CN106244527B - 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 - Google Patents

人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106244527B
CN106244527B CN201610755118.4A CN201610755118A CN106244527B CN 106244527 B CN106244527 B CN 106244527B CN 201610755118 A CN201610755118 A CN 201610755118A CN 106244527 B CN106244527 B CN 106244527B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture solution
kit
cell
stage
cardiac muscle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610755118.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106244527A (zh
Inventor
潘淳刚
池锦焕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by According To Guangdong Biological Technology Co Ltd filed Critical According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201610755118.4A priority Critical patent/CN106244527B/zh
Publication of CN106244527A publication Critical patent/CN106244527A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106244527B publication Critical patent/CN106244527B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法，利用本发明试剂盒所提供的培养液以及按照本发明方法可以使iPS干细胞高效地、定向地分化为心肌细胞。本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，多能干细胞向心肌细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的试剂盒和培养基适用于大规模生产高品质的心肌细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于心脏发育科学研究，心脏疾病的细胞治疗，心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求。

Description

人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法。
背景技术
随着中国人口日益老龄化，心血管疾病成为对健康构成极大威胁的一类疾病。在我国，心血管病死亡率列第二位，每年死于心血管疾病的约有300万人，尤其是冠心病导致的心肌梗死疾病会造成部分心肌缺血而坏死，导致病人引发心脏心律不齐，泵血不足，严重威胁国人健康和生活质量，目前只有用ES细胞(胚胎干细胞)分化来的心肌细胞进行贴片替换治疗才是可行的治疗方法。然而，ES细胞供体卵母细胞的来源困难，且细胞建系效率低，甚至存在免疫排斥反应，而且，ES细胞和治疗性克隆研究还存在伦理学争论，以致ES细胞无法大面积地被采用。同时患有各类心血管疾病危险因素的人群至少2.3亿人，我国心脑血管疾病用药市场总规模保持快速增长的势头，年均复合增长率超过25％并呈逐年上升的趋势。因此，相对应的在制药CRO市场就需要大量的心肌细胞来满足心肌药物的筛选。目前有许多通过ES细胞生成心肌细胞的方法大多是只在实验室里完成的，不能满足安全、均质、大规模化生产的需要。
因此，为了能满足未来CRO产业化大规模生产和细胞治疗的需求，开发出一种安全、可大规模生产的心肌细胞分化方法成为细胞再生领域亟待解决的一个现实问题。
iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相近，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同，其自我更新能力较强，且具有高度的分化能力。目前，iPS细胞可在体外被诱导生成所有210种构成人体的细胞，具有无限的疾病治疗前景。
理论上，iPS细胞培养出的组织或器官移植回原患者身体内时，可避开自身免疫系统的攻击难题，同时以往ES细胞所产生的道德伦理问题也可以取得根本解决。因此，iPS细胞成为了再生医学中备受瞩目的重要细胞来源。
除了再生医学之应用外，还可以利用患者自身细胞所形成的iPS细胞，将其进行特定细胞诱导分化后可以成为细胞的研究材料，解决以往人类组织细胞的提取难题。另外由于细胞来源于患者本身，其具有的“个别性”、“专一性”特性可以成为药剂或是药物毒理评估的最佳平台，也可成为转译医学的最佳测试材料。所以，iPS细胞的制作与发现也同样成为了医学、药学以及食品的重要安全实验平台。
虽然，目前有很多方法可以将iPS细胞定向分化为心肌细胞，但是心肌细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的培养基，本发明采用的技术方案为：
一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一培养液，所述第一培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述第一培养液还包括：
胰岛素4～11/ml；
2-磷酸抗坏血酸酯40～70mg/ml；
亚硒酸钠40～80ug/ml；
人类碱性成纤维细胞生长因子150～200ug/ml；
人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；
转铁蛋白30～60mg/ml；
NaHCO3 4～8wt％。
本发明人经过多次改进和尝试，终于发现本发明的第一培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续心肌细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述第一培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。其中，Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，TZV是四唑紫(tetrazolium violet)，第一培养液中含有的TZV或Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述第一培养液的pH值小于7。确保第一培养液颜色为红色，而不是紫色(碱性)。如果培养液为紫色，加入50～100μg/ml抗坏血酸或松动盖子后在37℃5％CO2培养箱中预热。在ips细胞培养分化过程中，酸碱度的变动过大会导致细胞死亡。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第二培养液，所述第二培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第二培养液还包括8～12μM的CHIR99021；其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。在分化初始阶段加入肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂CHIR99021可以激活Wnt/β-catenin信号通路提高心肌细胞的分化比率。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第三培养液，所述第三培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第三培养液还包括4～6ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；其中所述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。在培养液中加入约5ng/ml作用的bFGF(最终浓度)小分子化合物，可一定程度的增加转化后细胞的成活率和心肌细胞分化的效率。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第四培养液，所述第四培养液包括CDM培养液和已经使用过的第三培养液，进一步地，所述第四培养液还包括2～8μM的IWP2/4、1～3μM的IWR-1、或1～3μM的Wnt-C59；其中，所述述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁；其中，所述CDM培养液和已经使用过的第三培养液的体积比为0.5～2。优选地，所述第四培养液含有的是IWP2/4，其可以在一定程度上加速心肌细胞的分化。优选的，所述第四培养液含有的是IWR-1，IWR-1对分化后的细胞有一定毒性，虽然成活细胞较少，但在三周时，相比用IWP2/4，使用IWR-1的心肌细胞的纯度较高。在本发明中，“已经使用过的第三培养液”是指分化过程中将第三培养液用于培养细胞后收集起来的细胞培养液，该细胞液中含有细胞培养过程中一些细胞分泌的活性因子，使用一部分(约30～70vol％)该细胞液和新的CDM培养液构成的混合培养液有助于细胞存活率，从而促进心肌细胞的分化。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第五培养液，所述第五培养液为CDM培养液，或所述第五培养液包括基础培养基RPMI-1640以及2～4％的KOSR或2～4％的B27；其中所述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。其中，B27是一种血清替代物，用于细胞生长，尤其适用于大鼠海马和皮质神经元的长期培养。KOSR也是一种血清替代物。
本发明的另一个目的在于提供一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
第一阶段：用所述的试剂盒中的第一培养液传代培养即将用于定向分化的多能干细胞；
第二阶段：用所述的试剂盒中的第二培养液替换第一阶段所用的第一培养液，培养12～36小时；
第三阶段：用所述的试剂盒中的第三培养液替换第二阶段所用的第二培养液，培养36～60小时；
第四阶段：用所述的试剂盒中的第四培养液替换第三阶段所用的第三培养液，培养36～60小时；
第五阶段：用所述的试剂盒中的第五培养液替换第四阶段所用的第四培养液。
在体外诱导iPS细胞分化为心肌细胞的过程中，如何定向分化心肌细胞，提高分化效率，是一个复杂综合的问题，其涉及到多种基因、蛋白及信号通路的调节。本发明人在长期实验过程中，发现采用本发明的方法进行定向分化时，心肌细胞的分化效率和稳定性均大幅提高。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述方法还包括第六阶段，所述第六阶段为每2～4天更换一次所述的试剂盒中的第五培养液。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法获得的心肌前体细胞系或心肌细胞系。
此外，本发明进一步提供了上述心肌细胞系在细胞替代治疗、心脏疾病治病机制研究以及药物筛选中的应用。
本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，利用本发明的试剂盒和方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的心肌细胞，且让干细胞向心肌细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的方法可以大规模生产高品质的心肌细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于心脏发育科学研究，心脏疾病的细胞治疗，心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求。
可诱导多能干细胞的诱导分化研究反映了多能干细胞对外源性因子和微环境的反应的多样性。由于定向分化涉及错综复杂的因子网络,细胞活动收到多种信号间相互作用的调控,这些外源性因子和微环境的相互作用仍需进一步研究。
附图说明
图1是本发明一个实施例中人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法的示意流程图。
图2是本发明采用本发明一个实施例的试剂和方法体外定向分化人源iPS干细胞为心肌细胞第二周所得的心肌细胞球荧光显影图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
本文使用的术语“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPS细胞，指的是通过被迫表达对保持胚胎干细胞的“干性(sternness)”重要的因子而重编程以进入胚胎干细胞样状态的成体细胞。通常，iPS细胞通过以下方式由非多能性细胞(如成人体细胞，或末端分化细胞)，例如纤维原细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等人工制备，即通过将所述非多能性细胞引入重编程因子，或使所述非多能性细胞与所述重编程因子接触。术语“诱导多能干细胞(iPSC)”不包括胚胎干细胞。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的iPSC获得特化细胞(例如心肌细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。在某些实施方案中，多能干细胞可暴露于本发明的培养基组合物和方法，以便促进多能干细胞分化为胎儿样心肌细胞。
本文使用的术语“心肌细胞(cardiomyocytes)”通常指的是任何心肌细胞谱系细胞，并且，除非另有说明，可适用于处于心肌细胞个体发育的任何阶段的细胞。例如，心肌细胞可同时包括心肌细胞前体细胞(不成熟的心肌细胞或胎儿心肌细胞)和成熟的心肌细胞(成体样心肌细胞)。进一步的心肌细胞可被细分成亚型包括，但不限于，窦房心肌细胞、心室心肌细胞、窦房结(SA)节点心肌细胞、外围SA节点心肌细胞或中央SA节点心肌细胞。
本文使用的术语“约”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。
本发明培养基的配置按照各组分的比例采用常规的方法配置即可。
本实施例的人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法包括以下阶段：
第一阶段：iPS细胞材料前期准备
取传代细胞(来自Codex Biosolution)，采用0.5m MEDTA进行洗脱。在EDTA洗脱后，加入含10μM Y-27632(或2μM TZV)的第一培养液，并利用试管的吸吐搅动使大多数细胞洗脱。
将洗脱后的高浓度的细胞(约为5x106个)，平铺在Geltrex(一种商业化的基底膜基质)预处理过的培养皿上，用含有10μM Y-27632(或2μMTZV)的第一培养液培养24小时。每天需更换新鲜的第一培养液，培养三天后，细胞浓度若超过85％，可进行后续的分化。
第二阶段：
在iPS细胞材料前期准备完成后的第一天，将第二培养液(含有10μMCHIR99021和2130μg/ml AA2P)提前预热，确保其颜色为红色，如果培养液为紫色，需加入50～100μg/ml抗坏血酸，或松动培养液瓶子盖子后，将培养液放置于37℃5％CO2培养箱中预热，待培养液颜色转为红色方可使用。用第二培养液替换第一8培养液，培养24小时。
第三阶段：
在换入第二培养液24小时之后，吸出第二培养液，加入第三培养液，培养48小时，可以得到中胚层前体细胞。
第四阶段：
吸出第三培养液，加入第四培养液，该第四培养液含有5μM的IWP2/4，培养48小时(在实际操作中，仅吸出一部分第三培养液，再补充进去新的CDM培养液以及5μM的IWP2/4也可以达到类似的效果)。
第五阶段：
吸出旧的含有IWP2/4的第四培养液，加入新的含有2％的B27的第五培养液。
第六阶段：
每三天换一次含B27的第五培养液。
虽然不同细胞株之间存在不同，分化后心肌细胞的收缩最早可出现在第八天，最晚可出现在第三周，但通常出现在分化培养的第二周。通过荧光显影能看到团状的心肌细胞球如图2所示。
其他实施例：
本发明的其他实施例仅涉及到权利要求范围内的各组分的含量变化，其配置方法和用于多能干细胞的定向分化的方法与实施例1基本相同。
例如，在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约4mg/L到约11mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约10mg/L的胰岛素，优选约4mg/L到约9mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约8mg/L的胰岛素，优选约6mg/L到约7mg/L的胰岛素，更优选约6mg/L的胰岛素。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约40～70mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯；优选约50～60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯，更优选约60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约40～80ug/ml亚硒酸钠；优选约50～70ug/ml亚硒酸钠，更优选约60mg/L的亚硒酸钠。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约150～200ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子；优选约160～180ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子，更优选约160ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约90～140ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1；优选约100～120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1，更优选约120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约30～60mg/ml的转铁蛋白；优选约40～60mg/ml的转铁蛋白，更优选约40mg/ml的转铁蛋白。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约4～8wt％的NaHCO3，优选约5～7wt％的NaHCO3，更优选约6wt％的NaHCO3。
在具体实施方案中，本发明的第一培养液可包含约1～3μM TZV，更优选为2μMTZV；可选地，本发明的第一培养液可包含约8～12μM Y-27632，更有选为10μM Y-27632.
在具体实施方案中，本发明的第二培养液可包含8～12μM的CHIR99021；优选约8～10μM的CHIR99021，更优选约10μM的CHIR99021。
在具体实施方案中，本发明的第三培养液可包含约4～6ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；更优选约5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
在具体实施方案中，本发明的第四培养液可包含约2～8μM的IWP2/4，优选为约3～6μM的IWP2/4，最优选为约5μM的IWP2/4；或本发明的第四培养液包含约1～3μM的IWR-1，更优选为约2μM的IWR-1；或本发明的第四培养液包含约1～3μM的Wnt-C59，更优选为约2μM的Wnt-C59。
在具体实施方案中，本发明的第四培养液可以包括体积百分比为约50％的
CDM培养液和约50％的旧的(即已经使用过的)第三培养液，在另一个具体实施方案中，本发明的第四培养液可以体积百分比为约60％的CDM培养液和约40％的旧的第三培养液。
在具体实施方案中，本发明的第四培养液可以包括体积百分比为约以2～4vol％的KOSR或2～4vol％的B27。
虽然上述实施例中各组分的含量有一定程度的变化，但大体上均可以实现心肌细胞的定向分化，心肌细胞分化的比例和纯度有一些差异。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (3)

1.一种用于将诱导多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一培养液，所述第一培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述第一培养液还包括：
胰岛素4～11μg/ml；
2-磷酸抗坏血酸酯40～70mg/ml；
亚硒酸钠40～80μg/ml；
人类碱性成纤维细胞生长因子150～200μg/ml；
人类转化生长因子TGFβ1 90～140μg/ml；
转铁蛋白30～60mg/ml；
NaHCO3 4～8wt％；
其中所述第一培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632；
其中所述第一培养液的pH值小于7；
所述试剂盒还包括第二培养液，所述第二培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第二培养液还包括8～12μM的CHIR99021；
其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12vol％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁；
所述试剂盒还包括第三培养液，所述第三培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第三培养液还包括4～6ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12vol％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁；
所述试剂盒还包括第四培养液，所述第四培养液包括CDM培养液和已经使用过的第三培养液，进一步地，所述第四培养液还包括2～8μM的IWP2/4、1～3μM的IWR-1、或1～3μM的Wnt-C59；
其中，所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12vol％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁；
其中，所述CDM培养液和已经使用过的第三培养液的体积比为0.5～2；
所述试剂盒还包括第五培养液，所述第五培养液为CDM培养液，或所述第五培养液包括基础培养基RPMI-1640，还包括2～4vol％的KOSR或2～4vol％的B27；
其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12vol％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。
2.一种用于将诱导多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
第一阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的第一培养液传代培养即将用于定向分化的诱导多能干细胞；
第二阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的第二培养液替换第一阶段所用的第一培养液，培养12～36小时；
第三阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的第三培养液替换第二阶段所用的第二培养液，培养36～60小时；
第四阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的第四培养液替换第三阶段所用的第三培养液，培养36～60小时；
第五阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的第五培养液替换第四阶段所用的第四培养液。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括第六阶段，所述第六阶段为每2～4天更换如权利要求1所述的试剂盒中的第五培养液。
CN201610755118.4A 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法 Active CN106244527B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610755118.4A CN106244527B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610755118.4A CN106244527B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106244527A CN106244527A (zh) 2016-12-21
CN106244527B true CN106244527B (zh) 2019-10-08

Family

ID=57597815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610755118.4A Active CN106244527B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106244527B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957815B (zh) * 2017-03-16 2021-05-07 杨涛 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方
CN106834213B (zh) * 2017-03-27 2021-03-02 广州润虹医药科技股份有限公司 一种诱导多能干细胞形成毛乳头细胞的诱导培养基及诱导方法
CN107177555B (zh) * 2017-04-24 2019-09-17 暨南大学 一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法
CN111117951A (zh) * 2018-10-30 2020-05-08 澳门大学 通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用
CN113249310B (zh) * 2021-05-17 2022-10-11 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
WO2012172328A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Cambridge Enterprise Limited Populations of smooth muscle cells of specific embryonic lineages
CN103068969A (zh) * 2010-06-17 2013-04-24 思迪公司 化学成分确定的无血清细胞培养基
CN103409368A (zh) * 2006-01-31 2013-11-27 第一三共株式会社 干细胞及胚胎来源的心肌细胞及推定的心肌细胞的纯化方法
CN105849253A (zh) * 2013-09-20 2016-08-10 修复股份有限公司 一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409368A (zh) * 2006-01-31 2013-11-27 第一三共株式会社 干细胞及胚胎来源的心肌细胞及推定的心肌细胞的纯化方法
CN101962630A (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 北京大学 诱导人胚胎干细胞或人诱导形成的多潜能干细胞向肝细胞分化的方法
CN103068969A (zh) * 2010-06-17 2013-04-24 思迪公司 化学成分确定的无血清细胞培养基
WO2012172328A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Cambridge Enterprise Limited Populations of smooth muscle cells of specific embryonic lineages
CN105849253A (zh) * 2013-09-20 2016-08-10 修复股份有限公司 一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106244527A (zh) 2016-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106244527B (zh) 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法
KR101639988B1 (ko) 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물
Marx A better brew
CN106479977B (zh) 人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法
Lippi et al. Human cell modeling for cardiovascular diseases
Li et al. In vitro organogenesis from pluripotent stem cells
KR20190112185A (ko) 3ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도
CN112662624A (zh) 一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
Hofbauer et al. In vitro models of the human heart
CN109988746A (zh) 一种间充质干细胞成脂诱导分化方法
Huang et al. Organoids as innovative models for bone and Joint diseases
Strobel et al. Methods for vascularization and perfusion of tissue organoids
Pong et al. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Sahara Recent advances in generation of in vitro cardiac organoids
CN110462023A (zh) 作为有效成分包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂和激活因子的干细胞活性促进用组合物
Karathanasis Regenerative medicine: transforming the drug discovery and development paradigm
KR102169782B1 (ko) 인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자의 생산량을 증가시키는 방법
CN115975907A (zh) 培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法
CN115354029B (zh) 神经类器官的制备方法和神经类器官
EP3406704B1 (en) Modification method for adhesion-state cell culture
Sudulaguntla et al. Stem cells: Cultivation and routes of administration
CN116656600A (zh) 一种由多功能干细胞构建心脏类器官的试剂盒及方法
Wang et al. Advances in Cardiac Organoids
CN105505875A (zh) 一种高效诱导干细胞定向分化的培养基和培养方法
CN104726400A (zh) 人多能干细胞向生殖细胞分化的无动物源组分培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant