CN106957814B - 一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于干细胞技术领域，具体涉及一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法。本发明所提供的羊膜间充质干细胞培养基包含碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷和香菇多糖，各组分之间合理配伍，可促进细胞的增殖，提高羊膜间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量，适用于羊膜间充质干细胞的二维或三维培养，满足研发需求。

Description

一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的 方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为胰岛、神经、血管内皮、骨、软骨、肌肉、肝脏、心肌等多种组织细胞。MSCs因其相对缺少免疫源性，培养技术简单，并可冷冻保存，因此已成为细胞及基因治疗研究的种子细胞，具有潜在的临床应用价值，已成为干细胞研究的热点。然而，现有间充质干细胞培养基的培养效果不理想，存在细胞的增殖速度慢、表达低和获得增殖的细胞数量有限等技术缺陷。因此，寻找一种可促进间充质干细胞生长的细胞培养基，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明公开了一种羊膜间充质干细胞培养基，用以解决间充质干细胞增殖速度慢、表达低、获得增殖的细胞数量有限等技术问题。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种羊膜间充质干细胞培养基，包含：碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷、香菇多糖、胎牛血清、双抗、表皮生长因子和基础培养基。
优选的，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～2ng/mL；
所述血小板衍生细胞生长因子的浓度为0.1～0.5ng/mL；
所述珠子参皂苷的浓度为0.5～2g/mL；
所述香菇多糖的浓度为0.05～0.2g/mL。
优选的，所述胎牛血清的体积百分比浓度为5vol％～10vol％；
所述双抗的浓度为1vol％；
所述表皮生长因子的浓度为0.5～2ng/mL。
优选的，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明还提供了一种上述羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，将胎牛血清、双抗、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷、香菇多糖和基础培养基混合，得到所述羊膜间充质干细胞培养基。
本发明还提供一种培养羊膜间充质干细胞的方法，将羊膜间充质干细胞接种于前述羊膜间充质干细胞培养基中进行培养。
优选的，所述培养的条件为37℃和体积浓度为5％的CO2。
优选的，所述接种的密度为5×104～8×104个/mL。
与现有细胞培养基相比，本发明所提供的羊膜间充质干细胞培养基包含碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷和香菇多糖，各组分之间合理配伍，可促进细胞的增殖，提高羊膜间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量，适用于羊膜间充质干细胞的二维或三维培养，满足研发需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例2中P6代羊膜间充质干细胞的光学显微镜照片；其中，图1-A为40×光学显微镜照片，图1-B为100×光学显微镜照片；
图2为实施例2中P6代羊膜间充质干细胞经成骨分化后的光学显微镜照片；其中，图2-A为40×光学显微镜照片，图2-B为100×光学显微镜照片；
图3为实施例2中P6代羊膜间充质干细胞经成脂分化后的光学显微镜照片；其中，图3-A为40×光学显微镜照片，图3-B为100×光学显微镜照片。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1羊膜间充质干细胞的原代分离
在无菌条件下，取产后弃置的新鲜羊膜，剥离羊膜，用PBS缓冲溶液冲洗，将羊膜组织剪成5×5cm2大小的组织碎片，加入3-5倍体积的0.25％胰酶，置于200r/min 37℃恒温摇床上，消化30min，期间每隔10min剧烈摇晃数次，以去除上皮细胞。
消化完成后，将其转移至储液瓶中，加入150mL PBS缓冲溶液，剧烈摇动，重复此操作2次。将羊膜组织转移至小烧杯中，剪碎至1mm3。再转移至储液瓶中，加入0.5％I型胶原酶20mL以及完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，使胶原酶终浓度为0.1-0.2％。置于37℃，250r/min的恒温摇床中，直到组织块基本融化。用PBS缓冲溶液稀释消化后的组织液，1500r/min，离心5min，弃掉上清，用PBS缓冲溶液重悬沉淀，采用100μm过滤筛网过滤，滤液1500r/min，离心5min，获得原代羊膜间充质干细胞。
实施例2
(1)往DMEM/F12培养基中添加下述各种组分，混匀，得到一种羊膜间充质干细胞培养基。其中，该培养基包含以下各组分：
胎牛血清：7.5％vol；
双抗：1％vol；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：1.25ng/mL；
表皮生长因子(EGF)：1.25ng/mL；
血小板衍生细胞生长因子(PDGF)：0.3ng/mL；
珠子参皂苷：1g/mL；
香菇多糖：1g/mL；
基础培养基：DMEM/F12培养基。
(2)采用步骤(1)的培养基重悬实施例1的原代羊膜间充质干细胞，然后按5×104～8×104个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于CO2培养箱中进行培养，培养至48h后换液，之后每2d换一次培养基。
待原代羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，加入0.25％的EDTA-Trypsin进行消化，然后进行传代培养，传至P6代，采用电子显微镜进行观察细胞的生长状态。图1为P6代羊膜间充质干细胞的光学显微镜照片，如图1所示，采用本发明培养基培养3d后的细胞已经形成较典型的羊膜间充质样，并有明显的贴壁现象。
待羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，离心，收集P6代羊膜间充质干细胞进行流式细胞仪检测。表1为检测结果，如表1结果所示，采用本发明培养基培养得到的P6代羊膜间充质干细胞的CD105、CD73、CD90和HLA-ABC的表达量高于90％，CD45、CD34和HLA-DR的表达量低于1％，显示羊膜间充质干细胞的属性。
表1流式细胞检测结果
标记抗体 阳性比率(％) 标记抗体 阳性比率(％)
CD34 0.01 CD105 99.75
CD90 99.96 HLA-ABC 99.91
CD45 0.07 HLA-DR 0.01
CD73 99.6 / /
(3)取步骤(2)中收集得到的P6代羊膜间充质干细胞进行体外诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞，染色，拍照。图2为P6代羊膜间充质干细胞的光学显微镜照片，如图2所示，P6代羊膜间充质干细胞经过诱导分化可成脂细胞和成骨细胞分化，说明由本发明干细胞培养基培养得到的羊膜间充质干细胞具有多向分化能力。
以上鉴定结果参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准，可证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。
实施例3
(1)往DMEM/F12培养基中添加下述各种组分，混匀，得到一种羊膜间充质干细胞培养基。其中，该培养基包含以下各组分：
胎牛血清：7.5％vol；
双抗：1％vol；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：1ng/mL；
表皮生长因子(EGF)：1ng/mL；
血小板衍生细胞生长因子(PDGF)：0.3ng/mL；
珠子参皂苷：1g/mL；
香菇多糖：1g/mL；
基础培养基：DMEM/F12培养基。
(2)将实施例2中的P6代羊膜间充质干细胞采用步骤(1)的培养基进行传代培养，按5×104个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，接种五皿，共接种5×106个，再置于CO2培养箱中进行培养，培养至48h后换液，之后每3d换一次培养基，培养96h后，用胰酶消化，用PBS缓冲溶液洗涤，离心，收集P7代羊膜间充质干细胞。
实施例4
(1)往DMEM/F12培养基中添加下述各种组分，混匀，得到一种羊膜间充质干细胞培养基。其中，该培养基包含以下各组分：
胎牛血清：5％vol；
双抗：1％vol；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：0.5ng/mL；
表皮生长因子(EGF)：0.5ng/mL；
血小板衍生细胞生长因子(PDGF)：0.1ng/mL；
珠子参皂苷：0.5g/mL；
香菇多糖：0.05g/mL；
基础培养基：DMEM/F12培养基。
(2)将实施例2中的P6代羊膜间充质干细胞采用步骤(1)的培养基进行传代培养，按5×104个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，接种5皿，共接种5×106个，再置于CO2培养箱中进行培养，培养至48h后换液，之后每3d换一次培养基，培养96h后，用胰酶消化，用PBS缓冲溶液洗涤，离心，收集P7代羊膜间充质干细胞。
实施例5
(1)往DMEM/F12培养基中添加下述各种组分，混匀，得到一种羊膜间充质干细胞培养基。其中，该培养基包含以下各组分：
胎牛血清：10％vol；
双抗：1％vol；
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：2ng/mL；
表皮生长因子(EGF)：2ng/mL；
血小板衍生细胞生长因子(PDGF)：0.5ng/mL；
珠子参皂苷：2g/mL；
香菇多糖：0.2g/mL；
基础培养基：DMEM/F12培养基。
(2)将实施例2中的P6代羊膜间充质干细胞采用步骤(1)的培养基进行传代培养，按5×104个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，接种5皿，共接种5×106个，再置于CO2培养箱中进行培养，培养至48h后换液，之后每3d换一次培养基，培养96h后，用胰酶消化，用PBS缓冲溶液洗涤，离心，收集P7代羊膜间充质干细胞。
对比例1
(1)往DMEM/F12培养基中添加下述各种组分，混匀，得到一种羊膜间充质干细胞培养基。其中，该培养基包含以下各组分：
胎牛血清：8％vol；
双抗：1％vol；
表皮生长因子(EGF)：1ng/mL；
基础培养基：DMEM/F12培养基。
(2)将实施例2中的P6代羊膜间充质干细胞采用步骤(1)的培养基进行传代培养，按5×104个/mL的细胞密度接种于15cm的培养皿中，接种5皿，共接种5×106个，再置于CO2培养箱中进行培养，培养至48h后换液，之后每3d换一次培养基，培养96h后，用胰酶消化，用PBS缓冲溶液洗涤，离心，收集P7代羊膜间充质干细胞。
实施例6
收集实施例3～5和对比例1的P7代羊膜间充质干细胞，分别进行流式细胞仪检测。表2为检测结果，如表2结果所示，采用本发明培养基传代培养得到的P7代羊膜间充质干细胞的CD105、CD73、CD90和HLA-ABC的表达量高于90％，CD45、CD34和HLA-DR低于1％，说明采用本发明培养基培养得到的P7代羊膜间充质干细胞继续保持间充质干细胞的特性。与对比例1的结果相比，实施例3～5的流式结果更优。
表2流式细胞检测结果
Figure BDA0001299439100000071
对实施例3～5和对比例1的P7代羊膜间充质干细胞进行细胞计数，计数结果如表3所示，说明本发明培养基可以促进细胞增殖，而且细胞纯度更高。
表3流式细胞检测结果
实施例3 实施例4 实施例5 对比例1
细胞数(个) 2.83×10<sup>7</sup> 2.75×10<sup>7</sup> 2.78×10<sup>7</sup> 1.1×10<sup>7</sup>

Claims (6)

1.一种羊膜间充质干细胞培养基，包含：碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷、香菇多糖、胎牛血清、双抗、表皮生长因子和基础培养基；所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～2ng/mL；
所述血小板衍生细胞生长因子的浓度为0.1～0.5ng/mL；
所述珠子参皂苷的浓度为0.5～2g/mL；
所述香菇多糖的浓度为0.05～0.2g/mL；所述胎牛血清的体积百分比浓度为5vol％～10vol％；
所述双抗的浓度为1vol％；
所述表皮生长因子的浓度为0.5～2ng/mL。
2.根据权利要求1所述的羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
3.一种权利要求1至2任意一项所述羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，将胎牛血清、双抗、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生细胞生长因子、珠子参皂苷、香菇多糖和基础培养基混合，得到所述羊膜间充质干细胞培养基。
4.一种培养羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，将羊膜间充质干细胞接种于权利要求1至2任意一项所述的羊膜间充质干细胞培养基中进行培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃和体积浓度为5％的CO2。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种的密度为5×104～8×104个/mL。
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