 도시한 것이다. GFP-음성 세포와 GFP-양성 군집을 24일째에 수집하였다. Cdh1 = E-카드헤린.
도 3은 표시된 소분자로의 처리 후 iPSC 집락의 상대적 수를 나타내는 막대 그래프이다. (-) 대조군, DMSO. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n ≥2). 약어: PEG2 (프로스타글란딘 E12); 5-아자-C (5-아자시티딘); NaB (소듐 부티레이트).
도 4a는 36일째에 DZNep 처리한 후 유도된 GFP-양성 집락의 수를 도시한 것이다. 오차 막대, 평균 ± SD (n = 2개 생물학적 반복 웰). 도 4b는 OG-MEFs로부터 유도된 GFP-양성 세포의 FACS 분석이다. 좌측, 초기 MEFs에서 GFP-양성 세포의 부재; 중앙 및 우측, 44일째 VC6TF (중앙) 및 VC6TFZ (우측)에 의해 유도된 GFP-양성 세포의 비율. 도 4c는 CiPSC 발생 과정을 예시하는 도식적 다이어그램이다. 눈금 막대, 100 mm. 도 4a의 경우, 재프로그래밍하기 위한 세포를 12일째에 재도말하였다. 도 4d는 MEFs, GFP-양성 집락 및 ESCs (R1)에서 RNA-seq 분석에 의해 검출된 다능성 관련 유전자의 mRNA 수준을 도시한 것이다. 마우스 ESC 집락과 달리, 상피 모양이고 치밀한 이들 GFP-양성 집락은 ESC 배양 조건에서 유지될 수 없었으며 36일째에 수집하였다. 도 4e는 MEFs, CiPSCs 및 ESCs (R1)에서 RNA-seq 분석에 의해 검출된 다능성 관련 유전자의 mRNA 수준을 도시한 것이다.
도 5a-k는 VC6TFZ 조건 하에 개개의 화학물질에 대한 농도 및 처리 지속 기간의 최적화를 도시한 것이다. 도 5a-g는 표시된 바와 같은 소분자의 농도의 함수로서 (CiPSC 유도 동안 적정됨) CiPSC 세포의 집락 수를 도시한 것이다. 도 5h는 각 소분자의 지속 기간을 도시한 것이다. 도 5i-k는 화학적 조합물의 지속 기간을 도시한 것이다. 화학적 재프로그래밍 배지 플러스 VC6TFZ를 상이한 시점에서 2i-배지로 대체시켰다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n≥2).
도 6a-e는 화학적 재프로그래밍 효율 또는 역학을 개선시키는 것으로 검증된 소분자를 나타낸 것이다. 도 6a는 MEFs에서 VC6TFZ와 조합하여 화학적 재프로그래밍 효율을 개선시키는 것으로 검증된 소분자를 나타낸 것이다. 0일째부터 12일째에 부가된 화학물질: PGE2, DY131, RG108, 2-Me-5HT 및 IBMX; 12일째 후에 부가된 화학물질: SF1670, UNC0638 및 SRT1720. (-) 대조군, DMSO. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n≥2). 도 6b는 MEFs에서 C6FZ 또는 VC6TFZ와 조합하여 화학적 재프로그래밍 효율을 개선시키는 것에 대한 TTNPB의 효과를 도시한 것이다. C6FZ 및 VC6TFZ에 의한 화학적 재프로그래밍을 알아보기 위하여 CiPSC 집락을 50일째 및 40일째에 각각 정량화하였다. OSK-유도된 재프로그래밍과 OSKM-유도된 재프로그래밍을 알아보기 위하여 iPSC 집락을 24일째 및 16일째에 각각 정량화하였다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 도 6c는 MEFs에서 VC6TFZ와 조합하여 화학적 재프로그래밍 역학을 개선시키는 것에 대한 TTNPB의 효과를 도시한 것이다. GFP-양성 집락을 표시된 날에 정량화하였다. (-) 대조군, VC6TFZ. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 도 6d 및 6e는 CiPSCs에 대한 게놈 PCR 분석을 도시한 것이다.
도 7a-d는 CiPSCs가 트랜스유전자로 오염되지 않았다는 것을 보여주는 게놈 PCR 및 서던 블롯 분석을 도시한 것이다. 도 7a 및 b는 사용된 바이러스성 벡터 2개 세트에 대한 게놈 PCR을 도시한 것이다. 도 7c는 바이러스성 통합 현상을 검출하기 위한 서던 블롯 분석이다. pLL3.7-ΔU6 벡터와 tet-on 벡터 둘 다를 표적화하기 위하여 프사이(psi) 서열 상에서 DNA 프로브를 설계하였다. CiPSCs를 분석하였고, Tet-O-iPS, pLL-O-iPS 및 MEFS를 대조군으로서 사용하였다. 도 7d는 서던 블롯에 사용된 에티듐-브로마이드 염색된 겔을 도시한 것이다.
도 8a-b는 VC6TFZ로부터 개개의 화학물질을 제거함으로써 유도된 GFP-양성 집락 (도 8a) 및 CiPSC 집락 (도 8b)의 수를 도시한 것이다. 3가지 독립적인 실험 결과가 상이한 색상으로 도시된다 (백색, 회색 및 흑색).
도 9a는 RT-PCR에 의해 예시된 바와 같이, MEFS와 비교한 CiPS 세포의 상이한 클론에서의 다능성 마커 발현을 도시한 것이다. 도 9b는 CiPSCs에 대한 성장 곡선을 도시한 것이다. 도 9b-d는 MAF-CiPS 세포, ADSC-CiPSC 및 MNF-CiPSCs에서 다능성 마커의 RT-PCR 분석을 도시한 것이다.
도 10은 CiPSCs로부터 발생된 키메라의 생존 곡선을 도시한 것이다. n, 연구된 키메라의 총 수.
도 11a-b는 실시간 PCR에 의해 측정된 바와 같이 다능성 관련 유전자 (도 11a), 및 Gata6, Gata4 및 Sox17 (도 11b)의 발현을 도시한 것이다. 도 11c-d는 실시간 PCR에 의해 검증된 Sall4 , Sox2 , Gata6 , Gata4 및 Sox17의 발현을 도시한 것이다. 0일째 MEFs에서의 발현과 비교한 4일, 8일, 12일, 16일, 20일 및 24일째 (도 11c) 또는 12시간째 (도 11d) Sall4 , Sox2 , Gata6 , Gata4 및 Sox17 발현에서의 배수 변화. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 11e-i는 유전자의 발현에 대한, 개개의 화학물질 및 조합된 화학물질의 효과, 또는 VC6TF (또는 VC6TFZ)로부터 화학물질을 철수한 효과를 도시한 것이다. 도 11e-f는 12일째에 Sall4 및 Sox2의 발현에 대한 개개의 화학물질 및 조합된 화학물질의 효과를 도시한 것이다. 도 11g-h는 12일째에 Sall4 및 Sox2의 발현에 대한, VC6TF로부터 화학물질을 제거한 효과를 도시한 것이다. 도 11i는 32일째에 다능성 마커 유전자의 발현에 대한, VC6TFZ로부터 개개의 화학물질 (CHIR, 616452 및 FSK)을 철수한 효과를 도시한 것이다. 도 11j는 32일째에 Gata6 , Gata4 및 Sox17의 발현에 대한, VC6TFZ로부터 개개의 화학물질 (CHIR, 616452 및 FSK)을 철수한 효과를 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 11k는 32일째에 DZNep의 존재 및 부재 하에 다능성 관련 유전자의 발현을 도시한 것이다. 도 11l은 32일째에 DZNep의 존재 및 부재 하에 H3K9 메틸화를 도시한 것이다.
도 12a-b는 실시간 PCR에 의해 검증된 형질도입 후 4일째에 MEFs에서 Sal4 (도 12a) 및 Sox2 (도 12b)의 상대적 발현 수준을 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 12c는 Sall4 또는/및 Sox2 플라스미드를 이용하여 형질감염된 MEFs에서 Oct4 프로모터-구동된 루시페라제 활성을 조사하였다는 것을 보여준다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 도 12d-e는 VC6TFZ로부터 C6F 제거와 함께, Sall4 및 Sox2의 과발현에 의해 유도된 GFP-양성 및 iPSC 집락의 수 (도 12e) 및 Oct4 활성화 (도 12d)를 도시한 것이다.
도 13a-d는 24일째에 Sall4 , Gata6 , Gata4 또는 Sox17의 녹다운에 의한 유전자 발현 변화를 도시한 것이다. 도 13a는 Sall4 , Gata6 또는 Gata4 녹다운에 의한 Sall4, Gata6 및 Gata4의 상대적 발현 변화를 도시한 것이다. 도 13b는 Sox17 녹다운에 의한 Sox17 , Sall4 , Gata6 , Gata4 및 Oct4의 상대적 발현 변화를 도시한 것이다. 도 13c는 Sall4 , Gata6 또는 Gata4의 녹다운에 의한 Sox17의 상대적 발현 변화를 도시한 것이다. 도 13d는 Sall4 , Gata6 또는 Gata4의 녹다운에 의한 Sox2의 상대적 발현 변화를 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 13e-f는 Oct4의 발현 및 iPSCs 형성에 대한 Sall4 , Gata6 또는 Gata4 녹다운의 효과를 도시한 것이다. 도 13e는 32일째에 Sall4 , Gata6 또는 Gata4 녹다운에 의한 Oct4 발현 변화를 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 13f는 화학적 재프로그래밍 동안 Sall4 , Gata6 또는 Gata4를 녹다운시킬 때의 GFP-양성 및 iPSC 집락 수를 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 도 13g는 화학적 재프로그래밍 동안 다능성 회로의 단계별 확립을 예시하는 도식적 다이어그램이다.
도 14a-b는 화학적 재프로그래밍 동안 DZNep의 생물학적 활성을 도시한 것이다. 도 14a는 HPLC 분석에 의해 측정된 세포내 수준 SAH 대 SAM의 상대적 비를 MEFs에서의 것과 비교해서 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 14b는 CiPSC 생성을 유도하기 위하여 VC6TF 처리와 조합하여 SAH 가수분해효소 억제제 (Nep A, Adox 및 DZA)로의 DZNep의 대체 사용을 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 약어: HPLC (고 성능 액체 크로마토그래피). 도 14c는 EZH2의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 14d는 VC6TF 플러스 shRNA 또는 DZNep에 의해 유도된 iPSC 집락 수를 도시한 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 도 14e는 Ezh2의 shRNA-매개된 녹다운 후 Ezh2가 억제되었다는 것을 보여주는 실시간 PCR을 나타낸 것이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=2). 도 14f는 MEFs에서의 수준과 비교한 상대적 세포내 cAMP 수준을 도시한 것이다. 도 14g는 VC6TFZ에 의해 생성된 CiPSC 집락 수에 대한, 2'5'ddAdo에 의한 아데닐레이트 시클라제의 억제 효과를 도시한 것이다. (-) 대조군, DMSO. 도 14h-j는 화학적 재프로그래밍에 대한, FSK를 VC6T 플러스 DZNep (VC6TZ) 처리에 의해 수반된 cAMP 유사체 (IBMX를 수반하거나 수반하지 않는 DBcAMP)로 대체하거나 또는 CiPSC 유도 동안 VC6TZ와 조합된 포스포디에스테라제 억제제 (롤리프람 및 IBMX)로 대체한 효과를 도시한 것이다. 도 14k는 MEF를 표시된 화학물질로 처리한 후의 세포내 cAMP 수준의 정량화이다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n≥2).
도 15는 화학적 재프로그래밍 시스템을 개발하는 데 있어서의 주요 단계를 도식적으로 표시한 것이다. 청색 육각형은 재프로그래밍 전사 인자를 나타내고, 적색 사각형은 각 단계에서 확인된 주요 소분자를 나타낸다. 재프로그래밍 부스터(booster)는 상이한 재프로그래밍 조건에 상응하여 우측에 표시된다. 또 다른 Oct4 대체물 D4476 및 2-Me-5HT는 FSK 아래에 표시된다. 약어: O (Oct4), S (Sox2), K (Klf4), M (c- Myc), 트라닐 (트라닐시프로민).
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포" (CiPSCs)는 하나 이상의 형질감염된 유전자의 발현에 의해서가 아니라, 비-다능성 세포를 화학적 화합물과 접촉시킴으로써, 다능성이 아닌 세포, 즉 다분화능 또는 분화된 세포로부터 유래된 다능성 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "배양물"은 특정 배지에서 성장되고 임의로 계대된 세포 집단을 의미한다. 세포 배양물은 일차 배양물 (예를 들어, 계대된 적이 없는 배양물)일 수 있거나 또는 이차 또는 후속 배양물 (예를 들어, 1회 이상 계대되었거나 계대배양된 적이 있는 세포 집단)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "후성유전학(epigenetics)"은 돌연변이에 기반하지 않지만, 일부 경우에는 여전히 세대에서 세대로 전달될 수 있는, DNA의 공유적 변형을 지칭한다. DNA 서열에 있어서의 어떠한 변화도 수반하지 않으면서 활성화되거나 억제되는 유전자는 후성적으로 제어된다. 후성적 변형은 안정적이긴 하지만, DNA 서열 상의 영구적인 변화를 수반하지 않으면서 발생되는 유전자 발현 상의 잠재적으로 가역적인 변경이다. 많은 유형의 후성적 과정이 확인되었는데, 이는 히스톤의 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화 및 수모일화 뿐만 아니라 DNA 메틸화를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "후성적 조절제"는 후성적 과정을 조절하는 작용제를 지칭한다. 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 및 DNA 메틸화의 억제제가 후성적 조절제의 예이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제"는 GSK를 억제하는 작용제를 지칭한다. GSK는 GSK 1, GSK 2 및 GSK 3을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "히스톤 아세틸화를 증진시키는 작용제"는 히스톤 탈아세틸화의 억제제 또는 히스톤 아세틸화제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "히스톤 탈아세틸화의 억제제"는 히스톤 상의 리신 잔기로부터 아세틸 기를 제거하는 것을 방지하는 작용제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도된 다능성 줄기 세포" (iPSC)는 비-다능성 세포로부터 인공적으로 유래된 특정 유형의 다능성 줄기 세포이다. CiPSCs는 iPSCs이지만; 이들이 유전적으로 조작되지 않는다는 점에서 일부 iPSCs와 상이하다.
CiPSCs를 지칭하는 경우의 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 오염성 세포 유형, 예컨대 비-다능성 세포가 없는, 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포를 의미한다. 단리된 줄기 세포는 또한, 가용성의 자연 발생적 분자가 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다능성"은 다음 3가지 배엽 중 어느 것으로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기 세포를 지칭한다: 내배엽 (예를 들어, 내부 위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계). 용어 "비-다능성"은 세포가 상기 3가지 배엽 모두로 분화될 수 있는 잠재력을 지니지 않는다는 것을 의미한다. 다분화능 줄기 세포는 덜 유연성이고 더 분화되며, 소정의 기관 내에서의 몇 가지 세포 유형 중 하나가 될 수 있다. 예를 들어, 다분화능 혈액 줄기 세포는 적혈구 전구 세포, 백혈구 또는 혈소판 생성 세포로 발달될 수 있다. 성체 줄기 세포는 다분화능 줄기 세포이다. 지방 유래 줄기 세포는 다분화능이다.
본원에 사용된 바와 같은 "재프로그래밍"은 하나의 특이적 세포 유형이 또 다른 특이적 세포 유형으로 전환되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 비-다능성인 세포는 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍될 수 있다. 화학적 화합물을 이용하여 비-다능성 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 경우, 이로써 생성되는 세포는 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은 "재프로그래밍 배지"는 다능성의 하나 이상의 화학적 유도인자를 포함하는 세포 배양 배지를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 (SAH) 억제제"는 SAH를 억제하는 작용제를 지칭한다. SAH는 S- 아데노실 -L-호모시스테인을 아데노신과 호모시스테인이 되도록 가역적으로 수화시키는 것을 담당하는, 활성화 메틸 주기의 효소이다.
본원에 사용된 바와 같은 "2i 배지"는 글리코겐 합성효소 키나제-3과 분열촉진물질-활성화 단백질 키나제 신호 전달의 이중 억제를 수반하는 ESC 배양 배지, 예를 들어 2i (CHIR99021 및 PD0325901)를 보충시킨 ESC 배양 배지를 지칭한다. 용어 "소분자"는 2,000 달톤 미만, 보다 바람직하게 1,500 달톤 미만, 가장 바람직하게 1,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자, 예컨대 유기 또는 유기 금속 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 수용체 억제제"는 TGFβ 수용체를 억제하는 작용제를 지칭한다. TGFβ 수용체는 단일 패스 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. 3가지 TGF-β 수용체 유형은 수용체 유형 I, II 및 III, 즉 TGF-β 수용체 1, TGF-β 수용체 2 및 TGF-β 수용체 3을 포함한다.
II. 조성물
A. 다능성을 유도하는 소분자
다능성을 유도하는 화학적 화합물, 즉 다능성의 화학적 유도인자 (CIP)는 단독으로 또는 단백질과 조합하여, 2,000 달톤 미만, 보다 바람직하게 1,500 달톤 미만, 가장 바람직하게 1,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 소분자를 포함한다. 이러한 소분자는 900 달톤 이하 또는 500 달톤 이하의 분자량을 가질 수 있다. 보다 큰 분자도 화학적으로 유도된 재프로그래밍, 바람직하게 본원에서 확인된 소분자와 동일한 경로를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 몇 가지 단백질 인자, 예컨대 재조합 bFGF가 화학적 재프로그래밍을 위한 다음 프로토콜에 유효한 것으로 입증되었다.
부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 소분자가 확인되었다. 이에 요구되는 다능성의 화학적 유도인자 (CIPs)는 (1) 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제, (2) TGFβ 수용체 억제제, (3) 사이클릭 AMP 효능제, (4) S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 (SAH) 억제제, (5) 히스톤 아세틸화를 증진시키는 작용제, 예컨대 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 및 그의 조합물을 포함한다. 상기 CIPs는 별개로 제공되거나 또는 CIP 조성물로서 조합되어 제공될 수 있다. 또한, 하나 이상의 후성적 인자 및 레티노산 수용체 효능제가 CIPs와 함께 투여될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, GSK 억제제는 글리코겐 합성효소 키나제 3 억제제, 예를 들어 화학명 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴]을 갖는 아미노피리미딘, CHIR99021 ("CHIR")이고; TGFβ 수용체 억제제는 TGFβ 수용체 유형 1 억제제, 예를 들어 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)이며; cAMP 효능제는 포르스콜린 (FSK)이며 SAH 억제제는 3-데아자네플라노신 A (DZNep)이다.
일부 실시양태에서, CIPs는 CHIR, 616452, FSK 및 DZNep의 조합물 (C6FZ)이다. 보다 바람직한 실시양태에서, CIPs는 VPA, CHIR, 616452, 트라닐시프로민, FSK (집합적으로, VC6TF) 및 DZNep (집합적으로, VC6TFZ)의 조합물이다.
바람직한 실시양태에서, SAH 억제제는 3-데아자네플라노신 A (DZNep)이다. 본원에 개시된 CIP 조합 조성물에 포함될 수 있는 기타 유용한 SAH 가수분해효소 억제제는 (-) 네플라노신 A (Nep A), 아데노신 퍼아이오데이트 (산화됨) Adox 및 3-데아자아데노신 (DZA), 및 그의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
히스톤 아세틸화를 증진시키는 데 적합한 작용제는 HDAC 억제제를 포함한다. HDAC 억제제의 예는 히드록삼산, 예컨대 트리코스타틴 (A), 사이클릭 테트라펩티드, 벤자미드, 친전자성 케톤, 소듐 부티레이트, 및 화합물, 예컨대 페닐부티레이트 및 발프로산 (VPA)을 포함한다. 바람직한 HDAC 억제제는 VPA이다.
바람직한 실시양태에서, CIP 조성물에 포함될 수 있는 후성적 조절제는 DNA 메틸화를 억제하는 작용제, 예를 들어 5-아자시티딘 및 RG108 중 하나 이상, 및 그의 조합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자와, VC6TFZ를 이용한 경우에 관찰된 수준에 비해 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자가 포함된다. 개선된/증가된 효율은 상기 다능성 세포를 발생시키는 데 필요한 시간을 단축시킴으로써 (예를 들어, 상기 소분자를 이용하지 않는 유사하거나 동일한 과정과 비교해서 다능성 세포의 발생 시간을 적어도 1일 정도 단축시킴으로써) 나타날 수 있다. 또 다른 한편으론, 또는 조합하여, 특정 소분자는 특별한 과정에 의해 발생된 다능성 세포의 수를 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 상기 소분자를 이용하지 않는 유사하거나 동일한 과정과 비교해서 소정의 기간 내에 세포 수를 10%, 50%, 100%, 200%, 500% 이상 증가시킬 수 있다).
후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자는 cAMP 효능제 (예를 들어, 프로스타글란딘 E2 (PGE2), FSK 및 롤리프람), 및 후성적 조절제 (예를 들어, 5-아자시티딘, 소듐 부티레이트 및 RG108)를 포함한다.
화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자는 프로스타글란딘 E2 (PGE2), [N-(9,10-디옥소-9,10-디히드로페난트렌-2-일)피발라미드] (SF1670), [N-(4-(디에틸아미노벤질리데닐)-N'-(4-히드록시벤조일)-히드라진] (DY131), [2-시클로헥실-6-메톡시-N-[1-(1-메틸에틸)-4-피페리디닐]-7-[3-(1-피롤리디닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민] (UNC0638), [N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드 히드로클로라이드] (SRT1720), [N-프탈릴-L-트립토판] (RG108), 2-Me-5HT (2-메틸-5-히드록시트립타민), [3,7-디히드로-1-메틸-3-(2-메틸프로필)-1H-푸린-2,6-디온앤드] (IBMX) 및 [4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산] (TTNPB)을 포함한다. 화학적 재프로그래밍 효율을 증가시키는 데 바람직한 소분자는 TTNPB이다.
다능성을 유도시키는 조성물에 포함될 수 있는 부가의 분자는 D4476 (고순도 카세인 키나제 억제제인 D4476 (CAS 301836-43-1)); Ch 55 (RAR-α 및 RAR-β 수용체에 대해서는 고 친화성을 지니고 세포성 레티노산 결합성 단백질 (CRABP)에 대해서는 저 친화성을 지닌 고도로 강력한 합성 레티노이드인 [4-[(1E)-3-[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)페닐]-3-옥소-1-프로페닐]벤조산]); AM580 ([4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산]; 선택적 RARα 효능제로서 작용하는 레티노산의 유사체); 및 EPZ004777, "1-(3-((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸)(이소프로필)아미노)프로필)-3-(4-(tert-부틸)페닐)우레아 (EPZ)를 포함한다.
세포를 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 소분자 조합물의 예가 다음 표 1A에 제시된다.
<표 1A>
다능성을 유도시키기 위한 소분자 조합물
Figure 112016012045115-pct00001

본원에 개시된 제제 내에 포함될 수 있는 예시되는 소분자에 대한 농도 범위가 표 1B에 제공된다.
<표 1B>
소분자 농도의 요약
Figure 112016012045115-pct00002

B. 단백질 인자
단백질 인자, 예컨대 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)는 화학적 재프로그래밍을 위한 다음 프로토콜에 유효한 것으로 입증되었다. bFGF는 10 ng/mL 내지 200 ng/mL의 농도 범위, 바람직하게 100 ng/mL의 농도에서 사용될 수 있다.
C. 유도시키고자 하는 세포
유도된 다능성 줄기 세포는 포유류, 예컨대 모든 포유류 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 영장류), 바람직하게 인간으로부터 수득된 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 유도시킴으로써 수득된다. 공급원은 골수, 섬유아세포, 태아 조직 (예를 들어, 태아 간 조직), 말초혈, 제대혈, 췌장, 피부 또는 모든 기관 또는 조직을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CiPSCs는 화학적으로 유도된 섬유아세포, 지방 유래 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 또는 장 상피로부터의 세포로부터 수득된다. 보다 바람직한 실시양태에서, CiPSCs는 화학적으로 유도된 신생아 (예를 들어, 포피) 또는 성체 섬유아세포로부터 수득된다. 그러나, CiPSCs는 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 기타 세포 유형으로부터 수득될 수 있다: 다분화능 줄기 세포, 혈액 기원의 세포, 배아 기원의 세포, 피부 유래 세포, 섬유아세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 신경 세포, 및 결합 조직 세포. 다분화능 줄기 세포, 혈액 기원의 세포, 배아 기원의 세포, 피부 유래 세포, 섬유아세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 신경 세포, 및 결합 조직 세포. 재프로그래밍시키고자 하는 세포는 포유류 대상체로부터 수득된 샘플로부터 수득될 수 있다. 이러한 대상체는 모든 포유류 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 영장류) (인간 포함)일 수 있다. 세포 샘플은, 예를 들어 골수, 태아 조직 (예를 들어, 태아 간 조직), 말초혈, 제대혈, 췌장, 피부 또는 모든 기관 또는 조직을 포함한 수많은 상이한 공급원 중 어느 것으로부터 수득될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, CiPSCs는 섬유아세포 및 지방 유래 줄기 세포로부터 수득된다. 보다 바람직한 실시양태에서, CiPSCs는 신생아 (예를 들어, 포피 섬유아세포) 또는 성체 섬유아세포일 수 있는 섬유아세포로부터 수득된다. 또한 또 다른 바람직한 실시양태에서, 비-다능성 세포는 Oct4를 발현하지 않고/않거나 다능성의 하나 이상의 마커를 발현하도록 유전적으로 조작되지 않는다.
세포는 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 세포 공급원으로서 제공되어야 하는 적당한 기관 또는 조직을 분해함으로써 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 기관 또는 조직은 기계적으로 분해시킬 수 있고/있거나 이웃하는 세포들 간의 결합을 약화시키는 분해 효소 및/또는 킬레이트제로 처리하여, 상기 조직들이 인지 가능한 세포 붕괴 없이도 개개 세포의 현탁물을 형성하도록 분산시킬 수 있다. 효소적 해리는 상기 조직을 분쇄시키고 이와 같이 분쇄된 조직을 하나 이상의 효소, 예컨대 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및/또는 히알루로니다제, DNase, 프로나제, 디스파제 등으로 처리함으로써 달성될 수 있다. 기계적 붕괴는 또한, 분쇄기, 블렌더, 체, 균질화기, 압력 셀 또는 인소네이터(insonator)의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수많은 방법에 의해 달성될 수 있다.
D. 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포 ( CiPSCs )
CiPSCs는 생리적으로 및 형태학적으로 배아 줄기 세포 (ESC)와 구별 가능하지 않다. 본 실시예는 CiPSCs가 ESC와 유사한 배가 시간으로 성장하고, ESC와 유사하게 다능성 마커를 발현하며, ESC와 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖고 있고, Oct4 및 Nanog 프로모터에서 유사한 DNA 메틸화 및 히스톤 변형을 지니고 있다는 것을 보여준다. 핵형별 분석은 또한, CiPSCs가 염색체 이상을 획득하지 않는다는 것을 입증해 준다. CiPSCs가 다능성이라는 추가의 증거는 3가지 배아 배엽 조직으로 분화될 수 있는 그들의 능력이다. 이러한 발견들은 분화된 인간 세포를 환자-특이적 다능성 줄기 세포의 무제한 공급을 발생시키도록 조작할 수 있는 능력을 명확하게 보여준다.
CiPSCs는 ESC-유사 특성, 예컨대 ESC 형태학, ESC와 유사한 배가 시간, ESC 마커, 예컨대 알칼리성 포스파타제 (AP), nanog, Rex1, Sox2, Dax1, Sall4, 미분화된 배아 세포 전사 인자 (Utf1), 발생 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)의 발현, 및 3가지 배아 배엽 조직으로 분화될 수 있는 세포의 능력을 보유하고 있다. 이러한 세포는 또한, 그로부터 CiPSC가 유도되는 분화된 세포의 특징적인 마커의 하향 조절을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 섬유아세포로부터 유래된 CiPSCs는 섬유아세포 세포 마커 Thy1의 하향 조절 및/또는 SSEA-1의 상향 조절을 특징으로 할 수 있다. CiPSCs 상에 표시해야만 하는 다능성 마커의 최소 수는 없다. 다능성에 대한 최적 기준은 3가지 모든 배엽의 세포 유형으로의 분화 잠재력이다. 기형종 검정, 키메라 검정 및 생식세포계 전달 능력이 이들 분화 잠재력을 시험하기 위한 일부 직접적인 검정이다.
III. 제조 방법
A. CiPSCs의 유도
CiPSCs는 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포 (CiPSC)가 되도록 재프로그래밍시키기에 충분한 시간 동안, CIPs를 함유하는 배양 배지에 상기 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를 제공함으로써 유도시킨다. 이와 같이 재프로그래밍된 세포는 ESC-유사 특성, 예컨대 형태학, 배가 시간, ESC 마커, 예를 들어 알칼리성 포스파타제 (AP); nanog, Rex1; Sox2; Dax1; Sall4; 미분화된 배아 세포 전사 인자 (Utf1); 발생 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)의 발현, 및 3가지 배아 배엽 조직으로 분화될 수 있는 상기 세포의 능력을 보유하고 있는 것에 근거하여 다능성 세포로서 규정된다.
상기 CIP 화합물은 비-다능성 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 것을 유도하고/하거나 재프로그래밍을 증강시키는 데 유효한 양으로 유도시키고자 하는 세포와 접촉시킨다. 통상의 기술자는 다음 실시예에 요약된 방법 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법을 이용하여 완전한 재프로그래밍을 제공하는 데 요구되는 본원에 개시된 CIP 화합물의 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, CIPs는 SAH 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, VPA는 상기 세포에게 500 μM 내지 0.5 mM의 농도로 투여되고, CHIR은 10 내지 20 μM의 농도로 투여되며, 616452는 5 내지 10 μM의 농도로 투여되고, FSK는 10 내지 50 μM의 농도로 투여되며, DZNep는 20 nM 내지 0.1 μM, 바람직하게 0.05 내지 0.1 μM, 보다 바람직하게 20 내지 200 nM의 농도로 투여된다. 비-다능성 세포에서 다능성을 유도시키기 위해 사용될 수 있는 소분자의 예시되는 조합물 및 농도 범위가 표 1A 및 B에 제공된다.
616452와 포르스콜린은 2i-배지를 사용하기 전의 모든 시간에 존재해야 할 필요가 있다. CHIR99021은 처음 12일에 사용되어야 하고, 바람직하게는 2i-배지를 사용하기 전의 모든 시간에 존재한다. DZNep는 재프로그래밍의 후기 단계 (12일에서 40일째)에 부가되어야 하고, 바람직하게는 다른 소분자의 초기 처리 후 20일까지 부가되어야 한다. 소분자 조합물 (VC6TFZ)은 28일째와 48일째 사이의 특정 시점 후, 바람직하게는 40일째에 2i-배지로 변화시켜야 한다. 상이한 세포 유형은 소분자의 상이한 최적 농도를 갖고 있다. 이들은 본원에 기재된 연구에 근거하여 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 노출 순서 및 노출 기간은 세포 유형들 간에 유사하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 세포를 26일 내지 36일의 기간 동안 CIPs를 함유하는 재프로그래밍 배지에서 배양하고; 이러한 재프로그래밍 배지로 처리한지 약 28일 후에 글리코겐 합성효소 키나제-3 (GSK3)과 분열촉진물질-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 신호 전달의 이중 억제를 수반하는 ESC 배양 배지에서 상기 세포를 약 4일 동안 추가로 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, GSK3과 MAPK의 이중 억제는 CHIR99021 및 PD0325901을 이용하여 달성된다.
상기 세포는 바람직하게 CIP 성분 VC6TF를 함유하는 재프로그래밍 배지에서 약 16일 내지 20일 동안 배양하고, 상기 세포가 재프로그래밍 배지에 노출되는 동안의 나머지 기간 동안 VC6TFZ를 함유하는 배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 세포를, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자, 예를 들어 포르스콜린 이외의 cAMP 효능제 및/또는 본원에 개시된 후성적 조절제, 및/또는 본원에 개시된 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 후성적 조절제가, VC6TF를 함유하는 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 한편으론, 이들 소분자는 상기 세포를 VC6TF로 처리한 후 세포 배양 배지에 포함될 수 있다. 상기 세포는 1일 초과 동안 소분자에 노출되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 세포를 cAMP 효능제 및 후성적 조절제로 처리하는 것은 VC6TF로 처리하는 기간을 초과하지 않는다. 다른 실시양태에서, 세포를 cAMP 효능제 및 후성적 조절제로 처리하는 것은 VC6TFZ로 처리하는 기간을 초과하지 않는다. 또한 다른 실시양태에서, 세포를 cAMP 효능제 및 후성적 조절제로 처리하는 것은 VC6TF 플러스 VC6TFZ로 처리하는 기간을 초과하지 않는다. 화학적 재프로그래밍 효율을 증가시키는 데 바람직한 소분자는 TTNPB이다.
본원에 개시된 방법은 세포를 Oct4, KLF4, SOX2, C-Myc 또는 NANOG와 같은 유전자로 형질감염시킬 필요 없이 또는 세포를 KLF, Oct, Myc 및/또는 Sox 폴리펩티드 중 어느 것과 접촉시킬 필요 없이 유도된 다능성 줄기 세포를 산출시킨다.
B. CiPSCs의 단리
ES 세포의 미분화된 상태와 다능성을 유지시켜 줄 수 있거나 또는 분화를 유도시킬 수 있는 배지는 당해 분야에 공지되어 있다. 단리되고 유도된 다능성 줄기 세포의 분화 및 증식 능력은 ES 세포에 광범위하게 적용되어 온 확증 수단을 이용함으로써 통상의 기술자에 의해 용이하게 확증될 수 있다.
CiPSCs의 실질적으로 정제된 집단은, 예를 들어 배양 공급원으로부터 추출함으로써 (예를 들어, 밀도 구배 원심분리 및/또는 유동 세포계수법을 통하여) 수득될 수 있다. 순도는 적당한 모든 방법에 의해 측정할 수 있다. 다능성 세포는, 예를 들어 유동 세포계수법 (예를 들어, FACS 분석)에 의해 99% 내지 100%로 정제될 수 있다. 인간 유도된 다능성 줄기 세포는, 예를 들어 이러한 유도된 다능성 줄기 세포 상에서 특정 마커 (예를 들어, TRA-1-81, TRA-1-61 또는 마커 조합물)와 결합하는 분자 (예를 들어, 항체, 항체 유도체, 리간드 또는 Fc-펩티드 융합 분자)를 활용함으로써, 상기 분자와 결합하는 세포를 양성적으로 선별 (즉, 양성 선별)함으로써 단리할 수 있다. 양성 선별 방법의 기타 예는 목적하는 세포 유형과 원하지 않는 세포 유형의 혼합 집단에서 목적하는 세포 유형의 성장을 우선적으로 증진시키는 방법을 포함한다. 또 다른 한편으론, 목적하는 세포 유형 상에는 존재하지 않지만, 원하지 않는 세포 유형 상에는 존재하는 마커와 결합하는 분자를 사용함으로써, 이러한 마커를 함유하는 원하지 않는 세포를 목적 세포로부터 제거할 수 있다 (즉, 음성 선별). 기타 음성 선별 방법은 목적하는 세포 유형과 원하지 않는 세포 유형의 혼합 집단에서 원하지 않는 세포 유형의 성장을 우선적으로 사멸 또는 억제시키는 것을 포함한다. 따라서, 음성 선별, 양성 선별 또는 그의 조합을 이용함으로써, 강화된 줄기 세포 집단을 만들 수 있다.
분리를 위한 과정은 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리, 친화 크로마토그래피, 모노클로날 항체와 연결된 세포독성제, 또는 모노클로날 항체와 연계해서 사용되는 상기 작용제, 예를 들어 보체 및 세포독소, 및 고체 매트릭스 (예를 들어, 판)에 부착된 항체로의 "패닝", 또는 기타 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 다양한 수준의 복잡성을 지닐 수 있는, 예를 들어 복수 개의 색 채널, 저각 및 둔한 광산란 검출 채널, 및 임피던스(impedance) 채널을 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분류기를 포함한다. 항체는 마커, 예컨대 직접적인 분리를 허용해 주는 자기 비드; 특정 지지체와 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하여 제거될 수 있는 바이오틴; 또는 특별한 세포 유형의 분리를 용이하게 해줄 수 있는 형광 활성화 세포 분류기와 함께 이용될 수 있는 형광색소와 접합될 수 있다. 상기 유도된 다능성 줄기 세포의 생존력에 과도하게 해롭지 않은 어떠한 기술도 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 세포는 특정 마커에 대항한 항체 (예를 들어, TRA-1-81 항체)와 함께 인큐베이션하고, 이러한 마커에 대해 양성적으로 염색되는 세포를 수동으로 선별하며 계대 배양한다.
강화 방법을 조합하여 사용하여, 정제 또는 강화 시간 또는 효율을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 관심 세포 유형을 표시하지 않는 마커를 갖는 세포를 제거하기 위한 강화 단계 후, 상기 세포를 형광 활성화 세포 분류기 (FACS) 또는 고 특이성을 지닌 기타 방법론에 의해 추가로 분리 또는 강화시킬 수 있다. 다중-색 분석을 FACS와 함께 이용할 수 있다. 상기 세포는 특별한 항원에 대한 염색 수준 또는 그의 결핍을 기준으로 하여 분리할 수 있다. 형광색소를 이용하여 특별한 항원에 대해 특이적인 항체를 표지시킬 수 있다. 이러한 형광색소는 피코빌리단백질, 예를 들어 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레세인, 및 텍사스 레드를 포함한다.
특별한 세포 유형에 대항하는지 또는 그를 지지하는지를 선별하기 위하여 어떠한 세포 유형-특이적 마커도 사용할 수 있다. 강화에 유용한 유도된 줄기 세포 마커는 발현된 마커, 예컨대 TRA-1-81을 포함하고, 레트로바이러스성 벡터 또는 기타 외인성 벡터와 연관된 마커 (예를 들어, GFP)가 상실된다.
C. CiPSCs (및 그의 자손)의 배양 및 보존
CiPSCs는 배양 하에 확장시킬 수 있고, 나중에 검색하고 사용하기 위하여 저장할 수 있다. 일단 세포 배양물 또는 줄기 세포의 혼합 배양물이 확립되면, 세포 집단은 조직 형성을 수반하거나 수반하지 않으면서 세포 증식에 도움에 되는 조건 하에 세포 밀도에 따라서 신선한 배지로의 계대에 의해 시험관 내에서 유사분열 확장된다. 이러한 배양 방법은, 예를 들어 분화를 유도시키는 특별한 성장 인자 (예를 들어, IGF, EGF, FGF, VEGF, 및/또는 기타 성장 인자)가 결여된 배양 배지에서 상기 세포를 계대시키는 것을 포함할 수 있다. 배양된 세포가 충분한 세포 밀도에 도달하게 되면, 이 세포를 신선한 배지에 옮길 수 있다. 일부 줄기 세포 유형은 특유의 접촉 억제-아폽토시스(apoptosis)를 명확하게 보여주지 않거나 또는 이들 유형은 밀도가 최대일 때 휴지기가 된다. 따라서, 적당한 계대 기술을 이용하여 접촉 억제와 휴지기를 저하시킬 수 있다.
세포를 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester]에 기재된 방법에 따라서 저장하기 위하여 냉동보존할 수 있다. 예를 들어, 세포를 "냉동 배지", 예컨대 예를 들어, 약 4 내지 10 x 106개 세포/ml의 밀도로, 5 내지 10% 글리세롤을 수반하거나 수반하지 않으면서, 15 내지 20% 태아 소 혈청 (FBS) 및 10% 디메틸술폭시드 (DMSO)를 함유하는 배양 배지에서 현탁시킬 수 있다. 이러한 세포를 유리 또는 플라스틱 바이알 내에 제공한 다음, 밀봉하고 이를 프로그램 가능하거나 수동 냉동고의 냉동 챔버에 옮긴다. 최적의 냉동 속도는 실험적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 융합 열을 통하여 1분당 -1℃의 온도 변화를 가져다주는 냉동 프로그램을 이용할 수 있다. 일단 상기 세포를 함유하는 바이알이 -80℃에 도달하게 되면, 이 바이알을 액체 질소 저장 구역에 옮긴다. 냉동 보존된 세포는 수년 동안 저장할 수 있다.
IV. 사용 방법
목적하는 세포 유형 또는 형태를 생성시킬 수 있는 줄기 세포의 용이하게 입수 가능한 공급원을 확인하는 것이 치료적 처치, 조직 공학 및 연구에 중요하다. 줄기 세포의 입수 용이성이 이식, 조직 공학, 혈관형성, 혈관생성 및 세포 대체의 조절, 또는 세포 요법 뿐만 아니라 특정 질환의 예방에 상당히 유용할 것이다. 이러한 줄기 세포를 또한 사용하여, 특정 유전자 치료 요법의 일부로서 특정 유전자를 특정 대상체 내로 도입할 수 있다.
A. 분화된 체세포를 제공함 (재분화된 세포)
일단 확립되면, 줄기 세포 배양물을 사용하여 자손 세포, 예를 들어 신규 조직을 생산할 수 있는 섬유아세포를 생성시킬 수 있다. 상기 CiPSCs는 3가지 배엽 중 어느 것으로부터의 세포, 예를 들어 피부 및 유모 세포 (상피 세포 포함), 각질 세포, 멜라닌 세포, 지방 세포, 뼈, 근육 및 결합 조직을 형성하는 세포, 예컨대 근세포, 연골 세포, 골세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예컨대 간세포, 신장 세포, 부신 세포 및 섬 세포, 혈액 세포, 망막 세포 (및 감각 인식에 관여하는 기타 세포, 예컨대 귀에 유모 세포를 형성하거나 혀 위에 미뢰(taste buds)를 형성하는 세포), 및 신경을 포함한 신경 조직으로 분화되도록 유도시킬 수 있다.
한 실시양태에서, CiPSCs는 세포를 "외배엽성 분화성" 배지에 노출시킴으로써 외배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. 또 다른 실시양태에서, CiPSCs는 세포를 "중배엽성 분화성 배지"에 노출시킴으로써 중배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. 또한 또 다른 실시양태에서, CiPSCs는 세포를 "내배엽성 배지"에 노출시킴으로써 내배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. "내배엽성", "중배엽성" 및 "외배엽성" 배지의 구성분은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 공지된 세포 표면 마커를 사용하여, 세포들이 상응하는 세포 배양 배지 계통의 세포로 실제로 분화된다는 사실을 검증할 수 있다. 상기 3가지 배엽의 분화를 확증하기 위하여 가장 일반적으로 인정되는 마커는 내배엽 세포의 경우에는 알파 태아 단백질의 발현이고, 중배엽 세포의 경우에는 알파 평활근 액틴의 발현이며, 외배엽 세포의 경우에는 베타-III 투불린의 발현인데, 이들 모두는 상기 조직의 발생에 있어서 매우 초기에 정상적으로 발현된다.
줄기 세포가 섬유아세포 또는 기타 세포 유형으로 분화된 다음, 그로부터 조직이 생성되는 것은 특이적 외인성 성장 인자에 의해 촉발될 수 있거나 또는 줄기 세포 배양물의 배양 조건 (예를 들어, 밀도)을 변화시킴으로써 촉발될 수 있다. 세포가 목적하는 세포 유형의 특정 세포로 분화되는 것을 유도하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CiPSCs는 특정 물질 (예를 들어, 성장 인자, 효소, 호르몬, 또는 기타 신호 전달 분자)을 세포의 환경에 부가함으로써 분화되도록 유도시킬 수 있다. 분화를 유도시키기 위해 사용될 수 있는 인자의 예는 에리트로포이에틴, 집락 자극인자, 예를 들어 GM-CSF, G-CSF, 또는 M-CSF, 인터루킨, 예를 들어 IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, 백혈병 억제성 인자 (LIF), 또는 스틸(Steel) 인자 (Stl), 조직 수임 세포와의 공생 배양물, 또는 줄기 세포가 특별한 계통으로 수용되도록 유도시키는 기타 계통 수임 세포 유형을 포함한다.
재분화된 세포는 배양 하에 확장시킬 수 있고, 나중에 검색하고 사용하기 위하여 저장할 수 있다.
B. 세포 요법
유도된 다능성 줄기 세포의 치료적 용도는 이러한 유도된 다능성 줄기 세포, 줄기 세포 집단 또는 그의 자손을 개개인에게 이식하여, 암, 상처, 신생물, 손상, 바이러스성 감염, 당뇨병 등으로부터 비롯된 질환 및 장애를 포함한 각종 병리학적 상태를 치료하는 것을 포함한다. 치료는 현재 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 앞으로 개발될 모든 방법에 따라서, 신규 조직을 생성시키기 위해 상기 세포를 사용하는 것과, 이로써 생성된 조직을 사용하는 것을 수반할 수 있다. 상기 세포는 조직 손상 부위에 이식하거나, 주사하거나 또는 그렇지 않으면 직접 투여하여, 이들이 생체 내에서 신규 조직을 생성하도록 할 수 있다. 한 실시양태에서, 투여는 유전적으로 변형된 CiPSCs 또는 그의 자손을 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, CiPSCs는 자가 세포로부터 수득되는데, 즉 공여자 세포가 자가이다. 그러나, 세포를 이종 세포로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 공여자 세포는 수용자와 유전적으로 관계된 공여자로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 공여자 세포는 수용자와 유전적으로 관계가 없는 공여자로부터 수득한다.
인간 CiPSCs가 수용자 대상체와 비교해서 이종 (비-자가/동종) 공급원으로부터 유래되는 경우에는, 이와 동시에 면역억제 요법을 전형적으로 투여하는데, 예를 들어 면역억제제 시클로스포린 또는 FK506을 투여한다. 그러나, 인간 유도된 다능성 줄기 세포의 미성숙한 상태로 인해, 상기 면역억제 요법은 요구되지 않을 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포는 면역조정 (예를 들어, 면역억제) 요법의 부재 하에 수용자에게 투여될 수 있다. 또 다른 한편으론, 세포를 막 내에 피막화하여, 유체의 교환은 허용하지만, 세포/세포 접촉은 방지시킬 수 있다. 미소피막화된 세포를 이식하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Balladur et al., Surgery, 117:189-94, 1995]; 및 [Dixit et al., Cell Transplantation 1:275-79 (1992)]).
(i) 당뇨병
진성 당뇨병 (DM)은 대상체의 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 못하기 때문에 또는 세포가 생성되는 인슐린에 반응하지 못하기 때문에, 이러한 대상체의 혈당치가 높은 일군의 대사 질환이다. 인슐린 요법에 대한 장래성 있는 대체 요법은 인슐린을 필요로 하는 환자에게 섬 세포를 제공하는 것이다. 문헌 [Shapiro et al., N Engl J Med ., 343(4):230-8 (2000)]에서는 베타 세포/섬을 이식하는 것이 당뇨병 환자에 대한 치료를 제공한다고 명확하게 보여주었다. 수많은 인슐린 유형이 시판되고 있긴 하지만, 이들 제제는 주사제로서 제공된다. 인간 유도된 다능성 줄기 세포는 당뇨병을 예방하거나 치료하기 위한 섬 세포의 또 다른 공급원을 제공한다. 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포를 단리하고, 이를 췌장 세포 유형으로 분화시킨 다음, 특정 대상체에게 전달할 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 유도된 다능성 줄기 세포를 대상체의 췌장에 전달하고, 이를 생체 내에서 섬 세포로 분화시킬 수 있다. 따라서, 상기 세포는 당뇨병의 발병을 예방 또는 치료하기 위하여 이식하는 데 유용하다. 췌장 섬 세포의 생존력과 효력에 불리한 영향을 미치지 않으면서 사이토킨 노출 후 염증을 감소시키는 방법이, 예를 들어 미국 특허 번호 8,637,494 (Naziruddin, et al.)에 개시되어 있다.
(ii) 신경변성 장애
신경변성 장애는 질환, 유전성 병태 또는 손상, 예컨대 외상성 또는 허혈성 척수 또는 뇌 손상에 따른 결과로서 뉴런이 쇠약해지는 것과 관련된 병태를 특징으로 한다. 신경변성 병태는 뉴런의 손상 또는 쇠약과 관련된 모든 질환 또는 장애 또는 증상 또는 원인 또는 그의 효과를 포함한다. 신경변성 병태는 알렉산더(Alexander) 병, 알퍼(Alper) 병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관 확장성 운동 실조, 카나반(Canavan) 병, 코케인(Cockayne) 증후군, 대뇌피질 기저핵 변성증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 병, 헌팅턴(Huntington) 병, 케네디(Kennedy) 병, 크라베(Krabbe) 병, 레비소체(Lewy Body) 치매, 마카도-조셉(Machado-Joseph) 병, 다발성 경화증, 파킨슨(Parkinson) 병, 펠리쩨우스-메르쯔바하(Pelizaeus-Merzbacher) 병, 니만-피크(Niemann-Pick) 병, 원발성 측삭 경화증, 레프섬(Refsum) 병, 샌드호프(Sandhoff) 병, 쉴더(Schilder) 병, 스틸-리차드슨-올체브스키(Steele-Richardson-Olszewski) 병, 척수 매독(Tabes Dorsalis) 또는 손상된 뉴런과 연관된 기타 모든 병태를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 신경변성 병태는 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 뇌졸증, 외상성 뇌 손상, 및 유전성 병태를 포함할 수 있거나 또는 이에 의해 유발될 수 있다.
특히, 본원에 개시된 방법은 시험관 내에서 확장시킨 NSCs, 신경 전구 세포 또는 신경 전구체를, 이를 필요로 하는 대상체 내로 이식하여, 이들 세포가 신경변성 병태를 완화시킬 수 있도록 하는 것을 포함한다. 상기 확장된 신경 줄기 세포의 이식을 이용하여, 경직, 경축, 발작, 마비 또는 근육의 기타 모든 과잉 활동 증상을 수반하는 각종 형태의 골수증으로 인해 고통받고 있는 대상체에게서 보행 기능을 개선시킬 수 있다. 상이한 신경변성 병태를 치료하기 위하여 신경 세포 및 신경 전구 세포를 확장 및 이식하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,236,299 (Johe, et. al.)에 개시되어 있다.
(iii) 암 요법
CiPSCs 및 그의 자손의 치료적 용도는 이러한 유도된 다능성 줄기 세포, 줄기 세포 집단 또는 그의 자손을 개개인에게 이식하여, 암과 연관된 증상을 치료 및/또는 완화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CiPSCs는 특정 대상체의 세포를 사멸, 감소 또는 손상시킨 화학요법을 진행한 적이 있는 암 환자에게 투여할 수 있다. 암에 대한 전형적인 줄기 세포 이식체에서는, 극히 고 용량의 화학요법을 종종 방사선 요법과 함께 사용하여, 모든 암 세포를 파괴시키고자 한다. 이러한 치료는 또한, 골수 내의 줄기 세포를 사멸시킨다. 치료 직후, 줄기 세포는 파괴된 것을 대체하기 위해 제공된다.
또 다른 실시양태에서, CiPSCs는 (탈분화 인자 이외의) 하나 이상의 부가 치료 인자로 형질감염 또는 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어, 일단 CiPSCs가 단리되면, 상기 세포를 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시킨 다음, 이를 대상체에게 체내 이식하거나 투여할 수 있거나, 또는 목적하는 세포 유형으로 분화시킨 다음 대상체에게 체내 이식 및 전달할 수 있다. 이러한 조건 하에, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 생성물의 전달을 위해 대상체 내에서 발현된다.
(iii) 조직 공학
CiPSCs 및 그의 자손을 사용하여, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 조직 조작된 구조물을 제조할 수 있다. 조직 조작된 구조물은 손상된 기관 또는 조직의 복구 또는 대체를 위한 보철 장치로서 사용하는 것을 포함한 각종 목적에 이용될 수 있다. 이들은 또한, 구조물의 세포에 의해 분비된 단백질 또는 기타 분자에 대한 생체내 전달 시스템으로서, 또는 일반적으로 약물 전달 시스템으로서 제공될 수 있다. 조직 조작된 구조물은 또한, 조직 기능의 시험관내 모델로서 또는 각종 치료 또는 제약의 효과를 시험하기 위한 모델로서 사용된다. 줄기 세포를 이식하기 위하여 가장 흔히 사용되는 생체 재료 스캐폴드(scaffold)는 문헌 [Willerth, S.M. and Sakiyama-Elbert, S.E., Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery (July 09, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook]에서 고찰된다. 조직 공학 기술은 종종, 조직 성장을 지속시키고 증진시키는 데 적당한 배양 기질을 선별하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이들 기질은 3차원적이어야 하고, 관심 조직에 대한 목적하는 외형의 스캐폴드를 형성하도록 처리 가능해야 한다.
미국 특허 번호 6,962,814에는 일반적으로, 조직 조작된 구조물 및 조작된 천연 조직을 생성하는 방법이 개시되어 있다. 구체적인 예와 관련해서, 미국 특허 번호 7,914,579 (Vacanti, et al.)에는 조직 조작된 인대 및 힘줄이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,716,404에는 중합체성 매트릭스와 조합하여 체내 이식된 해리된 근육 세포를 이용하여 유방 조직을 재구축 또는 증대시키기 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 8,728,495에는 자가 피부 섬유아세포를 이용하여 연골을 복구하는 것이 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 20090029322 (Duailibi, et al.)에는 치아 대체물을 제조하는 데 사용하기 위한 치아 조직을 형성하기 위하여 줄기 세포를 사용하는 것이 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 2006/0019326에는 두개내 동맥류를 치료하기 위한 세포-시드 조직-조작된 중합체가 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 2007/0059293 (Atala)에는 손상된 기관, 예를 들어 신장, 심장, 간, 비장, 췌장, 방광, 수뇨관 및 요도를 대체하기 위해 사용될 수 있는 조직-조작된 구조물 (및 이러한 구조물의 제조 방법)이 개시되어 있다.
(ii) CiPSCs로부터 생성된 세포 (자손)
CiPSCs는 3가지 배엽 중 어느 것으로부터의 세포, 예를 들어 피부 및 유모 세포 (상피 세포 포함), 각질 세포, 멜라닌 세포, 지방 세포, 뼈, 근육 및 결합 조직을 형성하는 세포, 예컨대 근세포, 연골 세포, 골세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예컨대 간세포, 신장 세포, 부신 세포 및 섬 세포 (예를 들어, 알파 세포, 델타 세포, PP 세포 및 베타 세포), 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구, 적혈구, 대식세포 및 림프구), 망막 세포 (및 감각 인식에 관여하는 기타 세포, 예컨대 귀에 유모 세포를 형성하거나 혀 위에 미뢰를 형성하는 세포), 및 신경을 포함한 신경 조직으로 분화되도록 유도시킬 수 있다.
(iii) 치료 조성물
CiPSCs는 생체내 또는 시험관내/생체외에서의 탈-분화를 증진시키기 위하여 투여하거나, 전달하거나 또는 특정 대상체, 조직 또는 세포와 접촉하기 위해 제제화할 수 있다. 부가 인자, 예컨대 성장 인자, 분화 또는 탈분화를 유도시키는 기타 인자, 분비 생성물, 면역조절제, 소염제, 퇴행 인자, 신경지배 또는 혈관화를 증진시키거나 또는 림프계 네트워크를 증강시키는 생물학상 활성 화합물, 및 약물을 혼입시킬 수 있다.
상기 유도된 다능성 세포는 CiPSCs 또는 CiPSC 자손 집단을 단독으로 포함하거나 또는 이를 담체 또는 지지체 구조 상에 또는 구조 내에 포함하는 조성물의 형태로 환자에게 투여할 수 있다. 많은 실시양태에서, 담체가 전혀 요구되지 않을 것이다. 상기 세포는 이러한 세포를 필요로 하는 부위 상으로 또는 부위 내로 주사함으로써 투여할 수 있다. 이러한 경우, 상기 세포는 전형적으로, 세포 배양 배지를 제거하기 위해 세척될 것이고, 생리학적 완충액에 현탁될 것이다.
다른 실시양태에서, 상기 세포는 지지체 구조물에 제공되거나 또는 이러한 구조물 상으로 또는 구조물 내로 혼입된다. 지지체 구조물은 메쉬, 고체 지지체, 스캐폴드, 튜브, 다공성 구조물 및/또는 히드로겔일 수 있다. 지지체 구조물은 완전히 또는 부분적으로 생분해 가능하거나 생분해 가능하지 않을 수 있다. 지지체는 자연 또는 합성 중합체, 금속, 예컨대 티타늄, 뼈 또는 히드록시아파타이트, 또는 세라믹으로 형성될 수 있다. 자연 중합체는 콜라겐, 히알루론산, 폴리사카라이드, 및 글리코사미노글리칸을 포함한다. 합성 중합체는 폴리히드록시산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 그의 공중합체, 폴리히드록시알카노에이트, 예컨대 폴리히드록시부티레이트, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리우레탄, 폴리카르보네이트 및 폴리에스테르를 포함한다. 이들은 이식체, 튜브, 메쉬 또는 히드로겔의 형태일 수 있다.
고체 지지체
지지체 구조는 느슨한 직조 또는 부직 메쉬일 수 있는데, 세포를 이러한 메쉬 내에 및 메쉬 상으로 시딩한다. 상기 구조는 고체 구조적 지지체를 포함할 수 있다. 이러한 지지체는 튜브, 예를 들어 신경 축삭의 재증식을 위한 신경 튜브일 수 있다. 지지체는 스텐트 또는 밸브일 수 있다. 지지체는 세포의 내증식을 허용하고/하거나 세포를 다공성 구조 내로 시딩하는 다공성 계면을 갖는 관절 보철, 예를 들어 무릎 또는 엉덩이, 또는 그의 일부일 수 있다. 많은 기타 유형의 지지체 구조물이 또한 가능하다. 예를 들어, 지지체 구조물은 스폰지, 발포체, 코랄, 또는 내부 기공을 갖는 생체 적합성 무기 구조물, 또는 짜여진 중합체 섬유의 메쉬 시트로부터 형성될 수 있다. 이들 지지체 구조물은 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
지지체 구조물은 히드로겔-세포 혼합물의 외형을 형성하고 이를 지지해 주는 공극-유사 공동 또는 간극을 갖는 투과성 구조물일 수 있다. 예를 들어, 지지체 구조물은 다공성 중합체 메쉬, 자연 또는 합성 스폰지, 또는 뼈 또는 히드록시아파타이트와 같은 재료 또는 금속으로 형성된 지지체 구조물일 수 있다. 지지체 구조물의 다공도는 영양분이 이러한 구조물 내로 확산됨으로써, 세포 내부에 효과적으로 도달할 수 있게 해주고 세포에 의해 생성된 폐기물이 구조물로부터 확산 제거될 수 있도록 설정되어야 한다.
지지체 구조물은 신규 조직이 요망되는 공간에 맞는 모양으로 만들 수 있다. 예를 들어, 지지체 구조물은 화상을 입은 적이 있는 피부 부위 또는 상실된 연골이나 뼈의 일부 외형에 맞는 모양으로 만들 수 있다. 만드는 재료에 따라서, 지지체 구조물은 목적하는 외형을 생성시키는 절단, 몰딩, 주조 또는 다른 모든 방법에 의해 특정 모양으로 만들 수 있다. 지지체는 다음에 기재되는 바와 같이, 지지체 구조물에 세포를 시딩하거나 또는 히드로겔-세포 혼합물을 충진시키기 전 또는 후에 특정 모양으로 만들 수 있다.
적합한 중합체의 한 예는 폴리글락틴인데, 이는 글리콜리드와 락티드의 90:10 공중합체이고, VICRYL™ 땋아서 만든(braided) 흡수성 봉합사 [에티콘 캄파니(Ethicon Co.); 미국 뉴저지주 서머빌]로서 제조된다. 중합체 섬유 (예컨대, VICRYL™)는 짜여지거나 또는 펠트-유사 중합체 시트가 되도록 압축시킬 수 있고, 그 다음 이를 목적하는 어떠한 모양으로도 절단할 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 중합체 섬유를 주형 내에서 함께 압축시켜, 이들을 지지체 구조물에 대한 목적하는 모양이 되도록 주조할 수 있다. 일부 경우에, 부가의 중합체를 중합체 섬유에 부가할 수 있는데, 이는 이들이 섬유 메쉬에 부가 구조를 부여하거나 이를 수정하도록 성형되기 때문이다. 예를 들어, 폴리락트산 용액을 이러한 폴리글리콜산 섬유 메쉬 시트에 부가할 수 있고, 그 조합물을 함께 성형하여 다공성 지지체 구조물을 형성할 수 있다. 폴리락트산은 폴리글리콜산 섬유의 가교결합물과 결합함으로써, 이들 개개의 섬유를 코팅하고 상기 성형된 섬유의 모양을 고정시킨다. 폴리락트산은 또한, 섬유들 사이의 공간 내에 충진시킨다. 따라서, 지지체 내로 도입된 폴리락트산의 양에 따라서 다공도는 다양할 수 있다. 섬유 메쉬를 목적하는 모양으로 성형시키는 데 요구되는 압력은 아주 적당한 수준일 수 있다. 필요한 모든 것은 폴리락트산의 결합 작용과 코팅 작용이 그 효력을 나타내기에 충분히 길게 상기 섬유가 공간을 차지하고 있는 것이다.
또 다른 한편으론, 또는 또한, 지지체 구조물은 당해 분야에 공지된 기술에 의해 제조된 다른 유형의 중합체 섬유 또는 중합체 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체 용액으로부터 용매를 증발시킴으로써 얇은 중합체 필름을 수득할 수 있다. 목적하는 모양의 릴리프(relief) 패턴을 갖는 주형으로부터 중합체 용액이 증발되는 경우에, 상기 필름을 목적하는 모양이 되도록 주조할 수 있다. 당해 분야에 공지된 압축 성형 기술을 이용하여, 중합체 겔을 또한, 얇은 투과성 중합체 구조물이 되도록 성형할 수 있다.
히드로겔
또 다른 실시양태에서, 세포를 히드로겔과 혼합하여 세포-히드로겔 혼합물을 형성한다. 히드로겔은 주사 또는 카테터에 의해 투여하거나 또는 다른 지지체 구조물의 체내 이식시 투여할 수 있다. 투여하기에 앞서, 투여하는 동안 또는 투여 후에 가교결합이 발생할 수도 있다.
V. 키트
본원에 개시된 다능성의 화학적 유도인자 (CIP)를 포함하는 키트가 제공된다. CIPs는 상기 언급된 바와 같다. 이들은 목적하는 농도를 생성하기 위해 세포 배양 배지에 대한 부가를 촉진시켜 주는 규정된 농도를 갖는 형태일 수 있다. 키트는 유도시키고자 하는 세포의 유형에 근거하여 투여 시간과 목적하는 농도 범위를 제공하는 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 또한, 세포 배양물이 다능성을 유도하도록 CIPs와 함께 미리-혼합되는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음 비-제한적 실시예를 참조로 하여 추가로 이해될 것이다.
실시예
재료 및 방법
마우스
마우스 계통 C57BL/6J-Tg(GOFGFP)11Imeg/Rbrc (OG), C57BL/6NCrlVr (C57), ICR 및 129S2/SvPasCrlVr (129)는 문헌 [Li, Cell Res., 21:196-204 (2011)]에 기재된 바와 같이 구입하였다. OG 마우스는 다른 계통과 짝짓기를 하여, Oct4 프로모터-구동된 GFP를 수반하는 자손을 생산하였다. ICR, C57 X 129, OG X ICR, OG X 129 및 OG X C57을 포함한 마우스 계통을 사용하여, 일차 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs), 마우스 신생아 섬유아세포 (MNFs), 마우스 성체 섬유아세포 (MAFs) 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs)를 단리하였다. 이들 세포를 CiPSC 유도에 사용하였다. 사용된 신생아 마우스는 2 내지 3일령이고, 사용된 성체 마우스는 7주령이었다. Tet-On POU5F1 마우스 계통 B6;129t(ROSA)26Sortm1 ( rtTA *M2) Jae Col1a1tm2 ( tetO -Pou5f1)Jae/J는 잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하였고 (문헌 [Hochedlinger, et al., Cell, 121:465-477 (2005)]), 이를 Oct4 플러스 VC6T를 이용한 재프로그래밍에만 사용하였다. 동물 실험은 중국 베이징 대학교의 동물 보호 지침에 따라서 수행하였다.
세포 배양
생식 융기의 제거에 세심한 주의를 기울이면서, 일차 MEFs를 문헌 [Takahashi, et al., Cell, 126:663-676 (2006)]에 기재된 바와 같이 단리하였다. 문헌 [Lichti, et al., Nat. Protoc . 3:799-810 (2008); Seluanov, et al., J. Vis. Exp . 2010:2033 (2010); Tat, et al., Cell Transplant. 19:525-536 (2010) and McQualter, et al., Stem Cells, 27:623-633 (2009)]에 기재된 바와 같이, 피부로부터 MNFs를 단리하였고, 폐로부터 MAFs를 단리하였으며, 서혜부 지방체로부터 ADSCs를 단리하였다.
MEFs, MNFs, MAFs 및 ADSCs를, 10% 태아 소 혈청 [하이클론(Hyclone)]을 함유하는 DMEM/고 글루코스 (하이클론)에서 배양하였다. 재프로그래밍에 사용된 세포는 1회 내지 5회 계대로부터의 것이었다.
마우스 ESCs (R1 및 TT2), iPSCs 및 CiPSCs를, ESC 배양 배지 [10% 녹아웃 혈청 대체물 (인비트로젠(Invitrogen)), 10% 태아 소 혈청 (하이클론), 2 mM 글루타MAXTM-I (인비트로젠), 1% 비필수 아미노산 (인비트로젠), 0.1 mM 2-머캅토에탄올 (인비트로젠), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (인비트로젠) 및 1,000 U/ml 백혈병 억제 인자 (LIF, 밀리포어(Millipore))를 함유하는 녹아웃 DMEM (인비트로젠)] 또는 2i-배지 [2i (3 μM CHIR99021 및 1 μM PD0325901)로 보충시킨 ESC 배양 배지] 중에서 미토마이신 C-처리된 MEFs의 배양보조 세포층 상에 유지시켰다. 상기 배지를 매일 변화시켰다. ESCs, iPSCs 및 CiPSCs를 트립신-EDTA (인비트로젠)에 의해 계대하였다. CiPSC 유도를 위하여, 20 내지 100 ng/ml bFGF [오리젠(Origene)]로 보충시킨 LIF-무함유 ESC 배양 배지를 화학적 재프로그래밍 배지로서 사용하였다.
소분자 화합물 및 라이브러리
본 연구에 사용된 소분자 화합물은 표 1D에 기재된 바와 같이 구입하거나 합성하였다. 각 화합물의 농도가 표 1D에 제시되어 있다. 스크린을 위해 사용된 소분자 라이브러리는 표 1C에 기재된 바와 같이 구입하거나 또는 사내에서 생성시켰다.
<표 1C>
재프로그래밍에 사용된 소분자 라이브러리
Figure 112016012045115-pct00003

* 이러한 라이브러리는 사내에서 생성되었는데, 다능성, 재프로그래밍 또는 후성적 변형과 관계된 88개의 선별된 소분자를 포함한다.
<표 1D>
재프로그래밍에서 시험된 소분자 화합물
Figure 112016012045115-pct00004

Figure 112016012045115-pct00005

Figure 112016012045115-pct00006

Figure 112016012045115-pct00007

주: * MEFs로부터 CiPSCs 유도하는 경우에는, CHIR99021의 농도가 10 μM이었다. MNFs, MAFs 또는 ADSCs로부터 CiPSCs 유도하는 경우, 및 재도말없이 CiPSCs 유도하는 경우에는, CHIR99021의 농도가 0일 내지 12일 동안에 20 μM으로 상승하였다.
** MEFs로부터 CiPSCs 유도하는 경우에는, 포르스콜린의 농도가 10 μM이었다. MNFs, MAFs 또는 ADSCs로부터 CiPSCs 유도하는 경우에는, 포르스콜린의 농도가 0일 내지 12일 동안에 50 μM으로 상승하였다.
플라스미드 구축 및 렌티바이러스 생성
pLL3.7-ΔU6 벡터는 문헌 [McQualter, et al., Stem Cells, 27:623-633 (2009)]에 기재되었다. 마우스 Sall4는 RT-PCR에 의해 ESCs (TT2)로부터 증폭시켰고, pEASY-Blunt 벡터 [트랜스젠 바이오텍(TransGen Biotech)] 내로 클로닝하였으며, 서열 분석함으로써 확증한 다음, 이를 pLL3.7-ΔU6의 XhoI/EcoRI 부위 내로 도입하였다. 그 프라이머가 표 2에 열거되어 있다.
<표 2>
PCR 반응을 위한 프라이머 세트
Figure 112016012045115-pct00008

기타 개개의 재프로그래밍 인자 (Oct4 , Sox2 , Klf4 또는 c- Myc)를 함유하는 렌티바이러스성 벡터가 문헌 [Zhao, et al., Cell Stem Cell, 3:475-479 (2008)]에 기재되었다. tet-on Oct4 시스템에 대해서는, Fu-tet-hOct4 및 FU델타GW-rtTA가 문헌 [Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011); Maherali, et al., Cell Stem Cell, 3:340-345 (2008)]에 기재된 바와 동일하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 shRNAs (SIGMA MissionR shRNA)를 이용하여 유전적 녹다운을 수행하였다. 이러한 shRNA 서열이 표 3에 열거되어 있다. 렌티바이러스 생성, 수집 및 감염은 문헌 [Zhao, et al., Cell Stem Cell, 3:475-479 (2008)]에 기재된 바와 같다.
<표 3>
shRNA의 서열
Figure 112016012045115-pct00009

CiPSC 유도
초기 세포 (MEFs, MNFs, MAFs 또는 ADSCs)를 6-웰 판의 웰당 50,000개 세포의 밀도로 시딩하거나 또는 100 mm 디쉬당 300,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 그 다음날 (0일째), 본래의 배지를, 소분자 조합물을 함유하는 화학적 재프로그래밍 배지로 대체하였다. 이러한 소분자 조합물-함유 배지를 4일마다 변화시켰다. 12일째에, 이들 세포를 PBS에서 세척하고, 37℃ 하에 3 내지 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA (인비트로젠)로 분해시켰다. 중화시킨 후, 세포 덩어리를 철저하게 피펫팅함으로써 단일 세포로 해리시켰다. 세포를 채취하였고 (6-웰 판의 웰당 300,000 내지 1,000,000개 세포), 소분자 조합물을 함유하는 화학적 재프로그래밍 배지에서 6-웰 판의 웰당 300,000 내지 500,000개 세포의 밀도로 재도말하였다. DZNep를 16일 또는 20일째에 세포 배양물에 부가하였다. 28일 내지 36일째에, DZNep를 포함한 소분자 조합물을 제거하였다. 그러는 동안, 상기 화학적 재프로그래밍 배지를 2i-배지로 대체하였다. 8일 내지 12일이 더 지난 후, 2i-적격, ESC-유사하며 GFP-양성인 집락을 일차 CiPSC 집락으로서 계수하였다. OG 리포터를 이용하지 않고서도 야생형 세포로부터 CiPSC 유도하기 위하여, 2i-적격 ESC-유사 집락을 일차 CiPSC 집락으로서 계수하였다. 이들 CiPSC 집락을 확장 및 성상 확인을 위해 골라내었다. 또 다른 한편으론, 12일째에 재도말없이 CiPSCs를 유도할 수 있었다.
면역형광 , RT- PCR , 게놈 PCR , 기형종 형성 및 핵형 분석
면역형광, RT-PCR, 게놈 PCR 및 기형종 형성은 모두 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다. 면역형광의 경우, 1차 항체는 SSEA-1 (밀리포어, MAB4301), OCT4 [압캠(Abcam), ab18976], SOX2 (산타 크루즈, sc-17320), KLF4 (산타 크루즈, sc-20691), REX1 (산타 크루즈, sc-99000), NANOG (R&D, AF2729), UTF1 (압캠, ab24273), SALL4 (산타 크루즈, sc-166033)를 포함하였다. 2차 항체는 로다민-접합되었으며, 이는 당나귀 항 마우스 IgG (H+L) [잭슨 임뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 715-025-150], 당나귀 항 염소 IgG (H+L) (잭슨 임뮤노리서치, 705-025-147), 및 당나귀 항 토끼 IgG (H+L) (잭슨 임뮤노리서치, 711-025-152)를 포함한다. RT-PCR용 프라이머는 앞서 기재된 바와 동일하였다 (Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011)). 게놈 PCR용 프라이머는 표 2에 제시되어 있다. 핵형 분석은 문헌 [Longo, et al., Transgenic Res. 6:321-328 (1997)]에 보고된 바와 같이 수행하였다.
실시간 PCR
RNeasy 플러스 미니키트 (QIAGEN)를 이용하여, 배양된 세포의 전체 웰로부터 총 RNA를 단리하였다. 단일 집락의 경우에는, RNeasy 마이크로 키트 (QIAGEN)를 이용하여 RNA를 단리하였다. 트랜스크립트 제1 가닥 cDNA 합성 슈퍼믹스(SuperMix) (트랜스젠 바이오텍)를 이용하여 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 파워 SYBRR 그린 PCR 마스터 믹스 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)]를 이용하여 PCR을 수행하였고, 이를 ABI 프리즘(Prism) 7300 서열 검출 시스템 상에서 수행하였다. 델타-델타 Ct 방법을 이용하여 그 데이터를 분석하였다. 실시간 PCR에 사용된 프라이머는 표 2에 열거되어 있다.
키메라 구축
CiPS 세포를 날카로운 주사 바늘을 이용하여 배반포 내로 주사하거나 또는 XY 클론 레이저 시스템 [해밀톤 토른바이오사이언스(Hamilton ThorneBioscience)]을 이용하여 8-세포 배아 내로 주사함으로써 키메라 마우스를 수득하였다. 배반포 주사하는 경우에는, 10 내지 15개의 CiPS 세포를 3.5일째 [포스트코이툼(postcoitum) 일수]에 F2 (B6D2F1의 이종교배) 또는 CD-1 (알비노) 암컷 마우스의 수용자 배아 공동 내로 주사하였다. 2.5일째에 암컷 마우스로부터 숙주 8-세포 배아를 수집하였고, 7 내지 10개 CiPS 세포를 각 배아 내로 주사하였다. 주사 후, 배반포 및 8-세포 배아 (자궁의 각 난관 또는 호른 내의 6 내지 8개 배아)를 2.5일 또는 0.5일 거짓 임신 CD-1 암컷 내로 각각 옮겼다. 키메라 마우스를 코트 색상에 의해 확인한 다음, ICR 마우스와 짝짓기를 함으로써 생식세포계 전달에 관하여 평가하였다.
DNA 마이크로어레이 및 RNA- seq
마우스 섬유아세포, CiPSCs 및 ESCs로부터 총 mRNA를 단리하였다. 문헌 [Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011)]에 보고된 바와 같이 마이크로어레이를 수행하였다. 일루미나(Illumina) mRNA-seq 프렙 키트 (일루미나)를 이용하여 RNA 서열 분석용 라이브러리를 구축하였다. 일루미나 HiSeq 2000을 이용하여, 단편화되고 무작위로 프라이밍된 200 bp 쌍을 이룬-말단 라이브러리를 서열 분석하였다. 문헌 [Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011)]에 보고된 바와 같이 마이크로어레이 데이터의 계층적 클러스터링을 수행하였다. R [바이오컨덕터(Bioconductor)]을 이용하여 적외선 열지도를 생성시켰다.
비술파이트 게놈 서열 분석
비술파이트 처리함으로써 게놈 DNA를 변형시키고, 제조업자의 프로토콜에 따라서 메틸코드TM 비술파이트 전환 키트 (인비트로젠)를 이용하여 정제하였다. 그 프라이머는 표 2에 열거되어 있다. 증폭된 단편을 pEASY-blunt 벡터 (트랜스젠) 내로 클로닝하였다. 각 샘플로부터 무작위로 골라낸 10개의 클론을 서열 분석하였다.
cAMP , S- 아데노실메티오닌 (SAM) 및 S- 아데노실호모시스테인 ( SAH ) 정량화
제조업자의 프로토콜에 따라서 직접적인 cAMP ELISA 키트 (엔조)를 이용하여 cAMP를 정량화하였다. SAM 및 SAH 정량화를 위해서는, 배양된 세포 (1,000,000개 세포)를 트립신처리하고, 200 ㎕ PBS에서 초음파 처리함으로써 균질화시켰다. 이어서, 40 ㎕의 400 mg/ml TCA를 부가하였다. 세포 추출물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 원심분리시킨 후 (13,000 rpm, 15분), 0.22 ㎛ 필터를 통하여 상등액을 여과시키고, HILIC 칼럼 [워터스(Waters)]을 이용하여 고 성능 액체 크로마토그래피 [HPLC, 쉬마드주(Shimadzu)]함으로써 분석하였다.
비교 게놈 혼성화 ( CGH ) 분석
CGH 실험의 경우에는, 게놈 DNA를 추출하고, 참조물로서 C57BL/6 MEF DNA [젠 바이오디자인(Gene BioDesign)]를 이용하여 이매진(Imagenes)에 의해 님블젠(NimbleGen) 3x720K 마우스 전체 게놈 타일링 어레이와 혼성화하였다.
유동 세포계수 분석
배양된 세포를 트립신 처리하여 단일 세포로 만든 다음, 3% 태아 소 혈청을 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 내인성 Oct4-GFP를 사용하여, FACS칼리버(Calibur) 기기 [BD 바이오사이언스(BD Biosciences)]로 FACS 분석을 수행하였다. FCS 엑스프레스 4 (드 노보)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
크로마틴 면역침전 ( ChIP )
제조업자의 프로토콜에 따라서 EZ-마그나(Magna) ChIP A/G 키트 (밀리포어)를 이용하여 ChIP를 수행하였다. 항-H3K27me3 (압캠, ab6002), 항-H3K9me2 (밀리포어, 07-441), 항-H3K4me3 (압캠, ab8580) 및 항-H3K9ac (압캠, ab4441) 항체를 사용하였다. 면역침전 후, 실시간 PCR에 의해 DNA를 분석하였다. 사용된 프라이머가 표 2에 열거되어 있다.
서던 블롯
"DIG-표지된 프로브를 특정 블롯과 혼성화하기 위한 로슈(Roche) 기술"을 참조로 하여, DIG 하이 프라임 DNA 표지화 및 검출 스타터 키트 II (로슈, 11 585 614 910)를 이용하여 서던 블롯을 수행하였다. iPS 세포 또는 MEFs로부터 단리된 20 ㎍ 게놈 DNA를 EcoRI 및 XbaI로 분해하였다. pLL3.7-_U6 벡터 및 Fu-tet 벡터에 존재하는 프사이 서열에 근거하여 DNA 프로브를 설계하였으므로, 바이러스 감염 후에 외인성 트랜스유전자와 함께 상기 게놈 내로 통합될 수 있었다.
루시페라제 활성 검정
MEFs를 24-웰 판의 웰당 40,000개 세포의 밀도로 도말하였고, 제조업자의 지시에 따라서 리포펙타민(Lipofectamine) LTX & 플러스 시약 (인비트로젠)을 이용하여 Oct4 프로모터 리포터로 일시적으로 형질감염시켰다. pRL-TK 플라스미드 [프로메가(Promega)]를 각 웰에서 내부 참조물로서 공동 형질감염시켰고, 빈(empty) pLL3.7-_U6 벡터를 부가함으로써 모든 형질감염물에 대한 총 DNA 농도를 균등하게 하였다. 형질감염시킨지 48시간 후에, 세포를 PBS에서 세척하고 수동 용해 완충액(프로메가)에서 용해시켰다. 센트로(Centro) LB960 96-웰 발광계 [버솔드 테크놀러지(Berthold Technologies)]를 이용하여 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템 (프로메가)으로 루시페라제 활성을 측정하였고, 이를 레닐라(Renilla) 루시페라제 활성에 대해 표준화시켰다. 빈 발현 벡터 플라스미드를 음성 대조군으로서 사용하였다. 활성화 배수는 상기 빈 벡터 대조군과 비교해서 각 조건에 대한 반딧불이 대 레닐라 루시페라제 활성 비를 설명한다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 100 mm 디쉬에서 배양하고, PBS에서 세척한 다음, 용해 완충액에서 스크래핑하였다. 분취액을 8 내지 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상으로 부하하고, 니트로셀룰로스 막 상으로 블롯팅하였다. 막을 4℃에서 토끼 항-EZH2 (압캠, ab3748)와 함께 1:1000의 희석도 하에 밤새 인큐베이션하였다. 염소 항 토끼 IgG(H+L)/HRP (ZSBIO, ZB-2301)를 2차 항체로서 사용하였다. 슈퍼시그날 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 용액 [피어스(Pierce)]을 이용하여 검출을 수행하였다.
실시예 1: Oct4에 대한 화학적 대체물
Oct4의 화학적 대체물을 확인하기 위하여, OG 마우스로부터의 MEFs를 12-웰 판의 웰당 20,000개 세포의 밀도로 도말하고, Sox2 , Klf4 및 c- Myc를 코딩하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 감염시킨 후, 배지를 LIF-무함유 ESC 배양 배지로 대체시켰다. 소분자 라이브러리로부터의 개개의 화학물질을 각 웰에 가하였다. 상기 배지와 화학물질을 4일 마다 변화시켰다. 14일 내지 20일 동안 또는 GFP-양성 집락이 나타날 때까지 화학적 처리를 지속하였다. 추가의 확증과 최적화를 위하여 일차 표적물을 선별하였다.
Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 바이러스성 발현을 수반하는, Oct4 프로모터-구동된 그린 형광성 단백질 (GFP) 발현 (OG) 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs)를 이용하여, Oct4의 부재 하에 재프로그래밍을 가능하게 해주는 소분자를 조사하였다. 10,000개 이하의 소분자를 스크리닝한 후 (표 1C), 포르스콜린 (FSK), 2-메틸-5-히드록시트립타민 (2-Me-5HT), 및 D4476 (표 1D)을 Oct4에 대한 화학적 "대체물"로서 확인하였다 (도 1a 내지 1f).
계대된 SKM-FSK-iPSCs는 전형적인 ESC 형태학을 나타내고 GFP를 동질적으로 발현한다 (도 1b). 생식선 조직을 포함한 상기 SKM-FSK-iPSCs는 키메라 마우스에 기여할 수 있다. 유사하게, 2-Me-5HT 처리로 인해 SKM에 의해 유도된 iPSCs가 키메라 마우스에 기여할 수 있다.
이어서, 단일 유전자 Oct4를 이용하여 재프로그래밍할 수 있는 소분자 조합물 "VC6T" [VPA, CHIR99021 (CHIR), 616452, 트라닐시프로민] (문헌 [Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011)])를 이용하여, 트랜스유전자의 부재 하에 Oct4의 화학적 대체물 플러스 OG-MEFs를 처리하였다. 그 데이터는 VC6T 플러스 FSK (VC6TF)가 중간엽-대-상피 전이 마커인 E-카드헤린를 발현하는 일부 GFP-양성 집락을 유도시켰다는 것을 보여주는데, 이는 전사 인자에 의한 초기 재프로그래밍을 연상시킨다 (Li, et al., Cell Stem Cell, 7:51-63 (2010); Samavarchi-Tehrani, et al., Cell Stem Cell, 7:64-77 (2010)) (도 2). 그러나, Oct4 및 Nanog의 발현은 검출 가능하지 않았고, 그들의 프로모터는 여전히 과메틸화되었는데, 이는 억제된 후성적 상태를 제안하고 있다 (도 2a 및 2b).
실시예 2: 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자
후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자를 확인하기 위하여, 독시시클린 (DOX)-유도성 Oct4 발현 스크리닝 시스템을 사용하였다 (Li, et al., Cell Res. 21:196-204 (2011)).
OG 마우스로부터의 MEFs를 상기 언급된 바와 같이 도말하였고, Fu-tet- hOct4 및 FU델타GW-rtTA 렌티바이러스로 감염시켰다. 유도 프로토콜을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다.
감염시킨 후, 배양 배지를 VC6T (VPA, CHIR99021, 616452, 트라닐시프로민) 플러스 DOX (1 μg/ml)를 함유하는 LIF-무함유 ESC 배양 배지로 대체시켰다. 또 다른 한편으론, Tet-On POU5F1 마우스 계통 B6;129-Gt(ROSA)26Sor tm1(rtTA*M2)Jae Col1a1 tm2(tetO-Pou5f1)Jae /J로부터의 DOX-유도성 Oct4를 정착시킨 MEFs를 본 스크린에 사용하였다 (Li, et al., Cell Res., 21:196-204 (2011)). 이들 2가지 DOX-유도성 시스템을 본 스크린에서만 사용하였고, 완전한 화학적 재프로그래밍에서는 사용하지 않았다. 소분자 라이브러리로부터의 개개의 화학물질을 각 웰에 부가하였다. 소분자의 농도가 표 1D에 열거되어 있다. 소분자를 상이한 배양 시점에 부가하였다. 5-아자-C (5-아자시티딘) 및 DZNep는 8일째부터 부가하였다. 배지와 화학물질은 4일 마다 변화시켰고; DOX는 처음 4 내지 8일 동안에만 부가하였다. 16일 내지 24일 동안 또는 GFP-양성 집락이 나타날 때까지 화학적 처리를 지속하였다. 추가의 확증과 최적화를 위하여 일차 표적물을 선별하였다. 44일째에 CiPSC 집락을 계수하였다. 추가의 확증과 최적화를 위하여 일차 표적물을 선별하였다.
몇 가지 cAMP 효능제 (FSK, 프로스타글란딘 E2, 및 롤리프람) 및 후성적 조절제 [3-데아자네플라노신 A (DZNep), 5-아자시티딘, 소듐 부티레이트, 및 RG108]를 포함한 소분자 표적물을 본 스크린에서 확인하였다 (도 3 및 표 1D).
실시예 3: Oct-4 유도성 시스템을 사용하지 않는 완전한 화학적 재프로그래밍
Oct-4 유도성 시스템을 사용하지 않으면서 완전한 화학적 재프로그래밍을 달성하기 위하여, 트랜스유전자를 사용하지 않는 OG-MEFs의 화학적 재프로그래밍에서 소분자를 추가로 시험하였다. VC6TF로 처리한지 16일 후에 DZNep를 부가한 경우 (VC6TFZ)에는, 윤곽이 뚜렷한 가장자리를 수반하지 않는 치밀하고, 상피 모양의 GFP-양성 집락을 형성하는 VC6TF로 처리한 경우 보다 최대 65배 정도 더 빈번하게 GFP-양성 세포를 수득하였다 (도 4a-b 및 4e). 이들 세포에서는, 가장 다능성인 마커 유전자의 발현 수준이 상승되었지만, ESCs에서 보다는 여전히 낮았는데, 이는 불완전한 재프로그래밍 상태를 제안하고 있다 (도 4g 및 h). 처리한지 28일 후에 글리코겐 합성효소 키나제-3과 분열촉진물질-활성화 단백질 키나제 신호 전달의 이중 억제 (2i)를 수반하는 2i 배지로 전환시킨 후, 특정의 GFP-양성 집락이 ESC-유사 형태 (윤곽이 뚜렷한 가장자리를 수반하면서 균질하고, 위상 밝은 돔형)로 발달하였다 (도 4c) (Silva, et al., PLoS Biol ., 6:e253 (2008); Theunissen, et al., Curr. Biol ., 21:65-71 (2011)). 이들 집락은 ESC-유사 형태를 유지하면서, 30회 초과 계대 동안 추가로 배양할 수 있었다 (도 4a, 4d 및 4g). 이들은 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포 (CiPSCs)로서 2i-적격, ESC-유사한 GFP-양성 세포로서 지칭된다. 상기 언급된 바와 같은 CiPSCs의 형태에 관한 도식적 다이어그램이 도 4f에 도시되어 있다.
이어서, 소분자의 투여량과 처리 지속 기간을 최적화하면, 이로써 초기에 도말된 50,000개의 MEFs로부터 1 내지 20개의 CiPSC 집락이 생성되었다 (도 5a-k). 도 5a-f는 CiPSCs를 유도하는 데 있어서의 VPA, CHIR99021, 616452, 트라닐시프로민 및 포르스콜린의 잠재적 농도를 도시한 것이다. 이들은 또한, 재프로그래밍 효율이 상이한 농도의 소분자를 이용하는 실험과 상이할 수 있다는 것을 표시한다. 각 소분자에 대한 바람직한 농도가 도시되었다 (VPA, 0.5 mM; CHIR99021, 10 μM; 616452, 10 μM; 포르스콜린, 50 μM 및 DZNep 50 nM). 도 5g는 bFGF의 바람직한 농도 (100 ng/mL)를 도시한 것인데, 이는 또한, bFGF가 CiPSCs를 유도하는 데 필요하다는 것을 표시한다. 도 5h, i, j는 CiPSCs를 유도하는 데 사용되었던 소분자 및 bFGF의 바람직한 지속 기간을 도시한 것이다. 도 5k는 VC6TF를 함유하는 배지를 2i-배지로 변화시키는 데 바람직한 시점을 표시한다. 도 5a-f는 CiPSCs를 유도하는 데 있어서의 VPA, CHIR99021, 616452, 트라닐시프로민 및 포르스콜린의 잠재적 농도를 도시한 것이다. 이들은 또한, 재프로그래밍 효율이 상이한 농도의 소분자를 이용하는 실험과 상이할 수 있다는 것을 표시한다. 각 소분자에 대한 바람직한 농도가 도시되었다 (VPA, 0.5 mM; CHIR99021, 10 μM; 616452, 10 μM; 포르스콜린, 50 μM 및 DZNep 50 nM). 도 5g는 bFGF의 바람직한 농도 (100 ng/mL)를 도시한 것인데, 이는 또한, bFGF가 CiPSCs를 유도하는 데 필요하다는 것을 표시한다. 도 5h, i, j는 CiPSCs를 유도하는 데 사용되었던 소분자 및 bFGF의 바람직한 지속 기간을 도시한 것이다. 도 5k는 VC6TF를 함유하는 배지를 2i-배지로 변화시키는 데 바람직한 시점을 표시한다.
부가의 스크린 후, 화학적 재프로그래밍의 일부 소분자 부스터를 확인하였는데, 그 중에서도 합성 레티노산 수용체 리간드인 TTNPB가 화학적 재프로그래밍 효율을, 전사 인자 유도된 재프로그래밍 (0.2% 이하)과 거의 동등한 수준의 빈도가 되도록 최대 40배 정도 증강시켰다 (도 6a-c; 및 표 1D). MAFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MAF-CiPS-84)를 수반한 성체 키메라 마우스 (F)가 생성되었고, MAFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MAF-CiPS-85)를 수반한 블랙 F2 자손이 생성되었다. 게놈 PCR 분석은 CiPSCs가 트랜스유전자로 오염되지 않았다는 것을 보여준다 (도 6d 및 e).
소분자 조합물 VC6TFZ를 사용하여, MEFs로부터 수득된 것 보다 약 10배 정도 더 낮은 효율로써 마우스 신생아 섬유아세포 (MNFs), 마우스 성체 섬유아세포 (MAFs), 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs) (OG 카세트를 수반함)로부터 CiPSC 계열을 수득하였다.
<표 4>
CiPS 세포 성상 확인의 요약
Figure 112016012045115-pct00010

Figure 112016012045115-pct00011
Figure 112016012045115-pct00012

Figure 112016012045115-pct00013

Figure 112016012045115-pct00014

Figure 112016012045115-pct00015

Figure 112016012045115-pct00016

더욱이, CiPSCs는 OG 카세트를 수반한 MEFs로부터 달성된 것과 거의 동등한 효율로써, OS 카세트 또는 다른 유전적 변형을 수반하지 않는 야생형 MEFs로부터 유도되었다. 이러한 CiPSCs는 또한, 게놈 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 서던 블롯 분석에 의해 바이러스성 벡터가 없는 것으로 확증되었다 (도 7a-d).
추가로, 소분자 조합물을 사용하여, 신경 줄기 세포, 및 장 상피로부터 수득된 세포로부터 CiPSCs를 생성시켰다 (표 5).
<표 5>
신경 줄기 세포 , 및 장 상피로부터의 세포로부터 CiPSCs의 생성 ("ND"는 "아직 결정되지 않음"을 나타낸다)
Figure 112016012045115-pct00017

AM580은 4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산]이고; Ch55는 4-[(1E)-3-[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)페닐]-3-옥소-1-프로페닐]벤조산] 및 EPZ이다. 장 및 신경 줄기 세포는 MEF와 같이, 표시된 소분자를 부가하지 않고서도, 상이한 효율을 지님에도 불구하고 VC6TFZ를 이용하여 재프로그래밍할 수 있다.
이어서, 이들 소분자 중에서 CiPSCs를 유도하는 데 있어서 중요한 것을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 조합물로부터 개별적으로 철수하면, 상당히 감소된 GFP-양성 집락이 생성되고 CiPSCs는 전혀 생성되지 않는 4가지 필수 소분자 (다음에 제시됨)를 확인하였다 (도 8a-b).
Figure 112016012045115-pct00018

이들 소분자 (C6FZ)는 다음과 같다: 글리코겐 합성효소 키나제 3 억제제인 CHIR (C) (문헌 [Ying, et al., Nature, 453:519-523 (2008)]); 전환 성장 인자-베타 수용체 억제제 (문헌 [Maherali, et al., Curr . Biol ., 19:1718-1723 (2009)])인 616452 (문헌 [Zhang, et al., Cell Res. 21:196-204 (2011)]); cAMP 효능제인 FSK (F) (도 14f) (문헌 [Insel, et al., Cell. Mol . Neurobiol ., 23:305-314 (2003)]); 및 S-아데노실호모시스테인 (SAH) 가수분해효소 억제제인 DZNep (Z) (도 14a) (문헌 [Chiang, et al., Pharmacol ., Ther . 77:115-134 (1998)]; [Gordon, et al., Eur. J. Biochem., 270:3507-3517 (2003)]).
C6FZ는 비록 VC6TFZ에 의해 유도된 것 보다 10배 정도 더 낮은 효율을 나타내긴 하지만, MEFs와 MAFs 둘 다로부터 CiPSCs를 유도시킬 수 있었다 (표 4).
VC6TFZ에 의해 생성된 집락 수에 대한 아데닐레이트 시클라제의 억제 효과를 시험하였다. 2'5'ddAdo에 의한 아데닐레이트 시클라제의 억제는 VC6TFZ에 의해 형성된 집락의 수를 감소시켰다 (도 14f). 세포 재프로그래밍에 대한, FSK를 cAMP 유사체 (DBcAMP) 단독으로 교체시키거나 또는 cAMP 유사체를 포스포디에스테라제 억제제인 IBMX 또는 포스포디에스테라제 억제제인 롤리프람 및 IBMX와 조합하여 대체시킨 효과를 또한 시험하였다. DBcAMP와 IBMX 둘 다는 상기 조합 처리에서 50 μM으로 사용되었다. 그 데이터가 도 14g-j에 도시되어 있다. 롤리프람 (10 μM), IBMX (50 μM), DBcAMP (50 μM) 및 FSK (10 μM)로 처리한 후 MEF 중에서의 cAMP 농도의 세포내 수준을 대조군 (-) DMSO과 비교하였다 (도 14k). 포르스콜린은 cAMP 수준을 상당히 상승시키는데, 이는 다른 cAMP 효능제 (롤리프람 및 IBMX) 또는 유사체 (DBcAMP)와 유사하다. 포르스콜린을 대체하기 위해 사용되었던 다른 cAMP 효능제 또는 유사체를 이용하여 GFP+ 다능성 줄기 세포를 유도시켰다. cAMP 억제제인 2'5'ddAdo는 CiPSC 유도 효율을 저해하였다. 이들을 취합해 보면, 포르스콜린이 cAMP 신호 전달 경로를 조정함으로써 화학적 재프로그래밍을 촉진한다는 것을 제안하고 있다.
실시예 4: CiPSC 계열의 성상 확인
이어서, 상기 확립된 CiPSC 계열을 추가로 성상 확인하였다. 이들은 면역형광 및 역전사(RT)-PCR에 의해 검출된 바와 같이, ESCs (14.7시간)와 유사한 배가 시간 (14.1 내지 15.1시간)으로 성장하였고, 알칼리성 포스파타제 활성을 유지하였으며, 다능성 마커를 발현하였다 (도 9a-9d). 구체적으로 언급하면, 계대 21로부터의 CiPS-25, 계대 7로부터의 CiPS-26 및 계대 22로부터의 CiPS-30을 6회 계대 더 배양하였다. 계대 29로부터의 ESCs (R1)를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 3일 마다 계대하였고, 2i-배지 내에 배양보조 세포층을 수반하지 않는 12-웰 판 내에서의 웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 오차 막대는 s.d.를 표시한다 (n=3). 이들 세포의 계산된 집단 배가 시간은 14.8 ± 2.1시간 (CiPS-25), 15.1 ± 1.9시간 (CiPS-26), 및 14.1 ± 1.7시간 (CiPS-30)이었다. 이들 시간은 ESCs의 배가 시간과 등가였다 (14.7 ± 1.2시간).
유전자 발현 프로파일은 CiPSCs, ESCs, 및 OSKM-iPSCs (Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc에 의해 유도된 iPSCs)에서 유사하였다. CiPSCs 중에서 Oct4 및 Nanog 프로모터 하에서의 DNA 메틸화 상태와 히스톤 변형은 ESCs에서와 유사하였다. 또한, CiPSCs는 13회 계대까지는 정상적인 핵형과 유전적 완전성을 유지하였는데, 즉 CiPS 세포는 정상적인 염색체 수를 유지하고, 카피 수 변동 및 유전적 돌연변이가 거의 없으므로, 이들을 추가 임상에 적용하기에 안전하다.
그들의 분화 잠재력을 명확히 규명하기 위하여, CiPSCs를 면역결핍성 (SCID) 마우스 내로 주사하였다. 이 세포는 3가지 모든 배엽의 조직, 즉 호흡 상피 (내배엽); 근육 세포 (중배엽); 신경 상피 (내배엽) 및 색소 상피 (외배엽)로 분화될 수 있었다. 8-세포 배아 또는 배반포 내로 주사하는 경우, CiPSCs는 3가지 모든 배엽의 기관 (생식선 포함) 내로 통합될 수 있고, 후속 세대에 전달될 수 있다. 클론 ciPS-34 뿐만 아니라 F2 자손으로부터 성체 키메라 마우스가 생성되었다. 클론 CiPS-45의 생식세포계 기여가 고환에서 나타났다. MNFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MNF-CiPS-1)를 수반한 성체 키메라 마우스가 또한 생성되었다. MAFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MAF-CiPS-62)를 수반한 성체 키메라 마우스가 생성되었다. MAFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MAF-CiPS-62)를 수반한 블랙 F2 자손이 생성되었다. MAFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 MAF-CiPS-63)를 수반한 블랙 F2 자손이 생성되었다. (C57 × DBA) × ICR 배아 내로 미소주사된 WT MEFs로부터 유래된 CiPSCs (클론 CiPS-WT1, ICR)을 수반한 키메라가 생성되었다. c-Myc를 포함한 전사 인자에 의해 유도된 iPSCs로부터 발생된 키메라 마우스와는 달리 (문헌 [Nakagawa, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 107:14152-14157 (2010)]), CiPSCs로부터 발생된 키메라 마우스는 100% 생존하였고, 6개월까지 외견상 건강하였다 (도 10). 이러한 관찰 결과는 CiPSCs가 다능성이 되도록 완전히 재프로그래밍되었다는 것을 나타낸다 (표 4).
실시예 5: 소분자의 다능성 유도 특성
이들 소분자의 다능성-유도 특성을 보다 잘 이해하기 위하여, 화학적 재프로그래밍 동안의 포괄적인 유전자 발현을 프로파일링하였다. 화학적 재프로그래밍 동안의 유전자 발현 프로파일의 클러스터링을 결정하기 위하여, 12일, 20일 및 32일째에 화학적 재프로그래밍 동안 VC6TFZ (Z는 20일째부터 부가하였다)로 처리된 세포 배양 샘플을 분석하였다. MEFs (0일째), CiPSCs 및 ESCs를 대조군으로서 사용하였다. 특정의 주요 다능성 유전자의 순차적 활성화가 관찰되었는데, 이는 실시간 PCR 및 면역형광에 의해 검증되었다. MEFs (0일째)와 비교해서 ESCs에서 10배 초과하여 발현되고 샘플 (32일째)에서 3배 초과하여 발현되는 유전자는 Sall4 , Sox2, Lin28a , Dppa2 , Esrrb , Klf4 및 Pou5f1을 포함한다. MEFs (0일째) 및 ESCs와 비교해서 샘플 (32일째)에서 3배 초과하여 발현되는 유전자는 Sox 17, Gata6 및 Gata4를 포함한다. 2개의 다능성 관련 유전자, 즉 Sall4 및 Sox2의 발현 수준은 몇 가지 배외 내배엽 (XEN) 마커 Gata4 , Gata6 및 Sox17의 발현과 같이, VC6TF에 반응하여 초기 단계에서 가장 크게 유도되었다 (도 11a-j). Sall4의 발현은 소분자 처리 후 12시간 정도로 초기에 가장 크게 증강되었는데, 이는 Sall4가 화학적 재프로그래밍에서 다능성을 향한 첫 번째 단계에 관여할 수 있다는 것을 제안한다 (도 11d). 소분자를 사용된 처리로부터 철수시킨 실험과 관련해서, 그 데이터는 각각의 포르스콜린, CHIR99021 및 616452가 12일째 후 Sall4 및 Sox2의 내인성 발현 (도 11g 및 11h)과 다른 다능성 유전자의 후속 발현 (도 11i)을 활성화시키는 데 있어서 필수적이라는 사실을 보여준다. 이들 분자는 또한, XEN-유전자, 예컨대 Gata6, Gata4 및 Sox17을 활성화시키는 데 요구되었다.
유전자 과발현 및 녹다운 전략을 이용하여, 화학적 재프로그래밍에 있어서의 이들 유전자의 내인성 발현의 역할을 조사하였다. 그 데이터는 Sall4와 Sox2의 동시 과발현이 Oct4 프로모터-구동된 루시페라제 리포터를 활성화시킬 수 있었고 (도 12a-c), Oct4 발현을 유도시키고 iPSCs를 생성시키는 데 있어서 C6F를 대체하기에 충분하였다는 것을 (도 12d-e)을 보여준다. Sall4의 내인성 발현을 위해서는, 상기 XEN 유전자를 활성화시킬 필요가 있지만, Sox2의 경우에는 그렇지 않으며, 그 반대의 경우도 가능하다 (도 13a-d). 이는 마우스 XEN 형성에 있어서 기존에 보고된 바와 유사한, Sall4, Gata4, Gata6, 및 Sox17에 의해 형성된 양성 피드백 네트워크를 제안한다 (Lim, et al., Cell Stem Cell, 3:543-554 (2008)). Sall4 또는 이들 XEN 유전자의 녹다운으로 인해, Oct4 활성화와 다능성의 후속 확립에 손상을 입히는데 (도 13e-f), 이는 Gata4 및 Gata6이 다능성을 유도하는 데 기여할 수 있다는 기존의 발견 내용과 일치하지 않는다 (Shu, et al., Cell, 153:963-975 (2013)). 취합해 보면, 이들 발견으로 인해, 화학적 재프로그래밍의 초기 단계에서 작용하는 Sall4-매개된 분자 경로가 밝혀졌다 (도 13g). 이러한 단계는 양서류 사지 재생 동안 생체 내에서 Sall4-매개된 탈분화 과정과 유사하다 (Neff, at al., Dev. Dyn., 240:979-989 (2011)).
그 다음, 화학적 재프로그래밍의 후기 단계에 부가되었던 DZNep의 역할을 연구 조사하였다. 그 데이터는 Oct4 발현이 화학적 재프로그래밍에서 DZNep를 부가한 후에 상당히 증강되었고 (도 11a), DZNep가 Oct4의 발현을 자극하는 데 있어서는 중요하지만, 다른 다능성 유전자에 대해서는 그렇지 못하다는 것을 보여준다 (도 11k). SAH 가수분해효소 억제제로서, DZNep는 SAH 대 S-아데노실메티오닌 (SAM)의 농도 비를 상승시킴으로써, SAM-의존성 세포성 메틸화 과정을 억제할 수 있다 (도 14a). CiPSC 발생을 유도하기 위한 VC6TF 처리와 조합하여, SAH 가수분해효소 억제제 [(-) 네플라노신 A (Nep A), 아데노신 퍼아이오데이트 (산화됨) Adox 및 3-데아자아데노신 (DZA)] (문헌 [Chiang, et al., Pharmacol . Ther ., 77:115-134 (1998)], [Gordon, et al., Eur . J. Biochem . 270:3507-3517 (2003)])에 의해 DZNep를 대체시킨 것이 도 14b에 도시되어 있다. 그 데이터는 NEPA, ADOX 및 DZA가 각각, 재프로그래밍에서 DZNep를 대체하는 데 유용하다는 것을 보여준다. 이들은 DZNep와 동일한 표적을 조정하고, CiPSCs를 발생시키는 데 있어서 DZNep를 대체할 수 있다.
일관되게, DZNep는 Oct4 프로모터에서 DNA 메틸화와 H3K9 메틸화를 상당히 저하시켰는데 (도 11l), 이는 Oct4 활성화에 있어서의 그의 역할을 설명할 수 있다 (Feldman, et al., Nat. Cell Biol ., 8:188-194 (2006); Chen, at al., Nat. Genet., 45:34-42 (2013)). CiPSCs를 유도시키는 데 있어서의 DZNep의 기능은 Ezh2 발현을 하향 조절함으로써 대체시킬 수 없었다 (도 14c-e). 일차 배양물에서의 GFP+/ES-유사 집락은 다른 집락과 달리, 고 mRNA 수준의 Nanog와 저 수준의 Gata6을 발현하는데, 이는 ESCs 및 상기 확립된 CiPSCs와 유사하다 (데이터는 제시되지 않음). 이로써, 마스터 다능성 유전자로서의 Oct4 및 Sox2는 2i의 존재 하에, Nanog의 활성화 및 Gata6의 억제와 함께, 다른 다능성 관련 유전자를 활성화시키고 화학적 재프로그래밍 공정을 만족시킬 수 있다 (Silva, et al., PLoS Biol . 6:e253 (2008), Theunissen, et al., Curr . Biol ., 21:65-71 (2011). Boyer, et al., Cell, 122:947-956(2005); Chazaud, at al., Dev. Cell, 10:615-624 (2006)).
요약하면, 다능성을 결정하는 마스터 스위치로서의 Oct4 발현 (이는 체세포 내에서는 다중 후성적 변형에 의해 억제된 채로 있다)은 화학적 재프로그래밍에서 후성적 조절제 DZNep에 의해 드러나고, Sox2 및 Sall4의 C6F-유도된 발현에 의해 자극된다 (도 13g).
이러한 원리 증명 연구는 소분자 화합물만을 이용해서 다능성을 향한 신체 재프로그래밍을 조작할 수 있다는 것을 입증해준다 (도 15). 외성적으로 제공된 "마스터 유전자"에 의해서라기 보다는 오히려 소분자를 통하여 다능성에 대해 비특이적인 분자 경로를 조정함으로써 내인성 다능성 프로그램을 확립시킬 수 있는 것으로 확립되었다. 이들 발견으로 인해, 유전적 조작 및 제조하기 어려운 생물제제 대신, 특이적 화학물질 또는 약물을 이용하여 세포 운명 재프로그래밍에 의한 재생 의약에 있어서 목적하는 세포 유형을 기능적으로 생성시킬 수 있는 가능성이 열리게 되고, 세포 실체를 확립하는 것에 관한 본 발명자들의 이해가 증가된다.
SEQUENCE LISTING <110> Grandhope Biotech Co. Ltd Hongkui, Deng Zhao, Yang Hou, Pingping Li, Yanqin Zhang, Xu Liu, Chun Guan, Jingyang Li, Honggang <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR REPROGRAMING NON-PLURIPOTENT CELLS INTO PLURIPOTENT STEM CELLS <130> GHBCL 100 PCT <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sall4 (plasmid construction) <400> 1 actcgagcca ccatgtcgag gcgcaagcag gcgaa 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sall4 (plasmid construction) <400> 2 gcaattgtta gctgacagca atcttatttt cctcc 35 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sox2 (qRT-PCR) <400> 3 cgggaagcgt gtacttatcc tt 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sox2 (qRT-PCR) <400> 4 gcggagtgga aacttttgtc c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Klf4 (qRT-PCR) <400> 5 ttgcggtagt gcctggtcag tt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Klf4 (qRT-PCR) <400> 6 ctatgcaggc tgtggcaaaa cc 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Oct4 (qRT-PCR) <400> 7 cagggctttc atgtcctgg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Oct4 (qRT-PCR) <400> 8 agttggcgtg gagactttgc 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Gata4 (qRT-PCR) <400> 9 gagctggcct gcgatgtctg agtg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Gata4 (qRT-PCR) <400> 10 aaacggaagc ccaagaacct gaat 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Gata6 (qRT-PCR) <400> 11 tgaggtggtc gcttgtgtag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Gata6 (qRT-PCR) <400> 12 atggcgtaga aatgctgagg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sox17 (qRT-PCR) <400> 13 gtcaacgcct tccaagactt g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sox17 (qRT-PCR) <400> 14 gtaaaggtga aaggcgaggt g 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Esrrb (qRT-PCR) <400> 15 gtggctgagg gcatcaatg 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Esrrb (qRT-PCR) <400> 16 aaccgaatgt cgtccgaaga c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sall4 (qRT-PCR) <400> 17 tggcagacga gaagttcttt c 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sall4 (qRT-PCR) <400> 18 tccaacattt atccgagcac ag 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Lin28a (qRT-PCR) <400> 19 ccgcagttgt agcacctgtc t 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Lin28a (qRT-PCR) <400> 20 gaagaacatg cagaagcgaa ga 22 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Dppa2 (qRT-PCR) <400> 21 gcgtagcgta gtctgtgttt g 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Dppa2 (qRT-PCR) <400> 22 tcaacgagaa ccaatctgag ga 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Nanog (qRT-PCR) <400> 23 agttatggag cggagcagca t 21 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Nanog (qRT-PCR) <400> 24 aggcctggac cgctcagt 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Oct4 (genomic PCR) <400> 25 gaaggatgtg gtccgagt 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Oct4 (genomic PCR) <400> 26 gcagcgtatc cacatagcgt 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sox2 (genomic PCR) <400> 27 catgggttcg gtggtcaa 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sox2 (genomic PCR) <400> 28 gcagcgtatc cacatagcgt 20 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Klf4 (genomic PCR) <400> 29 accactgtga ctgggacg 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Klf4 (genomic PCR) <400> 30 gcagcgtatc cacatagcgt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for c-Myc (genomic PCR) <400> 31 tacatcctgt ccgtccaagc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for c-Myc (genomic PCR) <400> 32 gcagcgtatc cacatagcgt 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for hOct4 (genomic PCR) <400> 33 acctccatag aagacaccg 19 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for hOct4 (genomic PCR) <400> 34 tagccccact ccaacctg 18 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for hSox2 (genomic PCR) <400> 35 acctccatag aagacaccg 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for hSox2 (genomic PCR) <400> 36 ctccgacaaa agtttccact cg 22 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic foerward primer for hKlf4 (genomic PCR) <400> 37 acctccatag aagacaccg 19 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for hKLF4 (genomic PCR) <400> 38 gaagaggagg ctgacgct 18 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for hcMyc (genomic PCR) <400> 39 acctccatag aagacaccg 19 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for hcMyc (genomic PCR) <400> 40 gggtcgcaga tgaaactc 18 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Oct4 (bisulfite genomic sequencing) <400> 41 ggagtggttt tagaaataat tg 22 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Oct4 (bisulfite genomic sequencing) <400> 42 tccaacccta ctaacccatc acc 23 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Nanog (bisulfite genomic sequencing) <400> 43 gattttgtag gtgggattaa ttgtgaattt 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Nanog (bisulfite genomic sequencing) <400> 44 accaaaaaaa cccacactca tatcaatata 30 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Oct4 (chromatin immunoprecipitation) <400> 45 ctgtaaggac aggccgagag 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Oct4 (chromatin immunoprecipitation) <400> 46 caggaggcct tcattttcaa 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Nanog (chromatin immunoprecipitation) <400> 47 ctatcgcctt gagccgttg 19 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Nanog (chromatin immunoprecipitation) <400> 48 aactcagtgt ctagaaggaa agatca 26 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for Sox2 (chromatin immunoprecipitation) <400> 49 tttattcagt tcccagtcca a 21 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for Sox2 (chromatin immunoprecipitation) <400> 50 ttattcctat gtgtgagcaa ga 22 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic forward primer for OG (For OG (Oct4 promoter-driven GFP) cassette) <400> 51 aaccactacc tgagcaccc 19 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic reverse primer for OG (For OG (Oct4 promoter-driven GFP) cassette) <400> 52 acctctacaa atgtggtatg 20 <210> 53 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sall4 ShRNA 1 sequence <400> 53 ccggcagccc acctttgtca aagttctcga gaactttgac aaaggtgggc tgtttttg 58 <210> 54 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sall4 ShRNA 2 sequence <400> 54 ccgggcccac ctttgtcaaa gttgactcga gtcaactttg acaaaggtgg gctttttg 58 <210> 55 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gata4 ShRNA 1 sequence <400> 55 ccggagccca agaacctgaa taaatctcga gatttattca ggttcttggg cttttttg 58 <210> 56 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gata4 ShRNA 2 sequence <400> 56 ccggcatctc ctgtcactca gacatctcga gatgtctgag tgacaggaga tgtttttg 58 <210> 57 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gata6 ShRNA 1 sequence <400> 57 ccggccacta ccttatggcg tagaactcga gttctacgcc ataaggtagt ggtttttg 58 <210> 58 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gata6 ShRNA 2 sequence <400> 58 ccggcctcga ccacttgcta tgaaactcga gtttcatagc aagtggtcga ggtttttg 58 <210> 59 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sox17 ShRNA 1 sequence <400> 59 ccggcccaca atcactgtcc agtttctcga gaaactggac agtgattgtg ggtttttg 58 <210> 60 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sox17 ShRNA 2 sequence <400> 60 ccggcgcacg gaattcgaac agtatctcga gatactgttc gaattccgtg cgtttttg 58 <210> 61 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ezh2 ShRNA 1 sequence <400> 61 ccgggctagg ctaattggga ccaaactcga gtttggtccc aattagccta gctttttg 58 <210> 62 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ezh2 ShRNA 2 sequence <400> 62 ccggcggctc ctctaaccat gtttactcga gtaaacatgg ttagaggagc cgtttttg 58 <210> 63 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic control ShRNA sequence <400> 63 ccggcaacaa gatgaagagc accaactcga gttggtgctc ttcatcttgt tgtttttg 58

Claims (32)

  1. (1) 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제,
    (2) TGFβ 수용체 억제제,
    (3) 사이클릭 AMP (cAMP) 효능제, 및
    (4) S-아데노실호모시스테인 가수분해효소 (SAH) 억제제
    의 군 각각으로부터의 다능성의 화학적 유도인자 (CIPs)를, 비-다능성 진핵 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 것을 유도시키는 데 유효한 양으로 포함하는, 비-다능성 진핵 세포에서 다능성을 유도시키기 위한 세포 배양 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, GSK 억제제가 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴] (CHIR)이고; TGFβ 수용체 억제제가 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)이며; cAMP 효능제가 포르스콜린 (FSK)이고; SAH 억제제가 3-데아자네플라노신 A (DZNep)인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 히스톤 아세틸화를 증진시키는 작용제 또는 HDAC 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 발프로산 (VPA), 트라닐시프로민 또는 그의 조합물을 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 후기 재프로그래밍 촉진제가 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 롤리프람으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 5-아자시티딘, 소듐 부티레이트 및 RG108 [N-프탈릴-L-트립토판]로 이루어진 군으로부터 선택된 후성적 조절제를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로스타글란딘 E2 (PGE2), SF1670 [N-(9,10-디옥소-9,10-디히드로페난트렌-2-일)피발라미드], DY131 [N-(4-(디에틸아미노벤질리데닐)-N'-(4-히드록시벤조일)-히드라진], UNC0638 [2-시클로헥실-6-메톡시-N-[1-(1-메틸에틸)-4-피페리디닐]-7-[3-(1-피롤리디닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민], SRT1720 [N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드 히드로클로라이드], RG108, 2-Me-5HT (2-메틸-5-히드록시트립타민), IBMX [3,7-디히드로-1-메틸-3-(2-메틸프로필)-1H-푸린-2,6-디온앤드] 및 TTNPB [4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산]으로 이루어진 군으로부터 선택된, 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, D4476 (D4476 (CAS 301836-43-1)), Ch 55 ([4-[(1E)-3-[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)페닐]-3-옥소-1-프로페닐]벤조산]), AM580 ([4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산]), 및 EPZ004777 "1-(3-((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디히드록시테트라히드로푸란-2-일)메틸)(이소프로필)아미노)프로필)-3-(4-(tert-부틸)페닐)우레아" (EPZ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 성장 인자를 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 소분자량 화합물이, 분화된 세포가 다능성을 유도하도록 세포 배양 배지에 부가되는 상대적 양으로 존재하는 조성물.
  13. 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포를, 다능성을 유도시키기에 유효한 기간 동안 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항의 조성물과 함께 배양하는 것을 포함하는, 상기 부분적으로 또는 완전히 분화된 세포에서 다능성을 유도시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 분화된 세포가 다분화능 줄기 세포, 혈액 기원의 세포, 배아 기원의 세포, 피부 유래 세포, 섬유아세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 신경 세포, 및 결합 조직 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 유도시키고자 하는 세포가 섬유아세포, 지방 유래 세포, 신경 유래 세포 및 장 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 세포가 Oct4, KLF4, SOX2, C-Myc 또는 NANOG 중 어느 것을 발현하도록 형질감염되지 않은 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 유도시키고자 하는 세포가, 26일 내지 36일의 기간 동안 상기 CIPs를 포함하는 재프로그래밍 배지에서 배양되는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 세포 배양 배지가, 2i-배지를 사용하기 전의 모든 시간에 616452 및 포르스콜린을 포함하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 배지가 적어도 처음 12일 동안 CHIR99021을 포함하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 배지가 CHIR, 616452, FSK 및 DZNep의 조합물 (C6FZ)를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 배지가 VPA, CHIR, 616452, 트라닐시프로민 및 FSK의 조합물 (VC6TF) 또는 VPA, CHIR, 616452, 트라닐시프로민, FSK 및 DZNep의 조합물 (VC6TFZ)를 포함하는 방법.
  22. 제13항에 있어서, 배지가 28일째와 48일째 사이, 또는 40일째에 2i-배지로 변화되는 방법.
  23. 제13항에 있어서, DZNep를 12일째에서 40일째 사이에 부가하거나, 또는 다른 소분자의 초기 처리 후 20일까지 부가하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 세포를, VC6TF를 포함한 재프로그래밍 배지에서 약 16일 내지 20일 동안 배양한 다음, 이러한 세포를 다능성 세포로 전환시키는 데 요구되는 나머지 시간 동안 VC6TFZ에서 배양하는 방법.
  25. 제13항에 있어서, 세포 배양 배지가, cAMP 효능제, 후성적 조절제 및 화학적 재프로그래밍 효율을 개선/증가시키는 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된, 후기 재프로그래밍을 촉진시키는 소분자를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제13항에 있어서, 처리한지 약 28일 후에, 세포를 ESC 배양 배지에서 약 4일 동안 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제 및 분열촉진물질-활성화 단백질 키나제 신호 전달 억제제와 함께 배양하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 배지가 재프로그래밍 효율을 증가시키는 소분자인 TTNPB를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제13항에 있어서, 형태학, 배가 시간, 3가지 배아 배엽의 조직으로 분화될 수 있는 세포의 능력, ESC 마커의 발현, 및 그의 조합에 근거하여 다능성 세포를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, ESC 마커가 알칼리성 포스파타제 (AP); nanog; Rex1; Sox2; Dax1; Sall4; 미분화된 배아 세포 전사 인자(Utf1); 발생 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4) 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  30. 제13항에 있어서, 다능성 세포를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항의 조성물로 비-다능성 진핵 세포를 배양하는 것을 포함하는, 다능성 세포의 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서, 배양된 세포를 주사, 보철 장치의 체내 이식, 또는 조직 공학 매트릭스에 의해 개개인에게 투여하기 위하여 제제화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
KR1020167003185A 2013-07-12 2014-07-10 비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 KR102210850B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310292339.9 2013-07-12
CN201310292339.9A CN104278008B (zh) 2013-07-12 2013-07-12 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途
PCT/CN2014/081961 WO2015003643A1 (en) 2013-07-12 2014-07-10 Compositions and methods for reprograming non- pluripotent cells into pluripotent stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160029115A KR20160029115A (ko) 2016-03-14
KR102210850B1 true KR102210850B1 (ko) 2021-02-01

Family

ID=52253355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167003185A KR102210850B1 (ko) 2013-07-12 2014-07-10 비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9982237B2 (ko)
EP (1) EP3019596B1 (ko)
JP (1) JP6538669B2 (ko)
KR (1) KR102210850B1 (ko)
CN (1) CN104278008B (ko)
AU (1) AU2014289747B9 (ko)
CA (1) CA2917065C (ko)
WO (1) WO2015003643A1 (ko)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104673741B (zh) * 2015-02-04 2017-11-14 广东省中医院 高效非整合性人类iPSC诱导平台
CN104762324B (zh) * 2015-03-06 2017-12-15 昆明学院 利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法
CN104726395B (zh) * 2015-03-20 2018-03-23 深圳市人民医院 一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法
CN105062963B (zh) * 2015-03-23 2018-05-25 云南济慈再生医学研究院有限公司 一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法
CN105169484A (zh) * 2015-03-23 2015-12-23 昆明学院 一种在体内形成骨组织的细胞移植培养方法
KR101816103B1 (ko) * 2015-04-13 2018-01-08 고려대학교 산학협력단 소분자 화합물을 이용한 인간 섬유아세포를 신경줄기세포로 직접 전환하는 방법
WO2016210292A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
CN105002134B (zh) * 2015-07-24 2018-08-17 北京大学 制备多潜能干细胞的组合物、方法、试剂盒及其用途
CN105087796A (zh) * 2015-08-17 2015-11-25 中南大学湘雅三医院 Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用
CN106554936B (zh) * 2015-09-30 2020-05-05 海门雨霖细胞科技有限责任公司 诱导人干细胞向肝细胞定向分化的新方法
JP2018537118A (ja) 2015-10-05 2018-12-20 オリジェン， インコーポレイテッド 肝機能不全の同定および緩和に基づくパーキンソン病の診断および処置
CN109072183B (zh) * 2015-10-21 2023-01-20 京都府公立大学法人 细胞的制备方法
CN108348556A (zh) * 2015-11-02 2018-07-31 欧瑞3恩公司 细胞周期阻滞提高产生诱导多能干细胞的效率
CN108934168B (zh) * 2015-11-30 2022-05-03 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 用于将非多能细胞重编程为多能干细胞的改进方法
CN106806894B (zh) * 2015-12-01 2021-06-25 海门雨霖细胞科技有限责任公司 小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞的方法
EP4049665A1 (en) 2016-03-15 2022-08-31 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
EP3246330A1 (en) 2016-05-18 2017-11-22 Istituto Europeo di Oncologia S.r.l. Imidazoles as histone demethylase inhibitors
WO2017206837A1 (zh) * 2016-06-03 2017-12-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的小分子化合物组合、重编程方法及应用
CN106362155A (zh) * 2016-10-08 2017-02-01 无锡汉强医药科技有限公司 Gsk3抑制剂在制备治疗尼曼匹克病c型疾病中的应用
CN108060122B (zh) * 2016-11-07 2021-07-09 深圳臻德济慈药品研发有限公司 小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备软骨细胞的方法
CN108070549A (zh) * 2016-11-07 2018-05-25 昆明学院 小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管内皮细胞的方法
CN113265375B (zh) * 2016-11-07 2022-05-13 云南济慈再生医学研究院有限公司 一种提高细胞活性的方法
CN108060119B (zh) * 2016-11-07 2021-07-09 云南济慈再生医学研究院有限公司 小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备血管平滑肌细胞的方法
CN108060120B (zh) * 2016-11-07 2022-11-04 云南济慈再生医学研究院有限公司 用于分化的细胞重编程的小分子化合物组合、试剂盒及应用
KR102049211B1 (ko) * 2016-12-02 2019-11-26 다카라 바이오 가부시키가이샤 내피세포의 제조 방법
CN106676136B (zh) * 2016-12-30 2019-11-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高猪体细胞核移植效率的方法
CN108300686B (zh) * 2017-01-13 2022-08-26 云南美颜美龄生物科技有限公司 用于预防、延缓或逆转细胞、组织、器官、机体衰老的小分子化合物/组合，产品及其用途
JP2020521430A (ja) * 2017-04-18 2020-07-27 キング ファイザル スペシャリスト ホスピタル アンド リサーチ センター 人工多能性幹細胞を線維芽細胞から生成するための方法
CN110832069B (zh) * 2017-05-31 2023-06-20 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 用于化学诱导的谱系重编程的方法
CN107142238B (zh) * 2017-06-29 2018-04-24 杭州观梓健康科技有限公司 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在细胞培养中的用途及细胞培养基
CN109486744A (zh) * 2017-09-11 2019-03-19 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种用于制备内胚层细胞系的培养体系以及制备内胚层细胞系的方法
CN110218696A (zh) * 2018-03-01 2019-09-10 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种用于化学诱导多能性干细胞生成的培养体系以及使用该培养体系的化学重编程方法
CN108277203B (zh) * 2018-04-08 2020-07-24 浙江大学 一种体外维持人造血干祖细胞干性的培养基及方法
CN110423719B (zh) * 2018-05-01 2024-02-27 云南济慈再生医学研究院有限公司 调控Jak-Stat通路使细胞分化、去分化、年轻化的技术及其应用
WO2020077357A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for increasing transposition frequency
CN112301052A (zh) * 2019-08-01 2021-02-02 浙江霍德生物工程有限公司 一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法
CN112481192B (zh) * 2019-09-12 2024-05-28 海门雨霖细胞科技有限责任公司 体内外化学诱导成纤维细胞直接重编程为肝细胞的化学小分子组合物及方法
WO2021067914A1 (en) * 2019-10-03 2021-04-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combination therapy for acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndromes and other blood diseases and disorders
CN112980789A (zh) * 2019-12-16 2021-06-18 广州辑因医疗科技有限公司 扩增造血干细胞的小分子化合物及其组合
CA3162030A1 (en) * 2019-12-16 2021-06-24 Riguo FANG Small molecule compounds for amplifying hematopoietic stem cells, and combination thereof
WO2022099498A1 (en) * 2020-11-11 2022-05-19 Guangzhou Institutes Of Biomedicine And Health, Chinese Academy Of Sciences Media and methods for establishing and maintaining early embryo-like cells
CN112538458A (zh) * 2020-11-26 2021-03-23 北京赛尔湃腾科技咨询合伙企业(有限合伙) 用于重编程细胞的方法
CN114958726A (zh) * 2021-02-23 2022-08-30 海门雨霖细胞科技有限责任公司 化学诱导成纤维细胞重编程为肺干细胞的化学小分子组合物及其应用
CA3213219A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Hongkui Deng Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells
CN113466468A (zh) * 2021-07-02 2021-10-01 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 Fh-缺陷型肾细胞癌的二联诊断标志物及其应用
WO2023173370A1 (en) * 2022-03-17 2023-09-21 Guangzhou Institutes Of Biomedicine And Health, Chinese Academy Of Sciences Media and methods for producing human cells and tissues from teratoma, organoids and embryoid bodies
CN115354026B (zh) * 2022-08-16 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途
WO2024078119A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Peking University Methods for chemical reprogramming and pluripotent stem cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102027105A (zh) * 2008-03-17 2011-04-20 斯克里普斯研究所 用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716404A (en) 1994-12-16 1998-02-10 Massachusetts Institute Of Technology Breast tissue engineering
US6123727A (en) 1995-05-01 2000-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Tissue engineered tendons and ligaments
WO2002014480A2 (en) 2000-08-16 2002-02-21 Duke University Decellularized tissue engineered constructs and tissues
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
DE602004022508D1 (de) 2003-01-16 2009-09-24 Gen Hospital Corp Verwendung von dreidimensionalen, mikrogefertigten, mittels gewebetechnologie hergestellten systemen für pharmakologische anwendungen
EP2913393B8 (en) 2004-11-17 2020-02-26 Seneca Biopharma, Inc. Transplantation of human neural cells for treatment of neurodegenerative conditions
AU2007212085B2 (en) 2006-02-07 2011-11-17 Spinalcyte, Llc Methods and compositions for repair of cartilage using an in vivo bioreactor
CN101684457B (zh) * 2009-07-27 2013-01-09 中国科学院广州生物医药与健康研究院 I型转化生长因子受体抑制剂在产生诱导多能干细胞中的应用及其方法
WO2011082038A2 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Fate Therapeutics, Inc. Improved reprogramming compositions
CN102242146B (zh) * 2010-05-10 2015-11-25 高丽大学校产学协力团 组合物和用其产生诱导全能干细胞的方法
CN102260646B (zh) * 2010-05-26 2015-09-16 北京瑞普晨创科技有限公司 一种制备诱导多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
US8637494B2 (en) 2010-06-14 2014-01-28 Baylor Research Institute Method of achieving normoglycemia in diabetics by administration of Withaferin A
WO2012087965A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Fate Therapauetics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of ipscs

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102027105A (zh) * 2008-03-17 2011-04-20 斯克里普斯研究所 用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3019596A1 (en) 2016-05-18
CN104278008B (zh) 2020-08-21
AU2014289747B2 (en) 2020-07-16
JP2016528888A (ja) 2016-09-23
JP6538669B2 (ja) 2019-07-03
US9982237B2 (en) 2018-05-29
CA2917065C (en) 2021-09-07
AU2014289747A1 (en) 2016-01-28
AU2014289747B9 (en) 2020-08-13
CN104278008A (zh) 2015-01-14
EP3019596A4 (en) 2017-02-22
KR20160029115A (ko) 2016-03-14
EP3019596B1 (en) 2023-07-05
WO2015003643A1 (en) 2015-01-15
US20160145581A1 (en) 2016-05-26
CA2917065A1 (en) 2015-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102210850B1 (ko) 비-다능성 세포를 다능성 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법
US20220025321A1 (en) Methods for reprograming non-pluripotent cells into pluripotent stem cells
JP6780870B2 (ja) 誘導された拡張された多能性幹細胞、作製方法および使用方法
US20170191038A1 (en) TGFß SIGNALING INDEPENDENT NAÏVE INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, METHODS OF MAKING AND USE
US12018278B2 (en) Methods for chemically induced lineage reprogramming
JP2021516066A (ja) 幹細胞のベータ細胞への分化を促進する方法
CN116981768A (zh) 将人类体细胞化学重编程为多能细胞
Zenobi CHARACTERIZATION OF MOLECULAR MECHANISMS DRIVING EPIGENETIC CONVERSION AND PHENOTYPE SWITCH OF FIBROBLASTS INTO INSULIN SECRETING CELLS
Šarić et al. Alternative Embryonic Stem Cell Sources
TERMOTE Influence of Small Molecules on Production of Embryonic Stem cellls and Induced pluripotent stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant