CN105062963B - 一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明基于外源导入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2到人皮肤成纤维细胞的方法，开发了一套促进成纤维细胞各阶段分化的培养系统，有效促进向成骨细胞的转化，属细胞生物学与组织工程领域。本系统包含三套培养液，分别作用转分化过程中的三个关键阶段：a,维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增值;b,调控RUNX2在特定时间内的表达；c,细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间。从而实现人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化。三套培养液之间相互配合，根据细胞最后的使用目的，分别作用时间可以灵活调控，能够培养较大规模的诱导性成骨细胞。用于骨代谢性疾病，骨折等的细胞治疗。本发明的药物组合也可用于组织工程骨的研发和生产。为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种作用于Runx2表达的人皮肤成纤维细胞重编程为成骨细胞的诱导培养方法，特别小分子化合物和激素联合作用的,是一套培养方法促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法。属于细胞生物学与组织工程领域。
背景技术
骨组织工程技术通过将各种生物活性因子整合到或者把具备特殊结构的三维支架用于接种种子细胞,诱导各种来源不同的种子细胞向成骨方向分化,形成组织工程复合骨,以替代传统的骨骼修复材料。种子细胞按照来源不同，主要有分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞等，也包括非成骨细胞如皮肤成纤维细胞转分化而来的类成骨细胞。其中来源于皮肤成纤维细胞的类成骨细胞，来源丰富，容易从患者获取和体外大量扩增培养，得到了广泛的研究。经典的方法是通过ips的方法，先将皮肤成纤维细胞去分化为多能干细胞，再诱导干细胞向成骨细胞分化；另一种方法是，通过在皮肤成纤维细胞中高表达特定的成骨转录因子，使细胞直接转分化为成骨细胞。这两种方法虽然分化途径不同，外源倒入的基因不同，但是在分化过程中，都需要一整套性状稳定，高效诱导，便宜且容易获取的分化培养液，以支持细胞的转分化过程和满足骨组织工程所需的大量细胞培养要求。
目前已有报道的成骨细胞转分化因子如BMP-2,BMP-7，LMP3单独或协同作用可以使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞。这几种基因表达产物为分泌性的蛋白质，其表达分泌调控复杂。由于它们能通过旁分泌作用于周围的非骨质组织引起异位骨形成，在转分化细胞中长期持续高表达可能导致对移植部位周围健康组织的副作用。而且，由于重组蛋白成本高，长时间性状不稳定，因此不利于大规模的细胞分化产。
2013年邓宏魁报道，通过筛选了10000种小分子化合物后，找到4种小分子，可以实现皮肤成纤维细胞的重编程，其中CHIR99021和Forskolin在重编程过程中发挥了重要的作用。由此提示一些特定的小分子或者小分子组合可以促进细胞的重编程。
2006年，ANDRE′SJ.GARCI′A报道，通过使用对成骨细胞起决定性作用的关键转录因子，如在骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2，在单独用于转分化时没有效果，在有激素信号分子地塞米松的协同作用下可使大鼠的皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞。由此提示，在基础的细胞培养液中，加入某些激素和小分子化合物，通过刺激和维持某类骨组织细胞特异转录因子的表达，可以促进皮肤成纤维细胞向成骨细胞的分化。
发明内容
本发明目的之一,在外源转入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2后,通过特定的三套培养液，三套培养液分别作用转分化过程中的三个关键阶段：a,维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖;b,调控RUNX2在特定时间内的表达；c,细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间。从而最终实现人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化。
本发明的另一目的是，通过对上述的三套培养液的相互配合作用，可以维持和控制人皮肤成纤维细胞在转分化过程各阶段中相对停留的时间，细胞不会自发地很快到达成骨方向终末期，这样可以实现细胞的进一步扩增和用于治疗的移植对于细胞质量的控制。
本发明的另一个目的是通过一套稳定的培养体系，大规模培养和生产诱导性成骨细胞。该培养体系可以促进骨形成并有助于治疗多种骨病，例如骨质疏松，骨折等骨代谢疾病。
为了完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，人皮肤成纤维细胞在外源转入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2后,通过特定的三套培养液进行培养,让三套培养液分别作用转分化三个关键阶段过程：
a、第一套培养液TraA：10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10ng/mL bFGF+10nM地塞米松，第一套培养液TraA用于维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖，得到表达Runx2的阳性细胞，以获得更多的诱导性成骨细胞；
b、第二套培养液TraB:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+9μM CHIR99021+10μM Forskolin+10nM地塞米松，第二套培养液TraB调控RUNX2在特定时间内的表达，维持稳定的RUNX2的表达和碱性磷酸酶的形成，促进人皮肤成纤维细胞向成骨前体细胞重编程；
c、第三套培养液TraC:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10mM β甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mM ascorbate-2-phosphate，第三套培养液TraC在细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间，提高人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化，20天以内能够看到诱导的细胞形成明显的矿化结节。
进一步地，所述三套培养液都能在4°C储存1个月。
进一步地，所述成骨细胞是由人皮肤成纤维细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，所述皮肤成纤维细胞不需要传统的诱导性多能干细胞四因子c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。
进一步地，三套培养液使用过程各自为：
分化第一阶段，第一套培养液TraA根据细胞生长状态，使用培养时间3-5天，不宜超过5天，培养液每隔一天换液；分化第二阶段，第二套培养液TraB需要连续使用至少10天，培养液每隔一天换液；
分化第三阶段，第三套培养液TraC每隔一天换液，之后进行茜素红染色鉴定；
茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
本申请基于以往的向皮肤成纤维细胞中导入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2的方法，开发了一套促进细胞各阶段分化的培养体系，实现了人的皮肤成纤维细胞向成骨细胞的转化。
本套培养方法有其独特优势：①诱导过程短，培养液诱导效果明显，性能稳定；②可控性，可以准确控制药物达到需要的浓度；③成本低，化学小分子一旦确定可以大规模生产。
附图说明
图1为人皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞的培养方法示意图。
图2中的a和b是使用传统的培养液体系，感染病毒48—72小时后，感染的阳性细胞大量死亡（绿色荧光表示RUNX2的阳性细胞）；c和d,是使用TraA培养液，感染病毒48—72小时后，细胞存活率明显增加绿色荧光表示RUNX2的阳性细胞）；其中
a图表示白光和绿色荧光的叠加，显示培养皿中的所有细胞（感染阳性细胞和阴性细胞）。b图表示单纯的绿色荧光下存活的阳性细胞。c图表示白光和绿色荧光的叠加，显示培养皿中的所有细胞（感染阳性细胞和阴性细胞）。d图表示单纯的绿色荧光下存活的阳性细胞。
图3显示使用三种不同的培养体系，对于维持RUNX2一定时间内的稳定表达效果不同。其中TraB能有效地维持RUNX2的表达水平稳定，常规的培养液随着时间的进行，RUNX2的表达日趋不明显并且不稳定。
图4，ａ,TraB培养下，第11天碱性磷酸酶（ＡＬＰ）的高表达，阳性细胞紫色染色；
ｂ，TraB培养下，ｑPCR鉴定，第11天碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和基因Runx2的表达。
图5，a,转分化为成骨细胞后形成的矿化结节（团块红色），该培养体系TraC培养10天后，可以看到出现大量的矿化结节。b,从一开始都是使用常规的分化液培养，红色矿化结节不明显。
具体实施方式
1，本套培养方法中包含三种培养液，分别是：
TraA：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10ng/mLbFGF+10nM地塞米松；
TraB:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+9μM的CHIR99021+10μMForskolin+10nM地塞米松；
TraC:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10mMβ甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mMascorbate-2-phosphate。
以上三种培养液，都可以4°C储存1个月。
（注：常规一培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)；常规二培养液是：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10nM地塞米松）
培养液使用方法概述如下：
分化第一阶段，TraA的使用，维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖。前期由于使用慢病毒RUNX2载体感染人皮肤成纤维细胞，高滴度的病毒保证了细胞感染效率的提高，但是也使得感染了病毒的细胞容易死亡或者细胞变大且停止增殖。这样不利于RUNX2阳性细胞实现向成骨方向的转分化。因此，感染病毒后，使用TraA培养液，有效保证细胞的存活和增殖。根据细胞生长状态，使用培养时间3——5天，不宜超过5天。该步骤对于单纯的人成纤维细胞转分化为成骨细胞不是必须的，但可以很大程度上提高阳性细胞的存活率，从而提高诱导性成骨细胞的产量。培养液每隔一天换液。
分化第二阶段，TraB的使用，调控RUNX2在特定时间内的表达。该步骤是皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞的关键步骤，需要调控RUNX2的表达时长，以促进细胞重编程的进行。另外，使用TraB，可以有效促进成骨细胞分化前期的标志性蛋白碱性磷酸酶（ALP）的高表达。根据细胞培养状态，需要连续使用TraB培养，至少10天；之后，也可以一直使用TraB继续培养，此时细胞向终末成骨细胞分化速度减慢，部分细胞停留在成骨前体细胞阶段的时间延长，有利于细胞的扩增移植等。培养液每隔一天换液。
分化第三阶段，TraC的使用,可以加快上一阶段的重编程皮肤成纤维细胞向成骨细胞的分化速度，得到相对成熟的诱导性成骨细胞，之后使用该培养液持续培养。该阶段的细胞可以用于细胞性能的鉴定和作为疾病研究的细胞模型。培养液每隔一天换液。
实施例1
一、得到慢病毒RUNX2感染的阳性人皮肤成纤维细胞后（病毒感染后两天），更换培养液
TraA,每隔一天全部换液。持续培养3天。TraA的配方为：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10ng/mLbFGF+10nM地塞米松；
二、TraB培养液，TraA培养液培养三天后，完全换液，更换TraB培养液。TraB的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+9μM的CHIR99021+10μMForskolin+10nM地塞米松;TraB持续培养10天，每隔一天完全换液。
三、TraC培养液,经过上一阶段10天培养后，完全换液，更换TraC培养液。TraC的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10mMβ甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mMascorbate-2-phosphate。培养5天后，进行染色鉴定。
四、茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
实验结论：可以看到明显的矿化结节形成。
实施例2
一、得到慢病毒RUNX2感染的阳性人皮肤成纤维细胞后（病毒感染后两天），更换培养液TraA,每隔一天全部换液。持续培养5天。TraA的配方为：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10ng/mLbFGF+10nM地塞米松；
二、TraB培养液，TraA培养液培养三天后，完全换液，更换TraB培养液。TraB的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+9μM的CHIR99021+10μMForskolin+10nM地塞米松;TraB持续培养18天，每隔一天完全换液。
三、TraC培养液,经过上一阶段10天培养后，完全换液，更换TraC培养液。TraC的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10mMβ甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mMascorbate-2-phosphate。培养3天后，进行染色鉴定。
四、茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
实验结论：可以看到明显的矿化结节形成。
实施例3
一、得到慢病毒RUNX2感染的阳性人皮肤成纤维细胞后（病毒感染后两天），更换培养液TraA,每隔一天全部换液。持续培养3天。TraA的配方为：10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10ng/mLbFGF+10nM地塞米松；
二、TraB培养液，TraA培养液培养三天后，完全换液，更换TraB培养液。TraB的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+9μM的CHIR99021+10μMForskolin+10nM地塞米松;TraB持续培养30天，每隔一天完全换液。之后进行染色鉴定。
三、茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
实验结论：可以看到明显的矿化结节形成。
实施例4
一、得到慢病毒RUNX2感染的阳性人皮肤成纤维细胞后（病毒感染后两天），更换培养液TraB,每隔一天全部换液。持续培养13天。TraB的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+9μM的CHIR99021+10μMForskolin+10nM地塞米松;TraB持续培养13天，每隔一天完全换液。
二、TraC培养液,经过上一阶段10天培养后，完全换液，更换TraC培养液。TraC的配方为:10％胎牛血清(Hyclone)+100U/mL青霉素(Sigma)+100μg/mL链霉素(Sigma)+高糖DMEM培养基(Gibco)+10mMβ甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mMascorbate-2-phosphate。培养10天后，进行染色鉴定。
三、茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
实验结论：可以看到明显的矿化结节形成。
Claims (4)
1.一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：人皮肤成纤维细胞在外源转入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2后,通过特定的三套培养液进行培养,让三套培养液分别作用转分化三个关键阶段过程：
a、第一套培养液TraA：10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10ng/mL bFGF+10nM地塞米松，第一套培养液TraA用于维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖，得到表达Runx2的阳性细胞，以获得更多的诱导性成骨细胞；
b、第二套培养液TraB:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+9μM CHIR99021+10μM Forskolin+10nM地塞米松，第二套培养液TraB调控RUNX2在特定时间内的表达，维持稳定的RUNX2的表达和碱性磷酸酶的形成，促进人皮肤成纤维细胞向成骨前体细胞重编程；
c、第三套培养液TraC:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10mM β甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mM ascorbate-2-phosphate，第三套培养液TraC在细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间，提高人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化，20天以内能够看到诱导的细胞形成明显的矿化结节。
2.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：所述三套培养液都能在4°C储存1个月。
3.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：所述成骨细胞是由人皮肤成纤维细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，所述皮肤成纤维细胞不需要传统的诱导性多能干细胞四因子c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。
4.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：三套培养液使用过程各自为：
分化第一阶段，第一套培养液TraA根据细胞生长状态，使用培养时间3-5天，不宜超过5天，培养液每隔一天换液；分化第二阶段，第二套培养液TraB需要连续使用至少10天，培养液每隔一天换液；
分化第三阶段，第三套培养液TraC每隔一天换液，之后进行茜素红染色鉴定；
茜素红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
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