CN106834223B - 诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括接种、悬滴培养以及加入分化培养基悬滴培养三个步骤，一方面利用了三维培养和控制细胞数量和密度的方式实现间充质干细胞的定性定量分化，可以在较短时间内获得品质受到管控的软骨细胞团，另一方面本发明采用了悬滴培养方式，无需贴壁，不需要使用血清，更不需要震荡培养或者额外的载体，可以大大降低细胞的损伤和污染。

Description

诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
技术领域
本发明属于细胞生物技术及骨组织工程技术领域，具体涉及一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，它是人体新生细胞从增殖、迁移、分化直至达到成熟这一系列过程中的第一个细胞。关于干细胞的研究已成为目前生物学上最具挑战性、也最具有吸引力的领域之一。
间充质干细胞(MSCs，mesenehymal stem cells)，最早在骨髓中被发现，是一种来源于中胚层的多能干细胞。作为一类具有自我更新能力的成体干细胞，间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控、可连续培养和自我更新等特点，现已受到越来越多的关注。间充质干细胞在体内或体外一定条件下可以向多种细胞组织类型分化。它不仅可以向多种间质来源的细胞谱系分化，例如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌键细胞等等，也可以向其他的细胞谱系分化，比如星形胶质细胞、肌原细胞、心肌细胞以及神经细胞等。由于体外分离培养的MSCs在细胞表型上没有明显的改变，也无功能缺失，因此被认为是理想的修复和抗衰老细胞来源。
目前已知间充质干细胞可從骨髓、脂肪组织、华顿氏胶质、脐带、软骨组织和齿龈分离出來，其中自脐带可以获得更多的干细胞，且脐带取得容易，无需侵入性的医疗程序。此外自脐带分离的干细胞，表面所携抗原少且具有抑制免疫反应的特性，对于克服异体排斥反应，有更显著的效果，因此极具推广应用的价值。
软骨为一种半透明的弹性组织，在人体內起到支持与保护的作用。由于软骨本身自我修复能力非常弱，一旦受到损坏，往往自行无法恢复，从而让软骨损伤成为骨科临床治疗上的难题之一。传统治疗是采用骨软骨柱移植的方法，然而可供移植的骨软骨来源有限，再者很难确保各个骨软骨柱愈合完整，还存在软骨脱落的风险。后来，科学家们发现间充质干细胞可诱导分化成软骨细胞，从而开发出取代传统的自体软骨细胞移植的干细胞治疗方法。
关于间充质干细胞在体外诱导分化成软骨细胞的过程，其中，关于种子细胞在三维空间形成团聚是一个关键因素；三维空间细胞团的大小和分布会影响细胞因子的分泌和传递致使体外软骨细胞分化缺乏良好的质量控管。
本领域亟待开发一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。
发明内容
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)接种：经分散成单个细胞的脐带来源的间充质干细胞悬浮于DMEM高糖培养基中形成细胞溶液，再将所述细胞溶液以250个/μL～2500个/μL的细胞浓度，滴在培养板上；步骤2)悬滴培养：将所述培养板倒置进行悬滴培养48h，获得成簇种子细胞团；步骤3)加入分化培养基进行悬滴培养：吸除所述培养板上的DMEM高糖培养基，加入软骨分化培养基，继续倒置所述培养板进行悬滴培养获得软骨细胞团。
优选的，步骤1)中，所述培养板为96孔板，将所述细胞溶液以100μL的体积滴在所述96孔板中。
优选的，所述步骤2)中悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度。
优选的，所述步骤3)中加入分化培养基后悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度；每2天更换分化培养基，培养总时长为15天。
优选的，步骤3)中所采用的软骨分化培养基为无血清的软骨分化培养基。
本发明提供了一种新的以三维培养的方式诱导脐带间充质干细胞分化成软骨细胞的方法，一方面利用了三维培养和控制细胞数量和密度的方式实现间充质干细胞的定性定量分化，可以在较短时间内获得品质受到管控的软骨细胞团，另一方面本发明采用了悬滴培养方式，无需贴壁，不需要使用血清，更不需要震荡培养或者额外的载体，可以大大降低细胞的损伤和污染。
附图说明
图1为实施例1的步骤2)获得的成簇种子细胞团的电镜图片；
图2为实施例1获得的软骨细胞团染色后的电镜图片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
在本发明的一个具体实施方案中，一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤1)接种：经分散成单个细胞的脐带来源的间充质干细胞悬浮于DMEM高糖培养基中形成细胞溶液，再将所述细胞溶液以250个/μL～2500个/μL的细胞浓度，滴在培养板上；步骤2)悬滴培养：将所述培养板倒置进行悬滴培养24h～48h，获得成簇种子细胞团；步骤3)加入分化培养基进行悬滴培养：吸除所述培养板上的DMEM高糖培养基，加入软骨分化培养基，继续倒置所述培养板进行悬滴培养获得软骨细胞团。
本发明提供了一种新的以三维培养的方式诱导脐带间充质干细胞分化成软骨细胞的方法，该方案接种特定细胞浓度和密度的脐带来源间充质干细胞，并且以悬滴方式培养，让细胞依重力自然团聚，形成三维细胞团(种子细胞团)，然后在分化培养基的环境下，继续维持悬滴培养直至软骨分化完成；本发明的方法一方面利用了三维培养和控制细胞数量和密度的方式实现间充质干细胞的定性定量分化，可以在较短时间内获得品质受到管控的软骨细胞团(不仅可以管控体外诱导软骨细胞分化的质量，还可以控制软骨细胞团的大小)，另一方面本发明采用了悬滴培养方式，无需贴壁，不需要使用血清，更不需要震荡培养或者额外的载体，可以大大降低细胞的损伤和污染。
关于术语“DMEM高糖培养基”，简称DMEM-HG培养基，是指含有高浓度葡萄糖的DMEM培养基，例如培养基中的葡萄糖浓度为4000mg/L～5000mg/L。
本发明的一个优选实施方案中，步骤1)中，所述培养板为96孔板，将所述细胞溶液以100μL的体积滴在所述96孔板中。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述步骤2)中悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述步骤3)中加入分化培养基后悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度；每2天更换分化培养基，培养总时长为15天。
在本发明的再一个优选实施方案中，步骤3)中所采用的软骨分化培养基为无血清的软骨分化培养基。
实施例1
实施例1的诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，步骤如下：
步骤1)接种：
利用胰酶将未分化的脐带间充质干细胞自贴壁培养的培养皿中消化下來，使其悬浮在DMEM-HG培养基(DMEM培养基中葡萄糖的含量为4500mg/L)中，获得细胞浓度为500个/μL的间充质干细胞的培养基溶液，再将该溶液以每滴100μL的量接种于平底的96孔细胞培养板，滴入1滴；
步骤2)悬滴培养：
倒置培养板于37℃，5％CO2，饱和湿度培养48h，获得成簇种子细胞团；在本实施例中，成簇种子细胞团的直径为700微米，如图1所示。
步骤3)加入分化培养基进行悬滴培养：
小心吸除培养板上的DMEM-HG培养基，加入100μL软骨分化培养基(MSC goChondrogeni c XFTM，购自BI公司，产品型号为05-220-1B)，继续倒置培养板于37℃，5％CO2，饱和湿度下进行悬滴培养，每2天更换培养基，培养14天后获得分化后的软骨细胞团。
软骨细胞分化的鉴定
鉴定原则：蛋白多糖是软骨细胞的表面标志，可以被阿利新蓝染成深蓝色。
鉴定操作：取实施例1的培养板，小心吸除分化培养基，避免吸走软骨细胞团(球状体)。用200μL DPBS润洗一次，加入200μL 70％酒精，室温静置30分钟固定。吸除酒精后，用200μL蒸馏水润洗两次。加入200μL 1％阿利新蓝的盐酸染色液，避光室温过夜染色。吸除染色液，再用200μL 0.1N盐酸洗涤3次，加入200μL蒸馏水，观察染色效果。
实施例1获得的软骨细胞团的染色结果如图2所示，可以确认：软骨细胞的分化完成。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种诱导脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤1)接种：经分散成单个细胞的脐带来源的间充质干细胞悬浮于DMEM高糖培养基中形成细胞溶液，再将所述细胞溶液以250个/μL～2500个/μL的细胞浓度，滴在培养板上；步骤1)中，所述培养板为96孔板，将所述细胞溶液以100μL的体积滴在所述96孔板中；
步骤2)悬滴培养：将所述培养板倒置进行悬滴培养24h～48h，获得成簇种子细胞团；
步骤3)加入分化培养基进行悬滴培养：吸除所述培养板上的DMEM高糖培养基，加入软骨分化培养基，继续倒置所述培养板进行悬滴培养获得软骨细胞团。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤2)中悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤3)中加入分化培养基后悬滴培养的条件为37℃，5％CO2以及饱和湿度；每2天更换分化培养基，培养总时长为15天。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于：
步骤3)中所采用的软骨分化培养基为无血清的软骨分化培养基。
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