CN105505875A - 一种高效诱导干细胞定向分化的培养基和培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效诱导干细胞定向分化的培养基和培养方法，使用分化培养基高效诱导干细胞定向分化为特定组织细胞；所述定向分化包括离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞，离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞，离体神经干细胞定向分化为神经细胞，和离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞；所述分化培养基中含有本发明提供的化合物(Ⅰ)。本发明提供的培养基和培养方法定向诱导分化效率高。

Description

一种高效诱导干细胞定向分化的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及干细胞的定向诱导分化，具体涉及一种高效诱导干细胞定向分化的培养基和培养方法。
背景技术
最近十年，在生物技术领域内，最具有爆发力和实际应用价值的当属干细胞。尤其是2007年诱导多能性干细胞的成功获得，使干细胞成为世界高新技术的新亮点，全球掀起了干细胞研究热潮，政府和商业公司纷纷投入巨资进行干细胞研究。由于干细胞具有自我更新和分化的潜能，所以为临床医学提供了一个发展新疗法的机会，为临床组织移植、细胞治疗和基因治疗提供大量的细胞源，对再生医学领域发展具有重要的作用。目前通过在体外诱导干细胞分化成特定细胞的机制研究以及促诱导分化的药物研究已经成为干细胞研究的热点，国内外有关这方面的研究和药物开发都取得重大的进展。
神经系统疾病严重地威胁着人类的身体健康，帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化病、脊髓损伤、脑外伤、中风等均是由于分化成熟的神经细胞不能分裂增殖以弥补损伤或死亡的细胞所造成的。这些疾病的病理表现无一例外都涉及到神经细胞的丢失。如果丢失的细胞得不到新生细胞的补充，就不存在治愈的可能性，故治疗这些疾病的唯一希望就是诱导多能性干细胞分化形成各种类型的神经细胞，然后进行细胞移植治疗，以替代那些丢失的细胞，并使功能得到恢复。1998年，科学家们成功建立了人的胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)系，使科学家们看到了用胚胎干细胞治疗人类疑难疾病的曙光。ES细胞是从附植前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制分化培养的一种稳定的全能性细胞系。近几年的研究表明，胚胎干细胞是理想的供体细胞来源，由胚胎干细胞诱导分化的神经细胞或其前体细胞移植越来越成为治疗神经系统疾病的热点。
骨髓间充质干细胞(BMSC)也称骨艘基质来源干细胞，又因为呈成纤维细胞样外观，所以也称为集落形成单位成纤维细胞，至今还没有相对统一的命名。但是大量有关BMSC分化及跨系分化分子调控机制的研究表明，BMSC是可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞、肝细胞、健细胞等的一种具有多向分化潜能干细胞。这一重大发现为BMSC干细胞修复与移植的临床应用提供了理论基础和关键技术平台。
神经干细胞(neuralstemcell，NSC)的研究是当今生命科学研究领域的热点之一，近20年来，NSC的分离、体外培养、诱导分化及应用移植均取得了较大进展。NSC具有的自我更新和多向分化的特性，对临床应用NSC移植治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病具有重要意义。NSC是从胚胎期或成年哺乳动物的脑和脊髓中分离培养出的干细胞，具有两个基本属性，即自我更新和多向分化潜能，它不仅能自我更新，维持自身稳定，终身存在于神经系统，并且能分化成神经组织的各种细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。NSC在胚胎时期的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位，如脑室、脑室下区、中脑导水管周围和脊髓等。成年后，哺乳动物的脑内仍然广泛存在着NSC，主要聚集于侧脑室壁的室下区和海马齿状回的颗粒下层。正常生理情况下，NSC处于休眠状态，但在神经系统损伤或退行性病变时，NSC被激活，发生增殖、迁移、分化，参与神经系统结构和功能的修复。
发明内容
本发明的目的在于一种高效诱导干细胞定向分化的培养基，以及利用该培养基高效诱导干细胞定向分化的培养方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种使用分化培养基高效诱导干细胞定向分化为特定组织细胞的方法，所述定向分化包括离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞，离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞，离体神经干细胞定向分化为神经细胞，和离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞；所述分化培养基中含有如下结构所述的化合物(Ⅰ)，
一种高效诱导离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，将上述的化合物(Ⅰ)、N2添加剂、B27添加剂、胎牛血清、非必需氨基酸和DMEM/F12培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述N2添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％；所述B27添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为0.8～1.2％；所述非必需氨基酸在分化培养基中的浓度为0.08～0.12mmol/L。
一种利用上述的分化培养基高效诱导离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法，将离体胚胎干细胞在上述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
一种高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，将上述的化合物(Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和L-DMEM培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％。
一种利用上述的分化培养基高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法，将离体骨髓间充质干细胞在上述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
一种高效诱导离体神经干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，将上述的化合物(Ⅰ)和DMEM/F12培养液混合，得到分化培养基，所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L。
一种利用上述的分化培养基高效诱导离体神经干细胞定向分化为神经细胞的方法，将离体神经干细胞在上述的分化培养基中培养7～10天，得到神经细胞。
一种高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的分化培养基，将上述的化合物(Ⅰ)碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和DMEM培养液混合，得到分化培养基，所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％。
一种利用上述的分化培养基高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，将离体骨髓间充质干细胞在上述的分化培养基中培养6～21天，得到成骨细胞。
本发明的优点：
本发明提供的高效诱导干细胞定向分化的培养基以及利用该培养基高效诱导干细胞定向分化的培养方法能够诱导干细胞体外定向分化成单一类型的细胞，包括：诱导离体胚胎干细胞定向分化为单一的神经细胞；诱导骨髓间充质干细胞定向分化为单一的神经细胞；诱导离体神经干细胞定向分化为单一的神经细胞；诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为单一的成骨细胞。本发明提供的培养基和培养方法定向诱导分化效率高。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例涉及的细胞培养温度均为37℃，培养中均采用5～10％的CO2。
实施例1：诱导离体胚胎干细胞(ES细胞)定向分化为神经细胞
一、ES细胞支持培养
ES细胞D3细胞株【ES-D3细胞(RL-1934)，中国科学院细胞库】在基础培养基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10％胎牛血清、白血病抑制因子，购自美国invitrogen公司，培养基目录号31600-034，非必需氨基酸目录号04-001-1，胎牛血清目录号16000-044，白血病抑制因子目录号GSH0520)中，按1×106个/ml的密度接种于饲养层细胞(小鼠成纤维细胞)上，3天进行传代培养，得到传代培养的ES-D3细胞。
二、诱导ES细胞定向分化为神经细胞的培养
1、ES细胞分化为拟胚体
将上述获得的传代培养的ES-D3细胞用胰酶消化，用培养基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子，购自美国invitrogen公司，培养基目录号同上)制成单细胞悬液，按约600个/30μL接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中37℃培养3天，得到ES细胞拟胚体的悬滴。
2、预分化
将前述得到的ES细胞拟胚体的悬滴转入盛有10mL培养基(同前，含高糖DMEM、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子，购自美国invitrogen公司，培养基目录号同上)的培养皿内，继续悬浮培养1天，第二天加入终浓度为10-7mol/L的化合物(Ⅰ)(自制，纯度大于98％)，共培养4天；得到预分化细胞。
3、诱导分化
将前述得到的预分化细胞转移到预铺了多聚鸟氨酸及层粘连蛋白的96孔板内，每孔分别加入100μL分化培养基，诱导共培养8天，得到神经细胞。
分化培养基按照如下方法制备：将化合物(Ⅰ)、N2添加剂(购自invitrogen，产品目录号17502048)、B27添加剂(购自invitrogen，产品目录号17504-044)、胎牛血清(购自invitrogen，产品目录号16000-044)、非必需氨基酸(购自invitrogen，产品目录号04-001-1)和DMEM/F12培养液(购自invitrogen，产品目录号12400-024)混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-7mol/L；所述N2添加剂在分化培养基中的质量百分含量为1％；所述B27添加剂在分化培养基中的质量百分含量为1％；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为1％；所述非必需氨基酸在分化培养基中的浓度为0.1mmol/L。
以等体积不添加化合物(Ⅰ)的培养基为阴性对照，得到阴性对照神经细胞。
以维A酸(苏州亚科化学试剂公司，目录号206-129-0，终浓度为50nmol/L)为阳性对照(即将分化培养基中的化合物(Ⅰ)进行替换)，得到阳性对照神经细胞。
三、检测
从前述诱导分化中共培养的第一天起，开始用倒置显微镜每天观察细胞。若能出现神经样细胞(细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上)，则以此作为定向分化成神经细胞的指标，计算分化出神经元样细胞的拟胚体占拟胚体总数的比例。
结果表明，化合物(Ⅰ)诱ES细胞定向分化为神经细胞作用非常明显，分化率高。分化培养基中添加10-7mol/L化合物(Ⅰ)，ES细胞诱导培养6天时，就有79％拟胚体出现神经样细胞，而阴性对照在诱导培养10天时，仍只有36％分化率，阳性对照在共孵育6天时，分化率为80％。
所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L均可；所述N2添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％均可；所述B27添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％均可；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为0.8～1.2％均可；所述非必需氨基酸在分化培养基中的浓度为0.08～0.12mmol/L均可。将离体胚胎干细胞在所述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
实施例2：诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)定向分化为神经细胞
一、BMSC的分离培养
取离体的大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)股骨、胫骨骨髓置于离心管中，微吸管反复吸吹骨髓，形成分散的单细胞悬液，加入配制的PERCOLL分离液，密度为1.073g/mL，离心2000r/min，20min后可见中间有一层约2mm厚的白色层，其成分主要为MSC，仔细用吸管吸取这一层，再用PBS离心后，按1×104个/mL细胞密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中培养，获得BMSC。
二、BMSC的诱导分化
将传至第3，5，7代的BMSC按照0.4×106/ml接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，培养液为DMEM/F12+1％N2+1％B27+1％胎牛血清(均购自美国invitrogen公司，DMEM/F12目录号：12400-024，N2目录号17502048，B27目录号17504-044，胎牛血清目录号16000-044)，培养5天细胞达到70％～80％融合时，弃培养液，加入含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL)和20％(体积百分含量)FCS(胎牛血清)的L-DMEM培养液(美国invitrogen公司，产品目录号：31600-034)预诱导培养24h后，更换培养液，PBS洗两次，再分别在分化培养基中对BMSC进行诱导分化培养，分化培养的时间为8天，得到神经细胞。
分化培养基按照如下方法制备：将化合物(Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和L-DMEM培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-7mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为10ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为20％。
以等体积不添加化合物(Ⅰ)的培养基为阴性对照，得到阴性对照神经细胞。
以维A酸(苏州亚科化学试剂公司，目录号206-129-0，终浓度为50nmol/L)为阳性对照(即将分化培养基中的化合物(Ⅰ)进行替换)，得到阳性对照神经细胞。
三、检测
从前述诱导分化中共培养的第一天起，开始用倒置显微镜每天观察细胞。若能出现神经样细胞(细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上)，则以此作为定向分化成神经细胞的指标，计算分化出神经元样细胞的拟胚体占拟胚体总数的比例。
结果表明，化合物(Ⅰ)诱BMSC细胞定向分化为神经细胞作用非常明显，分化率高。分化培养基中添加10-7mol/L化合物(Ⅰ)，BMSC细胞诱导培养6天时，就有80％拟胚体出现神经样细胞，而阴性对照在诱导培养10天时，仍只有38％分化率，阳性对照在共孵育6天时，分化率为80％。
所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L均可；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL均可；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％均可。将离体骨髓间充质干细胞在所述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
实施例3：诱导离体神经干细胞(NSC)定向分化为神经细胞
一、NSC的分离培养
取离体孕13天胎鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)大脑，在无菌条件下用机械法将其制备成单细胞悬液，加入含1％B27、bFGF(2ng/ml)和胰岛素(5ng/ml)的DMEM/F12培养液(美国invitrogen公司，产品目录号：12400-024)培养10天后，形成神经球，呈悬浮状生长，收集NSC集落。
二、NSC的诱导分化
将上述获得的NSC集落以800r/min离心5min后，收集细胞，计数后接种于预先用多聚赖氨酸处理过的6孔板内，分别加入分化培养基进行诱导分化培养，分化培养的时间为9天，得到神经细胞。
分化培养基按照如下方法制备：将所述的化合物(Ⅰ)和DMEM/F12培养液混合，得到分化培养基，所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-7mol/L/L。
以等体积不添加化合物(Ⅰ)的培养基为阴性对照，得到阴性对照神经细胞。
以维A酸(苏州亚科化学试剂公司，目录号206-129-0，终浓度为50nmol/L)为阳性对照(即将分化培养基中的化合物(Ⅰ)进行替换)，得到阳性对照神经细胞。
三、检测
从前述诱导分化中共培养的第一天起，开始用倒置显微镜每天观察细胞。若能出现神经样细胞(细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上)，则以此作为定向分化成神经细胞的指标，计算分化出神经元样细胞的拟胚体占拟胚体总数的比例。
结果表明，化合物(Ⅰ)诱BMSC细胞定向分化为神经细胞作用非常明显，分化率高。分化培养基中添加10-7mol/L化合物(Ⅰ)，BMSC细胞诱导培养7天时，就有80％拟胚体出现神经样细胞，而阴性对照在诱导培养10天时，仍只有35％分化率，阳性对照在共孵育8天时，分化率为80％。
所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L均可。将离体神经干细胞在所述的分化培养基中培养7～10天，得到神经细胞。
实施例4：诱导离体骨髓间充质干细胞(BMSC)定向分化为成骨细胞
一、BMSC的分离培养
取离体的大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)股骨、胫骨骨髓置于离心管中，微吸管反复吸吹骨髓，形成分散的单细胞悬液，加入配制的PERCOLL分离液，密度为1.073g/mL，离心2000r/min，20min后可见中间有一层约2mm厚的白色层，其成分主要为MSC，仔细用吸管吸取这一层，再用PBS离心后，按1×104个/mL细胞密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中培养，获得BMSC。
二、BMSC的诱导分化
将传至第3、5、7代的BMSC按照0.4×106/ml接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，培养液为DMEM/F12+1％N2+1％B27+1％胎牛血清(均购自美国invitrogen公司，DMEM/F12目录号：12400-024，N2目录号17502048，B27目录号17504-044，胎牛血清目录号16000-044)，培养5天细胞达到70％～80％融合时，弃培养液，加入含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL)和20％(体积百分含量)FCS(胎牛血清)的L-DMEM培养液(美国invitrogen公司，产品目录号：31600-034)预诱导培养24h后，更换培养液，PBS洗两次，再分别在分化培养基中对BMSC进行诱导分化培养，分化培养的时间为8天，得到成骨细胞。
分化培养基按照如下方法制备：将所述的化合物(Ⅰ)碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和DMEM培养液混合，得到分化培养基，所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-7mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为10ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为20％。
以等体积不添加化合物(Ⅰ)的培养基为阴性对照，得到阴性对照成骨细胞。
以经典诱导剂AsAP(L抗坏血酸磷酸，0.105mmol/L)、β-GP(β磷酸甘油，10mmol/L)和Dex(地塞米松，10mmol/L)为阳性对照(即将分化培养基中的化合物(Ⅰ)进行替换)，得到阳性对照成骨细胞。
三、检测
对不同诱导时间的细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定。碱性磷酸酶是骨髓间充质干细胞的早期成骨分化指标，可反映诱导剂的成骨分化活性。ALP是成熟成骨细胞标志酶之一，其主要作用为水解有机磷酸，使局部磷酸根浓度升高，结合钙，启动钙化。在钙化期，细胞逐渐出现变性，其分泌的胶原纤维亲和钙盐，形成钙化结节。
碱性磷酸酶活性测定：在各组细胞分别诱导至1、3、6、9、12天进行碱性磷酸酶活性测定。碱性磷酸酶活性和总蛋白含量测定使用试剂盒(美国Promega产品)，按说明书操作。
碱性磷酸酶比活性计算：比活性(U/mg)＝碱性磷酸酶活性(U/L)÷蛋白浓度(mg/L)
结果表明，化合物(Ⅰ)显著增加了细胞内碱性磷酸酶含量，且略高于阳性对照组：12天时，阴性对照组碱性磷酸酶比活性为0.08，化合物(Ⅰ)组碱性磷酸酶比活性为1.15，阳性对照组碱性磷酸酶比活性为0.99。
所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L均可；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL均可；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％均可。将离体骨髓间充质干细胞在所述的分化培养基中培养6～21天，得到成骨细胞。
实施例5：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：(a)将灯心草的干燥茎髓(10kg)粉碎，用70％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用80％乙醇洗脱10个柱体积，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩得80％乙醇洗脱物浸膏(161g)；(c)步骤(b)中80％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(52g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和8:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(190mg)。
结构确证：白色固体；HRAPCIMS给出的准分子离子峰m/z233.1487[M+H]+，表明化合物分子式为C15H20O2，不饱和度为6。1H-NMR谱(CDCl3，600MHz)中，H-3(5.82，brs)，H-5(2.74，br，d，J＝12.8Hz)，H-6a(1.38，ddd，J＝13.5，12.8，4.5Hz)，H-6b(1.98，m)，H-7(2.11，tt，J＝13.0，4.5Hz)，H-8a(1.55，ddt，J＝13.5，13.0，3.6Hz)，H-8b(1.76，m)，H-9a(1.34，dt，J＝12.0，3.5Hz)，H-9b(2.04，dt，J＝12.0，4.1Hz)，H-12a(4.87，s)，H-12b(5.01，s)，H-13(1.81，s)，H-14(1.27，s)，H-15(1.92，br，s)；13C-NMR谱(CDCl3，150MHz)中，显示有15个碳信号，C-1(185.7，C)，C-2(184.1，C)，C-3(124.3，CH)，C-4(175.5，C)，C-5(42.9，CH)，C-6(32.6，CH2)，C-7(45.2，CH)，C-8(27.3，CH2)，C-9(34.7，CH2)，C-10(47.3，C)，C-11(148.8，C)，C-12(110.3，CH2)，C-13(21.2，CH3)，C-14(16.8，CH3)，C-15(22.5，CH3)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1715cm-1)与共轭羰基(1662cm-1)基团。1H-NMR谱显示一个烯烃质子信号δH5.82(1H，br，s，H-3)；两个甲基质子信号δH1.27(3H，s，H-14)与1.92(3H，br，s，H-15)；一组异丙烯质子信号基质子信号δH1.81(1H，s，H-13)、4.87(1H，s，H-12)和5.01(1H，s，H-12)；两个次甲基质子信号δH2.74(1H，br，d，J＝12.8Hz，H-5)，2.11(1H，tt，J＝13.0，4.5Hz，H-7)。13C-NMR谱结合DEPT谱表明该结构中有三个甲基碳信号，四个亚甲基碳信号(三个饱和碳和一个烯烃碳)，三个次甲基碳信号(两个饱和碳和一个烯烃碳)，五个季碳信号(两个羰基碳，一个饱和碳和两个烯烃碳)。通过HMBC谱分析可知，H2-12与C-7和C-13的相关性表明异丙烯基与C-7位相连。NOESY谱中，Me-14与H-8a存在相关性，同时，H-5与H-7之间也存在相关性，说明Me-14与H-8a的构型方向一致，H-5和H-7的构型方向一致，另外H-5与H-7偶合常数分别为J＝12.8Hz与J＝13.0Hz，因此确证H-5和H-7为α构型；同时NOESY谱中未有表明Me-14与H-5存在相关性，结合H-5与H-7的构型方向，可知Me-14为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下式所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致；
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (9)

1.一种使用分化培养基高效诱导干细胞定向分化为特定组织细胞的方法，其特征在于：所述定向分化包括离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞，离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞，离体神经干细胞定向分化为神经细胞，和离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞；所述分化培养基中含有如下结构所述的化合物(Ⅰ)，
2.一种高效诱导离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，其特征在于：将权利要求1所述的化合物(Ⅰ)、N2添加剂、B27添加剂、胎牛血清、非必需氨基酸和DMEM/F12培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述N2添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％；所述B27添加剂在分化培养基中的质量百分含量为0.8～1.2％；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为0.8～1.2％；所述非必需氨基酸在分化培养基中的浓度为0.08～0.12mmol/L。
3.一种利用权利要求2所述的分化培养基高效诱导离体胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法，其特征在于：将离体胚胎干细胞在权利要求2所述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
4.一种高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，其特征在于：将权利要求1所述的化合物(Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和L-DMEM培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％。
5.一种利用权利要求4所述的分化培养基高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法，其特征在于：将离体骨髓间充质干细胞在权利要求4所述的分化培养基中培养6～10天，得到神经细胞。
6.一种高效诱导离体神经干细胞定向分化为神经细胞的分化培养基，其特征在于：将权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和DMEM/F12培养液混合，得到分化培养基，所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L。
7.一种利用权利要求6所述的分化培养基高效诱导离体神经干细胞定向分化为神经细胞的方法，其特征在于：将离体神经干细胞在权利要求6所述的分化培养基中培养7～10天，得到神经细胞。
8.一种高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的分化培养基，其特征在于：将权利要求1所述的化合物(Ⅰ)碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清和DMEM培养液混合，得到分化培养基；所述化合物(Ⅰ)在分化培养基中的浓度为10-6mol/L～10-8mol/L；所述碱性成纤维细胞生长因子在分化培养基中的浓度为8～12ng/mL；所述胎牛血清在分化培养基中的体积百分含量为18～22％。
9.一种利用权利要求8所述的分化培养基高效诱导离体骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：将离体骨髓间充质干细胞在权利要求8所述的分化培养基中培养6～21天，得到成骨细胞。
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