CN101525594B

CN101525594B - 一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN101525594B
Application number: CN2009100685101A
Authority: CN
Inventors: 韩忠朝; 郑翠玲; 杨少光; 卢士红; 韩之波
Original assignee: Tianjin Amcell Gene Engineering Co ltd; Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Tianjin Amcell Gene Engineering Co ltd; Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: CN101525594A

Abstract

本发明公开了一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法。该完全培养基包括细胞基础培养基和终浓度为1-100μl/ml胎牛血清、1-100ng/ml表皮生长因子、1-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。本发明的低血清浓度完全培养基成功达到了与使用高血清浓度培养试剂持平甚至更好的促进细胞增殖的作用。培养的细胞除具有间充质干细胞的典型生物学特性外，还能表达胚胎干细胞的全能标志物和具有在体外诱导条件下高表达神经细胞特异性标志物的能力，而且细胞间批次差异小，成本低，安全性好。与以往的培养方法相比，操作简单，污染概率小，细胞培养的成功率高。

Description

一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种培养基，更具体地说，涉及一种培养间充质干细胞的完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞已成为再生医学、组织工程、细胞治疗和移植、基因治疗领域的研究焦点。理想的干细胞治疗策略要求干细胞既具有全能的分化潜能又具有自我更新能力。目前研究的最多的是间充质干细胞，该细胞所具有的自我更新、多向分化、归巢到病变组织及免疫调节的特性，使其成为细胞治疗和组织工程中很有前景的种子细胞。2006年，国际细胞治疗协会明确提出了间充质干细胞的定义：(1)贴壁生长；(2)表达CD105、CD13和CD90，不表达CD45，CD34，CD117，和HLA-II类分子；(3)能在体外分化为脂肪、骨和软骨细胞。骨髓来源的间充质干细胞因其易获得性，可多向分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞成为间充质干细胞研究的主要对象。目前，除骨髓外，已从很多组织如脐带、脐血、脂肪、胎盘、羊膜、脂肪、骨膜、滑膜、滑膜液和多种胎儿组织(骨髓、肺、肝、胰腺、脑)分离得到间充质干细胞。因此，间充质干细胞的多种组织来源的特点使其成为细胞治疗、基因治疗以及骨或软骨组织工程的一个崭新而丰富的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。然而，刚分离出来的原代间充值细胞数量太少，难以满足临床治疗和研究方面的需求。因此，需要在体外对间充质干细胞进行大量培养，这就要求有良好的细胞培养试剂为细胞的生长和扩增提供适合的环境。

目前用于间充质干细胞的培养试剂主要有美国Stem Cell公司的Mesencult^TM培养试剂或在美国GIBCO公司的基础培养基(DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640等)基础上添加血清、胰岛素和(或)细胞因子得到完全培养基。不同组织来源的间充质干细胞所用的基础培养基可能会有不同。其中DMEM/F12作为DMEM和F12的混合培养基，结合了这两种培养基的优点，能够适合更多组织来源的间充质干细胞。关于血清的浓度，现有的间充值干细胞培养方法一般必须使用终浓度至少10％(体积比)的血清，才能保证细胞的正常生长传代。然而间充质干细胞在高浓度血清中培养时，随着传代次数的增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，血清成分不明确，既包含促进细胞生长、稳定解毒的物质；也包含低水平的抑制细胞生长的物质。血清还存在添加及补充过程中导致培养基pH值变化大，含有潜在的病毒或支原体污染、存储过程中易受其他微生物污染，低温贮存解冻后易产生沉淀，不同批次差异大，成本高，以及难以从细胞下游产品中去除等缺点。因此，在间充质干细胞培养试剂中尽量不用或少用血清成为培养领域需要解决的一个问题。虽然研究人员尝试了很多的无血清培养基，但是间充质干细胞在无血清培养条件下，增殖缓慢，随着传代次数的增加处于负增殖状态，并且存在向骨和软骨细胞分化的能力消失的问题。至今间充质干细胞的无血清培养基的研究也未获得重大突破。现有的技术一般通过额外添加细胞因子等成分来减低血清的使用量。有人发现表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)对间充质干细胞有较强的促增殖作用。

综上所述，亟需开发出一种新的适合于多种组织来源间充质干细胞生长的完全培养试剂，可以在尽量低的血清浓度同时又不会过多的增加别的成分的情况下促进细胞的生长。但是，迄今为止，尚未见新的间充质干细胞完全培养基方面的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种与以往的高血清浓度培养试剂相比可以显著增加所得间充质干细胞的一种低血清浓度的完全培养基；提供一种扩增培养间充质干细胞的可重复性方法，以满足有关领域的需要。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，包括细胞基础培养基、胎牛血清、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子；所述细胞基础培养基可以是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640和IMEM等中的任意一种或其任意组合，所述胎牛血清的终浓度为1-100μl/ml，所述表皮生长因子的终浓度为1-100ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-100ng/ml。

其中，所述细胞基础培养基优选为α-MEM，尤其优选为DMEM、最优选为DMEM/F12；所述胎牛血清的终浓度优选为1-50μl/ml，尤其优选为1-30μl/ml，最优选为20μl/ml；所述表皮生长因子的终浓度优选为1-80ng/ml，尤其优选为30-70ng/ml，最优选为50ng/ml；所述碱性成纤维细胞生长因子的优选终浓度为1-50ng/ml，尤其优选为1-30ng/ml，最优选为10ng/ml。

所述的基础培养基、胎牛血清、重组的人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子均为市售产品，均可从公司购买得到。

为实现这一目的，先配制大体积(如500ml)的完全培养基，然后体外扩增培养时往细胞中一次性加入所需体积(如20ml或8ml)的完全培养基。

用上述的低血清浓度完全培养基的培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1、间充质干细胞完全培养基的配制

(1)在超净工作台内向细胞基础培养基中加入碳酸氢钠、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，吹打混匀。

(2)4℃保存1-2个月。

2、间充质干细胞的分离

在本发明中，间充质干细胞来自骨髓、脐带和肺组织，而且是具有能够分化为脂肪组织、软骨组织或骨组织的未分化细胞。间充质干细胞可以从含有该细胞的骨髓、脐带和肺组织中采集。

(1)骨髓间充质干细胞的分离

将无菌抽取的胎儿股骨骨髓移入含DMEM/F12培养基的离心管中，500g离心5-8分钟左右，除去脂肪及上清。将沉淀的骨髓细胞用5-10ml磷酸盐缓冲液重悬，缓慢加入到等体积的Ficoll分离液上，900g离心15-18分钟。取界面云雾状细胞层加入完全培养基中，吹打成单细胞悬液，将细胞接种于25cm²培养瓶中。

(2)脐带充质干细胞的分离

用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎。加入1～1.5倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2～1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化40-70分钟，过滤。将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化20-30分钟，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开。在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15-18分钟，取界面云雾状细胞层加入DMEM/F12培养基，洗涤2-3次，加入完全培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种与75cm²培养瓶中。

(3)肺组织间充质干细胞的分离

用磷酸盐缓冲液漂洗去除肺组织表面残留血液，将组织剪碎。加入1～1.5倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2～1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化40-70分钟，过滤。将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化20-30分钟，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开。在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15-18分钟，取界面云雾状细胞层加入DMEM/F12培养基，洗涤2-3次，加入完全培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种与75cm²培养瓶中。

3、间充质干细胞的培养

将上述的细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养2-3天后弃去非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。当细胞达到70％-80％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程。将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml胎牛血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。

本发明的有益效果是：通过使用低浓度血清和极低浓度细胞因子的组合，成功培养了骨髓、脐带和肺组织来源的间充质干细胞，并达到了与使用高血清浓度培养试剂持平甚至更好的促进细胞增殖的作用。与现有的高血清浓度培养试剂相比，本发明的完全培养基使用低浓度血清和极低浓度细胞因子的组合就能达到与使用高血清浓度培养试剂持平甚至更好的促进细胞增殖的作用。因此，利用本发明的完全培养基培养的细胞，不同批次之间的差异小，成本低，利于分离细胞下游产品，安全性好，适合于用作基因工程相关产物的病毒宿主、表达载体等。本发明提供的间充质干细胞的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行；事先配制大体积的完全培养基，使加入的微量细胞因子的体积更准确，配制好的完全培养基可在4℃较长时间的保存备用；一次性加入细胞培养所需体积的完全培养基，大大降低了反复加液引起的污染概率，缩短了细胞操作时间，显著提高细胞培养的成功率；消化传代操作后的间充质干细胞贴壁更快，生长状况更良好。利用本发明的完全培养基体外扩增的间充质干细胞具有贴壁生长特性；阳性表达CD29、CD44、CD90、CD105等表面分子及阴性表达CD34、CD45、CD11b、CD31等表面分子；具有分化为脂肪组织、骨组织和软骨组织的能力；具有较低的免疫原性，不表达HLA II类分子，不引起同种异体的T淋巴细胞的增殖，从而极大地降低了同种异体移植时免疫排斥反应的风险，使其可以应用于同种异体移植。另外，培养的间充值干细胞还具有表达胚胎干细胞的全能标志物和体外诱导分化为神经细胞的特性。将间充质干细胞的多向分化潜能与其易于基因操作特点相结合而产生的细胞治疗和基因治疗的联合治疗，无疑将极大的增强其潜在的临床应用价值，同时也为间充质干细胞的研究提供了丰富的、新的实验材料。

附图说明

图1为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的形态特征：

(A)骨髓间充质干细胞的纺锤状形态和贴壁生长特性；

(B)脐带间充质干细胞的纺锤状形态和贴壁生长特性；

(C)肺组织来源间充质干细胞的纺锤状形态和贴壁生长特性；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞的纺锤状形态和贴壁生长特性。

图2为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的生长曲线。

图3为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的全能标志物的表达。

图4为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的脂肪细胞定向诱导的油红O染色：

(A)骨髓间充质干细胞的脂肪细胞定向诱导的油红O染色；

(B)脐带间充质干细胞的脂肪细胞定向诱导的油红O染色；

(C)肺组织来源间充质干细胞的脂肪细胞定向诱导的油红O染色；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞的脂肪细胞定向诱导的油红O染色。

图5为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的成骨细胞定向诱导的茜素红染色：

(A)骨髓间充质干细胞的成骨细胞定向诱导的茜素红染色；

(B)脐带间充质干细胞的成骨细胞定向诱导的茜素红染色；

(C)肺组织来源间充质干的成骨细胞定向诱导的茜素红染色；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞的成骨细胞定向诱导的茜素红染色。

图6为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的成软骨细胞定向诱导的阿尔新蓝染色：

(A)骨髓间充质干细胞的成软骨细胞定向诱导的阿尔新蓝染色；

(B)脐带间充质干细胞的成软骨细胞定向诱导的阿尔新蓝染色；

(C)肺组织来源间充质干的成软骨细胞定向诱导的阿尔新蓝染色；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞的成软骨细胞定向诱导的阿尔新蓝染色。

图7为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的神经元系特异性标志物MAP2的表达：

(A)骨髓间充质干细胞高表达MAP2；

(B)脐带间充质干细胞高表达MAP2；

(C)肺组织来源间充质高表达MAP2；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞不表达MAP2。

图8为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的神经祖细胞标志物Nestin的表达：

(A)骨髓间充质干细胞高表达Nestin；

(B)脐带间充质干细胞高表达Nestin；

(C)肺组织来源间充质干高表达Nestin；

(D)高血清浓度培养的间充质干细胞不表达Nestin。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

下述实施例如无特别说明所用方法均为常规方法，所有反应均在室温下进行，所有离心条件为500g，10分钟。

实施例中所使用的完全培养基组分包括细胞基础培养基、碳酸氢钠、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。

所述细胞基础培养基可以是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640和IMEM等中的任意一种或其任意组合。

500ml细胞完全培养基的配制：

(1)在超净工作台内向499.5ml DMEM/F12中加入1.22g的碳酸氢钠、0.5ml的胎牛血清、15g谷氨酰胺、50000U青霉素/链霉素、0.5μg的表皮生长因子和0.5μg的碱性成纤维细胞生长因子，吹打混匀，4℃保存1-2个月。

(2)在超净工作台内向490ml DMEM/F12中加入1.22g的碳酸氢钠、10ml的胎牛血清、15g谷氨酰胺、50000U青霉素/链霉素、25μg的表皮生长因子和5μg的碱性成纤维细胞生长因子，吹打混匀，4℃保存1-2个月。

(3)在超净工作台内向450ml DMEM/F12中加入1.22g的碳酸氢钠、50ml的胎牛血清、15g谷氨酰胺、50000U青霉素/链霉素、50μg的表皮生长因子和50μg的碱性成纤维细胞生长因子，吹打混匀，4℃保存1-2个月。

以下实施例中培养细胞所使用的完全培养基均是采用上述第二种配制方法配制而成。

实施例1：

(1)人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增

无菌抽取胎儿(3-4个月水囊引产胎儿，经产妇知情同意提供)股骨骨髓约1ml，移入含4ml DMEM/F12培养基(GIBCO公司产品)的无菌离心管中，离心去除脂肪及上清。向细胞团加入5ml左右的磷酸盐缓冲液重悬细胞，缓慢加到等体积的Ficoll上，900g离心15-18分钟。取界面云雾状细胞层加入完全培养基中，吹打成单细胞悬液，计数有核细胞，将细胞以10⁵/ml接种于25cm²培养瓶中。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养，2-3天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。当细胞达到70％-80％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1。重复上述操作进行传代培养过程。将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml胎牛血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。其P8纺锤状形态如图1A所示。

(2)人骨髓间充质干细胞的生长曲线

取对数生长期细胞，消化计数后，用生长培养基将细胞制成10⁴/ml的细胞悬液，于96孔板中每孔接种200μl，共接种8块板。每天随机取一块板加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃继续孵育4小时后，终止培养。小心洗净孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡10分钟，使甲臢充分溶解。570nm测定各孔吸光度值，以时间为横轴，吸光度值(A)为纵轴绘制生长曲线。如图2所示。

(3)人骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定

消化收集P8细胞计数后，细胞按1.0-1.2×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/mlNaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入FITC标记的CD90、HLA-I、HLA-II、CD45、CD34抗体和PE标记的CD29、CD44、CD73、CD105、CD13、CD117和CD166抗体，并设FITC和PE的同型对照各一管，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。人骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD29、CD44、CD105、CD13、CD166和HLA-I类抗原；不表达CD34、CD45、CD117、STRO-1和HLA-II类抗原。结果如表1所示。

表1为骨髓、脐带、肺组织来源和高血清浓度培养的间充质干细胞的免疫表型

特异性抗体	骨髓阳性细胞率(％)	脐带阳性细胞率(％)	肺组织阳性细胞率(％)	高血清阳性细胞率(％)
					CD90	99.24	99.87	99.57	80.31
HLA-I	98.93	95.01	99.79	92.67

HLA-II	1.09	1.33	1.87	3.54
					CD34	0.29	0.11	0.51	1.87
CD45	0.34	0.45	0.37	1.35
					CD29	99.14	99.29	99.91	87.59
CD13	99.75	99.33	99.73	86.14
					CD166	99.69	96.05	98.3	78.52
CD105	99.32	97.57	94.7	88.36

CD44	99.47	99.68	99.79	91.26
					CD117	1.98	1.55	1.83	2.42
STRO-1	1.57	1.02	1.74	1.98

(4)人骨髓间充质干细胞的全能标志物表达水平

消化收集P8细胞，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入5ml冷丙酮固定10分钟后。用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入1μl/ml Triton-X破膜15分钟，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，计数。细胞按2-3×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入Oct4、Nanog和Sox2的一抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入相应的PE或FITC标记的二抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。同时设相应的阴性对照管。细胞表达较高水平的Oct4、Nanog和Sox2。分析结果如图3所示。

(5)人骨髓间充质干细胞的成脂肪诱导

P8细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为成脂肪诱导培养基(900μl/ml IMDM+100μl/ml胎牛血清+1nmol/ml地塞米松+50μg/ml 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+50μg/ml抗坏血酸+10μg/ml胰岛素)。每3-4天换液，共诱导3周。油红O染色可见细胞内产生的脂滴被特异性的染成红色。如图4A所示。

(6)人骨髓间充质干细胞的成骨诱导

P8细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为含900μl/mlIMDM+100μl/ml胎牛血清+0.1nmol/ml地塞米松+10nmol/mlβ-磷酸甘油+50μg/ml抗坏血酸的诱导培养基。每3-4天换液，共诱导3周。茜素红染色将钙盐染成红色。如图5A所示。

(7)人骨髓间充质干细胞的成软骨诱导

0.5-1×10⁷P8细胞离心后在离心管中形成微团，小心弃上清后，缓慢加入诱导培养基。它包括1ml/ml DMEM-HG、0.1nmol/ml地塞米松、50μg/ml抗坏血酸磷酸盐和10ng/ml转化生长因子β₁(TGFβ₁)。每3-4天换液，共诱导3周。阿尔新蓝染色显示胞外基质的蛋白多糖被染成蓝色。如图6A所示。

(8)人骨髓间充质干细胞的神经细胞诱导

P8细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时以含有100μg/ml B27，20ng/ml EGF，10ng/ml bFGF和10ng/ml PDGF的DMEM培养基诱导7天；然后换成含有10ng/ml bFGF，10ng/ml PDGF和50ng/ml NGF的DMEM培养基再诱导7天。

诱导后的细胞和对照细胞用冷丙酮固定10分钟后，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一遍，加入1μl/ml Triton-X透膜15分钟后，分别加入1∶750稀释的MAP2一抗和1∶700稀释的Nestin一抗，4℃避光反应过夜。加入1∶500稀释的FITC或PE标记的二抗，37℃避光反应30-40分钟，用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入1∶1000稀释的DAPI复染细胞核，进行共聚焦显微镜分析。结果如图7A，8A所示。

实施例2

(1)人脐带间充质干细胞的分离、培养和扩增

将无菌采集的人脐带用磷酸盐缓冲液漂洗去除残留血液，用无菌刀具将其剪成约1～1.5mm³的小碎块。加入1～1.5倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2～1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化40-70分钟，将该混合物用100-200目滤网过滤，将滤过的细胞悬液与未消化完全的组织分开。将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化20-30分钟，血清终止胰酶的作用，用100-200目滤网过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开。在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15-18分钟，取界面云雾状细胞层加入DMEM/F12培养基，洗涤2-3次，加入完全培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种与75cm²培养瓶中。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养2-3天后弃去非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。当细胞达到70％-80％融合时，按照12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1。重复上述操作进行传代培养过程。将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml胎牛血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。其P10纺锤状形态如图1B所示。

(2)人脐带间充质干细胞的生长曲线

(3)人脐带间充质干细胞的免疫表型鉴定

消化收集P10细胞计数后，细胞按1.0-1.2×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/mlNaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入FITC标记的CD90、HLA-I、HLA-II、CD45、CD34抗体和PE标记的CD29、CD44、CD73、CD105、CD13、CD117和CD166抗体，并设FITC和PE的同型对照各一管，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。人骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD29、CD44、CD105、CD13、CD166和HLA-I类抗原；不表达CD34、CD45、CD117、STRO-1和HLA-II类抗原。结果如表1所示。

(4)人脐带间充质干细胞的全能标志物表达水平

消化收集P10细胞，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入5ml冷丙酮固定10分钟后。用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入1μl/ml Triton-X破膜15分钟，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，计数。细胞按2-3×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入Oct4、Nanog和Sox2的一抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入相应的PE或FITC标记的二抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。同时设相应的阴性对照管。细胞表达较高水平的Oct4、Nanog和Sox2。分析结果如图3所示。

(5)人脐带间充质干细胞的成脂肪诱导

P10细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为成脂肪诱导培养基(900μl/mlIMDM+100μl/ml胎牛血清+1nmol/ml地塞米松+50μg/ml 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+50μg/ml抗坏血酸+10μg/ml胰岛素)。每3-4天换液，共诱导3周。油红O染色可见细胞内产生的脂滴被特异性的染成红色。如图4B所示。

(6)人脐带间充质干细胞的成骨诱导

P10细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为含900μl/mlIMDM+100μl/ml胎牛血清+0.1nmol/ml地塞米松+10nmol/mlβ-磷酸甘油+50μg/ml抗坏血酸的诱导培养基。每3-4天换液，共诱导3周。茜素红染色将钙盐染成红色。如图5B所示。

(7)人脐带间充质干细胞的成软骨诱导

0.5-1×10⁷P10细胞离心后在离心管中形成微团，小心弃上清后，缓慢加入诱导培养基。它包括1ml/ml DMEM-HG、0.1nmol/ml地塞米松、50μg/ml抗坏血酸磷酸盐和10ng/ml转化生长因子β₁(TGFβ₁)。每3-4天换液，共诱导3周。阿尔新蓝染色显示胞外基质的蛋白多糖被染成蓝色。如图6B所示。

(8)人脐带间充质干细胞的神经细胞诱导

P10细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时以含有100μg/ml B27，20ng/ml EGF，10ng/ml bFGF和10ng/ml PDGF的DMEM培养基诱导7天；然后换成含有10ng/ml bFGF，10ng/ml PDGF和50ng/ml NGF的DMEM培养基再诱导7天。

诱导后的细胞和对照细胞用冷丙酮固定10分钟后，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一遍，加入1μl/ml Triton-X透膜15分钟后，分别加入1∶750稀释的MAP2一抗和1∶700稀释的Nestin一抗，4℃避光反应过夜。加入1∶500稀释的FITC或PE标记的二抗，37℃避光反应30-40分钟，用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入1∶1000稀释的DAPI复染细胞核，进行共聚焦显微镜分析。结果如图7B，8B所示。

实施例3：

(1)人肺组织来源的间充质干细胞的分离、培养和扩增

取3-4个月水囊引产胎儿(经产妇知情同意提供)肺组织，用含有100U/ml青霉素/链霉素和250μg/ml两性霉素B的磷酸盐缓冲液反复冲洗去残留血液，用无菌器械将其剪成1-2mm³的小碎块。加入终浓度为0.1％II型胶原的磷酸盐缓冲液至50ml，混匀后在持续磁力搅拌下，37℃消化40-60分钟。该混合物经100-200目滤网过滤后，滤过的细胞悬液与未消化完全组织分开。用40ml磷酸盐缓冲液将未消化完全的组织块从滤网上清洗下来，再加入含12.5mg/ml胰酶的磷酸盐缓冲液20ml，混匀后在持续磁力搅拌下37℃消化20-30分钟，加入终浓度为6ml的血清终止胰酶的作用，用100-200目滤网过滤，弃去未消化的组织。在收集的细胞悬液中加入等量的磷酸盐缓冲液混匀后，缓慢的加入到Ficoll上，在900g离心15-20分钟。弃上清，将细胞震散后用DMEM/F12培养基重复洗两次；用完全培养基将离心后的细胞吹打重悬，按1-2×10⁶/ml的密度接种于75cm²培养瓶中，置37℃，5％CO₂孵箱中培养。四天后换液，去除未贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。待细胞70％-80％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1。重复上述操作进行传代培养过程。将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml胎牛血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。其P15纺锤状形态如图1C所示。

(2)人肺组织来源的间充质干细胞的生长曲线

(3)人肺组织来源的间充质干细胞的免疫表型鉴定

消化收集P15细胞计数后，细胞按1.0-1.2×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/mlNaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入FITC标记的CD90、HLA-I、HLA-II、CD45、CD34抗体和PE标记的CD29、CD44、CD73、CD105、CD13、CD117和CD166抗体，并设FITC和PE的同型对照各一管，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。人骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD29、CD44、CD105、CD13、CD166和HLA-I类抗原；不表达CD34、CD45、CD117、STRO-1和HLA-II类抗原。结果如表1所示。

(4)人肺组织来源的间充质干细胞的全能标志物表达水平

消化收集P15细胞，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入5ml冷丙酮固定10分钟后。用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，加入1μl/ml Triton-X破膜15分钟，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，计数。细胞按2-3×10⁵细胞/管分到流式管中，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一次后，弃上清，残留100-200μl吹打混匀后，分别加入Oct4、Nanog和Sox2的一抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入相应的PE或FITC标记的二抗，4℃避光反应30分钟。用含2μl/ml血清的PBS洗一次后，加入300μl 2％多聚甲醛吹打混匀细胞，上流式细胞仪进行检测。同时设相应的阴性对照管。细胞表达较高水平的Oct4、Nanog和Sox2。结果如图3所示。

(5)人肺组织来源的间充质干细胞的成脂肪诱导

P15细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为成脂肪诱导培养基(900μl/ml IMDM+100μl/ml胎牛血清+1nmol/ml地塞米松+50μg/ml 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+50μg/ml抗坏血酸+10μg/ml胰岛素)。每3-4天换液，共诱导3周。油红O染色可见细胞内产生的脂滴被特异性的染成红色。如图4C所示。

(6)人肺组织来源的间充质干细胞的成骨诱导

P15细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时后换为含900μl/mlIMDM+100μl/ml胎牛血清+0.1nmol/ml地塞米松+10nmol/mlβ-磷酸甘油+50μg/ml抗坏血酸的诱导培养基。每3-4天换液，共诱导3周。茜素红染色将钙盐染成红色。如图5C所示。

(7)人肺组织来源的间充质干细胞的成软骨诱导

0.5-1×10⁷P15细胞离心后在离心管中形成微团，小心弃上清后，缓慢加入诱导培养基。它包括1ml/ml DMEM-HG、0.1nmol/ml地塞米松、50μg/ml抗坏血酸磷酸盐和10ng/ml转化生长因子β₁(TGFβ₁)。每3-4天换液，共诱导3周。阿尔新蓝染色显示胞外基质的蛋白多糖被染成蓝色。如图6C所示。

(8)人肺组织来源的间充质干细胞的神经细胞诱导

P15细胞按1×10⁵/孔接种于六孔板中，贴壁10-12小时以含有100μg/ml B27，20ng/ml EGF，10ng/ml bFGF和10ng/ml PDGF的DMEM培养基诱导7天；然后换成含有10ng/ml bFGF，10ng/ml PDGF和50ng/ml NGF的DMEM培养基再诱导7天。

诱导后的细胞和对照细胞用冷丙酮固定10分钟后，用含1μg/ml NaN3的磷酸盐缓冲液洗一遍，加入1μl/ml Triton-X透膜15分钟后，分别加入1∶750稀释的MAP2一抗和1∶700稀释的Nestin一抗，4℃避光反应过夜。加入1∶500稀释的FITC或PE标记的二抗，37℃避光反应30-40分钟，用含2μl/ml血清的磷酸盐缓冲液洗一次后，加入1∶1000稀释的DAPI复染细胞核，进行共聚焦显微镜分析。结果如图7C，8C所示。

本发明提供与以往的高血清浓度培养试剂相比可以显著增加所得间充质干细胞的一种低血清浓度的完全培养基；和提供一种扩增培养间充质干细胞的可重复性方法，以满足有关领域的需要；提供使用低血清浓度完全培养基得到的细胞具有能在体外长期生长和稳定传代，并具有典型的短梭状形态，生长速度快，活力强的特点；表现出作为干细胞的稳定的细胞形态、免疫表型和多向分化潜能；具有免疫原性低，不表达HLA II类分子的特性；易于外源基因的外源基因的导入和表达。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，包括终浓度为1-50μl/ml胎牛血清、1-100ng/ml表皮生长因子、1-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和细胞基础培养基。

2.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述细胞基础培养基是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640、IMEM中的一种或几种组合。

3.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述胎牛血清的终浓度为1-30μl/ml。

4.根据权利要求3所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述胎牛血清的终浓度为20μl/ml。

5.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述表皮生长因子的终浓度为1-80ng/ml。

6.根据权利要求5所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述表皮生长因子的终浓度为30-70ng/ml。

7.根据权利要求6所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述表皮生长因子的终浓度为50ng/ml。

8.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-50ng/ml。

9.根据权利要求8所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为1-30ng/ml。

10.根据权利要求9所述的培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml。

11.权利要求1～10任一所述的低血清浓度完全培养基的培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)完全培养基的配制：在超净工作台内向细胞基础培养基中加入碳酸氢钠、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，吹打混匀，4℃保存1-2个月；

(2)脐带间充质干细胞的分离方法：用磷酸盐缓冲液漂洗脐带去除残留血液，将组织剪碎；加入1～1.5倍于剪碎组织体积的磷酸盐缓冲液，加入1/2～1/3该总体积的II型胶原酶在37℃下搅拌消化40-70分钟，过滤；将磷酸盐缓冲液和胰酶加入未消化完全的组织块中继续消化，37℃搅拌消化20-30分钟，血清终止胰酶的作用，过滤使细胞悬液和未消化完全的组织块分开；在所有收集的细胞悬液中加入等量磷酸盐缓冲液混匀，缓慢加到Ficoll分离液上，900g离心15-18分钟，取界面云雾状细胞层加入DMEM/F12培养基，洗涤2-3次，加入步骤(1)中制得的完全培养基将细胞吹打成单细胞悬液接种于75cm²培养瓶中；

(3)间充质干细胞的培养：将上述分离方法收集的细胞在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中培养，2-3天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％-80％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml胎牛血清和100μl/ml二甲基亚砜的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。